Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Рекомбинация ДНК в культивируемых клетках различающихся по опухолевому фенотипу

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Рекомбинация ДНК в культивируемых клетках различающихся по опухолевому фенотипу"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ

На правах рукописи

РОМАНОВ Сергей Рудольфович

РЕКОМБИНАЦИЯ ДНК В КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТКАХ РАЗЛИЧАЮЩИХСЯ ПО ОПУХОЛЕВОМУ ФЕНОТИПУ

Специальность: 03.00.25 — Клеточная биология

!

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ

1992

Работа выполнена в лаборатории биологии клетки а культуре Отдела клеточных культур Института цитологии РАН.

Научный руководитель — доктор биологических наук О. К. Глебов.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Ю. Б. Бахтин; доктор биологических наук В. А. Ланцов.

. Ведущее учреждение!, — Биолого-пачвенный факультет Санкт-Петербургского государственного университета.

на заседании Специализированного сонета м-ои^.73.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064, С.-Петербург, Тихорецкий пр., 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН.

Защита состоится «'-'»

Автореферат разослан «

1992 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, доктор биологических наук

Л. Н. Писарева

© Институт цитологии РАН, 1992

)CY/%" ■ • ■

э '

Актуальность работы. Одним из наиболее мнтер)0сньас<, свойств опухолевых клеток является , их Фенотишческая нестабильность, приводящая к гетерогояности опухолевых клеточных популяций по целому ряду признаков. Клетки одной и той же опухоли могут различаться по набору поверхностных антигенных детерминант

(Miller, 1902; Mamburg et. al., 1986), МеТаСТаТИЧ8СК0Му Потенциалу

(Каминская, Бахтин, 1989*, Rubin et ai., 1992), устойчивости к лекарственным препаратам (Clfon, Fidler, 1981; Otto et al., 1099). Такая гетерогенность ос5уславливает наблюдаемую в клиничечскои практика' прогрессию опухолевого Фенотипа (Poste, i see ). Молекулярный механизм Фенотипической нестабильности, по-видимому, может иметь как генетическую (точковыэ мутации, генная амплификация, хромосомные перестройки) (Radman, 19ЙЭ; Novell, 1988) , так и эпигенетическую (изменения в спектре метилирования и контроле экспрессии генов) (Drinlcwater, 1990) природу. В СВЯЗИ С этим большой интерес вызывает целый ряд опубликованных данных о повышенной генетической . изменчивости опухолевых клеток. В опухолевых клетках наблюдают как специфические (коррелирующие с данным типом опухоли), так и случайные многочисленные хромосомные аберрации (траяслонации, дэлеции, анеуплодаю и др. ) (Levan et ai., 1977; Rowley, Ш tmann, 19вЭ), ИМвЮТСЯ СООбШЭНИЯ 0 ПОВЫШбННОЙ

частоте спонтанных .точховых мутаций в. опухолевых клетках по сравнению с нормальными (Cl fon, Fl dl er, 1SS1 ; Seshadri, 1987;. Levi et' ai., 1Э91). Особый интерес вызывает характерная для опухолевых клеток высокая частота амядиФикэцш генов лекарственной

УСТОЙЧИВОСТИ (Ott о et al., 1989; Wright et al., 1090},

Перечисленные генетические перестройки зачастую затрагивают клеточные протоонкогены и гены супрессии опухолевого Фенотипа, модифицируя их экспрессию (xnudson, íaae). Последнее обстоятельство указывает на возможную роль ' генетической нестабильности в процессах инициации и прогрессии опухолевого Фенотипа. Одним . из возможных молекулярных механизмов,-обеспечивающих наблюдаемые в трансформированных к опухолевому фенотипу клетках генетические перестройки, является рекомбинация ДНК.- :

• В ' связи с выше изложенным, становится понятным интерес к

сравнительному исследованию особенностей гомологичной рекомбиаации ДНК в клетках с нормальным и опухолевым Фенотипом.

В качества объекта исследовании был выбран рад меточных культур, клетки которых различаются по опухолевому потенциалу. Мы использовали линии злокачественных, и иммортализовакных клеток, как спонтанного происхождения, так и . полученные путем трансакции клонированный онкогенами. В качестве нормальных клеток в эксперимент брали первичные эксплантаты эмбриональных ФИйробластов, Целью работы являлось выявление различий в уровне гомологичной рекомбинации ДНК в указанных клеточных культурах. В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

1. Разработать экспериментальную систему дая изучения гомологичной рекомбинации ДНК в соматических клетках в культуре, то есть: а) сконструировать тестерные плазммдные ДНК, несущие мутантные копии генетического маркера (нео-гчзна), способные вступать в реакцию гомологичного обмена, приводящую к восстановлению Функциональной активности этого гена; б) отработать метод временной трансакции культивируемых клеток тестерными плазмидными ДНК с последующим выделением Фракций экст^ахромосомной ДШС; . в) разработать технологию получения белковых ядерных экстрактов, обладающих реконбшшционноя активностью; г) разработать методы определения частот рекомбьшационных событий и выявления продуктов рекомбинации (метода бактериального анализа частот и детекции продуктов рекомбинации с помощью цепной полимеразной реакции); Я. Сравншъ частота гомологичной мемшгазмидной рекомбинации в экспериментах по временной трансакции клеточных культур , различающихся по опухолевому потенциалу; .„ 3. Сравнить рекомбинациониую активность белковых ядерных экстрактов, полученных из клеток с нормальным; иммортализованным и опухолевым Фенотипом.

НЭИная Впервые на

болыюи выборка клеточных культур различного видового и тканевого происхождения показапа корреляция между злокачественным Фенотипом клетки и повышенной частотой' гомологичной межплазмвдной рекомбинации, измеренной в экспериментах но временной трансФекции

клеток1 и по рекомбинации in vitro <э белковых экстрактах). Установлен Факт повышения уровня гомологичной рекомбинации ДНК в клетке на ранних этапах ее опухолевой трансформации. Да ляда о повышенной рекомбинационноа активности белковых экстрактов, полученных из опухолевых клеток, в сравнении с экстрактами из нормальных клеток, подтверждает- вывод об изменении контроля рекомбинации ДНК в связи с опухолевой трансформации клеток.

Полученные результаты свидетельствуют в пользу того , что изменения в. контроле рекомбинации ДНК могут быть одним из существенных компонентов в опухолевой трпнсФориации клеток.

Апробадая_рабдтъь Материалы диссертации докладывались на Первой и . Второй: Всесоюзных конференциях "Геном ' человека" (Переславль-Залесский, 1990, 1991), на 31st Annual Symposium or>

Cell Biology CBostow, 19913, НЭ КОЛФервНЦИИ "БИОЛОГИЯ КЛ0ТКИ В

культуре" (Санкт-Петербург, 1992), а также на семинарах в Институте цитологии РАН.

Публикации^ По теме диссертации опубликовано в работ.

Объем___работу j. Диссертация изложена на стр.

машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы, содержащего публикаций.

Диссертация иллюстрированна рисунками и таблицами.

Мзтериалы_и_метдаы^

^етдчиые^ультуры_и^

• Краткая характеристика клеточных культур, использованных в работе приведена, в таблице 1. ТрчнсФекцюо соматических клеток .прводили методом кзльций-фосфэтного преципитата (Глебов, 1989).

В качестве исходного материала для конструирования тесторных плазмидаых ДНК мы использовали челночный вектор psvaNec, (southern, Berg, 19Ö2) (см. рис.1, А). Этот вектор содеркит бактериальный ген аминогликозидфосфорибозилтрансчюразы (АГФГ, weo-ген) под контролем' промотора ранних генов вируса SV40, ген бактериальной устойчивости к ампициллину и другие Функционально важные последовательности ДНК

. Таблица I.

Краткая характеристика■клеточных культур, использованных в работе.

Название Происхождение Откуда получена Литературный источник

кеъа м - Кашинома шейки матки (человек) Коллекция постоянных клеточных линий Института цитологии РАН г. Вхр. Мей., 1953, v.-97, р- 695

Jf-1 Саркома Енсена (крыса) ---„--„--- Cancer Res., 1959, v. 19. в.591

haw епонтанно-шмортализованные эмбриональные фибробласты (ксыоб.) ---„ —_ „-- Virology, 1981, v. 113, p. 4-08

химически- индуцированная рабдомйосаркома (крыса) Лаборатория генетики клеточных популяций. Институт цитологии РАН Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1989, №11, стр. 613

SIAad5 (2,12] икмортализованкые геном ехй аденовируса 5 'эмбриональные оибробласты (кокса) Отдел клеточных культур, Институт цитологии РА1г Цитология, 1990, т.32, №2, стр. 148

EIAad5+ +o-ha-ras '. (10„17> трансформированные онкогенами 21Ав15+о-На-газ эмбриональные шкб роб ласты (кшса) ----„---„ - - .,--и---

he? •первичный эксплантат эмбриональных фибробластсв человека получены нами -

ks? ' первичный эксплантата эмбриональных фибрсбластов крысы получены нами

(см. подпись к рис.1). На основе этого вектора были «.получены те стернью плазмидные ДНК pHepdN И pNeodSK (см. рис. 1, Б, В), несущие делеционные варианты Meo-гена: NeodN и Meodsic соответственно.

Выделение зкстражромосомной ДНК проводили по методу ХИрта (lllrt, 1967) С модификациями (Finn et al., Ю8Э).

Высокоэд^кттаиая^щ^

В качестве бактериального реципиента плазмвдноа ДНК использовали. штамм е. сои dhsoi (кесд"). высокая эффективность введения плазмиднои ДНК достигалась методом злекгрпорации бактерий на приборе ГВИ-1 (разработка С.-Пб Технического Университета) по описанному протоколу (Романов и др., 1992а);

Получение рокомбгаацкотю-активных белковых „ядерных эктрактов и проведение рекомбинации ДНК in vitro.

Экстракты из ядер клеток получали и рекомбинацию ДНК проводили ТЭК, КаК ЭТО ОПИСаНО КуЧерЛЭПаТИ С Соавторами (Kucherlapatl et »1, .1983) с незначительными модификациями (Романов и др., 19926).

Определение частоты меяшлазмидной рекомбинации - методом бакт^иалъной_тдаясФормацтеи1. •

V500 часть суспензии бактериальных клеток подвегнутых элекропорации смеоыо плазмидаых ДНК рнеоам и pHeodSK, содержащихся во Фракциях экстрэхромосомнои ДНК или обработанных белковыми экстрактами, высевали на чашки с агаризованноа средой ьв с ампициллином, оставшуюся суспензию - на такую ш среду, содержащую канамицин. Частоту рекомбинации Fr рассчшъвали по Формуле:

F «N.^M xSOO, г k а •

где на и »к - число колония, выросших на среде с ампициллином и канамицином, соответственно.

Обнаружение рекомбинантных ДНК а поморю цепной полимеразной

Были использованы два олигодэзоксинуклеотидных праймера (20 н.п.), имеющих места посадки в области делецш dN cNeoL-праймер: : eOTAAGGTTGGGAAGCCCTSJ И dSK CNeoR-праЯМер: AGCATGAGATCCCC6CGCTGJ.

В результате гомологичной рекомбинации восстанавливается целостный ' Neo-ген и возникает ДНК-матрица, на которую отжигаются оба праймерз (см. рис.3).' Поэтому, при использовании указанных

т

S71B,Nln41 Н

1J62.IWIII 5363.Hindi II

' Рис.1. Ристрикщонта^ушсциона.льные карггы плзмида psvaweo саз и скоиструированных нз бе основе pHebdM <В> И pNeodSK; Условные обозначения: svio Рг. - промотор ранних генов вируса SV40-, sv-io poiyA - сайт подиаденилирования мРШ т-антигена вируса SV40; рвкэгаог! - точка инициации репликации в бактериальных клетках.

а '

праймеров в ЦПР, проводимой в присутствии плазмидвых ДНК, , содержащихся в экотрахромосомяои Фракции или обработанных рэкомбинационно активным экстрактом, • амгшм>ицируется ■ "диагностический" фрагмент размером 1066 н.п. Продукты рекомбинации анализировали с помощью гель-электрофореза в агарозном гелэ. •

Результаты

1. Конструирование тестерных плазммдных ДНК.

Мы • сконструировали две тестерные плззмвдвсые ДНК рмеоан и pKeodSK, несущие дэлэционные (Функпиодально-неактивные) копии гена АГФТ NeodN и Meod.SK СООТВвТСТВвННО.

Для создания конструкции pNeodW ограниченный перевар плазмида psvsHeo рестрикттируощэа эндонуклеззои м»п лигировали сам на себя ДНК лигазоя ч>ага 14 и использовали для трансформации бактерий DHSa. Среди выросших трансФормантных ампициллин-устойчивых клонов отбирали клоны, не способные к росту на среде с канамиципом. Препарата плазмидноя ДНК; выделенные из таких- клонов, анализировали с помощью рестриктаз. Таким образом был отобрав бактериальный клон, несущий ллазмиду рИеоам, отличающуюся от исходной плазмида-psv2Neo отсутствием Mari-Фрагмента размером 240 п.н. в области Neo-гева, соответствующей и-концевой части белка АГФТ.

Для создания конструкции pMeodSK бактерии трансформировали лигированньм в присутствии Kpni линкеров . ограниченным переваром

ЭКЗОНуКЛеЭЗОЙ Bal 31 SmaI-ГИДроЛИЗата ПЛЭЗМИДЫ pSVEWeo. В

результате., был отобран клон, несущий плазмидную ДНК с делециеи размером 340. п.н- в кодирующей чаоти и<?о-гена, соответствующей с-концевой области белка АГФТ. Причем в сайте, по которому прошло лигирование, застроен Kpni- линкер. Схема взаимного ' расположения дэлеций в вариантах Neodw и Ne-odsx представлена на рис.2.

Полученные таким образом далеционные варианты могут вступать в реакцию гомологичного обмена, одним из продуктов которого будет Функционально-активный Neo-ген, вторым - двойной делеционный ' вариант NeodNdsx, несущий обе дэлеции (при условии реципрокности обмена)(см. рис.3).

э

■1.99 kip

SU48 poly А

-i.es kip—

lieo ffarJ

Ва м ИI

SmI Hbei PvuII

Маг/

SU4B e.pp.

РуШ Uindlll

А

Sgiii

Pvull

SW8 ïoly ft J4Zb--i-^-ЗЧв bp

HpnJ

Иеа dSK

BanHI

dSH

Snal

SU40 poly A j-O---L

Saraf//

■fZBbp-* lieo dH

УЖ/Ж

8У48 е.рг.

В

PvuJI

SU48 е. pr,

246 dH i

С

* Рис.2. Схема взаимного расположения делеций в далециониьо вариантах мео-геиа; А .- структурно-целостный нео-ген < прилегающими ' регуляторными последовательностями: промотором ранних генов е. рг.) и саето»

полиаденилирования (эт-ю Ро1у а) вируса В -

далеционный вариант неоаж; с - делеционный вариант ие>о<ш. Штриховкой' показан район гомологии между двум) ■ делеционяши вариантами, рекомбвдэщовдый обмен в котори приводит к восстановлению Функционально-активного мео-гэн; (см. рмб.З).

пео

] пео аЭК

V

ПМЖИД1

пео

■а^ -4-

азк

Ф»/

пео дШЭК

Рис.З. Схема гомологичного реципрокного обмена | между делеционными вариантами меоаас и нво<т. Продукгажи обмена ЯВЛЯЮТСЯ структурно-иэлостньт Иео-ГВН И ГвЕ МммМЗХ, несущий обе делеили одновременно, .Расположен!» коротких • горизонтальных стрелок указывает на места посадки синтезированных наш олигодвзоксирибонуклэотидных праймеров ■ (см. соотаэтсггвугщия раздел "Материал» и метода"/. .

2. Измерение частот зкстрахромасомиой мажплазмидао« рекомбинации в экспериментах го временной трансфекции клеточныа культур.

Первую серию таких экспериментов мы провели на линия» крысиных клеток опухолевого и ишорггализованного Фвнотилг спонтанного и химически-иадуцированного происхождения, а так же на культуре первичных эмбриональных одбрабластлв крысы. Частота экстрахромосошюй гомологичной рекомбинации ДНК в клетках этих культур сравнивали в экспериментах по временной транФвкцил соматических клеток плазмвдами рнеоан и рнеоайк, содержащими деле дна иные варианты №о-гена. В результате гомологичной рекомбинации между этими плазмвдами может восстанавливать« функционально-активный «ео-ген, экспрессия которого у бактерий обеспечивает способность последних расти на среда с канамицином. ' Ддя измерения частоты рекомбинации плазмидаых ДНК в соматически! клетках, последние транспонировали смесью указанных плазмид. Через 48 часов посла .этого из клеток изолировали зкстрахромосомную ДНК » этой ДЩ{ трансформировали бактерии. Оказалось, что отношение числг канамицин-устойчивых колоний бактерий к ампициллин-устойчивым щ» трансформации экстрахромосомной ДНК, изолированной из опухолевых клеток (линии Рал1-!), в 10-20 раз выше, чем при трансформации их ДНК,изолированной из иммортализованых клеток линии Иас-г и нормальных Фиоробластов крысы (см. табл.2).

Известно, что внесение одно- и двухниговых разрывов е плазмидную ДНК стимулирует гомологичную камплазвдцну» рекомбинация: в. бактериях. Дли того, чтобы проверить, не является ли увеличение отношения канамицин-устоачивых клонов бактерий . г амгаадллин-устойчивым результатом пошшвния частоты рекомбинации ^ плазмид в момент трансформации бактерий в результате большей ' . деградации плазмщдш ДНК во время нахождения ее в оду холе вил клетках по сравнению о . деградацией в иммортализовашшх V. нормальных клетках, мы провели анализ зкстрахромосомной ДНК, изолированной из тран&кщфовшшых клеток посредством гибридизации ■по Саузерпу. Оказалось, что стонень деградации плазмвдной ДНК, содержащейся во Фракципх Хирта, получелшых из о[1ухолевых клеток. Заметно, меньше, чем во Фракциях, шлучченаых из нормальных у

1 Таблица 2. ,

Частота экстрахромосомной гомологичной рекомбинации между плазмидами рмеоам и pweodSK в соматических клетках.

Вариант опыта

Частота рекомбинации отношение числа кана-мицин-устойчивых клонов к числу ампициллин- устойчивых.

Трансформация бактерий плазмиднои ДНК, изолированной из временно трэнсФвцмрованных разных культур:

Ра-23 5,0 х 10

Ра-2Ч 8,0 х 10"

Jf-1 4,0 х 10

Rat-2 . 3,0 X 10"

REF 2,5 X 10" Трансформация бактерий смесью ■

плазмид pNeodN И pMeodSK (КОТрОЛЬ) <5,0 X 10'

-4

-4

г7

иммортализоваиных клеток (рис.4). Следовательно, наблюдаемое в условиях нашего эксперимента повышение частота гомологичной рекомбинации плазмидных ДНК в ряду разных клеточных культур не коррэлируот с увеличением степени деградации этих ДНК во Фракциях .экстрахромосомной ДНК.

. При электрофорезе препаратов плазмидных ДНК, изолированных из нескольких каиамищш-устойчилнх бактериальных клонов и гидролизованных рестрмктзззми sn»i и вдш, во всех препаратах был _ обнаружен "диагностический" Фрагмент ДНК • размером 1000 п.н., характерный -для , полученного с помощью тех же рестриктаз гвдролизата плазмвды psvzNeo, содержащей структурно-нормальный Neo-ген (рис.5). Это доказывает восстановление нормальной структуры Meo-гена в результате рекомбинации между делеционными вариантами этого гэна в культивируемых клетках.

Рис.4

(схема1 Ь- Блот-ги1ридазащтанньш анализ препаратов плазмидаои ДНК, содержащейся в экстрахромосомных Фракциях, изолированных из временна транспонированных культур клеток: Ра-23 . (дорожка 2), Ра-24 (дорожка 3); с«} 1и».-Е сз); ма? с 05. на дорожку 1 нанесена ссмесь линейных Форм плазмид рнеолм и рмвоагх; на дорожку 7 -смесь суперскрученных и релаксированных Форм этих же плазмид. На схеме обозначены: л - линейная Форма, сф -сушрскрученвая Форма, - релаксированная Форма

плазмвдных ДНК. В качестве гибридиэационвого зонда использовали радиоактивно-меченный препарат плазмвды ряуа^во.

Рис.б. (схема). ЭлектроФореграамма препаратов пяазмидных -ДНК, изолированных из канаммцин-устойчивых бактериальных клонов и гидрояизованных рестриктазами &па1 и вдмх (дорожки 1-в); на дорожку 7 нанесен Бтах-вдш-гадролизат плазмида рБУгнво; на дорожку & - р«ч-гидоолизат' ДНК ч>ага. Размер рвстрикционвых Фрагментов указан в т.п.н.

1) •

В связи о тем, что типография не гарантирует качества

воспроизведения тоновых рисунков , автор вынужден приводить схемы '

оригинальных фотографии, за что приносит спои извинения.

Д4

Выравненные по содержанию плазмидноя ДНК аликвоты Фракций экстрахромосомной использовали ДНК для проведения ЦПР в '( присутствии синтезированных олигодезоксинуклеотиднъа праймеров. Во всех Фракциях бьиа обнаружена ампличмкация "диагностического" фрагмента ДНК размером 1068 п.н., характерного для плазмиды рхугмео, содержащей структурно-нормальный мео-ген (рис.6).

1 2 3 4 5 в 7*8 9

Рис.в. (схема). Рентгенограмма блот-гийрвдизационного, анализа продуктов амплификации ЦПР, проведенной в присутствии синтезированных праймеров на ДНК, содержащейся во Фракциях Хиргга, полученных из трансФвцирцванных клеточных культур: 1 дорожка - Ра-23 s 2 - Ра-2V ; 3 - Jf-i; * - - R»t-a; 5 - réf. На дорожку Ô Наносили продукты ЦПР,. проведенной в присутствии смеси ПЛЭЗМИДНЫХ ДНК pHeodH И pHeodSK ( по 6 • пг каждой); на дорожках ' 7,8,9 нанесены продукты ЦПР, ппроведеняой в присутствии 0,001, 0,01 и 0,1 пг гаазмвды psv2 №о соответственно. В качестве гибридазационного зонда ' исгаюльзовали радиоактивно- меченный препарат ПЛаЗМИДЫ pSV2Meo.

Во второй серии экспериментов, проведенной по описанной выше схеме, мы измеряли скорости * . гомологичной мешлазмидаой экстрахромосомной рекомбинации в ' клетках эмбриональных ФИбробЛаСТОВ КрЫСЫ, ИММОртаЛИЗОВаННЫХ ОНКОГеИОК EIAadS и. трансформированных онкогенами ElAadS+c-lt»-ras (Поспелова и до., 1990). ■ ■ .

Существенным, с нашей точки зрения, отличием этих клеточных линий от использованных в первой серии экспериментов по экстрахромосомной рекомбинации (см. табл.2), помимо их опосредованного оякогенной транеФвкцдаа происхождения, является лто, что прошло сравнительно мало времени с момента их получения до постановки наших экспериментов. Так, если использовэкиью нами в

описанной выше серии экспериментов клетки двух сублиний рэбдомиосэркомы Ра-23 и Pa-2V прошли длительный (более 10 лет) и многократный (более 180 циклов) отбор m vivo на повышение метастатического потенциала с момента индукции першчной опухоли 2р-метилхолзнтреном (Каминская, Бахтин, 1989), а саркома Енсена ведет свою историю, по крайней мере, с 1959 года, то с момента

ПОЛуЧеНИЯ КЛеТОЧНЫХ ЛИНИЙ СерИИ EIAadS И EIAadS4c-Ha-ras ДО

настоящего времени, последние претерпели всего несколко пассажей и, еле- дователшо, их имморггализованный и (или) злокачественный . Фенотип мошт считаться только-что инициированным.

В результате проведенных экспериментов, оказалось, что частота якстрахромосомной Гомологичной иежпплазмидаой рекомбинации в клетках ФШробластов крысы, транФормированных двумя онкогенами на порядок выше, чем 9 Клетках Фибробластов, имморггализованных одним онкогеном (табл.3)

' ' . Таблица 3. ■

, Частоты зкетрахромосошюй рекомбинации между плазмидами

pNeodN И pNeodSK В ЗМбрИОНЭЛЬНЫХ ФИбрОбЛЭСТаХ КрЫСЫ, ИММОрТЭ-<лизованных онкогеном EIAadS и транФормированных. онкогенами

EIAad3+c-Ha-ras.

к__

Клеточная линия- Частота рокомбинаци ЛНК, измеренная с

помощью трансформации бактерий (число канамицин-устойчивых клонов отнесен- • ■. ное к числу ампициллин-устойчивых)

EIAadS Сг> 4.S X ю"5

EIAadS С123 4,0 X Ю- . ;

EIA»d5+c-Ha-rasr <Ю> 3,3 X ю-4

■EIAadS+c-Ha-ras С17) 3,3 X ю'4

3. Рекомбинация ДНК in vitro

Дорвые эксперименты по рекомбгаации ДНК в белковых ядерных

;3tccrpa.Tras, ив ль которых, главным образом, заключалась в отработке

IB

технологии получения рекомбинациошю-активных экстрактов и оптимизации условии рекомбинации in vitro, были поставлены на клеточной линии Pa-2V

•Частоту рекомбинации ДНК в этих экспериментах, так ю, как и в экспериментах по экстрахромосомноа межплазмиднои рекомбинации, измеряли с помощью трансформации бактерий смесыо плазмидаых ДНК, обработанных белковым .ядерным экстрактом.

Оказалось, что белковый ядерный экстракт, полученный из клеток линии Pa-SV обладает рекомбинационвой активность», и что частота рекомбинации (отношение количества рекомбинаютых плазмидаых ДНК, содержащих восстановленный Функционалыю-ак- ■ тивный Meo-ген, it количеству исходных, содернащих делационные варианты этого гена, оцененное с помощью трансформации бактериальных клеток) возрастает пропорционально количеству белка, содержащегося в реакционной смеси, в диапазоне 10-30 мкг. Кроме того, наличие доунитевого разрыва ДНК в районе облигатной рекомбинации в дэлециошом варианте рмеоам, приводит к увеличению частоты меитдазмидной рекомбинации в 10 раз (табл.4).

Препараты шазмвдных ДНК, выделенных из канамицин-устоичивых клонов бактерий, были подвергнуты Гидро- лизу рестриктазами Батнт и Bgixr, и было проведено Фракционирование полученных Фрагментов ДНК с помощью электрофореза в агарозном геле. Оказалось, что в гидролизатах всех проворенных препаратов содержится Фрагмент WiK размером 2020 п.н., характерный для Bamin-Bgin-тадролизата плазмида psvanea со структурно-нормальным Нес.-геном и отсутствующей В ГВДфОЛИЗаТЭ смеси плазмид pMeodW и pMeodSIC ■ (рис.7).

Затем мы прово.ли сравнительные исследования рекомбинационной . активности белковых ядерных экстрактов, полученных из ¡и:отск с .опухолевым, имморггалиоовэтшм и нормальным Фенотипом. Помимо пяти культур клеток крысы, использованных в описаиых вьша экспериментах по экстрахромосошюй рекомбинации (Ра-23,Ра-2',', Jr-i, ни ».--г, red, мы, , дополнительно, исслодпэали реяомбинацконнуш активность белковых адэрных экстрактов клеток. линии неьа м (человек) и-первичных эмбриональных Фибробластов че.тодака (пег.). Реакцию (©комбинации in vitro ставили в двух «гфиш/тах: в норном, в

Таблица 4.

Гомологичная рекомбинация плазиидных ДНК в .белковом экстракте из ядер клеток линии Ра-2Н- >

Комбинация пяазмвд3* • Вариант опыта

Частота рекомбинации

pMeodH<C4 )+pMeo<ISK<CK>)

Инкубация смеси одазмид с ядерным экстрактом с разным содержанием белка, мкг О

10 • " • 20 30

контроль

Ö)

<S,0 х 10 2,0 х 10 3,5 х 10" 4,2 X, 10" 3,0 х 10"

г?

гб

p№>odN(Hart )+pNeodSK(C4>)

Инкубация смеси плазмид с ядерным экстрактом с разным содержанием белка, мкг О

10 ■ ' 20 30

контроль

Ö)

<1;3 х 10

1.2 х 10"

2.1 х 10"

4.3 х 10

1.2 X 10"

-в

,-4

Примечания: а) в скобках указана особенность препаратов ДНК: рч> -суперскрученная Форма плазмиды; Karl- - линейная Форма плазмиды, полученная путем гидролиза ее рестриктазой Narr б) в контрольном эксперименте бактерии трансформировали" смесью плазмидных ДНК, инкубированных с ядерным ■ . акстрэ1сгом, содержащем 30 мкг белка, по-отдельности.

1 2 3 4 5 в 7 82,02

- - - - - -- - - = 1.68

Рис.7, (схема). Электрофореграмма препаратов плазмидаых ДНК, изолиройанных из канамицин-устойчивых бактериальных клонов и гидролизованных рестриктазами ваши! и Bgin (дорожки 2-7 >•, на дорожку 1 нанесен ватнх-Bgi i х -гидролизат плазмиды pSVEMeo; на дорожку 8 - BamHI-Bgl II-гидролизат CMS СИ 1 плазмидаых ДНК рнео^м и pNeodSK. Размер рестрикционных 1 Фрагментов указан в т.п.н. .

качестве субстрата для рекомбинации использовали смесь , суперскрученных Форм плазмидаых ДНК, во втором - смесь суперскрученной Формы плазмида pKeonsK и линейной Формы (wari--гидролизата) плазмвды pueodu. во всех вариантах в реакционную смесь добавляли 15 мкг белка свежеприготовленных экстрактов. Оказалось, что частота рекомбинации плазммидаых ДНК, наблюдаемая при инкубации их с белковыми экстрактами из ядер опухолевых клеток (Ра-23(Ра-2Л, Jf-i, HeLai и имморгализованных клеток cRat-2>, на порядок выше чем частота рекомбинации' плззмвдной ДНК, обеспечиваемая экстрактами из ядер нормальных клеток cref, нею, при рекомбинации между сужрскручешыми Формами плазмвд pm^ocjsk и pNeodN, и в 3-10 раз выше при рекоммбинации между суперскрученнои формой плазмиды pNeodSK И ЛИНОЙНОЙ ФОрМОЙ ПЛ83МИДЫ plteodM . (табл.5).

Препраты плазмидаых ДНК, очищенных из реакционном смеси для рекомбинации in vitro, мы использовали в качестве матривд для ЦПР в присутствии синтезируемых дезоксирибонукльотипных праймероа. В результате в этих препаратах была обнаружена амплификация "диагностического" Фрагмента ДНК размером 1088 п.н., характерного для плазмиды psvaNeo, содержащей структурно-нормальный Neo-ген "(¡тс.7). '■

Таблица б.

Частота рекомбинации плазмид при. инкубации их в белковом экстракте из опухолевых, иммортализованных и нормальных клеток

субстрат дом клеточная частота

рекомбинации линия рекомбинации

рМеойМССФ) ■* 8,0x10

рМвоаэкссФ) Ка-гУ 3,0*1 о"3

Л-1 'й,5х10~3

г, 5x1 о"3 '

НеЬа г, 0x1 о"3

ЙЕГ 3,0х10_в

ГОТ 2,0x10"®

контроль6* 3, 0x1 о"в

рМеоаМСНаг1Э + ва-гз 1,2x1 о"4

рМео<ЗЗКС СфЗ Ка-г-У 1,3x10-4

1Г-1 1,0x10~4

Каг-г 1,2x10-4,

НеЬа 1,5x10-4

(?ЕГ 3,0x10-5

НЕГ г, Охю

контроль6* 1,2x10

Примечания: а) сф - сушрскрученная Форма плазмиды, маг! -Наг1 -гидролизат плазмиды; б) в контрольном эксперименте бактерии трансформировали смесью илазмвдных ДНК, обработанных экстрактом из ядер клеток линии Ра-2*/ ' по отдельйости.

Прелраты шазмццша ДНК, отапэнаых из реакционной смеси для I рекомбинации in vitro, мы использовали в качестве матрицы для ЦПР в присутствии синтезируемы* дезоксинуклэотидаых праймэров. В результате в этих препаратах была обнааружена амшификация "диагностического" Фрагмента ДНК размером 1068 л.я., характерного "для плазмида рзугмео, содержащей структурно-нормальный мво-ген <рис.7>;

, сс. ЛС

'1.2 3 4 6 6 7 8 "9 10 11 12 13 14

.......... >— -- - ...... III! 1,06

ЛЛ i'V

15 16 17 "18 19 20 21 22 23 24 25 281 27 28

------ • ...... ...... - 1,08

Рис.7, (схема). ЭлекгроФореграмма продуктов амплификации смеси ПЛЭЗМВДДЫХ ДНК pNeodSX И pNeodN, ОбрабОТЭННОЙ . рекомбинационно активными экстрактами из клеток Ра-23 (дорожки 1,9,18), • Pa-2V , (дорожки 2,10,19), Jr-i (ДОрОЩСИ 3,11,20), Rat-2 (ДО- рОЖКИ 4,12,21 )*XEF СД0р0ЖКИ 5,13,22), HeLa (доронаш 6,15,23), HEF (ДОрОШШ 7,18,24), В присутствии синтезированных праимеров.На дорожках 8,17,25 ' нанесены продукты амплификации смеси, плазмид pMeodu и pMeodsK, обработанных экстрактом из клеток линии Pa-2V по отдельности. На дорожках 28,27 нанесены продукты амплиФикацииг плазмида pSV2N»o. на дорожках 14,28 - Pvuii-• -перевар Фага Условные обозначения: со - смесь

суперскрученных плазмид pHeodN И pHeodSK; лс - смесь линейной Формы pNeodN И СуШрСКруЧвННОЙ pNeodSKj ЛЛ -смесь линейных плазмидаых. ДНК. ■

Обсуждение

Проведенные наш эксперименты позволили выявить-существенные различия между клетками опухолевого, иммортализованного и нормального генотипа, в характере экстра-хромосомной гомологичной рекомбинации, наблюдаемой в экспериментах по временной трансФекции клеточных культур тэстернымй плазмидными ДИК. Основным результатом .этих экспериментов является установленная нами корреляция менаду злокачественным Фенотипом клетки и повышенной частотой, наблюдаемой в ней экстрахромосомной гомологичной рекомбинации ДНК. В другой серии экспериментов - по рекомбинации ДНК m vitro, • мы обнаружили более высокую •рекомбинационную активность белковых экстрактов из ядер опухолевых и иммортализуванных клеток, чем активность, обнаруживаемую в экстрактах из ядер нормальных клеток. Представляется интересным обсудить эти результаты' с точки зрения возможной роли механизмов рекомбинации ДНК в процессе становления и (или) прогресии опухолевого Фенотипа. Действительно, тот Факт, что повышенная частота экстрахромосомной рекомбинации ДНК наблюдается наш в опухолевых клетках различного происхождения . (сппонтанного, химически-индуцированного и опосредованного трансФекциея онкогенами) и имеющих различную предасторию (то есть различные условия и длительность культивирования до момента постановки наших экспериментов), свидетельствует в пользу того, что изменения приводящие к увеличению рекомбинащонного потенциала клетки могут иметь место на очень ранних стадиях, инициации трансформированного Фенотипа.

Известно, что активация клеточных протоонкогеиов, наблюдаемая В целом ряде опухолей (Bishop, 1987; Land et al., 10831 может осуществляться за -счет перестроек ДНК, переносящих промо-торно-энхансерный участок в проксимальное по отношению к онкогену положение, или за очет увеличения "дозы" протоонкогена путем его амплификации. Указанные перестройки, так же, как и наблюдаемую в опухолевых клетках • с . высокой частотой . амплификацию генов лекарственной устойчивости (Otto et al-, 1ыеэ>, по-видаому, могут быть результатом рекомбшационных событии. Результатом рекомбинащи (например генной конверсии) может быть и наблюдаемое

es

в некоторых опухолях явленна утраты гэтерозиготности (Jeinsenа, Radman, 1Q765, приводящее к Фенотипическому проявлению рецэссивных мутаций в генах-супрессорах опухолевого Фенотипа.

Есть сообщения о стимуляции некоторыми канцэрогенами внутрихромосомной ГОМОЛОГИЧНОЙ рекомбинации ДНК CWana et al., 19вю и о зависимой от индукций экспрессии с-шус онкогена амплификации гена лекарственной устойчива с ста ДГФР в эмбриональных фибробластах крысы (Denis et al., 1991).

Важным указанием на роль генетической нестабильности в канцерогенезе является повышенный риск опухолеобразоватая у людей с такими наследственными заболеваниями, как синдромм Блюма, анемия Фанкони, атаксия телеангиозктазия, характеризующимися высокой частотой спонтанных хромосомных аберраций аналогичных тем, которые индуцируются канцерогенами В нормальных клетках С Radman, Kinsella,

i 9B03 -

Различия, обнаруживаемые нами в речомбинационвой активности белковых экстрактов, полученных из опухолевых, иммортализованных и нормальных клеток могут указывать на модификацию экспрессии генов, контролирующих гомологичную рекомбинацию в процессе опухолевой трансформации. Однако, непонятно на каком уровне регуляции зкспресш происходит эта модификация (на уровне синтеза мРШ,> процэссинга мРНК или про- цесеингз белка). В то же время известно, что. многие онкобелки могут модифицировать экспрессию генов как па уровне транскрипции (транскрипционные Факторы), так и на уровне' процэссинга белка (тарозин-специфическиэ нротеишшазы).

Известно, что имморгализация* соматической клетки, то есть приобретение ею способности неограниченно делиться, можно рассматривать как один из начальных этапов опухолевого перерождения. Мы не обнаружили повышения частоты экстрахромосомной рекомбинации . ДНК в исследованных нами имморталийзованных' клеточных линиях. Однако, белковый экстракт и»' ядер спонташш-иммартализовагашх ФИброблчсгов крысы линии Rat-г обллдает рекомбинационной активностью, сравнимой с активностью экстрактов из ядер опухолевых клеток. Остается загадкой, какие Факторы ¡»¡>отитп'вукт рекомбинации j.%',;;цу тесторными. плаэмидами, находящимися и экстрахромосомном сопо^нии в клетках этой линии. Ташми Фактсплы! могут быть либо

гз

белок-репрессор, негативно контролирующий активность рекомбинационного комплекса, присутствующий в клотко и отсутствующий в белконом экстракте, либо особенности в трехмерной (хроматиновой) структуре плазмиднои ДНК, возникающей в первые часы после трансФекцш клеток.

'• Выводы

1. В клетках опухолевого Фенотипа в 10 раз по сравнению с нормальными и . иммортализованными повышена частота экстрахромосомной гомологичной рекомбинации ДНК. Повышение частоты

; экстрахромосомной рекомбинации ДНК наблюдается . в опухолях различного происхождения й различной видовой специфичности.

2. Белковые экстракты из ядер опухолевых и иммортализованных клеток нрояьляют сходную рекомбинационную активность, более высокую, чем экстракты из ядер нормальных клеток.

3. События, приводящие к увеличению рекомбинационного. потенциала, имеют место на ранних стадиях инициации и

(или) прогрессии опухолевого Фенотипа, и, по-видимому являются необходимой компонентой этого процесса.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Романов O.P., Абрамян Д.С., Смагина Л.В., Глебов O.K. Особенности рекомбинации ДНК в разных линиях культивируемых клеток животных ✓✓ Первая Всесоюзная конференция "Геном человека", Переславль-Залэсский, 1990 /V Тезисы конференции,. М., 1990, с.55.

2. Абрамян Д.С., Романов O.P., Смагина Л.В., Глебов O.K. Исследование зависимости направленного встраивания генов в хромосомы культивируемых клеток животных от. количества копий гена-мишени. ^ Вторая Всесоюзнаая конференция "Геном человека", Перославль-Залесский, 1991 ^ Тезисы конференции, М., 1991, с.З.

3. О. K.Gleboy, D. S. Abramyan, S.R.Romanov and L.'V. Smagina. Agents Changing Chromatin's Structure Influences Homologous DNA Recombi natiorV ss.J.-Cell Biol.. 1001, v.llS, n. 3, pt.2, p. S6a.

4. 'Романов С.P., Абрамян Д.С., Глебов O.K. Рекомбинация ДНК в культивируемых клетках с различным опухолевым потенциалом. Цитология, 1992, т.34, n 9, с. ; Тезисы конференции "Биология

клетки в культуре", Санкт-Петербург, 1992.

5. СМапша Л.В., Романов O.P., Ермилов А.Н,, Гиикул Л.Б., Швембергер И.Н., Глебов O.K. Внутрихромосомная рекомбинация ДНК в соматических клетках трансгенных мышэя. // Цитология, 1992, т.34, N 9, с. . Тезисы конференции "Биология клетки в культуре", Санкт-Петербург, 1992.

8. Романов O.P., Абрамян Д.С., Глебов O.K. Изучение особенностей гомологичной рекомбинации ДНК в соматических клетках. х..Конструирование плазмидйых ДНК, содержащих делеционные варианты гена аминоглшсозидФосФорибозилтрансФвразы. ^ Цитология, 1993, т.35,

N , С.

7. Романов O.P., Абрамян Д.С., Глебов O.K. Изучение особенностей гомологичной рекомбинации ДНК в соматических клетках, и. Особенности рекомбинации плазмидных ДНК в культивируемых клетках, различающихся опухолевым потенциалом. Цитология, 1993, т.35, и с.