Структура и экспрессия вируса саркомы Рауса в клетках неспецифических хозяев

Рындич, Алла Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структура и экспрессия вируса саркомы Рауса в клетках неспецифических хозяев
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структура и экспрессия вируса саркомы Рауса в клетках неспецифических хозяев"

ОРДЕНА ЛЕШТНА И ОРДЕНА ДРУЖБЫ НАРОДОВ АКАДЕМИЯ НАУК УССР ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ

На правах рукописи

УДК 577.21:578.828.11

РЫНДИЧ Алла Владимировна

СТРУКТУРА И ЭКСПРЕССИЯ ВИРУСА САРКОМЫ РАУСА В КЛЕТКАХ НЕСПЕЦИФИЧЕСКИХ ХОЗЯЕВ

03.00.03 - молекулярная биология

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук в >|юрм0 научного доклада

ОТВРТСТРИЕ

»\>~:уб:!Н " ' ЛЯ*?у

Работа вшолнена в отделе биосинтеза нуклеиновых кисло? Института молекулярной биологии и генетики АН УССР /Киев»/ некоторые участки работы выполнены в отделе вируоной и клеточной генетики и шцунологии Института молекулярной генетики ЧСАН /Прага/, биологическом секторе Института биологии Кюри /Орсе/ и лаборатории молекулярной генетики Института Ж.Моно /Париж/.

Официальные оппоненты:

член-кор. АН СССР, академик АН ЛатССР Э.Я.ГРЕН

член-кор. АН СССР, профессор Е.Д.СВЕРДЛОВ

член-кор. АН УССР, профессор З.А.БУТЕНКО

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии

на заседании Специализированного совета Д 016.11.01 при Институте молекулярной биологии и генетики АН УССР по адресу: 252627, Киев-143, ул. Заболотного, 150.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии и генетики АН УССР.

Автореферат разоолан "_" _,_ 1990 года

им. В.А.Энгельгарцта АН СССР

Защита состоится

1990 года в чао.

Ученый секретарь Специализированного совета кацц.биол.иаун

ОВДАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Индукция сарком у цыплят фильтрующимся агентом описана П.Раусом в 1911 г., и с тех пор вирус, названный его именем, наряду с множеством других ретровирусов, интенсивно исследуется как модель или участник различных биологических процессов, включая образование злокачественных опухолей, эмбриональное развитие, соматические мутации, эволюцию. Такое внимание к ретрови-русам обусловлено их исключительными особенностями. Они широко рас-простраяеян у позвоночных, передаются как горизонтально, так и вертикально, являются природными агента.® онкогенеза, для размножения используют РНК-зависимый синтез ДНК. В последнее время интерес к ретровирусам еще более обострился в связи с установлением этиологии синдрома приобретенного иммунодефицита и Т-клеточного лейкоза человека.

Ретровирусы обнаружены практически у всех высших животных, однако, для каждого данного ретровируса круг хозяев чрезвычайно ограничен. Вместе с тем имеются хорошо документированные описания расширения или изменения круга хозяев. Чем обусловлена специфичность ретровирусов, какие условия и какие изменения в них необходимы для смены хозяина? Ответы на эти вопросы не только возбуждают теоретический интерес, но и приобретают большое практическое значение. "Адаптация" куриного вируса саркомы Рауса (яэч) к условно пермио-сивному хозяину, утиным клеткам, - прекрасная модель для подобных исследований.

Хотя ретровирусы являются только одним из агентов, приводящих через специфические генетические изменения в индивидуальных клетках к злокачественному перерождению, их привлекательность для исследователей в области канцерогенеза об"ясняется относительной простотой строения и надеждой, что детальное понимание генетического вклада, вносимого этими вирусами в клетку, расширит в целом наше понимание неопластического превращения. предоставляет экспериментаторам наиболее удачную ситуацию: он внедряет в нормальную клетку единственный ген, чей продукт споообен инициировать и поддерживать опухолевый фенотип. Действительно ли ген зге всегда необходим для поддержания злокачественной трансформации клетки или, раз инициировав этот процесс, он может быть элиминирован? Клетки млекопитающих, трансформированные вирусами птичьих сарком, непермиссивны для этих вирусов, что позволяет длительное исследование их сохранения в условиях, исключающих повторное заражение.

rsv при длительном пассировании легко теряет частично или полностью ген arc, что приводит к появлении н е тран сформирующих мутантов. Механизм образования таких трансформационно-дефектных (td) мутантов удобно исследовать при заражении вирусом саркомы Рауса клеток уток, исходно не имеющих ksv-гомологичных последовательностей. Использование td -мутантов rsv чрезвычайно полезно для изучения путей трансдукции клеточного протоонкогена и превращения его в вирусный онкоген, понимания способов образования новых остро трансформирующих ретровирусов.

Таким ооразом, изучение организации, структуры и экспрессии вируса саркомы Рауса в клетках несвойственных для него хозяев дает возможность получить ответы на многие актуальные вопросы, относящиеся к молекулярной биологии ретровирусов и проблеме возникновения злокачественных новообразований.

Целью настоящей работы было выяснение молекулярных основ образования новых ретровирусов и их необходимости в поддержании индуцированного ими опухолевого фенотипа. Для выполнения работы на моделях, разрабатывающихся совместно с Институтом молекулярной генетики ЧСАН и представляющих собой rsv-трансформированные клетки различных животных, предполагалось последовательное решение нескольких задач. Прежде всего, интересно было узнать, на каких этапах жизнедеятельности rsv происходит ингибирование его репликации в условно пермиссивных для него утиных клетках и какие изменения необходимы для его приспособления к новому хозяину. Многократное пассирование Rsv на утиных клетках генерирует, наряду с образованием "адаптированного" к уткам трансформирующего вируса, большое количество тран-сформационно-дефектного мутанта. Выяснение его структуры было последующей задачей этого исследования. После инфицирования таким td-мутантом в раннем возрасте здоровых цыплят, у взрослых кур иногда обнаруживали саркомы, продуцирующие вирус. Определение организации и структуры этого вируса оказалось полезным для понимания механизмов образования саркомных вирусов, а последующее изучение наличия вирусспецифических нуклеотидных последовательностей в клетках млекопитающих, изначально трансформированных rsv, помогло обнаружить отсутствие отрогой их необходимости для поддержания опухолевого фенотипа.

Научная новизна. Проведено детальное изучение организации и структуры провирусов, имеющих общее происхождение (вирус саркомы

Рауса ), но измененных в соответствии с условиями эксперимента на пути к образованию новых ретровирусов: траисформационно-активного и трансформационно-дефектного, заражающих клетки другого, несвойственного для нзу вида животных, а также нового саркомного вируса птиц. Впервые получена и определена нуклеотвдная последовательность провируса рг-^бу-с, адаптировашюго к утиным клеткам (¿аРг-ЯБУ-с), ввделен и охарактеризован его трансформационно-дефектный мутант (га с!арг-(?5У-с). в обоих вариантах вируса обнаружена изменения в гене епу, имеющие значение для адаптации к несвойственному хозяину.

Расшифрована первичная структура провируса нового остро-трансформирующего вируса, вызывающего саркомы у птиц, который был ввделен из опухоли, индуцированной у цыпленка внутриэмбриональной ин"ек-цией се! аарг-РБУ-с. впервые показана трансдукция гена с-эгс вместе с протяженным 3 -прилежащим участком хозяйской ДНК.

До последнего времени считалось общепринятым отсутствие какой-либо специфичности интеграции провирусов ретровирусов с хромосомной ДНК хозяйской клетки. В этой работе показано, что провирусные последовательности вируса саркомы Рауса в разных линиях клеток млекопитающих, трансформированных этим вирусом, локализуются преимущественно в бс- богатых участках генома.

Принципиальным является обнаруженный в данной работе и на той же модели другими авторами (тагозуап ог а1.,19Эб) факт, что для поддержания опухолевого фенотипа нет обязательной необходимости сохранения в геноме трансформированной клетки ни нуклеотидных последовательностей репликативных генов ретровируса, ни нуклеотидных последовательностей самого онкогена, инициировавших этот процесс. В патогенез опухолевого заболевания могут вовлекаться другие онкогены, активированные вирусными промоторами, либо изменившие свою структуру в результате перестановок в геноме, вызванных первичной трансформацией.

Теоретическая и практическая ценность. Результаты описанных в работе исследований расширили существующие представления об образовании новых ретровирусов, молекулярных механизмах перехода ретровирусов от одного хозяина к другому, превращения саркомных вирусов в трансформационно-дефектные мутанты, которые можно отнести к лейкоз-ной группе медленно трансформирующих вирусов. Особенно ценно, что такой круг превращений был показан на одной модели - язу-трансформированных клетках специфических и неспецифических хозяев. Таким

образом, продемонстрирована сиотема для распространения и сохранения ретровирусов, роль которых в природе, по-видимому, далеко выходит за рамки онкогенеза.

Молекулярно-биологические исследования адаптации rsv к условно пермиссивному хозяину позволили сформулировать гипотезу о путях расширения круга хозяев ретровирусов и открыли возможность направленного изменения их хозяйской специфичности.

В процессе "адаптации" онкогенного ретровируса к новому хозяину происходит накопление его td-мутанта. Выделение и характеристика td daPR-Rsv-c позволили нарисовать схему их образования из трансформационно-активного Rsv и использовать в дальнейшем эти мутанты после определенных модификаций в качестве вектора для переноса чужеродных генов в клетки птиц.

В природе, однако, как было показано в работе, такие td-мутанты могут рекомбшшровать с клеточными протоонкогенами, давая в результате трансформирующие ретровирусы. Определенная в работе структура нового птичьего саркомного ретровируса подтверждает высказанную ранее ГИПОТезу ХанафуЗЫ (Lerner, Hanafusa,1984) , что изолят, известный сегодня псд именем "Пражский штамм вируса саркомы Рауса", - это результат вторичной рекомбинации исходного репли-кативно-дефектного саркомного вируса.

one-содержащие ретровирусы, как репликативно компетентные, так и репликативно-дефектные, вызывают трансформацию клеток vitro и возникновение опухоли in vivo и, как считалось до сих пор, необходимы для дальнейшего поддержания опухолевого фенотипа. Полученные в работе результаты указывают на то, что второе не всегда необходимо, из чего следует важный вывод: ретровирусная этиология рака встречается чаще, чем это можно выявить доступными сегодня методами.

Использование подхода, разработанного Дж.Бернарди для фракционирования длинных фрагментов ДНК по их ge-составу, позволило обнаружить, что интеграция провируса происходит не статистически, а распределяется по определенным сегментам гомогенной по нунлеотидно-му составу ДНК большой протяженности, называемых изохорами. Открытие такой предпочтительности в интеграции ретровирусных провирусов создает перспективы для дальнейшего исследования районов клеточного генома, участвующих в поддержании опухолевого фенотипа.

Разработанные при выполнении этой работы в рамках международ-

ных программ АН соц.стран "Обратная транскриптаза (ревертаза)" и "Ревертаза-онкоген" методические приемы получения препаративных количеств обратной транскриптазы и синтеза полноценных кДНК способствовали как развитию работ, явившихся предметом этой диссертации, так и созданию научно-технической базы для получения клонотек кДНК вирусов, растений и животных в нашей и других лабораториях страны.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Раздел I. ИССЛЕДОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ ОСНОВ "АДАПТАЦИИ" ВИРУСА

САРКОМЫ РАУСА К УСЛОВНО ПЕРМИССИВНШУ ХОЗЯИНУ Введение. Спектр хозяев РНК-овых опухолевых вирусов сложен и высоко специфичен. Он контролируется продуктами вирусных структурных генов, взаимодействующими с детерминантами как на поверхности, так и внутри клетки. Многие онкогенные ретровирусн дефектны и зависят от вирусов-помощников при сборке вирионных белков. Однако фенотипическое смешивание может происходить даже с недефектными вирусами в смешанных инфекциях, что может изменить спектр хозяев и другие биологические свойства таких вирионов, не затрагивая существенно геном исходного вируса.

Вирусы птичьих сарком (asv), относящиеся к подгруппе С, эффективно инфицируют и трансформируют утиные эмбриональные клетки, но реплицируются в них плохо. Тем не менее, имеется несколько сообщений, описывающих адаптацию или селекцию asv in vivo или in vitro В утиных клетках (Duran-Reynals, 1942| Shoyab ot al., 1975j Zar-ling, Temin,1976). Свойства вируса обычно изменялись после нескольких пассажей через гетерологичного хозяина (Bart, Meinkoth, 197а). Для Пражского штамма вируса саркомы Рауса, относящегося к подгруппе С, нашими соавторами (Hlozansk «t ai.,1979) была показана способность трансформировать утиные эмбриональные фибробласты, но его продукция в этих клетках била незначительна. К 6-му пассажу на этих клетках титр "адаптированного" вируса, однако, возвращается почти к его уровню на куриных клетках, достигая плато, которое удерживается при дальнейших пассажах. Различия медцу исходным и "адаптированным" рг-rsv-c наблюдаются также в эффективности трансформации: первый трансформирует утиные клетки через 15-17 дней после инокуляции, второй - продуцирует трансформацию всей клеточной популяции через 4-5 дней.

Свойства рг-rsv-c, обусловленные гликопротеином оболочки, не

изменяются при его "адаптации" к утиным клеткам (Hlozanek et ai., 1979). В то же время имеются значительные различия в трансфекцион-ных свойствах ДНК из утиных клеток, трансформированных исходным Pr-Rsv-c или после его первого пассажа на утиных клетках, и ДНК из утиных клеток, трансформированных "адаптированным" рг-rsv-c, т.е. после 6-го и далее его пассажей на утиных клетках. Если в первом случае не удается получить продукцию инфекционного вируса, то во втором регулярно получается положительная трансфекция.' Описанные различия можно было бы об"яснить отсутствием или запозданием соответствующей интеграции провирусной ДНК в первых пассажах на условно пермиссивном хозяине, низким числом интегрированных копий или изменениями в вирусном геноме.

Материалы и методы. Фибробласты II-дневных эмбрионов уток полуин-бредного выводка уток Khaki-Campbell (def), имевшие фенотип 0/ABDE, выращивали как описано (Rynditch et ai.,1986). Контрольные клетки цыпленка (СЕР) брали ИЗ куриных эмбрионов Brown-Leghorn С фвНОТИ-по;и С/Е (Hlozanek, svoboda, 1974). В работе использовали клонированные вирусы рг-rsv-c И daPr-RSV-c (Hlozanek et al.,1979).

Клеточную ДНК расщепляли различными рестриктазами, подвергали электрофорезу и после блоттинга гибридизовали на фильтрах с зондами (Рис.1). Выделение вирусной РНК, синтез на ней кДНК с помощью ревертазы вируса миелобластоза птиц и гибридизацию в растворе проводили, как описано (Rynditch et al.,1986).

Геномную библиотеку утиных клеток, трансформированных dapr-rsv-c после 30-го пассажа на утиных эмбриональных фибробластах, получали с использованием в качестве вектора ДНК бактериофага X емвцз, обнаружение рекомбинантных фагов, субклонирование вирусспецифичео-ких последовательностей, рестрикционный анализ проводили по общепринятым методикам (Маниатис и др., 1984). Нуклеотвдную последовательность определяли по Максаму-Гилберту в модификациях Коробко и др. (1978 ), Чувпило и Кравченко (1983). Метку ^Р вводили с помощью обратной транскриптазы вируса миелобластоза птиц, достраивая укороченный з'-конец дс кДНК после расщепления соответствующей рес-триктазой. Здесь и во всех остальных случаях С получение кДНК-кло-нотек, синтез кДНК-зовдов, определение нуклвотидной последовательности по Сэнгеру) мы использовали ревертазу, которую выделяли по разработанному наш регламенту (ТУ 6-09-50-2481-87 ). Ко времени начала этой работы многое в.реакции обратной транскрипции было не-

UR i----gig—I----pel — i—ел»—!—src—lcHTR

pATV-l

рбц L

pPoll

pPo! 2

pPoI-env

pEnv

pSrcllJ

pSrc

pSrc II

pSrc 14

pLTR

LTR »»»•» \

piES-l p8D-FM BS9 pN-ras Hi-Hi-3

Рис. I Гибридизационные зонды, полученные и использовавшиеся в работе.

A. pATV8 - ПОЛНЫЙ ПрОВИруО Pr-RSV-C В pBR 322 (Katz et al.,1982)5 pGag -Bam HI/Bam HI фрагмент (фр.) pATV-8 В pBR 322; pPoli-EcoRl/Kpnl фр. Рг-RSV-C В pSM804 (Svoboda et al., 1983); pPol2-Bam HI/Baro HI фр. pATV-8 В pBR 322 (Ge-ryk et al., 1986); pol2 -BamHI-BamHI фр. pPol2; pPol-env-Kpnl/EcoRI фр. Pr-RSV-A В pSM804 (svoboda et al.,1983); env-XhoI-Slal фр. pATV8; pSroU3-фр. ОТ ATG sre до EcoRI-сайта Pr-RSV-A в pBR 325 (Gilmer et al.,1982);

src-EcoRI-PvuX фр. pSrcU3; pEnv-XhoI/XhoI фр. pATV-8 в pAT153 (3.Svoboda); pSrc-EcoRI/EcoR^p. SR-RSV-A В pBR 322 (Svoboda et al.,1983); pSRC14-SacI/PvuII фр. pATV-8 ВpBR 322 (Geryk et al.,1986); pSrcll-PvuIl/PvuII фр. pATV-8 в pBR 322 (Geryk et al.,1986); pLTR-Haelll/HaelXI фр. pATV-6 в pBR 322 (R.Gun-taka); LTR-EcoRI/EcoRIфр. pPrCLTR (Амбарцумян И Др., 1984 )> В. pYES-l-Pstl/Pstl фр. Y73 (v-yes) В pBR 322 (Kitoraura et al., 1982); pBR-F04-BaraHI/BamHI фр.FCV-2 (V-fps)B pBR 322 (Shibuya et al.,1982); BS9-BglI/SalGI фр. v-Ha-ras в pBR 322 (Ellis et al.,1980); pN-rae-полноразмерный N-газ Человека В pAT153 (A.Hall); Hi-Hi-3-HincII/HincII фр. Ki-MuSV в pBR 322 (Ellis et al.,1981).

ясно, и первые наши эксперименты были, посвящены поиску оптимального источника обратной транскриптазы, разработке технологии ввделения этого фермента, а также условий получения полноценного кДНК-продук-га. Результаты этих совместных исследований подробно отражены в

диссертации В.М.Кавсана (1985 ) и соответствующих публикациях.

Трансфекцию клонированной провирусной ДНК клеток сер и def осуществляли модифицированным методом (Graham et al.,19731 wlg-ler et al.,1979), как описано (Hajkova et al.,1982). Вирус с00и-рали через 8 недель после трансфекции def или через 3 недели после трансфекции сер и его титр в ФОЕ (фокусобразующие единицы ) на I мл среды определяли согласно svoboda et al. (1968). Результаты и их обсуждение. Для выяснения молекулярных различий в геномах "дикого" рг-rsv-c и его "адаптированного", хорошо реплицирующегося в утиных клетках варианта (daPr-nsv-c), прежде всего было необходимо сравнить гомологию их геномов. Оказалось, что различия, полученные перекрестной гибридизацией в растворе геномных РНК вирусов Рг-rsv-c и dapr-Rsv-c и синтезированными на них % кДНК (рис.2 ), составляют около 10$. Это значение отвечает различию между вирусными геномами примерно в 1000 н. и, как будет показано ниже, обусловлено накоплением td-мутанта при пассировании dapr-Rsv-c.

Рис. 2 Перекрестная гибридизация вирусной 35S РНК с кДНК: а - 35S РНК рг-rsv-c с синтезированной на ней кДНК; в - 35S РНК dapr-Rsv-c с синтезированной на ней кДНК; с - 35S РНК рг-rsv-c С кДНК daPr-rsv-C| d - 35S РНК daPr-rsv-C С ЦЩ1К Pr-rsv-C.

---1--1--г -г-

10-S Ю-2 Ю"1 10°

В другой системе (линия куриных лимфоидных клеток msb-i из опухоли, индуцированной вирусом болезни Марека ) репликация RSV также не имела места. В этом случае происходило проникновение вируса в клетку, однако, синтезировавшиеся вирусспецифические ДНК не интегрировали с ДНК клеток и исчезали через 2 дня после инфекции («•imán et al.,1978). в наших экспериментах, где эмбриональные

утиные фибробласты заражали рг-кэу-с, интеграция провируса с ДНК клетки-хозяина происходила уже на первых пассажах. На отпечатке электрофореграммы фрагментов, полученных гидролизом клеточной ДНК различными рестриктазами, мажорными обнаруживались только внутренние регулярные фрагменты провируса. На рис.3 для примера показан результат такого опыта с одной из использовавшихся рестриктаз.

Рис. 3 Гиоридизационный анализ провирусных последовательностей рг-rsv-c в ДНК утиных эмбриональных фибробластов. Гидролиз Ecori: /1/ DEF-0 - без заражения (отрицательный контроль)j /г/ def-i -через 72 ч после заражения (клетки еще не трансформированы ) s DEF-itr то же, что /2/ через 15 дней после инфекции (клетки трансформированы); /4/ 0EF-30 - 30—й пассаж вируса через 72 ч после заражения; /5/ ХС - клетки, имеющие 20 копий провируса (положительный контроль).

Количество копий провируса, определенное с помощью денситомет-рического анализа, не отличается существенно на 1-м и 30-м пассажах рг-rsv-c на oef и равно около 5 на клетку. Оставалось возможным, что какие-то изменения в самом геноме исходного ретровируса способствовали его адаптации к новому хозяину. Для выяснения этого предположения был получен банк нуклеотидных последовательностей oef, трансформированных dapr-Rsv-c после 30-го пассажа на этих клетках. Скрининг банка с помощью patv8 в качестве зовда позволил обнаружить рекомбинантный фаг Л DF3 со вставкой, включающей последовательность полного провируса. Эта ДНК была инфекционной, в отличие от ДНК A. 0F7 (см.Раздел 2 ). что показано трансфекцией С/Е эмбриональных фибробластов курицы.

На рис. 4 представлены нуклеотвдные последовательности транс-формационно-активного варианта рг-rsv-c, адаптированного к def после 30 пасоажей. Сравнение с рг-rsv-c, сиквенированным Schwartz

12 3 4 5

бСМТПГЙССЛТТСАСсШтВтбТВСАССТАбВТТбДТебСИбДССбТСбйТТСССТАЙСВАТТбСбйИАсЬбАЙТВййбСАВ 90 (1)

..................................6..............................................................................................................(2)

----------------------------------5—ft-----ft-A......T--G..................................................................(3)

йА6В:ПСйТТтЬгаСССС6АС6ТВЙТС61ТйВ6ВЙЙТА6Т6ВТС6ВССАИВЙС66С6166СВАТССТ6СССТСАТСс6!?...... (11

.............................A........................................................................................................121

.........................................................................................................................................................................(3)

вб1ййВВЙА6СССВАС6АСТ6А6САВТССАССССАВ6СВ16АТТСТ6ВТСБСКВ6Т66АТСААВСАГИййВССВГИГЙЙЙ6ВТ6ЙГТ 403 (1) .......................................................................................... (2)

TCGTCCBCGT&TAAAACCTATTBCGSGAAAACCTCTCCTTCTAAGAAS6AAATABB6BECATSTTBTCCCTCTTACAAAAGBAA6BGTTG 153 II) .......................................................................................... (21

CTTATGTCTCCCTCftSACTTATATTCCCCGGSGrCCTGGGATCCCflTTACCGCG6CACTCACCCfiGCGGGCAAT6GTACTTGGGAflATCG 583 (t) --------------------------------------------------------6„M..........J—A-------------- 12)

СВАВА6ТТАААААССТ6ВЕВАТТЕВТШЕБВВВШГЕАА66СВВСТСЕА6АВВААСА6ВШСАГСТВАВСАА6САААВТГТ?ВВ7Г6 473 (I) .......................................................................................... (21

GGATTAG6GGGAGGSA5GGiCTCTCCCCCAGGTCCGGfiGTGCATC6AGAAACCA6CAAC6BASCGGCSfiATCGACAAGGGGGAGGAAGIG 763 111 .............................................................................A------------ 121

66ABAfifiCAACT3T6CABCBA6ATBC6AAGAT6GC6CC66fiSGAAACBBCCACACCTAAAACC6ITBSCACflICCT6CTiTCÀ!î..... II)

................................................................................... (21

АТГгвАйгастгАААВвгтпбЕсввйгебйАТббГгбвсАйталвбвгсАВйгшггйггАйвйавввевААгтбвтггем MW Ш

-------------------С—ñ--C-----G-----G.....С—С—.......С------------------------------- 12)

TTACfiGCSTCSGCTCICCASBCBiriASASASSICBCCCSSTISœAArmCASACCCBTBGSCBSACAICATBCABSSACCAICTB 15S0 (Ii ----------------------------------j------с----------IE—ET—ß---------------------------- (2)

AGÎCCTTTGTTGATTTTECCAATCBBCTIflTAAABGEGGTIGAGGGGTCflEATCTCCCGCCTICCECGCGBGGTCCEGTGAICATTBSCT 1670 II) ------------------------------------------------------------------------------------------ (21

BCTTTAG6Cfl6AASTCACflGCCASArATrCA6CA6CirATfiCGBGCAGCACCCTCCACBC:BACCACCCCflG6Â6ASflTAATCAAATAT6 17¿0 (1) --------------------------------------------й-------------------------------------т------- (2)

T6CTAGACAB6CAGAAGACTGCCCCTCTTACGBATCAÂBSCATAGCC6CGGCCATGTCBTCI6C™CCAGCCCTTAGITAT6GCAGTAG 1850 (I) -----------------------------------------------------------------------------д------------ (21

TCAATfiGAGAGAGGGATGGACAfiACTGG6TCGG3TGGÎCGrGCCCGAGflGETCT6CÎACACTT6TGGAÎIXCC6GBACftTTATCABEC6C 1940 11) ................................................G----------------------------------------- 12)

AST6CCC6AAAAAAC6BAASTCA5SAflfiCASCCBI6A6CBAT6ICABTI6TfiTÂAKSBAI6GSACACAACfiCTAAACABJ6TABBAA8C 2030 (1) ------------------------------------------------------------------------------------------ (2)

GGGflTGGCflACCfiGGGCCAACGCCCAGGAfiBAG6TCTCTCTTGGGGGCCBT6GCCCGGCCCi6AGCCACCIGCCGTCTCGlTflGCGATGA 2120 111

------------------------------S----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------12)

CAATGGAACATAAAGA7CGCCCCnGBTTAGGGTCATÎCIGACTAACACTGGGAGTCATCCGGTCAAACAGCBTICGGTGTATATCACCG 2210 111

------------------------------------------------------------------------------------------ (2)

С A О Об CA АО

CeCI37766ACrCIGGAGCGGACArCACTATrA7TTCAGASGA5GATTGGCECACCGA7TGG£CAE76AI£GAE6CCGCGAACCC6CABA 2300 11)

----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------121

489?

CGAATAGAGACASGGGABTGGGAAAAAGGAT6GAACGTGCÎGGTCTGGGGACGAGGITATGCCGCTG7GAAAAACAGGGACACTEATAAG <936 11) --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------(2)

GTIATTIEG5ÎÀCCEICTCGAAAA6TTAAACCEGACflTCACCCAAAABGATSAGGTGACTAft6AAAGAIGAGGCGAGCCCTCTTTrrGCfl 5076 111

------------------------------------------------------------------------------------------ (2)

---------------------------------------------------------------------------------------- 13)

GCCÀfTTCTGACTGGATACCCÎGEGÂAGACGAGCAAGAAGGACTCCAABGASAAACCGCTASCAACAAGCAAGAAAGACCCGGAGAABAC 5166 11 I

--------------------------------------------------------------------------------------- (2)

-------------------------В----j--------------------------------------------- 13)

■газ

AGCCITGCTGCCAACGAGAGTTAATTATATTCTCATTATTGGTBTCTTSBTCTTBTBTGAGSTTACSGGGGTAAGAGCTGÂTBTICACTT 5254 Ш

----------------------------------------------с-------------------------------------- 12)

---------------------------------------------С--------------------------------С--- (3)

ACrCGA6CAGCCAGGBAACCTTTGGArrACATGGGCCAACCBTACASSCCAAACSGATTTCTBCCTCrCTACACASTCAGCCACCTCCCC 5Ш (II

--------------------------------------------------------------------------- (2)

----------------------------------------------------------------------------- Ш

TTTTCfiftftCfiTBTTTSftifiGGTfiTCCCGIETCCVftTTlCCSfifiSGTGftTTTTftfiSBGATfiTSTTTCTGfiTfiCfiftftTTBCTCCfiCTGTEGQ 5434 11)

....................................................................................................................................................................................(21

............-.................С--------------------------------С---------------А----CT—- (3)

flflCTGftCC6GTTft6TCTCGTCfl5CCfteCftTTflCCGGTEBCCCTBftCaflCABCecCftCCCTCflCTTflTCGaAftfiSTTTCflTBCTTeCT57C 5526 (11

.................I..................С...............й...................Ii---------и------1 (2)

............-..............-........С---------------А------------------------------------7 (31

AflAGCTEAATGTC:CTAT6TGGGAT6A6CCACC6EAACTACAGCT6CTaS6TTCCCAGT^CCCTAflCGTTACTflACATTACTCASGT 5414 (1)

.........С.....С.................Г.....G.................................................. (21

—...................................................................й-------Т---------й- (3)

CTCTGGCGTGßCCGGSGGfiTGTSTÄTATTTCGCCC 5703 (1)

...........................-.............................v............................. (21

Г-----Т--ЙЙ..........C---S5C.........СИГ—A-CMASTG-S-C-C-G—SBCCGSAS-CAGG-TA-S-ACAA (3)

CCTCCTCCGTCACCCC"""".......TTTACCTCCACCTCTAACTCCACu¿AflCCGTTCAi:6GTGGT6ACAGCB6ATAGACACAA 577В (I)

_____________....................

-7--T-GA7CGC—GTGGGTCAATCCÍT7C----А-ЙЗ-5-Т--------------------T--------------------8----- (3)

TCTTTÍTSTGG6GfiGT6flG7fiCTGÍGGTGCATAÍGG:TACAGATTÍÍGGGflAATA7fiTAfiCTGC7CMmCTfl6G"4!ñT""'"AC 535? (1)

----------------------------------------------------------------------------12)

.............-..........С—.................................T--------C-GAT7TGA7—T7TGA7-T (3)

TTACC6CTGT66AGaC6T66GfiBG7ACT"""GSCCTCCCTGAAACCT66I6CASABGaAAAGGeGGTATflT6G6TTAATCAATCAflA 5943 (11

............................""-------------------------------------------------------- 12)

—-AC.........T—СА6АСЙ8ТС*"'"АААТС--С----АЙСЙ—IG7G—GGG--------------------------- (31

GGftftftTTAA76AGACAGaGCCGTTCflGT77TflCTGC3hACT67ftCAôCTAGTAflT77GGG7flflTGTMC5SA7GTTGTGMflAAC6AC 61)33 (1)

---------------------------------------------í-óC-----------------------------C-H-H (21

.........................................................................................T (3)

CAC6flTTCTCCCfl7CA6GGGCGTbGATCGfiCAECflfiGCflAGG7flGTTTCflC7flAACCAAftfiGCGCTfiCCflCCCGCAA7T7TCCTCATTTG 6123 (1) -------------CI------fi-----------j_c------------------------------------------------------ l2)

------------------------6.........H--------------С----------------------------------------------------------------------------13,

TGGGGATCGCGCA7GGCflfiGGftfl77CCCAG7CG7CCG3TflGGGGGCCCCTGC7flT77flGGCñfiGCTTACCA7GTIAGCflCCCAACCAIAC 4213 (1)

----------------------------------------------------------------------------------------- 12,

................................................................С--------------T-------- (3)

О» О С A i-f> GP3T

AGA7CT7C7CfiAflA7ACTTGC7AGTTCG7CGCGGflCAGSTATAAGACG7AAACGflflGCGTC7CfiCflCCTGGflTGATACATGCTCAGAI6A 6303 (1)

----j------------------í---------------------------------------------------------------- (2)

.... д-------E3.s-----c-A—А----------------------------А-АС-Б---------------------------- (3)

AG7GCAGCT77G8GG7CCTAMGMGflftTC7TTGCftTCTATCTTAGCCCCGGG6G7ASCAGCTGC6CAfiGDCTTAAGASAflA7TGAGAG 6353 (1)

-«-------------------------------------------------------------------------------------- (2)

--------------------------------------------T------------------------------------------- (3)

ACCfiGCCTGT7GGTCCGT7AAACfiGGC7AACTTGAMMTCflCTCCTCGG6GACTTATTG6ATGftTGTCflCGAGTflTTCGflCflCGCGGT £483 (1)

------------------------------------------------------------------------------------- (21

Т-Т------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------,3,

CCT6CA6AflCC6fl6CEGCTATTGftCTTC77GCTTC7ABCTCACGGCCAT6GCT6TBASGflCGTTGCC6SfifiTSTBTTG7TTCAflTCTGfl5 6573 (Il

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------(J)

--------------------------------С--------------------------------------------------------------------------------------------------------------и,

ТШСЙСЙ6Т6АЙГСТАТАСЙВДЙ6ЙЙ6ГТССЙВС7ЙЙТЕЙАВЙЙЙШ6ТШТАД6АТ1Ж6ТВБАСЙ6С6АССШТСВВАЙВТТ6 6643 (1)

-G------------------------------------------------------------------------------------ (2)

-G----------G------------------------------G------------------------------------------- (31

6C7GCGflGGGA7ATTCGGSGGflATABGGGflfl7GGGCCGTiCATC76CIAflflfl56AC7SCTTIIG6GECTIGTfl8TIATTTTATT6CTflGT 6733 ( 1 )

----------------------------------------------------------------------------------c_ (2,

---------Ht-----A---------.------------1--Б-------------------------G------- (31

АВТ6Т6ССТ6ССТТВСШТТДСААТТТ6ТБТСТДБТАЕТАТТС6ЙАА6АТ6АТТААТА6ТТСАЙТСАЙСТАТСАТАСТ6ЙАТАСА86АА 63*3 <1I

6—----------------¿-"¡¡"™"c------------------Ü-------g-----------—— (21

GATECflEGECGEAGCAGTCTftEAGCTCAETIAlAATfiflTCCTGCSAATCEGGCTBTÀACGGESCAftEECTTGACCGAGGGSACTATAÂèA 6933 (11

---------------------------------------------------------------- ,2)

-î----AAAG-CTT61A6SC~CC-EA-AA-6G-6C-B-61AAAGCABTA........................................ (3)

T CT D«l <-l

T6TAT№BCGAAeA6C6G6STCTC66TTeTAAC6C6CTTAB6Afl6TCCCCTCGA6STATG6CA6ATAT6CTCTT6CATA5B6B6AAAAAA 7023 Ш .......................................................................................... (2|

TGTASTCTTAATATT6TCTSTSTGCT6CAG5ASCTIAGCTGACTCT&CTAGTSGCCTCGCSTAACACTB7GSCCAGGC6BTASCT68SAC 7113 (I)

...................................д.............S.............с....................................................,21

«"С I — >

GT6CASCC6ACCACCATG866AGCA6CAASAGCAAGCCCAGSSACCCCAGCCASCGCCGGCACAGCCTeGft6CCACCC6ACAGCACCCAC 7203 (

CACGGSSGArTCCCflSCCrCGCAGACCCCCGflCGASACA6CAGCCCCCGfiCGCACACCeCfiflCCCCfiSCCSCrCCTîC6fiGACCGTGSCC 7293 (

............................................................................................................................................I

flCCGflSCCCAÄECTCTTCrGGGGCITCAflCACTTCTGflCflCCGICflCSTCGCCGCflSC6TSCCGG6SCftCT6GCTESCBSCGTCACCACT 7383 I ..............................................................................................................................................................................I

ITCSTeGCTCTCTACGACTACGAGTCCTGSACTGAAACGGACTTGTCCTTCAAGAAAGGAGAACGCCTGCAGATTGTCAACAACACGGAA 7173 (

GGTTACTSGTG6CTGGCTCATTCCCTCACTACASSACA8ACGGGCTACATCCCCAGTAACTAT6TCGCGCCCTCA6ACTCCAICCAGGCT 7563 I

-6...................................................................................... (21

GAAGAST6STACTTTEGGAASATCfiCTC6TCEGGAGTCCBAGCGSCT6CTGCTTfiftCCCCGAAflÄCCCCCGGGGAACCTTCTTSGTCCGG 7453 ( .......................................................................................... I

AAGABCGAGACGGCAAAGGGTGCCTATT6CCTCTCCGTTTCTGACTTTGACAACGCCAAGGG6CCCAATBT6AAGCACTftCAABATCTAC 7743 I

12)

AAGCÎSTÂCASCGGCCGCIÎCTACATCACCTTACGCACACAGIICG&CAGCCIACAGCAGCTGSÏGGCCCACTACTCCAAACATSCTGAC 7833 I

..c-------------------------------------j-------------------T (2)

в6СПеТ6ССАСС6ССТ6АССААС6ТСТБССССАС8ТССЙА6ССССАБАСССАБВБАСТСВССААБеАС6С6Т666АААТСССССВ6БА6 7923 I

12)

TCGCIACBeCT66ASSCGAASCTB5GGCABGGCTGCTTIGeAGAG6ICT6GAT6EGGACCIGfiAACBSCACCACCAGA6TGBCCAIAAAG 6013 I

-A--------------------------------------------121

ACTCïGAAGCCCGGCfiCCATGTCCCCGGAGGCCTTCCTBCAGGAAGCCCAABTGfiTGAflGAABTTCCGGCATGftGAfiGCTGGTTCflGCTG 8103 I ---------------------------------------------------------------c------------------------- 121

TftCSCAGTGGTGTCGSaAGAGCCCATCTACATCGTCATrGAGTflCATGflSCAAGeSGASî:CTCCTEGATTrcCT6AfiGeSAGÂSA7fîGGC 8193 I ------------------------------------------------------------------------------------------

AAGTACCT&C6GCTGCCACAGCICGTCGATATGGCTGCTCAGATTeCATCCGGCA1GGCCTATGT&GAGAGAAI6AACTACGT6CACCGA 8283 I

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------I;

GACCTGCGGGCG6CCAACATCCTG5TESGGGA&AACCTGGTGTBCAAGGTGGCTGACTTCGG&CTGGCACGCCTCATC6AGGACAAC6AG 8373 1

) 121

)

12) )

(2)

TATAMGCACGSCAAEGTeCCAA&TTCCCCflTCflñGTEGflCA£CCCCCCflGDCflGCCCTCTATGGCCeGTTCA¡:CATCfiAGTEGGflTGTC 8)43 I ■-C--------------------------------------------------------------------------------------- 12)

TGGTCCTTCGGCATCCTGCTGACTGfiGCTGACCACCflAGGGCCSGGTGCCATACCCAGGGATGGTCAACAGGGfiGGTECTGGACCAGGTG B553 I

(2)

GÄaASGSfiCTflCCSEfiTSCCCTECCCECCCSÄErECCCnGASTCGCrECATGiECTCÄTEIGCCflSTECTBSCGEAfl............. 8443 I

----------------------------------------------------------------------------- (2)

ИН7Э DR2 <—I AO

TAGGAATCCCCTCAGGACAATTCTGCnGGAATATGATGGCGTCTTCCCTGTTTTGCCCTTAGACTATTCAGGTTGCCTCTGTGGATTAG 8944 (1) ------------------------------------------------------------------№------------------ m

)

GGCTSGAGGCAGCACGGATAGTCIGATGGCCfiAATAfiEGCAGGCAAEfiCAGCTATTTSTAfiCrGCBAAATACGCTTTTGCATflGSGAGBG 9054 (

*5АЛвГ6ТШС1ИгеСМГАСТССГ6«61С1Тест1ВС1Гй167ШЛ1ШГМ6И«ШШГйСМ6Ш(16йДМвв 9144 <

----------------------------------------------------------------------------------------- (21

...-------AA~AG-GCCAGAGGCA-CCÏGAAT-GTC-AAAG-CCA--TA-6--AAA-----6-CATTCC-T-T-CTC-TTS6T-- 13)

CACCGÎGCATECCGAÎTGGTGGTGGTAASGTGGTACGATCATGCCTTATTAGGAAGGTATCAEACGGGTCTAACAÎGGATTGGACGAACC 9234 I1)

------------------ц----------------s---------------------------------------------- (21

-EA-TA5ATO5GA-Î6AS--AC-CA-6-ACATAT6-GCGIA-A-6A-GCTATBTACG—T-T-1AA-CI6IT6CCACCA-CAV**M" 13)

V tt tATktUI U1 <•!•> n

ACTGAATTCCGCAICGCAGASATATTGTATTTAASTGCCTAGCTCEATACAAIAAACSCCAÎTTTACCATTCACCACA 9312 I

(2)

(2) (31 .

Рис. 4 Нуклеотидная последовательность daPr-Rsv-c, вдоль которой указаны различия в рг-rsv-c (буквами над последовательностью отмечены различия при определении первичной структуры кДНК рг-rsv-c, Schwarz et al.,1983); третья Строка - раЗЛИЧИЯ В rav-0 (Bova at

al.,1988);........- нерасшифрованные участки;._■ снизу показывает

возможные участки рекомбинации с rav-o.

et al.(1983), выявило консервативность большй части их геномов. На протяжении около двух тысяч сиквенированных нуклеотадов ltr и репликативных генов gag и pol имеется лишь 13 замен, из которых в нетранслируемых районах 6,5 - молчащие, а еще 2 приводят к консервативным замещениям. Иное дело ген arc. Зцесь в 1500 сиквенированных нуклеотцдах тлеется 10 замен, из которых 3 молчащие, I приводит к консервативному замещению, а 6 дают неконсервативные замещения: Asp 117-»-Туг, Ser216—Leu, Tyr229->-Hist А1а242ч-ТЬг, Asp288—Gly, His416—Tyr.

Основные различия в собственно ретровирусных генах обнаружены в гене env. При этом участок гена env, кодирующий др37 также мало иаменился: в daPr-Rsv-c здесь имеется 5 замен по сравнению с рг-rsv-c, из которых две приводят к неконсервативному замещению (Leu43—pro, Азрюз-*-Туг) и не затрагивает ни одного из 3-х консервативных сайтов гликозилирования по аспарагину, ни гидрофобного участка молекулы, обеспечивающего заякоривание др37 к вирусной оболочке (Hunter et al.,1983).

Значительно больше замен в гене env наблюдаются в домене, кодирующем дрв5, распределение которых чрезвычайно неравномерно. Подавляющее их большинство сосредоточено в двух кластерах (на рис.4 подчеркнуты), дивергенция в которых составляет белее 10$, в то врет как на протяжении других участков дрв5-домена, она всего около 1%. Кластеры дивергенции da-вариантов рг-rsv-c не совпадают с обнаруженными ранее вариабельными участками vr2, hri, hr2, определяющими, как предположено оогпег и coffin (1986), субгрупповую специфичность вируса. По-видимому, это обстоятельство обгоняет сохранение принадлежности рг-rsv к подгруппе С после длительного его пассирования В УТИНЫХ клетках (Hlozanek et al.,1979), несмотря на обнаруженные изменения в структуре env гена. Причиной дивергенции отмеченных районов, как показало сравнительное изучение нуклеотвдных последовательностей вирусов саркомы Рауса, относя-

щихся к разыьм подгруппам, могла быть рекомбинация с соответствующими районами ретровируса подгруппы Е (кау-о): на участке 97 н.п. из 14 замен в ¿эРг-яву-с 13 совпадают с изменениями в йлу-о. Кроме них на этом участке в (?ау-о имеется только одна замена. Еще 6 замен на участке в 113 н.п. полностью совпадает с И на

этом участке, кроме отмеченных, больше нет никаких различий.

Замены в др8 5-домене гена епу в II случаях приводят к замещениям аминокислотных остатков, из которых только два консерватив-ныз. Из неконсервативных замещений 4 находятся в вариабельном районе угЗ. Еще 2 замещения нарушают 2 из 14 сайтов гликозилирования.

По-видимому, адаптация онкогенннх ретровирусов к новым хозяевам имеет сложный механизм, обусловленный не только изменениями гена епу. Не исключено, что мутации в других районах вирусного генома принимают участие в этом процессе, как например, возможные изменения в организации дад-последовательностей, способствующие репликации всего вируса. Окончательные доказательства можно будет получить в экспериментах с искусственным введением соответствующих мутаций, определенных в нашем исследовании, с последующей трансфек-цией такими мутантами утиных и куриных эмбриональных фибробластов. Во всяком случае, первые эксперименты в этом направлении ( Табл.1 ) указывают на то, что с)а-маркировка (свойства иэу, характерные для его адаптированного к оея варианта) кодируется провирусом ааРг-кзу-с, нуклеотвдная последовательность которого отличается от рг-кбу-с, как показано на рис.4. В трансфекционных экспериментах полный провирус аарг-ргзу-с, клонированный в составе гибридной плазмиды орз, бьш столь же эффективен как и суммарная ДНК оер, трансформированных этим вирусом и значительно выше, чем ДНК оер, трансформированных Рг-ЯЗУ-С (Шогапек а1. , 1979).

Таблица I

Репликативная активность молекулярно клонированного "спасенного" трансфекцией вируса <)аРг-Р!ЗУ-с

Трансфицированные Титр вируса. определенный на клетках

клетки сер о ея

оея 6,3х105 1,45х105

сер 0,53х105 0,15хЮ5

Раздел 2. ОБРАЗОВАНИЕ td-МУТАНТОВ ВИРУСА САРКОМЫ РАУСА Введение. Ген src не является необходимш для репликации Rsv. Интенсивно накапливающиеся в нем мутации практически не дают возможности получить вирусные стоки, не содержащие нетрансформиругацие частицы в качестве мажорного компонента (ouesberg, 1985). Такие мутанты могут тлеть температурно-чувствительные (ts) дефекты трансформационной активности, которые обусловлены малыми ( точечными) изменениями src-гена, либо безусловные трансформационные дефекты Сtrd) в результате обширных делеций в этой области (vogt, 1977).

Новый нетрансформирунций мутант (td daPr-Rsv-c) был получен разведением пула вируса саркомы Рауса ( Пражский штамм, тип С ), "адаптированного" к утиным эмбриональным фибробластам и способного трансформировать эти клетки (Geryk et al.,1980). как будет показано в разд.З этот td-мутант после инфицирования куриных эмбрионов восстанавливал сбою трансформационную активность. Материалы и методы. В разд.1 описано получение библиотеки геномных последовательностей эмбриональных утиных клеток, трансформированных "адаптированным" после тридцати пассажей на таких клетках вирусом саркомы Рауса (daPr-Rsv-c). Скрининг библиотеки для поиска де-леционных td-мутантов rsv осуществляли с помощью зовдов: patv8 (гибридная плазмида, включающая полный rsv-прозирус), pGag, ppol, psrc (фрагменты "gag", "pol" и "зге", субклонированные в составе раязггь

Результаты и их обсуждение. Всего из примерно одного миллиона ре-иомбинантных фаговых клонов, которые были проверены на содержание Rsv-специфических нуклеотидных последовательностей, десять дали юложительный сигнал. Как показывает расчет, это примерно соответствует десяти копиям провируса на ядро утиной клетки, трансформиро-)анной "адаптированны:/," к утке Rsv. Хотя хр нически инфицирование клетки содержат, часто только интегрированные провирусные копии, :ем не менее, неинтегрированная ретровирусная ДНК также может об-гаруживатьоя в этих клетках (varmus et al.,1984).

Первоначальное картирование рекомбинантных бактериофагов выя-1йло спектр размеров провирусных вставок, но из семи исследованных ¡олев подробно, только один содержал вставку, соответствующую раз-юру полного провируса (Разд.1). Остальные шесть включали дефект-:ый провирус с удаленной последовательностью гена src. ДНК из этих

CGAA7AGAGACAGGGGAG7bGSAAAAAG6A16GAAC676CT6G7C7GGGGACGAGG77A7GCCGC7G7GAAAAACAGGGACAC76A7AAG 49В4 (11

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------(2)

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------,31

GIlAIIIGG^ÎÂCCCTCTCGAAAAGTTAAACCGGACATCACCCAAAAGGATGAGGTGACIAAGAAAGATGAGGCGAGCCClCItTITSCA S07¿ ( 1 )

.......................................................................................... 12)

.......................................................................................... (3)

GGGÂTlîcÎGACTGGATACCClGGGÂAGACGAGCAAGAAEGACICCAAGGAGAAACCGCrAGCAACAAGCAAGAAAGACCCSSAGAAGAC 5144 11)

------------------------------------------------------------------------------------------ ,2,

.......................................................................................................................................................................13)

враз

ACCCTT6CTGCCAACGAGAGITAATTATATTCICATTATTGGIG1CCTGGTCnGTGTGAGBtTACGGGGGrAASAGCr6ÂrGirCACrr 5234 ([I

...............................................1........................................... 12)

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------,3,

AC7CGAGCAGCCAGGGAACC777GGA77ACA7EGGCCAACCG7ACAGGCCAAACGGA777C76CC7C7C7ACACAG7CAGCCACC7CCCC 5346 (1)

.......................................................................................... (2)

.......................................................................................... 13)

1777CAAACA7G7I7GA7AGGIA7CCCGTC7CC7A777CCGAAGG7GA7T77AAGGGA7A76777C7GA7ACAAA77GC7CCAC7G7GSG 5436 I!)

.......................................................................................... 12)

.......................................................................................... (3)

AACTGACCGGTTAGTCTCGTCAGCCAGCATTACCGGTGGCCCTGACAACAGCACCACECTCACTlATCGABAAGniCAIGCTTGCTGlC 5526 (I)

----------------------------------------------------S-------------------6----------------------------------12)

.................7------------------С...................................G---------С------7 (3)

AAAGC7GAA7G7C7C7A7GIGGGA7EAGCCACCGGAAC7ACAGC76C7AG677CCCAG7C7C7CCC7AACG77AC7AACA77AC7CAGG7 5616 (1)

------------------------------------------------------------------------------------------ 12)

---------С-----С-----------------Т-----G-------------------------------------------------- (3)

пстёзсбтаотЖ^^^ 3703 ш

................................................."---------'----------------------------- 12)

-------------------------------------------------«---------»----------------------------- (j)

CCrCCrCCGTCACCCC»"""""""I7!ACCTCCACCTCIAAC7CCACGGAACCGnCACGSIGG7GACAG:GGATAGACACAA 5778 I1 )

7m777A7GSGGASÎGAGÎAC7G76G76CA7A7GGC7ACAGA7777GGGAAA7A7A7AAC7GC7CACA6AC7AGG*"AA7"""AC 585? (1)

----------------------------------------------------------------------------|2,

---------------------------------------------------------------------------->«—>»>".. (3)

77ACCGC7G7GGAGACS76GGA6G7AC7"""GGCC7CCCÎ6AAACC76G76CAGAGGAAAAG6AGG7A7A7GGG77AA7CAA7CAAA 5943 (Il

----------------------------•»•»-------------------------------------------------------- (2)

---------------------------->•»••-------------------------------------------------------- 13)

£GAAA77AA7GAGACASAGCCG77CAG7777AC7GC6AAC767ACAGC7AG7AA7776GG7AA7G7CAGCG6A7677G7GGAAAAACGAC 6033 (I)

----------------------------------------------------------------------------------------- (2)

---------------------------------------------Т-БС-----------------------------С—6-C-A-T (3)

CAC6ATrC7CCCA7CAG6GGC67GSA7CGACA6CACACAAGG7AG777CACCAAACCAAAASC6C7ACCACCCGCAA77T7CC7CA7778 6123 (1)

-----------------------------------AG--------------J------------------------------------- (2)

------------C7------A-----------T--G--------------7------------------------------------- 13)

7G&G6A7CGCGCA76GCAAGGAA77CCCAG7CG7CC6G7AGGGSGCCCC76C7A7T7AGGCAAGC77ACCA7677A8CACCCAACCA7AC 6213 II)

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------|2)

--------------------------------------------------------------------------------------------------------------(3)

во в С * ! —> HJJ

AGA7A77C7CAAAATACT7GC7AA77CGTCGCGGACAGGTA7AAGACS7AAAC8AAGCGTCrCACACC7GGATSA7ACA7GCrCASATGA 6303 111

---С----------------G--------------------------------------------------- (2)

--------------------------------------------------------------- |j)

«SlÈCAGC777GGGS7CC7ACASCAAGAA7C777SCA7C7A7C77AGCCCCGGSGG7AeCASC7GCGCAA6CC7rMBAGAAATT6AGAS 6373 (1)

------------------------------------------------------------- (2)

—A----------------------------------------------------------------------- (3)

ACCAGCCTGTTG87CC677AAACAGGC7AAC776ACAACA7CAG7CC7CGGGGAC77ATTEGATGA767CACGAG7A7TCGACACGC66T 6433 11)

------------------------------------------------------------------- 12)

„I--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------(3)

CCTGCflBAnCCeflGCCGCTATTGACfTCTTGCTTCTflGCTCACeSCCeTSSCTBT6flSBACSTTGCCeGflflT6TeTT6TTTCAflTCTBftB 6573 ш

.....................................................................-........................................(2)

..........................................-..............................................................................................(31

tEArCACAeTGflflTCrATACAGflflGfiflGTTCCASCTftAT6A<ffiftAACAT6TCAATftfteATCBeC6TG6ftCAGCSftCCCfiftTCS6ftASTT6 ЬЬ63 Ш

-I........................................................................................ (21

.......................................................................................... 131

6CT6CGASGDATATTCGGSGGAATA6GGGfiATGGSCCSTTCATCTGCTSAflflGGACTGCTTTTGGGGCTT6TAGTTATTTTATTGCTAST 4753 (II

.......................................................................................... (21

..............................................................................-.........С- 13)

AGrGTGCCTGCCCTGCCTTTTACflATTTGTGTCTAGTAGTATTCGflAAGñTGATT'AATASTTCAATCfiACTATCATACTGfiATACAGGAA 6843 (1)

............I............................................................................. (2)

0...........T----------------------------------------------------------------------------- (I)

Al — > DR1 Г A 6T

GATGCfiGGGCSGíiGCftETCTAGAGCTCAGITATfiATflflTCCTGCGAATCGGGCT6TAf*CGGGGCAflBGCTTGflCCEñ6GGEñCTATfifiCA 6933 11)

.......................................................................................... (2)

......................................................................................... (3)

T CT DRI <-t

T&TATAG6CGAAAAGCGGGGTC1CSGTTGTAAC6CGCTIAGGAAGTCCCCTCGAGGTATGGCA6ATATGCTCTTGCATAGSGGBAAAAAA 7023 (I)

.............................-...............................................(21

.......................................................................................... (3)

I — >DR2

4""""4DSSTCftEE1ftTfi6TGTEMT715ftCTGAS6S5fiCmBMSTGTSTftE6C6TCAS6CE6eSCT)CGSTTGTftCGC6Gft 8374 I»

----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------(3)

Ив73 &R2 <I AQ

TAG8AAlCCCCTCAG5ACAATTC"IBCTTGGAATATÜAIGGCGTCTTCCCTGTTTTGCCCTTABACTATICGG6TTGCCrCTGTGGATTAS 8964 (1)

.................................-....................................ft------------------- (21

.......................................................................A------------------ 13)

GGCTGGAGGCflGCACGEArAGTCrGATGGCCAAATAAGGCAGGCAASACAGCTATTTBTAflCTGCGflAATACGCTTTTBCATAGGGASGG 9054 (i)

.......................................................................................... 12)

.......................................................................................... (31

ЕЕЙмНт'йЬсТ1й!ЕСйНйС1СаЗТШСТ;гСЛКйТБСП«5ТЮМЕ№ЗТ№СЙММ5аТТЙСЙ655М№йМЙ5В 4144 ll)

.......................................................................................... (2)

.......................................................................................... (3)

CACCS1GCñTGCCGAlTGGTGGTA6TAAG6T6GTACGATCG7GCCTTArTAGGAAGSTATCASACGGGTCTAACATGGATTGSACGAACC 9234 (1)

.......................6................Л................................................. (2>

.......................................................................................... 13)

T 9 TOTAdOt ил í - I - /Я R<--l-->l/S

ACTGAATTCCBCATCeCAGA6ATATTBTATTIAAGTGCCIAGCTC6ATACAATAAACGCCATTTTACCArCCACCACATTG6TBrGCACC 33 (1)

......................................................................T------------------- (2|

......................................................................Г------------------- (3)

CGGGTTGATGGCTGGACCGTCGATCCCCTAACGATTGCGAACACCTGAATGAAGCAG 90 (1)

TA----------С-----------1----------------------------------------------------------------(2)

J-----------c-----------1----------------------------------------------------------------(3)

Рис. 5 Нуклеотидная последовательность сиквенированной части генома нового трансформационно-дефектного мутанта (td dapr-Rsv-c), вдоль которой показаны различия в daPr-Rsv-". и рг-rsv-c. Нумерация нуклеотидных. остатков соответствует полной нуклеотидной последовательности Pr-RSV-C (Schwartz et al., 1983участок делеции; orí, dr2 - прямые повторы.

фагов, гибрдцизовавшаяся с полным rsv- провирусом, давала также положительные сигналы, когда в качестве зондов использовали последовательности генов gag и pol. Определение нуклеотидной последовательности вставки одного из таких рекомбинантных бактёриофагов (рис. 5) показано, что транслируемый район гена arc (1,7 т.н.п.) полностью делегирован. Его делеция произошла у границ повторов.

фланкирующих ген с обеих сторон (21 н. от конца левого повтора от и 4 н. от начала правого повтора dr2). Оставшаяся нуклеотидная последовательность иезду геном env и правым ltr идентична последовательности недешекгного провируса daPr-Rsv-c.

Замены в сиквенированных участках td daPr-Rsv-c, отличающие его от Pr-Rsv-c (Schwartz et al., 1983), имеются в 25 случаях из 33 также и в daPr-Rsv-c ( рис. 5 ). Это сходство говорит о тесном родстве td dapr-Rsv-c и dapr-Rsv-c и указывает на то, что td dapr-Rsv-c произошел от daPr-Rsv-c путем делеции src-гена.

Нуклеотидная последовательность td daPr-Rsv-c, учитывая делению гена sгс, примерно на 2С$ меньше нуклеотидной последовательности daPr-Rsv-c. Как отмечалось, этот мутант был получен субтерминальным разведением вируса, т.е. его содержание в пуле, как минимум, на порядок больше, чем трансформационно-зктивного daPr-Rsv-c. Таким образов, простой расчет показывает, что различие в 10$ между нуклеотидными последовательностями геномов, полученное при перекрестной гибридизации353РНКи кДНК дикого рг-rsv-c с 3ss РНК и кДНК вирусного пула после 30-го пассажа на утиных эмбриональных фибро-бластах (см. Разд. I), соответствует наличию в последнем смеси td dapr-Rsv-c и daPr-Rsv-c в соотношении примерно 10:1. В исходном же стоке клонированного рг-rsv-c, которым заражены эмбриональные фибробласты, содержание td-мутанта можно принять порядка 10/5, поскольку было показано, что даже в случае специально клонированного Rsv последний все еще содержит от 7 до 14%td-мутанта (Vogt,

1971) .

Таким образом, очевидно, что td-одтант размножается в утиных эмбриональных фибробластах значительно эффективнее, чем трансформа-ционно-активный вирус саркомы Рауса. Подобные различия в репликации ретровирусов и их трансформационно-дефектных мутантов отмечались и ранее. Так, в клетках msbi репликация td rsv происходит нормально, в то вреда, как некоторые "дикие" штаммы rsv не реплицируются (Neimen et ai.,1973). Показано было также, что репликация "дикого" B77-rsv-c в утиных эмбриональных фибробластах (def) шла значительно хуже, чем в сер. В то же время td-мутант этого вируса, появившийся в процессе его пассирования на утиных клетках, реплицировался одинаково эффективно как в куриных, так и утиных клетках (shimakogs et al.,1979). Результаты наших исследований в совокупности с этими данными показывают, что какие-то последовательности

src-гена угнетают репликацию. Пока неясно, каким образом ген зге препятствует репликации, хотя некоторый свет на этот вопрос проли- • вает характерная вторичная структура вирусной РНК в этой области

(Wang, Hanafusa,1988) .

parvin и Wang (1984) описали два td-мутанта вируса саркомы Рауса, штамм Шмидт-Руппин, относящийся к подгруппе A (sr-rsv-a) , у которых также полностью удалена транслируемая область src-гена. В отличие от td- мутантов sr-rsv-a, у которых были сохранены 5 -и/или 3 -концевые участки src-гена, td- мутанты с полностью удаленной транслируемой областью гена s.-с не восстанавливали свою трансформирующую активность после инфицирования куриных эмбрионов. Это позволило авторам'предположить, что восстановление трансформирующей активности должно происходить путем рекомбинации с клеточным

src-геном при условии сохранения td- мутантом по меньшей мере 3 -концевой части v-src, длиной 100-200 н. Однако как было описано ранее (Karakoz et al.,1980), после внутривенного введения 12-дневным куриным эмбрионам td-мутанта, полученного субтерминальным разведением пула рг-rsv-c, адаптированного к утиным эмбриональным фибробластам, в двух случаях были получены саркомы, содержащие трансформирующий вирус. Хотя по данным электрофоретического анализа этот мутант характеризовался полным отсутствием гена src (Haj-kova et al.,1982), тем не менее, нельзя было исключить сохранение небольшого участка 3*-концевого района (svoboda, 1986).

Анализ 3 -концевой последовательности провируса td dapr-Rsv-c показал, что транслируемая часть гена v-src делетирована полностью (Рындич и соавт.,1988 ). Эти результаты указывают на то, что механизм "восстановления" трансформирующей активности td-мутантов вирусов саркомы Рауса путем рекомбинации з'-концевой части транслируемой области- с клеточным src-геном, по-видимому, не является единственным и что хотя транедукция c-src вирусами лейкозов птиц представляется крайне редким явлением (wang, 1987), тем не менее ее можно наблюдать практически в экспериментальный период времени даже с полными td- мутантами, обычно вызывающими у птиц эритроблас-ТОЗ (Karakoz et al.,1980).

Раздел 3. ОРГАНИЗАЦИЯ И НУКЛЕОТИДНАЯ ПХЛЕДОВАТЕЛЬКОСТЬ НОВОГО

ВИРУСА КУРИНОЙ САРКОМЫ PR 2257 Введение. Уникальной особенностью остро онкогенных ретровирусов является присутствие в их геномах трансформирующих генов опс, кото-

рые возникают в результате захвата лейкозными вирусами и последующей модификации их клеточных предшественников - протоонкогепов. Механизмы превращения одного из них c-src в v-src и формирования трансформирующих ретровирусов пока далеки до полного выяснения. Подробный анализ нового остро онкогенного вируса птичьей саркомы, появившейся у курицы после внутриэмбриональной инокуляции td- мутанта вируса саркомы Рауса дал новые сведения для понимания этих механизмов.

Материалы и методы. Веретеноклеточная саркома, возникшая у курицы № 2257 породы Brown Leghorn через 155 дней после внутривенной инокуляции td daPr-RSV-C 12-ДНбЕНОму эмбриону (Svoboda et -al.,1984 ) , вводилась в ввде 25$ клеточной взвеси в грудную мышцу однодневным японским перепелкам. Опухоль, образовавшаяся через 9 дней после инокуляции, а также клетки линии С?, полученные из этой опухоли, служили источником вьиеления ДНК, содержавшей провирус PR2257. Контролем служила ДНК, полученная из эмбриональных фибробластов перепелки (QEF), инфицированных ^трансформирующими вирусами

td daPr-RSV-C (Geryk et al.,1980) И td Pr-RSV-C (Vogt, 1971), а

также из нормальных Qef. Библиотеку последовательностей ДНК клеток линии С7, рестрицированной ecori, получали с использованием в качестве вектора бактериофага Agtii. Библиотеку последовательностей ДНК из клеток опухоли 2257 получали в составе бактериофага Aemql.3 после неполного гидролиза рестриктазой Sau3A. Результаты и их обсуждение. Организацию провируса PR2257 изучали в клетках опухоли японской перепелки, поскольку они не содержат -эндогенных ретровирусов, способных гибрядизоваться с rsv- зондами в строгих условиях (Frisby et ai.,1979). Картина рестрикции ДНК этих клеток эндонуклеазой Ecorx и гибридизации с patvs шло чем отличалась от ДНК из клеток перепелки, инфицированных td daPr-Rsv-c С зондом pSrcU3, однако, гибридизовался только фрагмент 4,1 т.н.п. (и значительно хуже 1,3 т.н.п.), которые плохо выявлялись при гибридизации с pATvs. фракция 4,1 т.н.п. имела электрофоретическую подвижность намного больше ecori- фрагмента c-src и гибридизова-лась также с pltr.

Полученные результаты указывали на присутствие в геноме клеток опухоли перепелки провируса трансформирующего вируса, содержащего arc-ген необычной структуры, которую трудно было установить из-за помех, вносимых значительно большим количеством провируса td- мутан-

В д I Н

ос а.

Е с о Я I ♦ В д 1 И

КЬ

7.7 -5.6 -

3.1 -

1.5

— г*>,

ОС о.

сэ

с;

о «г» О _)

г»

СЯ>

Рис. 6 Гибридизация ДИК клеток линии 07 из опухоли перепелки, индуцированной РЙ2257, С ЗОНДОМ рЭгсИ.

М - маркеры молекулярного веса; 0 - ДНК нормальных клеток перепелки; ррг - ДНК клеток перепелки, трансформированных

С7 - ДНК клеток линии С7.

та. В связи с этим размеры и организацию провируса РК2257 исследовали в клетках линии С7, которые получили из одного изолированного фокуса оея, трансформированных культивированием с клетками оригинальной опухоли "257. Эта линия продуцировала бхЮ* ФОЕ/мл трансформирующего вируса и 5x10® ИЕ/мл нетрансформирующего td ¿эрг-йзу-с

(МеЫЬа а1. ,1988).

Гибридизация с зондами рдту-в, рэгсИ, рвгс14 и |_тк есои-фрагментов ДНК клеток линии С7 подтвердила результаты, полученные на ДНК из опухоли перепелки 2257 (рис. 6). Кроме фрагмента 4,1 т. н.п., дававшего положительный сигнал с перечисленными зондами и имевшего электрофоретическую подвижность значительно отличающуюся от с-агс, на авторадиограмме присутствовали только фрагменты, соответствующие td-мyтaнтy. Подобный фрагмент 4,1 т.н.п. был получен после гидролиза рестриктазой руш. Поскольку чер не содержит эндогенных куриных провирусов, гомологичных ргвУ, было возможно провести анализ этого фрагмента на присутствие в нем репликативннх вирусных генов (рис. 7 ). Фрагмент 4,1 т.н.п. не гибридизовался ни с

• re 14

leg II

XI 5

(toll

u cr í I I

poli

( < o > I

a s

i lu a i i

env

f t o « I

II 5 с ;

7 Г ~ i »- ,

5 » -

»»-O

S » - I

- U W®

JO «ta

1 9- O

i ъ- o

Рис. 7 Тест на присутствие последовательностей gag, pol и env в Е с о RI-прОВИруСНОЙ еДИНИЦв PR2257.

Обозначения М, G7, q, pr как на рис. 6; da pr-ДНК из клеток перепелки, трансформированных daPr-Rsv-ci Н-20 - ДНК из линии опухолевых клеток хомяка С интегрированным провирусом (Svoboda et al.,1983

pGag-, ни с pPoli- зондами, хотя давал положительный сигнал с зондом, включавшим ген env. Последний, по-видимому, представлен в новом провирусе не полностью, т.к. не гидролизуется ecori, Hind их, xhoi, которые режут слева ген env в рг-rsv-c. Совместный гидролиз рестриктазами ecori и pvuii разделил фрагмент 4,1 т.н.п. на 2 части: фрагмент 1,8 т.н.п. гибрвдизовался с пробами arcii, srci4 и LTR} 2,3 т.н.п. гибридизовался только с пробой srcii, но не с sгс14• с ltr этот фрагмент давал очень сильный сигнал, что указывало на размещение в PR2257 неполного гена env справа от гена ere. Дальнейший рестриктный анализ с помощью ферментов xhoi, Bgiu, Peti, saci позволил сделать заключение, что PR2257 sre-ген в значительной мере отличается от ere-гена рг-rsv-c, и прея-положить, что куриный c-src внедрен в геном pr2257, соединившись с вирусной лидерной последовательностью, как это имело место в случае саркомного вируса SI (Ikawa et al.,1986).

A I (I) cell DNA <--

TEACAeCAAATG6AAG6ftCTTCAASCAT6GT6T6CÍTCAAT-//-CTCAGAETCACCTrTT6B6ACTGTGSTGAtCTTGAAEECCTTTTC 12)

—> UJ EnMcer Enluticer ft1GIAB1CTTftTECAftTACTCCTSTASTCTTECAACATGCTrATGTAftCGArBAGTTASCAAraTGCCrTACAfl6gAAAGAAAAG6CACC C.........................................................................—1.....

Ill

....................................................................................................................................................................................(3)

....................................................................................................................................................................................(41

........«A—AE-GCCABASECA-CCTSAAT-B7C-AAA6-CCA—TA-G—AAA"—--6-CATrCC-T-r-CrC-TTGST—GA- (51

Enhancer CAÍ Bo*

GIGCftT6CC6ftTTGGT6BTflSTAa5GTEGTftCGftTCGT6CCTTATTASGAAGGTATCASflCGSGTCTAACfiT6GATT6GflCGAftCCACT6 I8t ^

....................................................................................................................................................................................(31

....................................................................................................................................................................................(41

7A-A7AAGGA-5GAA—ACGCA-S-ACATATS-GCETAGA-GAAGC--T-T-C-AT-ATATAA-C-G-TS-CACC—CA-"""*"-"""* (51

TATA Bon PAS<-'.--> R <--!!--> U5

AATrcCGCATCECASfiGATATTGTflniAftSISCCTAGCTCGATACAA7AAfy6CCATrrTACCflTCCACCACATFGGT5T6CACCr6G8 271 jjj

......................................................................................C— (3)

..................................................................r—........................................II)

T........-............................(51

R85 Ü5 <--! PBS

Tfi6ft7EGaCASftCCSTTGflSTCCCTftftC6ATTECSftftCftCCT6ftflT6ftftSCftSfthE5tnCftTT7SG7EBECEC6ACGT6flTGSTTASTB 341 II)

-I.....C-G......C--7..............................................................................(21

-7.....C-G......C--IC......................................................................................(3)

-7-----C-G......C—7..............................................................A--------------1«)

................................................................-.................C--------------131

AATASTG5TCGGCCfiCfiGACGGCG7G6CGA7CC7GCCC7CArcC67CiCGC7TA77CGGGGAGCGGACGA7GACCC7AGTAGA6GGGGC7 (51 <i)

..........................................................-..................................(2)

....................................................................................................................................................................................HI

......................................................AC*--A-C-A.....................NN— 13)

Packaging Signal

GCGGCIT»5GaGgGCAGAAGCTGflGTGGCGrCSGAGGGAGCTC7ACTGCAGGGAGCCCAGATACCCrACCGAGAftCTCAGAGA67C6T76 541 (!)

....................-......—-......................................................................................................................(2)

....................................................................................................................................................................................14)

...........................A..............................(5)

Gag Init. Sol.

GAAGACG66A66GASGCCC6ACSACr6AGCASTCCACCCCA6GCSreAlTCT6GTCBCCC6BTBGATCAA6CATeBAABCCGTCATAAfiG 431 (I) ....................-...................................................~.............~ (21

Site KetGlySerSerlys 3

GRGC7GAGCiGftC7ETGC7GD7EECC7CGCD7ACCA£7GIGGCCAGGCGS7AGC7GGGACGTGCAGCCCACCACCA7GSEGA6CAGCAAG 721 111

....................................................................................................................12)

-]T-A-TTCG-CCGCG-GIfiAAACCTA-IG-GGGAA-ACC-C7"7rC7AAB-AGGAAA7A-S-GCCATG77GíCCCrCÍTACAAAAGGAA (4)

-L>_GAG - Pfll - EHV (№85; t;c37).......> (51

SerLy5Prt)I.Y5AspProSerElriArgArqftrgSerl.EuGluProPrDAspSifrTtirtlÍ5Hi5GlyEl yPheProAlaSerGlnThrPro 33

AGCAHGCCCAÁGGALCCCAGCCAGCGCCGGCGLAGCCTGGAGCCACCCGACAGCACCCACCACSGGGGflíTCCCAGCCrCGCAGACCCCC 811 (I)

AsnLysThrAlaAlíProA5pThrHisArg7hrProSerArgSerPti6GIy7hrValalj7hrGluProLysLeuPheS)y61yPlieAsn 43

AACflAGACAGCAeCCCCCGACACGCACCGdACCCCCAGCCGCTCCTr T6SGACC6TGGCCACC6AGCCCAAGC TCTTCfiBGGSGTIt AAC 901 II)

ThrSerAspThrVal rhrSerProGlnArgAIaGIyAlaleuAUGlyGlyValTtirThrPheValalaleuTyrAspTyrGluSerArg 95

ACIlClGAtACCGKACGICGCC6CAGCGÍGCCGGGGCACTGGCÍGGCGGÍGrCACCACHrC6r6GClcrC7HGA¿rtaA6ICCCGÍ 991 (I)

I C

7ftrGlu7hrAspLeuSerPheLysLysG!yGluAroLeuElni 1eValisnAsn7hrE)uGlyAspTrp7rpleuA!aHi sSerLeufhr 123

ACTGAAAt6EACTT6TCCTIMABftAftGSAGAACBtCTBCA6A71BTCAACAACAC6BAABSIGACTGBIBGCT6BClCAUCtCICACl 10B1 I»

7hrElyGIn 7hrGI i-TyrIUProSfrAsnTyrVal alaPrnSerAspSerIJ eGInAlaGlu6luTrpTyrPhíSlyLysl1»Thrftrq 153

«CAGGACASACGGGtlACaTCCCCAGlAAClfiTGTCGCGCCCTCAGACTCCATCLASGrTGAAGAGTGGTACTTrGGGAAGATCACTCSt 1171 111

ArqG)uSerGluArqUuLpuLeuA5nProGluAinProAroGl»Ilir'PhfUuVaUr9GluSerGli/!lirIhrLy5SlYAU7yrCyt 185

CGfiGAGItCGAGCGtCrGCIGCICAACCCCGAAAACCCCCGGSGÍACCncnGGTCCGOGAGAliCGAGACGACAAAAGGTGCCTÍlTGC 1261 (II

г 335 с ¡711

«а37—>CGGGG5î M ç?37->CGGGGGTÎ —--с--.......»—-.....-...................

-----i........ .......A- :gc-gc-gccgcct

LeuSerVälSerAsoPieÄspflsn«hCysEi»LeiiA5iiVäRysWsry'rty'i;ieflrolwsUu/ispSer01v6Iyf,heTyrIleftr 215

CTCTCCETTTCT6ACTTTQACAACGCCAACGSGCTCAAT6TGA£GCACTACAASATCCBSAAGCTG6ACAGC&SCGGCTTCTACATCACC 1351

SerAí-gTbrGIfiPfiEEerSerLeuSÍ nGlnLeuVal a 1 aTyrTyr SerLybHi sftl âAipGl yLeuCvsHi sflrqLeuïhrAsnVal Cvs 245

TCACGCACACAGTTCACtCAGCC16CAGCASCTeSTSGCCTACTACTCCAAACATBCTGATEGCTTET6CCACCeCCr&ACCAACfiTCT6C »41

PrDThrSerLy5ProGlnIhrGlnBlYLeufitaLYSfis.pÄlälrpGluIleProAroGluSerLeuArnLeuGluVilLvsLeuSlySin 275

CCCACGrCCflÂGCCCCfiGACCC«SGGACÎCGCCAAûS/ÎCSCG76GGAAATCCCCCGGGASTCGCT6CGGCTDGABSTGAAGCTEGGGCAG 1531

61\C¥5PheGIv61uVaITrpHet6lvThrrrpAsnStyTArThrArgVil<laIleLf'sThrLeuLrsProGIvTbrHetSerProGlu 305

EGCTGCTTTSGAGAGGTCTGGAT&BGÊACCTGGAACGGCACCACCAGAGT66CCATAAAGACTCTGAÂSCCCSGCACCATGTCCCCGGAG 1621

AläPheLeuGlnGluAlsGInValMetLyslysLeuArgHisGluLysLeuVaieinLeuTyrA!aValValSerGluGluProlleTyi GCCT ÏCCIGCAGGAAGCCCAAGIËATGARGAAGCTCCGGCATGAGAfiGCTEGTTCAGCTGrftCGCAGrGGTGÏC6GAA6ASCCCATCr«l

lUV«HhrGluTyrfletSerLyESLyEErLeuLeuAspPhcLeuLys61yGlul1etGlyLY5TyrLEuArgLeuProGlnLeuValA5n 365

atcgtcactgagíacargfiscftagsgáiíscctcc7egatiiccieaaegdasaeateeg¿aagtacctbc6sc7eccacagcicgtceat 1601

HetAlaAlaGlnlleAlaSerCIyMetAlalyrValG¡uArgHetAsn7yrVaiHisArgAspLeuAroAUAlaAsnlleLeuValGly 395

ATS6CI6CICAGAIT0CAT£C6GiAIG6CClAl6ie6ASAGfiAI6AACTÄCGT8CACCSAGAEci6CGiGCGGCCAACAICCT6GT6GGÜ 1891

61uAsnLeuV4]CysLy5ValalaAspPheBlyLeuAlaArnLeuIleGluAspA&nGlu7vrThrAlaflrgGlnGlyAlaLYSPhePro 425

6A6AACCT6GTGTGCAAGSrGGCTGACTTrGGGCrGGCACGCCTCATCGAG6ACAACGA6roCflCASCACGäCAAG6rGCCAASrrCCCC 1981

IleLysTraThrAtaProGluAlaAlaLeuTyr61yArgPheThrIlit.ysSerAspVal1rpSerPheGlYlULeuLeuThr6IuLeu 455

ATCAftGTGGACAGCCCCCGAGGCAGCCCrcrA7GSCCGGT7CACrA7CAAGICGGATGICTGGTCCTTCGG£ATCCTGCT8ACTGAGCTG 2071

ThrThrL]rsGlyArgValProîyrProGJyJTctValAsnArgS.>tiyjtl.ftiAspG]nV«}GJvArD£J yTyrArefletProCysProPro 485

ACCACCAAGGGCCGâGTeCCATACCCAGGGAtGGTCAACAGGGAGGTGCTGGACCAGGTGGAGAGGGGCTÄCCGCATБСССТGCCCSCCC 2161

filuCyfPreGluScrJ.«u71j5A5pLeul1etCysSlnCyslrpArgLysAspPra61uGluArgPraThrPheGiulyrLeuGlnA]aPhe 515

GAGlíCCCCGAGICGCIGCAIGfiCCKATGTKCAGTéCTGGCG6AAGGACCCISAGGAGCGBCCCACT[rrSAGttetG«6GCC7TC 2251

LeuGluAspTyrPheThrSer Thr61 uProf'rcValProñl airpArgGluProИeGlyUuGluUuUuLeuAlaProGluAlaSer 545

CT6SAGGACrACTrCACCTCffACAGAGCCCCÇAGTACCfiSCCTGGAGAGAACCIATWGCCTGGAGCTCCICCTGGÇACCAGA6GCCTCG 2341 jjj

inserted С c-src Stop inserted С

LeuTrpGlyTbrGbAIaïrpUuArçAlaGliiGlуРгоЛгgPhcGJyGíuSJnProSJ/iSerArg^e17rpwisSlySluVálSerBly 575

CTSTGUGGCACASSBGCCTGGCICCGTGCAGAGGGGCCACGTTTTBGGGAGCAGCCCCAGAGCAGGATGTGGCATGGIGAGGTGTCGGGT 2431 111

.......................................................................................... 12)

AI aPr oSer Leu IleUsThr Va lLeuGlyHi5Pro »**»»» 587 GCICCArcGCrCAnAAAACTGTGCIGGGtCACCCrTAATGAGGTGGCGñGAGGAGCCCCGGGCACTGCCfiCCAGCGGAGCTGGGGCÍCA 2521 (U ................................................. 12)

GGAÎG6CfiAATGGfiEChGCAEGACGGCTCCT6GCACfiGCCACGGCrTICA6GSCCCTCTICTCACAGCAGCCAGAGAAAT7GGGGGACAA 2611 II)

CCCCJCCCACCTEAGACACACIGCCCCACACCICCTeCACCCCCTTrrTrAAAICAGCACAAATrTCrrCACCCATTCACCCCCCCACTT 2701 II)

CGCTCTGGTCI3CCCGfiGGCCGTTÎGCAGfiGACGIIT6GCGATGCGGAAGGCACTGCTTTGSArCGGATGCAGCÎ6GAGAGCAGACCTTG 2791 II)

GGAIGCCCCATGGAGGClGATG&TCTCCCnCClCCGGCACCIGCCCGÎCCTCGG&CGCfiGGGCICAGIGTTITfiGGGAACTACTTGICr 2831 Ш

nCAGCGCTGCmiGrCCACCGGfiGIGniCIAGCCACCArcCCCCCCGCrrCIGCCAICCCCTÍATCAGGGAGCACGGAGCCACCGCG 2971 (II

sequence of v-sre C-terainus

AGCCGTTrSCASBClCAGCIGCICCCTGCITGTGTGITGGAGGTCGGAGIGATtCATGCACAltCCGGIGCCCGCAGCAGCTCCCATIGA 3061 11)

eCíCCCCTSlACATAGICC7CCAGCACHCaGCIACCTGACCAAGCIGCAIGTGClGlCGIGTTCCICCIGTG6IACCGCCBCCAIC!G 3151 11)

ICCriGrrí6ICCCCAGríSGAGCCCCGCA7CACACCAICCCCACCT6TGTCCT6GACCTCTTATCCATCAC7CACACCCGGTGCCAAAA 3241 11)

............. (2)

Í--7 fn<ígpJ7l

ACfiCCICCGGAGAACCfiBGCIGCGCAAGCCITAAGAGAAATTGAGAGACTAGCCIGITGGICCGUAAACAGGCTAACTrGACAACAICA 3331 (II

121 131 14) 151 (71

CIC£7£GSS5AC7TA7IGGATuA7GICACGAG7AT7CGACACGCGGTCCTGCAGAACCGAGCGGCTA7TGAC7rCT7SC7TCrAGCICAC 3421 III

................................................................-...................... 12)

...................................................................................................................................................................131

.........................................................................................................................................................................(41

.............................................................................С..................(5)

GGCCflTGGClBTEftGG«CGT7BCCeGflflrGTSrrGrTrCftflrCIGflGTGfiTC«CftSrs/lflICrATflCflGflAGflfl6TTCCflGCTflflr6AftS 3311 (I)

....................................................................................................................................................................................12)

....................................................................................................................................................................................131

....................................................................................................................................................................................14)

...........................................................G............................................................(51

ftflftCATGTCfiMfiflGfiICGGCE1GGfiCftGCGflCCCfiA!CG3flftGTTGGCTGCGAGGGATATTCGGSGGAftT«G6SSft«T6GSCC6tlMT SMS (1)

..................................(21

...............................-....................................................................................................................(31

.................-................................................................................................................................................(41

G.......................................................ST------A..................................................(5)

CT6CTAAAAGGftCTGCTTTTGGBGCTTETAE1TATTTTflTTGCrA6TASr6T6CCrgCCCrSCCTTTrACAArTr6TGrcrA6TAGrATT 3691 (I)

............................................---............-..........................................................13)

............................................C-G............r............................................................(4)

t—-G................................5....................T........G—A-------C-----C--C (5)

En» Stop

CEnACSSTGATTAtir<ETT[AATCAGCrArCACACGGflATATflAGAfiGTrGCAflAAGGCTr6TfiGGCASCCCGAAftAI6SAGCAGT6IAA 3781 (1) ......................-^fi......T--T.....C-G-—A-—(31

............r—r.....C-G----A.........""-H55 (41

................................................................................................................................................(j,

'--> 1 <-!:--> Fl-A <--,'!--> Fl-B

ASCftGTftCftT5G6TGSTSSTATGAAACTTGCSAATCG6SCT6TAACGGGGCAAGSCTT6ACTGAGGGGACCATAGTATGTATAGGCGAAA 1871 (1)

......CT-GA-C-A--TA--AT--T-C..........................................I—AC............................13) drl

..................................CGGGTCAG3TATAATGTGCA-T.................GA-G..........TC- (3) tr2

......CT-GA-C-A--TA--AT--T-C..........................................I—AC............................14) drl

........................... CGAT6TACGGGTCAGGTATAATGTGCA-T.................GA-G..........TC- (41 dr2

1..........................................----.................-—-R.........................(5)

FI-B <-::--> i <—::->FI-C<-::—>

GGCGGGGCTTCGGnGTiCGCGGSTAGGAATCCCCTCAGGACAATTCTGCTTGGAATATGATGSCGTCTTCCCTGTTTTGCCCTTAGACT 3961 (I)

A-.....TC........ACGCGCTTAGGAAGTCCCCTCGAAATATGGCAGATATGCTCTTGCA -> dr2__<JI drl

'"-----TC--------ACGCGOTTAGKiflGTCCCCTCGflSflTATEGCAGATATGC TrGCATflb'SGGSABAfiAAliiTAGicriAATAT (4) drl

11!

(4) dr2

"""""A-V-TA-TT-CGCTCTTGCATAGAGAGGGGGA" (5)

ATTCAG5TTGCCTCTSTeGATTASEGCTGEAGSCAGCACSGATAGrCTGATGGCCAAATAA6SCAGGCAAGACAGCTATTTSTAACT6CG 4051 (1)

—G...............................-..............................................................................................(3) dr2

—-GA.......-....................-.......-..............................................................................................(4) tr2

F2<-!-> Fl-D <-! PPT !-> U3 Enhancer

AAArACGCrTTTGCATASGGAGGGGGAAATGTAGTCTTATGCAATACTCCTSTAGTCTTGCAACATSCTTATGTAACGATGAGTTAGCAA 4141 jjj

-................................................................................................................................................................................14)

.........fe A--ftG~GCC AGfeEGC A "EC1E A AT ~STC'A A AE'CC A—TA-G—AAA^--------15)

Enhancer Enhancer

TATGCCTTACAHGGAAAGAAAA6SCACCGTG[ATGCCGATTGGTGGTAGTAAGGT6GTACGATC6TC6CCTrATTAGGAAGGTATCAGAC 4231

.........................................................................-................................(4)

G-CATTCC-T-T-CrC-TTCC-T-T-CTC-ITGST—GA-TA-ATAAGGA-GGAA--ACGCA-5-ACATAT6-GCGTAGA-GAAG-T-T 13)

CAT So* ' TATA Bon PAS<-!--> R

GGGlCTAACftTS6ATlGGACGACCftCTGAATTCCDCATCGCAGAGATATTSTATTTAA5TGCETARCTCSATACAATAAArGrrATTTTft 4321 jjj

......................................-......................................................................................................(4)

ACGATTATATAAGCTBTTGCCACCATCA""""*""""""""'""""*""......................................(3)

R <--!!--> U3

CCATCCACCACATTGGTGTGCACCTGGGTAGATGGACAGACC6TTGAGTCCCTAACGATTGCGAACACCTGAATGAAGCAGAAGGCTTCA 4411 (I)

....................—-c—-1.....C-6......C—TC..................................................................................(3)

----T........................T.....C-G......C--T....................................................................................(4)

—T..........................................................................................................................................................................(5)

TT 4413 (1) !-> cell ONA

CTTAAGACCACAGGAAAAGGCTTAAGATAGACACACCCAATACTAAAATTTTGAAGATTACTAATSTCTAATGCTTGTAAGATAATGACT (3)

(4)

(5)

Рис. 8 Нуклеотидная последовательность нового вируса куриной саркомы PR2257.

(1) PR2257-C7 - провирус, изолированный из клеток линии с7; (2) PR2257-T - провирус, изолированный из опухоли перепелки, индуцированной инокуляцией клеточной суспензии опухоли 2257; (з) td daPr-Rsv-c - провирус td-мутанта ретровируса, индуцировавшего опухоль 2257; (4) Pr-RSV-C - провирус, снивелированный Schwartz И др. (1987)! (5) RAVO - ЭНДОГеННЫЙ провирус (Hughes, 1982) (6) c-src - куриный протоонкоген c-src (Takeya, Hanafusa,1983) ! (7) -

клеточная ДНК курицы (Takeya, неопубликованные данные )! прямыми линиями показаны гомологичные участки, а образующиеся прямоугольники демонстрируют места возможных рекомбинаций.

Итак, данные рестриктно-гибридизационного анализа указывали на то, что провирус PR2257 содержит модифицированный c-src, соединенный слева с лидерной вирусной последовательностью и справа с непол-нум геном env, эта структура обрамлена ltr и включает немногим более 4 т.н.п. Никакой, кроме 4,3 т.н., вирусспецифической РНК, не выявлялось в клетках линии С7 ни src-, ни ltr-специфической пробой. Имея это в виду, библиотека геномных последовательностей была получена после полного гидролиза ДНК из клеток линии С7 эндонуклеа-зой EcoRi. Вставка (4,1 т.н.п.) одного из рекомбинантных бактериофагов , давших положительный сигнал при скрининге библиотеки гибридизацией с psrc-зовдой, была субклошрована в EcoRi-сайте бактериофага ЖЗ tgi30 в обеих ориентациях. Набор делеци'< бил получен с помощью экзонуклеазы Ш (Henikoff,1984) после защиты MI3 tgi30 Sali- фрагмента 5-<*-ти0 АТР и гвдролиза EcoRI (Putney et al., 1981). Анализ нуклеотидной последовательности провируса PR2257 и сравнение с рг-rsv-c и c-src показал, что он состоит из 5 -ltr, нетранслируемого района, c-src, неизвестной ДНК, фрагмента env, 3 -нетранслируемого района, 3 ltr и с обоими lTR включает 4413 н. (рис. 8).

Так же, как и у Pr-rsv-C и daPr-rsv-C, ltr pr22s7 состоит из 335 н. В снивелированной порции ltr тлеется 6 одиночных замен по сравнению с рг-rsv-c и локализованных в r и us. Сравнение с ltr других ретроЕирусов обнаружило совершенную гомологию us-домона с этим участком у rav-o (Hughes,1980). Оба они в четырех из пяти позиций отличаются отрг-rsv, sr-rsv и rav-2. Все сигналы, требу-

ющиеся для эффективной экспрессии Rsv ( энхансер, TATA-бокс, САТ-бокс, сигнал полиаденилирования, сайт связывания с рибосомой) сохранены В иЗ-раЙОНе PR2257.

б'-Нетранслируемый район до инициирующего кодона гена gag отличается только на I позицию от рг-rsv-c и много больше от rav-o. Все сигналы, необходимые для репликации Rsv, сохранены в PR2257, включая сайт связывания с праймером (тРНК Тгр) для инициации обратной транскрипции и cis-действующую последовательность для эффективной упаковки геномной РНК в вирион. Единственная замена A-*-G в позиции 354 на границе этого сайта приводит к возникновению нового инициируодего кодона в контексте последовательности, обычно встречающейся в месте инициации трансляции у эукариот (Kozak, 1987), и может играть роль в регуляции вирусной репликации.

После инициирую»,его кодона gag в pr2257 размещается последовательность донорного сайта, соединенная (631-632 н. ) с акцепторным сайтом сплайсинга нетранслируемого экзона c-src, как это имеет место в субгеномной мРНК v-src рг-rsv-c. Однако кодирующая последовательность pr2257 src значительно менее гомологична v-src pr-Rsv-Cî 29 замен до позиция 2248 (начиная с этой позиции почти полная гомология с c-src), чем c-src (только 5 замен до нуклеотида 2356 pr2257, из которых Tgjg-C и C97g*-T немые, а еще 3 находятся в С-конце c-src: две инсерции С в положениях 2283 и 2328 и С235СГТ). Инсерция С2233 коренным образом меняет С-конец src- белка pr2257, сдвигая рачку считывания и тем удаляя нормальный терминирующий кодон c-src, что удлиняет кодирующий район гена до нуклеотида 2467 и т.о. приводит теоретически к образованию src-белка pr2257 о 587 а.к. (м.в. 65,7 кДа), вместо 533 а.к. для белкового продукта c-src. При этом происходит изменение Туг Начиная с нуклеотида

2310, участок длиной 956 н.п. представляет собой клеточную ДНК, по-видимому, прилежащую к c-src в геноме куриной клетки, поскольку 2310-2356 нуклеотиды, за исключением только двух положений гомологичны сиквенированному участку клеточной ДНК курицы, расположенному вправо от c-src (Takeya, Hanafusa,1983) . Последовательность ИЗ 39 н., которая локализована на расстоянии примерно 900 н. от терминирующего кодона c-src, используется при образовании 3 -конца v-erc. Гомология с клеточной последовательностью у PR2257 обрывается в конце района из десяти нуклеотидов (3257-3266), где имеется высокая гомология клеточной последовательности и участка env-гена

rsv, размещенного в районе 90 н. после начала дРз7-Ксщирующей последовательности. Гомология в этом участке почти полная с pr-Rsv-c до нуклеотида 3716. Конец гена env и последующий некоди-руюций район имеет гомологию с вирусом только в отдельных участках.

Таким образом.в отличие от других asv, трансдуцировавших с-вгс с модификацией его С-конец-кодируюцего участка транспозицией нижележащей клеточной последовательности (rsv) или рекомбинацией с вирусным репликативным геном (вирусы si, s2), у pr2257 этот участок изменен мутацией со сдвигом раши считывания. Геном этого нового изолята asv представлен ltr, включающими из из td рг-rsv-c, a us из RAv-o, донорный сайт вирусной лвдерной последовательности присоединен прямо к акцепторному сайту экзона I c-src, a c-src трансдуцирован вместе с 956 н.п. 3 -фланкирующей его некодирующей последовательности и включает мутацию, модифицирующую С-конец кодируемого белка; c-src рекомбинировал с env в пределах др37-коди-рующего домена, последние 60 н. которого и последние 90 н. нетранс-лируемой области (до прямого повтора pi-e) ведут начало, по-видимому, от RAv-o, после чего вдет до самого конца участок из td рг-rsv-c. Несмотря на высокую туморогенность in vivo, трансформационный титр pr2257 низок Ha cef и нз qef (Svoboda et al.,1984), что может об"ясняться дефектом репликации и/или низким трансформирующим потенциалом. Наличие добавочного сильного рибосом-связыва-ющего сайта в 3 -направлении от праймер-связывающего сайта может быть причиной низкой репликации из-за дестабилизации вторичной стру ктуры РНК, требуемой для эффективной обратной транскрипции (оаг-llx, 1986J Cobrlnik et al.,1988).

Анализ расшифрованной структуры PR2257 ставит несколько новых вопросов: как образовался этот вирус, каков механизм трансдукции c-src,какова структура возникшего src-белка?

В провирусе, полученном из клеточной линии (pr2257-c7) два района гомологичны нуклеотидным последовательностям эндогенных куриных ретровирусов: us- домен ltr и конец гена env с частью з'-фланкируюцей нетранслируемой области. Их образование можно было бы об"яснить рекомбинацией во время формирования нового саркомного ретровируса с участками генома цыплят Brown Leghorn, имеющего RAv-o-последовательности в нескольких локусах, три из которых транскрибируются (Gudkov et el.,1986). Однако выделение и определение первичной структуры провируса из клеток самой опухоли

(PR2257-T) в значительной степени усложняет картину. Оба провируса имеют идентичное строение за исключением того, что в PR2257-T отсутствуют RAV-o-специфические замены, обнаруженные в PR2257-C7. В то же время из опухоли был ввделен и сиквенирован еще один транс-формационно-дефектный мутант (td daPr-Rsv-c-Q2) с сайтами делении s г с-гена и последовательностями репликативных генов, полностью гомологичных тем, которые описаны у td daPr-Rsv-c (Разд. 2 ), но в us-домене td daPr-Rsv-c-Q2 опять-таки имеются RAV-o-специфичес-кие замены.

Идентичность замен в нуклеотвдных последовательностях, а также идентичность сайтов рекомбинации с геном c-src и прилегающей к нему участком геномной ДНК клетки хозяина указывают на то, что оба провируса pr2257-t и PR2257-C7 имеют общее происхождение от td dapr-Rsv-c (Рис. 9). При этом трансдукцией c-src с фланкирующим участком клеточной ДНК вначале был образован рг2257-т, который превратился в Рг2257-с7, приобретя rav-o- характерные участки в ltr и 3 -конце env-гена и прилежащей з'-нетранслируемой области рекомбинацией с сопутствующим td-мутантом, тлеющем в геноме соответствующие нуклеотидные последовательности rav-o. Последний мог быть генерирован из td daPr-rsv-c-q2, образовавшимся из td dapr-Rsv-c, рекомбинировав с эндогенным провирусом в районе us-домена ltr, путем повторной рекомбинации в 3 -конце гена env и прилежащей 3 -нетранслируемой области.

Нуклеотидные последовательности rav-o находят довольно часто в us- доменах ltr рекомбинантов между rav-o и экзогенными вирусами (Coffin et al.,1970; Robinson et al.,1980,1982; Schibuya, Hanafusa,1982), где они не имеют заметного влияния на репликацию или экспрессш вирусных генов. Расположение этих последовательностей в 3 -районе PR2257 может тлеть биологичесное значение (Robinson et al.,1982).

Анализ нуклеотвдных последовательностей указывает на то, что вирус PR2257 возник с помощью механизма, отличающегося от использовавшегося восстановленными штаммами asv, которые были получеьы из td-мутантов, сохранивших частично v-src- последовательности

(Parvin, Wang, 1984; Wang et al.,1987). нужно отмвтить, что PR2257 представляет собой первый asv, полученный из полного td-мутанта. Он был образован соединением восемнадцати нуялеотвдов у регулярного донорного сайта сплайсинга в гене gag с акцепторным

ЗЗЕ

4 S

вПРЧ*

7 « »К 11 12

из RU5

и. ушмт

т-с с-т

SDS ATG c-*rc/v-arc

SA5 с-фгс

(TAC е-»»с) TAA.TGA PR22S7 ere

Рис. 9 Происхождение нуклеотвдных последовательностей PR2257. /А/ Вверху - топография с-зге по Такауа И Hanafusa (1983). Закрашены интроны, незакрашены акзонн. Границы 5 -экзона I и 3 экзона 12 не идентифицированы (штрихи). Открытые кружки - 39 н. для образования 3 -конца v-src rsv. Внизу - районы c-src для PR2257. Длина и организация участка c-src вправо от экзона 12 точно неизвестна, в вирусе он может быть модифицирован делецией или сплайсингом и потому указан прерванными двумя вертикальными черточками. Прямоугольники по краям PR2257 - ltr. /в/ Структурная организация провируса

PR2257. из, R, U5 - учаСТНИ UTR; SDS gag - ДОНОРНЫЙ СЭЙТ СПЛЭЙ-

синга лидерной последовательности s sas c-s re -акцепторный сайт сплайсинга c-srcî atg c-src - инициирующий кодон; Т-С, С-Т - тран-зиции; +С - инсерция, указаны терминирующие кодоны для соответствующих белков. Точками и горизонтальными полосками заполнены районы, имеющие происхождение из rav-o или td daPr-Rsv-c, соответственно, косыми полосками - нетранслируемые районы, имеющие c-src-происхож-дение.

сайтом сплайсинга первого нетранслируемого экзона с-вгс (Рис. 9), как это также имело место в абу в1 (1ка«а ег а!.,1986) и вирусе 1С2, где донорный сайт сплайсинга лидерного района рау-1 присоеди-

нился к акцепторному сайту второго экзона c-mil (Marx et al.,1988). Вопреки общепринятому мнению о траясдукции с-onc путем случайной интеграции ретровируса впереди с-one, утратой его 3 -конца (или без утраты) и котранскрипцией с последующим сплайсингом, никогда еще не была показана интеграция alv впереди c-sre. Полученные данные о структуре трех вирусов (asv si, s2, PR2257) свидетельствуют о том, что первым этапом в захватывании клеточных протоонкогенов может быть транс-сплайсинг лвдерной последовательности вирусной мРНК к экзону мРНК с-опс, В любом случае следующий шаг - это упаковка сплайсирозанной РНК в вирион вместе с РНК td daPr-Rsv-c и затем их рекомбинация механизмом выбора копии (vogt, 1973; coffin, 1979) ИЛИ механизмом сдвига - ассимиляции (aunghans et al.,1982) дм соединения 3 -района c-src с дРз7-кодирующим районом td daPR-RSV-C.

PR2257 src-кодируемый белок в результате инсерцяи цитозина на 24 н. впереди терминирующего кодона. c-src имеет измененные последующие восемь аминокислот из-за сдвига рамки считывания, которая в свою очередь модифицируется инсерцией остатка цитозина через 19 остатков за терминирующим кодовом c-src. В результате получается белок на 54 аминокислотных остатка длиннее, чем у рг-rsv-c (рис. 10). Наиболее критическое изменение, вероятнее всего ответственное за активацию белка PR2257 v-src - это Tyr527 vais фосфорилирование этого остатка в c-src регулировало ниназную активность и трансформационные свойства (Courtneldge, 1935,- Cooper et al.,1986). Подобное замещение позволило c-src трансформировать cef (Reynolds et al.,1987) и КЛвТКИ NIH ЗТЗ (Cartwrlght et al.,1987} Piwmica-worms et ai.,1987) in vitro, а трансформированные ЗТЗ-клетки были туморогенны ДЛЯ nude-мышей (Kmiecik, Shalloway,1987). Однако значение замещения Туг527 для туморогенности было показано впервые только у вирусов S2 и PR2257 на цыплятах. В p62sl"arc и в

3X0 5Z0 SJO 540 550 SCO 570 5*0

lorrrstepq rrjqpeehl ■ • • • tu tt i»,t >mi

LPACVLQVAE • • • • • • I» 11 ISf.l «0.1

......... » fAW«m6UUl«mSlW6U№l(AÍEr«fCECP(¡S«HW«6EVS6APSI.t«rH6KI> Sil M <«.1 kMl

.......... » »НИАТОРвитАШИАтЗИМИАИРААРМт.иРЗ«' • 5M >A «l.XcMI

•*niHMtUJl<tl>MKWttETII$IIMlMrM(>HltMS • • ' >» U IU.S tul

'ис. 10 С-концевые районы рг-rsv-c, pr22S7, si и ss ere-белков. 5 PR2257 последние 8 аминокислот заменены 62 новыми аминокислота-га. В прямоугольниках - консервативный Leu516 (Yaciuk, Shalloway, 1986) к замещение ИЛИ отсутствие c-erc TyrS27.

c-arc IT10AF

ГЯ-С «о

PRZ257 ......

•1 ......

р62зг-згс отмечалось удлинение С-конца на 36 и 23 аминокислотных остатков, соответственно. Сравнение С-концов трех белков не обнаружило никакой гомологии, указывая на то, что ни длина, ни состав С-концевого участка не играют роли в активации трансформирующих свойств. Последние приобретаются только благодаря изменению Туг527. Трансформирующий белок РЯ2257 имеет также дополнительный остаток фосфосерина в v2-фpaгмeнтe, который будучи расположен вблизи каталитического домена киназной активности, возможно, играет роль в ре-гуляторяой функции.

Раздел 4. ИССЛЕДОВАНИЕ СПЕЦЙШНОСТИ ИНТЕГРАЦИИ Rsv С КЛЕТОЧНОЙ ДНК Введение. Результаты исследования интеграции чужеродных генов, в том числе вирусных, с геномом эукариот показали, что стабильное внедрение может происходить во многие места генома клетки хозяина и, таким образом, предпочтительных мест для интеграции не существует. Однако исследования, проведенные в лаборатории Дж.Бернарци, продемонстрировали, что геном эукариот характеризуется строгой компарт-ментализацией и состоит из сегментов ДНК большой протяженности (изохор). принадлежащих к небольшому числу основных классов, которые различаются по уровню содержания ее. Семейства молекул ДНК, полученные из этих классов, могут быть отделены и использованы для исследования распределения по геному любой последовательности. Этот подход позволил обнаружить, что распределение генов и семейств повторяющихся последовательностей не статистично в геноме и что сс-уровень кодирующих и не кодирующих последовательностей, содержание ос в третьем положении кодона и уровень потенциальных сайтов для метилирования линейно коррелирует с с с- уровнем изохор. Открытие такой структурной организации позволило поставить вопрос о том, является ли интеграция ретровирусных последовательностей случайной, что считается общепринятым, или она "предпочитает" определенные классы изохор.

Материалы и методы. Использовались линии трансформированных клеток из опухолей, возникших у сирийского хомячка после введения измельченной опухоли цыпленка, индуцированной инокуляцией хс йэу (эуоЬоаа, 1901). Клетки различных линий, как было показано (эуо-ЬоЬа ег а1. ,1983,1984 и см. Разд.5), содержат различное количество (^-специфических последовательностей: Н42 - 7 копий провиру-са, Н-20 и Н-18 - полный провирус со всеми вирусными генами; Н-12 Н - полный провирус и отдельно несколько его фрагментов; Н-9 и

-14 KI - проЕирусы с делецияш в структурных генах; H-I9 - только ен src, обрамленный ltr. Все исследованные линии клеток обладают ысокой туморогенностыо, которая проявляется при их инокуляции хо-якам.

Высокомолекулярную клеточную ДНК, полученную из этих клеток, ак описано Bemardi и Sadron (1964), центрифугировали в градиен-е плотности cs2so4 в присутствии 3,6-бисацетатмеркурийметилдиок-ана (salinas et al.,1986). Распределение ДНК по Gc-составу во ракцяях контролировалось с помощью аналитической центрифуги. ДНК з фракций рестрицировали ecori, подвергали элентрофоретическому азделению в О,7Д агарозе, переносили на нитроцеллюлознш фильтры гябрвдизовали с patv8-зондом, включавшим полную rsv-провирусную НК, 0,0Р-меченную ДНК-полимеразной реакцией в присутствии рассеян-ой затравки до удельной радиоактивности 2x10^ имп/мин-мкг. зз.ультаты и их обсуждение. Как показали эксперименты, провирусная Ж во всех клеточных линиях из хомячьих опухолей, индуцированных ярусом саркомы Рауса, обнаруживается в 7-ой фракции о плавучей яотностыо 1,7100 г/см®. На рис. II показаны результаты, полученные ДНК из клеток H-I2KI. Провирусная ДНК из линии клеток Н-42 обна-/живается также еще в двух более легких фракциях, однако, посколь-j клетки этой лишш содержат 7 провирусных копий, пока нельзя ска-)ть, находится ли в этих фракциях экспрессирувдаяся провирусная ЗК, т.е. та, которая привела к возникновению и продолжает дальше юсобствовать поддержанию опухолевого фенотипа.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что интегрирован-ш провирус саркомы Рауса локализуется предпочтительно в Gc-бога->м участке генома, составляющем не более 10% его последовательнос-!Й. Результаты могут также говорить ц/иля о большей стабильности «ранения аровируса в специфическом небольшом участке генома. На ¡новании описанных данных неясно, происходит ли интеграция провиса изначально в этот комлартмент генома или имеет место селекция тегрироЕанных провирусных последовательностей в связи с формиро-нием опухолей. Однако в обоях случаях такой участок генома, без-ловно, важен для поддержания опухолевого фенотипа, янициировая-го ретровирусом.

В следующем разделе будет показано, что для поддержания опухо-вого фенотипа нет строго обязательной необходимости в. экспрессии русного гена src, индуцировавшего процесс злокачественной транс-

Рис. II Локализация кэу- провирусных последовательностей в ДНК трансформированных клеток хомяка Н-12 М. А - Препаративное центрифугирование ДНК в грациенте плотности сз2эо4 в присутствии БАВД. Стрелкой указано направление увеличения плотности в градиенте. Б - Аналитическое центрифугирование в градиенте ПЛОТНОСТИ СвС1 _ ДНК из фракций 1-8. В

12)456761 1.705 1.715 ^

% указано относительное содержание каждой

фракции в суммарном препарате. В - Гибридизация ДНК из 1-8 фракций после рестрикции Есот и электрофореза в 0,8$ агарозе с рдтув-зовдом.

формации. Значит в этом процессе имеет место другой механизм, отличный от того, в котором участвует ген вгс. Для выявления генов, в том числе и клеточных онкогенов, чья транскрипционная активность может инициироваться провирусом язу в ходе опухолеобразования, данная модель представляет исключительный интерес и требует дальнейшей разработки. Использованный подход, предложенный в лаборатории Дк. Бернарди по идентификации локализации нуклеотвдных последовательностей специфических генов в определенных компартментах генома, открывает также новую перспективу для оригинальных исследований по выяснению молекулярных механизмов адаптации ретровирусов к клеткам условно пермиссивных хозяев.

Раздел 5. СТРУКТУРА И ЭКСПРЕССИЯ ВИРУСА САРКШЫ РАУСА В КЛЕТКАХ

МЛЕКОПИТАЩИХ

Введение. Индукция трансформации клеток в культуре и образование опухолей у животных вирусом саркомы Рауса обуславливаются геном вгс, входящим в состав вирусного генома. Вирусный онкоген обычно

[к К

ни

К I

2 3 4 5 « 7

Г» » <М О. м «

& о — г. ■ «о 5

ОЬООО о о р -

N N Г»

т. он.

-г.»

-2.5

Б А««»

\ (.70

-О V) \

\IAV._J \

-и

•Л

1.702,;

1.7039

70 4 г

1.70»,

Й-V" »5

фиксируется в геноме клеток хозяина, и его транскрипция регулируется СИЛЬНЫМ вирусным промотором (Bishop,1977).

Трансформация вирусами птичьих сарком меток млекопитающих (Зильбер, Крюкова,1957; Свет-Моддавский, Скорикова,1957) представляет удобную модель для исследования взаимодействия вирусного и клеточного геномов. Такие клетки, трансформированные вирусом саркомы Рауса, незаменимы в эксперименте, поскольку хромосомная ДНК таких клеток не содержит эндогенных вирусных последовательностей, способных гибридизоваться с ДНК Rsv.

Материалы и методы. Моноклеточные клоны rvp3k2 и rvp3k3 получены из опухоли мыши (57BL/6), которая была индуцирована подкожной инокуляцией пассированных в культуре клеток куриной саркомы, вызванной у цыплят Pr-Rsv-c (Rynditch et al.,1983). Линия клеток Н-35 выделена из опухоли сирийского хомячка, возникшей в результате внутри-эмбрионального введения клеток куриной саркомы. Эта саркома получена у цыплят инокуляцией фибробластов, которые были трансформированы С ПОМОЩЬЮ ДНК хс-клеток (Svoboda et al.,1983). Линии клеток H-2257-I, S-2257-2, Н-2257-ЗТ и Н-2257-ЗМ выделены соответственно из трех различных опухолей и метастаза третьей опухоли, образовавшихся после внутриэмбрионалшого введения сирийским хомячкам клеток куриной саркомы 2257 (см. Разд. 3 ).

Результаты и обсуждение. Опухолевые клетки мыши Rvp3 и хомяков Н-35, Н-2257 (Рындич и соавт.,1985 ) так же, как и другие линии хомячьих КЛеТОК, ПОЛучеННЫе ПОДОбНЫМ СПОСОбОМ (Svoboda et al.,1983, 1984), обладают чрезвычайно выраженной способностью индуцировать возникновение злокачественных новообразований при инокуляции животным того же вида, от которых они бшш получены. Так, введение мышам и хомякам, соответственно, уже 100 клеток вызывало образование опухолей у всех исследованных животных. Однако ни в одном случае при слиянии этих клеток с фибробластамя цыплят, содержащими вирус-помощник (td-мутант Вогта; vogt, 1971), не был получен трансформирующий вирус и не был обнаружен gs-антиген.

Гибридизация ядерной ДНК клеток Rvp3«3, рестрицированной EcoRi, с зондом 32p-patv8 не выявила никаких вирусспецифкческкх последовательностей. Провируснне гены не обнаруживались как после 20-кратного пассирования клеток in vivo, так и в клетках после одного пассажа in vivo, которые до этого культивировались in vitro (рис. 12,А ) • В качестве положительного контроля использовали ДНК

Л 1

3 4

5 6

2-1

.1*

—2

-г1.5

Рис. 12 Тест на абу-последовательности в ДНК (а) Клеток уток, трансформированных

сlaPr-RSV-C, ПОЛОЖИтельный контроль (1), опухолевых клеток мышей (гуя3кз, 1-й пас-"_о,э саж (г), нормальных клеток мышей (з), опухолевых клеток мышей яур3кз, 20-й пассаж (4) ; СБ) - нормальных клеток сирийского хомячка (1), опухолевых хомячьих клеток Н-20, положительный контроль (2), опухо левых крысиных клеток Х0, положительный контроль (з), хомячьих клеток Н-35 (4); (в) - опухолевых клеток сирийского хомячка

н-2257-1 (1), н-2257-2 (2), н-2257-зт (3), н-2257-зм (4), н-20, ПОЛОЖИТвЛЬНЫЙ КОНТрОЛ!

(5), нормальных хомячьих клеток (6). Рестрикция ЕсоК1, гибридизация с зовдом рдтуа Размеры фрагментов указаны в }ДЦа.

О.в—

из клеток уток, трансформированных ¿аРг-кзу-с, включавших около ш ти копий провируса на геном.

В хомячьих клетках линии Н-35 последовательности «зу- генов также не обнаруживались, хотя чувствительность метода позволяет выявить даже одну провирусную копию на клеточный геном. В контрольна эксперименте с ДНК линии Н-20 опухолевых клеток сирийского хомячка отмечался четкий положительный сигнал (рис. 12,Б). Эти клетки был получены тем же путем, что и линия клеток Н-35, однако, в отличие

т последних содержат в своем геноме один полный Rsv-провирус и ри слиянии с фибробластами цыплят, содержащими вирус-помощник, редуцируют трансформирующий вирус (Svoboda et al.,1983).

Клетки куриной саркомы, с помощью которых были индуцированы пухоли Н-2257 у сирийских хомячков, как отмечалось в Разд.З, ока-ались вируспродуцирующими. Вирус, выделенный из этих клеток PR2257) трансформирует эмбриональные куриные клетки in vitro и ызывает опухоли у цыплят. Однако ни в одном из исследованных гено-ов хомячьих клеток Н-2257 не обнаружены вирусспецифические после-овательности-при гибридизации с зондом, включавшим полный провирус уриной саркомы (Рис. 12,В).

Таким образом, для нескольких линий опухолевых клеток показано элное отсутствие в их геномах последовательностей генов rsv (в dm числе и гена src), с инфекции которыми началась цепь событий, риведших к возникновению этих опухолей. Ретровирусные ltr, кото-ае могли бы активировать клеточные онкогены, иногда трудно заме-ш>, если в качестве гибридизационного зовда используется реком-инантная плазмвда с встроенным в нее полным провирусом. Действи-?льно, при гибридизации ядерной ДНК с зондом Rsv ltr такие нукле-гвдные последовательности были обнаружены в клетках Н-2257-2 и -2257-ЗМ, но не определены в клетках H-2257-I, Н-2257-ЗТ, Н-35 и vp3. Ядерную ДНК предварительно гидролизовали рестриктазой ecori рис. 13,А ), сайт для которой расположен в провирусном ltr, или and ш(рис. 13,Б ), которая разрезает провирусную ДНК в участках, зтавляюцих ltr неповрежденными. Как и в опыте (рис. 12) четкий зложительный сигнал наблюдался при гибридизации с ДНК опухолевых геток Н-20 сирийского хомячка.

Нуклеотддные последовательности, гомологичные Rsv ltr, были ¡наружены в двух из пяти исследовавшихся в этой работе линиях хо-гчьих опухолевых клеток, не содержащих нуклеотвдных последователь->стей вирусных генов. Хотя в остальных линиях опухолевых клеток )мячков и мышей ltr не обнаружены, это не исключает их участие в ¡тивации клеточных онкогенов во всех исследованных случаях. Чув-'вительность использованного метода мо;«ет быть недостаточной для [явления коротких участков вирусных ltr в клеточном геноме.

Гибридизация ecori-гддролизатов ядерной ДНК с зондами Ha-ras, N-ras, v-Ki-ras позволила обнаружить перестройки клеточ->го онкогена c-Ki-ras в нлетках Н-2257 (рис. 14 ). В клетках rvp

в 7

«в/-.

■3*

Рис. 13 Тест на присутствие 1.тк в ДНК из опухолевых клеток сирийского хомячка. Гибридизация

— 6.1

зонда (^у ьтяс -« ДНК (а) нормальных клеток сирий-~2-8ского хомячка (1). Н-2257-1 (2). Н-2257-2 (з), —М5 Н-35 (4), Н-2257-ЗТ(5), Н-20, положительный контроль (6), клеток опухоли перепелки, индуцированной Р1?2257, положительный контроль (7), эмбриональных клеток перепелки (а). Рестрикция Есст, (Б) Н-2257-1 (1), Н-2257-ЗТЛ (2), Н-2257-ЗТ (з). Рестрикция на пь 111.

"Ъ

— 126

—13.1

Рис. 14 Гибридизация зонда V—К1-Т88 с ядерной ДНК опу--4.71 холевих клеток сирийского хомячка Н-2257-1 (I, 2 и 3 -—3.79 401 20 и 5 мкг соответственно)»

—З.о

. _3>02 нормальных клеток (4, 5 и ' 6 - 40, 20 и 5 мкг соответственно ).

никаких заметных изменений в организации с-к1-гаа не обнаружено. Подобные перестановки, по-видимому, также могут иметь значение для активации экспрессии клеточного онкогена, необходимой для поддержа-

ния опухолевого фенотипа.

Ядерная ДНК ХС-клеток из крысиной фибросаркомы, полученной введением клеток куриной саркомы, содержит до 20 копий провируса и способна трансформировать куриные фибробласты, инокуляция которых индуцирует саркомы У цыплят (Уагтиэ еХ а1.,1973). ВнуТрИЭМбрИО-нальное введение клеток такой саркомы сирийским хомячкам вызывает у них появление злокачественных опухолей. Показано, что ядерная ДНК из клеток этих опухолей содержит как полный (линия Н-42 - 7 копий, линии Н-18 и Н-20 - полные копии с вирусным геном зге), так и в различной степени делетированные (линия Н-12 содержит полный и отдельные провирусные фрагменты, линия Н-9 и Н-14 - с делециями в структурных генах) вирусные геномы вплоть до ситуации (линия Н—19), когда ядерная ДНК содержит только ген эге с прилежащими участками 1_тр! (эуоЬс^а а1.,1983, 1984). Здесь же впервые обнаружено, что в клетках опухолей млекопитающих могут полностью отсутствовать гены изV-провируса, инициировавшего их образование. Мы наблюдали это как в клонированных клетках опухолей мышей и сирийского хомячка, индуцированных как внутриэмбриональнш введением игл суспензии клеток куриной саркомы ( получена у цыплят инокуляций фибробластов, трансформированных с помощью ДНК ХС-клеток), так и в клетках из опухолей сирийского хомячка, индуцированных новым саркомным вирусом

ИЗ ПТИЦ Р1*2257.

Опухоль (?ур3 была получена у мышей в 1965 г. (виЬеШк е* а1., 1967) и около 402 последовательностей провирусного генома определялось в ДНК этих клеток (эуоЬоаа в г а1.,1977). Более того, ви-русспецифическую РНК можно было обнаружить как в гяРНК (яулсИесИ ег а1.,198 3), так и в Цитоплазме (татозуап ег а1.,1980). В случае гяРНК кзу-специфическая РНК составляла около 0,0064%, что соответствует порядка 30 эквивалентов вирусного генома на клетку. При анализе же РНК из клонов вур3к2 и ^р^кз после многократно повторенных (до двадцати) пассажей клеток во взрослых мышах количество вирусспецифяческой франции в ядерной РНК клеток снижалось практически до уровня контроля. При этом вирусспецифические последовательности еще выявлялись в клеточной ДНК как гибридизацией в растворе, так и «^-гибридизацией (яуттси в» а1.,198з). Однако через несколько лет усиленного пассирования этих клеток на животных рзу-специфические последовательности были полностью утрачены из клеточной ДНК (Рнццич И соавт. ,1985 ). НиЫгаап И ОовгПвг (1983) также

обнаружили, что при пассировании клеток опухолей, индуцированных у хомяков аденовирусом типа 12, может происходить постепенная утрата вирусспецифической ДНК, интегрированной с геномом хозяина. При stow из 39 индуцированных опухолей в трех случаях рестриктная карта Adi; ДНК не изменялась свыше десяти пассажей, а в трех образцах вируснук ДНК не определяли уже после первого пассажа. Аналогично в трех из 39 опухолей, иццуцированных у цыплят восстановленным вирусом миело-бластоза, не обнаруживались провирусные последовательности (Bister et al.,1983).

Таким образом, показано, что трансформационно-активннй ретровя рус, инициировавший образование саркомы, может быть удален из клетки без исправления опухолевого фенотипа. Последний может поддерживаться за счет изменения экспрессии клеточных протоонкогенов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Клетка-хозяин мажет сопротивляться вирусной инфекции, не позвс ляя вирусу войти внутрь или нарушая внутри цепь событий, ответстве!-ных за экспрессию вирусных генов. Вход для вируса блокируется отсуа ствием клеточного рецептора, требующегося для проникновения вируснс го генома в хозяйскую клетку. В общем вице трансформация любым штал мом вируса может происходить только для одного типа клеток-мишеней. Однако ретровирусы даже тех штаммов, которые специально культивируются в лаборатории, как правило, представляют собой смесь по меньшей мере двух различающихся геномов (vogt,i97i).

К примеру, вирус саркомы Рауса, Пражский штамм, имеющий, как нам удалось выяснить, длинную историю после выделения Rsv в США (Rous,1911), бесконтрольного культивирования В Европе (Engel-breth-Holm,?;Svoboda, Hasek,1956; Svoboda,1958 ; Svoboda, Grozda-novlc,1959 ; Svoboda,1960,1961,1962,1963,1964), передачи Я-Свобс дой обратной в США рг-rsv, оказалось состоял, в основном, из вирусов подгруппы А И В И ТОЛЬКО на 5% - подгруппы С (Vogt, Ishizaki, 1966). в основе разделения ретровирусов на подгруппы лежит круг хозяев, перекрестная интерференция рецепторов, нейтрализация антителами (Hanafusa,1965; Rubin,1965; Vogt, Ishizakl,1965), ЧТО ВО многом обуславливается различиями в последовательностях вариабельных участков др85- кодирующих доменов гена env (Bova et al.,1986) pr-Rsv-c культивировали далее в Университетских лабораториях Нью-Джерси на фибробластах Fertile Hyline White Leghorn (Smith, Bernstein,1973), после чего снова вернули в Европу, где пассировали

рее на цыплятах Brown Leghorn, имеющих последовательности rav-o 3 разных локусах, 3 ИЗ которых транскрибируются (Gudkov et al., 1986). Пул этого вируса, использовавшийся в экспериментах по адаптации rsv к условно пермиссивному хозяину - утиным клеткам (Hio-zanek et al.,1979), МОГ быТЬ СМвСЬЮ, КЭК МИНИМуМ Вируса, СИКВенИ-эованного в составе patvs в лаборатории У.Гилберта (Schwartz et il.,i983) и рекомбинировавшего с rav-o его варианта, сиквениро-занного в нашей лаборатории (Рыцдич и соавт. ,1989). Подобная ре-<омбинация, как показыает проведенный нами анализ, могла произойти i в случае рг-rsv-c, который культивировался в университетских ла-5ораториях на цыплятах white Leghorn и структуру генома которого зпределяли через кДНК.

Исследование первичной структуры "адаптантов" rsv к утиным (леткам позволило выявить корреляцию изменений в нуклеотидных пос-гедовательностях дра5-кодирующего домена гена env с расширением tpyra хозяев. Однако в отличие от рекомбинанта ntre-4, который :тал способен размножаться в клетках индюка после приобретения r-Rsv-в rav-o - специфических нуклеотидных последовательностей в hri-вариабельном участке (oomer et ai.,1985), в наших опытах рг-rsv-c стал способен размножаться в клетках утки после приобре-■ения им rav-o- последовательности в двух других участках др85-;одирующего домена гена env ( рындич и др.,1989). Эти данные лег-;е было бы об"яснчть, если предположить, что обнаруженные изменения I др85-ксдирующем домене гена env участвуют не в образовании де-ерминант, узнаваемых только специфическими рецепторами на поверх-ости индюшиных ¡1,м утиных клеток, а способствуют нарушению исход-ой специфичности данного штамма ретровируса только к определенной одгруше рецепторов куриных клеток. Действительно, адаптированный утке вариант рг-RSV-с остался в подгруппе С и продолжал эффек-ивно заражать куриные эмбриональные фибробласты (Hiozanek et al., 979).

Итак, изменения в др85-кодирующем домене.гена env, внесенные утем рекомбинации с rav-o, способствуют проникновению rsv в кле-ку условно пермиссивного хозяина, которую он трансформирует и с jномом которой интегрирует, хотя при первых пассажах еще и не спо-збен к усиленной репликации. Как правшго, остро трансформирующие зтровирусы репликативно-дефектны, и для их репликации требуется ярус-помощник. Pr-Rsv может реплицироваться и без вируса-помощни-

ка, однако, все же менее эффективно, чем его трансформационно-де-фектные мутанты, что особенно заметно в условно пермиссивном хозяине - утиных клетках. Как показало сравнительное изучение нуклеотвд-ных последовательностей daPr-Rsv-c и его td-мутанта, никаких существенных различий в их геномах не обнаруживается, кроме присутствия гена вгс в трансформационно-активном варианте. Таким образом, ген ere в rsv представляет собой чужеродное образование, мешающее его жизнедеятельности, и потому легко теряется при репликации вируса. Удаление нуклеотидной последовательности гена src может иметь место на этапе обратной транскрипции, когда ревертаза проскакивает структурированную, как показывают наши расчеты, область РНК src.

Даже в стоках клонированного rsv может содержаться значительное количество td-мутанта (vogt,i97i-, Рыадич, Кавсан,1989). При многократном пассировании вирусного пула на фибробластах происходит относительное обогащение td rsv за счет значительно большей скорости его размножения: на шестом-десятом пассаже титр td-мутанта на 1-2 порядка выше титра трансформирующего вируса. Это примерно соотношение, при котором вирус-помощник обычно способствует размножению репликативно-дефектного остро-трансформирующего вируса (ва-luda et al.,19В2). Как было показано в нашей работе, наличие td-мутанта с высоким титром коррелирует с ускоренным размножением dapr-Rsv-c в условно пермиссивном хозяине - утиных клетках.

Непермиссивные хозяева - клетки далеко отстоящих по эволюционной шкале животных (млекопитающих), по-видимому, не имеют соответствующих рецепторов и потому не заражаются куриным вирусом рг-rsv-с, даже если он в силу отмеченных выше причин способен заражать клетки близкородственных видов (перепелки, индюки, утки). Путем трансфекции этот барьер может быть преодолен, может произойти интеграция Rsv и даже трансформация клеток мыши (svoboda et al.,1977), крысы (MItslalls et al.,1983), СИРИЙСКОГО ХОМЯЧКа (Svoboda et. al.,1983). Однако заражение вирусом, спасенным из этих клеток, может происходить не дольше трех-четырех пассажей из-за постоянного снижения титра (svoboda,1981) и, как было показано (Hillova et al.,1974), дщ таких клеток не содержит геномов td rsv.

С другой стороны, когда для инфекции использовали daPr-Rsv-c, у хомячков возникали опухоли, в которых вирус обнаруживался как при инокуляции цыплятам, так и при слиянии с cef или def (Hlozanek, личное сообщение ) • Такой вирус уже может реплицироваться в клетках,

которые становятся для него пермиссиЕНыми, т.е. произойдет образование нового ретроЕИруса. Дальнейшая дивергенция исказит его черты, оставив лишь консервативные участки, в частности гена pol. как это, например, случилось с вирусом регикулоэндотелиоза (вапег и Temln,1980) .

В силу своей дефектности остро трансформирующие ретровирусы мало жизнеспособны и не существуют длительное время в природе, если их не поддерживать искусственно. Например, у кур известны лишь редкие ЭПИЗООТИИ сарком ИЛИ острого лейкоза (Purchase, Burmeister, 1978). Саркомные ретровирусы, по-ввдимому, образуются кавдый раз заново в результате захвата и преобразования клеточных генов типа arc, так называемыми лейкозными или, в общем виде, нетрансформирующими ретровирусами. В эксперименте моделью такого превращения служили td-мутанты Rsv с неполной делецией src-гена, у которых оставались 5 - и/или 3 -концевые участки. По мнению Parwin и Wang (1984), такое восстановление трансформирующей активности происходит путем рекомбинации о c-src при условии сохранения и за счет хотя бы 100-200 н. 3 -концевой части v-erc. Однако, как уже отмечалось, структура pr-Rsv, скорее исключение из обычной организации птичьих ретровирусов саркомной группы» Поэтому такой механизм образования онкогенного ретровируса встречается в природе, по-ввдимому, крайне редко. Охарактеризованные нами td- мутанты рг-rsv-c близки по структуре к вирусам лимфоад-лейкозной группы, встречающихся в природе у птиц, и до настоящего времени не было сообщено ни одного случая "восстановления" полностью дефектных по гену src мутантов. Описанную в нашей работе структуру ретровируса, возникшего в результате рекомбинации td рг-rsv-c с c-src, скорее можно назвать новым птичьим ретровирусом сарком, чем "восстановленным" вирусом саркомн Рауса.

Как показал анализ полной нуклеотидной последовательности, новый вирус (PR2237) образовался в результате трансдукции сплайсиро-ванной копии гена c-src и 957 н.п. 3*-фланкирующей клеточной ДНК. Транедукция элиминировала почти все репликативные гены td dapr-Rsv-c, как это обычно имеет место при образовании диких остро трансформирующих ретровирусов: у PR2257 с 5'-конца донорный сайт сплайсинга гена gag соединен с акцепторным сайтом сплайсинга erc-гена, а на 3 -конце рекомбинация произошла в конце гена env. В образовании 5 - и 3 -нетранслируемых районов приняли участие рекомби-

нации экзогенного и эндогенного вирусных геномов. Инсерция двух ци-тозинов перед и после терминирующего кодона c-src привело к увеличению кодирующей порции до 587 н., дивергенции последовательностей после Рго525 и замене Tyr527—vai. Последнее, по-видимому, является критическим для активации онкогенного потенциала гена sre.

Экспрессия v-src изменяет ряд морфологических и биохимических характеристик, что в конечном итоге приводит к злокачественному перерождению клетки. Как было показано в этой работе, для поддержания опухолевого фенотипа нет строго обязательной необходимости в сохранении как генов, участвующих в репликации вируса, так и в функционировании вирусного онкогена. Утрата из опухолевой клетки генов вируса, инициировавшего злокачественный процесс, представляет, по-видимому, довольно распространенное явление, характерное как для ДНК-, так и для РНК-содержащих опухолеродных вирусов. В этих случаях поддержание неоплатической трансформации может иметь место за счет активации онкогенов клетки, если они оказываются размещенными вблизи вирусных ltr. Для активации соответствующих онкогенных потенциалов клеточных протоонкогенов могут иметь значение также перестановки типа обнаруженных в c-xi-ras. По-видимому, вирусная этиология рака может встречаться чаще, чем это считалось до настоящего времени. Нельзя исключить, что в осуществлении рекомбинации ретровирусов о клеточным протоонкогеном, в репликативной активности провируса и трансформирующей активности онкогена какую-то роль играет место интеграции ретровирусного провируса с ДНК клетки-хозяина. Показанная предпочтительность интеграции rsv с определенными изохорами клеточной ДНК открывает пути для выяснения поставленных вопросов.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

I. Молекулярно клонирован инфекционный трансформационно-активный провирус адаптированного к утиным клеткам варианта rsv (dapr-Rsv-c) определена нуклеотидная последовательность ltr, генов gag, ere и env (всего 5750 н.п.). Показано участие в его образовании эндоген ного ретровируса rav-o, рекомбинация с которым привела к изменению двух районов дрв5-кодирующего домена гена env.

Культивирование Rsv в клетках условно пермиссивного хозяина при водит к образованию пула вирусов, способных размножаться и вызывать трансформацию клеток других, удаленных по эволюционной шкале животных, таким образом открывая путь к образованию новых ретровирусов. Первичное заражение с последующей интеграцией провируса и трансфор-

ацией утиной клетки происходит за счет вирусных частиц, ген env ко-орых в определенных локусах рекомбинировал с геном env эвдогенно-о куриного провируса. При последующих пассажах трансформационно-ктивного вируса его репликация затрудняется из-за присутствия гена '-ere, а td-мутанты накапливаются в значительно больших количес-вах, возможно, играя роль вируса-помощника для репликации "адапти-ованного" варианта Rsv в клетках неприродных для него хозяев.

2. В составе геномной библиотеки утиных фибробластов, трансфор-ированных адаптированным вариантом rsv, клонирован провирус транс-ормационно-дефектного мутанта, Анализ нуклеотвдной последователь-ости выявил родственную связь td-мутанта с daPr-Rsv-c, у которо-о произошло полное удаление гена arc по границам прямых повторов.

rsv в силу особенностей своего строения легко теряет ген ere. отеря v-src, вероятно, происходит при обратной транскрипции стру-турированного участка РНК sre, что приводит к образованию частич-ых и полных td- мутантов, способных транедуцировать клеточный зге-ген.

3. Молекулярно клонирован инфекционный, траксформациошю-активннй ровирус нового ретровируса птичьей саркомы PR2257, который, как оказал анализ всей его нуклеотвдной последовательности, образовал-í m vivo в результате присоединения сплайсированной копии гена -sre вместе с 3 -прилежащими 956 н.п. клеточной ДНК курицы к до-эрному сайту гена gag полного td-мутанта daPr-Rsv-c. з'-реком-лнация имела место в конце вирусного гена env, в окончательном язайне нового вируса приняли участие рекомбинации с последователь-эстями эндогенного ретровируса в 5 - и 3 -нетранслируемых районах, геерция двух дополнительных нуклеотидных остатков до и после тер-1нирукщего кодона c-src, соответственно, привели к удлинению кочующего района и замене Туг527 остатком val, что существенно

и активации онкогенного потенциала src-гена.

Следовательно, полные td-мутанты Rsv, подобно вирусам лейкозов ?иц, после длительного инкубационного периода также могут вызывать фкомы в результате транодукции и преобразования клеточного c-src. )и этом, в отличие от неполных td rsv, транедукция приводит к эли-[нированию в большей или меньшей степени вирусных генов, давая в !зультате репликативно-дефектные остро-трансформирующие вирусы, вдающиеся в вирусе-помощнике для обеспечения жизненного цикла.

4. Показано, что в линиях клеток сирийского хомячка, трансфорш-

рованннх Rsv, провирусше нуклеотидные последовательности встраиваются только в определенную фракцию высокомолекулярной ДНК с высоким содержанием G и С, и составляющую менее 10$ от всего генома.

Эти опыты подтверждают данные генетического анализа о том, что существуют локусц, вероятность интеграции ретровирусных провирусов в которые значительно выше, чем в остальные участки генома.

5. Охарактеризованы линии клеток млекопитающих, изначально трансформированных Rsv. Показано, что наряду с содержащими полные ц/ил дефектные провирусы, включающие ген src, в некоторых линиях опухолевых клеток не определяются нуклеотидные последовательности ни вирусных репликативных генов, ни v-src. Для двух из них показано наличие вирусных LTR, интегрированных с клеточным геномом; в одной лиши обнаружены перестановки в гене c-Ki-ras.

Таким образом, для поддержания опухолевого фенотипа нет строго обязательной необходимости как в сохранении генов, участвующих в репликации онковируса, так и функционировании гена src, инициировавших злокачественную трансформацию. В этот процесс могут вовлекаться клеточные протоонкогены, активирующиеся вирусным промотором в LTR либо за счет перестройки в салом протоонкогене.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах

1. Кавсан В., Рыццич А. Выделение РНК-зависимой ДНК-полимеразы (ре— вертазы) из вируса миелобластоза птиц//Ш Всесоюз.симп. по химии пептидов и белков: Тез.докл. - Киев, 1974. - С.55.

2. Синтез ДНК на матрице гетерогенной ядерной РНК ДНК-полимеразой вируса миелобластоза птиц /В.Кавсан, А.Рындич, О.Лукшина и др. // Молекуляр.биология. - 1975. - Т.9, №5. - 0.768-774.

3. Kavean V.,Rynditch A.,Samarina 0.,Georgiev G. DNA-synthesle on giant nuclear RNA by AMV DNA-polymerase//Mol.Biol.Reports.-1975. -V.2,N3.-P.203-207.

4. Кавсан В.,Рыццич А. Определение поли/А/-последовательностей в РНК с помощью реакции обратной транскрипции//Докл.АН УССР.-1976.-Сер.Б, JS7. - С.630-634.

5. Сравнительное изучение РНК-зависимых ДНК-полимераз вируса миелобластоза птиц и вируса виснц/В.Кавсан,М.Чумаков,Г.Флеер,А.Рындич и др.//Докл.АН СССР. -1976.-Т.230.Н.-С.227-229.

6. Virus-specific nuclear RNAs in clone« of mouse tumor cell linee transformed by Rous sarcoma virus/A.Ryndltch,1.Svobodo.O.Mach •t al,//Fol.biol. -1983.-V.29.-P.273-281.

'. Выделение обратной транскриптазы вируса миелобластоза птиц в сепаративных количествах/О.Ставерская,Г.Добровольская,В.Кавсан, кРшщич и др.//Укр.биохим.ж. -1984.-Т.56, Й5.-С.503-514. !. Реорганизация структуры провируса rAsv, интегрированного в опу-:олевые клетки хошка/А.Рындич,И.Герин,Б.Яцула и др.//16-я конф. >ЕБ0: Тез.докл. - М.,1984. - 0.302.

I. Отсутствие генов вирусов саркомы птиц в трансформированных игли :летках млекопитаюцих/А.Рындич,И.Герик,В.Лготак и др.//Биополимеры i клетка.-1985.-T.I, №2.-0.92-99.

0. Rynditch A.,Svoboda I.,Hlozanek I.,Yatsula В. Alterations in Sous sarcoma virus genome sequences after infection of се11з of inrelated hosts//Macromolecules in the functioning cell/Ed.A.A. )ayev. - Puschino,1986. -P.98-103.

Л. Rynditch A.,Yatsula B.,Hlozanek I.,Svoboda I. Instability of ^SV genomes structure in mammalian and duck cells//Blol.Chem. (oppe-Seyler.-1986.-V.367, suppl.-P.226.

12. Virus-specific nucleotide sequences in duck cells transformed iy chicken and duck-adapted RSV/A.Kynditch, B.Yatsula, I.Hloza-lek et al.//Fol.biol.-1986.-V.32.-P.145-153.

.3. RSV sequences in duck cells/V.Kavsan, A.Rynditch, B.Yatsula it al.//18th FEBS meet.¡Abstr. - LJubljana,1987. - P.95. .4. The fate of RSV sequences in the transformed duck cells/V. :avsan, A.Rynditch, B.Yatsula et al.//lX meet.EACR» Abstr. -lelsinky,1987. - P.24.

5. Alterations in Rous sarcoma virus genome after adaptation on luck cells/A.Rynditch, B.Yatsula, V.Kavsan et al.//XVIl meet. TVGi Abstr. -Dresden, 1987. - P.97.

6. Molecular characterization of full transformation defective utants and their role in the generation of new ASV/A.Rynditch, .Geryk, I.Nehyba et al.//14th Internat.Cong. of Biochemistry» bstr. - Prague, 1988. - P.149.

7. Generation of new avian sarcoma viral genomes/A.Rynditch, V. ashuba, B.Yatsula et al.//VI Symp.USSR-Italy "Macromoleculee in he functioning cell":Ab9tr. - Leningrad, 1988. - P.124.

8. Genome structure of a new avian sarcoma virus PR2257 deterral-ed by restriction analysis/I.Nehyba, 0.Svoboda, I.Ksrakoz, A. ynditch et al.//Fol.blol.-1988.-V.34.-P.289.

9. Rous sarcoma virus (td daPr-RSV-C) region of deletion/V.Ke-

shuba, S.Zubac, A.Rynditch et al.//The EMBL Data Library. -1989. - Ac. NX 13818.

20. The nucleotide sequence of the region of ere gene deletion in transformation-defective Rous sarcoma virus adapted to semi-permissive host cells/V.Kashuba, S.Zubac, A.Rynditch et al.// Nucl.Acids Res. - 1989.-V.17, N5.-P.2120.

21. Семейство генов env птичьих ретровирусов: молекулярный анализ вариантов вируса саркомы Рауса, адаптированного к утиным клеткам/ А.Рывдич, В.Кашуба, В.Кавсан и др.//Молекуляр.биология. - 1989. -Т.23, №5. - С.934-941.

22. Roue sarcoma virus (daPr-RSV-C) env gene/A.Ryndltch.V.Kashubi V.Kavsan et al.//The EMBL Oata Library. - 1989. - Ac. NX 14641.

23. Рындич А.,Кавсан В. Адаптация онкогешшх ретровирусов к новым хозяевам/Вестник АН УССР. - 1989. - №6. - С.30-34.

24. Структура нового трансформационно-активного мутанта вируса саркомы Рауса/В.Кашуба, С.Зубак, З.Лазуркевич, А.Рындич и др.//Докл. АН СССР. - 1989. - Т.304, №1. - С.206-208.

25. Transduction of the cellular sre gene and 3'adjacent sequences in avian sarcoma virus PR2257/I.Geryk, P.Dszellee, D.Barnier O.Svoboda, O.Nehyba, I.Karakoz, A.Rynditch et al.//J.Virol. -1989.-V.63, N2.-P.481-492.

26. New ASV genome organizetion/A.Rynditch, V.Kashuba, S.Zubak e al./8 symp.USSR-FRGi Abstr. -Irkutsk,1989. - P.75.

27. The nucleotide sequence of the env-gene of Rous sarcoma vlrui adapted to semipermlsslve host с ells/A.Rynditch, V.Kashuba, V. Kavsan et al.//Nucl.Acids Res. -1989.-V.17, N15.-P.6450.

Материалы диссертации докладывались также на конф. Программы "Обратная транскриптаза" (Москва,1973; Рига,1974; Прага,1976; Ново-сибирск,1977; Потсдам,1979; Киев,1980; Рига,1982; Либлице,1984; Таллин,1988 ), Ш-1У Всесоюз.биохим.с"ездах (Рига,1974; Ленинград, 1979 ). ХУП-Х1Х симп. ФЕЮ ( З.Берлин, 1986; Рим, 1989 ), У смезде ВОГ'иС (Москва, 1987), УШ конф. eacr (Братислава, 1985 ), Всесоюз. конф. "Молекулярная биология генов высших организмов" (Москва,1987; "Макромолекулы и клетка" ( Москва,1989).

Информация о работе

Рындич, Алла Владимировна
доктора биологических наук
Киев, 1990
ВАК 03.00.03

Автореферат

Похожие работы