Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональный анализ мембранных белков вирусов в генетически трансформированных клетках

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Тугизов, Шароф Мавлонович

Введение.

Получение и характеристика мутантных клонов человека и млекопитающих, пригодных для генетической трансформации клеток в культуре.

Литературная справка.

Селекция мутантных клеток, дефектных по генам ТК и ГФРТ.

Реверсионный анализ мутантных клонов. Стабильность мутантного фенотипа и факторы, влияющие на нее.

Оптимизация условий трансфекции, анализ эффективности и частоты трансформации мутантных клонов маркерными генами.

Анализ экспресии нв s Ад в генетически трансформированных клетках млекопитающих.

Литературная справка.

Временная экспрессия HBsAg.

Получение трансформированных клеток, стабильно экспрессирующих поверхностный антиген вируса гепатита В.

Сравнительный анализ экспрессии HBsAg в различных клетках. Влияние промоторов LTR ВСР и МТ-1 мыши на экспрессию HBsAg.

Роль клеточной дифференцировки в экспрессии генов вируса гепатита В.

Литературная справка.

Селекция клеточных клонов гепатокарциномы человека, проявляющих различную степень дифференцировки.

Особенности экспрессии HBsAg и HBcAg в высокодиффренцированных и низкодифференцированных клонах гепатокарциномы.

Цитогенетический анализ высокодифференцированных и низкодифференцированных клонов гепатокарциномы человека.

Структурно-функциональный анализ мембранных белков цитомегаловируса в генетически трансформированных клетках глиобластомы человека.

Литературная справка.

Роль гликопротеина В ЦМВ в адсорбции и проникновении в клетки.

Получение генетически трансформированных клеток, экспрессирующих гликопротеин В цитомегаловируса человека.

Анализ функционально активных доменов гликопротеина В ЦМВ, участвующих в слияниии генетически трансформированных клеток.

Закономерности вирусной инфекции в полярных эпителиальных клетках.

Литературная справка.

Особенности инфекции ЦМВ и ВПГ-1 в полярных эпителиальных клетках сетчатки глаза человека.

Роль оболочечных белков ЦМВ и ВПГ-1 в распространении инфекции через латеральные мембраны полярных клеток.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурно-функциональный анализ мембранных белков вирусов в генетически трансформированных клетках"

Изучение структурных и функциональных свойств вирусных белков позволяет выяснить механизмы развития вирусной инфекции на молекулярном и клеточном уровнях, открывает новые перспективы профилактики и лечения вирусных инфекций. В процессе вирусной инфекции в клетках хозяина синтезируется множество вирусных антигенов, обладающих различающимися функциональными свойствами. Их можно условно разделить на две группы: существенные - белки, которые необходимы для размножения вируса, и несущественные - белки, непосредственно не участвующие в репродукции вируса, но играющие важную роль в развитии инфекционного процесса. Определение функции индивидуального вирусного белка, обнаруживаемого в зараженной клетке, не всегда возможно, т.к. нельзя исключить роль других белков вируса. Использование мутантных вирусов, в которых исследуемый ген инактивирован, также имеет ряд недостатков: невозможно исследовать функции несущественных генов, поскольку вирусы, несущие мутации по этим генам, хорошо размножаются в клеточных культурах. При получении мутантных вирусов по изучаемым генам нельзя избежать нелетальных мутаций других генов вируса, т.к. мутагенное воздействие может индуцировать большое число различных мутаций в вирусном геноме; множественные мутации в исследуемом гене не позволяют идентифицировать функциональные домены генного продукта.

Создание генетически трансформированных клеток, экспрессирующих индвидуальные вирусные гены под контролем природных и искусственных промоторов, дает в руки исследователей новый инструмент, позволяющий изучать функции и свойства генных продуктов, открывает перспективы создания клеток-продуцентов для биотехнологии. Клеточные линии, экспрессирующие мутантные варианты исследуемого гена, позволяют идентифицировать функциональные домены вирусных белков. Использование клеточных линий, экспрессирующих существенные гены вирусов, и вирусов, несущих мутации по этим же генам, для комплементарного анализа является уникальным методом для анализа вирусных антигенов, ответственных за ключевые стадии размножения вируса: адсорбция, проникновение, сборка, отпочковывание. Клеточные линии, экспрессирующие гены трудно культивируемых вирусов, таких как гепаднавирусы, являются почти безальтернативной моделью для изучения генных продуктов.

Используя генетически трансформированные клеточные линии, экспрессирующие вирусные гены, можно создать путем селекции их в присутствие гормонов, лекарственных веществ, лектинов и т.д. различные модельные системы, проявляющие признаки дифференцировки, дефектности по рецепторам и пострансляционной модификации (гликозилирование, олигомеризация), для изучения регуляции экспрессии вирусных генов, внутриклеточного транспорта, созревания и компартментализации генных продуктов.

Генетически трансформированные клетки различного происхождения (нервные клетки, лимфоциты, гепатоциты), экспрессирующие вирусные гены, позволяют определить роль этих генов в тропизме вируса и выяснить механизмы клеточного и тканевого тропизма вирусной инфекции.

Генетически трансформированные клеточные линии, экспрессирующие вирусные белки, являются, таким образом, не только удобной клеточной системой для решения важных фундаментальных проблем вирусологии, но представляют также большую ценность для биотехнологических исследований и решения прикладных вопросов вирусологии и медицины.

Работа состоит из трех частей. Первая часть (глава 1) посвящена получению и характеристике биохимически маркированных мутантных клеток человека и млекопитающих, показана их пригодность для генетической трансформации. Во второй части (глава 2, 3) анализируются закономерности экспрессии поверхностного белка вируса гепатита В (HBsAg) в генетически трансформированных клетках, рассматривается роль дифференцировки гепатоцитов в регуляции экспрессии генов оболочечного и нуклеокапсидного белков этого вируса. Третья часть работы посвящена структурно-функциональному анализу оболочечных белков цитомегаловируса в генетически трансформированных клетках.

Пользуясь случаем, выражаю глубокую благодарность профессору Алле Александровне Кущ, под влиянием которой складывалось мое научное мировоззрение, за постоянное внимание и помощь в работе; а также профессору Lenore Pereira за предоставленную возможность проведения исследований по цитомегаловирусу человека в Университете Калифорнии США.

Глава 2. Получение и характеристика мутантных клонов человека и млекопитающих, пригодных для генетической трансформации клеток в культуре.

1.1 Литературная справка

Метод генетической трансформации клеток широко используется для решения различных прикладных и фундаментальных проблем молекулярной биологии, вирусологии и биотехнологии.

Получение генетически трансформированных клеток, экспрессирующих чужеродный ген состоит из двух этапов: введение клонированного гена в клетки и отбор клеточных клонов, экспрессирующих этот ген. ДНК-плазмида, несущая исследуемый ген, находящийся под контролем промоторов и энхансеров, обеспечивающих экспрессию генного продукта в эукариотической системе, внедряется в клетку (Lewin., 1983.; Глебов и др., 1982; Глебов и др., 1985; Глебов и др., 1985; Shay., 1985; Томилин и др., 1985; Томилин и др., 1985; Томилин., Глебов., 1986; Инге-Вечтомов., 1986; Щелкунов., 1986; Дубинин., 1986; Глебов., 1989; Alberts et al., 1994). Отбор клеток-трансформантов осуществляется с помощью маркерного гена, находящегося в составе экспрессируемого или самостоятельного вектора, и соответствующей селективной системы, в которой он функционирует. В зависимости от используемого маркерного гена подбираются клетки, имеющие дефект по нему. Наиболее широко распространенными клетками, имеющими маркерные свойства, являются мутантные клетки, дефектные по генам тимидинкиназа (ТК) и гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансфераза (ГФРТ). Внедрение маркерного гена ТК или ГФРТ совместно с исследуемым геном в соответствующие клетки, в которых ген ТК или ГФРТ инактивирован, культивирование их в специальной селективной среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин (ГАТ среда), обеспечивают отбор трансформантов, экспрессирующих исследуемый ген. Впервые ГАТ среда была разработана Шибальским (Szybalski, 1962) и использована Литлфилдом для селекции гибридов соматических клеток (Littlefield, 1964. Принцип отбора гибридных клеток в среде ГАТ основан на наличии в клетках млекопитающих двух путей синтеза нуклеотидов. Первый (основной) представляет собой синтез нуклеотидов de novo из Сахаров и аминокислот; для второго характерно использование уже имеющихся в клетке остатков нуклеозидов гипоксантина и тимидина (Рис 1 и 2). Первый путь блокируется с помощью аналога фолиевой кислоты - аминоптерина или аметоптерина, а для использования второго необходимо одновременное присутствие ферментов ТК и ГФРТ. Поэтому клетки, дефектные по ферментам ТК или ГФРТ, участвующим в синтезе рибо- и дезоксирибонуклеотидов из остатков внутриклеточных нуклеозидов, не могут размножатся в среде ГАТ. Гибридные клетки, содержащие в результате комплементации гены обоих родительских клеток, экспрессируют необходимые ферменты (ТК и ГФРТ) одновременно, используют экзогенные гипоксантин и тимидин для синтеза предшественников нуклеиновых кислот и могут размножаться в среде ГАТ.

Селективная система ГАТ была использована с большим успехом для выделения генетически трансформированных клеток.

Клонированные гены ГФРТ человека, АФРТ аденозинфосфорибозилтрансферазы) хомячка и прокариотический (E.Coli) КГФРТ (ксантингуанинфосфорибозилтрансферазы) были трансфицированы в клетки человека, мыши и хомячка, дефектные по ГФРТ (ферментативная активность АФРТ и КГФРТ соответствует активности ГФРТ). Селекция трансформантов проводилась в среде ГАТ (в случае КГФРТ к ГАТ-среде добавлялась микофеноловая кислота, ингибирующая образование ксантинмонофосфата) (Wigler et al., 1979; Lowy et al., 1980; Mulligan and Berg., 1980; Brennand et al., 1983). Аналогичным путем были получены многочисленные генетически трансформированные клеточные линии человека и млекопитающих с клонированными генами ТК вируса простого герпеса (тип 1 и 2), китайского хомячка и курицы. Гены ТК были трансфицированы в ТК-дефектные клетки человека, мыши, хомячка, обезьяны; трансформанты были изолированы в среде ГАТ (Pellicer et al., 1978; Sweet et al., 1981; Reyers et al.,1982; Lews et al., 1983; Bandyopadhay et al., 1984 )

Селекция трансформантов в среде ГАТ обеспечивается вследствие экспрессии функционально активных ферментов ТК или ГФРТ, осуществляющих синтез нуклеотидов из экзогенных тимидина и гипоксантина с использованием резервных путей. Таким образом, практически любой ген вместе с маркерными генами ТК или ГФРТ путем трансфекции или котрансфекции, если ген находится в другой плазмиде, можно экспрессировать в эукариотических клетках, используя для селекции трансформантов ГАТ-среду.

Разработка метода селекции мутантных клеточных линий, имеющих дефект по ферментам фосфорибозилтрансфераз или нуклеозидкиназ, связана с использованием аналогов пуриновых и пиримидиновых нуклеозидов для химотерапии раковых заболеваний. Было установлено, что часто эти препараты не подавляют развитие новообразований в связи с возникновением резистентных к ним клеток (Harris, 1964). Для выяснения механизма этого феномена были выделены различные клеточные линии, резистентные к пуриновым и пиримидиновым нуклеозидам. Генетический и биохимический анализ этих клеток показал, что во многих случаях они стабильно сохраняют устойчивость к препарату в его отсутствие, что связано с утратой активности ферментов фосфорибозилтрансфераз при резистентности к пуриновым аналогам и нуклеозидкиназ при резистентности к пиримидиновым аналогам (Morrow., 1970; Sharp et al., 1973; Vesely., Cihak., 1973; Cive et al., 1979; Ullman et al., 1981; Patterson., 1980). Эти ферменты не являются необходимыми для размножения клеток, т.к. участвуют в синтезе нуклеотидов, используя нуклеозиды промежуточного внутриклеточного распада. Мутантные клетки, дефектные по этим ферментам, могут нормально размножаться благодаря синтезу нуклеотидов по основному биосинтетическому пути de novo из Сахаров и аминокислот.

Для отбора мутантных клеток, дефектных по ферментам фосфорибозилтрансфераз, используются следующие, наиболее стабильные токсические аналоги пуриновых нуклеозидов: 8-азагуанин, 6-тиогуанин, 6-меркаптопурин, 2-6-диаминопурин, 2-фтораденин (Morrow., 1970; Wolpert et al., 1971; Sharp et al., 1973;

Chasin., 1974; Tachi-Sinkawa., 1987; Koberle., 1993). В нормальных клетках 8-азагуанин, 6-меркаптопурин и 6-тиогуанин катализируются ферментом ГФРТ и проходят тот же путь, что и гуанин, гипоксантин и ксантин. 2-6-диаминопурин и 2-фтораденин катализируются специфическим ферментом для аденина аденозинфосфорибозилтрансфераза. Цитотоксическое действие пуриновых аналогов обнаруживается после превращения их в токсические мононуклеотиды, которые включаются в ДНК и убивают клетки.

Селекция мутантных клеток, дефектных по ферментам нуклеозидкиназ, осуществляется с помощью токсических аналогов пиримидиновых нуклеозидов. Для селекции мутантов наиболее часто используются следующие пиримидиновые аналоги: 5-бром-2-дезоксиуридин, 5-иод-2-дезоксиуридин, 3-фтортимидин, 6-азауридин и 5-азацитидин (Clive et al., 1972., Skopek et al., 1978; Hozier et al., 1981; Morre et al., 1985; Amundson and Liver; 1991). Все нуклеозиды кроме 6-азауридина и 5-азацитидина, фосфорилируются с помощью фермента тимидинкиназы. Метаболизм 6-азауридина и 5-азацитидина происходит с участием фермента уридинкиназы и дезоксицитидинкиназы соответственно (Clive et al., 1979; Kit et al., 1973; Vesely., 1973; Call et al., 1986; Call and Thilly., 1991). Пиримидиновые аналоги оказывают цитотоксический эффект, включаясь в нуклеиновые кислоты в виде трифосфатов, или вызывая ошибки в спаривании оснований и хромосомные разрывы.

Инактивация ферментов фосфорибозилтрансфераз и нуклеозидкиназ в мутантных клетках, как правило, связана с мутацией соответствующих генов. С помощью молекулярно-биологического анализа генов ТК, ГФРТ и АФРТ в различных клетках человека и млекопитающих, устойчивых к пуриновым и пиримидиновым аналогам, не удалось установить какую-либо закономерность возникновения мутации или ее зависимость от мутагенов или аналогов, использованных для селекции мутантных клонов. Были обнаружены делеции, инсерции, замещения нуклеотидных последовательностей как в пределах гена, так и его промоторных участков (Harris and Collier., 1980; Wise and Harris., 1988; Lin et al., 1985; Davidson et al., 1988; Niclas et al., 1991; Keohavong etal., 1991; Lukash et al., 1991; Koberly et al., 1993).

Селекция мутантных клонов, устойчивых к пуриновым и пиримидиновым аналогам, из популяции клеток в культуре - процесс довольно сложный и трудоемкий. Частота возникновения мутантов в разных клеточных линиях варьирует очень широко (10"4-10"7) и зависит от многих факторов, связанных с генетическими и биохимическими свойствами культур. Возникновение мутантных клеток в культуре происходит как спонтанно, так и индуцированно. В качестве индукторов используются классические мутагены (нитрозогуанидин, этилметансульфонат, бромурацил и др.), частота мутации при индуцированном мутагенезе повышается от нескольких раз до нескольких порядков (Chasin., 1974; Tachi-Sinkawa., 1987; Keohavong et al., 1991; Lukash et al., 1991; Koberly et al., 1993).

Для отбора мутантных клеток из популяции существует два метода: одношаговый (одноступенчатый) и многошаговый (многоступенчатый). По одношаговому способу отбор мутантов осуществляется путем обработки клеток определенной концентрацией токсического нуклеозида в течение одного эксперимента. Принцип многошаговой селекции заключается в многократной обработке клеток непрерывно возрастающей концентрацией препарата. При высокой частоте мутирования и клонообразующей способности клеток, одношаговый метод может обеспечить быстрый отбор мутантных клонов. Однако, этот способ селекции не всегда позволяет провести отбор стабильных, высокоустойчивых мутантных вариантов.

Для изоляции мутантных клонов в селективных условиях решающее значение имеет плотность посева клеток, т.к. слишком редкий посев приводит к гибели мутантов из-за нехватки ростовых факторов, а плотный образует контакты между клетками, обеспечивающие метаболическую кооперацию, влияющую на выживание и гибель как мутантных, так и немутантных клеток. Метаболическая кооперация является одной из распространенных форм межклеточных взаимодействий, образующихся с помощью щелевых контактов и обеспечивающих обмен низкомолекулярных веществ между клетками (Subak-Sharp et al., 1970; Сох et al., 1970). Благодаря межклеточной кооперации, мутантные клетки могут включать промежуточные производные вещества - антиметаболиты, если они находятся в контакте с чувствительными клетками. Это приводит их к гибели одновременно с чувствительными клетками в селективных условиях (Davidson et al., 1984).

Противоположное явление - выживаемость чувствительных клеток в селективных условиях может наблюдаться при проявлении контактного торможения в культуре, если клетки способны его проявлять. Контактное торможение, обусловленное развитием ряда биохимических процессов, обеспечивающих остановку размножения клеток, резкое снижение макромолекулярных синтезов и проницаемости мембран, возникает при образовании сплошного монослоя,. При этом чувствительные клетки не могут включать токсические нуклеозиды и не погибают (Маршак и др. 1970). Поэтому определение оптимальной посевной концентрации клеток в условиях селекции, обеспечивающей выживание истинных мутантов, является одним из важнейших условий отбора мутантных клонов.

Известно, что при селекции мутантных клеток, устойчивых к пуриновым и пиримидиновым аналогам, возникают нестабильные клоны. Возникновение нестабильных вариантов устойчивых клеток в популяции может быть связано с изменением структуры ферментов за счет непосредственного влияния токсического нуклеозида на них или возникновения нестабильной перестройки гена-мишени вследствие инсерции мобильных генетических элементов или супрессивного влияния его фланкирующих последовательностей (Rasmusson et al., 1980; Harris and Coolier., 1980; Глебов, Абрамян., 1984)

Мутантные клеточные линии, проявляющие стабильные фенотипические признаки и обладающие низкой частотой реверсии (10-7-10-8 на генерацию), обеспечивают селекцию трансформантов при использовании соответствующих маркерных генов. В настоящее время клонированы маркерные гены ТК ВПГ типа 1 и 2, китайского хомячка, курицы, ГФРТ человека, китайского хомячка, мыши, КГФРТ

E. Coli, АФРТ китайского хомячка, человека; и созданы различные векторные конструкции, обеспечивающие их экспрессию в эукариотической системе, которые широко используются для трансформации клеток и являются коммерческими (Sigma, Invitrogen, Serva, Biogen и др.) Имеется также ряд мутантных клеточных линий, дефектных по ферментам ТК, ГФРТ и АФРТ, которые используются в исследованиях по генетике соматических клеток. Однако, несмотря на бурное развитие клеточной биологии и биотехнологии наличие таких биохимически маркированных линий ещё ограничено. Мутантные аналоги клеточных линий, наиболее часто используемых в вирусологических исследованиях, почти отсутствуют. Это затрудняет создание трансформированных клеток, экспрессирующих вирусные гены, на основе клеточных линий, интересующих исследователя. Поэтому получение новых мутантных клеточных линий, пригодных для генетической трансформации является актуальным.

Генетически трансформированные клетки, экспрессирующие чужеродные гены, можно также получать трансфекцией немаркированных клеток. Селекция трансформантов из немаркированных клеток осуществляется с использованием гена аминогликозидфосфотрансферазы (АГФТ), клонированного из транспозона Тп5, прокариотического гена гигромицин-В-фосфотрансферазы и гена дигидрофолатредуктазы (ДГФР) мыши (Southern and Berg., 1982; Bernard et al., 1985; Wigler et al., 1977). В этих случаях селекцию трансформантов проводят в среде, содержащей высокую концентрацию антибиотиков - неомицина (G418), гигромицина и ингибитора ДГФР - метотрексата В. Однако, использование маркированных клеточных линий по ТК или ГФРТ для генетической трансформации имеет существенные преимущества перед немаркированными. Частота и эффективность трансформации маркированных клеточных линий во многих случаях в 10-100 раз выше, чем немаркированных клеток. Уровень и длительность экспрессии исследуемого гена в маркированных клетках также, как правило, относительно высоки и стабильны. Поэтому, одной из наших задач являлось получение мутантных клеток, имеющих маркерные свойства. Основным критерием для выбора клеточных линий для исследований была широкая распространенность этих клеток в вирусологических работах в нашей стране. Первые шаги для реализации этого подхода были начаты нами в начале 80-х годов. Были получены ТК'клетки почки эмбриона свиньи (СПЭВ) и ГФРТ'-клетки трахеи эмбриона коровы (TP), которые с успехом были использованы для трансформации и гибридизации клеток в культуре (Тугизов., 1986; Дьяконов, Кущ., Тугизов., 1986; Тугизов и др., 1986). Развивая этот подход, мы получили серии мутантных клеток гепатокарциномы человека (PLC/PRF/5), почки зеленой мартышки (CV1), лимфобластомы (СЕМ) и глиобластомы (U373MG) человека, имеющих дефект по генам ТК и ГФРТ (Тугизов и др., 1989а; Тугизов и др., 19896; Тугизов и др., 1989с).

2.2 Селекция мутантных клеток, дефектных по генам ТК и ГФРТ.

Для селекции мутантных клеток по генам ТК и ГФРТ были выбраны следующие клеточные линии: клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека PLC/PRF/5, клетки глиобластомы человека

U373MG, клетки лимфобластомы человека СЕМ, клетки почки эмбриона свиньи СПЭВ, клетки почки обезьяны CV-1, клетки трахеи эмбриона коровы ТР. Клетки PLC/PRF/5, CV-1 и СЕМ были получены из лаборатории культур тканей института Вирусологии Д.И.Ивановского РАМН, СПЭВ и TP - из лаборатории культур тканей и питательных сред Института Экспериментальной Ветеринарии РАСХНИЛ, клетки глиобластомы человека U373MG - из Амерканской коллекции клеточных культур (АТТС).

Одношаговый метод селекции мутантов ни в одной из использованных нами клеточных линий не позволил произвести отбор ТК- и ГФРТ-дефектных клеток. Поэтому все эксперименты по селекции мутантов были проведены многошаговым методом. Для повышения частоты возникновения мутаций по генам ТК и ГФРТ были использованы следующие мутагены: этилметансульфонат (ЭМС), М-метил-К-нитрозомочевина, афлотоксин В, М-метил-К-нитро-нитрозогуанидин (Sigma). В качестве селективных агентов для отбора клеток, дефектных по гену ГФРТ, были использованы токсические аналоги пуриновых оснований нуклеиновых кислот - 8-азагуанин (8-АГ), 6-тиогуанин (6-ТГ), 6-меркаптопурин (6-МП) (Fluka); для отбора клеток, дефектных по гену ТК, - 5-бром-2-дезоксиуридин (БДУ) (Sigma). Концентрации препаратов, обеспечивающих LD90 определяли при редком посеве клеток (23-104).

Предварительно была определена частота возникновения спонтанных и индуцированных мутантов, оптимальная посевная концентрация клеток, препятствующая метаболической кооперации и обеспечивающая размножение истинных мутантных клеток (табл. 1 и 2). Также была определена эффективность клонирования культур, поскольку изолирование единичных мутантных клеток в селективных условиях зависит от клонообразующей способности клеток (Табл. 1 и 2).

Установлено, что метаболическая кооперация в клетках PLC/PRF/5 и TP проявляется при посеве выше, чем 4-5-102кл/см2-Частота возникновения мутантных клонов по гену ГФРТ при такой плотности была 2-3-10"^. Интересно отметить, что частота возникновения мутантных клонов клеток PLC/PRF/5 по гену ТК была на порядок выше, чем по ГФРТ. Клонообразующая способность этих культур была очень низкой - 0,5-3%. В клетках СПЭВ и CV-1 метаболическая кооперация проявлялась при посеве выше, чем 2-5-1()Зкл/см2- Частота возникновения мутантов по гену ТК была очень высокой - б-б-Ю'^1 для клеток СПЭВ и 1-2-10"5 -для клеток SV-1. Клонобразующая способность этих клеток достигала 90%. Клетки глиобластомы U373MG проявляли метаболическую кооперацию при посевной концентрации выше, чем 1-2-102кл/см2, частота мутирования была 7-8-10~6. Эффективность клонирования клеток глиобластомы составляла 50-60%. Концентрационный эффект клеток СЕМ, обеспечивающий метаболическую кооперацию в селективных условиях, определить не удалось, т.к. даже при посеве высокой конентрации клеток мл) не были обнаружены псевдомутанты, что, по-видимому, связано с отсутствием щелевых контактов. Частота возникновения мутантов клеток СЕМ, дефектных по ТК, была приблизительно 10"^ (точно определить не удалось, т.к. клетки растут в суспензии).

Таблица 1. Оптимальные параметры селекции мутантных клонов-ТК."

Посевная

Клетки Концентрация концентрация Эффективность

БДУ, вызывающая клеток, не клонирования (%)

LD90 клеток допускающая мкг/мл) метаболическую кооперацию кл/см^)

PLC/PRF/5 3 4,5-102 0,5-1,0

U373MG 1 1-2-1О2 40-60

CV-1 3 2-Ю3 50-70

СПЭВ 3 5-103 80-90

Таблица 2. Оптимальные параметры селекции мутантных клонов-ГФРТ"

Посевная Концентрация концентрация препарата, клеток, не

Клетки вызывающая LD90 допускающая клеток (мкг/мл) метаболическую кооперацию кл/см^)

Эффективность клонирования (%)

АГ-3

PLC/PRF/5 ТГ- 0,5 3-Ю2 0,5-1,0

МП-1

АГ-3

TP ТГ- -0,1 5-102 3-5

МП-0,5

В связи с низкой частотой спонтанных мутаций, а также сильно выраженной метаболической кооперацией клетки PLC/PRF/5, U373MG и TP обрабатывали мутагенами (Табл. 3). В качестве мутагенов были использованы этилметансульфонат, 1ч[-метил-]М-нитрозомочевина и К-метил-1ч[-нитро-а-нитрозогуанидин (Sigma). Селекцию мутантов проводили при низкой посевной концентрации клеток для избежания метаболической кооперации.

Частота возникновения спонтанных мутантов в клетках СПЭВ и CV1 была достаточно высока (10~4-10~5), что позволило отобрать мутантные клетки без использования мутагенов (Табл. 3).

Эксперименты по селекции мутантных клеток проводили в среде ДМЕМ, т.к. она не содержит пуриновые и пиримидиновые основания нуклеиновых кислот. Для удаления азотистых оснований из сыворотки эмбриона коровы, ее диализовали против фосфатно-солевого буфера (рН7,2) в течение 48ч. Постепенным повышением концентрации селективных агентов были отобраны клональные сублинии клеток, устойчивых к высоким концентрациям токсических аналогов пуриновых и пиримидиновых оснований нуклеиновых кислот. Длительность селекции была 3-6 месяцев. Когда клетки приобретали устойчивость к высоким концентрациям препаратов (30-100мкг/мл пуриновых аналогов, 50-200мкг/мл пиримидиновых аналогов), их проверяли на стабильность проявления фенотипического признака - культивировали в течение 1,5-2 месяцев без препаратов и затем вновь подвергали воздействию токсических аналогов. Результаты этих экспериментов показали, что при многошаговой селекции возникают как стабильные, так и нестабильные варианты мутантных клеток, устойчивых к токсическим аналогам. Природа возникновения нестабильных вариантов неизвестна. Для некоторых клеток было показано, что это может быть связано с приобретением новых эпигенетических признаков во время селекции: изменение проницаемости мембран, снижение активности соответствующих киназ и фосфорилаз (Shay., 1985). Для дальнейших исследований были отобраны клоны, проявляющие стабильную устойчивость к токсическим препаратам (Табл. 3).

О выражении мутантного фенотипа клеток судили по проявлению функциональной активности ферментов ТК и ГФРТ в среде ГАТ. Клетки культивировали в среде ГАТ при низкой посевной концентрации (5-6-103Кл/см2) в течение 2-3 недель. Массовая гибель и дегенерация клеток в ГАТ-среде наблюдалась через 5-8 дней, к третьей неделе культивирования все клетки погибали. Мутантный фенотип также проверяли по включению радиоактивного 3]-[-тимидина и Знгипоксантина авторадиографическим методом. Включение радиоактивных изотопов в мутантные клетки не было обнаружено. Эти результаты свидетельствуют об отсутствии активности ферментов ТК и ГФРТ в мутантных клетках.

2.3. Реверсионный анализ мутантных клонов. Стабильность мутантного фенотипа и факторы, влияющие на нее.

Реверсионный анализ мутантных клеток проводили через каждые 20-30 пассажей (40-60 генераций). Для этого клетки предварительно обрабатывали мутагеном (ЭМС) и через 2-3 пассажа культивировали в ГАТ-среде. Количество клеток для реверсионного анализа было не менее 107 Ревертанты были обнаружены в клетках TP, PLC/PRF/5 и CY1 (1-3-10"7) (Табл. 3) В остальных мутантах при анализе 10? клеток ревертанты не были обнаружены, что свидетельствует о частоте реверсии меньшей, чем 10~7 (Табл. 3). Для предотвращения появления ревертантов через каждые 20-30 пассажей клетки культивировали в течение 2-3 пассажей в среде, содержащей соответствующие аналоги.

Для экспериментов по генетической трансформации клеток очень важна стабильность мутантного фенотипа используемых линий, т.к нестабильные клоны обеспечивают появление ГАТ-резистентных клеток в процессе селекции трансформантов. Такие клетки не являются истинными трансформантами, т.е. не экспрессируют ни маркерный, ни исследуемый гены. Факторы, влияющие на нестабильность мутантных клеток, могут быть различными, но наиболее часто встречаемые - контаминация клеток микоплазмами и латентными вирусами. Механизм этих явлений может быть разным: комплементация неактивных ферментов в мутантных клетках за счет соответствующих фосфорилаз и киназ контаминантов, повышение частоты реверсии, перестройка мутированных генов или их фланкирующих последовательностей. Эти факторы также могут влиять на возникновение и селекцию мутантных клеток. Было показано, что аналоги пуриновых и пиримидиновых оснований нуклеиновых кислот могут активировать латентные вирусы в клетках. Если такой феномен проявляется в процессе селекции, это, возможно, приводит к гибели мутантных клеток, но не является критическим, т.к. вероятность его не высока. Проблема становится более острой, если контаминируется уже выделенный и хорошо изученный мутантный клон. К сожалению, в таких случаях очень трудно осуществить деконтаминацию как вирусную, так и микоплазменную.

2.4 Оптимизация условий трансфекции, анализ эффективности и частоты трансформации мутантных клонов с маркерными генами.

Известно, что степень поглощения клетками трансфицируемых ДНК-плазмид, а также эффективность и частота трансформации эукариотических клеток сильно различаются. Поэтому были изучены эти параметры для полученных мутантных клеток. В качестве маркерных генов были использованы гены ТК ВПГ-1 и КГФРТ Е. СоН, клонированные в эукариотических векторах pFF (Курбанов М.Х., 1986; Филатов Ф,П., 1992) и pSV-2gpt (Mulligan et. al., 1980) соответственно. Ген ТК ВПГ-1 находился под собственным промотором, экспрессия gpt контролировалась ранним промотором SV-40. ТК-дефектные клетки трансфицировали ДНК-плазмидами, несущими ген ТК, ГФРТ"-клетки - ДНК плазмидами, несущими бактериальной ген КГФРТ pSV-2gpt.

Трансфекцию клеток осуществляли кальций-фосфатным, ДЕАЕ-декстрановым методами, а также электрическим пробоем клеточных мембран. В качестве ДНК-носителя использовали очищенную ДНК лосося. Селекцию ТК+-трансформантов осуществляли в среде ГАТ, а КГФРТ+-трансформантов - в среде ГАТ, содержащей микофеноловую кислоту и ксантин. Эффективность и частоту трансформации определяли подсчетом клонов, выросших в селективной среде через 14-21 день после трансфекции.

Оптимальным методом трансфекции клеток СПЭВ-ТК", CV-ТК" и U373MG-TK" был кальций-фосфатный метод (Chen and Okayama., 1987). Трансфекцию клеток осуществляли используя однодневную, субконфлуэнтную культуру. Для приготовления ДНК-преципитата использовали: 2xHEPES (280mM NaCl, ЮтМ KC1, 1.5Mm Na2HP04-2H20, 12mM декстроза, 50mM HEPES), 2MCaCl2 и ТЕ (lmM Tris/Cl, pH8; O.lmM EDTA, pH8). 220(il ТЕ, содержащего ДНК-плазмиду (максимум 20 мкг/мл раствора для преципитации), совмещали с 250|il 2xHEPES и медленно добавляли 30ц1 2МСаС12

ДНК-преципитат образуется через 30-40мин при комнатной температуре. Затем его вносили в ростовую среду, содержащую 10% сыворотки эмбриона коровы, смесь добавляли к клеткам и инкубировали при 37°С в течение 4-6ч. По истечение этого времени клетки промывали средой без сыворотки и культивировали в течение 24ч в ростовой среде, затем трипсинизировали и осуществляли селекцию трансформантов в среде ГАТ при низкой плотности посева (3-4-ЮЗ кл/см2). Эффективность трансформации для клеток СПЭВ-ТК", CV-TK" и U373MG-TK" на 1 мкг ДНК-плазмид составляла - 1-4-10"5. Частота трансформации также была высокой - 1-8,5Т0"^. Однако, кальций-фосфатный метод не оказался высокоэффективным для ТК" и ГФРТ--клонов PLC/PRF/5 и ТК'-клонов СЕМ (Табл. 4).

Наиболее высокий выход трансформантов в мутантных клетках PLC/PRF/5 и СЕМ (Табл. 4) обеспечивал ДЕАЕ-декстрановый метод (Jakoby and Pastan., 1979). ДНК-плазмиду (0,1-5мкг) вносили в PBS (рН7,2), содержащий 1,0мг/мл ДЕАЕ-дехтрана (Farmacia, ММ 500). 250р,1 ДНК-содержащего раствора вносили в чашки Петри диаметром 60мм с клетками и инкубировали при 37°С в увлажнёном инкубаторе, содержащем 5% С02- Время инкубации зависело от состояния клеток. Для клеток PLC/PRF/5 оптимальное время было бОмин, а для клеток СЕМ - ЗОмин. Затем их трижды промывали средой, не содержащей сыворотку, и культивировали в течение 24ч в ростовой среде. Затем клетки трипсинизировали и высевали в среду ГАТ в низкой концентрации для селекции трансформантов. Частота трансформации в клетках PLC/PRF/5-ГФРТ" при ДЕАЕ-декстрановом методе была в 100 раз выше, чем при кальций-фосфатном. Клетки СЕМ удалось трансфицировать только ДЕАЕ-декстрановым методом.

Электрический пробой мембран является одним из новых меточеских подходов для трансфекции клеток в культуре (Neumann et al., 1982; 1987; Wong and Neumann., 1982). Метод основан на высокоэффективной транслокации ДНК-плазмид через мембраны клеток, механизм которой ещё не установлен. Предполагается, что в электрическом поле на мембранах образуются поры, которые обеспечивают переход ДНК в цитоплазму (Tur-Kaspa et al., 1986). Условия электрической обработки (состав среды, температура, амплитуда, длительность импульсов и т.д.) для различных клеток сильно варьируют. Факторы, влияющие на эффективность трансформации клеток (вид и тип клеток, способ культивирования, морфологические особенности клеток) также не выяснены. Поэтому нами были определены оптимальные параметры электрообработки мутантных клеток, обеспечивающие высокоэффективный перенос ДНК-плазмид. Для электрообработки использовали специальный электрогенератор импульсов высокого напряжения, конструкция для инкубации клеток была разработана сотрудниками лаборатории проф. Чизмайджева, института электрохимии им. А.Н.Фрумкина РАН. Для трансфекции ДНК в электрическом поле к суспензии клеток (5-105кл/мл) добавляли 20мкг ДНК-плазмид pFF (ТК-дефектные клетки) или pSV2gpt (ГФРТ-дефектные клетки) и затем проводили электрообработку. Напряженность электрического поля составляла 2-4кУ/см2> длительность импульсов - ЮОмкс. После электрического пробоя клетки инкубировали в течение Юмин при 0°С. Наиболее высокий выход трансформантов наблюдался при обработке клеток в электрическом поле с напряженностью 4кУ/см2. Электрический пробой мембран мутантных клеток гепатокарциномы человека и почки эмбриона свиньи в присутствие ДНК-плазмид увеличивал частоту трансформации в 100 раз по сравнению с кальций-фосфатным методом (Табл. 4).

Был проведен сравнительный анализ трансформации клеток СПЭВ-ТК" и ТР-ГФРТ" с клонами этих клеток, устойчивых к уабаину, т.е. имеющих двойную мутацию: дефектность по ТК и устойчивость к уабаину (СПЭВ-ТК"уабУс); дефектность по ГФРТ и устойчивость к уабаину (ТР-ГФРТ"уабУс). Трансфекцию осуществляли с помощью кальций-фосфатного и ДЕАЕ-декстранового методов с использованием соответствующих маркерных генов. Клетки, имеющие двойную мутацию, СПЭВ-ТК"уабУс и ТР-ГФРТ"уабУс более эффективно поглощали ДНК, чем СПЭВ-ТК" и ТР-ГФРТ как при кальций-фосфатном, так и ДЕАЕ-декстрановом методе. Эффективность и частота трансформации клеток, имеющих двойную мутацию, была в 80-100 раз выше, чем клеток, имеющих дефект только по ТК или ГФРТ. Возможно, это связано с изменением свойств мембран, т.к. в

Таблица 4. Эффективность и частота трансформации мутантных клеток по генам ТК и ГФРТ.

Наименование клеток

Методы трансфекции

Эффективность трансформации (на 1 мкг ДНК)

Частота трансформации (на 106 клеток)

PLC/PRF/5-A7-4-ТК~

PLC/PRF/5-A7-1-3-ГФРТ

Кальций-фосфатный

ДЕАЕдекстрановый

Электрический пробой

Кальций-фосфатный

ДЕАЕдекстрановый

5-6-10-6

4-5-10-6

3-4-10"6

4-5-10-6

0,5-0,6-10-6

0,4-0,5-10-6

3-4-10-6

4,5-5-10-6

35-40-10-6 35-40-10-6

70-80-10-6

70-85-10-6

СПЭВ-Д5-ТК

Электрический пробой

Кальций-фосфатный

ДЕАЕдекстрановый

Электрический пробой

10-40-10-6 5-6-10-6

20-30-10-6

70-85-10-6 10-20-10-6 200-300-10"

ТК- и ГФРТ-дефектные клетки трансфицировали генами ТК ВПГТ (pFF) и КГФРТ E.Coli соответственно.

Эффективность трансформации - число трансформантов на 1 мкг/мл плазмидной ДНК.

Частота трансформации - число образовавшихся трансформантов / число использованных в опыте клеток. уабаинустойчивых клетках теряется активность Na+/K+-зависимой АТФ-азы.

Таким образом, нами были получены серии мутантных клонов клеток человека и млекопитающих, дефектных по генам ТК и ГФРТ. Стабильное сохранение ими мутантного фенотипа, т.е. резистентности к токсическим аналогам пуриновых и пиримидиновых оснований нуклеиновых кислот, и чувствительность к среде ГАТ продемонстрировали функциональный дефект ферментов ГФРТ и ТК. Трансфекция мутантных клонов маркерными генами ТК ВПГТ и КГФРТ E.Coli и селекция трансформантов в среде ГАТ показали пригодность этих клеток для генетической трансформации.

Глава 3. Анализ экспресии HBsAg в генетически трансформированных клетках млекопитающих.

3.1 Литературная справка

HBsAg является поверхностным мембранным белком вируса гепатита В человека, участвующим в адсорбции его на клеточной мембране и проникновении нуклеокапсида в цитоплазму (Gerlich et al, 1993). HBsAg впервые был найден в сыворотке крови австралийских аборигенов, поэтому его назвали австралийским антигеном (Аи). Позже была установлена его взаимосвязь с гепатитом В (по старой классификации болезнь называлась сывороточный гепатит) (Blumberg et al., 1965; Prince., 1968). Электронно-микроскопический анализ сывороток, содержащих австралийский антиген (Аи) показал, что они имеют многочисленные сферические (22 нм) и филаментозные (до ЮООнм) частицы (Bayer., et al. 1968; Dane., et al. 1970). Также было обнаружено, что в Au-положительных сыворотках имеются сферические частицы (частицы Дейна) размером 42 нм, содержащие внутренние структуры размером 28 нм (Gast et al., 1970; Jokelainen et al., 1970). В присутствие иммунных антител к австралийскому антигену сферические (22нм) и филаментозные частицы образовывали агрегаты, что свидетельствовало о свойствах, присущих оболочечным белкам вирусов. Поэтому эти структуры получили название HBsAg -Hepatitis В surface Antigen (поверхностный антиген вируса гепатита В) (Dane., et al. 1970; Committee on Viral Hepatitis, and National Academy of Sciences., 1974).

Дальнейшие структурно-морфологические, биофизические, биохимические исследования частиц Дейна и HBsAg показали, что

HBsAg не содержит нуклеиновой кислоты и не имеет полимеразнои активности, тогда как 28нм сердцевина частицы Дейна имеет ДНК вируса и обладает ДНК-полимеразной активностью (Gerinetal., 1971; Kaplan etal., 1973; Robinson and Greenmann., 1974). Эти исследования продемонстрировали, что частица Дейна (42 нм) является полноценным вирусом, содержащим 28 нм структуру, представляющую собой ДНК, упакованную в нуклеокапсидную оболочку (HBcAg), и 22 нм сферическую или филаментозную частицу, являющуюся оболочечным белком вируса (Рис. 3).

Геном ВГВ состоит из 3200 пар нуклеотидов и имеет четыре открытые рамки считивания, кодирующие поверхностный HBsAg, нуклеокапсидный HBcAg, ДНК-полимеразу и Х-белки вируса (Pasek., et al, 1979; Chang et al., 1981; Toh et al., 1983; Peterson., 1981; Siddiqui., 1991), Открытая рамка считивания, кодирующая HBsAg, имеет три инициирующих кодона, трансляция которых обеспечивает синтез полипептидов с молекулярными массами 25, 31 и 43КД (Gailibert., et al, 1979). После гликозилирования и нарезания они образуют 6 полипептидов: p25/gp28, gp33/gp36, p43/gp46 - маленкий, средний и большой соответственно. Нуклеокапсидный антиген HBcAg синтезируется как 24КД белок, после нарезания образующий два полипептида - р 18 и р21 (Takahashi., et al, 1983). Открытые рамки считивания генов ДНК-полимеразы и Х-белка кодируют полипептиды с молекулярной массой 94 и 17 соответственно (Chang et al., 1981; Toh et al., 1983).

Поверхностный антиген ВГВ (HBsAg) является трансмембранным гликопротеином, состоящим из трех субъединиц: маленькой, средней и большой. Маленькая субъединица HBsAg состоит из 226 аминокислот, после процессинга образует два полипептида - негликозилированный р25 и гликозилированный (в позиции Asp 146) gp28 (Heermann et al., 1984; Heermann and Gerlich., 1991). Средняя субъединица HBsAg имеет на 55 аминокислот больше, чем маленькая, состоит из гликозилированных полипептидов gp33 и gp36, образующих S и preS2 домены белка (Stibbe and Gerlich., 1983). Большая субъединица HBsAg имеет добавочные к маленькому и среднему белку 108 или 119 аминокислот (в зависимости от вирусного штамма), синтезирует полипептиды gp43 и gp46, образуя полноразмерный мембранный белок с preSl, preS2 и S доменами (Heermann et al., 1984).

Изучению процессинга, внутриклеточного транспорта, укладки субъединиц и топологических свойств HBsAg посвящены многие исследования, однако, ключевые вопросы, связанные с организацией субъединиц на вирусной мембране, функциональной ролью различных регионов в связывании и проникновении вируса в клетки-хозяина, остаются невыясненными. Анализ открытой рамки считывания, кодирующей HBsAg, показал, что белок имеет три наиболее гидрофобных участка, находящихся в пределах 11-29, 80-98 и 123147 аминокислот. Предполагается, что гидрофобный регион между 11-29 аминокислотами, образующий а-спираль, обеспечивает транслокацию домена полипротеина до 11 аминокислоты (1 сигнал) в эндоплазматический ретикулум после отщепления его от полирибосом. При этом этот домен не нарезается с помощью сигнальной пептидазы (Eble et al., 1990). Возможно, второй гидрофобный домен (80-98 аминокислоты) также образует а спираль и обеспечивает транслокацию в ЭР следующего домена полипептида (2 сигнал), сам в него не внедряясь (Eble et al., 1987). Ориентация гидрофильных участков до первого сигнала и до второго точно не установлена, однако, предполагается, что N-конец белка, который внедрялся в ЕР, находится на поверхности вириона (Howard et al., 1988; Ganem., 1991). Гидрофобный изгиб после первого трансмембранного региона, возможно, находится внутри мембраны вируса. Тогда второй изгиб после второго трансмембранного домена должен находится на поверхности мембраны. Однако, локализация второго и третьего изгиба, а также С-конца белка не установлена.

HBsAg является основой плазменных и субъединичных вакцин, которые широко используются для профилактики инфекций (Львов и др., 1989). HBsAg является также диагностическим маркером, присутствующим в крови как составная часть вируса или как вирусный антиген, имеющий сферическую или филаментозную форму. Несмотря на интенсивные исследования HBsAg, многие вопросы, связанные со структурой и функцией этого белка остаются невыясненными. Это, в первую очередь, связано с трудностью культивирования вируса гепатита В, т.к. культуры клеток, поддерживающие размножение вируса, пока отсутствуют. Экспрессия HBsAg осуществлена в различных прокариотических и эукариотических системах (Гибадулин и др., 1987; Cheng et al., 1986; Chelyapov et al., 1987; Cheng et al., 1988; Moss et al., 1988; Евстигнеева и др., 1990a; Евстигнеева и др., 19906; Прокуронова и др., 1991 Прокариотические системы имеют серьёзные ограничения, т.к. они не обеспечивают полноценную пострансляционную модификацию и укладку субъединиц белка. Вирусные векторы аденовирусы, герпесвирусы и др.), обеспечивающие экспрессию HBsAg в клеточных культурах, вызывают цитопатогенное действие в клетках и не позволяют провести исследования для изучения внутриклеточного транспорта белка, выяснения роли клеточных факторов, влияющих на созревание и организацию HBsAg. Генетически трансформированные клеточные линии, конститутивно экспрессирующие HBsAg, позволяют провести всесторонний анализ его в отсутствие других белков вируса, являясь удобной модельной системой. Поэтому одной из наших задач являлось создание генетически трансформированных клеточных линий, продуцирующих поверхностный антиген ВГВ.

3.2 Временная экспрессия HBsAg.

Для экспрессии HBsAg использовали мутантные клеточные линии СПЭВ-ТК" и ТР-ГФРТ"' а также первичные и диплоидные клетки сурка. Ткани печени и почки были стерильно изолированы из взрослого сурка (Marmata топах), любезно предоставленного Рымаловым И.В. Отработаны оптимальные параметры диспергирования тканей печени и почки сурка, получены первичные клетки печени и диплоидные клетки почки. Первичные клетки печени культивировались в течение 3-4 недель без пассирования. Диплоидные клетки почки культивировались в течение 2,5-3 месяцев (4-12 пассажей). Попытки получения диплоидных или иммортальных линий гепатоцитов с помощью различных канцерогенов (метилхолантрен, афлотоксин В) и онкогенов (c-myc, c-ras,El-A и Е1-В аденовируса) не увенчались успехом. Были получены иммортальные клетки почки сурка путем трансформации онкогенами аденовируса Е1-А и Е1-В.

Рекомбинантные ДНК-плазмиды, несущие ген HBsAg, были любезно предоставлены ст.н.с. Института молекулярной биологии РАН Еникалоповым Г.Н., (pUC19,pAGO) и ст.н.с. Института вирусологии РАМН Филатовым Ф.П., (pRPAS,pFF). В этих рекомбинантных конструкциях ген HBsAg находился под контролем промотора металлотионина-1 (МТ-1) мыши (pUC19) и промотора LTR вируса саркомы Рауса (pRPAS). Ген ТК ВПГ-1 в обоих плазмидах находился под собственным промотором (pFF, pAGO). СПЭВ-ТК" клетки котрансфицировали ДНК-плазмидами, несущими ген HBsAg и ген ТК ВПГ-1. ТР-ГФРТ" клетки котрансфицировали геном HBsAg и маркерным геном бактериальной КГФРТ (pSV-2gpt). Экспрессию HBsAg определяли в реакции пассивной гемагглютинации (Горьковский НИИ ЭМ) и реакции иммунофлуоресценции с использованием моноклональных антител к HBsAg (Кущ А.А., 1986, 1987).

Для временной экспрессии клетки СПЭВ-ТК", ТР-ГФРТ", первичные и диплоидные культуры клеток почки и печени сурка были трансфицированы ДНК-плазмидой, несущей ген HBsAg (pRPAS,pUC19), и ДНК-носителем. Через 48ч. после трансфекции клеточный экстракт и культуральная жидкость были проверены на экспрессию HBsAg (Табл. 5).

Результаты РПГА показали, что HBsAg присутствует только в клеточном экстракте СПЭВ-ТК" и ТР-ГФРТ" в низком титре - 1:4-1:8 через 48ч. после трансфекции. В первичной культуре клеток печени сурка HBsAg был обнаружен в куль тура льной жидкости и в клеточном экстракте в одинаковом титре - 1:16. Анализ экспрессии HBsAg в клетках почки сурка показал, что он обнаруживается только в клеточном экстракте в низком титре - 1:4-1:8. Низкий уровень экспрессии HBsAg, возможно, связан с небольшим числом клеток, продуцирующих HBsAg в культуре, т.к. результаты иммунофлуоресценции показали, что количество клеток, экспрессирующих исследуемый белок, было 3-5%. Тем не менее, эти результаты свидетельствуют о том, что значительное количество HBsAg секретируется только в гепатоцитах сурка. Возможно, это объясняется различной степенью процессинга белка в гепатоцитах и клетках почки. Иммунофлуоресцентный анализ клеток, экспрессирующих HBsAg, показал локализацию белка в цитоплазме гепатоцитов и клеток почки, что характерно для оболочечных белков вирусов. Вышеизложенное свидетельствует о пригодности клеток печени и почки сурка для изучения экспрессии оболочечного белка вируса гепатита В человека.

3.3. Получение трансформированных клеток, стабильно экспрессирующих поверхностный антиген вируса гепатита В.

Для получения генетически трансформированых клеток, конститутивно экспрессирущих HBsAg, были использованы мутантные клеточные линии СПЭВ-ТК" и ТР-ГФРТ". СПЭВ-ТК" клетки котрансфицировали ДНК-плазмидами, несущими ген HBsAg и ген ТК ВПГ-1. ТР-ГФРТ" клетки котрансфицировали ДНК-плазмидами, несущими ген HBsAg и маркерный ген бактериальной

КГФРТ pSV-2gpt. Селекцию трансформантов по ТК+ фенотипу осуществляли в ГАТ-среде, а трансформантов по ГФРТ+ фенотипу -в ГАТ среде, содержащей микофеноловую кислоту и ксантин. Экспрессию HBsAg определяли в реакциях пассивной гемагглютинации и иммунофлуоресценции с использованием моноклональных антител к HBsAg (Кущ А.А., 1986, 1987).

Через 2-3 недели после трансфекции в соответствующей селективной среде были обнаружены клеточные клоны с ТК+ и ГФРТ+ фенотипами. Они были изолированы и проверены на экспрессию HBsAg. Продукция HBsAg клетками различных клонов варьировала от 0,4 нг до 1.28 мкг /юб кл в сутки (титр в РПГА 1:41:528). С помощью иммуноцитохимического анализа была показана цитоплазматическая локализация HBsAg (Рис. 7).

3.4. Сравнительный анализ экспрессии HBsAg в различных клетках. Влияние промоторов LTR VSR и МТ-1 мыши на экспрессию HBsAg.

Был проведен анализ экспрессии HBsAg в клетках СПЭВ-ТК+ и ТР-ГФРТ+, полученных путем генетической трансформации. Трансформированные клоны СПЭВ с ТК+ фенотипом размножались быстро, некоторые имели тенденцию к росту в суспензии. Были проанализированы 88 клонов, полученных в результате трансфекции клеток СПЭВ-ТК" ДНК, содержащей ген HBsAg, находящийся под промотором МТ-1 мыши. По результатам РПГА 24 клона экспрессировали HBsAg. Эти данные были подтверждены результатами дот-гибридизации ДНК клеток-трансформантов с радиоактивными ДНК-зондами (Рис. 5). Титры HBsAg в клонах на

44 уровне 4-6 пассажа распределялись следующим образом: в 13-клонах титр был 1:8, в 8 - 1:128, в 3 - 1:512. Три наиболее сильных продуцента были использованы для дальнейшего анализа экспрессии HBsAg. Анализ экспрессии HBsAg в этих клонах в селективных условиях в течение 3,5-4 месяцев показал, что продукция белка постепенно снижалась к 6-14 пассажу до 1:64, к 15-27 пассажу -до 1:32, к 27-41 пассажу - до 1:8 (Рис. 6). На поздних пассажах (40-45), когда титры HBsAg были низкими (1:4, 1:8), клетки обрабатывали глюкокортикоидным гормоном дексаметазоном (5мкг/мл). Гормональная обработка клеток в 2-3 раза усиливала экспрессию HBsAg в течение нескольких пассажей (Табл. 6). Можно предположить, что этот эффект был обусловлен действием гормона на промотор LTR ВСР, т.к. известно, что промоторы LTR многих ретровирусов являются индуцибельными и под воздействием различных гормонов усиливают транскрипцию гена (Engel L,W.,et al, 1983).

Во второй серии экспериментов были получены 150 клонов трансформантов с помощью котрансфекции клеток СПЭВ-ТК" рекомбинантной ДНК, содержащей ген HBsAg, находящийся под промотором МТ-1 мыши, и ДНК-плазмидой, несущей маркерный ген ТК ВПГ-1. Результаты РПГА показали, что 34 клона из 150 экспрессировали HBsAg.Титр антигена в разных клонах варьировал от 1:8 до 1:512, 4 клона оказались высокопродуктивными (1:256, 1:512). Изучение экспрессии HBsAg в течение 2,5 месяцев непрерывного культивирования показало, что стабильную экспрессию сохранили 11 из 34 клонов (Рис. 6). Была изучена возможность усиления экспрессии HBsAg в клетках-трансформантах путем

Таблица 5. Временная и стабильная экспрессия HBsAg (титр в РПГА).

Клетки Пробы для анализа Временная экспрессия (48ч после трансфекции) Стабильная экспрессия (1.5мес. после трансфекции)

СПЭВ-Д5-ТК- Культ, жидкость не обнаруж. 1:128 - 1:256

Клет. экстракт 1:4, 1:8 1:128- 1:256

ТР-АГ9ТФРТ" Культур, жидкость не обнаруж 1:4-1:8

Клеточ. экстакт 1:4-1:8 1:4- 1:8

Гепатоциты сурка Культур, жидкость 1:16

Клеточ. экстакт 1:16

Диплоидные Культур, жидкость не обнаруж, клетки почки Клеточ. экстакт 1:4-1:8 сурка

Иммортальные Культур, жидкость не обнаруж. клетки почки Клеточ. экстакт 1:4-1:8 сурка

Результаты представленные в таблице являются усредненными данными трех независимых экспериментов при анализе 10^ клеток и 5мл культуральной среды.

Таблица 6. Индукция экспрессии HBsAg (титр в РИГА).

Гепатоциты сурка с промотором: LTR VSR

МТ1 мыши

Имморталны е клетки почки сурка с промотором: LTR VSR

МТ1 мыши к. ж. 1:16 к. э. 1:16 к. ж. 1:8 к. э. 1:8 к. ж. Н. О. к. э. 1:4 к. ж. Н. О. к. э. 1:4

1:128 1:128 н. о.

1:32

1:32 1:64 н. о.

1:32

1:64 1:64 н. о.

1:32

Анализ индукции экспрессии HBsAg в генетически трансформированных клетках был осуществлен на 15-20 пассажах, когда уровень экспрессии заметно уменьшался. Результаты, представленные в таблице, - усредненные данные трех независимых экспериментов при анализе 10^ клеток и 5 мл культуральной среды к.ж.- культуральной жидкость, кэ. - клеточной экстракт н.о. - не обнаружено обработки их солями тяжелых металлов. Клетки были обработаны ионами цинка (ЮмМ) и кадмия (1мМ) в течение 6 и 10 часов соответственно, через 24ч анализировали продукцию HBsAg. Результаты экспериментов показали, что ионы тяжелых металлов усиливают продукцию HBsAg в 3-4 раза (Табл. 6).

Для изучения экспрессии HBsAg в генетически трансформированных клетках трахеи эмбриона коровы ТР-ГФРТ-" клетки котрансфицировали рекомбинантной ДНК, содержащей ген HBsAg, находящийся под промотором LTR ВСР или МТ-1 мыши, и ДНК-плазмидой, несущей маркерный ген бактериальной КГФРТ. Получены 2 серии клонов трансформантов, экспрессирующих HBsAg: 43 клона, экспрессирующих HBsAg под промотором LTR ВСР, и 36 клонов, экспрессирующих HBsAg под промотором МТ-1. Все трансформанты, независимо от промоторов, оказались слабопродуцирующими (титр 1:4, 1:8) и медленнорастущими, однако, обработка клеток глюкокортикоидными гормонами (для промотора LTR ВСР) и солями тяжелых металлов (для промотора МТ-1 мыши) усиливала экспрессию HBsAg в 2-3 раза (титр 1:32, 1:64) (Табл. 6).

Была изучена индуцибельная активность промоторов LTR ВСР и МТ-1 мыши в иммортальных клетках почки и первичных гепатоцитах сурка. Клетки трансфицировали ДНК-плазмидами, содержащими ген HBsAg под контролем LTR ВСР или МТ-1 мыши, через 8-12ч. обрабатывали дексаметазоном и солями тяжелых металлов соответственно. Через 48ч. культуральная жидкость и клеточный экстракт были исследованы на экспрессию HBsAg. Результаты РПГА показали, что экспрессия HBsAg, контролируемого обоими промоторами, в первичных гепатоцитах, которые обрабатывались индукторами, увеличивалась в 3-4 раза по сравнению с необработанными (Табл. 6). Такая закономерность, следует отметить, была установлена как в культуральной жидкости, так и в клеточном экстракте. Анализ индуцибельности экспрессии HBsAg в клетках почки сурка показал, что экспрессия белка увеличивается только в клеточном экстракте, титр антигена в культуральной жидкости примерно одинаков с контрольными клетками (Табл. 6).

Таким образом, были получены генетически трансформированные клеточные линии, экспрессирущие поверхностный антиген вируса гепатита В. Результаты экспериментов показали, что клетки почки эмбриона свиньи обеспечивают высокую и стабильную продукцию HBsAg. Эти трансформированные клеточные линии могут служить модельной системой для изучения HBsAg и быть полезными в биотехнологических исследованиях.

Глава 4. Роль клеточной дифференцировки в экспрессии генов вируса гепатита В.

3.1 Литературная справка

Вирус гепатита В является гепатотропным вирусом. Однако, несмотря на то, что ДНК ВГВ была найдена в непеченочных клетках пациентов и трансгенных животных, репликация, созревание вируса и патологический процесс, вызываемый им, осуществляются в клетках печени (Shaul., 1994). В результате трансфекции ДНК ВГВ в клетки гепатокарциномы установлено, что репликация вирусной ДНК происходит только в высокодифференцированных гепатоцитах (Sells et. al., 1988). Анализ вирусных антигенов в опухолевой ткани, полученной от HBsAg-позитивного пациента, показал, что высокая экспрессия HBsAg и HBcAg обнаруживается только в нормальной части ткани, которая окружает опухолевую (Raimondo et al., 1987). Результаты этих исследований свидетельствуют о том, что дифференцировка гепатоцитов играет ключевую роль в регуляции экспрессии вирусных генов и развитии инфекции.

Регуляция экспрессии вирусных генов на уровне транскрипции осуществляется путем связывания транс- и цис-активирующих клеточных факторов с промоторными и энхансерными последовательностями вирусного генома. Клеточные факторы или вирусныме, регулирующие экспрессию вирусных генов, могут влиять на их работу как положительно, так и отрицательно. ВГВ имеет четыре промотора: два промотора, обеспечивающие транскрипцию HBsAg, один - HBcAg и один - X гена.

Рис 8. Схематическая структура генома вируса гепатита В человека. Широкие стрелки - положение 4 открытых рамок считивания (ОРС) транскриптов, L(-) -цепи: а.к. - аминокислоты: Enh - энхансер; DR1 и DR2 - прямые концевые повторы: тонкие стрелки - длина мРНК; сайты рестриктаз и нумерация нуклеотидов указаны в соответствии с субтипом ayw; пунктирная линия - одноцепочечный участок ДНК вируса.

53

Инициирующий сайт для транскрипции preS региона поверхностного белка вируса картирован в положении 2810 нуклеотида (варьирует в пределах 10 нуклеотидов в зависимости от субтипа вируса), TATA бох находится в позиции 2785-2791н.п. (Rail etal., 1983). PreS промотор обеспечивает транскрипцию 2,4 kb мРНК, кодирующей preS-1 полипептид (Ganem and Varmus., 1987). Второй промотор, обеспечивающий синтез preS-2 и S-полипептидов, находится в пределах preS-1-кодирующего участка генома и имеет три сайта инициации, обозначенные как а, Ь, с (Standring et al., 1984). Все три сайта инициации расположены недалеко от preS-2 ATG кодона, в позиции 3213 нп. (различается в пределах 10-15 нп. в зависимости от субтипа вируса (Siddiqui et al., 1986; Yaginuma et al., 1987; Bulla and Siddiqui., 1989). PreS-2 промотор контролирует 2,1 kb-транскрипт, обеспечивающий трансляцию preS-2 и S полипептида. Анализ нуклеотидных последовательностей preS-2 промотора показал, что он имеет гомологию с поздним промотором SV40 и не имеет TATA бокса (Cattaneo et al., 1983).

Открытая рамка считивания, кодирующая HBcAg, имеет два ATG кодона в позициях 1816 и 1903н.п., нуклеотидные последовательности, находящиеся между этими кодонами, обеспечивают синтез ргеС-региона и содержат сигнальную информацию для секреции HBeAg. Промотор HBcAg фланкируется с первым ATG кодоном и контролирует транскрипцию 3,5 kb мРНК, которая необходима для синтеза HBcAg, HBeAg и, возможно, полимеразы (Rossinsk et al., 1986; Rail etal., 1983).

Промотор X гена ВГВ, расположенный между 1255 и 1340 нуклеотидными последовательностями, обеспечивает транскрипцию 0,7-0,9 kb мРНК (Treinin and Laub., 1987; Siddiqui et al., 1987). Продукт X гена является транс-активатором для многих вирусных и клеточных белков (Twu., Schloemer., 1987; Zahm et al., 1988; Caselman., 1995; Natoli et al., 1995).

Были идентифицированы два энхансера ВГВ, влияющие на транскрипцию вирусных генов по транс-действующему механизму. Первый энхансер находится между открытыми рамками считывания S и X генов и частично перекрывает X промотор. Второй энхансер расположен внутри X гена (Guo et al., 1991; Shaul et al., 1985; Yee., 1989; Yuh., Ting., 1990).

Сравнительный анализ репликации вирусного генома и экспрессии вирусных белков в клетках печеночного и непеченочного происхождения, трансфицированных ДНК ВГВ, показал, что только гепатоциты обеспечивают синтез вирусных белков и сборку вирусных частиц (Chang et al., 1987; 1989; Honigwachs etn al., 1989; Sureau et al., 1986; Yaginuma et al., 1987; Tsurimoto et al., 1987). Также имеются сведения, что (высокодифференцированные) зрелые клетки печени имеют факторы, значительно усиливающие активность промоторов как оболочечного, так и нуклеокапсидного белка вируса (Yun., Ting., 1993; Raney., 1991; Pirjo et al., 1994; Zhang., Mclachlan., 1994). Результаты этих исследований свидетельствуют о существовании транс- и цис-активирующих элементов в высокодифференцированных гепатоцитах, участвующих в регуляции экспрессии генов ВГВ и тем самым обеспечивающих гепатотропность этого вируса. В связи с этим нашей задачей являлось создание модельной клеточной системы гепатоцитов, проявляющих различные признаки цитодифференцировки и дедифференцировки, для изучения регуляции экспрессии генов ВГВ человека.

4.2. Селекция клеточных клонов гепатокарциномы человека, проявляющих различную степень дифференцировки.

Большинство клеточных линий, как опухолевых, так и экспериментально трансформированных in vitro, сохраняют способность к дифференцировке. Процесс дифференцировки клеток может быть индуцирован самыми различными факторами и воздействиями. Индукторами являются противоопухолевые препараты, антиметаболиты, цитостатики, опухолевые промоторы, ДМСО, ретиновая кислота, простогландины, интерферон, гормоны, условия культивирования, антиметаболиты (Барановский, Вервес., 1985; Ставровская А.А., 1990; Schwariz., 1992, )

В наших исследованиях была использована опухолевая клеточная линия гепатокарциномы человека PLC/PRF/5 (Alexander et al.,1976). Эта клеточная линия содержит несколько копий интегрированной ДНК ВГВ и экспрессирует HBsAg (Marion et al., 1979; Machab et al., 1976; Skelly et al., 1979; Miller and Robinson., 1983; Ривкина и др., 1983; Ривкина и др., 1986). Были изучены свойства клеток PLC/PRF/5, находящихся в нашем распоряжении. Было установлено, что клеточная популяция состоит из гепатоцитов, 60-80% которых экспрессируют альфа-фета протеин (канцероэмбриональный антиген). Экспрессию человеческого альбумина обнаружить не удалось. При введении бестимусным мышам б-Ю^кл. опухоль образуется через 1421 день. Вышеуказанные характеристики свидетельствуют о низком уровне дифференцировки клеток.

В культуральной жидкости клеток PLC/PRF/5 HBsAg обнаружить не удалось, лишь при гормональной индукции или 8-10-кратном концентрировании культуральной жидкости удавалось обнаружить антиген в низкой концентрации (титр 1:2, 1:4). Путем клонирования и реклонирования клеток не удалось выделить клоны, проявляющие признаки дифференцировки или экспрессирующие HBsAg в высоких концентрациях.

Для селекции клонов гепатомы с признаками дифференцировки был использован методологический подход, основанный на имевшихся данных о том, что возникновение клонов, устойчивых к противоопухолевым препаратам, часто сопровождается приобретением признаков дифференцировки ( Игнатова Т,Н., 1986, Ставровская А,А., 1990, Kane,et al.,1990; Schwartz.,et.al. 1992). С этой целью мы применяли ряд цитостатиков и антиметаболитов (колхицин, винбластин, винкристин, пуромицин, 6-тиогуанин, 8-азагуанин, 6-меркаптопурин) - Sigma (Табл. 7). Для индукции возникновения клеток, устойчивых к токсическим препаратам, использовали мутагены и опухолевые промоторы N-метил-М-нитрозомочевина, К[-метил-М-нитрозогуанидин, 20-метилхолантрен, афлотоксин В, 12-0-тетрадеканоил-форбол-13-ацетат (Sigma). Эксперименты проводили с клетками одного из клонов линии PLC/PRF/5 - PLC/PRF/5-А7. Селекцию устойчивых вариантов клеток осуществляли многошаговым методом, постепенно повышая

Результаты селекции мутантных клоноа гепатокарциномы человека по устойчивости х различным агентам

Таблица 7

Мутаген (канцероген)

Концентрация и время обработки Селектирующий агент Начальная концентрация, мкг/мл Частота устойчивых клонов ив первом шаге селекции Число выделенных устойчивых клонов Из них-с признаками дифференцировки

300 мкг/мл, МТ 0,5—1,0 1,5-10—4 9

18 Ч АГ 1—2 3,0-10-5 17 3

1,5—3,0 мкг/мл. ТГ 0,5-1,0 1,7-10-» 23 3

4—6 ч АГ 1—2 7,5.10-< 3 1

МП 0,5—1,0 3.2-10-5 17 4

10 мкг/мл. МТ 0,5—1,0 3,2.10-» 14 2

24 ч ВБ 0,01—0,02 3,5'Ю-4 9 4

3—5 мкг/мл. АГ 1—2 1,5.10-" 21 2

4—6 ч КХ 0,01—0,02 4,2* 10-5 4 4

МП 0,5—1,0 6.3.10-5 19 5

10 мкг/мл, ВК 0,01—0,02 3,2.10-5 4 3

24 ч КХ 0,01—0,02 4,7.10-5 11 7

ПР 0,01—0,02 4,8* 10—4 20 13

0,5—1,0 мкг/мл. КХ 0,01—0,01 3,7*10—4 5 3

24 ч ВК 0,01—0,02 5,3-10—4 15 5

МТ 0,5—1,0 3,0-10-* 4 1

ВБ' 0,01—0,02 7,9-10—• 15 5

ПР 0,01—0,02 3,2-10-5 3 2

БУДР 2,0—3,0 3,6-10-5 17 2

Этилметансульфонат Ы-метил-Ы-нитрозомочевнна

Афлотокснн В

Ы-метил-Ы-ннтро-а-нитрозогуанндин 20-Метилхол а нтрен 12-0-тетрадеканоилфорбол-13-ацетат

Примечание. Здесь и в табл. 2 МТ — метотрехсат, АГ — 8-азагуаннн, ТГ — 6-тиогуаннн, МП — 6-меркаптопурин, КХ — колхицин, ВБ — винбластин, ВК — вннкрнстин, ПР — пуромицнн, БУДР — 5-бром-2-дезокснуридин. концентрацию селективных агентов. После каждого шага селекции устойчивые клоны исследовали на экспрессию маркерных белков -альфа-фета протеина (АФП) и человеческого альбумина для определения степени дифференцировки клеток. Экспрессию белков определяли с помощью реакция иммунофлуоресценции. Анализ экспрессии альфа-фета протеина был проведен совместно с сотрудником Института Канцерогенеза Эрайзер T.J1. с использованием моноклональных антител к этому белку (лаб. проф. Абелева Г.П.). Экспрессию человеческого альбумина определяли с использованием моноклональных антител к нему, меченых ФИТЦ (Sigma). Интервалы времени между последовательными шагами отбора были от трех недель до 1,5-2 месяцев. Эти периоды мы условно обозначили как этапы селекции.

В процессе селекции было обнаружено, что, начиная со второго этапа, некоторые устойчивые клоны снижают или теряют экспрессию АФП и начинают синтезировать человеческий альбумин, т.е. приобретают признаки дифференцировки. Такие клоны очень медленно размножались, и в некоторых из них на 6 этапе селекции наблюдалась остановка роста и дегенерация клеток (фенотип терминальной дифференцировки). Клетки таких культур в течение 11,5 месяцев не размножались, но сохраняли жизнеспособность. Возникновение этого периода (период покоя) не было связано с токсическим действием селективных агентов, т.к. этот период наступал также при культивировании клеток с 5 этапа без селективных агентов. На 7 этапе селекции на фоне неразмножающихся клеток появлялись активно растущие клоны. Эти клоны экспрессировали АФП и прекращали синтез человеческого альбумина, что свидетельствовало о дедифференцировке клеток. Частота возникновения клонов с фенотипом дедифференцировки была 1-5-10-6.

Таким образом, селекция высокодифференцированных клеток гепатомы состояла из 6 этапов; 1-3 этапы - селекция клонов, потенциально имеющих признаки дифференцировки (снижение экспрессии АФП); 4 этап - селекция клеток, имеющих признаки дифференцировки (остановка экспрессии АФП, начало синтеза альбумина); 5 этап - предтерминальная дифференцировка (замедление размножения клеток, усиление экспрессии альбумина); 6 этап -терминальная дифференцировка (остановка размножения клеток, увеличение их размера); 7 этап - дедифферернцировка (появление активно растущих клонов, возобновление экспрессии АФП, исчезновение синтеза альбумина).

Известно, что возникновение клеток, устойчивых к противоопухолевым лекарственным препаратам, сопровождается амплификацией генов MDR (multi drug resistance), которые кодируют белок с молекулярной массой 170 КД (Kane, et.al., 1990). Р170 выполняет роль мембранного насоса, осуществляющего откачивание токсических веществ из клеток (Endicott, and Ling ,1989). Экспрессию Р170 определяли в реакции иммунофлуоресценции с помощью моноклональных антител (Accurate Chemical). Анализ экспрессии Р-170 в высокодифференцированных клонах, устойчивых к пуромицину (клоны 92 и 95), показал высокий уровень продукции белка в клетках, тогда как в исходном клоне (А7) продукция не была установлена (Рис. 8). Начало экспрессии Р-170 коррелировало с

Таблица 8 Экспрессия человеческого альбумина и белка р170 в клетках клона А7 и двух пуромицин-устойчивых клонов.

Клон Доля клеток, содержащих белок (в %) *

Человеческий белок р170 альбумин

92 20-30 50-60

95 70-80 90-100 В таблице представлены крайние значения по результатам трех-четырех повторных опытов прекращением синтеза АФП и возобновлением синтеза альбумина, т.е. с приобретением клетками признаков дифференцировки. Установлено, что экспрессия РТ70 является физиологическом процессом в многих тканях организма, включая печень, почки, поджелудочную железу, надпочечники, прямую кишку (Sigawara et al., 1988;) Высокий уровень экспрессии Р-170 отмечен в зрелых (высокодифференцированных) гепатоцитах, участвующих в процессе детоксикации организма от вредных веществ (Arias et al ., 1990).

Из 200 клонов, устойчивых к токсическим препаратам, в 60 были обнаружены признаки дифференцировки. Не была установлена корреляция между возникновением клонов, имеющих фенотип дифференцировки, и селективным агентом, однако, большинство из них было получено при селекции клеток в присутствие цитостатиков. Анализ клеток с признаками дифференцировки на туморогенность на бестимусных мышах показал отсутствие этой способности (эксперименты проведены совместно с проф. Ревазовой Е.С). Клетки, проявляющие дифференцированный фенотип, также не образовывали колонии в полужидком агаре.

Таким образом, полученные нами данные об экспрессии Р-170 в клетках ряда клонов подтверждают заключение о проявлении ими свойств высокодифференцированных гепатоцитов. Клоны, не проявлявшие признаки дифференцировки, особо не отличались от PLC/PRF/5 или исходного клона А7 - хорошо размножались, при введении бестимусным мышам образовывали опухоли, экспрессировали АФП, не синтезировали альбумин и Р-170.

4.3. Особенности экспрессии HBsAg и HBcAg в высокодифференцированных и низкодифференцированных клонах гепатокарциномы.

Анализ синтеза оболочечного и нуклеокапсидного белков ВГВ осуществляли в процессе селекции клонов клеток гепатокарциномы PLC/PRF/5, устойчивых к лекарственным препаратам. Экспрессию HBsAg определяли в реакции пассивной гемагглютинации (диагностикум Горьковского НИИ ЭМ) и в реакции иммунофлуоресценции с использованием моноклональных антител к HBsAg (Кущ А.А., 1986, 1987). HBcAg в клеточном экстракте выявляли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа с использованием анти-НВс-сыворотки человека, любезно предоставленной М.И.Михайловым. Анализ экспрессии HBcAg проведен совместно с Т.И.Калининой. Экспрессию HBcAg в клетках определяли в реакции иммунофлуоресценции с использованием кроличьей анти-HBcAg сыворотки (Accurat Chemical).

Анализ экспрессии HBsAg в высокодифференцированных и в низкодифференцированных клетках клонов PLC/PRF/5 показал, что практически во всех клонах с признаками дифференцировки было отмечено усиление продукции этого белка (Табл. 9). На уровне 2-3 этапа селекции в большинстве исследованных клонов экспрессия HBsAg увеличивалась в 100-200 раз в сравнении с исходным клоном А7 и в 400-500 раз - в сравнении с исходной культурой PLC/PRF/5. Количество клеток, экспрессирующих HBsAg, составляло 50-80%. Локализовался HBsAg в цитоплазме и на клеточной мембране (Рис. 10). Усиление экспрессии HBsAg строго

Таблица 9

Зависимость экспрессии HBsAg и HBcAg от степени цитодифференцированностн клеток линии PLC-PRF-5, клона А7 и его субклонов1

Клок, устойчивый к юздейстэню Число клеток С АФП. % Коэффициент эффективности клонирования, % (на 10» клеток) Частота образования колоний ■ мягхом ■ агареПО—3 (на 10* клеток) Экспрессия HBsAg Экспрессия HBcAg число клеток с HBsAg. % тхтр HBsAg а культуральной жидкости > РПГА число клеток с НВсАг. % татр HBcAg в клеточном гоыоггиате

PLC-PRF-5 60—80 1—3 0,5—2 3—5 0

А7 60—80 5—10 0,1 — 1 10—16 — 0

4 (БУДР) 3—20 3—5 3—5 4—13 1:2—1:8 0

14 (БУДР) 60—80 7—10 1,5—2 10—12 1:2—1:4 0

1-3 (АГ) 60—80 25—30 7—8 3—5 1:2—1:4 0

13-2 (АГ) 70—80 10—13 3,5—5 8—10 — 0

41-1 (MX) 70—80 22—25" 1—3 2-3 — 0

2 (АГ) 0,3—18 0 0 20—80 1:128—1:256 10—15 1 64

17 (КХ) 8—10 0 0 40—50 1:32—1:128 20—40 1 5

52 (КХ) 3—20 0 0 60—80 1:8—1:16 0—15 1 20

19 (КХ) 8—15 0 0 70—80 1:10—1:32 45—60 1 6

70 (ВК) 10—16 0 0 44—53 1:8—1:64 40—50 1 5

72 (ВК) 0,5—13 0 0 25—42 1:8—1:32 20—30 1 5

65 (ВК) 15—25 0 0 27—50 1:64—1:128 35—40 1 т 0

92 (ПР) 3—13 10—12 > 0 11-53 1:64—1:128 40—50 1 5

95 (ПР) 0,1 — 12 7—10 0 50—90 1:32—1:128 30—40 1 25

1 Приведены крайние значения по результатам нескольких повторных опытов. Прочерк — белок не выявляется титрованием.

Рис. 9. Экспрессия HBsAg в клональном варианте клеток гепатокарциномы PLC/PRF/5/A7, использованных для селекции высокодифференцированных культур. Клетки выращивали на покровных стеклах, фиксировали 4% формалином с добавлением 2% сахарозы и 0.1% Тритона Х-100. Экспрессию HBsAg (мышиные МАК), определяли с помощью реакции непрямой иммунофлуоресценции. (Увеличение хбОО.)

Рис. 10. Экспрессия HBsAg в пуромицин-устойчивом клоне, проявляющем признаки дифференцировки на 4 этапе селекции. Клетки выращивали на покровных стеклах, фиксировали 4% формалином с добавлением 2 сахарозы и 0,1% Тритона Х-100. Экспрессию HBsAg (мышиные МАК), определяли с помощью реакции непрямой иммунофлуоресценции. В культуре встречаются многоядерные клетки-симпласгы. (Увеличение хбОО)

Рис. 11. Экспрессия HBsAg (правая панель) и сывороточного альбумина (левая панель) в пуромицин-устойчивом клоне N92, проявляющем признаки дифференцировки на 4 этапе селекции. Экспрессию HBsAg (мышиные МАК) и сывороточного альбумина (кроличьи ПКА) определяли с помошыо реакции непрямой иммунофлуоресценции. (Увеличение хбОО)

Рис. 12. Экспрессия HBsAg (левая панель) и альфа-фета протреина (правая панель) в высокодифференцированных клетках гепатокарциномы (пуромицин-устойчивый клон 92) на 4 этапе селекции. Экспрессию HBsAg (мышиные МАК) и альфа-фета протеина (мышиные МКА) определяли с помощью реакции непрямой иммунофлуоресценции. (Увеличение хбОО) н Н п

--г » Г"

4 5 G

Рис. 13. Изменение экспрессии HBsAg и HBcAg в процессе селекции клеток с признаками дифференцировки. Абсцисса - этапы селекции: Ордината -количество клеток, экспрессируюших белки вируса гепатита В HBsAg ( ) и HBcAg ( ), %.

---колхшин-устойчивый клон N17

------------колхицин-устойчивый клон N19

------винкристин-устойчивый клон N70 коррелировало с уменьшением экспрессии АФП и появлением синтеза альбумина (Рис. 11 и 12). На 5 этапе селекции (предтерминальиый этап) отмечался самый высокий уровень экспрессии HBsAg (титр 1:512, 1:2048) (Рис. 13). Однако, он уменьшался на 6 этапе селекции, когда клетки приобретали признаки терминальной дифференцировки (титр 1:8. 1:16) (Рис. 13). Экспрессия HBsAg в дедифференцированных клонах не была установлена.

Известно, что ген нуклеокапсидного антигена ВГВ в клетках PLC/PRF/5 находится в репрессированном состоянии (Miller and Robinson., 1986; Yoakim et al., 1988). Анализ экспрессии HBcAg в клетках, устойчивых к противоопухолевым препаратам, показал, что происходит активация гена сердцевинного белка ВГВ в клетках, имеющих признаки дифференцировки. В 14 из 60 клонов с дифференцированным фенотипом и усиленной экспрессией HBsAg был обнаружен HBcAg (Табл.3). Результаты иммунофлуоресцентного анализа показали, что HBcAg локализуется в ядре и на ядерной мембране клеток (Рис. 14 и 15). Начало экспрессии HBcAg отмечалось на 4-5 этапе селекции (5-10% клеток) (Рис. 17 и 18), но максимальный уровень экспрессии был зарегистрирован на 6 этапе селекции (остановка роста) (Рис. 13 и 19), когда клетки приобретали признаки терминальной дифференцировки. До 40-60% клеток в популяции экспрессировали HBcAg, титр антигена в клеточном экстракте (10^ клеток) достигал 1:100-1:200 (Табл. 9). Интересно отметить, что на 6 этапе селекции, когда клетки имели признаки терминальной дифференцировки и

Рис. 14. Экспресия HBcAg в пуромицин-устойчивом клоне N92 на 6 этапе селекции. Клетки выращивали на покровных стеклах, фиксировали 4% формалином с добавлением 2% сахарозы и 0,1% Тритона Х-100. Экспрессию HBcAg (кроличьи антитела) определяли с помощью реакции непрямой иммунофлуоресценции. (Увеличение х900)

Рис. 15. Экспресия HBcAg в пуромицин-устойчивом клоне N92 на 6 этапе селекции в присутствие пуромицина (ЗОмкг/мл). Клетки выращивали на покровных стеклах, фиксировали 4% формалином с добавлением 2% сахарозы и 0.1% Тритона Х-100. Экспрессию HBcAg (кроличьи антитела) определяли с помощью реакции непрямой иммунофлуоресценции. (Увеличение х900).

Рис. 16. Экспресия HBsAg (правая панель) и HBcAg (левая панель) в пуромицин-устойчивом клоне N92 на 4 этапе селекции. Клетки выращивали на покровных стеклах, фиксировали 4% формалином с добавлением 2% сахарозы и 0.1% Тритона Х400. Экспрессию HBsAg (мышиные МАК), HBcAg (кроличьи ПК А) определяли с помощью реакции непрямой иммунофлуоресценции. (Увеличение хбОО).

Рис. 17. Экспресия HBsAg (правая панель) и HBcAg (левая панель) в пуромицин-устойчивом клоне N92 на 6 этапе селекции. Клетки выращивали на покровных стеклах, фиксировали 4% формалином с добавлением 2% сахарозы и 0.1% Тритона Х-100. Экспрессию HBsAg (мышиные МАК), HBcAg (кроличьи ПКА) определяли с помощью реакции непрямой иммунофлуоресценции. (Увеличение хбОО).

Рис. 18 Экспрессия Р170 (правая панель) и HBcAg (левая панель) в пуромицин-устойчивом клоне N92 на 6 этапе селекции. Клетки выращивали на покровных стеклах, фиксировали 4% формалином с добавлением 2% сахарозы и 0,1% Тритона Х-100. Экспрессию Р170 (мышиные МКА), HBcAg (кроличьи антитела) определяли с помощью реакции непрямой иммунофлуоресценции. (Увеличение хбОО).

ВЯЗСЗЯ ■

Ш Ж^ <- " ^ Ь - ^^SjLHH тюНь '12Я щ К ^Тъ* Лвшл ^iЯ ШЗякг - Мл^ШШ лМш

E^HMfS '

ДУу л

Иг^ИБдЯ tjgl. ЯМяи''.' "Я ЕрЩ

Рис. 19. Экспресия HBcAg в пуромицин-устойчивом клоне N92 на 6 этапе селекции. Клетки выращивали на покровных стеклах, фиксировали 4% формалином с добавлением 2% сахарозы и 0.1% Тритона Х-100. Экспрессию HBcAg (кроличьи антитела) определяли с помощью реакции непрямой иммунофлуоресценции. (Увеличение х900) синтез HBcAg достигал максимального уровня, экспрессия HBsAg резко снижалась (Рис. 13).

В литературе имеется много свидетельств того, что экспрессия генов ВГВ связана с дифференцировкой гепатоцитов. Установлено, что в высокодифференцированных гепатоцитах имеется ряд белков, участвующих в регуляции экспрессии вирусных генов. В высокодифференцированных линиях гепатомы идентифицирован белок (белок А), связывающийся со вторым энхансером ВГВ и активирующий транскрипцию генов ВГВ. Найден другой белок в низкодифференцированных клетках гепатомы и в клетках непеченочного происхождения (белок F), который тоже взаимодействует со вторым энхансером ВГВ и блокирует работу вирусных генов (Yun and Ting, 1991,1992). Другими авторами из ядер высокодифференцированных клеток гепатомы выделены факторы (HNF1, HNF3), связывающиеся с промоторами HBsAg и HBcAg и обеспечивающие экспрессию этих генов. (Raneu et al., 1991, 1995).

Результаты наших исследований демонстрируют, что усиление экспрессии HBSAg и активация HBcAg зависят от степени дифференцировки клеток гепатомы. Степень дифференцировки, вероятно, играет важную роль в регуляции экспрессии этих генов, которая, возможно, связана с различными клеточными факторами, взаимодействующими с регуляторными элементами (промоторы, энхансеры) генов поверхностного и нуклеокапсидного антигенов ВГВ.

Результаты цитоморфологического анализа показали, что в клетках с признаками дифференцировки наблюдается заметное повышение доли многоядерных клеток, т.е. симпластов (Рис. 10). Отмечена прямая зависимость появления симпластов и усиления экспрессии HBsAg (Рис. 20). Симпластообразование является одним из показателей фузогенной активности мембранных гликопротеинов вирусов. Считают, что HBsAg обладает фузогенной активностью, которая обеспечивает проникновение вируса в клетку (Gerlich et al., 1993). Возможно, симпластообразование в клетках с признаками дифференцировки и высоким уровенем экспрессии HBsAg связано с фузогеной активностью этого белка.

4.4. Цитогенетический анализ высокодифференцированных и низкодифференцированных клонов гепатокарциномы человека

Был проведен кариологический анализ исходного клона А7 и десяти высокодифференцированных клонов, экспрессирующих HBsAg и HBcAg. Число хромосом в исходном клоне значительно колебалось и составляло 84-98 с модальным классом 89 хромосом. Структура кариотипа клона также оказалась достаточно изменчивой. Более трети хромосом из околотетраплоидного набора клона А7 оказались перестроенными, при этом количество и структура маркеров варьировали. Все клоны были столь же гетерогенными кариологически, как и исходный клон. Было отмечено сходство с исходном клоном как по количеству маркеров, так и по их составу и вариабельности. Таким образом, каждый клон, являясь потомством одной клетки, не только сохраняет маркеры данной клетки, но и способен воспроизвести ее большей частью, если не

Рис. 20. Симпластообразование в клетках PLC/PRF/5: А7 - контрольных, А7-10 - обработанных дексаметазоном, N 92 и N95 - устойчивых к пуроминину. проявляющих признаки дифференцировки. полностью. Как известно, хромосома 7 у человека содержит ген mdr, во всех исследованных клонах эта хромосома активно участвует в маркерообразовании. Однако, цитогенетическое изучение клеток мутантных клонов не выявило амплификации mdr на уровне хромосом (мелкие хроматиновые образования, двойные мини-хромосомы и др.). Это, возможно, связано с физиологической функцией mdr в гепатоцитах. Конститутивная усиленная экспрессия mdr и, возможно, его амплификация не выявляется на уровне хромосом.

Было проанализировано маркерообразование хромосомы, несущей в себе вирусный геном. Для линии PLC/PRF/5 установлено, что геном ВГВ интегрирован в хромосомы 11. 15 и 18 (Bowcock et al., 1985). В нашей работе продемонстрировано увеличение числа копий хромосомы 15 и изменение частоты встречаемости маркеров хромосомы 11 в клонах, экспрессируюших вирусные белки. В отношении хромосомы 11. можно отметить, что в анализируемой нами линии она активно участвует в маркерообразовании. при этом точки разрыва локализуются либо в коротком плече в локусе 11р12-15р (именно эти маркеры меняют свою частоту в клонах), либо в локусах Ilql3-ql4 длинного плеча. Очевидно, эти участки отличаются повышенной ломкостью. В работе Bowsosk et al. показано, что сайт интеграции вирусного генома в хромосоме 11 локализован в ее длинном плече (локус llq22). Однако, в ряде других работ, выполненных с клетками гепатокарцином, интегрированный вирусный геном обнаруживали именно в коротком плече хромосомы 11, при этом интеграция вирусных последовательностей сопровождалась перестройками фланкирующих последовательностей клеточной ДНК (Rogler et al., 1985; Wang, Rogler., 1988). Отмечены также перестройки короткого плеча хромосомы 11, выявляемые цитогенетически в разных линиях гепатокарцином (Simon, Knowles., 1987; Wuu et al., 1987).

Обращают на себя внимание вариации доли полиплоидных клеток в клонах. В то время как в исходном клоне доля полиплоидных клеток составляла 1,3-2,9%, все изученные клоны с признаками дифференцировки демонстрировали увеличение доли полиплоидних клеток до 5,0-19,5% (Табл. 10). Интересно отметить, что в высокодифференцированных клонах обнаруживаются клетки с пульверизованными хромосомами. При этом в исходном клоне частота встречаемости таких клеток была минимальной (0,2-0,4%). Во всех анализированных клонах, экспрессирующих HBsAg и HBcAg, число клеток с пульверизованными хромосомами оказалось повышенным, достигая максимума 6.9 в клоне 95 (Табл.6). Как известно, пульверизация хромосом наблюдается при слиянии клеток (симпластообразование) на разных стадиях митотического цикла и обусловлена преждевременной конденсацией хроматина одной из клеток (Ильинских и др., 1984). Эти результаты ещё раз подтверждают возможную роль вирусных антигенов в симпластообразовании, т.к. пульверизация хромосом и симпласты появляются в клонах, экспрессирующих HBsAg и HBcAg.

Таблица ю Результаты цитоморфологического и цитогенети-ческого анализа линии PLC-PRF-5, клона А7 и полученных из него ■ клонов, обладающих признаками дифференцировки.

Клон Доля двуядер- Доля полипло- Доля клеток с линия) ных клеток (в %, идных клеток пульверизацией на 2000 клеток) (в %, на 1000 хромосом (в Z, на клеток) 1000 клеток)

PLC-PRF-5 2,8 2,9 0,4

PLC-PRF-5-7 не определяли 1,6 0,3

2 4,3 0,7

4 10,4 0,7

7 4,2 8,9 2,0

65 не определяли 6,3 1,6

62 3,9 8,6 1,1

72 не определяли 9,6 1,2

92 9,4 12,2 4,7

95 6,2 19,5 6,9

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Тугизов, Шароф Мавлонович

выводы

1. Получены мутантные клетки человека на основе клеточных линий PLC/PRF/5, СЕМ, U373MG и мутантные клетки млекопитающих на основе клеточных линий СПЭВ, TP, CV-1, дефектные по генам ТК или ГФРТ. Показана пригодность мутантов для генетической трансформации в культуре.

2. Получены генетически трансформированные клеточные линии, экспрессирующие поверхностный антиген вируса гепатита В (HBsAg). Изучена конститутивная и индуцибельная активность промоторов ltr вируса саркомы Рауса и металлотионина-1 мыши. Показано, что генетически трансформированные клетки СПЭВ являются высоко эффективным продуцентом HBsAg.

3. Многошаговой селекцией с использованием токсических лекарственных препаратов получены мутантные клоны клеток гепатокарциномы человека PLC/PRF/5. Показано, что в клонах с признаками цитодифференцировки активируется синтез альбумина и прекращается экспрессия канцеро-эмбрионального антигена (альфа-фета протеина). В процессе селекции было отмечено, что проявление фенотипа дифференцировки осуществляется как многоступенчатый процесс и завершается терминальной дифференцировкой (стадия покоя) гепатоцитов.

4. Показано, что в клетках гепатомы с признаками цитодифференцировки в 100-500 раз усиливается экспрессия HBsAg. В высокодифференцированных клетках PLC/PRF/5 в предтерминальной и терминальной стадиях дифференцировки установлена индукция репрессированного гена HBcAg. В период активации HBcAg отмечалось снижение экпрессии HBsAg, что свидетельствует о существовании различных механизмов регуляции экспрессии этих генов в клетках печени.

5. С помощью генетически трансформированных клеток глиобластомы U373MG, экспрессирующих оболочечный гликопротеин В (gB) цитомегаловируса человека, впервые показана фузогенная активность gB ЦМВ.

6. Впервые установлено, что: а) пассивный транспорт или задержка gB в просветах эндоплазматического ретикулума и в аппарате Гольджи уменьшает или блокирует его фузогенную активность; б) протеолитическое расщепление gB (между аминокислотами 460-461) не влияет на сливающую активность белка; в) моноклональные антитела к внеклеточным доменам gB Dl, D2a и D2b блокируют сливающую активность белка; г) мутантные формы gB с отсутствующим трансмембранным и цитоплазматическим доменами (Д670-906) и только цитоплазматическим доменом (А760-906) не проявляют фузогенной активности. Мутант с частично отсутствующим цитоплазматическим доменом (А833-906) на- половину восстанавливает сливающую активность белка.

Эти результаты демонстрируют, что трансмембранный и цитоплазматический домены (73 аминокислоты) gB участвуют в процессе слияния, и для осуществления фузогенной функции белка принципиально важен его активный транспорт к плазматическоой мембране клеток и сохранение конформации внеклеточных доменов gB - Dl, 2а и 2Ь.

7. Впервые показано, что ЦМВ может инфицировать полярные клетки только через апикальную мембрану, тогда как ВПГ-1 - как через апикальную, так и через базолатеральную поверхности эпителиальных клеток. Установлено, что gB ЦМВ транспортируется к апикальной мембране полярных клеток, где происходит почкование вируса.

8. Получены генетически трансформированные полярные эпителиальные клетки почки собаки (МДСК), экспрессирующие оболочечный гликопротеин ЦМВ - US9. С помощью конфокального микроскопирования показано, что US9 аккумулируется на латеральной мембране полярных клеток, меняет распределение клеточных белков (актин, кадхерин, тенсин, В-катенин), регулирующих полярность, в результате чего происходит деполяризация клеток.

9. Установлено, что в присутствие вируснейтрализующих моноклональных антител как ЦМВ, так и ВПГ-1 могут переходить от инфицированных клеток к неинфицированным через латеральную мембрану полярных клеток. Впервые показано, что гены US9 ЦМВ и gE ВПГ-1 ответственны за переход вируса через латеральную мембрану полярных эпителиальных клеток.

7. Заключение

7.1. Использование биохимически маркированых клеточных линий для селекции генетически трансформированных клеток

Биохимически маркированные мутантные клеточные линии широко используются для изучения различных фундаментальных и прикладных вопросов современной биологии. Клеточные линии, имеющие стабильные маркерные свойства, обеспечивающие селекцию генетически трансформированных клонов, экспрессирующих трансфицированный чужеродный ген, являются ценной модельной системой для исследований по вирусологии и биотехнологии. (Siminovich ., 1976; Baker ., Ling., 1978; Wright et al., 1980; Рингерц и Сэвидж., 1979; Prokop., Bajpai1991).

В популяции культивируемых клеток in vitro могут возникать разнообразные мутантные варианты как спонтанно, так и индуцированно (Siminovich ., 1976; Шапиро., Варшавер., 1976). Индуцированная мутация может быть вызвана мутагенами самого различного происхождения - химического, физического и биологического. Мутационный процесс возможен на уровне всего генома (изменение числа хромосом), отдельной хромосомы (нарушение структуры хромосом) и одного гена (изменение пары нуклеотидов). Геномные и хромосомные мутации могут затрагивать жизненно важные функции клеток и, в большинстве случаев, это является причиной гибели появившихся в популяции мутантных вариантов. Генные мутации могут возникнуть посредством изменения одной пары оснований (замена, делеция или вставка), вызывающего нарушение лишь в одном кодоне затронутого гена, в последствии приводящего к изменению биологических свойств продукта гена - белка. Фенотипические признаки клеток, несущих такие мутации, связаны с нарушением или потерей способности белка выполнять свою нормальную биологическую функцию.

Примером таких мутантов являются клетки млекопитающих, имеющие мутации в генах, кодирующих ферменты -фосфорибозилтрансферазы и нуклеотидкиназы. Эти ферменты участвуют в биосинтезе нуклеиновых кислот, а клетки, дефектные по ним, являются биохимически маркированными. Такая генная мутация не является летальной для клеток, т.к. существует два альтернативных пути биосинтеза пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов (см. стр. 10, 11). Наличие этой уникальной синтетической системы, т.е. двух путей биосинтеза нуклеиновых кислот в эукариотических клетках, и возможность блокировки одной из них за счет генной мутации, послужило основой создания селективной системы, обеспечивающей клонирование генов в эукариотических клетках.

Нами были получены серии мутантных по генам ТК и ГФРТ клонов клеток человека и млекопитающих: клетки гепатоиеллюлярной карциномы человека PLC/PRF/5, клетки глиобластомы человека U373MG, клетки лимфобластомы человека СЕМ, клетки почки эмбриона свиньи СПЭВ, клетки почки обезьяны CV-1, клетки трахеи эмбриона коровы TP (Тугизов., 1986; Дьяконов, Кущ., Тугизов., 1986; Тугизов и др., 1986; Тугизов и др., 1989а; Тугизов и др., 19896; Тугизов и др., 1989с). В процессе многошаговой селекции было установлено возникновение мутантов как со стабильными фенотипическими признаками (потерей активности фосфорибозилтрансферазы или нуклеотидкиназы при культивировании клеток без селективных агентов), так и нестабильными (восстановление активности ферментов в неселективных условиях). Возникновение нестабильных вариантов, возможно, связано с эпигенетическими событиями, происходящими в процессе селекции, такими как изменение проницаемости плазматической мембраны, снижение биологической активности ферментов при нарушении их процессинга, изменение структуры ферментов в результате непосредственного влияния нуклеозида на них, возникновение нестабильной перестройки гена-мишени вследствие инсерции мобильных генетических элементов или супрессивного влияния его фланкирующих последовательностей (Bakay et al.,1973; Davidson et al., 1973; Bakay et al., 1978; Rasmusson et al., 1980; Harris et al., 1980; Глебов, Абраман., 1984., Kaufman, 1985., Davies., et al., 1993).

Стабильные мутантные клоны, как правило, были резистентны к высоким концентрациям токсических пуриновых и пиримидиновых нуклеозидов. Не было установлено снижение пролиферативной активности и изменение морфологии клеток. Реверсионный анализ показал, что частота возникновения мутантов с диким фенотипом в стабильных, высокорезистентных клонах была невысокая (10" 7-10-8). Мутантные клоны проявляли чувствительность к ГАТ среде, что свидетельствует об отсутствии активности соответствующих ферментов -фосфорибозилтрансфераз или нуклеотидкиназ.

Инактивация ферментов фосфорибозилтрансфераз или нуклеозидкиназ в мутантных клетках, резистентных к токсическим нуклеозидам, как правило, связана с мутацией соответствующих генов. Путем молекулярно-биологического анализа генов ТК, ГФРТ и АФРТ в различных клетках человека и млекопитающих, устойчивых к пуриновым и пиримидиновым аналогам оснований нуклеиновых кислот, были обнаружены делеции, инсерции, замещения нуклеотидных последовательностей как в пределах гена, так и его промоторных участков (Harris and Collier., 1980; Wise and Harris., 1988; Lin et al., 1985; Davidson et al., 1988; Niclas et al., 1991; Keohavong et al., 1991; Lukash et al., 1991; Koberly et al., 1993).

Степень поглощения мутантными клетками трансфицируемых ДНК-плазмид, а также эффективность и частота трансформации в различных клонах различались и зависели от метода трансфекции

Глебов., 1989; Тугизов 1989с; Савченкова., Тугизов., 1991). Поэтому нами были изучены оптимальные параметры трансфекции клеток при кальций-фосфатном, ДЕАЕ-декстрановом методах и при помощи электрического пробоя клеточных мембран. Оптимальным методом трансфекции СПЭВ-ТК", CV-TK" и U373MG-TK" клеток был кальций-фосфатный (Chen and Okayama., 1987). Он является высокоэффективным методом переноса ДНК в эукариотические клетки в культуре и широко используется для трансформации. Хлористый кальций в растворе фосфатов, содержащем ДНК-плазмиду, при рН 7,0-7,4 образует преципитат, который проникает в клетки путем фагоцитоза и транспортируется к их ядру (Loyter et al., 1982). Поглощение ДНК-преципитата является энергозависимым процессом, внутриклеточный транспорт его осуществляется с участием микротрубочек (Loyter et al., 1982). Кристаллы фосфата кальция защищают ДНК от действия нуклеаз, а также способствуют слиянию внутриклеточных вокуолей, транспортирующих ДНК-преципитат к клеточному ядру, где происходит интеграция ДНК-плазмиды в хромосомную ДНК клеток (Zakai et al., 1977). Векторы, обладающие автономной (эписомальной) репликацией, обеспечивают экспрессию исследуемого гена в цитоплазме клеток. Эффективность трансформации на 1 мкг ДНК-плазмид для клеток СПЭВ-ТК", CV-TK" и U373MG-TK" составляла 1-4-10-5. Частота трансформации также была высокой - 1-8,5-10"^. Однако, кальций-фосфатный метод не оказался высокоэффективным для ТК" и ГФРТ'-клонов PLC/PRF/5 и ТК"-клонов СЕМ. Это, возможно, связано со свойствами плазматических мембран клеток, их фагоцитирующей активностью. Может быть, проникновение ДНК-преципитата осуществляется с осуществляется с участием специфических рецепторов, которые связываются с ним и индуцируют образование фагоцитирующих вакуолей. Наличие таких рецепторов определяет активность поглощения ДНК-преципитата клетками, количество их в различных клетках, вероятно, варьирует.

Наиболее высокий выход трансформантов в мутантных клетках PLC/PRF/5 и СЕМ обеспечивал ДЕАЕ-декстрановый метод (Jakoby and Pastan., 1979). Показано, что ДЕАЕ-декстран связывается с ДНК, нейтрализует ее заряд, изменяет конформацию, благодаря чему она становится устойчивой к нуклеазам. ДЕАЕ-декстран, связанный с ДНК, также стимулирует эндоцитоз, обеспечивая проникновение ДНК в клетки, сам не проникая в них. (Graham., 1977; Hasnain et al., 1980). Частота трансформации в клетках PLC/PRF/5 при ДЕАЕ-декстрановом методе была значительно больше, чем при кальций-фосфатном. Клетки СЕМ удалось трансфицировать только ДЕАЕ-декстрановом методом.

Трансфекция мутантных клеток также осуществлялась с использованием электрического пробоя мембран. Метод основан на высокоэффективной транслокации ДНК-плазмид через мембрану клеток под воздействием электрического поля высокого напряжения. Механизм этого процесса ещё не установлен (Neumann et al., 1982; 1987; Wong and Neumann., 1982). Предполагается, что под воздействием электрического поля высокого напряжения на мембранах образуются поры, обеспечивающие переход ДНК в цитоплазму (Tur-Kaspa et al., 1986). Условия электрической обработки для различных клеток сильно варьируют. Свойства культур, вид и тип клеток, способ культивирования, морфологические особенности клеток, концентрация ДНК-плазмид имеют важное значение. Поэтому нами были определены оптимальные параметры электрообработки мутантных клеток, обеспечивающих высокоэффективный перенос ДНК-плазмид. Результаты экспериментов показали, что электропробой мембран клеток гепатокарциномы человека и клеток почки эмбриона свиньи в присутствие ДНК-плазмид увеличивал частоту трансформации в 100 раз по сравнению с кальций-фосфатным методом.

Таким образом, нами были получены серии новых мутантных клонов клеток человека и млекопитающих, дефектных по генам ТК и ГФРТ. Стабильное сохранение мутантного фенотипа клеток и чувствительность к ГАТ среде свидетельствуют об инактивировании ферментов ГФРТ и ТК. Трансфекция мутантных клонов маркерными генами ТК ВПГ-1 и КГФРТ E.Coli и селекция стабильных трансформантов с фенотипом ТК+ и ГФРТ+ в среде ГАТ показали пригодность этих клеток для генетической трансформации.

7.2. Анализ экспрессии HBsAg в генетически трансформированных клетках. Временная и стабильная, конститутивная и индуцибельная экспрессия HBsAg.

Генетически трансформирование клетки, экспрессирующие белки вирусов, бактерией, простейших и других патогенов стали перспективным источником для медицинской биотехнологии. Это связано с тем, что при экспрессии таких белков в прокариотических клетках часто теряется их биологическая активность, а также возникают трудности очистки. Внутриклеточный процессинг, укладка субъединиц, посттрансляционная модификация экспрессируемых белков в прокариотических клетках происходят не полностью, что приводит к серьезному изменению их четвертичной структуры. Проблема становится очень острой при экспрессии оболоченых белков вирусов, т.к. они являются гликозилированными глобулярными полипептидами, и нарушение их укладки, пострансляционной модификации и межцепочечных дисульфидных связей приводит к существенному изменению их структуры.

HBsAg является оболочечным белком вируса гепатита В. Он служит основой плазменных и субъединичных вакцин, которые широко используются для профилактики инфекции. HBsAg также является диагностическим маркером, присутствующим в крови как составная часть вируса.

Для экспрессии HBsAg использовали мутантные клеточные линии СПЭВ-ТК" и ТР-ГФРТ"» а также первичные и диплоидные клетки сурка (Тугизов и др., 1988; Тугизов., 1990; Тугизов., Кущ., 1990; Тугизов., Рымалов., 1990; Филатов., Тугизов., и др., 1992). Для временной экспрессии клетки СПЭВ-ТК", ТР-ГФРТ" первичные и диплоидные культуры клеток почки и печени сурка были трансфицированы ДНК-плазмидами, несущими ген HBsAg, находящийся под контролем промотора LTR ВСР и МТТ мыши (pRPAS,pUC19). Анализ экспрессии HBsAg в клеточном экстракте показал, что во всех исследованных клетках белок обнаруживается в низком титре (1:4, 1:8). В первичной культуре клеток печени сурка HBsAg был обнаружен в культуральной жидкости и в клеточном экстракте в одинаковом титре - 1:16, что свидетельствует о секреции белка. Низкий уровень экспрессии HBsAg, вероятно, связан с небольшим числом клеток в культуре, продуцирующих HBsAg, т.к. результаты реакции иммунофлуоресценции показали, что почти во всех случаях белок экспрессируется только 3-5% клеток. Эти результаты, возможно, объясняются различной степенью процессинга белка в гепатоцитах и других клетках (клетках почки, трахеи). С помощью реакции иммунофлуоресценции HBsAg был обнаружен в цитоплазме всех клеток, использованных для трансфекции, что характерно для оболочечных белков вирусов.

Известно, что при временной экспрессии трансфицируемые гены начинают экспрессироваться спустя несколько часов (8Т0ч) после введения их в клетки, однако, этот процесс происходит асинхронно. Через 24-48 часов после трансфекции количество клеток, экспрессирующих белок, достигает максимума, после чего начинает уменьшаться (Pellicer et al., 1980). Эта закономерность не зависит от метода введения генов и от способа репликации вектора (эписомальный или интеграционный) (Dean et al., 1983; Dean et al., 1984). Установлено, что топологическое состояние векторной ДНК имеет важное значение для транскрипции трансфицируемого гена. Суперкольцевые ДНК-плазмиды транскрибируются с большей эффективностью, чем линейные, что, возможно, связано с более активным приобретением нуклеосомной организации суперкольцевых ДНК. (Cohran et al., 1985; Cohran et al., 1985). Вероятно, для регуляции экспрессии трансфицируемого гена важное значение имеет наличие транс- и цис-активирующих элементов клеток. Количество этих факторов зависит от типа и вида клеток. Связывание их с промоторными и энханцерными участками гена определяет уровень его экспрессии. Однако, результаты наших экспериментов не показали существенной разницы в экспрессии HBsAg, контролируемого различными промоторами - LTR ВСР и МТ-1 мыши. Это свидетельствует о том, что количество цис- и траис-активирующих элементов, взаимодействующих с этими промоторами, в клетках, использованных для временной трансфекции, примерно одинаково.

Для получения генетически трансформированых клеток, стабильно экспрессирующих HBsAg, были использованы мутантные клеточные линии, дефектные по ферментам ТК (СПЭВ) и ГФРТ (TP). ТК'-дефектные клетки котрансфицировали ДНК-плазмидами, несущими ген HBsAg и ген ТК ВПГ-1, ГФТР-дефектные - ДНК плазмидами, несущими ген HBsAg и маркерный ген бактериальной КГФРТ (pSV-2gpt). Селекцию трансформантов по ТК+ фенотипу осуществляли в ГАТ среде, а трансформантов по ГФРТ+ фенотипу - в ГАТ среде, содержащей микофеноловую кислоту и ксантин. Через 2-3 недели после трансфекции в соответствующей селективной среде были обнаружены клеточные клоны с ТК+ и ГФРТ+ фенотипами. Частота трансформации в ТК дефектных клетках СПЭВ достигала 8-10-10"^' в ГФРТ дефектных клетках трахеи эмбриона коровы была на порядок меньше. Около 30% клонов с фенотипом

ТК и ГФРТ экспрессировали HBsAg, что свидетельствует о совместной экспрессии котрансфицируемых генов.

Показано, что котрансфицирование двух генов, находящихся в самостоятельных векторах (плазмидах), в клетки эукариот обеспечивает коэкспрессию обоих генов (Huttner et al., 1979; Hsiung etal., 1980; Hsiung et al., 1982). Возможно, это обусловлено тем, что компетентные клетки по своей физиологической способности одинаково поглощают обе независимо трансфицированные ДНК-плазмиды. В ядрах клеток трансфицируемые ДНК подвергаются рекомбинации и лигированию, в результате чего образуются гибридные структуры (пекелосомы), содержащие ДНК, ранее ковалентно не связанные.

Наиболее широко используемыми маркерными генами для котрансфекции ТК- и ГФРТ-дефектных клеток являются ген ТК ВПГ-1 и прокариотический ген КГФРТ. Показано, что котрансфекция ТК-дефектных клеток ТК ВПГ-1 с различными вирусными, прокариотическими и эукариотическими генами обеспечивает селекцию клонов с ТК+ фенотипом, экспрессирующих как маркерный ген, так и исследуемый (Wigler et al., 1979; Huttner et al., 1979; Perucho et al., 1980). Собственный промотор ТК ВПГ-1 обеспечивает конститутивную экспрессию гена, что очень важно при селекции генетически трансформированных клеток (Bacchetti and Graham., 1977; Maitland et al., 1977). Установлено, что при котрансфекции имеет важное значение соотношение ДНК плазмид, несущих ТК ВПГ-1 и исследуемый ген. Варьирование его от 1:2 до

1:20 в различных клетках влияет на эффективность экспрессии котрансфицируемых генов (Huttner et al., 1979).

Ген КГФРТ Е. coli при котрансфекции с исследуемым геном обеспечивает получение трансформантов как генетически маркированных, так и немаркированных клеток (Mulligan., 1982). Это обусловлено способностью фермента КГФРТ узнавать в качестве субстрата ксантин в среде ГАТ, содержащей ксантин и микофеноловую кислоту (ингибитор инозинмонофосфат-дегидрогеназы) (Neusch et al., 1984).

Анализ экспрессии HBsAg в генетически трансформированных клетках СПЭВ и TP показал, что клетки СПЭВ обеспечивали наиболее высокой уровень продукции белка (128 мкг/Ю^кл/сутки), как при использовании промотора LTR ВСР, так и МТ-1 мыши. Такое же количество белка было обнаружено в клеточном экстракте, следовательно, соотношение секретируемой и клеточно-ассоциированной форм HBsAg было 1:1. Возможно, секретируемой формой белка является S-HBsAg, который не имеет pre-Sl и pre-S2 регионов, т.к. M-HBsAg и L-HBsAg, имеющие pre-Sl и pre-S2, не секретируются (Moss et al., 1988). Тогда клеточно-ассоцированными формами белка являются M-HBsAg и L-HBsAg. Высокий уровень экспрессии сохранялся до 3-4 месяцев непрерывного культивирования клеток при использовании обоих промоторов. Гибридизация радиоактивной ДНК плазмиды, содержащей полную нуклеотидную последовательность HBsAg, с хромосомной ДНК трансформантов показал интеграцию трансфицируемого гена HBsAg в геноме генетически трансформированных клеток. Результаты изучения индуцибельных свойств промоторов свидетельствуют о том, что оба промотора обеспечивают индуцибельную экспрессию HBsAg как в стабильно трансформированных клетках, так и при временной экспрессии белка. В качестве индукторов были использованы глюкокортикоидный гормон - дексаметазон для LTR ВСР и соли тяжелых металлов - цинка и кадмия для МТ-1 мыши. Экспрессия HBsAg увеличивалась в 3-4 раза в клетках обработанных индукторами.

Индуцибельные промоторы часто используются для изучения регуляции экспрессии генов, т.к. они, в отличие от конститутивной экспрессии, позволяют контролировать работу гена по желанию исследователя. Были идентифицированы серии индуцибельных промоторов, такие как длинные концевые повторы ретровирусов, металлотионины мыши и человека, гормон роста, белки теплового шока (Lee et al., 1981; Pelham., Bienz., 1982; Mayo et al., 1982; Karin., Richrds., 1982; Lee et al., 1993). Механизм регуляции экспрессии генов с помощью индуцибельных промоторов может быть различен и зависеть от индукторов, но главный принцип заключается в том, что индуктор, непосредственно или опосредственно, связывается с промотором, обеспечивая его взаимодействие с РНК-полимеразой, и таким образом инициирует транскрипцию мРНК гена (Мертвецов., 1986; Мертвецов, 1990; Albert etal., 1995).

Генетически трансформированные клеточные линии, экспрессирующие поверхностный антиген вируса гепатита В могут быть полезными для биотехнологических исследований, поскольку HBsAg является основным компонентом вакцинных и

7.3. Регуляция экспрессии HBsAg и HBcAg в клональных сублиниях гепатокарциномы человека, проявляющих различную степень дифференцировки и дедифференцировки

Вирус гепатита В является одним из уникальных представителей царства Vira, который обладает строгой гепатотропностью к клеткам печени. Изучение молекулярного механизма тропизма вируса гепатита В к гепатоцитам является одним из важнейших фундаментальных вопросов биологии этого вируса. Анализ соседствующих опухолевых и здоровых тканей у людей, больных гепатитом В, и результаты трансфекции высокодифференцированных и недифференцированных гепатоцитов в культуре плазмидой, несущей ДНК вируса, показали, что репликация вирусного генома, экспрессия вирусных белков и сборка вирусных частиц происходит в неопухолевой части печени, в высокодифференцированных гепатоцитах (Raimondo et al., 1987; Sells et. al., 1988; Shaul., 1994). Однако, ДНК вируса была найдена в различных непеченочных клетках (лимфоцитах, нервных клетках, сперме) и, как правило, в интегрированной форме (Наумова и др., 1983; Наумова и др., 1986; Наумова и др., 1988' Shaul., 1994). Эти результаты позволяют предположить, что вирус адсорбируется и проникает не только в печеночные клетки, но репликация вирусного генома и созревание полноценного вириона происходят только в гепатоцитах.

Роль дифференцировки гепатоцитов в тропизме ВГВ интенсивно изучается. В качестве модельных культур используются высокодифференцированные (HepG2, HuH7), низкодифференцированные (HA22T/VGH) клетки печени и непеченочные клетки (HeLa) (Yuh., Ting., 1990; Yuh., Ting., 1991; Raney., 1991; Yuh., Ting., 1993; Pirjo et al., 1994; Zhang., Mclachlan., 1994). Эти клетки трансфицировали плазмидами, несущими ДНК ВГВ, и анализировали экспрессию вирусных белков и клеточные факторы, участвующие в регуляции экспрессии вирусных генов. Нами была разработана другая альтернативная модель клеток печени, позволяющая изучать регуляцию экспрессии вирусных генов в процессе приобретения цитодифференцировки и дедифференцировки в культуре. Для этого мы использовали опухолевую клеточную линию PLC/PRF/5, полученную от больного ВГВ с гепатоцеллюлярной карциномой ( Alexander et al., 1976).

Клетки PLC/PRF/5 широко используются для изучения различных аспектов биологии ВГВ и гепатоцеллюлярной карциномы человека, т.к. эта линия имеет полный геном вируса, интегрированный в ДНК клеток, и экспрессирует HBsAg (Marion et al., 1979; Machab et al., 1976; Skelly et al., 1979; Miller and Robinson., 1983; Ривкина и др., 1983; Ривкина и др., 1986).

Результаты анализа цитоморфологических и культуральных свойств клеток PLC/PRF/5, имеющихся в нашей лаборатории, показали, что популяция состоит из хорошо размножающихся гепатоцитов, 60-80% которых экспрессируют альфа-фета протеин (канцероэмбриональный антиген). Синтез клетками PLC/PRF/5 человеческого альбумина обнаружить не удалось. Туморогенная активность их, проверенная на бестимусных мышах, была очень высокой - при введении кл опухоль образуется через 14-21 день. Эти результаты свидетельствуют о низком уровне дифференцировки клеток в культуре. Анализ экспрессии HBsAg показал, что уровень синтеза как секретируемой, так и клеточно-ассоцированной формы белка был очень низкий. Экспрессия нуклеокапсидного белка (HBcAg) и других белков ВГБ в клетках PLC/PRF/5 была репрессирована (Marion et al., 1979; Machab et al., 1976; Skelly et al., 1979; Miller and Robinson., 1983; Dejean et al., 1983).

Реверсия опухолевого фенотипа клеток к норме, т.е. возвращение признаков дифференцировки, соответствующих гистогенезу, встречается как in vivo в процессе малигнизации, так и in vitro при культивировании трансформированных клеток (Бахтин Ю.Б.,., Швембергер И.Н., 1966; Кавецкий Р.Е., Шуклинов В. А., 1978; Туманова С.Ю., 1978; Шапиро., 1981; Васильев., Гельфанд., 1981; Bissel, 1981; Alsabit, 1981; Wheelock et al., 1981; Райхлин., 1981; Пинаев Г.П., 1981; Райхлин Н.Т., 1983; Эренпрейс Я.Г., 1983; Эренпрейс Я.Г., 1984; Швембергер, 1987; Эренпрейс, 1987; Лобко, Поробова. 1989; Gourdeau., Fournier., 1990; Blau., Baltimore., 1991). Механизм этого явления неизвестен, но некоторые общие свойства эмбриональных и опухолевых клеток позволяют предположить, что в опухолевых клетках имеются некие факторы, участвующие в процессе остановки размножения. Дифференцировку опухолевых клеток в культуре можно индуцировать с помощью природных биологически активных веществ (витаминов, простогландинов, факторов роста); метаболитов (5-БДУ, метотрексата, тиогуанина, цитозина, арабинозида, 6-меркаптопурина, 2,6-аминопурина, 1-метилгипоксантина); антибиотиков (митомицина, валиомицина, блеомицина, актиномицина Д, актиномицина С); цитостатиков (винкристина, винбластина, колхицина); гормонов (дексаметазона, гидрокартизона), изменения условий культивирования (концентрации сыворотки, рН, плотности клеток) и т.д (Marks., Rifkind., 1978; Alsabit., 1978; Bissell., 1981; Wheelock et al., 1981; Laat de., Saag van der., 1982; Фридлянская., 1984; Scwartz et al., 1992). Эти вещества также индуцируют новые хромосомные изменения и амплификацию клеточных генов (онкогены, ДГФРТ, MDR и др) (Розенблатт, и др., 1973; Игнатова и др., 1974; Беляева и др., 1074; Плескач., Игнатова, 1980; Игнатова и др., 1981; Какпакова и др., 1981; Копнини и др., 1982; Копнин., Гудков., 1983а; Гринчук, Игнатова, 1983; Гудков, Копнин, 1983; Зыбина, 1983; Ефимова и др., 1984; Плескач., Игнатова,

1984; Ефимова, Игнатова, 1984; Сальников., Соркин., 1984; Горностаев и др., 1984; Горнастаев и др., 1985; Забаровский., 1985; Тарунина, Игнатова, 1985;).

Для селекции клональных вариантов PLC/PRF/5, проявляющих признаки дифференцировки, был использован широкий спектр индукторов и селективных агентов различного происхождения, которые широко используются в качестве противоопухолевых препаратов in vivo и для изучения механизмов нормализации раковых клеток, т.е. возвращения их к дифференцированному фенотипу.

Селекцию высокодифференцированных клонов гепатокарциномы PLC/PRF/5 осуществляли посредством многоступенчатой обработки клеток токсическими препаратами (Тугизов и др., 1992; Tugizov et al., 1993). Периоды отбора были условно разделены на 7 этапов в соответствии со ступенями или шагами селекции. В процессе 1-3 этапов был осуществлен отбор клонов, потенциально имеющих признаки дифференцировки, характеризующиеся снижением экспрессии АФП. Начиная со второго этапа, некоторые клоны, устойчивые к токсическим селективным агентам снижают или теряют экспрессию АФП (40-50 % клеток) и начинают синтезировать человеческий альбумин (3-5%), т.е. приобретают признаки дифференцировки. Четвертый этап селекции обеспечивал отбор клонов, имеющих более дифференцированный фенотип (остановка экспрессии АФП, увеличение синтеза альбумина - 40-50%). На этом этапе была обнаружена экспрессия ещё одного маркера цитодифференцировки клеток печени - Р-170, являющегося мембранным насосом, активно функционирующим в зрелых гепатоцитах. Клетки, изолированные на 5 этапе селекции, проявляли признаки предтерминальной стадии дифференцировки - потеря туморогенной активности при введении бестимусным мышам, замедление размножения клеток, прекращение экспрессии АФП, усиление экспрессии альбумина и Р-170 до 60-80%. Затем наступала стадия покоя (6 этап), которая характерна для терминальной дифференцировки. В этот период наблюдалась остановка размножения клеток, культуры сохраняли жизнеспособность в течение 1-1,5 месяцев. На 7 этапе селекции на фоне неразмножающихся (покоящихся) клеток появлялись активно растущие клоны. Они экспрессировали АФП, прекращали синтез человеческого альбумина и Р-170, обладали туморогенной активностью. Эти свойства характеризуют их как низкодифференцированные гепатоциты и свидетельствуют о фенотипе дедифференцировки клеток

В литературе имеется много данных о том, что обработка клеток гепатокарциномы различными вышеуказанными препаратами приводит к реверсии опухолевого фенотипа и к отбору клонов, проявляющих признаки дифференцировки (Bosze., Venetianer., 1985; Cook et al., 1985; Chou et al., 1982; Nakagawa et al., 1985). Для анализа фенотипа дифференцировки клеток использовались различные морфо-функциональные свойства нормальных гепатоцитов, в том числе экспрессия альфа-фета протеина (АФП) и сывороточного альбумина. Альфа-фета протеин экспрессируется печеночными клетками в период эмбрионального развития, в зрелых гепатоцитах его синтез прекращается (Абелев., 1979; Глейберман., 1979; Энгельгард, 1984). Возобновляется экспрессия АФП в раковых клетках печени и поэтому АФП имеет второе название - карцино-эмбриональный антиген (Троянский., 1982; Банников., Троянский., 1984; Lescoat et al., 1985; Freeman et al., 1981). Сывороточный альбумин является маркером зрелых гепатоцитов, в опухолевых клетках печени его синтез исчезает (Cassio et al., 1981; Gal et al., 1985).

Известно, что белок P170 выполняет роль мембранного насоса, осуществляющего откачивание токсических веществ из клеток. Феномен множественной лекарственной устойчивости клеток (multy drug resistance) часто связан с амплификацией гена Р170 и увеличением синтеза этого белка (Endicott and Ling., 1989; Kane, et.al.,1990; Mayer et al., 1995). Установлено, что экспрессия P-170 является физиологическим процессом в многих тканях организма, включая печень, почки, поджелудочную железу, надпочечники, прямую кишку (Sigawara et al., 1988) Высокий уровень экспрессии Р-170 отмечен в зрелых (высокодифференцированных) гепатоцитах, участвующих в процессе детоксикации организма от вредных веществ (Arias et al .,1990., Mayer et al., 1995).

Таким образом, нам удалось создать модельную систему гепатоцитов in vitro, иммитирующую многостадийный процесс дифференцировки этих клеток, позволяющую изучать экспрессию белков ВГВ (Тугизов и др., 1991; Тугизов и др., 1992; Tugizov et al., 1993).

Анализ экспрессии HBsAg в процессе селекции высокодифференцированных и низкодифференцированных клонов PLC/PRF/5 показал, что практически во всех клонах с признаками дифференцировки было отмечено усиление продукции этого белка, что не наблюдалось в низкодифференцированных клонах. На уровне 2-3 этапа селекции, когда происходил отбор клонов, имеющих потенцию к высокодифференцированному фенотипу, в большинстве исследованных клонов экспрессия HBsAg увеличивалась в 400-500 раз в сравнении с исходной низкодифференцированной культурой PLC/PRF/5. Усиление экспрессии HBsAg строго коррелировало с уменьшением экспрессии АФП и появлением синтеза альбумина. Отмечалось динамичное увеличение экспрессии HBsAg на 4 этапе селекции, когда экспрессия АФП прекращалась и начинался синтез сывороточного альбумина и Р170. На 5 этапе селекции (предтерминальный этап) отмечался самый высокий уровень экспрессии HBsAg, титр белка в культуральной жидкости достигал 1:512 - 1:2048, количество клеток, экспрессируюших HBsAg, составляло 70-80%. Однако, на 6 этапе селекции, когда клетки приобретали признаки терминальной дифференцировки (остановка роста, высокий уровень экспрессии сывороточного альбумина и Р170), экспрессия HBsAg резко уменьшалась (титр 1:8 - 1:16). Экспрессия HBsAg в активно растущих, дедифференцированных клонах PLC/PRF/5 не была установлена (Тугизов и др., 1991; Тугизов и др., 1992; Tugizov et al., 1993).

Анализ экспрессии HBcAg в низкодифференцированных, высокодифференцированных и дедифференцированных клетках показал, что активация этого ранее репрессированного гена ВГВ происходит только в клетках, имеющих признаки высокой степени дифференцировки. Начало экспрессии HBcAg отмечалось на 4-5 этапе селекции (5-10% клеток), но максимальный уровень ее был зарегистрирован на 6 этапе, когда клетки приобретали признаки терминальной дифференцировки (остановка роста и экспрессии АФП, усиление синтеза сывороточного альбумина и Р170). Результаты реакции иммунофлуоресценции показали, что 40-60% клеток популяции экспрессировали НВсА, который был локализован в ядре. Секреция HBcAg в культуральной жидкости не была обнаружена, титр белка в клеточном экстракте (10б клеток) достигал 1:100-1:200 (Тугизов., 1989; Тугизов и др., 1991; Тугизов и др., 1992; Tugizov et al., 1993).

Сравнительный анализ экспрессии HBsAg и HBcAg в высокодифференцированных клонах гепатомы PLC/PRF/5 показал отсутствие одновременного усиления экспрессии оболочечного и нуклеокапсидного белков ВГВ. Например, на 6 этапе селекции, когда клетки имели признаки терминальной дифференцировки, экспрессия HBsAg резко снижалась, а синтез HBcAg достигал максимального уровня.

Результаты наших исследований показали, что экспрессия оболочечного и нуклеокапсидного белков ВГВ зависит от степени дифференцировки гепатоцитов. Несмотря на то, что разделение периодов дифференцировки клеток PLC/PRF/5 во время селекции по этапам представляет собой условный характер, несомненно, что проявление фенотипа дифференцировки это сложный многоступенчатый процесс. Возможно, что на каждой ступени дифференцировка имеет свои морфо-функциональные и биохимические особенности. Сравнительный анализ экспрессии HBsAg и HBcAg в процессе развития дифференцировки гепатоцитов продемонстрировал, что каждая ступень или стадия дифференцировки клеток имеет автономный механизм регуляции экспрессии вирусных белков. Примером этого является асинхронная регуляция экспрессии генов HBsAg и HBcAg в предтерминальной и терминальной стадии дифференцировки (Tugizov et al., 1993).

В литературе имеется много свидетельств того, что экспрессия генов ВГВ связана с дифференцировкой гепатоцитов. В высокодифференцированных гепатоцитах был идентифицирован ряд цис- и транс-активирующих белков, участвующих в регуляции экспрессии генов ВГВ. Эти белки, как правило, связываются с промоторными и энхансерными элементами вируса. ВГВ имеет четыре промотора: два промотора HBsAg, один - HBcAg и один - X белка (Cattaneo et al., 1983; Guo et al., 1991; Yaginuma et al., 1987) . ВГВ имеет также два энхансера, которые находятся между открытыми рамками считывания HBsAg и X белка (первый энхансер) и внутри открытой рамки считывания X белка (второй энхансер). Показано, что оба энхансера регулируют транскрипцию гена HBcAg, но это не исключает их роли в регуляции других генов вируса. Второй энхансер имеет два функциональных участка - бокс а и бокс (3, которые находятся между 1636-1690 и 1704-1741 нуклеотидами соответственно (Chang., Ting., 1989; Shaul et al., 1985; Wang et al., 1990; Yee., 1989; Yuh., Ting., 1990; Zhang., Mclachlan., 1994).

Chang et al. выделили из ядер зрелых гепатоцитов белок (HNF1), связывающийся с промотором большого L-HBsAg и усиливающий транскрипцию только этого промотора (Chang et al.,

1989). Позже был найден другой белок в ядрах гепатоцитов (HNF3), усиливающий транскрипцию промотора L-HBsAg и промотора HBcAg (Raney et al., 1995).

Из клеток печени были выделены и анализированы белки, взаимодействующие с энхансерными элементами ВГВ. Энхансеры, как правило, регулируют транскрипцию вирусных генов ориентации независимым путем (транс-активирующий механизм). В высокодифференцированных линиях гепатомы HepG2 и НиН7 идентифицирован белок (белок а), связывающийся с 23 парами оснований второго энхансера, которые называются бокс a (Yuh and Ting., 1991; 1993). Связывание белка а с боксом а второго энхансера активирует транскрипцию гена HBcAg ВГВ. В низкодифференцированных клетках гепатомы и в клетках непеченочного происхождения найден другой белок (белок f), который тоже взаимодействует со вторым энхансером ВГВ, блокируя работу вирусных генов (Yun and Ting., 1991,1993). В клетках печени также были идентифицированы следующие факторы: С/ЕВР, HBLF, RXRa. Все эти белки связываются с энхансерными элементами ВГВ и оказывают позитивное влияние на транскрипцию вирусных генов (Shaul., 1991; Trujillo et al., 1991; Siddiqui., Huan., 1993; Zhang., Mclachlan., 1994; ). Таким образом, в дифференцированных гепатоцитах идентифицированы как транс-, так и цис-регулирующие белки, связывающиеся с промоторными и энхансерными участками вируса и оказывающие негативный или позитивный эффект на работу генов.

Факторы, выделенные из дифференцированных гепатоцитов, и их роль в регуляции экспрессии генов ВГВ свидетельствуют о том, что эти клетки имеют набор белков, регулирующих работу вирусного гена на уровне транскрипции и обеспечивающих таким образом тропизм вируса к клеткам печени. Вероятно, экспрессия и регуляторные функции этих белков зависят от степени дифференцировки гепатоцитов и, следовательно, работа вирусных генов также связана с ней.

Результаты цитоморфологического анализа высокодифференцированных клонов PLC/PRF/5 показали заметное повышение доли многоядерных клеток (симпластов), число которых строго коррелирует с усилением экспрессии HBsAg. Однако, симпластообразование не было обнаружено в генетически трансформированных клетках почки эмбриона свиньи (СПЭВ) и трахеи эмбриона коровы (TP), экспрессирующих HBsAg. Возможно, фузогенная активность HBsAg зависит от вида и типа клеток, что характерно для некоторых фузогенных белков вирусов. Симпластообразование является одним из показателей фузогенной активности оболочечных гликопротеинов, обеспечивающих слияние вирусной и клеточной мембран, вследствие чего генетическая информация вируса проникает в клетки. Мембранные белки оболочечных вирусов являются многофункциональными, но их основная роль заключается в обеспечении связи вирусной частицы с рецепторами и слиянии вирусной мембраны с плазматической мембраной клеток. Предполагается, что HBsAg выполняет эти функции, т.е., связываясь с рецепторами, обеспечивает адсорбцию вируса и индуцирует слияние вирусной и клеточной мембран.

Показано, что preS2 домен LHBsAg участвует в адсорбции вируса на клетках печени. Синтезированные пептиды 27-48 аминокислоты домена preS2 антител ингибируют связывание HBsAgs клетками HepG2 (Neurath et al., 1986). Позже был обнаружен другой эпитоп preSl (31-34 аминокислоты), который участвует в адсорбции HBsAg на клетках печени (Sominskaya et al., 1992). Установлено, что N-конец preS2 региона, взаимодействующий с олигосахаридными группами, также вовлечен в связывание HBsAg с рецепторами гепатоцитов (Gerlich., 1993). Предполагается, что preS2 регион LHBsAg ответственен за слияние вирусной и клеточной мембран, т.к. обработка белка протеолитическими ферментами увеличивает связывание его с мембраной клеток как печеночного, так и непеченочного происхождения (Gerlich., 1993; Капп et al., 1995). Протеолитические ферменты усиливают фузогенную активность оболочечных вирусов, проникающих в клетки путем рН-зависимого слияния (White., 1993).

Результаты эпидемиологических исследований свидетельствуют о том, что вирус гепатита В участвует в развитии гепатоцеллюлярной карциномы (Matsubara. 1991). Показано, что геном ВГВ интегрирует в хромосомы малигнизированных клеток, однако, не была установлена закономерная сайт-специфическая интеграция ДНК вируса, фланкирующая с известным онкогеном или антионкогеном в определенной хромосоме (Ogston., 1982; Alexander., 1987). Поэтому роль ВГВ в развитии гепатоканцерогенеза остается невыясненной. Геном клеток PLC/PRF/5 имеет не менее восьми копий интегрированной ДНК ВГВ, интеграция установлена в хромосоме 11, 15 и 18 (Zimeretal., 1985; Bowcock., 1985). Результаты хромосомного анализа высокодифференцированных клонов PLC/PRF/5 показали, что число копий хромосомы 15 увеличивается, а хромосома 11 активно участвует в маркерообразовании. Возможно, эти изменения в хромосомах 11 и 15 связаны с усилением экспрессии HBsAg и HBcAg (Grabovskaya., Tugizov et al., 1993).

Таким образом, анализ закономерностей регуляции экспрессии оболочечного и нуклеокапсидного белков ВГВ в низкодифференцированных, высокодифференцированных и дедифференцированных клонах PLC/PRF/5 показал, что работа вирусных генов зависит от степени дифференцировки гепатоцитов и, возможно, связана с регуляцией экспрессии клеточных белков, взаимодействующих с энхансерными и промоторными участками вирусного генома. Однако, возникает вопрос: "В каких гепатоцитах происходит сборка зрелого вириона?" Наши результаты показали, что в стадии терминальной дифференцировки клеток PLC/PRF/5 экспрессия оболочечного белка снижается, а синтез нуклеокапсидного белка увеличивается. Такая регуляция могла бы негативно влиять на процесс сборки вириона, приводящий к синтезу и секреции дефектных вирусных частиц, не имеющих оболочки. Но неизвестно, какое соотношение оболочечных и нуклеокапсидных белков необходимо для нормальной сборки вируса и как этот процесс регулируется. Возможно, в зрелых гепатоцитах существует очень совершенный и сложный механизм, обеспечивающий регуляцию процесса сборки вируса, при котором необходим более активный синтез нуклеокапсидного белка, чем оболочечного.

7.4. Структурно-функциональный анализ оболочечных белков цитомегаловируса и вируса простого герпеса-1 в генетически трансформированных клетках

Генетически трансформированные клеточные линии, экспрессирующие белки, являются удобной модельной системой для изучения различных структурных свойств оболочечных белков вирусов таких, как олигомеризация, укладка субъединиц, посттрансляционная модификация, внутриклеточный транспорт и т.д. Используя эту модель, можно анализировать функции белков вирусов, в том числе мембранных гликопротеинов, их взаимоотношения с клеточными белками. С помощью этой системы нами были изучены некоторые структурно-функциональные свойства мембранного гликопротеина В (gB) цитомегаловируса человека.

Для трансформации использовались перевиваемые клетки глиобластомы человека, которые являются пермиссивными для цитомегаловируса. Подбор клеток для трансформации определенным геном конкретного вируса является критическим, т.к. необходимые процессинг и посттрансляционная модификация белков могут зависеть от клеток, обеспечивающх тропизм к исследуемому вирусу.

Трансформированные клоны были обнаружены через 10-14 дней после трансфекции, 5-7% клонов экспрессировали gB ЦМВ. Уровень экспрессии был очень высоким, до 60-80% клеток популяции продуцировали гликопротеин В ЦМВ. Локализация белков была характерна для гликопротеинов, т.е. в цитоплазме и на плазматической мембране. Анализ трансформантов с помощью панели моноклональных антител к внеклеточным и цитоплазматическим доменам белка показал, что все исследуемые эпитопы экспрессируются. Результаты цитофлуорометрии живых (нефиксированных) клеток продемонстрировали, что gB транспортируется на плазматическую мембрану клеток. Сравнительный анализ полипептидов в трансформантах, экспрессирующих дв, ив ЦМВ-инфицированных клетках с помощью метода радиоиммунопреципитации показал, что в генетически трансформированных клетках не происходит протеолитического расщепления гликопротеина, т.е. клетки продуцируют только 150-160 КД предшественник. Эти результаты свидетельствуют о том, что активность протеаз, расщепляющих полипротеин между 460 и 461 аминокислотами, возможно, регулируется с помощью других белков вируса (Tugizov et al., 1994).

Цитоморфологический и иммунофлуоресцентный анализ трансформантов показал, что в клонах, экспрессирующих gB, имеются многоядерные клетки-симпласты. Симпластообразование клеток в gB-продуцирующих культурах зависело от интенсивности внутриклеточного транспорта гликопротеина к плазматической мембране. Блокирование внутриклеточного транспорта gB с помощью туникамицина и моненсина приводилоло к уменьшению количества симпластов, что также свидетельствует о зависимости слияния клеток от транспорта белка. Дефект нарезания gB, синтезируемого в генетически трансформированных клетках, не играл существенной роли в фузогенной активности белка. Вируснейтрализующие моноклональные антитела к gB блокировали симпластообразование как в генетически трансформированных клетках, так и в инфицированных. Все эти результаты свидетельствуют о том, что гликопротеин В цитомегаловируса индуцирует слияние клеток в культуре, т.е. является фузогенным белком (Tugizov et al., 1994).

Внедрение генетической информации оболочечных вирусов в клетку хозяина происходит благодаря слиянию вирусной и клеточной мембран, индуцируемому с помощью мембранных гликопротеинов вирусов (Marsh., 1984; Helenius., 1990; White., 1993). Мембранные гликопротеины, обладающие сливающей активностью, называются фузогенными белками (fusion proteins). Они представляют собой глобулярные белки, имеющие внеклеточный, гидрофобный трансмембранный и внутриклеточный домены (Schlesinger and Schlesinger., 1987).

Слияние мембран, индуцируемое вирусными оболочечными гликопротеинами, может быть рН-зависимым или рН-независимым (Helenius., 1990; White., 1993). При рН зависимом слиянии вирусная частица путем эндоцитоза обволакивается плазматической мембраной клетки и попадает во внутриклеточные вакуоли с рН5-6. Вирусный гликопротеин при этом рН подвергается конформационному изменению и приобретает биологически активную форму. Когда белок становится функционально активным, он индуцирует слияние вирусной мембраны с мембраной вакуоли, содержащей вирус, в результате чего его генетическая информация, упакованная в нуклеокапсидной оболочке, оказывается в цитоплазме клетки (Marsh., 1984; Helenius., 1990; White., ; 1990; 1992; 1993 ). Ортомиксовирусы, тогавирусы, рабдовирусы и буньявирусы внедряются в клетки путем рН-зависимого слияния (Marsh., 1984; Marsh and Helenius., 1989; Duzgunes andBronner., 1988; White., 1993).

Герпесвирусы, парамиксовирусы, коронавирусы внедряются в клетки путем рН-независимого слияния, происходящего между мембранами вируса и клеток хозяина, в результате чего генетическая информация оказывается в цитоплазме (Sturman., 1985; Morrison., 1988; Spear., 1989; Spear., 1993). рН-независимое слияние также индуцируется с помощью оболочечных гликопротеинов вируса, которые связываются с рецепторами клеточных мембран. При этом остается невыясненным, каким образом приобретается функционально активная форма белка, индуцирующего слияние. Предполагается, что связывание гликопротеина с рецептором клетки инициирует конформационное изменение гликопротеина, в результате чего белок становится фузогенным (Moore et al., 1990; Hart et al., 1009; Ellens and Larsen., 1993). Ретровирусы используют оба пути внедрения в клетки, вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) использует рН-независимый путь, тогда как вирус рака молочной железы мышей (MMTV) проникает в клетки рН-зависимым путем (RedmondS., 1984; McClure et al., 1988).

Многоядерные клетки-симпласты образуются в результате проявления фузогенной способности оболочечных гликопротеинов и являются одним из основных критериев оценки функциональной активности этих белков (White., 1992). Анализ симпластообразования в инфицированных клетках не всегда позволяет идентифицировать фузогенные гликопротеины крупных вирусов, таких как герпесвирусы, поксвирусы, т.к. они могут иметь несколько белков, участвующих в процессе слияния. Наши результаты показали, что гликопротеин В, экспрессирующийся генетически трансформированными клетками, в отсутствие других белков вируса проявлял фузогенную активность, которая блокировалась с помощью моиоклональных антител к gB. Инкубация вируса с моноклональными антителами к gB не влияла на его адсорбцию на плазматической мембране, но полностью блокировала проникновение в клетки. Эти результаты демонстрируют, что гликопротеин В цитомегаловируса ответственен за слияние вирусной и плазматической мембран и проникновение вируса в цитоплазму. Процесс адсорбции вируса на мембране клеток, возможно, осуществляется посредством других оболочечных белков.

Известно, что фузогенные оболочечные гликопротеины имеют функционально активный участок, инициирующий слияние тесно контактирующих вирусной и клеточной мембран. Эти участки называются "пептид слияния" и, как правило, состоят из 24-34 гидрофобных аминокислот (White., 1990; 1993). Для выяснения функционально активных доменов gB, участвующих в процессе слияния, были проанализированы клеточные клоны глиобластомы U373MG, экспрессирующие мутантные формы белка, не имеющие внеклеточный, трансмембранный и цитоплазматический домены (Д170-447; А411-447; А548-618; А669-906; А717-772; А717-747; А751-771; А760-906; А833-906). Результаты радиоиммунопреципитации показали, что размер молекулярных масс полипептидов, кодируемых мутантными генами, соответствовал недостатку кодирующих последовательностей гена gB ЦМВ. Эпитопное картирование с помощью панели моиоклональных антител методом непрямой иммунофлуоресценции также подтвердило отсутствие соответствующих эпитопов в мутированных доменах (Tugizov et al., 1994; Tugizov et al., 1995).

Анализ внутриклеточного транспорта мутантных форм gB с помощью проточной цитофлуорометрии с использованием моноклональных антител к gB показал, что мутанты А717-747 и knpm , имеющие делении в первом сегменте трансмембранного региона и замену полярных аминокислот на неполярные в изгибе между первым и вторым сегментом белка, теряли способность к транспорту белка к плазматической мембране клеток. Параллельный иммунофлуоресцентный анализ (колокализация) этих мутантных белков с маркерными белками эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи показал, что они задерживаются в просветах эндоплазматического ретикулума. Результаты радиоиммунопреципитации мутантных белков также продемонстрировали, что они копреципитируются, т.е. ассоциируются, со стрессовыми белками ЗР - GRP78 и GRP94. Было показано, что стрессовые белки ЭР связываются с белками, имеющими дефект гликозилирования, олигомеризации, укладки субъединиц, и задерживают их просветах ЭР для деградации (Kim et al., 1987; Lee., 1987; Chang et al., 1989; Little et al., ,1994). При этом активация стрессовых белков индуцируется самими дефектными белками (Kozutsumi et al., 1988; Ramakrishnan et al., 1995). Делеционные мутанты по второму трансмембранному сегменту и полному трансмембранному домену секретировались в культуральную среду. Эти результаты продемонстрировали, что трансмембранный домен gB имеет две функции. Первый гидрофобный сегмент и изгиб между первым и вторым сегментом содержит сигнал для транспорта белка к компартментам аппарата Гольджи и, возможно, к плазматической мембране. Второй гидрофобный сегмент трансмембранного домена gB выполняет функцию заякоривания белка в мембране, т.к. при удалении этого сегмента гликопротеин начинает секретироваться в культуральную среду.

Анализ симпластообразования в клеточных клонах, экспрессирующих мутантные формы gB, показал, что слияние клеток обнаруживается только в мутантах, имеющих делеции во внеклеточных иммунодоменантных участках белка. Интересно отметить, что вируснейтрализующие моноклональные антитела к этим доменам блокируют симпластообразование. Спонтанно мутированный gB, не экспрессирующий трансмембранный и цитоплазматический домены, и экспериментально мутированный gB с недостающим цитоплазматическим доменом теряли полностью фузогенную активность. Другой мутант gB с недостатком 63 аминокислот с С-конца проявлял только 50% сливающей активности. Эти результаты свидетельствуют о том, что трансмембранный и цитоплазматический домены gB участвуют в процессе слияния (Tugizov et al., 1994; Tugizov et al., 1995).

Функциональные домены мембранных гликопротеинов, участвующие в слиянии мембран, как правило, имеют "пептид слияния", состоящий до 70-100% из неполярных аминокислот -аланина и глицина (White., 1992; Wharton et al., 1988; Bullough., 1994). "Пептиды слияния" могут находиться на N-конце белка (вирус гриппа, ВИЧ, вирус Сендай) (McCune et al., 1988; Morrison., 1988; Stegmann et al., 1989) или внутри (internal) белка (вирус Синдбиса, вирус саркомы Рауса) (Hunter et al., 1983; White et al., 1983) и образуют альфа спираль. Механизм слияния мембран, индуцируемый с помощью "пептида слияния" окончательно не выяснен, но на основе результатов, полученных при изучении фузогенного белка вируса гриппа гемагглютинина создана следующая гипотетическая модель (Hoekstra and Kok., 1989; Stegmann et al., 1989; White., 1992; Bullough., 1994 ). В эндосомах при pH 5-6 происходит конформационное изменение гемагглютинина, в результате чего глобулярные головки (гемагглютинин является тримером) раскрываются и N-конец белка, содержащий "пептид слияния", выходит наружу. Затем "пептид слияния" внедряется в мембрану эндосом и образует маленькую пору, инициирующую смещение наружных липидних слоев сливающих мембран, что приводит, в свою очередь, к смещению внутренних слоев, завершая этот процесс слиянием вирусных и клеточных мембран.

С помощью аминокислотного анализа (совместно с Dr. J. White) гликопротеина В ЦМВ не удалось найти участки гомологичные "пептиду слияния" других мембранных вирусов. Однако, расположение глицина в позициях 719, 722 и 726 аминокислот первого сегмента трансмембранного домена gB идентично "пептиду слияния" gp41 вируса иммунодефицита человека. Возможно, первый гидрофобный сегмент трансмембранного домена гликопротеина В ЦМВ является потенциальным "пептидом слияния".

Наши результаты показали, что три домена gB участвуют в процессе слияния: Dl, D2 - иммунодоменантные участки внеклеточного домена (антитела к этим участкам блокируют симпластообразование); трансмембраный (мутантные формы gB с недостающим трансмембранным участком не индуцируют

Neutral conformation

Рис. 55. Гипотетическая модель слияния мембран вируса гриппа и внутриклеточных эндосом (White., 1994). В эндосомах при рН5-6 происходит конформационное изменение гемагглютинина, в результате чего глобулярные головки (гемагглютинин является тримером) раскрываются и N-конец белка, содержащий "пептид слияния", выходит наружу (acid-induced conformation). Затем "пептид слияния" внедряется в мембрану эндосом и образует маленькую пору, инициирующую смещение наружных липидних слоев сливающихся мембран, что приводит, в свою очередь, к смещению внутренних слоев, завершая этот процесс слиянием вирусной и клеточной мембран. симпластообразование) и цитоплазматический (мутантный gB, не имеющий внутриклеточный домен не индуцирует слияние мембран). По-видимому механизм слияния, индуцированный гликопротеином В ЦМВ, существенно отличается от других известных вирусов, имеющих "пептид слияния" оболочечных белков, обладающий фузогенной активностью (гемагглютинин вируса гриппа, gp 41 ВИЧ и др) (Navarro et al., 1993, Tugizov et al., 1994; Tugizov et al., 1995).

Анализ гликозилирования мутантных форм гликопротеина В ЦМВ показал, что ни один из мутантов существенно не уменьшает степени связывания олигосахаридных групп. Возможно это связано с тем, что gB имеет 15 N-связывающих аспарагин-сайтов и удаление одного или двух из них путем мутации не достаточно для значительного изменения количества сахарных групп, связанных с белком. Однако, обработка клеток туникамицином снижает количество симпластов и блокирует гликозилирование. Известно, что гликозилирование мембранных белков необходимо для внутриклеточного транспорта (Hirschberg., 1987). и, таким образом, можно предположить, что гликозилирование gB влияет на его фузогенную активность. Не было обнаружено также существенного изменения в укладке субъединиц (олигомеризации) мутантных форм gB. Все мутанты образовывали олигомерные формы (340-360 КД) не зависимо от размера делеции, что свидетельствует о достаточном количестве S-S связей и взаимозаменяющих аминокислот, обеспечивающих правильную укладку субъединиц при организации четвертичной структуры мутированных белков.

Анализ фосфорилирования gB в генетически трансформированных клетках показал, что мутантные формы белка, не имеющие внутриклеточный домен не включают радиоактивный ортофосфат. Это свидетельствует о том, что сайты фосфорилирования расположены в цитоплазматическом домене белка, который также участвует в процессе слияния. Внутриклеточный домен gB имеет ряд аминокислот таких, как серин, трионин и тирозин, которые могут быть акцепторами фосфатных групп. Не исключено, что фосфорилирование gB играет важную роль, поскольку, мембранные белки в результате фосфорилирования и дефосфорилирования, связываясь с другими белками, участвуют в передаче сигнальной информации. Фосфорилирование цитоплазматического домена gB может инициировать взаимодействие и кооперацию различных доменов белка для приобретения ими функционально активной формы (Tugizov et al., 1994).

Таким образом, было установлено, что гликопротеин В цитомегаловируса является фузогенным белком, ответственным за слияние вирусной и плазматической мембран. С помощью молекулярно-биологического метода (инактивация различных доменов белка путем мутагенеза) и с использованием моноклональных антител, блокирующих функции gB, было показано, что три внеклеточных иммунодоминантных эпитопа (Dl, D2a и D2), трансмембранный участок и проксимальный регион цитоплазматического домена (760-833 аминокислоты) являются функционально активными. Также было установлено, что первый гидрофобный сегмент трансмембранного домена несет сигнальную информацию для транслокации белка от ЭР к аппарату Гольджи, а

7.5. Полярная инфекция цитомегаловируса и вируса простого герпеса-1 в эпителиальных клетках. Анализ экспрессии мембранных гликопротеинов вирусов в полярных эпителиальных клетках.

Начало вирусной инфекции на уровне организма зависит от первичного контакта вируса с клетками-мишенями. Взаимодействие вирусных и клеточных рецепторов обеспечивает адсорбцию и проникновение вируса в клетки хозяина, где его геном начинает функционировать как самостоятельная генетическая единица. Мишенями, обеспечивающими первичный контакт вируса с клетками в большинстве случаев являются эпителиальные клетки, т.к. они образуют те участки организма, которые непосредственно взаимодействуют с внешней средой (кожный покров, желудочно-кишечный и дыхательный тракты) (Alberts et al., 1994).

Было установлено, что адсорбция и проникновение некоторых вирусов в клетки и выход дочернего потомства происходит с определенной поверхности эпителиальных клеток (Tucker and Compans., 1993). Вирус гриппа инфицирует эпителиальные клетки как с апикальной, так и с базолатеральной поверхности, но выход (отпочковывание) дочерних вирусов происходит только с апикальной мембраны (Rodriguez-Boulan et al., 1983; Rodriguez-Boulan and Sabatini., 1978; Rodriguez-Boulan et al., 1989). Вирус везикулярного стоматита инфицирует эпителиальные клетки с базолатеральной поверхности, выход новосинтезированных дочерних потомков также происходит с этой поверхности (Fuller et al., 1984). Как проникновение, так и отпочковывание вируса трансмиссивного гастроэнтерита происходит с апикальной мембраны эпителиальных клеток (Rossen et al., 1994).

Наши результаты показали, что адсорбция и проникновение цитомегаловируса в пигментные эпителиальные клетки сетчатки глаза человека (ARPE-19) осуществляется с апикальной мембраны, тогда как вирус простого герпеса-1 может инфицировать эти же клетки как с апикальной, так и с базолатеральной поверхности. Выход (отпочковывание) цитомегаловируса из инфицированных ARPE-19 клеток также был установлен с апикальной мембраны. Анализ культуральной жидкости ARPE-19 клеток, инфицированных ВПГ-1, показал что выход его неполярный, как и проникновение, т.е. вирус отпочковывается с обоих мембран. Результаты инфицирования ВПГ-1 другой клеточной модели - эпителиальных клеток почки собак (МДСК) показали, что проникновение вируса происходит с базолатеральной мембраны, тогда как отпочковывание отмечается с апикальной поверхности (Tugizov et al., 1996).

Терминально дифференцированные эпителиальные клетки как in vivo, так и in vitro проявляют морфо-структурную полярность, т.е. распределение рецепторов и других мембранных белков на плазматической мембране апикальной поверхности клеток существенно отличается от базолатеральной (Compans and Srinvas., 1991; Rodreguez-Boulan and Powell., 1992). Расположение внутриклеточных органелл, организация цитоскелета и межклеточные контакты представлены ассиметрично, обеспечивая функциональную полярность клеток, т.е. транспорт ионов, белков и других макромолекул через клетки (трансклеточный транспорт) или между клетками (параклеточный транспорт) происходит по полярному принципу (от апикальной поверхности к базолатеральной или наоборот) (Albert., 1994).

Основываясь на результатах инфекции ARPE-19 клеток ЦМВ можно предположить, что рецепторы для ЦМВ в эпителиальных клетках сетчатки глаза человека локализованы на апикальной мембране, что обеспечивает проникновение вируса через нее. Рецепторы для ВПГТ в этих же клетках расположены не полярно, т.е. на апикальной и базолатеральной поверхности. Полярное распределение рецепторов к вирусам, возможно, зависит от вида и гистогенеза эпителиальных клеток. Сравнительный анализ инфекции ARPE-19 клеток и MDCK ВПГ-1 показал, что рецепторы для ВПГ-1 в клетках сетчатки глаза распределены не полярно, а в клетках почки собаки локализованы на базолатеральной поверхности. Вероятно, полярное распределение рецепторов к вирусам эпителиальных клеток определяет полярную адсорбцию и проникновение их через мембрану, где локализованы рецепторы.

Установлено, что отпочковывание ЦМВ из ARPE-19 клеток происходит с апикальной мембраны, т.е. выход дочерних вирусных частиц полярен. Анализ выхода ВПГТ из инфицированных ARPE-19 клеток и MDCK продемонстрировал, что полярное отпочковывание вируса происходит только с апикальной мембраны клеток. При этом путь выхода ВПГ-1 из клеток почки собаки является противоположным пути его проникновения, тогда как пути входа и выхода для цитомегаловируса в клетках эпителия сетчатки глаза человека одинаковы - через апикальную мембрану. Анализ полярного транспорта оболочечного гликопротеина В ЦМВ и ВПГ-1 в клетках ARPE-19 и МДСК соответственно показал, что gB обоих вирусов в соответствующих клетках транспортируется к апикальной мембране, где происходит отпочковывание дочерних вирусных частиц (Tugizov et al., 1996).

Полярные эпителиальные клетки имеют высокоорганизованную систему сортировки белков (Compans and Srinvas., 1991; Rodreguez-Boulan and Powell., 1992 ). Установлено, что новосинтезированные белки эпителиальных клеток после процессинга в эндоплазматическом ретикулуме или в транс-компартменте аппарата Гольджи распознаются с помощью специальных везикул и транспортируются к соответствующим мембранам (апикальной, латеральной или базальной) (Compans and Srinvas., 1991; Rodreguez-Boulan and Powell., 1992; Louvard., et al., 1992). Показано, что оболочечные белки вируса гриппа и везикулярного стоматита в полярных эпителиальных клетках транспортируются к апикальной и базолатеральной поверхности соответственно (Rodriguez-Boulan et al., 1983; Rodriguez-Boulan and Sabatini., 1978; Rodriguez-Boulan et al., 1989; Fuller et al., 1984). Полярный транспорт оболочечных белков этих вирусов коррелирует с полярным выходом новосинтезированных вирусных частиц (Rodriguez-Boulan and Sabatini., 1978; Fuller et al., 1984.) Такая корреляция была обнаружена в наших экспериментах, т.е. полярный выход ЦМВ и ВПГ-1 в клетках ARPE-19 и МДСК соответственно происходил с той поверхности клеток, куда транспортировался гликопротеин В. Механизм этого явления не известен, но логично было бы предположить, что оболочечные белки участвуют в регуляции внутриклеточного транспорта незрелых вирусных частиц (нуклеокапсид с ДНК вируса) к той мембране, куда они транспортируются и где незрелый вирус мог бы приобрести оболочку. Однако, результаты электронномикроскопического анализа показали, что приобретение оболочки герпесвирусами происходит на ядерной мембране инфицированных клеток (Fields et al., 1994). Для анализа полярного транспорта зрелого вируса от ядерной мембраны к апикальной поверхности клеток необходимо провести комплексные исследования с помощью методов иммуноэлектронной и конфокальной микроскопии.

Наши результаты продемонстрировали, что цитомегаловирус инфицирует полярные эпителиальные клетки сетчатки глаза человека с апикальной поверхности, и после репродукции выход вновь синтезированных дочерних вирусных частиц также происходит с этой мембраны клеток (Tugizov et al., 1996). Известно, что при цитомегаловирусном ретините поражается в основном сетчатка, клетки пигментного эпителия, расположенного между сетчаткой и хороидом, инфицируются, но без видимых патологических изменений (Pepose et al., 1987; Jabs etal., 1989). Инфекция в хороидном слое не была установлена, т.е. она не распространяется дальше сетчатки (Pepose et al., 1985; Holland., 1994; ). Возможно, локализованность ЦМВ инфекции в сетчатке глаза объясняется тем, что пигментные эпителиальные клетки являются барьером для распространения инфекции от сетчатки к хороиду. Вероятно, вирус заражает сетчатку через оптические нервы (ЦМВ - нейротропный вирус), переходит из ее клеток в эпителиальный слой, инфицируя клетки с апикальной мембраны, и затем после репродукции вновь синтезированные вирусные частицы выходят из клеток через эту же мембрану, т.е вирус возвращается назад к клеткам сетчатки, в результате чего блокируется распространение инфекции в следующий слой - хороид, содержащий множественные капиллярные сосуды.

Таким образом, полярные эпителиальные клетки могут транспортировать вирусные частицы от базолатеральной поверхности к апикальной мембране (вирус гриппа), от базолатеральной - к апикальной (ВПГ-1), от апикальной - к апикальной (ЦМВ) и от базолатеральной - к базолатеральной (вирус трансмиссивного гастроентерита). (Rodriguez-Boulan et al., 1983; Rodriguez-Boulan and Sabatini., 1978; Fuller et al., 1984; Rodriguez-Boulan et al., 1989; Rossen., 1994; Tugizov., 1995). Несмотря на то, что эти результаты не позволяют создать рабочую модель, объясняющую роль эпителиальных клеток в распространении инфекции, несомненно, полярные эпителиальные клетки участвуют в регуляции перехода вируса в соседние клетки и ткани. Например, если вирус гриппа проникает в клетки слизистого эпителия с апикальной поверхности, т.е. извне, тогда его выход с этой же поверхности может блокировать распространение инфекции в нижележащие клетки и ткани. Если вирус гриппа проникает в слизистый эпителий с базолатеральной мембраны, т.е. из крови, то его выход с апикальной поверхности клеток ускоряет элиминацию вирусных частиц, т.к. IgA и IgM, секретирующиеся также на апикальной поверхности, обладают высокой нейтрализующей активностью.

Нами был обнаружен также переход вирусных частиц через латеральную мембрану полярных эпителиальных клеток. Добавление вируснейтрализующих антител с апикальной и базолатеральной поверхности инфицированных эпителиальных клеток как при ЦМВ, так и при ВПГ-1 инфекции не блокировало образование бляшек (Pereira et al., 1995; Tugizov et al., 1996). Латеральные мембраны эпителиальных клеток имеют межклеточные контакты (плотные, адгезивные) и десмосомы, которые могут препятствовать проникновению антител в эти участки клеток. Тогда новосинтезированные потомки вируса имеют возможность инфицировать соседние клетки только через те участки, где антитела отсутствуют, т.е. через латеральную мембрану. Анализ локализации белков латеральных мембран (ZO-1, кадхерин, катенин, актин и тенсин) показал, что все они теряют полярное распределение или деградируют в инфицированных клетках. Параклеточная проницаемость инфицированных клеток по сравнению с неинфицированными драматически увеличивается. Эти результаты свидетельствуют о том, что переход вируса происходит через латеральную мембрану полярных эпителиальных клеток

Было показано, что ряд представителей альфа-герпесвирусов, включая ВПГ-1, имеющих делеции в гене gE, утрачивают бляшкообразующую способность. Делеционные мутатнты по gE и gE-gl ВПГ-1 и вируса визикулярного стоматита теряли вирулентность при заражении экспериментальных животных (Litwin et al., 1992; Dingwell et al., 1994). Нами было показано, что делеционные мутанты ЦМВ по гену US9, который является гомологичным gE ВПГ-1, теряли бляшкообразующую способность (Tugizov., et al 1995). Анализ клеточной полярности, параклеточной проницаемости и структурных изменений межклеточных контактов клеток ARPE-19 и МДСК, инфицированных делеционными мутантами ВПГ-1 и ЦМВ по генам gE и US9 соответственно, показал, что эти мутанты не способны существенно изменять морфо-структурную полярность клеток и проникать через их латеральную мембрану.

Распространение вирусной инфекции в организме часто наблюдается при наличии вируснейтрализующих антител. Этот феномен, по-видимому, связан с переходом вируса от инфицированных клеток к неинфицированным (Fields et al., 1994). Такой переход, вероятно, возможен только в области контакта инфицированных клеток с неинфицированными во избежание действия нейтрализующих антител. Механизм этого явления неизвестен, но результаты наших исследований показывают, что оболочечные гликопротеины вируса могут играть ключевую роль в этом процессе.

Анализ генетически трансформированных полярных эпителиальных клеток МДСК, экспрессирующих US9 ЦМВ, показал, что этот несущественный (US9 не необходим для инфекции и репродукции вируса) оболочечный гликопротеин играет критическую роль в переходе вируса через латеральную мембрану клеток. Результаты конфокального анализа продемонстрировали, что US9 аккумулируется на латеральной мембране полярных клеток и постепенно на 7-8 день культивирования клеток вызывает структурные изменения латеральной мембраны клеток. При этом меняется полярное распределение актина, В-катенина и тенсина: актин и В-катенин распределяются диффузно, экспрессия тенсина сильно уменьшается. Белки плотного (ZO-1) и адгезивного (Е-кадхерин) контактов также становятся диффузными или дегенерируют, что свидетельствует о разрушении межклеточных контактов. Параклеточная проницаемость увеличивается, клетки деполяризуются. Анализ растворимой и нерастворимой фракции белков клеток, экспрессирующих US9, показал, что US9 входит в нерастворимую фракцию, т.е. ассоцируется с белками цитоскелета или межклеточных контактов (Pereira et al., 1995).

Известно, что актин является одним из важнейших белков цитоскелета, регулирующих и обеспечивающих морфогенез клеток (Hartwing and Kwiatkovski., 1991; Albert., et al., 1994). Предполагается, что функция тенсина заключается в связывании актиновывых филаментов с белками межклеточных контактов - катенинами и интегринами. (3-катенин, в свою очередь, связывается с цитоплазматическим доменом Е-кадхерина, обеспечивающего адгезивные контакты между клетками (Davis., etal., 1991; Geiger and Ayalon., 1992; Weigt et al., 1992; Hink et al., 1994; Lo et al., 1994). Этот белковый комплекс нерастворим при обработке неионными детергентами. Таким образом, посредством такого каскадного связывания белки цитоскелета взаимодействуют с белками межклеточных контактов, регулируя и поддерживая полярные свойства эпителиальных клеток. Мутация тенсина или одного из катенинов приводит к нарушению каскадного взаимодействия белков, в результате чего наступает деполяризация клеток (Weigt et al., 1992; Hink et al., 1994; Lo et al., 1994). Возможно, оболочечный гликопротеин US9, внедряясь в нерастворимый белковый комплекс, связывается с одним или несколькими его белками, нарушает каскадное взаимодействие, приводящее к изменению межклеточных контактов. Нарушение межклеточных контактов, вероятно, обеспечивает переход вируса от инфицированной к соседней неинфицированной клетке. Делеционные мутанты ЦМВ по US9, а также ВПГТ по gE не могут переходить от инфицированных клеток к неинфицированным, т.к. межклеточные контакты в отсутствие US9

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Тугизов, Шароф Мавлонович, Москва

1. Абелев Г.И., Эмбриональные антигены в опухолях: Анализ в системе альфа-фета протеина. В кн.: Опухолевой рост как проблема биологии развития. М., 1979, с. 14&173

2. Банников Г.А., Дифференцировочные антигены при опухолевом росте. М., 1984, с 221-242. Итоги науки и техники. Сер. Онкология/ВИНИТИ; т. 13

3. Банников Г.А., Троянский С.М., Изменение дифференцировки и морфогенеза при неопластической трансформации печени in vitro и in vivo. В кн.: Иммунологические аспекты биологии развития. М„ 1984, с. 107-125

4. Беляева Т.Н., Игнатова Т.Н., Сальников К.В., Фадеева М.Д. Определение ДНК в митохондриях клеток L, резистентных к действию бромистого этидия. В кн. Функциональная морфология, генетика и биохимия клетки., Л., 1974, вып.16, с.292-293

5. Васильев Ю.М., Гельфанд И.М. Взаимодействие нормальных и неопластических клеток со средой. М., 1981, 220с.

6. Бахтин Ю.Б. Швембергер И. Н. Сохранение способности к дифференцировке при малигнизации клеток in vitro. В кн. Клеточная наследственность и злокачественный рост. Л., 1966, с.80-94

7. Горностаев B.C., Игнатова Т.Н., Различная степень стабильности устойчивых к колхицину клеток мышиной гепатомы МГХХПа. Цитология, 1984, 26:594-598

8. Гринчук Т.М., Игнатова Т.Н., Кариотипические особенности фибробластов китайского хомячка линии RJK, устойчивых к бромистому этидию, Цитология, 1983, 25:1081-1097

9. Глейберман А.С., Храмкова Н.И., Белошапкина Т.Д., Структура печени как возможный фактор регуляции синтеза альфа-фета протеина. Бюл. эксперим. биол. и медицины, 1979, 87:576-578

10. Глебов О,К., Абрамян Д.С., Природа фенотипической изменчивости соматических клеток в культуре: нестабильные фенотипические изменения. Цитология, 1984, 26:235-251

11. Глебов О.К., Титомиров А.С., Пинаев Г.П., Томилин Н.В., Трансформация клеток китайского хомячка плазмидой pBR325::tk;;HBS и влияние на стабильность трансформантов опухолевого промотора ТФА. ДАН СССР, 1982, 267:1496-1498

12. Глебов О.К., Абрамян Д,С1, Томилин Н.В., Генетическая трансформация соматических клеток. 1. Клон клеток китайского хомячка, дефектных по тимидинкиназе, отличающихся высокой эффективностью трансформации. Цитология, 1985 а, 27:467-475

13. Штамм мутантных клеток трахеи эмбриона коровы для гибридизации клеток животных ин витро Авторское свидетельство, N 1294010, 1986, 5 а

14. Ефимова Е.В., Игнатова Т.Н., Генетическая характеристика устойчивости клеток китайского хомячка к колхицину, актиномицину Д и бромистому этидию. Генетика, 1984, 20:1148-1154

15. Ефимова Е.В., Игнатова Т.Н., Гринчук Т.М. и др., Получение и генетическая характеристика клеток китайского хомячка, устойчивых к колхицину, актиномицину Д и бромистому этидию. ДАН СССР, 1984, 274:431-434

16. Забаровский Е.П., Онкогены ретровирусов и клеточные протоонкогены. Молекулярная биология, 1985, 19, вып. 1, 9-35

17. Зыбина Е.В., Различные пути репродукции клеток при дифференцировке плаценты млекопитающих. Цитология, 1983, 25:1103-1120 Инге-Вечтомова С.Г. Молекулярные и клеточные аспекты биотехнологии. Л, 1986, 255с.

18. Игнатова Т.Н., Плескач В.А., Сальников К.В. Получение и характеристика клеток китайского хомячка и мыши, устойчивых к бромистому этидию. В кн. Функциональная морфология, генетика и биохимия клетки. Л., 1974, вып.16, с.142-144

19. Копнин Б.П., Гудков А.В. Амплификация участков генома в соматических клетках млекопитающих, устойчивых к колхицину. Сообщение 4.

20. Генетическая трансформация с помошью амплифицированных генов клеток джунгарского хомячка, высокоустойчивых к колхицину. Генетика, 1983а, 19:864-871

21. Копнин Б.П., Гудков А.В. Амплификация участков генома в соматических клетках млекопитающих, устойчивых к колхицину. Сообщение 5. Индукция генной амплификации в клетках джунгарского хомячка и мыши. Генетика, 19836, 19:872-880

22. Копнин Б.П., Гудков А.В., Кадырова ЕЛ. Хромосомная и внехромосомная локализация амплифицированных генов в резистентных кколхицину клетках. ДАН СССР, 1982, 262:993-997

23. Лобко Г.Н., Резистентность опухолей. Минск, "Наука и техника" 1989, с.60.64

24. Львов Д.К., Вязов С.О., Гибадулин РА. Кущ А.А., Иммунобиотехнология гепатита В. Журнал Всесоюз. химич. общества им. Менделеева, 1989, 34, 1:60-67

25. Льюин Б. Гены Пер. с анг., М., 1987, 465с.

26. Мертвецов Н.П., Регуляции экспрессии генов стероидными гормонами. М. Наука, 263 с, 1990

27. Маршак М.И., Варшавер Н.Б., Спонтанный темп возникновения мутаций резизтентности к 8-азагуанину в диплоидних и анеуплоидных клетках человека in vitro. Генетика, 1970, 7:130-138

28. Наумова А.К., Сотникова Е.Н., Цибиноген В.В., Коренев В.И., Бухны А.Ф., Васильева М.В., Киселев. Л.Л., Вирус гепатита Б и возникновение эмбриональных опухолей человека. Молекулярная биология, 1988, 22,1:106-110

29. Пинаев Г. П., Синтез специфических сократительных белков как биохимическая основа дифференцировки миогенных клеток. В кн. Проблемы миогенеза., Л., 1981, с. 75-95

30. Плескач В А., Игнатова Т.Н. Контроль размножения клеток. 1. Зависимость размножения клеток от факторов сыворотки. Цитология, 1980, 22^332-337

31. Ривкина М.Б., Народицкий Б.С., Кукайн Р.А., Тихоненко Т.И, Клонирование и рестрикционный анализ последовательностей ДНК вируса гепатита В, интегрированных в геном клеток линии PLC/PRF/5 , ДАН СССР, 1983, 269, 6:1505-1509

32. Ривкина М.Б., Лунин В.Г., Кукаин Р.А., Тихоненко Т.И., Нуклеотидная последовательность фрагментов генома вируса гепатита В (HBV), интегрированных в ДНК клеток линии PLC/PRF/5. ДАН СССР, 1986, 288, 2:503-506

33. Рингерц Н., Сэвидж Р., Гибридные клетки. М. Мир. 1979, 415 с.

34. Розенблат В.А., Серпинская А.С., Ставровская А.А., О механизме резистентности к колхицину сублинии мышиных клеток L. ДАН СССР, 1973,211:1460-1462

35. Савченкова И.П., Тугизов Ш.М., Анализ компетентности клеток млекопитающих к поглащению и экспрессии трансфицируемых генов. Тез. докл. Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии, М, 1991:169.

36. Сальников К.В., Соркин А.Д. Пониженная скорость поступления уридина и глицерина в клетки L, устойчивые к бромистому этидию. Цитология,1984, 26:699-705.

37. Тугизов Ш.М., Использование электрического пробоя мембран для гибридизации и трансфекции эукариотических клеток. В кн: Молекулярная биология и генетическая инженерия вирусов, М. 1989: 9398.

38. Тугизов Ш.М., Сравнительный анализ экспрессии поверхностного антигена (HBsAg) вируса гепатита В. В кн: Молекулярная биология и медицина, Л, 1990:7.

39. Тугизов Ш.М., Кущ А.А., Активация внутренного антигена вируса гепатита В в мутантных клеточных клонах гепатокарциномы человека. Тезисы докладов Всесоюзной конференции по генетике соматических клеток в культуре, Звенигород, 1989:75-76.

40. Тугизов Ш.М., Савченкова И.П., Грабовская И.Л., Кущ А.А., Изменение экспрессии генов вируса гепатита В в клетках гепатокарциномы человека PLC/PRF/5 в процессе приобретения ими лекарственной устойчивости. Вопросы вирусологии, 1992, 5/6: 238-241.

41. Туманова С.Ю. Роль гликопротеинов и гликолипидов в межклеточных взаимодействиях. Биохимия,1978, 43, 387-398

42. Шапиро Н.И. Генетические механизмы канцерогенеза. Вестн. АН СССР, 1981, 12, 69-73

43. Фридлянскаа И.И., Постоянные клеточные линии, дифференцирующиеся in vitro. В кн.: Биология клетки в культуре. Л, 1984, с. 50-100

44. Эренпрейс Я.Г. Современные концепции опухолевого роста. Рига, "Зинатне, 1987, с. 72-77

45. Alberts В., Bray D., Levis J. et al., Molecular biology of the cell. 1994, New York-London, 1154 p.

46. Aden D.P., Fogel S., Plotkin I., et al., Controlled synthesis of HBsAg in a differentiated human liver carcinoma-derived cell line. Nature (London), 1979, 282:615-617

47. Alford C.A., and Britt W.J., Cytomegalovirus. In "Virology"., (B. N. Fields, Ed.) pp. 629-660. Raven Press, New York, 1988

48. Aden D.P., Fogel S., Plotkin S., et al., Controlled synthesis of HBsAg ina differentiated human liver carcinoma- deryved cell line. Nature, 1979, 282, 5739:615-616

49. Alsabit A.K., Tumor dormancy; a rerview. Tumor Res., 1978, 13:1-13

50. Abelev G.I., Alpha-fetaprotein in ontogenesis and its association with malignanttumors. Adv. Cancer Res., 1971, 14:295-359

51. Blumberg B.S., Alter H.R., and Visinich, S., A new antigen in leukemia sera. JAMA, 1965, 191:541-545

52. Boiler K., Vestweber D., Kemler R., Cell-adhesion molecule uvomorulin is localized in the intermediate junctions of adult intestinal epithelial cells J. Cell Biol., 1985, 100:327-332

53. Brasitus T.A., Schachter D., Lipid dinamics and lipid protein interactions in rat enterocyte basolateral and microvillus membranes. Biochemistry, 1980,19: 27632769

54. Bakay В., Crose C., Koprovski H., et al. Restoration of HPRT activity in mouse IR cells after fusion with chick embrio fibroblasts, PNAS USA, 1973, 70:19982002

55. Bosze Zc., Venetianer A., Tumorogenecity in nude mice of dexamethazone-sensitive and resistant differentiated and dedifferentiated hepatoma cells. Cancer res., 1985, 45:2165-2169

56. Bowcock A.M., Pinto M.R., Bey E.K. et al., The PLC/PRF/5 human hepatoma cell line . 2. Chromosomal assignment of hepatitis В virus integration sites. Cancer Genet Cytogenet, 1985, 18:19-26

57. Chasin L.A., Mutations affecting adenine phosphoribosyl transferase activity in Chinese hamster cells. Cell, 1974, 2, 37-41

58. Call K., and Thilly W., 5-azacytidine inhibits the induction of transeint TK-deficient cells by 5-bromodeoxyuridine. Mutat. Res. 1991, 248:101-114

59. Clive D., Flamm M., Mashesko M and Bernheim, a mutational assay system using the thymidine kinase locus in mouse lymphoma cells, Mutat. Res. 1972, 16:77-87

60. Cox R, P., Kraus M, R., Balis M,E., Danus J., Evidence for transfer of ensyme product as the basis of methabolic cooperation between tissue culture fibroblst of Lesch-nayan disease and normal cells. PNAS, USA,1970, 67:1573-1578

61. Chen C., and Okoyama H., Hight-efficiency transformation of mammalian cell by plasmid DNA. Mol. Ce. Biol. 1987,7:2745-2753

62. Cross George A.M., Glycolipid anchoring of plasma membrane proteins. Annu. Rev. Cell Biol. 1990, 6:1-39

63. Compans R.W., and Srinas R.V., Protein sorting in polarized epithelial cells. Current topics in microbiology and immunology. 1991, 170:142-181

64. Cohran M.A., Mackett M., Moss В., Eucariotic transient expression system dependent on transcription factors and regulatory DNA sequences of vaccinia virus. PNAS USA, 1985, 82:19-23

65. Cohran M.A., Puckett C., Moss В., In vitro mutagenesis of the promotor region for a vaccinia virus gene: Evidence for tandem early, and late regulatory signals. J. Virol, 1985, 53:30-37

66. Cassio D., Weis M.C., Ott M.O., Expression of the albumine gene in the rat hepatoma cells and their dedifferentiated variants. Cell, 1981,27:351-358

67. Caselmann W., Transactivation of cellular gene expression by hepatitis В viral proteins: a possible mechanism of hepatocarcinogenesis. J. Hepatology, 195, 22:37-37

68. Chou J.Y., Mano Т., Feldman M., Inhibition of synthesis of a-fetaprotein by glucocorticoids in cultured hepatoma cells. J. Cell Biol., 1982, 93:314-317

69. Cook J.M., Schwartz Ch.E., Fausel K.D., Chin J.F., Effect of sodium butyrate on a-fetaprotein gene expression in rat hepatoma cells in vitro. Cancer Res., 1985, 45:3215-3219

70. Chang H and Ting 1., The surface gene promoter of the human hepatitis В virus displays a preference for differentiated hepatocytes. Virol., 1989, 170:176-183

71. Chang H., Wang C., Yuh C., et al., A liver-specific nuclear factor interacts with the promoter region of the large surface gene of human hepatitis В virus. Mol. Cell. Biol., 1989, 9:5189-5197

72. Chang S., Erwin A.E., and Lee A., The glucose regulated protein genes (GRP94 and GRP78) share common regulatory domains and coordinately regulated by common trans-acting factors. Mol. Cell Biol., 1989, 9:2153-2162

73. Chelyapov N.Y., Antonova, T.P., Yanova N.N., et al., Antigenic properties of vaccinia virus and of the virus recombinant strains expressing heterologous genes., Acta virol, 1988, 32:409-415

74. Cheng К and Moss В., Selective synthesis and secretion of particles composed of the hepatitis V virus middle surface protein directid by a recombinant vaccinia virus: induction of antibodies to pre-Sl and S epitopes, J of Virol. 1987, 61:1286-1293

75. Cheng K., Smith G., Moss В., Hepatitis В virus large protein is not secreted but is immunogenic when selectively expressed by recombinant vaccinia virus. J. Virol., 1986, 60:337-344

76. Cattaneo R.H., Will N., Hernandez H and Schaller H., Signals regulating hepatitis В surface antigen transcription. Nature (London), 1983, 305:336-338

77. Chang H.K., and Ting L.P., The surface gene promoter of the human hepatitis В virus displays a preference for differenciated hepatocytes. Virology, 1989, 170:176-183

78. Chang H.K., Wang B.Y., Yuh C.H., Wei C.L., and Ting L.P., A liver-specific nuclear factor interacts with the promoter region of the large surface protein gene of human hepatitis В virus, Mol. Cell Biol. 1989, 9:5189-5197

79. Communitee on Viral Hepatitis, and National Academy of Sciences. Nomenclature of antigen associated withviral hepatites type B. Morbid. Mortal. Wkly Rep. 1974, 23 29-39

80. Carlison R.W., Wada H.G., Sussman H.H., The plasma membranes of human placenta: isolation and characterization of protein and glycoprotein subunits. J.Biol. Chem., 1976, 251:4139-4146

81. Chang C., Jeng К., Ни C., et al., Production of hepatitis virus in vitro by transient expression of cloned HBV DNA in hepatoma cell line. EMBO J., 1987, 6:675-682

82. Peterson D.L., Isolation and characterization of the major protein and glycoprotein of hepatitis В surface antigen. J Biol. Chem., 1981, 256:6975-6983

83. Drew L., Cytomegalovirus infection in patients with AIDS J. Infect, dis. 1988, 158:449-456

84. Davidson R., Broeker P., and Ashman C., DNA base sequence shanges specificity of bromodeoxyuridine induced mutations in mammalian cells. PNAS USA, 1988, 85:4406-4410

85. Davis S., Lu L., Lo S., Lin S., et al., Presence of an SH2 domain in the actin-binding protein tensin. Science, 1991, 253:712-715

86. Davidson J,S., Baumgarden J,M., Harley E,E., Methabolic cooperation berween argininosuecinate lyase deficient haman fibroblast, Exp. Cell. Res. 1984, 150:367378

87. Dane D.S., Cameron C.H., and Briggs M., Virus-like particles in serum of patients with Australia-antigen associated hepatitis. Lancet, 1970, 1:695-698

88. Davidson R.L., Adelstein S.J., Oxman M.N., Herpes simplex virus as a sourse of thymidine kinase for thymidine kinase-deficient mouse cells: Superexpression and reactivation of the viral enzymes, PNAS USA, 1973,70:1912-1916

89. Dean D.C., Knoll B.J., Rizer M.E., et al ., A 5'-flanking sequence essential for progesteron regulation of an ovalbumin fusion gene. Nature, 1983, 305:551-554

90. Dean D.C., Gope R., Knoli B.J. et al., A similar 5'-flanking region is required for estrogen and progesteron induction of ovalbumin gene expression. J. Biol. Chem, 1984, 259:9967-9970

91. Dejean A., Brechot C., Tiollais P., and Wain-Hobson S. Characterization of integrated hepatitis b viral DNA cloned from a human hepatoma and hepatoma-derived cell line PLC/PRF/5. PNAS USA, 1983,80:2505-2509

92. Duzgunes N., Bronner F., Membrane fusion in fertilization, cellulat transport and viral infection. Curr. Top. Membr Trans., 1988, 32:1-384

93. Dingwell K., Brunett G., Hendricks R., et al., herpes simplex virus glycoprotein E and I facilitate cell-to-cell spread in vivo and across junctions of cultured cells. J. Virol., 1994, 68:834-845

94. Eble B.E., Lingappa V.R., and Ganem D., The N-terminal (Pre-S) domain of hepatitis В virus surface glycoprotein is translocated across membranes by downstream signal sewuences. J. Virol., 1990, 64:1414-1425

95. Eble B.E., MacRay D.R., Lingappa V.R., and Ganem D., Multiply topogenic sequences determine the transmembrane orentation of the hepatites В surface antigen. Mol. Cell. Biol. 1987, 7:3591-3603

96. Eaton S., and Simons K., Apical, basal, and lateral cues for epithelial polarization. Cell 1995, 32:5-8

97. Ellens H., Larsen C., CD4-induced change in gpl20/41 conformation and its potential relationship to fusion. In.: Viral fusion mechanisms, 1993, by CRC Press. Inc., p. 292-307

98. Fuller S., von Bonsdorf C., Simons k., Vesicular stomatitis virus infects and matures only through the basolateral surface of the polarized epithelial cell line, MDSK. Cell, 1984, 38:65-77

99. Furuse M., Hirase Т., Itoh M., Nagafuchi A., Yonomura S., Tsukita S., Tsukita S., Occludin: a novel integral membrane protein localizing at tight junctions, J Cell Biol., 1993, 123:1777-1788

100. Furuse M., Itoh M., Hirase Т., Nagafuchi A., Yonomura S., Tsukita S., Tsukita S., Direct association of occludin with ZO-1 and its possible involvment in the localization of occludin at tight junctions. J. Cell Biol., 1994, 127: 1617-1626

101. Friedlander D.R., Mege R.M., Cunningham B.A., Edelman G.M., Cell sorting-out is modulated by both the specificity and amount of different cell adhesion molicules (CAMs) expressed on cell surfaces. PNAS, USA, 1989, 86:7043-7047

102. Farquhar M.G., Palade G.E., Junctional complexes in various epithelia. J. Cell Biol., 1963, 17:375-412

103. Feeman A.E., Engvall E„ Hivata K., Yoshida Y., Kottel R.H., Hibborn V., Ruoslahti E., Differentiation of fetal liver cells in vitro, PNAS USA, 1981,78;3659-3663

104. Fields b., Knipe d. Fundamental virology, New York, 1994, 768p.

105. Gal A., Nahon J.L., Gomez-Garcia M., Trodner I., Salva-Trepat J.M., Organization of the albumin and alfa-fetaprotein genes in fetal and adult rat tissues and rat hepatoma. Diffrerntiation, 1985, 29:238-242

106. Gust I.D., Cross G., Kaldor J., and Ferris A.A., Virus like particles in Australia-antigen associated hepatitis. Lancet, 1970, 1:953-956

107. Gerin J.L., Holland P.V., and Purcell R.H., Australian antigen:large scale purification from human serum and biochemical studies of its proteins. J. Virol., 1971,7:569-578

108. Gailbert F., Mandart E., Fitoussi F., et al., Nucleotide sequence of the hepatitis human hepatitis virusgenome (subtype ayw) cloned in E. coli. Nature (London), 1979, 281:644-646

109. Ganem D., Assemble of hepadnaviral virions and subviral particles. Current topics in Microbiology and immunology, 1991, 168:70-76

110. Guo W.K., Moffat L.F., and Howard B.H., Characterization of the hepatitis b virus Enhl enhancer and X promoter complex. J Virol. 1991, 65:6686-6692

111. Geiger В., and Ayalon O., Cadherins. Annu. Rev. Cell. Biol. 1992, 8:307-332

112. Gumbiner В., Breaking through the tight junction barrier. J. Cell Biol., 1993, 123:1631-1633

113. Gumbiner В., Lowenkopt and Apatira. Identification of 160 kDa polypeptide that binds to the tight junction protein ZO-1. PNAS. USA, 1991, 88:3460-3464

114. Gaiger В., Cytoskeleton-associated cells contacts. Curr. Opin. Cell Biol. 1989, 1:103-109

115. Geuger В., Ginsberg D., Solomon D., Volberg T., The molecular basis for the assamble and modulation of adherens-type junctions. Cell Differ. Dev. 1990, 32:343-354

116. Goodwin L., Hill J.E., Raynor K., Raszi L., Manabe M., et al., Desmoglein shows extensive homology to the cadherin family of cell adhesion molecules. Biochem. Biophis. Res. Commun. 1990, 173:1224-1230

117. Gourdeau H and Fournier R.E., Genetic analysis of mammalian cell defferentiaition. Annu. Rev. Cell Biol., 1990, 6:69-94

118. Gerlich W., Lu X., Heermann K., Studies on the attachment and penetration of hepatitis В virus. J. of Hepatology, 1993, 17, suppl. 3:S10-S14

119. Grabovskaya, I.L., Tugizov, S.M., Glukhova, L.A., Kushch, A.A. Cytogenetic analysis of human hepatocarcinoma cell line PLC-PRF-5 and its mutant clones withdifferent degrees of cell differentiation .Cancer Genetics and Cytogenetics, 1993, 65:145-151

120. Harris M., Cell culture and Somatic Variation. Holt, Rinehart and Winston, New York 1964.

121. Hartwing., Kwiatkowski., Actin-binding proteins. Current opinion in cell biology. 1991, 3:87-97

122. Hinck L., Nathke S., Papkoff J., Nelson J., (3-catenin: a common target for the regulation of cell adhesion by Wnt-1 and Src signaling pathways. TIBS, 1994, 19:537-543

123. Harris M., and Collier K., Phenotypic evolution of cells resistant to bromodeoxiuridine. PNAS, USA, 1980, 77:4206-4210

124. Hart Т., Kirsh R., Ellens H et al., Binding of soluble CD4 proteins to human immunodeficiency virus type 1 and infected cells induces release of envelop glycoprotein gp 120, PNAS USA, 1991, 88:2189-2193

125. Hozier J., Sawyer M., Moore M., et al., Cytogenetic analysis of the L5178Y/tk+/~ to TK"/" mouse lymphoma mutagenesis assay system, Mutat. Res. 1981, 84:169181

126. Heermann K.H., and Gerlich W.H., Surface proteins of hepatitis В virus. Molecular biology of hepatitis В virus. CRS Press. 1991,109-144

127. Honigwachs J.O., Factor O., Dikstein R., Shaul Y., and Laub O., Liver-specific expression of the hepatitis virus is determined by the combined action of the core gene promoter and the enhancer. J. Virol. 1989, 63:912-924

128. Howard C.R., Stirk H.J., Brown S.E., et al., Towardsthe development of synthetic hepatitis В vaccines, in Viral Hepatitis and Lver Disease, Zuckermann, A.Y., Ed. Alan R. Liss, New York, 1988, 1094-1115

129. Hirschberg C.B., Topography of glycosylation in the rough Endoplasmic reticulum and Golgi apparatus. Ann. Rev. Biochem. 1987,56:63-87

130. Hurtley S and Helenius A., Protein oligomerization in the endoplasmic reticulum. Annu. Rev. Cell Biol. 1989, 5:277-307

131. Holton J. L„ Kenny T.P., Legan P.K., Colins J.E., Keen J.N., et al., Desmosomal glycoproteins 2 and 3 (desmocolins) show n-terminal similarity to calcium dependent cell-cell adhesion molecules. J. Cell Sci. 1990, 97:239-246

132. Heermann K.H., Goldmann U., Schwartz W., et al., Large surface proteins of hepatitis В virus containing the Pre-s sequence. J. Virol., 1984, 52:396-409

133. Hsiung N., Roginski R., Henthorn P., et al., Introduction and expression of a fetal human globin gene in mouse fibroblast. Mol. Cell. Biol. 1982, 2:401-411

134. Hsiung N., Warrick H., deRiel J., et al., Cotransfer of circular and linear procariotic and eukariotic DNA sequences into mouse cells. PNAS USA, 77:48524856

135. Huttner K., Scangos G., Ruddle F., DNA- mediated gene transfer of a circular plasmid into murine cells, PNAS USA, 1979, 76:5820-5824

136. Hasnain S.E., Ganesan K„ Upadhaya K.C., Indian J. Exp. Biol. 1980, 18:12301232

137. Huan В and Siddique A., regulation of hepatitis В virus gene expression. J. of Hepatology, 1993, 17, Suppl. 3:S20-S23

138. Hunter E., Hill E.,Hardwick M., et al., Complete sequence of the Rous sarcoma virus env gene;: identification of structural and functional regions of its product. J Virol. 1983, 46:920-936

139. Hoekstra D and Kok W., Entry mechanisms of enveloped viruses. Implications for fusion of intracellular membranes. Bioscince Reports, 1989, 9:273-305

140. Holland G.N., AIDS: retinal and choroidal infections. In.: Medical and Surgical Retina: Advances, Controversies and Managment, pp 415-443, Ed: Lewis H.„ and Ryan, St Louis: Mosby

141. Jokelainen P.Т., Krohn К., Prince A.M., and Finlayson N.D.C., Electron microscopic observation on virus like particles associated with SH antigen. J. Virol., 1970, 6:685-692

142. Jakoby W.B., and Pastan I.H., eds. Cell culture. Metods in enzymology, vol. 58 1979, Academic Press, New York.

143. Jabs D., Green W., Fox R., et al., Ocular manifestations of acquired immune deficiency syndrome. Ophthalmology, 1989, 96:1092-1009

144. Johnson R., Spear P., herpes simplex virus glycoprotein D mediated interference with herpes simplex virus infection. J. Virology, 1989, 63:819-827

145. Keohavong P., Liu V., Thilly W., Analysis of point mutations induced by ultraviolit light in human cells. Mutat. Res. 1991, 249:147-159

146. Kit S., Dubbs D.R., Piekarski L., Hsu T.C., Deletion of timidine kinase activity from L cells resistant to bromodeoxyuridine, Exp. Cell. Res. 1973, 31, 297-312

147. Koberle В., Rosheisen C., Helbig R et al. Molecular characterization of methyl methanesulphonate (MMS)- induced HPRT mutations in V79 cells. Mutat. Res. 1993, 301:65-71

148. Kaplan P.M., Greenman R.L.,Gerin J.L., Purcell R.H., and Robinson W.S., DNA polymerase associated with human hepatitis В antigen. J. Viro., 1973, 12:995-1006

149. Kann M., Lu X., Gerlich W., recent studies on replication of hepataitis В virus. J. Hepatology, 1995, 22:9-13

150. Kane S., Pastan I., Gottesman M., Genetic basis of multidrug resistance of tumor cells. J. of Bioenergetics and Biomembranes., 1990, 22:593-618

151. Kachar В., Reese T.S., Evidence for the lipidic nature of tight junctions strands. Nature (London) 1982, 227:680-685

152. Kaufman E., Reversion analysis of mutation indused by 5-bromodeoxyuridine mutagenesis in mammalian cells. Molecul. and Cell Biol. 1985, 11:3092-3096

153. N-nitro-N-nitrozoguanidine in the HPRT gene of diploid human fibroblast. Mutat. Res. 1991, 250: 397-409

154. Lin P., Liberman D., Yeh Т., et al, Molecular cloning and structural analysis of murine thimidine kinase genomic and DNA sequences, Mol. Cell. Biol., 1985, 5:3149-3156

155. Loyter A., Acandos G.A., Juricek D et al., Mechnism of DNA entry into mammalian cells. Exp. Cell Res. 1982, 139:223-234

156. Loyter A., Scandos G.A., Ruddle F., Mechanism of DNA uptake by mammalian cells: Fate of exogenously added DNA monitored by the use of fluorescent dyes. PNAS USA, 1982, 79:422-426

157. Lo S., Weisberg E., Chen L., Tensin: a potential link between the cytoskeleton and signal transduction. Bio Essays, 1994, 16, 11:817-823

158. Laat S.W., Saag P.T. van der., The plasma membrane as a regulatory site in growth and differentiaition of neurablastoma cells. Inter Rev. Cyt., 1982, ,74:1-54

159. Litwin V., Jackson w., and Grose C., Receptor properties of two varicella-zoster virus glycoproteins, gpl and gp4, homologous to herpes simplex virus gE and gl. J. Virol., 1992, 66:3643-3651

160. Mulligan R.C., Berg P., Selection for animal cells that express the Escherichia Coli gene coding for xanthine-guanine phosphoribosyltransferase. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1981, 78, 2072-2076.

161. Morrow J., Genetic analysis of azaguanine resistance in an established mouse cell line, Genetics, 1970, 65, 279-287

162. Martin L., Montgomery P., Holland Т., soluble glicoprotein D blocks herpes simplex virus type 1 infection of rat eyes. J. Virology, 1992, 66:5183-5183

163. Martin M., Tsung t., Johnson D., et al., Antigenic and functional analysis of a neutralization site of HSV-1 glycoprotei D. Virology, 1990,174:375-387

164. Moore M., Clive J., Hozier В., et al, Analysis of trifluorthymidine-resistant (TFTr ) mutatnts or L5178Y/tk+/" mouse lymphoma cells. Mutat. Res. 1985, 151:161174

165. Mays R.W., Beck K.A., Nelson.W.J., Organization and function of the cytoskeleton in polarized epithelial cells: a component of the protein sorting mashinary. Curr. Opin. Cell Biol. 1994, 6:16-24

166. Marks P.A., Rifkind R.A., Erythroleukemic differentiaition. Annu. Rev.Biochem., 1978, 47:419-448

167. Moss В., Fuerst Т., Flexner C. et al., Roles of vaccina virus in the development of new vaccines, Vaccine, 1988, 6:161-168

168. Mayo K., Warren R., Palmiter D., The mouse metallothionine gene is transcriptionally regulated by a cadmium following transfection into human or mouse cells. Cell, 1982, 29:99-108

169. Mulligan R.C., Eukariotic viral vectors. Cold spring Harbor (New York), 1982, 133-137

170. Mayer R., Kartenbeck J., Buchler M., Jedlischky G et al., Expression of MRP gene-encoded conjugate export pump in liver and its selective absence from the canacular membrane in transport-deficient mutant hepatocytes. J. of Cell Biol., 1995,131:137-150

171. Matsubara K., Chromosomal changes associated with hepatitis b virus DNA integration and hepatocarcinogenesis. In.: Molecular biology of the hepatitis В virus. Ed. A. McLachlan., 1991, CRS Press, p. 246-257

172. Moore J., McKeating J., Weiss R., and Sattentau Q., Dissotiation of gp 120 from HIV-1 virions induced by soluble CD4, Science, 1990, 250:1139-1142

173. Miller R., Robinson W., Integrated hepatitis В virus DNA sequences speciffying the major viral core polypeptide are methylated in PLC/PRF/5. PNAS USA, 1983, 80:2534-2538

174. Marion P.L., Salazar F.H., Alexsander J.J., Robinson W,S., Polypeptides of hepatitis В surface antigene produced by hepatoma cell line. J. Virol, 1979, 32:796-802

175. Macnab G.M., Alexsander J.J., Lecatsas G., et al., Hepatitis В surface antigen produced by a human hepatoma cell line. British Journal of Cancer, 1976, 34:509515

176. Marsh M. Helenus A, Virus entry into animal cells. Adv. Vir. Res., 1989, 36:107151

177. Marsh.M., The entry of enveloped viruses into cells by endocytosis. Biochem. J. 1984, 218:1-10

178. McClure M.O., Marsh M., Weiss R., Human immunodeficiency virus infection of CD-4 bearing cells occurs by a pH-independent mechanism. EMBO J., 1988, 7:713-718

179. McCune J.M., Rabin L.B., Feinberg M.B., et al., Endoproteolytic clevage og gp 160 is required for the activation of human immunodeficience virus. Cell, 1988, 53:55-67

180. Natoli G., Avantaggiati M., Chirillo P., et al., Modulation of intracellular signal transduction pathways by the hepatitis b virus transactivator pX. J. Hepatology, 1995, 22:14-20

181. Morrison Т., Strusture, function and intracellular processing of paramyxovirus membrane proteins. Vir. Res. 1988, 10:113-136

182. Nuesch J., Schumperli D., Structural and functional organization of the gpt gene region of Escheichia coli. Gene, 1984, 32:243-249

183. Neumann E.M., Schaefer-Ridder., Wang Y., and Hofschneider P. Gene transfer into mouse limphoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO, 1982, 1:841-848

184. Nakabayashi H., Taketa К., Miyano M., Yamane Т., and Sato J., Growth of human hepatoma cell lines with differentiated functions in chemically defined medium. Cancer Res. 1982, 42:3858-3863

185. Neumann J.R., Morency C.A., and Russian K.O. A novel rapid assay for chloramphenicol acityltransferase gene expression. BioTechniques, 1987, 5:444451

186. Nicklas J., Neill P., Hunter Т., et al. In vivo ionizing irradiations produce deletions in the hprt gene of human T-limphocytes. muttat. res. 1991,250:383-396

187. Nakagawa t., nakar Y., Matsui Т., Koizumi Т., Matsuda s., Meada s., Fujita Т., Effect of sodium n-butirate on alfa-fetaprotein and albumine secretion in the human hepatoma cell line PLC/PRF/5. Brit J.Cancer, 1985, 51:357-363

188. Neurath A.r., Kent S.B., Strick N., et al., Identification and chemical synthesis of a host cell receptor binding site on hepatitis В virus. Cell, 1986, 46:429-437

189. Ogston W., Jonak G., Rogler C., et al., Cloninig and structural analysis of integrated woodchuck hepatitis virus sequences from hepatocellular carcinomas of woodchucks. Cell, 1982, 29:385-397

190. Pellicer A., Wigler M., Axel R., Silverstein S. The transfer and stable integration of the HSV thymidine kinase gene into mouse cells. Cell, 1978, 14,133-141.

191. Pereira L., Hoffman M., Cremer N., Electrophoretic analysis of polypeptides immune precipitated from extracts of cytomegalovirus infected cells by human sera, infect. Immun. 1982, 36:933-942

192. Pinto da Silva P., Kachar В., On tight junction structure. Cell, 1982, 28:441-450

193. Pelham H., Bienz M., A synthetic heat-shock promoter element confers heat-inducibility on the herpes simplex virus thimidine kinase gene. EMBO J, 1982, 1:1472-1477

194. Perucho M., Hanahan D., Wigler M., Genetic and physical linkage of exogenous sequences in transformed cells, cell, 1980, 22:309-317

195. Rasmusson В., Montell J., Rasmusson A., et al., Genetic instability in Drosophila melanogaster. Evidence for regulation, excision and transportation at the white locus, Mol. Gen. 1980, 177:567-570

196. Rossinck M.J., Jamel S., Loukin S.H., and Siddiqui A., Expression of hepatitis В virus core region in mammalian cells . Mol. Cell Biol., 1986, 6:1393-1400

197. Robinson W.S., Greenman R.L., DNA polymerase in the core of human hepatitis В candidate. J. Virol., 1974, 13:1231-1242

198. Recombinant DNA technology. Ed; Ales Procop and Rakesh Bajpai. Annals of the New York Academy of Sciences, Volume 646, New York ,1991

199. Rossen J., Bekker C., Voorhout W., et al., Entry and release of transmissible gastroenterites coronavirus are restricted to apical surfaces of polarized epithelial cells. J Virol., 1994, 68:7966-7973

200. Rodriguez-Boulan, E., Paskiet K., Sabatini D., Assembly of enveloped viruses in Madin-Darby kidney cells; polarized budding from single attached cells and from clasters of the cells in suspension. J. Cell Biol., 1983, 96:866-874

201. Rodriguez-Boulan, E., Sabatini D., Assymetric budding of viruses in epithelial monolayers: a model system for study of epithelial polarity. PNAS USA, 1978, 75:5071-5075

202. Rose K.J and Doms R.W., Regulation of protein export from the endoplazmic reticulum. Annu. rev. Cell Biol. 1988,4:257-288

203. Rodriguez-Boulan E., and Nelson J., Morphogenesis of the polarized epithelial cell phenotype. Nature, 1989, 245:718-724

204. Rodriguiz-Boulan E., and Powell S.,. Polarity of epithelial and neuronal cells. Annu. Rev. Cell. Biol., 1992, 8:395-427

205. Rail L.B., Standring D.N., Laub O., and Rutter W.J., Trnscription of hepatitis В virus by RNA polymerase II. Mol. Cell Biol. 1983, 3:1766-1773

206. Revel J.P., Karnovsky M.J., Hexagonal array of subunits in intracellular junctions of the mouse heart and liver. J. Cell Biol., 1967, 33:C7-C12

207. Raney A., Zhang P., Mclachlan A., Regulation of transcription from the hepatitis В virus large surface antigen promoter by hepatocyte nuclear factor 3. J.of Virol., 1995, 69:3265-3272

208. Redmond S., Peters G., Dickson C., Mouse mammary tumor virus can mediate cell fusion at reduced pH. Virology. 1984, 133:393-402

209. Reyes G. R., Jeang K.T., Hayward G. S., Transfection with the isolated Herpes simplex virus thimidine kinase genes. Minimal size of the active fragments from HSV-1 and HSV-2. Journal of General Virology, 1982, 62, 191-206

210. Sells, M.A., Zelent, A.Z., Shvartsman, and Acs, G. Replicative intermediates of hepatitis В virus in HepG2 cells that produce infectious virions. J. of Virol., 1988,62: 2836-2844

211. Stegmann Т., Doms R., Helenius A, Protein mediated membrane fusion. Ann. Rev. Biophys. Biophys. Chem., 1989, 18;187-211

212. Stinski M., Cytomegalovirus and its replication. In.: Fundamental virology. Ed: by В Fields, Raven Press, Ldt N.Y., 1991, p. 929-945

213. Spear P., Membrane fusion induced by herpes simplex virus., In:. Viral fusion mechanisms. 1993, by CRC Press, Inc., p. 202-225

214. Szybalski W., Szybalskia E., Drug sensitivity as a genetic marcer for human cell lines, University of Michigan Medical Bulletin, 1962. 28, 277-293

215. Sharp J.D., Cabecchi N., Cabecchi M., Altered Enzymes in drug resistant variants of mammalian tissue cultured cells. PNAS, USA, 1973, 70(11), 3145-3149.

216. Skopek Т., Liber H., Penman В., and Thilly W., Isolation of a human lymphoblastoid line heterozygous at the thymidine kinase locus: possibility for a rapid human cell mutation assay. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1978, 84:411-416

217. Southern P., Berg P., Mammalian cell transformation with SV40 hybrid plasmid vectors, In: Eucariotic Viral Vectors, Ed. Gluzman Y, N.Y.: Cold Spring Harbor, 1982, p. 41-45

218. Stibbe W., and Gerlich W.H., Structural releationship berween minor and major proteins of hepatitis В surface antigen. J Virol., 1983,46:626-637

219. Siddiqui A., Transcription of Hepadnaviruses. Molecular biology of hepatitis В virus. CRS Press. 1991, 95-108

220. Shaul Y., Rutter W.J., Laub O., A human hepatitis В viral enhancer elemenr. EMBO J., 1985, 4:427-430

221. Standring D.N., Rutter W.J., Varmus H.E., and Ganem D., Transcription of the hepatitis В surface antigen gene in cultured murine cells initiates within the prresurface region. J.Virol. 1984, 50:564-573

222. Siddiqui A., Jamel S., and Mapoles J.E., Transcriptional control elements of hepatitis В surface antigen gene. PNAS, USA, 1986, 83:566-570 Singer S.J., The structure and insertion of integral proteins in membranes. Annu. Rev. Cell Biol. 1990, 6:247-296

223. Schlesinger M.J., and Schlesinger S., Domains of virus glycoproteins. Adv. in Virus Research., 1987, 33:1-44

224. Sureau C., Romet-Lemonne J.L., mullins J.I., and Essex M., Production of hepatitis virus by a differentiated human hepatoma cell line after transfection with sloned circular HBV DNA. Cell. 1986, 47:37-47

225. Spaete R.R., Saxema A., Scott P.I., Song G.J, Probert W.S., Britt W.J, Gibson W., Rasmussen I and Pachl C., Sequence requirments for proteolytic processing of glycoprotein b of human cytomegalovirus strain towne. J.Virol. 1990, 64;2922-2931

226. Spaete R.R., Thayer R.M., Probert W.S., Masiarz F.R., Chamberlain S.H., Rasmussen L., Merigan T.C., and Pachl C., Human cytomegalovirus strain Towne glycoprotein В processed by proteolitic cleavege. Virology 1988, 167:207-225

227. Sturman L., Ricard C., Holmes K., Proteolitic clevage of the E2 glycoprotein of murine of murine coronavirus: Activation of cell-fusing activity of virions by tripsin and separation of two different 90K clevage fragments. J. Virol., 1985, 56:904911

228. Tsurimoto Т., Fujiyama A., and Matsubara K., Stable expression and replication ofhepatitis В genome in an integrated state ina human hepatoma cell line transfectedwith the cloned viral DNA. PNAS, USA, 1987, 84:444-448

229. Takahishi K., Machida A., Funatsu G., et al., Immunochemical structure ofhepatitis В e antigen in the serum. J. Immunol., 1983, 130:2903-2910

230. Twu J., Schloemer R., Transcriptional transactivating function of hepatitis В virus.

231. J. Virol., 1987, 62:3448-3453

232. Toh H., Hayashida H., and Miyata Т., Sequence homology between retroviral reverce transcriptase and putative polymerase of hepatitis В virus and caulifower mosaic virus. Nature (London), 1983, 305:-307

233. Tachi-Shinkawa К., Morimoto К., Koizimi A., Enhancing effects of cytosine arabinoside on ethyl methansulphonate induced 6-tioguanine resistance mutation in Chinese hamster V79 cells, Mutat. Res. 1987, 191:37-40

234. Tucker S., Compans W., Virus infection of polarized epithelial cells, adv. Virus Res., 1993, 42:187-247

235. Tugizov Sh.M., Selection of human hepatocarcinoma cell lines for expression of transfected genes in vitro. In Ibero-American Congress on Biotechnologu. Havana, Cuba, 1989: 06-014

236. Tugizov,S., Maidji, E .,Pereira,L.,Role of apical and basolateral membranes in replication of human cytomegalovirus in polarized pigment epithelial cells.Journal of General Virology, 1996,77: 3421-3432.

237. Vesely J., Cihak A., Resistance of mammalian tumor cells toward pyrimidine analogues, a rewiew, Oncology, 1973, 28, 204-226

238. Venetianer A., Bosze Z., Expression on differentiated functions in dexametazone-resistant hepatoma cells . Differentiation, 1983, 25:70-78

239. Wolpert M., Dample S., Browne J., Sznycer E., Agrawal K., Sartorelli A., The role of phosphohydrolases in the mechnism of resistance of neoplastic cells to 6-thiopurines, cancer Res. 1971, 31 1620-1626

240. Wise Т., and Harris M., deletion of hypermethylation of thymidine kinase gene in V79 Chinese hamster cells resistant to bromodeoxyuridine, Somat, Cell Mol. Genet. 1988, 14:567-581

241. Wigler M., Perucho M., Kurtz D et al., Transformation of mammalian cells with an amplifiable dominant-acting gene, PNAS, USA, 1980, 77:3567-3570

242. Wigler M., Sweet R., Sim G., et al., Transformation of mammalian cells with genes from procariotes and eucariotes. Cell, 1979, 16:777-785

243. Wong Т.К., and Neumann E., Electric field mediated gene transfer. Biochem. Biophys. res. Commun. 1982, 107:584-591

244. Weller Т.Н., The cytomegalovirus: Ubiquitous agents with protean clinical manifestations (first of two parts) N. Engl. J Med. 1971, 285;203-214

245. Weller Т.Н., The cytomegalovirus: Ubiquitous agents with protean clinical manifestations (second of two parts) N. Engl. J Med. 1971, 285;267-274

246. Wright J.A., Lewis W.H., Purfett L.J., Somatic cell genetics: A rewiw of drug resistance, lectine resistanse and gene transfer in mammalian cells in culture. Canad. J. Genet. Cytol. 1980, 22:443-496

247. Watson В., Cromley I.P., Gardiener S.E., et al., Reappearence of murine HPRT activity in mouse A9 cells after attempted hybridization with human cell lines. Exp. Cell Res., 1972, 75:401-409

248. White J., Kielian M., Helenius A., Membrane fusion proteins of enveloped animal viruses. Q. Rev. Biophys. , 1983, 16:151-195

249. White J., Membrane fusion. Scence, 1992, 258:917-924

250. White J., Viral and cellular membrane fusion proteins. Annu. Rev. Physiol., 1990, 52:675-697

251. Wigler R.C., Silverstain S., Lee L., et al., Transfer of purified herpes virus thymidine kinase gene to cultured mouse cells. J ., Cell, 1977, 11:233-241

252. Wheelock E.F., Weinhold K.J., Levich Yu. The tumor dormant state. Ad. Can. Res. 1981, 34:107-140

253. Weigt c., Gaertner A., Wegner A et al., Occurance of an actin-inserting domain in tensin. J. Mol. Biol. 1992, 227:593-595

254. Yuh С and Ting L., C/EBP-Like proteins binding to the functional box-a and box-P of the second enhancer of hepatitis В virus. Molecul. and Cell. Biol, 1991, 10:5044-5052

255. Yaginuma D., Shiracata, Kobayaashi M., and Koike., Hepatitis В virus (HBV) particles are produced in a cell culture system by transient expression of transfected HBV DNA. PNAS, USA, 1987, 84:2678-2682

256. Yee J.K., A liver specific enhancer in the core promoter region of human hepatitis В virus. Science, 1989, 246:658-661

257. Yuh C., and Ting L.P., The genome of the hepatitis В virus contains a second enhancer: cooperation of two elements within this enhancer is required for its function. J.Virol. 1990, 64:4281-4287

258. Yuh C., and Ting L.P., C/EBP-like proteins binding to the functional box-a and box-|3 of the second enhancer of hepatitis b virus. Mol. Cell. Biol., 1991, 11:50445052

259. Ziemer, M., Garsia P., Shaul et al., Sequence of hepatitis В virus DNA incorporated into the genome of human hepatoma cell line. J. Virol. 1985, 53:885893

260. Zhang P and Mclachlan A., Differentiation-specific transcriptional regulation of the hepatitis В virus nucleocapsid gene in human hepatoma cell line. Virology, 1994, 202:430-440

261. Zakai N., Kulka R.G., Loyter A., Membrane ultrastructural changes during calcium phosphate induced fusion of human erithrocyte ghosts. PNAS USA, 1977, 74:2317-2421

262. Zahm P., Hofschneider p., Koshy R., The HBV X ORF encodes a transactivator:a potential factor in viral hepatocarcinogenesis. Oncogene, 1988, 3:169-177