Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетическая трансформация клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ ТК- ) геном поверхностного антигена вируса гепатита В

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Генетическая трансформация клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ ТК- ) геном поверхностного антигена вируса гепатита В"

■&0 и 3'

ЗСЕСОСЗТЫЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА НАУЧНО^ССВДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ' ЭОТЕРИМЕНТАЛЬНО!!' ВЕТЕРИНАРИИ IWEHH Я. Р. КОВАЛЕНКО

РОССИЙСКАЯ АКАДИИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВШЬК НАУК

На лразах рукописи

САВЧЕНКОВА Ирина Петровна

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ТРАНС&ОРМАЩЯ КЛЕТОК ПОЧКИ ЭМБРИОНА СВИНЬИ /став ТК~/ ГЕНОМ ПОВЕРХНОСТНОГО АНТИГЕНА ВИРУСА ГЕПАТИТА В

03.00.23 - ЕИОШНйЯОШЯ •

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук '

МОСКВА - 1Ь92

Диссертационная работа выполнена в лаборатсрия клеточной инженерии института вирусологов км. Д.И.Ивановского РДЯН.

Научные, руководители: доктор биолотческих наук .профессор И.Я.Шихов

доктор биологических наук А.АЖуц Официальные оппоненты: доктор биолошческшс наук .профессор Л.Ц.Дьяконса

доктор биологических наук С.ОЛааов ' Ведущее учревдение - Всесоюзный научно-исследовательский институт ветеринарией вирусологии а микробислопш

Защита состоится " аа/ти^ 1992 г. нечаст на заседании специализированного Совета К.020.28.01 при Всесоюзном ар* дена Ленина научно-исследовательском институте-экспериментальной ветеринарии им. Я.Р .Коваленко.

■Адрес института: 109472, г.Моснва, Кузьминки, ВИЭВ. С диссертацией можно ознакомиться в^ библиотеке ШЭВ. Автореферат разослан теЬ/ЮсСЛ^ 1992 г.

Ученый секретарь

спедиализфованного Совета, ' '' •

кандидат ветеринарных наук Ф.Г. Терешков

Подписано в печать 30.01.92. Заказ . 528 Формат 60x84/16 Тирах 120 •

Москва. Типография ВАСЛМЛ :

Г. * Р i

, 1. Я. ; СБЩАЯ ХАРАКТЕШСТЖА РАБОТЫ

О-гдзл j

Актуальность теин. Значительные у спек, достигнут re в области'генетической трансформации соматических клеток гшесмных /То-малин Н.В., 1S87; Глебов O.K., 1589/, стимулировали рост числа работ, в которых исследуется или используется г, et од генетической транс^ормашг. За прозедшие 10 лет генетически, трансформированные клетки с. али одним из самых важных инструментов в исследовании экспрессии генов шекопитаовдх, механизмов злокачественной трансформации, процессов репликации и рекомбинации ДНК. Однако, многие вопросы, в особенности касагзздеся экспрессии чужеродных генов в соматических метках, остаются невнясненюаа.

Актуальность работ по генетической трансформации. клеток *и-вотных связана такта с трудностям, которые выявились при.-про-!зводстве генно-иьтекерных белков в прокариот ных клетках и дротс-sax. Снп обусловлены неудовлетворительным выходом продуктов, плотностью к дороговизной 1«етодик очистки белков и потерей или значительным снижением биологической активности некоторых эукари-ггических белков /особенно таких, для биологической активности, соторых существенны посттрансляционные модификации, в частности 'ликозилирование/. В последнее время предпринимаются попишек шести чужеродную информации в организмы с целью создания траяс-■енных тевотных, содержащих и продувдрузздх чужеродные белки' арнст л.к., 1290/. Однако, методы генетической инженерии для иклоплтаюпах, и особенно для сельскохозяйственных животных пока ' едостаточяо разработаны. Для того, чтобы получать и использовать раке генных млекопитаюгше в биотехнологии, необходимо изучать актеры, от котсрыт зависит тканеспеппфичность экспрессии чужзред-

ных генов .регуляция экспрессии введенных генов, чтобы контролировать уровень выработка нужного продукта. Необходимы дальнейшие исследования, направленные на изучение проблем взаимодействия ге нема соматических клеток с чужеродной генетической информацией. Кроме того, изучение свойств рекомбинантной ДНК и способности, к экспрессии в культивируемых клетках, открывает возможность. для анализа чужеродных генов до введения их в животных.

Цель и задачи исследования. Цель исследования состояла в изучении экспрессия гена поверхностного антигена вируса гепатит; В, введенного в клетка сельскохозяйственных животных.

Для достижения намеченной дели необходимо было решить следующее задачи:

- отработать технику введения чужеродной ДНК, провести генетича кую трансформацию клеток сельскохозяйственных животных /СПЭВ и ТР ЮРТ"/, культивируемых ¡л ;

- создать стабильные линии клеток, экспрессирушДно ДНК плазмид продуцирующие чужеродный белек;

- изучить экспрессию гена поверхностного антигена вируса гепаю та В э клетках СГОВ ТК~;

- изучить возможность регуляции трансгена в культуре генетичбе: трансформированных клеток;

- сравнить экспрессию гена НВ£А^ в искусственно созданной эксп риментальной системе /генетически трансформировали!® клетки сельскохозяйственного животного/ с закономерностями естестве ней экспрессии гена НВ$А§ в культуре клеток гепатокарциномы ловека '

- изучить влияние вдтодифферешдаровкн клеток гепатокарциномы 1 ловека на экспрессию в них НВгАо.

Научная новизна. Впервые в нашей стране проведен анализ

петентности мутантных клеток сельскохозяйственных тавотных /СПЭВ ТК~ и ТР Г*РГ~/ к поглощению и экспрессии чужеродных генов. Выделены наиболее компетентные клоны клеток к аккумуляции и экспрессии трансфицкруемшс ДНК плазкид рН? и -2<ЦрЬ , содержащих ген ТК ВПГ-1 и ген КВЬРТ Е. сой. соответственно. Показано, что клетки свиньи СГОВ ТК- можно использовать для введения и экспрессии чужеродньх генов с достаточно высокой эффективностью трансформации /2-6-1 Э-3/.

Получены генетически трансформированные ¿слетки СПЭВ, содержащие ген поверхностного антигена вируса гепатита В, поставленного под контроль разных регуляторных последовательностей /промоторы iK.TR. вируса саркомы Рауса и гена МТ-1 мыш/. Установлено, что по эффективности трансформации, продукции НВзАс^ я стабильности экспрессии гена НВгА^ более эффективным в клетках ПЕВ ТК~ является промотор вируса саркомы Рауса.

Впервые проведено сравнительное изучение экспрессии гена НВгАд в двух экспериментальных, системах: в искусственной /генетически трансформированные клетки почки эмбриона свиньи/ и естественной /клетки гзлатокарпиномн человека РХС/РКР-5. Показано, что по числу, клеток, синтезирумцн НВ^А^, а также по активности секре-тируемого НВгА^, клетки трансформировании* клонов превосходят клетки гепатокарщномн в 8-10 раз.

Проведено сравнительное иммуноцитохимическое изучение экспрессии генов ВГВ в клетках мутантных клонов гепатокарциномы РЛС/РКР-5, проявляющих признаки плтодяфферанвдровки в различной степени. Установлено, что в клетках части кленов, характеризующихся более высокой степенью цитодифференцаровки /по скорости и ■ характеру роста, экспрессии альфа-фетопротеина и способности, к образованию опухолей у бестимусных мышей/ усиливается экспрессия

гена НЗзАс; и и иду тру е гея экспрессия НВсА^.

Практическая значимость. Показана пригодность клеток мутант-ных штаммов с.-х. тавотных /СПЭВ ТК~ и ТР ГФРГ-/ дня получения генетических транс^ормантов. Получены генетически трансформированные перевиваемые клерки свиньи, продуцирующие ген поверхностного антигена вируса гепатита В человека, продукт экспрессия которого может иметь медицинское значение.

Показана возможность прогнозирования более эффективней экспрессии гена НЗгАд под контролем промотора Х1Я вируса саркаш Рауса /по сравнению с промотором гена ЧТ-1 мыши/ при введении его в геном с.-х. "швстэтых, в частности сшньи.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены: на конференции "Современные направления создания медицинских даа-гностикумов", г.Москва, декабрь 1990 г.; на 44-й научно-мэтодичес-кой конференции аспирантов и молодых ученых ШЗа, п.Дубровицн, июнь 1991 г.; на втором Всесоюзном симпозиуме "теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии" в г.Самарканде, сентябрь 1991 г..

Структура и сбъем работы. Диссертапия изложена на 134 страницах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы и список литературы.

Материалы диссертации иллюстрированы 12-го таблицами и 15-ю рисункаш» Список литературы содержит С1 источник на русском и 191 на иностранных языках.

1. СОБСТВЕННЫЙ ИССЛЕДОВАНИЯ ■

,1.1. Материалы и методы исследований.

В настоящей работе бши использованы независимо полученные мутантныэ клшальные сублинии о* двух перевиваема культур с.-х.-

животных: свиньи /клетки почки эмбриона свиньи СПЬВ/и крупного рогатого скота /клетки трахеи эмбриона коровы ТР/. Полученные Тугазовш Ш.М. в 1985 г. метки СПйВ несли одинарные по ?<>рменту тимидинкиназа /ПС/ или. двойные /по тк~ -Уавзт?е3'/ мутащи. Клетки ТР несли одинарные по ферменту гип'оксантингуанинфосфорибо-зилтрансфераза /1ФРТ~/ или двойные /по ГФРТ^Уабаия^3'/ мутащи. Использовали также перевиваемую линию культуры клеток гепатокар-цнномы челове :а Р^С/РНР-б, имеющую в своем геноме интегрированную полную генетическую информацию вируса гепатита В /ВГВ/ /<Леиал~ ¿гл«Ы..197б/.

В работе быта использованы питательные среды Игла №1, Игла Д"ЕЧ, сыворотка эмбриона керовы, различные растворы, необходимые

для культивирования клеток и постановки экспериментов.

♦

Клеточные линии поддерживали путем периодического пассирования в культуральных сосудах. Пересев меток осуществляли по мере формирования мояослоа.с помощью 0,025? версена и 0,25^трипсина в соотношении 9:1 бесцентрифужным способом. Посевная доза составляла 5'1С^-1«105 клеток в шт.. Концентрацию и жизнеспЗЗобность клеток контролировала путем окраски 0,1$ раствором трапанового синего с последующим шкроскошрованием. Криоконсервиррвание и хранение клеточных культур осуществляли по стандартна! методикам.

Для трансфекщи клетск использовали рекомбинанзшые ЛНК клаз-

мид:

- Плазмида /фирма "£еп>"а" ФРГ/. Сконструирована на основе векторной плазмиды рВЯ322, содержит маркерный ген ксантингуа-нин фосфорибозшгтрансфераза /<рк / Е. со& £ (¿,а(., 1980/.

- Плазмила рН?. Плазмида была предоставлена Филатовым. Ф.П. /инсти-1 тут шрусологии РШН/. В составе векторной плазмиды рВД322

BAH Hl-Q. фрагмент ДЖ ВПГ-1 размером 3,6 квр /2,2 M^/, содержащий ТК ген этого вируса /Силатов 4.П., 1291/. Шгаз?.-зда pEPAS-27. Плазмида была такте предоставлена Филатовым Ф.П.. Плазмида pKPAS-2 7 с рекокблнантнш геном PAS. собранным из последовательностей preS//Pl HAV/HBsA<^ а поставленным noj контроль промотора ^.TR-Блруса саркомы Рауса. В состав плазмидк входят последовательности вирусов: g\/40, саркомы Рауса /Р5У/, ipunna А человека /1АУ, гены белков НА и Vp/, гепатита А чело века /HAV, участок гена V'Pl/, гепатита В человека /НВИ, гены белков HBSAj/ /S / с участка,и зон рге-1 и рге-2 и X, часть ге на НВсА^ /С/ и энхансер /е/ /Силаюв С.П., 1591/.

- Плазмида pt/C-lS, содержащая ген поверхностного антигена шруса гепатита В под контролем прсмотора гена МТ-1 мыши, и плазмида pAQO, содержащая ген ТК ВПГ-1, бшш предоставлены Ендколопо-вым Г.Н. /лаб. нуклеиновых кислот института молекулярной биол< гаи РАН/ Рекомблнантная конструкщя pUQ-19 пса.яйо клонирование! комплементарной ДНК генаНВгА^, содержала прсмоторную область, включающую«акхансер /промотор и часть 5-кснцевсй штранслируе-мой области .м?НК/ гена МГ-1 мыш, донорной и акцепторный участ ки сплайсинга из ранней области, вируса 3/40 и участок пслиаде: дарования из этой же области.

- ДНК-носитель. В качестве ДНК-носителя в экспериментах использо вали ДНК спермы лосося' /фирма " gervü." 5рг/.

Перед транс?екшей плазшдные ДНК двукратно пере осаждали эт ноя ал к растворяли в стерильном буфере /0,1 Ш ЭДТА, 1 Ш трас-' pH 8,0/. Конечная концентрация ДНК составляла 20 мкг/мл.

Трансфекцга проводили кальций-(Тосфатным методом /Глебов 0. и др., 1985/. Через 24 ч. после трансфеквди клетки рассевали по 1*10® на чашки Петра "Cojiar" диаметром 10 см. в. селективную с;

1У ГАТ, содержащую гипоксантин /13,G мкг/мл /, аминоптерин '0,176 мкг/мл /, тиг.яднн /3.78 ккг/ш / /е£,0.£. , LS64; 1965/. Выросиие на 12-15 сут. к си снид либо выделяли с по-лощья титановых сшшдров но методике /Абрамян Д.С. и др. 1981/, шбо фиксировали мзтанолсм 15 мин. и окрашивали Ю£ красителем Гам-за /водный раствор/ в течение 15 мин.. Выделенные колонии трансформированных клеток размножали на среде ГАТ и замораживатк. Ана-из кленов пр шодили спустя 5-10 сут. культивирования на среде ГАТ юеле размораживания клеток.

Экспрессию гена H3sA<j определяли с помощью мояокленальных штягел к HBjAg, полученных и проверенных на специфичность в лаб. слеточной инженерии института вирусологии им. Д.И. Ивановского 'А1 Я Лущ A.A. и др.. 1986; 1SP7/.

Наличие HBsAj в культуральной жидкости и в клеточном 'лизате лзределялп с помогаю двух методов: в реакции пассивной гемагглюта-!ашл /использовачи эрлтроцихарныГ.. диагяоетикум Горькснского НИН JM/ и твердофазного иммуноферментного анализа, разработанного в LH статуте вирусология им. Д.И. Ивановского РА'Ш /Кущ A.A. и др., .987/.

Очистку МКА к HBjAg проводили на протеине А, иммобилизованном ia Cifer-сефарозе 4В/рАддаасi^a "Швевдя"/. Ü(jQ к HBjAg специфически связавшиеся с иммуносорбентом, снимали 0,1 М глициновым буфером >Н 3,0 с моментальной нейтрализацией 1 М TPiS pH 8,9. JjQ к HBSA^ ¡сньюгаровала с пероксидазой хрена /ПХ/ фирж "^гпй." с РХ-3,0. Я связывали с 3jQ к в белковом соотношении 1:1 по пераодат-

■ ому методу /tfa.fca.ne ¿L at, 19Р4/.

Для выявления экспрессии гена НЗ?А^ в клетках культуры исполь-ювали кммуноштохнмнческле методы: метод непрямой иммунофлюорес-кнгяи /И®/ и клеточный вариант иммуноферментного анализа /кИФА/

/ а£. , 1981/.

Клетки выравдвала в пекицилиновых флаконах с покровными стеклами. Концентрация клеток в суслензии составляла 1,5-2,0>105клет/ы объем суспензии 1,5-2,0 ми,. Клетки фиксировали при комнатной температуре 10^ забуференным формалином /20 мин./, а затем дофикси-ровали 70% этанолом /20 шн./. При проведения К!> использовали антивидовой, против С^Ч мши, коньюгат меченный ШТЦ /фирма "$сдмх Клетки микроскопировали под водной иммерсией на микроскопе ."лю-ман", испсяьзуя фильтры /с длиной волны 470-490 нм./. При постановке кИФА применяли козлиные антитела против ЯдЦ мши меченный ПХ /фирма "В£о-Яас£'/ и диаминбензидин'тетрахлорид фирмы "Ва^таГ з качестве субстрата.

Внутренний белок вируса гепатита В человека /НВсАд/ определяли с помощью иммуноглобулинов антя-НВсАд человека.

Наличие альфа-фетапротеина в культуре кле.ток гепатокарвднежш человека РоМЗЛ'ЕР-Б выявляли с помощью метода пероксидаза-антипе-роксидаза / Тауёог- а£., 1978/. МКА к А$П бшш предоставлены йзозой А.К. /НИИ Канцерогенеза СНЦ РАМН/. Антивидовая сыворотка и ПАД-комплекс бшш предоставлены урайзер т,Л. ' /НИИ Канцерогенез ОНЦ РАШ/.

Онкогенные потенции клеток изучали путем введения бестимуснь ышш Ва£в/Д /ш/пцшш / подкожно в область спины по 2>10е

кленок. Подсчитывали число мышей с опухолям через 3 недели.

Способность роста в мягком агаре /2,5$-й слой агара А'^зо / определяли по частоте образования колоний. Клонирование клеток '• осуществляли путем посева в различных концентрациях /1«10^, 2«102, 5-10^, 1-Ю3/ на чашку Петри диаметром 60 ш. Клетки фи) сировали в 70$ этаноле и окрашивали по Гимза. Подсчитывали чиоло выросших клонов и определяли ковффицаент-вффективности клширова

ния, как отнесение 'числа вросших клонов к общему числу посеянных клеток.

Анализ ДНК выполняла с помочью дот-гибридизации. Суммарную ДНК выделяли аз клеток по методу / Рапкси^Ьу е1> , 1981/. ДНК Денатурировали щелочью и наносил,; точки на капроновый фильтр, фиксировали ери. 80°С в течение 2ч. в вакууме и гибрадизовали с фрагментами I лазт.иды рКРАЗ меченной с помощью ник-транслягяи

/Ыаниатис Т. I др., 1585/.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ •

2.1. Трансфеквдя клетск с помощью калы:ий-фосфатного метода. Определение частоты и эффективности трансформации клеток СПЭВ ТК~ и клеток ТР ТСРТ-.

Была изучена степень компетентности к трансфипируемой ДНК илазмид независимо полученных мутантных клональных субликйй-от двух перевиваемых культур с.-х. животных /СШВ ТК~ и ТР 14РГ-/. Использовали клетки почки эмбриона -свиньи - СПЭВ, не супце одинарные по ТК~ и двойные по ТК~-Уаб.Рез* мутации, и клетка трахеи эмбриона коровы - ТР, несузие одинарные по ШТ~ и двсйныэ по ПРТ"-Уаб.Рез- мутации /Тугизов Ш.М.. Я др., 1985/.

Мутантнне сублишш клеток СШВ /Д5. Д54~1. Д54~7. Д5-12. А1, Д5-7, 05. В2, А4, ДЗ/ и ТР /Д1-1-ТГ, АГ-13. АГ-9, АГ-15, АГ-6. МП-7, МП-11, АГ-5-4, А&-ТГ/ проявляли чувствительность к среде ГАТ Дугизов Ш.М., 1.985/. ТК-дефиштныэ клетки СПЭВ погибали в среде ГАТ на 8-10 сутки культивирования. Гибель ШТ-Дефицитных культур в селективной средэ наблюдали на 10-14 сутки культивирования.

Трансаор-'аиж мутантных клоков ТР Г4РТ- проводили с использованием кслы-еьой формы рекомбинантной плаз:.иды р5\/-2урЬ, содеряа-сгй ген К1СРТ Е.со&. Дли трансформации клеток мутантных кленов

СГОВ ТК" использовали кольцевую орглу рексмблнантной длазшды рН?, содержащей ген тимидинкиназы вируса простого герпеса 1. Для генетической трансформации клеток линии ТР 1СРТ~ использовал;*, смесь ДНК: р8У-2£рк-2 мкгДи, ДНК-носитель - 18 ыкгДл.

Было изучено влияние концентрации ионов водорода на эффективность трансфевдлк. Использовали растворы со значениями рН 7.0; 7,1; 7,12; 7,15; 7,2. Данные экспериментов показали, что существе!; пых различий-в образовании трансформангов при исследуемых значениях рН не наблюдалось, хотя при значении рН 7,0 мы получили, наименьшее число трансформантов. В дальнейших опытах мы остановились на значении рН 7,12.

Образование ОШВ ТК+-трансформантов на среде ГАТ наблюдала • на 12-е сутки, ТР ГФРТ+-трансформантов - на 14-е сутки.

При проведении серии экспериментов ми установили, что мутант ные клональнне сублнниа двух культур клеток с.-х. животных сильно различались по степеи.: аккумулящи и экспрессии трансфицируемых ДНК-плазмид. Были обнаружены существенные различия в экспрессии чужеродной информации не только в мутанткых сублиниях разных куль тур клеток /СПЭВ ТК- и ТР КРТ~/, но и среда мутантных клонов одной я той же' видовой принадлежности. Результаты анализа представлены в табл.1 и табл.2.

Количественны!! гнализ трансформантов, полученных из кленов СПЭВ, показал, что высокоэффективной компетентностью к экспресса ТК гена ВПГ-1 обладали два клона, несущае двойные мутахвш /ТК~-Уаб.^е3-/, из 10 наследованных. При этом эффективность трансформации составляла 1,0-3,0-Ю-3 на 1 мкг ДНК. Эффективность трансформации Б клшов ТК~ била значительно юте /1,0-Р,С-Ю^/, 3 ил на Ж- сказались не компетентными к поглощению и экспрессии гона ТК ВПГ-1. . .

Табл»1

Частота и эффектов: есть трансформации клеток СПЗВ ТК~ с помощью ДНК плазмидн pEF.

й ¡Название ! Устойчивость ! Частота ! 1 Эффективность

п/п| ! клонов {препарат j j.jkoim. { ! мсг/пл ! трансформации* i 1 трансформации30 !

I Д5 5_Бдуххх 2С0 8,0-10"5 4,0.10~5

2 3 Д54-7 Д54-1 5-ЕДУ уабаин 5-ЕДУ уабаин 2С0 1,5 , 2СС 1,5 2,0-6,0-Ю"3 1,0-1,5.1СГ3 1,0-3,0-¿О"3 0,5-0.7-М"3

4 Д5-12 5-ЕЩУ 200 7,0-е ,6-ю"*5 3,5-4 ,3-Ю"5

5 Д5-7 3,5-5,0-10~5 1,7-2,5-10"5

6 А1 5-ЗДУ 20-70 - • —

7 CS —

8 В2 — 1,0-1,7-Ю-5 ' 0,5-0,7-10"6

о А4 5-W 200 - ■ -

10 дз 5-ЕДУ 20-70 4,2-5.0-10~б 2,1-2,5-1С-5

Частота трансформашл-число образовавшихся трансформантов на число использованных в опыте клеток, ''эффективность трансформации- число транефермантов на 1 мкг/мж плаз:,эдной ДНК.

"XX

ЕПУ- 5-ч5ромдезоксиурщщн. . Высок окот.шетентныг.и к трансфекпаа гена КГ®РТ Е.сой оказались клетки клона AT-S-4, несуще двойнш мутации по 1ФРТ~-7аб.Рез*. Эффективность трансформации составляла 1,7-2,Б-1С-4 на 1 тжг ДЖ. Шесть клоноз, десРектныт по Т$РТ, обладала назяоЗ эффективностью трансформации / 0,1-3,0-Ю-6/, ens два клана не проявляли компетентность к трансакции.

Tata. 2

Частота и эффективность трансформации клонов клеток ТР ГИТ" с помощью ДЦК pSV-2gpt.

' Название' Устойчивость

п/п "кленов 'препарат ! канд. ! ! ! мкг/мп

Частота транс-®«»ффективность

ф ормащл

• трансф ормацшг

xx

1 Д1-1-ТГ 6-тиогуанин 0,5

2 АГ-13 . б-азагуаннн 10

3 АГ-9 8-азагуанин 50-100

4 АГ-15 _п_

5 АГ-6

6 МП-7 6-меркапто- 10

пурин

7 ■ МП-11

8 АГ-9-4 8-азагуанин 50-100

уабаин 0,05

9 А6-ТГ 6-тиогуанин 1,0

1,2-1.4-10"° 1,0-3,0-Ю"6 0,8-1,0-Ю"5 1,5-2,2-10"° 4,0-4,5-Ю"6

2.0-3,0-Ю"6 3.5-5.0-10"4

Г6

гб

0.6-0,8-Ю-6 0,5-1,5-Ю-® 0.1-0,5-10 0.7-1.0-10' 2,0-2,5-10"

1,7-2,0-10"

1.7-2.5-10"4

х> 10 что б табл.1.

. Из представленных результатов еидно, что высокоэффективной котетентностыо к экспрессии чужеродных генов, входном в состав влазмид, обладали клены, несущие двойные мутаппи /ТК~-Уаб.^е3'/ и /1ФРТ~-Уаб.Ре3*/. Как известно, уабаин ингабирует ///а-КУ-АТФ-азу /Албертс Б. и др.. 1986/. Иотао предположить, что различия в компетентности клеток к аккумуляции и экспрессии трансфицирован-нкх генов связаны с изменением свойств цитоплазматической мембраны и обусловлены функциональным нарушением //а-К зависимой АТФазн.

Для проведения дальнейших исследований по изучении экспрессии гена поверхностного антигена вируса- гепатита В, мы выбрали клетки мутантного клена /Д5/ линии ШоВ ТК~, эффективность трансформации которого геном ТК ВПГ-1 составляла 8-на 1мкг ДНК. Наш выбор был обусловлен тем, ч40 клены Д54~7 а Д54-1,.а такт® АГ-9-4,

проявившие наибольшую степень компетентности к поглощению чужеродной ДНК, после проведения генетической трансформации были склонны от части к суспензионному росту, «то затрудняло дальнейшие исследования, так как популяция трансформированных клеток была весьма гетерогенка по характеру роста.

2.2. Изучение экспрессии гена поверхностного антигена вируса гепатита В в генетически трансформированных метках.

2.2.1. Получение генетически трансформированных клеток СПУЗ, содержащие ген НВ$Ад> находявдйся под контролем промотсра 3t.TR ВСЕ.

Клетки мутантного клена Д5 почки эмбриона свиньи, дефектные по фермэнту тимиданкиназа /СПаВ ТК-/, трансф^шровали кольцевыми формата рекомбинантных плазмид, содержащих ген НБ5Ад, поставленный под контроль промотора ХТЙ вируса саркомы Рауса. Проведали ко-трансфекцию соответствующих клеток плазмидами, несущиш клонированный ген ¡ШзА^, и плазмидаш, несущиш ген фенотипического мар;;ера. В наших опытах последний представляет собой ген тишдинкиназы вируса простого герпеса /ВПГ-1/. Для проведения котрансф^кдаи клеток мутантного клена Д5, плазмиды с генами НВ$Ад, ТК ВПГ-1' и ДНК-носитель брали в весовом соотношении 1:9:10.

Эффективность траясфюрмапии на 1т.«г ДНК составляла '8-10-10"® клеток. В результате серии экспериментов было получено 73 клона клеток СПЭВ-Д5 с фенотипом ТК+ /табл.3/. Экспрессия гена НВ$А^ была проанализирована в РПГА. Материалом для анализа служила не- • концентрированная куль тур альная жидкость от всех клснов-трансфор- ' мантов. ПолозЕтельниа по этому тесту оказались 13 клонов. Это составляло от общего числа ТК+-тршсформантов 17,8?. Продукция НВ$А^ оказалась неодинаковей в клетках положительных по ДНК ТК кленов-трансформаятов. В трех клонах /23$ от числа положительных по НВ5Ао/ уровень синтеза рекомбинантного гена НВ$Ад достигал высоких

титров /1:512, 1:25б/. в одном клоне /7,65?/ активность HB$Aj выявлена в титре 1:32, у 6-ти клонов-трансформантов /46?/ этот показатель бкл значительно ниже /1:8/, а у остальных трех кланов /23,155/ HBsA(j выявлялся в тшре 1:4- Продукция HBsAg клетками разных клонов варьировала от 0,4нг до 5,12 мкг/ 10®клет. сут..

Клетки ГАТ-резлстентннх клонов /XI, .42, КЗ/, отличавшиеся наиболее высокой секрешей HBjAJ по данным РПГА, анализировали в реакции кИФА с применением моноклонашшх антител к HBsAg. Результаты показали, что для клеток этих клонов характерна штоплазмати-ческая локализация HBsAg, который бкл обнаружен в 70-80^ клеток.

Так как рекомбинантная плазшда pSPAS-27 содержала лигарован-ные ген HBsAcj и ген VP1 вируса гепатита,А, поставленные под промотор Ï.IR ВСК, мы попытались проанализировать и экспрессию гена VP1 в ¿огонах ТК+-транс?ормантов. Из 47 проанализированных клонов три клона оказались положительными в РПГА по экспрессии гена YP1 вируса гепатита А, Причем экспрессия гена VP1 обнаруживалась в двух кленах, которые обладали наиболее высокой продукцией KBsAg.

Клскь1, отличаациеся от других наиболее сильной и стабильной экспрессией рекомбиначтного г^на, были нами отобраны и реклониро-ваны. Результате!,; стало получение 18 реклонов /из 79 с ТК+ фенотипом/ положительных по экспрессии KBsA^ /титр в РПГА 1:32, 1:4/. Шесть из 18-ти реклонов сохраняли стабильную экспрессию HBsAcj на протяжении 10-20 пассажей.

Полученные данные были подтверждены при анализе культуральной Едкости 10 клонов в И5А /превышение оптической плотности в опытных образцах по сравнению с контрольный составляло 5-7 раз/.

2.2,2. Получение гегетически трансформированных клеток СП2В, содержащих ген HBsAçj, находыздйся под контролем промотора гена МТ-1 мши.

Цри проведении экспериментов по генетической трансформации. /котрансфсрмации/ мутантного клена Д5 /СПЭВ ТК~/ илазмидаш, содержалаи ген HBsAg под контролем промотора гена МТ-I мыши и ДНК длазмиды, содержащей ген IK ВПГ-1, бьио получено в обцей слоаности. 150 ГАТ-резнстентных клонов /табл.3/. Эффективность трансформации, на 1 мкг ДНК составляла 8,5-Ю-5 клеток. Все 150 клонов с фенотипом ТК+ бшш проанализированы на экспрессию гена HBsAj. Из 150 клонов в 24-х /165? от обоего числа ТК+ трансформантов/ выявлен HBsAg • /данные Я1ГА/. Продукция HBsAcj клетка*,Я разных клонов варьировала от 0,4 нг до 1,28 мкг/ 106 клет. суг.. 11 клонов ТК+ трансформантов /45,£?* от числа положительных по HBsAcj продуцировали HBsAg с титром 1:64. В двух кленах /б,3£/ продукция HBsAg составляла 1:32. У остальных 11-ти кланов /45,8^/ выявлена продукция HBsAcj в титрах 1:8, 1:4.

С помощью непрямой "реакции. ИФ с МКА к HBsAg б на о проанализировано 7 кленов. Установлено, что для большинства клонов /о из 7 изученных/.характерна цатоддазыатнчзская локализация HBsAcj в 4550$ трансформированных клеток. Среди, клеток двух других кленов выявлены метки с ядерной локализацией HBsAg. Такие клетки составляли 10-15$ всей популяции. Юшш отличались гетерогенностью по экспрессии HBsAg. Клетка четырех ГАТ-резлстентных клонов показавпжх наиболее сильную и стабильную экспрессию HBsA^, били реклонарова-ны. Из 53 полученных реклонов в 14 Снд выявлен HBsAg с титром р РПГА 1:256-1:128. Полученные ре клони превосходила по уровню синтеза HBsAcj первоначально полученные кланы з 3 раза. Семь клонов, положительные по НЗ$Ас^ в РИГА была изучены в реакции непрямой имыу-нсфлюоресценщш. HBsAcj бия выявлен б 40-50? клеток всех-изученных рекленов. 11 яз 14 р склонов .сохраняла стабильный уровень лродуквдл. HBsAg на протяжении 10-14 пассажей с титраш в Н1ГА 1:128-1:61.

Табл. 3

Получение генетически трансфоршроваяных клеток ШЭВ, со-Лерхаамт ПВлАд, наход-теиРся под контролем разных промоторов.

I I

¡НЗ»Ад под кснтННВаАд под конт-¡рояе?" поомото- ¡ролей промотора Показатели |ра ХГО'В® ¡гена МТ-1 мыли

| Число ! % ¡Число ! %

эффективность трансформации, на 1 мкг ДШ 8- •10-Ю"5 8,5-Ю"5

Палучен о клонов с фенотипе*.!'ТК+ 73 150

Из них проанализировано на экспрессию HBjAg в РЫТА 73 150

Подучено клонов НВ$Ад+ 13 17,8 24 16.0

из них с титром 1:512 3 23,1 -

1:С4 ' - 11 45,8

1:32 1 7.6 2 8,3

1:6 6 46,1 6 25,0

1:4 3 23,1 5 20,8

Наличие HBsAg в клетках клонов-трансформачтоз /данные кИ5А и 11$/ 70-80 45-60

Получено реклетов с Генотипом 1К+ ■ 79 53

из них HBsAg+ /РПГА/ 18 22,7 14 25,9

Таким сбразсм мы получили генетически-транофоркированные клетки почки эмбриона свиньи, содерт.алме ген белка оболочки вируса гепатита 3 человека, ксмркР ¡л vivo экспрессируе'тся только

• в гепатоштах человека.

2-2.3. Акт^ьация экспрессии, гена HbsA^ б клетках СПЭЗ клснсв-•тр ан сформант сш.

Была изучена возможность усиления продукта я HBsAg в клетках кланов-трансФорт-.антов путем экспертентатьнога воздействия на ре-туляторные элементы /пртготерк/ рекст-бггначгкого гена S . Так как известно, что ионы тяжелых металлсЕ еттухгруют активность дремоте-

ра МТ-1 Мыли клетки СПБВ, содержащие HBsAg иод

контролем промотора МГ-1, были обработаны солями кадмия и цинка. Результаты анализа показали /табл.4/, что обработка трансформированных кланов с помощью ионов кадмия /Ы2+/ и вднка /2«. 2+/ в течение 6-10 часов цриводшга к 4-х кратному увеличению продукции. HBsAjj. Это свидетельствует в пользу существующего представления об амплификации трансгена, находящегося под контролем промотора гена МГ-1 мйши. а процессе индукции солим тяжелых металлов /VcAui-ion ti. OLÍ- , 1S83/. .

Тайл.4.

Активация экспрессии гена HBsAg в трансформированных клетках с помощью солей тяжелых металлов.

Название клонов ! 1 Гитр HBsAg .

J lOr.fЛ cdce2j luM 5R¿¿Oa ! Контроль /необработ.кл./

А-А4 1:128 1:64 1:8

?-ДЭ 1:128 1:128 1:8

9-В4 1:64 1:64 1:4

7-А2 . 1:64 . 1:64 1:4

В настоящее время проясняется механизм еще одной регулятор-ной системы,- это гены, стимулируемые' стероидными гсрмонами. Белок регулятор, связываясь с гормонаш, приобретает способность садиться на рехуляторные участки я активировать соответствующие гены. Циг- Z£&sfia ei. 1986 г. псйазали, что непосредственно в структурном районе гена HBsA^ локализованы регуляторные НП, которые при. действии глвдокортикоидных гормонов активируют работу энхансера ВГВ.

Для изучения шшяни/з глюкокортякоидных гормонов на экспрессии гена HBsAq /промотор JMR BCS/ в клетках СГОВ с фенотипом ТХ*-

клетки обрабатывали гормонами и подвергали анализу. Анализ дрово-дили в то время, когда экспрессия НВ5А^ в клетках ГАТ-резистент-ных клонов значительно сгсшалась в результате длительного непрерывного культивирования и достигала значений: в культуральной .жидкости 0,5-1,С нг/мл, а в. клетках клонов-трансформантов Ъ~Ъ% клеток. Анализу подвергались клетки двух исходных клонов &2 и ЛЗ /уровень 27-33 пассажа/ и 8 реклснов, полученных от наиболее сильных продуцентов КБзАд /уровень 10-21 пассажа/. Концентрация гормонов составляла: дексаметазон, дексазон, гидрокортизон - Юмкг/ш и инсулин - 8 ед/гл.

Результаты анализа показали, что обработка клеток "¡рансформи-рованннх клонов глюкокертикоидными гормонами в течение 24ч. привела в некоторых клонах /4 из 10-ти изученных/ к 3-4 кратному усилению прод'кши НВзАс|. Продукшя Н35Ад в культуральной жидкости после обработки декса'-етазоном и гидрокортизоном составляла 2-4 нг/ил, а в клетках 12-15'. Синтетический аналог дексаметазона -дексазон и белково-пептидныЧ гору.сн инсульт не оказывали стимулирующего эффекта на синтез НВ5Ад.

2.3. Сравнительной анализ экспрессии гена ЫЗЗАд в двух экспериментальных шстемах: в генетически траясфорг.ированных клетках почки эмбриона свиньи и в опухолевых клетках человека РХС/ЕИР-б, имеющих природно-кнтегрпрованный геном вируса гепатита В.

2.3.1. Изменение экспрессии НВ$Ад в тралсфоршрованных клетках СПЭВ при джггельном культивировании.

Экспрессия гена НВвА^ в клснах-трачсформантах была изучена в динамике. Результаты ош-ггов показал;!, что в процессе длительного непрерывного культивирования клеток ГАТ-резистентных кленов происходило постепенное снижение и затем утрата продукции антигена.

Так, в клетках наиболее продуктивных клснав-трансфсрмантов

/1$1,-02, ИЗ/, содержащих ген HB5Ад под промотором X.TR BCR, синтез HBsAcj снижался, начиная с 6-го пассажа и к 14-глу naccaity характеризовался титрам 1:128-1:64. В процессе дальнейшего культивирования /до 27-го пассата/ титр H3sAg снижался до 1:32, ас 27-го пассата до 40-го это значение достигало 1:8. Экспрессия HBsAg сохранялась до 45-го пассата, но в низких титрах /1:2, 1:4/. В Дальнейшем экспрессия HBSA^ не выявлялась. Остальные Ю клонов потеряли продукцию вирусного rem в течение 4-5 пассажей.

Изучая экспрессию гена HBsAg под проготором МТ-1 мши в динамике мы наблюдали, что с ростом числа пассачеей также происходило постепеннее отгщние, а затем - и утрата синтеза и секреции HBsAg. Снижение секреции KBsAg в клетках, наиболее сильно продуцирующих клонов-трансформантов, наблюдали начиная с 14-го пассата. К 27-му пассачу уровень продукции HBsAg в этих клонах характеризовался титром 1:4, а к 29-му пассажу - 1:2. Продукщя HBsA^ в культураль-ной дикости составляла 0,5-1,0 нг/мл. При. анализе экспрессии гена H3sAg в клетках трансформированных клонов- было установлено, что только 2-3? клеток сохраняла способность к экспрессии вирусного гена. На 31 пассате синтез HBsAg прекращался. Остальные 13 ГАТ-ре-зпстентных клонов теряли экспрессию HBgAg на уровне 4-5 пассатай.

Таким образом, сопоставление данных по анализу продукции НЗдАд в динамике показало, что более длительную экспрессию Еирус-ного гена обеспечивает конструкция с рекомбинантным геном HBsAj, • находящиеся под контролем промотора 5CTR В CR. Как. видно на рас.1 окспрессяя HBsAj под промотором JCTR BCR. балее стабильна и сохраняется до 45- пассата' пра непрерывном купьтивиршании клеток клонов-трансформантов, что составляет по продолжительности, белее чем 220 суток. '.

.Рис.1 Динашка экспрессии гена HBsAcj в клетках наиболее сильных и стабильных клснов-трансфф!1антов' при. непрерывном.культивировании: ■ • - ген EBsAg под контролем промотора XTS. BCR. о- ген HBsAg псщ контролем промотора гена МТ-1 мыши.

2.3.2. Выявление ДНК S-гена в клетках кл снов-трансформантов.

Представляло интерес выяснить .какова причина утраты продукта.

HBsAg в клетках. Мы провели анализ ДНК в 20-ти. трансформированных кланах.Параллельно тестировали. HBjAJ в культуральной жидкости в ИФА в динамике. Результаты дот-гибридизации ДНК 12 клшов-трансфор-мантав с меченными / / ДНК-зондагж, представлявшим рекомбинант-вую ДНК, содержаЦуто ген HBsAg приведены на рис 2. Они показывают, что все 7 клонов потерявшие продукцию H3sA<J в результате длительного ' непрерывного культивирования лишались'также и вставки рекомбинант— них последовательностей. 5 клонов, содержавшие ДНК HBsAj, экспресса-ровали вирусный трансген •- .

2.3.3. Влияние степени цатодафференцировки на экспрессия HBsAg в клетках гепатокаршномы человека.

Изучали, экспрессию R3sA<j в нативной системе, в культура клеток гепатокарциномы человека РХС/Р5Р-5, содержащих интехрированный геном ВГВ.

1 г 3 Ч 5 6 7

А Г. ' ' 0 • 9 • 'с г.

В • ♦ • «

С ! « » • «

А • • % •

Е 9 ; -

1 Р • л I €

-"4 п.п.!Назв.клс ¡Нсмер ¡НЗзЛо в культ

| На -у.гли" Т/'йй

¡пассажа', -=ыдк2 ,КОА

Л Я

41 V

т.*

к+

к-

Рас.2 Анализ ДНК рекомби-нантного 5-гена в клетках клонов-транс$о;тнтов- с помощью точечной гибридизации. •

А1 3 10

31 3 12 +

С1 2 8 +

д: 2 17 +

51 2-2 17 +

И 2-2 23 —

К2 3-А4 9 +

32 1-1 11 +

С2 1-1 14 —

Д2 1-1 9 +

22 1-4 18 —

Р2 1-6 8 —

АЗ 1-0 15 —

■ ВЗ . 1-2 6 +

СЗ 1-2 10 +

1-5 ' 7 +

ез РЗ 1-5 14 +

1-5 17 —■

А4 З-Ао 5 • +

В4 3-А6 1С -

• С4 3-А~ 21 —

- Д4 4-В4 5 +

и 4-34 1С —

74 1-3 4 +

А5 1-3 . 9

.. И кл.РЛС/РЯР-б - +

Был проведен имлуноцатохиг.ичесхий анализ АвП в метках перевиваемой линии РЖ/Р5Р-5. Сн показат.что число клеток, содержащих А2П, достигаю 8С? от всей популяция. Зто позволяет заключить, что линия Р*С/РКР-5 представляет собой низкодиМеренвдрованную гепатокарцн-ноку / табл.5 /. Число клеток, экспрессируюидх НВгА^ в культуре составляло 1-53. НВзАд наблвдали в цитоплазме и на меточной мембране. Продукция НЗгАд в культурачьней жидкости йыла незначительна и составляла по данным ИФА 0,02-0,С& нг /10 е клот.сут. .для обнару- • жекия анмиена требовалось 8-10 кратное концентрирсваше кулътураль-. ной'жадкостд.

На основе клеток гепатокараина.ш человека РХС/РКЕЧэ / трижды клонированный 'вариант / в лаборатории клеточней инженерии института вирусологии им. ДЛ- Ивановского РАМН были получены мутантныа клены гепатакарпиноин, устойчивые к анхаметаболшганг /8-АГ; 6-ТГ; 6-Ш; 5-ЕДУ / и цитостатикам /винблзстан, винкрнстин.катящин.пуро-мицин/ / Тугизаз Ш.М.а--Др»,1989/. Отбор вариантов клеток, устойчивых к перечисленным выше препаратам, проводили, путем многошаговой селекции с постепенно возрастающей концентрацией препаратов. В процессе селекшш регулярно определяли экспрессию НВзА^,НВсАс| и. АФП..

Отбор устойчивых вариантов продолжатся от 5-6 месяцев до одного года. В процессе селекции бклп. отобраны клоны гепатокаршнсмы резко отличающиеся по vopicuionm и характеру роста. Некоторые клоны характеризовались резким снижением или отсутствием синтеза АФП, потерей клснообразутаеи способности на полужидкой среде и. твердом субстрате, потерей опуходеобразувдей способности при введении бестимусным мышам, медленным ростом с низким коэффициентом пересева. В часкл таких клонов набладали. остановку роста в течение 1,5 месяца, после чего клетки часто дегенерировала.. Такие свойства характерны для вы-сокодифф-еренцированнкх клеток.

¿нло проведено сравнительное игя/уноидтохимическое изучение экспрессии генов ECB / HBSAj и HBcAcj / в клетках' мутантных клонов, проявлявших признаки гдтодифференвдрсвки в различной степени.. Результаты анализа показала,что почти во всех исследованных высокоднфферен-цированных кленах наблюдалось усиление экспрессии HBsAcj и. активация ранее репрессированного гена HBcAcj /табл.5/. В таблице 5 приведены данные о свойствах 11—га изученных мутантных клонов.

Эксперименты показали,что приобретение клетками, гепатокарцпномн устойчивости, к использованным токсическим веществам в ряде случаав может сочетаться-с индукцией признаков дифференцнровки. Одновременное приобретение лекарственной устойчивости и признаков Дифферёнга-ровки известно и. для клеток другого происхождения /Ставровская A.A. и. KB. ,li>zJQ-,Qu^ia± S>.ti.a.P- ,1288/. Полученные результаты позволят предположить,что суиествует взаимосвязь между функциональными. перестройка® генов ВГВ и процессом дифференцировки. гепатоттов линии РХС/РйЕЧ). В частности, возможно,что включение или усиление экспрессия вирусных генов связано со стадиями цитодифференщровки., на которых происходит индукция синтеза .специфических ядерных' фтторов ге-патоцитов, участвующих, как известно, в регуляции экспрессии, генов BIS / Cka-nq Ж. el, arises/."

Табл.£

Экспрессия НЗзА^ и НЗсАд в клетках мутантных клонов линии РАС/Р12Р-5, обладающих различным проявлением признаков цитодит4еренцировки.

экспрессия НВ5А0 ! Экспрессия НЗсАл (Число юйОнкоген-(НоэКжци-!Частота об4-

г ! ' I ' " 'Т I ? ! I

Число кл.'Титр НЗАд Числоккл.' Титр 'содержагиность клиент эффек- разования содержат.'в культур!содержящ, 'нЗсАд в'аФП/^/' 'а бестия! тианпсть 'колоний в ' НЗвАд/?/ (жидкости (НЗсА^/Й/ !клеточ.1 (мышах' 1клониров.(мягком ага4-

1/ РПГА / 1 (гомоген.1 ■ ( (£,нч Юкл1ре на 10кл!

РХС/РКР-б 3-5 _ _ - 60-80 Образ, опу- 1-3 0,5-2« Ю~3

/исходный/- холи

Р««С/РЕР-5-7 10-15 - ■ - - ■ 60-80 _ 5-10 О.1-М0"3

/рзклон исх. /

4 /БУДР/ 4-13 1:2-1:8 3-20 3-5 3-5-Ю-3

14/ЕУдР/ 10-12 1:2-1:4 - - 60-80 н 7-10 1,5-2*10 ■

-Х-З/АГ/ 8-Л0 - - 70-80 10-13 3-5 • Ю-3

41-1/МХ/ 2-3 - - 70-80 22-25 1-3 • Ю-3

'г?т/ . 40-50 1:32-1:128 30-40 I 5 8-10 Не образ. - -

52/КХ/ 60-80 1:8-1:16 0-15' I 20 3-20 - -

70/ВКР/ 44-53- 1:8-1:64 40-50 I 5 10-16 п - - .

72/ВКР/ ' 25-42 1:8-1:32 • 20-30 I 5 • 1-13 « - -

92/ПУР/ 11-53 1:64-1:128 40-50 I 5 3-13 - -

.95/ПУР/ 50-80 1:256 ■ 30-40 I 25 7-10 - -

"бЗ/ЗВЛ/ 50 1:32 ■ - I 25 5 - -

Название клсноа

Примечание: БУДР- 5-бром-2-дезоксиуридин; АГ-аэагуанин; КХ-колхицин; ЗКР-винкрнстин; ЗБЛ-винбластин; ПУР-пуромицин; МХ-метатрексат.

Таким образом, созданные наг/л экспериментальные клеточные системы являются удобной годелыэ для изучения закономерностей экспрессии чутсроднкх генов в клетках млекоплтавдпх.

ВЫВОДЫ.

1. Анализ компетентности мутантных штаммов клеток с.-х. животных /СПЭВ ТК~ и Т? ГЬРТ-/ к поглощению и экспрессии чухерод-ных генов показал,'что клетки трех мутантных клонов их 19 исследованных, проявляют вксокую чувствительность к трансфишруемой ДНК

' плазмад. максимальная эффективность грансформагаи /2-6-10"^/ превышает таковуа для батьоляства изученных клеточных линий.

2. Получены 37 клонов-трансформантов на основе клеток свиньи, лилии СПЭВ, экспрессируюиа.е ген НВ5Ад. Продукция НВ8А<] клетками, разных клонов варьировала от 0,4 нг до 5,12 мкг/ 10° клоъсут.. Синтез НВ$Ад выявлен в 70-605 клеток изученных клонов. Максимальная специфическая активность НВзА^, секре тируемого клетками клонов-трансформаг.юв, характеризовалась титра».« 1:512-1:255 в РПГА.

3. Изучение динамнки экспрессии гена НЗхАд в клетках клонов-трансформантов показало, что стабильную экспрессии вирусного гена сохраняли 15 клонов из 37 в течение 2,5 месяцев нецрерывного культивирования. В дальнейшем происходило.снижение, экспрессии чужеродного, вирусного гена.

4. Установлено, что по эффективности трансформации, прсдукши. НВаАд, и стабильности экспрессии гена НЗвА^ более эффективным в клетках СПЭВ ТК~ является промотор ХТЯ вируса саркомы рауса по сравнению с промоторе?.: гена МТ-1 мши.

5. Изучена возможность регуляции экспрессии гена НЗзАд в клетках СПЭЗ клонов-тралсФсрмантов. Показано увеличение продукции НЗвАо после обработки г.лахокрртикопдныма гормона:« /дехсаметазон

и гядроксртмзон/ в 3-4 раза. Такое же воздействие оказывала обработка клеточ, содержании ген HBjAg под контролем промотсра гена МГ-1 мша, соляш тяжелых металлов.

6. Сравнительный анализ экспрессии гена в генетически, трансфор&арсванныг клетках почки эмбриона свиньи и в культуре клеток гепатокарцинсмы человека PjfC/PKF-5, содержащих интегрированный геном BIB показал, что до числу клеток, синтезарушдах HBeAj, а также по активности секретируемого HBsAg, клетки-трансформанты превосходят клетки гепатокарвдномы в р-10 раз.

7. В клетках мутантннх кленов гепатокарииномы PXC/PRF-б характеризующихся высокой степенью дифференшровки /по скорости и характеру роста, экспрессии альфа-фе'тшротеина и способности к образованию опухолей у бе стану сных мышей /усиливается эксцрессия гена HBsAj в 100-1000 раз и наблюдается индукщя гена НВсАд.

ОТССК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ.

1. Савченкова И.П., Тугизов Ш.М.. Анализ компетентности. клеток млекопятаюикх к поглощению и экспрессии транскицируемых генов. Тезисы докладов. Те еретические и прикладные аспекты молекулярной биологии. -М., 1991, с.169.

2. Тугизов »ü.M., савченкова И.П. и др.. Связь степени даффе-ренцировка клеток гепатокаршномы человека с экспрессией интегрированных генов вируса гепатита В. Тезисы докладов. Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии. - М., 1991, с.195.

3. Савченксоа И.П.. Изучение экспрессии гена HBsAg в клетках почки эмбриона сшньи и в культуре клеток гепатокарцийомы человека PXC/PRF-5. Бюллетень науч. раб. - ВИЖ, 1992. В печати.

4. Тугизов Ш.М., Савченкова И;П., 1*рабовская И.Л., Кущ A.A.. Изменение экспрессии генов вируса гепатита В в клетках гепатокаршномы человека PiC/PRP-5 в процессе приобретения ими лекарственной устойчивости. Вопросы вирусологии. - М., 1992. В печати.

5. Тугизов Ш.М.. Савченкова И.П., 1£абовская ИЛ.,Зрайзер TJT.« Ревазова Е.С.,Кущ A.A.. Влияний степени дифференцировки гепатоцатов линии РХС/Р5У--5 на экспрессию поверхностного а внутреннего антогег нов вируса гепатита В. Цитология.-i.f. ,1992. В печати.