Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности структуры, экспрессии и взаимодействия с патогенами белка табака Nt-4/1

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Особенности структуры, экспрессии и взаимодействия с патогенами белка табака Nt-4/1"

На правах рукописи

МАКАРОВА Светлана Сергеевна

ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ, ЭКСПРЕССИИ И ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С ПАТОГЕНАМИ БЕЛКА ТАБАКА N1-4/1

03.01.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 Я АПР

Москва 2013

005057462

005057462

Работа выполнена на кафедре вирусологии биологического факультета и в отделе биохимии вирусов растений НИИ Физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова».

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Морозов Сергей Юрьевич

Официальные оппоненты:

Левицкий Дмитрий Иванович, доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии имени А.Н.Баха РАН, лаборатория молекулярной организации биологических структур, руководитель.

Кантидзе Омар Леванович, кандидат биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена РАН, лаборатория структурно-функциональной организации хромосом, старший научный сотрудник.

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии имени В.А.Энгельгардта Российской академии наук.

/-}СО

Защита состоится «26» апреля 2013 г. в часов на заседании Совета Д 501.001.76 по

защите докторских и кандидатских диссертаций при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова» по адресу: 119234, Москва, Ленинские Горы, д.1, стр. 12, МГУ, Биологический факультет, ауд. 389.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке МГУ имени М.В.Ломоносова (Фундаментальная библиотека, Ломоносовский проспект, 27, отдел диссертаций).

Автореферат разослан уиЛ» марта 2013 года.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

Крашенинников И.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Помимо широко известных взаимодействий компонентов вирусов и вироидов с белками аппарата транскрипции и трансляции клетки, а также транспортных комплексов вирусов с элементами цитоскелета, появляются данные о вовлеченности новых, неизученных белков растения-хозяина в жизненный цикл патогенов. Роль таких взаимодействий на сегодняшний день не всегда понятна. Так, обнаружено, что подавление экспрессии гена VirPl в протопластах N.tabacum приводило к нарушению репликации вироида веретеновидности клубней картофеля (ВВКК) (Kalantidis et al., 2007). Кроме того, получены данные, свидетельствующие в пользу того, что белок VirPl необходим для системного распространения ВВКК и вироида экзокортиса цитрусовых (Kalantidis et al., 2007), тогда как функция этого белка в жизненном цикле растения по-прежнему неизвестна. Показано, что ключевую роль в дальнем транспорте умбравирусов и потивирусов играет взаимодействие белков ORF3 и VPg с фибрилларином. Снижение уровня экспрессии фибрилларина являлось причиной подавления накопления А вируса картофеля в системных листьях и невозможности дальнего транспорта вируса розеточности арахиса (Kim et al., 2007; Rajamaki and Valkonen, 2009). Несмотря на то, что многие функции фибрилларина в клетке изучены, роль его взаимодействия с компонентами вирусов является недостаточно понятной.

Таким образом, более детальное исследование факторов растения-хозяина, вовлеченных в осуществление отдельных стадий жизненного цикла патогенов, позволит приблизиться к пониманию устойчивости некоторых видов сельскохозяйственных культур к патогенам и в перспективе поможет в создании новых сортов растений резистентных к инфекционным агентам.

В двугибридной дрожжевой системе при скрининге кДНК библиотеки Arabidopsis thaliana против транспортного белка (NSm) вируса пятнистой гнилостности томатов был обнаружен белок с неизвестной функцией, названный At-4/1 (von Bargen et al.,2001). Ранее в нашей лаборатории в экспериментах по совместной экспрессии в клетках N. benthamiana At-4/1 слитого в одной рамке трансляции с GFP и слитого с YFP третьего транспортного белка (ТБГЗ) полулатентного вируса мятлика было показано, что оба белка локализуются в одних и тех же структурах. В нашей лаборатории была клонирована полная кодирующая последовательность белка ортолога At-4/l из растений Nicotiana tabacum (Nt-4/l). В данной работе физико-химическими методами исследуется вторичная и третичная структуры белка Nt-4/l, анализируется его РНК-связывающая активность, а также тканеспецифичность экспрессии гена Nt-4/l.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы было изучение структурных особенностей, РНК-связывающих свойств и профиля экспрессии гена Nt-4/l.

В ходе работы решались следующие основные задачи:

1. Исследование тканеспецифичности экспрессии гена Nt-4/l в трансгенных растениях.

2. Анализ вторичной и третичной структуры полноразмерного белка и его мутантов с помощью метода кругового дихроизма и дифференциальной сканирующей калориметрии.

3. Изучение олигомеризации белка дикого типа и его делеционных мутантов с помощью динамического лазерного светорассеяния.

4. Визуализация олигомерных комплексов белка Nt-4/l с помощью электронной микроскопии.

5. Изучение РНК-связывающих свойств белка Nt-4/l и картирование участка, отвечающего за образование рибонуклеопротеидных комплексов.

Научная новизна и практическая ценность работы

В ходе выполнения данной работы с помощью физико-химических методов впервые была исследована вторичная и третичная структура белка. Было продемонстрировано, что белок Nt-4/l является а-спиральным и состоит из трех доменов. Впервые было показано, что белок Nt-4/1 in vitro взаимодействует с разными РНК, предпочтительно связывая молекулы, содержащие шпилечные структуры и несовершенные дуплексы, но не образует комплексов с ДНК. Были получены делеционные и точечные мутанты белка Nt-4/l, позволившие локализовать сайт связывания с РНК, включающий область положительно заряженных аминокислот в С-терминальном домене белка. В ходе выполнения диссертационной работы были получены трансгенные растения, несущие ген Р-глюкуронидазы (gusA) под контролем промотора гена Nt-4/l. Гистохимическое окрашивание трансгенных растений позволило выяснить, в каких органах и тканях работает данный промотор.

Результаты диссертации могут быть использованы в научно-исследовательской работе, а также при чтении курсов лекций на биологических факультетах высших учебных заведений. Полученный материал может быть использован в дальнейших исследованиях распространения патогенов по растению и последующего получения растений, устойчивых к вирусной инфекции. Апробация работы

Диссертация была апробирована на совместном заседании кафедры вирусологии Биологического факультета и отдела биохимии вирусов растений НИИ физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского МГУ имени М.В.Ломоносова. Результаты работы

докладывались на семинарах кафедры вирусологии Биологического факультета и на международных конференциях: «Новые информационные технологии в медицине, фармакологии, биологии и экологии» 2011, 2012 (г. Ялта, Украина); 36th FEBS Congress «Biochemistry for Tomorrow's Medicine» (Torino, Italy) 2011; FEMS, 4th Congress of European Microbiologists (Geneva, Switzerland), 2011. Публикации

По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, из которых 2 статьи в международном реферируемом журнале и 4 тезиса международных конференций. Структура работы

Диссертация состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы». Работа изложена на страницах, содержит рисунков и ~~> таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1.0 ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА Nt-4/l

Для исследования уровня экспрессии гена и его регуляции широко используется система, содержащая репортерный ген из E.coli - uidA (gusA), кодирующий фермент р-глюкуронидазу (GUS) (Jefferson et al., 1987).

Р-глюкуронидаза представляет собой фермент, катализирующий гидролиз широкого спектра p-глюкоуронидов. При использовании в качестве субстрата 5-бромо^4-хлоро-3-индолил P-D-глюкуронида (x-gluc) в ходе ферментативной реакции образуется устойчивый нерастворимый голубой осадок, позволяющий делать срезы и проводить гистохимический анализ уровня экспрессии данного гена (Hull and Devic, 1993; Ishida et al., 2007).

Для исследования тканеспецифичной и временной экспрессии гена Nt-4/l нами была получена конструкция, содержащая ген Р-глюкуронидазы (gusA) под контролем промотора гена Nt-4/1 (pLH7000prNt-4/lGUS). С использованием этой конструкции нами были получены трансгенные растения N.tabacum и N.benthamiana. Отбор положительных трансформантов, осуществлялся по устойчивости проростков к гербициду — фосфинотрицину, обусловленной наличием в векторе гена pat (Yun et al., 2009).

Всего было получено несколько десятков трансгенных линий. Для работы были отобраны три лучшие, с наибольшей экспрессией. Эти три линии между собой отличались только степенью окраски, но не ее локализацией. Поэтому в данной работе в качестве примера приводятся только фотографии линий №30 N.benthamiana и №35 N.tabacum.

Для подтверждения отсутствия эндогенной глюкуронидазной активности в растениях КЬемИатгапа и ЫЛаЪасит проводилось окрашивание нетрансгенных растений. Голубое окрашивание не было обнаружено ни на одной стадии развития (данные не приводятся).

Первоначально окраску проводили на 11-ти дневных проростках с хорошо развитыми семядолями. В растениях ЫЛаЪасит наблюдалась окраска в жилках семядолей (Рис.1,А; Рис.2). В проростках КЬеп1Ьат1апа помимо жилок прокрашивались также области между ними. Ни корень, ни стебель, ни развивающийся настоящий лист не давали голубого окрашивания (Рис.1,А).

В 16-ти дневных проростках на стадии двух семядолей и двух хорошо развитых настоящих листьев сохранялось окрашивание в жилках семядолей и не появлялось в каких-либо других тканях (в единичных растениях наблюдалось окрашивание на небольших участках молодых листьев) (Рис. 1,Б).

На более поздних стадиях при развитии следующих настоящих листьев окраска появлялась в гипокотиле и в листьях, но исчезала в семядолях. Причем наиболее сильное окрашивание наблюдалось в черешках листьев, в основании главной жилки листа и в латеральных маленьких жилках. В некоторых растениях наблюдалась окраска гипокотиля, которая переходила в окрашивание верхней части главного корня. Однако основная часть главного корня и боковые корни не окрашивались (Рис. 1,В).

По мере дальнейшего развития растений голубое окрашивание сохранялось в гипокотиле, черешках, главных и боковых жилках листьев. В молодых листьях наблюдалась более яркая голубая окраска, чем в зрелых (особенно в растениях ТЯЛаЪасит). Появлялось окрашивание участков стебля.

На более поздних стадиях развития, когда растения уже выращивали в открытом грунте в теплице, появилось окрашивание единичных корней опытных растений (данные не приводятся).

ргЫМЛСиБ М.ґаЬасит М.ЬепґІїсітісіпа

1,5 см

6 мм

Рисунок 1. Тканеспецифичность экспрессии гена р-глюкуронидазы под контролем промотора N1-4/1. Гистохимическое окрашивание проростков трансгенных растений разного возраста: А - 11-ти дневные проростки, Б -16-ти дневные проростки, стадия 2-х семядолей и 2-х настоящих листьев. В - стадия 4-6-ти настоящих листьев.

Рисунок 2. Увеличенный участок семядоли 11-ти дневного проростка ИЛаЪасит.

Для детального исследования экспрессии гена А под контролем промотора N1-4/1 были получены ультратонкие срезы тотально окрашенных проростков трансгенных растений ЫЛаЬасит на стадии 4 настоящих листьев.

Микроскопическое исследование срезов выявило локализацию голубого окрашивания в первичной флоэме молодых жилок листа и в паренхимных клетках, окружающих развивающийся проводящий пучок (Рис.ЗА). Анализ экспрессии гена в зрелых жилках листьев показал, что окрашивание сохраняется в клетках флоэмы (Рис.ЗБ). Наибольшая активность промотора N1-4/1 наблюдалась в клетках ксилемной паренхимы. Как и ожидалось, в мертвых клетках вторичной ксилемы не было обнаружено экспрессии гена gusA, однако голубая окраска появляется в молодых клетках ксилемы и в ксилемной паренхиме.

Рис.3. А. Поперечный срез развивающейся жилки листа проростка трансгенного растения ИЛаЬасит. Б. Поперечный срез зрелой жилки листа проростка трансгенного растения ЫлаЬасит.

Таким образом, в трансгенных растениях наблюдается тканеспецифичность экспрессии гена gusA под контролем промотора гена №-4/1. Первоначально окрашивание появляется в жилках семядолей. С развитием четырех настоящих листьев в семядолях экспрессия пропадает и появляется в нижних листьях, черешках, в гипокотиле. Высокий уровень активности промотора N1-4/1 наблюдается в первичной флоэме развивающейся жилки листа. По мере развития проводящего пучка активность промотора сохраняется в клетках флоэмы, появляется в молодых ксилемных клетках и особенно в ксилемной паренхиме. С последующим развитием проростка экспрессия включается в жилках верхних листьев и стебле.

2.0 СТРУКТУРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ БЕЛКА №-4/1

2.1 Исследование вторичной структуры белка N1-4/1

Согласно компьютерным предсказаниям вторичная структура белка N1-4/1 представлена преимущественно а-спиральными элементами (Рис.4). С помощью программы

Таблица 1. Значения коэффициента молярной эллиптичности и содержание а-спиралей, рассчитанное двумя способами, с помощью формулы Гринфилда-Фасмана и веб-сервиса К2П2.

Коэффициент молярной эллиптичности, град*см2*дмоль"' а (%) по формуле Гринфилда-Фасм ана K2D2

0208 0222 0191 а (%) ß (%) другое (%)

Nt-4/l -16500 -15500 30400 43 37 11 52

AN90 -18200 -17000 30400 49 39 И 50

ACCV -20600 -19000 35500 57 44 13 43

ДИ90ДССУ -27000 -25000 48600 79 57 6 37

Данные, рассчитанные с помощью формулы Гринфилда-Фасмана, немного отличаются от значений, полученных с помощью веб-сервиса K2D2, позволяющего по спектру оценить содержание вторичных элементов в белке. Однако разница в значениях не существенна: наибольшее содержание a-спиральных элементов сохраняется у мутанта AN90ACCV, а наименьшее - у белка дикого типа.

Таким образом, видно, что удаление N-концевого и С-концевого участков белковой молекулы приводит к возрастанию процента a-спиралей в центральном регионе белка, и, как следствие, уменьшению структурной неупорядоченности белковой цепи.

2.2 Ограниченный протеолиз белка Nt-4/l в клетках Е.соИ

В процессе работы было замечено, что при экспрессии полноразмерного белка Nt-4/l (Mr 29,6 кДа) в клетках Е.соИ, на акриламидном геле детектируется вторая полоса с молекулярной массой приблизительно 26 кДа (Рис.6, А, отмечена стрелкой).

Вполне вероятно, что фрагментация белка связана с действием клеточных протеаз, которые, как известно, атакуют экспонированные на поверхность междоменные участки (Schlotmann and Beyreuther, 1979; Corchero et al., 1996). Поскольку фрагмент выделяется совместно с полноразмерным белком на Ni-NTA агарозе, мы предположили, что он содержит шесть гистидиновых остатков, расположенных в N-концевой части белка.

Для проверки этого предположения нами был сделан иммуноблот с ранее полученными моноклональными антителами, специфичными к разным участкам белка 4/1 Arabidopsis thaliana (Минина и др., 2006). Моноклональные антитела, специфичные к центральной части белка At-4/1 (4D4), детектировали белки дикого типа, низкомолекулярные фрагменты и оба делеционных мутанта. Однако антитела, специфичные к С-концевой части белка (1D2), взаимодействовали только с полноразмерными белками и мутантом AN90 (Рис.6 Б).

Спектр ДСК №-4/1 имеет вид, характерный для мультидоменных белков (Рис.7А). Деконволюция термограммы полноразмерного белка позволяет выделить в её составе три пика: наиболее легкоплавкий компонент имеет температуру плавления равную 38сС и обладает слабокооперативным характером, свойственным белкам со значительным содержанием природно-неупорядоченных элементов, а два более тугоплавких компонента обладают температурой плавления 44°С и 53°С соответственно (Рис. 7А). Чтобы идентифицировать калориметрические домены полноразмерного белка и соотнести их со структурными, были проведены измерения кривых плавления двух делеционных мутантов №-4/1. Термограмма ДК'90 имела два четко выраженных пика избыточной теплоемкости: 44°С и 53°С, при этом пик в области 38°С отсутствовал (Рис.7Б). Помимо исчезновения одного из пиков спектр ДСК ДЫ90 также обладал большим значением избыточной теплоемкости по сравнению с исходным белком, что говорит об увеличении упорядоченности и стабилизации третичной структуры мутанта по отношению к белку дикого типа. Спектр ДСК ЛЫУОДССУ обладал только одним пиком с температурой в точке максимума равной 44°С, а максимальное значение избыточной теплоемкости значительно превышает таковое не только для полноразмерного №-4/1, но и для ДЫ90 (Рис.7В).

Исходя из вышеописанных данных, можно предположить, что наиболее легкоплавкий компонент термограммы белка №-4/1 соответствует предсказанному Ы-концевому домену и отличается значительной структурной неупорядоченностью. Пик с температурой плавления 53°С отсутствует у всех белков, имеющих делецию пятого соПес1-соП участка, и, по всей видимости, соответствует С-концевому домену исходного белка. И, наконец, пик, имеющий максимум в районе 44°С, соответствует центральному домену N1-4/1. Интересно, что удаление К- и С-концевого доменов приводит к значительной стабилизации третичной структуры (что также было получено методом КД), что может объясняться наличием взаимодействий между доменами белка, ослабляющих прочность глобулы, образуемой центральным доменом.

РНК ВВКК LH:Nt-4/l РНК ВВКК RH:Nt-4/l

1:0 1:5 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:0 1:5 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160

"".....~ • *—* » * -

LH ^ ... . RH

а;;^:

тРНК • ' ** rt 1 I тРНК

Рисунок 16. Определение участка РНК ВВКК, ответственного за связывание с белком Nt-4/l. А. РНК-связывание белка Nt-4/l с левой половиной РНК вироида веретеновидности клубней картофеля в присутствии тРНК. Б. РНК-связывание белка Nt-4/l с правой половиной РНК вироида веретеновидности клубней картофеля в присутствии тРНК

Таким образом, белок Nt-4/l обладает способностью in vitro взаимодействовать с РНК, но не с ДНК. Выяснилось, что белок предпочтительно образует комплексы с РНК, имеющей в своей структуре несовершенные дуплексы и шпильки. Способность взаимодействовать с одинаковой эффективностью с РНК вироида дикого типа и с его делеционными мутантами свидетельствует об отсутствии специфичности к определенной последовательности нуклеотидов в субстрате связывания.

4.3 Картирование РНК-связывающего сайта белка Nt-4/l

Для локализации в белке сайта связывания с молекулами РНК были проведены эксперименты по взаимодействию делеционных и точечных мутантов белка Nt-4/l (Рис.17) с РНК вироида.

Схема белка дикого типа и его мутантов РНК-связывающая

активность

Nt-4/l 41 I 1 I 1 II I! | Н++-НЦ250 ..о. +

AN90 94 П II | К++^250 а.о. +

ACCV 111 1 1 I I II II |~~1218 а.о.

AN90ACCV 911 II II И 218 а.о.

KQK 1 II I I I I II II \W 250 а.о.

CCIII

1 II II I............ а.о.

Рисунок 17. Схема делеционных и точечных мутантов белка №-4/1. а - спиральные участки выделены серыми прямоугольниками. На схеме также обозначены порядковые номера аминокислотных остатков. Знаком «+» выделены участки с концентрацией положительно-заряженных аминокислотных остатков. Р- остаток пролина. Справа отмечена РНК-связывающая активность. Знаком «+» отмечены белки, проявляющие РНК-связывающую активность, знаком «-» - не проявляющие РНК-связывающую активность.

Мутант с делецией первых двух a-спиралей с N-конца белка (AN90) взаимодействовал с РНК вироида идентично белку дикого типа (Рис.18Б). Делеция С-концевого пятого coiled-coil домена (ACCV) приводила к полной неспособности формировать комплекс (Рис. 18В). Двойной мутант AN90ACCV также был не способен образовывать комплексы с РНК (Рис. 18Г).

Таким образом, можно заключить, что за взаимодействие с РНК отвечает С-концевой домен белка.

Nt-4/l AN90

1:0 1:20 1:50 1:80 1:100 1:150 1:200 1:0 1:20 1:50 1:80 1:100 1:150 1:200

ACCV AN90ACCV

1:0 1:20 1:50 1:80 1:100 1:150 1:200 1:0 1:20 1:50 1:80 1:100 1:150 1:200

В г

Рисунок 18. РНК-связывающая активность белка Nt-4/l (А) и делеционных мутантов (Б-Г). В качестве субстрата в реакции использовали РНК ВВКК. Соотношение белка и РНК в реакционной смеси указано над лунками.

На основании распределения зарядов в белке можно предположить, что связывание обуславливает С-концевой район белка длиной 30 аминокислотных остатков, двенадцать из которых (40%) являются положительно заряженными. Для проверки этого предположения был получен точечный мутант KQK, в котором несколько положительно-заряженных аминокислот (три лизина, один аргинин) в С-концевой области белка заменены на незаряженные остатки аланина (Рис.19А). Было обнаружено, что данный мутантный белок не взаимодействовал in vitro с РНК вироида (Рис. 19Б).

Также в этой области белка были внесены другие точечные замены, не влияющие на изменение заряда, но нарушающие coiled-coil структуру. Был получен мутант CCIII, в котором консервативные лейцины, предположительно участвующие в образовании лейциновой молнии и coiled-coil структуры, были заменены на остатки пролина (Рис.19А).

Радиоактивно-меченный транскрипт РНК вироида инкубировали с ренатурированными на мембране белками. В опыте использовали белок дикого типа и два его делеционных мутанта (AN90 и ДССУ).

№4/1 ДССУ AN90 Mr, kDa

■HSñ 9П

Ш85 50

ШТ|35

Я

1Ш1*

ftffitjftft щШш 2 5

'Щ§г 20

А

Рисунок 20. Анализ РНК-связывающей активности белка Nt-4/l и его делеционных мутантов AN90 и АССV методом Норт-Вестерн гибридизации с радиоактивно-меченным транскриптом ВВКК. A. PVDF мембрана, крашенная понциановым красным. Крайняя правая дорожка - маркеры молекулярной массы белков. Б. Пленка после экспозиции с мембраной.

В итоге, как и предполагалось, только в районе белков Nt-4/l и AN90 связывается радиоактивно-меченный транскрипт вироида (Рис.20Б).

4.5 Определение размера рибоиуклеопротеидных комплексов методом динамического лазерного светорассеяния

Помимо метода задержки в геле и Норт-Вестерн гибридизации, РНК-связывающая активность белка Nt-4/l была подтверждена методом динамического лазерного светорассеяния (ДЛС), позволяющим определить размер формируемых рибоиуклеопротеидных комплексов в растворе.

Максимальный размер комплекса, формируемый белком в растворе, равен приблизительно 24 нм при 25°С и составляет 33% от всех имеющихся в растворе комплексов. После инкубации белка с РНК вироида размер комплекса возрастает до 58нм, а относительное его содержание снижается до 23% (Рис. 21).

№4/1 ДССУ AN90

2-і I.:;

fl -N1-4/1

----Nt-4/l+PHK ВВКК

(80:1)

■ 1 «"»« '« «1 ' 58 nm L_

--1 > ТГ*1-L1-- і І і і ]-=r—.......I ' ■ ' > ' > >'t

1 10 100 1000 10000

Размер комплекса (им)

Рисунок 21. Образование комплексов при добавлении РНК ВВКК к препарату белка №-4/1.

5.0 ПРЕДСКАЗАНИЕ ТРЕТИЧНОЙ СТРУКТУРЫ БЕЛКА 4/1

QUARK представляет собой программу, позволяющую моделировать третичную структуру белка по его последовательности (Xu and Zhang, 2012). Однако она позволяет работать только с белками, состоящими из менее чем 200 аминокислотных остатков. Поэтому с помощью этой программы нами были проанализированы мутант AN90 (161 аминокислотный остаток) и полноразмерный 4/1 белок маршанции (Marchantia polymorpha L., Отдел печеночные мхи), который является наименьшим из всех известных 4/1-подобных белков (196 аминокислотных остатков).

Предложенная программой модель мутантного белка AN90, с удаленными первыми двумя а-спиралями, представлена на рисунке 22А. Данная модель хорошо согласуется с предсказаниями вторичной структуры белка, сделанной программой PSSFinder (Soli et al., 2009) (Рис.4). Четвертая а-спираль, протяженностью 55 аминокислотных остатков по предсказаниям программы PSSFinder, программой QUARK предсказывается длиной в 61 остаток и является самой длинной в белке.

Единственным известным белком 4/1 с длиной менее 200 аминокислотных остатков является белок печеночного мха - маршанции. В этом белке программа QUARK предсказала наличие четырех а-спиралей, уложенных в структуру four helix bundle (пучок из четырех а-спиралей) (Рис.22Б).

Рисунок 22. Предсказание программой QUARK третичной структуры мутантного белка ДЫ90 (А) и белка 4/1 маршанции (Б).

Структура белка 4/1 маршанции, как полноразмерного белка, была также проанализирована с помощью программы COFACTOR (Roy et al., 2012). Данная программа работает со структурой белка, определенной в результате экспериментальных исследований или с помощью компьютерного моделирования. Используя доступные библиотеки известных структур белков, программа COFACTOR отбирает белки со схожими укладками и подобными функциональными доменами и сайтами.

В результате проведенного анализа данная программа отобрала РНК-связывающий белок Saccharomyces cerevisiae She2p. Также как и белок Nt-4/l, он содержит несколько а-спиралей, антипараллельно уложенных в пучок (Niessing et ai, 2004).

Белок She2p входит в состав гетеромерного комплекса, обеспечивающего направленный транспорт ASH1 мРНК в гаплоидные споры, образованные в результате мейоза. Неравномерное распределение ASH1 мРНК среди дочерних клеток является детерминантой будущего «пола» споры (mating type). Взаимодействие ASH1 мРНК с She2p происходит посредством узнавания специфических цис-элементов (zip-code) в РНК (Long et al., 2000; Niessing et al., 2004; Muller et al., 2009). Мутационным анализом было обнаружено, что ключевую роль играет не последовательность нуклеотидов в этих элементах, а пространственная структура, представляющая собой двуцепочечный участок, разделенный одноцепочечными выпетливаниями. Замены нуклеотидов, приводящие к разрушению такой структуры, приводили к невозможности взаимодействия с She2p и полной отмене ассиметричного транспорта (Chartrand et al., 1999; Gonzalez et al., 1999; Olivier et al., 2005).

Таким образом, взаимодействие белка Nt-4/l с РНК ВВКК происходит подобно белку She2p путем узнавания одноцепочечных выпетливаний и шпилек в дуплексе РНК. Однако взаимодействие белка Nt-4/l с РНК является неспецифичным, поскольку Nt-4/l также образует комплексы с РНК-субстратами, лишенными таких структур, хотя и с меньшей эффективностью.

Выводы

1. Промотор Nt-4/l активен в тканях проводящей системы, преимущественно в жилках молодых листьев.

2. Альфа-спиральный белок Nt-4/l состоит из трех структурных доменов.

3. Экспериментально доказано, что белок Nt-4/l способен олигомеризоваться in vitro, формируя протяженные фибриллярные структуры.

4. Белок Nt-4/l обладает РНК-связывающей активностью, предпочтительно связывая несовершенные дуплексы РНК.

5. РНК-связывающая активность определяется участком белка, расположенном в его С-терминальном структурном домене.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Makarova S.S., Minina Е.А., Makarov V.V., Semenyuk P.I., Kopertekh L., Schiemann J., Serebryakova M.V., Erokhina T.N., Solovyev A.G., Morozov S.Y. Orthologues of a plant-specific At-4/1 gene in the genus Nicotiana and the structural properties of bacterially expressed 4/1 protein. //Biochimie. 2011. V.93. P. 1770-1778. doi: 10.1016/j.biochi.2011.06.018.

2. Solovyev A.G., Minina E.A., Makarova S.S., Erokhina T.N., Makarov V.V., Kaplan I.B., Kopertekh L., Schiemann J., Richert-Poggeler K.R., and Morozov S.Y. Subcellular localization and self-interaction of plant-specific Nt-4/1 protein. // Biochimie. 2013. V.95.

doi: 10.1016/j.biochi.2013.02.015.

3 . Erokhina T.N., Makarova S.S., Solovyev A.G., Morozov S.Y. Plant protein Nt4/1 as a factor interacting with double-stranded RNA and participating in transport of viroid infection in plants. // New Information Technology in Medicine, Pharmacology, Biology, and Ecology. Ukraine. Yalta. 2012. P. 120-121.

4. Makarova S.S., Erokhina T.N., Solovyev A.G., Schiemann J., Owens R., Morozov S.Y. Genomic organization, subcellular localization and structural properties of a plant- specific tobacco Nt-4/1 gene and the encoded 4/1 protein. // FEMS 2011, 4th Congress of European Microbiologists. Switzerland. Geneva. 2011. P. 100.

5. Makarova S.S., Erokhina T.N., Solovyev A.G., Schiemann J., Owens R., Morozov S.Y. Subcellular localization and structural properties of tobacco 4/1 protein. // 36th FEBS Congress Biochemistry for Tomorrow's Medicine. Italy. Torino. 2011. P. 465.

6. Erokhina T.N., Makarova S.S., Solovyev A.G., Morozov S.Yu. Genomic organization, subcellular localization and structural properties of a plant-specific tobacco Nt4/1 gene and the encoded 4/1 protein. // New Information Technology in Medicine, Pharmacology, Biology, and Ecology. Ukraine. Yalta. 2011. P. 235-237.

Заказ № 103-а/03/2013 Подписано в печать 22.03.2013 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; e-maihzak@cfr.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Макарова, Светлана Сергеевна, Москва

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ М.В.ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

04201355639

МАКАРОВА Светлана Сергеевна

ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ, ЭКСПРЕССИИ И ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С ПАТОГЕНАМИ БЕЛКА ТАБАКА N1-4/1

03.01.03 - Молекулярная биология

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук профессор Морозов С.Ю.

Москва 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 4

ВВЕДЕНИЕ.................................................................................................7

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9

1 Транспорт вирусов по растению........................................................................9

1.1 Транспортные белки вирусов растений.........................................................9

1.2 Внутриклеточный транспорт....................................................................12

1.2.1 Роль микротрубочек во внутриклеточном транспорте............................12

1.2.2 Роль микрофиламентов во внутриклеточном транспорте.........................15

1.2.3 Везикулярный транспорт.................................................................19

1.3. Межклеточный транспорт......................................................................24

1.3.1 Строение ПД................................................................................24

1.3.2 Транспорт через ПД.......................................................................29

1.4 Дальний транспорт вирусов ...................................................................36

1.4.1 Строение проводящей системы растений............................................36

1.4.2 Дальний транспорт вирусов по флоэме...............................................38

1.4.2.1 Вирусы, для дальнего транспорта которых не нужен белок оболочки...39

1.4.2.2 Вирусы, для дальнего транспорта которых необходим белок оболочки40

1.4.2.3 Транспортные системы поти- и клостеровирусов.............................42

1.4.2.4 Флоэмно-ограниченные вирусы.................................................44

2 Белки растений - участники вирусной и вироидной инфекции ..............................45

2.1 Белки растений, необходимые для транспорта вирусов .................................45

2.2 Белки растений, негативно регулирующие транспорт вируса по растению.........51

2.3 Белки растений, участвующие в жизненном цикле вироидов .........................53

2.4 4/1 белок растений ..............................................................................58

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ...................................................................60

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 77

1.0 ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА Ш-4/1 .............................................77

2.0 СТРУКТУРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ БЕЛКА N1-4/1 ............................................85

2.1 Исследование вторичной структуры белка N1-4/1 ......................................85

2.2 Ограниченный протеолиз белка N1-4/1 в клетках Е соИ................................88

2.3 Анализ третичной структуры белка N1-4/1 методом дифференциальной

сканирующей калориметрии .....................................................................90

9

3.0 ОЛИГОМЕРИЗАЦИЯ .............................................................................92

3.1 Изучение способности к олигомеризации белка Nt-4/l и его делеционных мутантов методом динамического лазерного светорассеяния..............................92

3.2 Визуализация мультимерных комплексов, образуемых белком Nt-4/l, с помощью электронной микроскопии ........................................................................94

4.0 ИССЛЕДОВАНИЕ БИОХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ БЕЛКА Nt-4/l ...................95

4.1 Анализ РНК-связывающей активности белка Nt-4/l ....................................95

4.2 in vitro взаимодействие белка AVirPl с РНК ВВКК ..................................101

4.3 Картирование РНК-связывающего сайта белка Nt-4/1 ..............................102

4.4 Анализ РНК-связывающей активности белка Nt-4/l и его мутантов методом Норт-Вестерн гибридизации ...................................................................104

4.5 Определение размера рибонуклеопротеидных комплексов методом динамического лазерного светорассеяния ...................................................105

5.0 ПРЕДСКАЗАНИЕ ТРЕТИЧНОЙ СТРУКТУРЫ БЕЛКА 4/1 .............................106

ЗАКЛЮЧЕНИЕ ..................................................................................108

ВЫВОДЫ ..............................................................................................110

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 111

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Названия вирусов

ВТМ - вирус табачной мозаики (Tobacco mosaic virus, TMV)

ВНПД - вирус некротической пятнистости дыни {Melon necrotic spot virus, MNSV)

BMT - вирус морщинистости турнепса (Turnip crinkle virus, TCV)

ВПГ - вирус пятнистости гвоздики (Carnation mottled virus, CMV)

ВШМЯ - вирус штриховатой мозаики ячменя (Barley stripe mosaic virus, BSMV)

BCBK - вирус скрученности верхушек картофеля (Potato mop-top virus, PMTV)

ВЖС - вирус желтухи свеклы (Beetyellow virus, BYV)

ВГТ - вирус гравировки табака (Tobacco etch virus, TEV)

ПЛВМ - полулатентный вирус мятлика (Poa semilatent virus, PSLV)

BKB - вирус короткоузлия винограда (Grapevine janleaf virus, GFV)

ВМЦК - вирус мозаики цветной капусты (Cauliflower mosaic virus, CaMV)

ВМБ - вирус мозаики бамбука (Bamboo mosaic virus, BaMV)

BOM - вирус огуречной мозаики (Cucumber mosaic virus, CMV)

ВОЖТ - вирус осветления жилок турнепса (Turnip vein clearing virus, TVCV)

ВМКГ - вирус мозаики коровьего горошка (Cowpea mosaic virus, CPMV)

XBK - Х-вирус картофеля (Potato virus X. PVX)

BMB - вирус мозаики вигны (Сом'реа mosaic virus, CMV)

BMA - вирус мозаики арахиса (Groundnut rosette virus, GRV)

ВПГТ - вирус пятнистой гнилостности томатов (Tomato spotted wilt virus, TSWV)

BHMKK - вирус некротической мозаики красного клевера (Red clover necrotic mosaic virus,

RCNMV)

ВШМП - вирус штриховатой мозаики пшеницы (Wheat streak mosaic virus, WSMV)

BC-J1K - вирус скручивания листьев картофеля (Potato leaf roll virus, PLRV)

ВЗЖС - вирус западной желтухи свеклы (Beet western yellow virus, BWYV)

BMP - вирус мозаики рапса (Oil-seed rape mosaic virus, ORMV)

BMoT - вирус мозаики турнепса (Turnip mosaic virus, TuMV)

ВПГТ - вирус пятнистой гнилостности томатов (Tomato spotted wilt virus, TSWV)

Названия вироидов

ВКХ - вироид карликовости хмеля (Hop stunt viroid, HSVd)

ВВКК - вироид веретеновидности клубней картофеля (.Potato spindle tuber viroid, PSTVd) ВСПА - вироид солнечной пятнистости авокадо (.Avocado sunblotch viroid, ASVd) ВЭЦ - вироид экзокортиса цитрусовых (Citrus exocortis viroid, CEVd) ВЛМП - вироид латентной мозаики персика (Peach latent mosaic viroid, PLMVd)

Другие сокращения

ГТД - плазмодесма

ТБ-транспортный белок

ВРК - вирусный репликативный комплекс

ТК - транспортный комплекс

БО - белок оболочки

вРНП-комплекс - вирусный рибонуклеопротеидный комплекс

вРНК - вирусная рибонуклеиновая кислота

оцРНК - одноцепочечная РНК

ЭПР - эндоплазматический ретикулум

АГ - аппарат Гольджи

МТ - микротрубочки

ПМ - плазматическая мембрана

Пл - пластиды

М - митохондрии

В - вакуоль

Я - ядро

КС - клеточная стенка Хл - хлоропласты СЭ - ситовидный элемент КС - клетка-спутница ПМЭ - пектинметилэстераза

ППС ПД- предельная пропускная способность плазмодесм ДБГ ТБ - двойной блок генов транспортных белков ТБГ ТБ - тройной блок генов транспортных белков

TGBpl - первый белок тройного блока генов

TGBp2 - второй белок тройного блока генов

TGBp3 - третий белок тройного блока генов

ORF - open reading frame, открытая рамка трансляции

GFP - green fluorescent protein, зеленый флуоресцентный белок

mRFP - monomeric red fluorescent protein, мономерный красный флуоресцентный белок

NCAP - non-cell-autonomous-protein, неклеточный автономный белок

МРВ2С - movement protein binding 2С, белок 2С, связывающий транспортный белок

БиФК - бимолекулярная флуоресцентная комплементация

KJICM - конфокальная лазерная сканирующая микроскопия

ДЛС - динамическое лазерное светорассеяние

КД - круговой дихроизм

ДСК - дифференциальная сканирующая калориметрия ПААГ - полиакриламидный гель

ВВЕДЕНИЕ

Распространение вирусов по растению является сложным многостадийным процессом, состоящим из внутриклеточного транспорта к местам репликации, самой репликации и образования транспортного комплекса, с последующим его распространением по всему организму хозяина. Для осуществления транспорта вирусы кодируют специфические транспортные белки, которые обеспечивают межклеточный транспорт, а некоторые - и дальний. После достижения вирусным транспортным комплексом проводящей системы растения, происходит загрузка флоэмы и системное распространение с током ассимилятов в незараженные ткани, что в итоге приводит к заражению всего организма.

Поскольку генетический аппарат вирусов относительно небольшой и кодирует ограниченное число белков, становится очевидным, что для осуществления некоторых этапов своего жизненного цикла вирусам приходится использовать не только белки, кодируемые своим геномом, но и рекрутировать специфические факторы растения-хозяина. Особенно это очевидно в отношении вироидов - патогенов, представляющих собой кольцевую одноцепочечную молекулу РНК, не кодирующую белков.

Помимо широко известных взаимодействий компонентов вирусов и вироидов с белками аппарата транскрипции и трансляции клетки, а также транспортных комплексов вирусов с элементами цитоскелета, появляются данные о вовлеченности новых, неизученных белков растения-хозяина в жизненный цикл патогенов. На первый взгляд не всегда понятна роль таких взаимодействий для вируса или вироида. И даже не всегда известна функция таких белков для самого растения. Так обнаружено, что подавление экспрессии гена VirPl в протопластах N.tabacum и N.benthamiana приводило к нарушению репликации вироида веретеновидности клубней картофеля (ВВКК). Также получены данные, свидетельствующие в пользу того, что белок VirPl необходим для системного распространения ВВКК и вироида экзокортиса цитрусовых (Kalantidis et al., 2007). Известно, что ключевую роль в осуществлении дальнего транспорта умбравирусов и потивирусов играет взаимодействие ORF3 и VPg белков, соответственно, с ядрышковым белком фибрилларином. Снижение уровня экспрессии фибрилларина являлось причиной значительного подавления аккумуляции А вируса картофеля в системных листьях, но не приводило к полной отмене дальнего транспорта, как в случае с умбравирусной инфекцией (Kim et al., 2007а; Rajamaki and Valkonen, 2009).

Таким образом, более детальное исследование факторов растения-хозяина, вовлеченных в осуществление определенных стадий жизненного цикла патогенов, позволит приблизиться к пониманию устойчивости некоторых видов и сортов сельскохозяйственных культур к патогенам и, в перспективе, поможет создать новые сорта резистентные к инфекционным агентам.

В двугибридной дрожжевой системе при скрининге кДНК библиотеки Arabidopsis thaliana против транспортного белка (NSm) вируса пятнистой гнилостности томатов (ВПГТ) был обнаружен миозин- и кинезин-подобный белок с неизвестной функцией, названный At-4/1 (von Bargen et о/.,2001). В экспериментах по совместной экспрессии в' клетках N. benthamiana At-4/l слитого в одной рамке трансляции с GFP и слитого с YFP белка ТБГЗ полулатентного вируса мятлика было показано, что оба белка локализуются в одних и тех же структурах. В нашей лаборатории была клонирована полная кодирующая последовательность белка ортолога At-4/l из растений Nicotiana tabacum (Nt-4/l). С помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии было определено, что белок локализуется в подвижных везикулярных структурах в цитоплазме и на периферии клетки рядом с ПД. В данной работе продолжаются исследования белка Nt-4/l - вероятного участника жизненного цикла патогенов растений.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1 ТРАНСПОРТ ВИРУСОВ ПО РАСТЕНИЮ

Распространение вирусной инфекции - это сложный процесс, успешность которого зависит от скоординированного и сбалансированного взаимодействия белков вируса и белков растения-хозяина. Для плодотворного развития инфекции в растении необходимо распространение вируса из первично зараженных клеток хозяина в соседние здоровые клетки и в проводящую систему для дальнейшего транспорта в здоровые молодые листья. Таким образом, в распространении вируса по растению можно выделить три стадии: внутриклеточный транспорт от мест репликации к плазмодесмам (ПД), относительно медленный межклеточный транспорт через ПД и быстрый дальний транспорт с потоком фотоассимилятов по флоэме. Транспорт вируса представляет собой активный процесс, в регуляции которого существенную роль играет геном вируса, а также кодируемые им вирусспецифические белки.

1.1 Транспортные белки вирусов растений

Все вирусы растений кодируют один или несколько транспортных белков (ТБ). которые позволяют распространяться вирусному геному из участков репликации внутри зараженной клетки в соседние незараженные клетки. Вследствие наличия у растений клеточной стенки вирусам растений для распространения необходимо преодолеть плазмодесмы - цитоплазматические каналы, проходящие сквозь клеточные стенки соседних клеток и соединяющие их. В этом процессе участвуют транспортные белки, которые доставляют вирусный геном на периферию клетки, увеличивают диаметр отверстия плазмодесмы и «протаскивают» вирусный рибонуклеопротеидный (вРНП) комплекс (вирион) в соседнюю клетку (Lucas, 2006: Verchot-Lubicz et eil.. 2010; Schoelz et al., 2011).

На данный момент выделяют три большие группы вирусов, кодирующих транспортные белки: вирусы, кодирующие один, два и три ТБ. К первой группе относятся представители родов тобамо-, дианто-, умбра-, бромо- и кукумовирусов (Epel, 2009).

Первым открытым и наиболее хорошо изученным транспортным белком является транспортный белок вируса табачной мозаики (ВТМ, Tobacco mosaic virus, TMV), относящийся к роду тобамовирусов. ТБ ВТМ имеет молекулярную массу 30 кДа (ЗОК) и

относится к, так называемому, «ЗОК суперсемейству» (Atabekov and Dorokhov, 1984; Deom et al., 1987; Meshi et al., 1987). В работе Citovsky et al, 1990 было показано, что ТБ ВТМ in vitro способен кооперативно связывать одноцепочечную РНК (оцРНК) (Citovsky et al., 1990). Комплекс, образованный ТБ и РНК ВТМ. был изолирован из зараженных растений в 80-е годы XX века (Dorokhov et al.. 1983, 1984). Также было обнаружено, что ЗОК локализуется рядом с ПД и может изменять ее предельную пропускную способность (Tomenius et al., 1987; Ding et al., 1992a; Oparka et al, 1997).

Для транспортного белка ВТМ было предсказано (Kahn et al., 1998), а в дальнейшем показано, наличие двух трансмембранных участков. Эти участки пересекают мембрану эндоплазматического ретикулума (ЭПР) таким образом, что N- и С-концы белка находятся со стороны цитоплазмы, а гидрофильная петля из 70 аминокислот - со стороны просвета ЭПР (Reichel and Beachy, 1998; Brill et al, 2000; Fujiki et al., 2006).

Для ЗОК, слитого в одной рамке трансляции с GFP, показана локализация на мембранах ЭПР в виде крупных структур неправильной формы. В клетках листа Nicotiana benthamiana 30K-GFP локализовался в плазмодесмах, в то время как в протопластах 30К-GFP накапливался в виде отдельных точек рядом с плазматической мембраной (Heinlein et al, 1998).

Род кармовирусы. относящийся к семейству томбусвирусов, кодирует в своем геноме два небольших транспортных белка, образующих двойной блок генов транспортных белков (ДБГ ТБ).

Вирус некротической пятнистости дыни (ВНПД, Melon necrotic spot virus. MNSV). относящийся к этому роду, представляет собой маленький изометрический вирус растений с геномом, кодирующим пять генов, два из которых являются генами транспортных белков (р7А, р7В). Белок р7А является гидрофильным и локализуется в цитоплазме, а р7В - гидрофобным и ассоциирован с мембраной ЭПР. Гидрофильный транспортный белок обладает способностью взаимодействовать с гидрофобным белком-партнером и неспецифически с оцРНК. Комплекс из двух транспортных белков и вирусной РНК вдоль мембраны ЭПР направляется к ПД (Epel, 2009; Navarro et al., 2006; Genoves et al, 2006). Аналогичным способом осуществляется внутриклеточный транспорт у других представителей рода кармовируса ((Вирус морщинистости турнепса (Turnip crinkle virus), вирус пятнистости гвоздики (Carnation mottled virus)) (Vilar et al., 2002: Martínez-Gil et al., 2007; Li et al, 1998).

Вирус морщинистости турнепса кодирует в своем геноме два транспортных белка: р8 и р9. Известно, что белок р8 является гидрофильным и проявляет РНК-связывающие

свойства, а белок р9 - гидрофобным с двумя трансмембранными доменами (Maritnez -Gil eta!., 2010; Sauri eta!., 2005).

Третья группа вирусов кодирует эволюционно консервативный модуль из трех частично перекрывающихся генов транспортных белков (тройной блок генов, ТБГ, triple gene block, TGB), названных TGBpl, TGBp2, TGBp3 соответственно позиции гена в этом модуле (Solovyev et а!., 1996; Morozov and Solovyev, 2003). Все три белка необходимы для распространения инфекции по растению. ТБГ-содержащие вирусы растений можно поделить на две группы: потексподобные и гордеиподобные. К потексподобным относят вирусы родов Potexvirus, Ccirlavirus, Foveavirus и Allexivirus. Эта группа вирусов характеризуется нитевидным вирионом и необходимостью белка оболочки для осуществления межклеточного транспорта. К гордеиподобным относят вирусы родов Benyvirus, Hordeivirus, Pecluviru.s и Pomovirus. Для них характерен палочковидный вирион и отсутствие необходимости белка оболочки для межклеточного транспорта. TGBpl этой группы вирусов отличается наличием удлиненного N-концевого района. Таким образом, транспортная функция у вирусов содержащих ТБГ в отличие от ВТМ поделена между тремя белками. РНК-связывающими свойствами обладает первый белок из тройного блока генов (TGBpl). Однако было показано, что TGBp2 вируса скрученности верхушек картофеля (ВСВК, Potato mop-top vims, PMTV) и мозаики бамбука (ВМБ, Bamboo mosaic virus, BaMV) обладает способностью in vitro взаимодействовать с РНК (Cowan et а!., 2002; Hsu et ai, 2008). Кроме того, стоит отметить, что белок TGBpl потексвирусного типа способен выполнять роль супрессора сайленсинга, в то время как белок TGBpl гордеивирусов не обладает такой активностью, несмотря на его способность связывать двухнитевую РНК (Jackson et а!., 2009). Для белков TGBp2 и TGBp3 показано наличие гидрофобных сегментов, необходимых для локализации в составе мембран ЭПР (Solovyev et а!., 2000; Morozov and Solovyev, 2003; Haupt et a!., 2005; Ju et a!., 2005). TGBp3, напрямую взаимодействуя с TGBp2, опред�