Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль структуры поверхностных белков оболочечных вирусов в формировании вирионов

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Роль структуры поверхностных белков оболочечных вирусов в формировании вирионов"

На правах рукописи

КОРДЮКОВА Лариса Валентиновна

РОЛЬ СТРУКТУРЫ ПОВЕРХНОСТНЫХ БЕЛКОВ ОБОЛОЧЕЧНЫХ ВИРУСОВ В ФОРМИРОВАНИИ ВИРИОНОВ

03.01.03 - молекулярная биология 03.02.02 - вирусология

2 8 НОЯ 2013

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 2013

005539633

Работа выполнена в отделе хроматографического анализа НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова»

Научный консультант:

доктор химических наук, профессор Баратова Людмила Алексеевна

Официальные оппоненты: Бовин Николай Владимирович,

доктор химических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и ЮЛ. Овчинникова Российской академии наук, заведующий лабораторией углеводов

Ленёва Ирина Анатольевна,

доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» Российской академии медицинских наук, заведующая лабораторией экспериментальной вирусологии

Карягина-Жулина Анна Станиславовна,

доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение «НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации лаборатория биологически активных наноструктур, главный научный сотрудник

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт гриппа» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Защита состоится 19 декабря 2013 г. в //' 5 ^ на заседании Совета Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова» по адресу: 119234, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет, ауд. ЪвН.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке МГУ имени М.В. Ломоносова (Фундаментальная библиотека, Ломоносовский проспект, 27, отдел диссертаций)

Автореферат разослан ¿¿Р&^ЗЛ- 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Крашенинников И.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. К группе оболочечных вирусов относятся многие опасные патогены, в том числе вирусы гриппа и респираторных инфекций, а также гепатитов, герпеса, геморрагических лихорадок, иммунодефицита человека и многие другие. Вакцино-профилактика в случае вируса гриппа А осложнена высокой изменчивостью поверхностных антигенов вириона. К препаратам, наиболее широко применяемым в настоящее время для лечения гриппа - ингибиторам ионного канала (белка М2) ремантадинового ряда и ингибиторам нейраминидазы - занамивиру и озелтамивиру достаточно быстро возникает резистентность. Таким образом, проблема профилактики и лечения вирусных инфекций не решена, несмотря на неустанный активный поиск и дизайн новых антивирусных препаратов (УапЬегПпЬеп & ЫаеэепБ, 2013). В связи с этим не ослабевает актуальность фундаментального изучения структуры отдельных компонентов вириона и их взаимодействий, с целью целостного понимания сложной картины патогенеза оболочечных вирусов и в перспективе, для разработки новых антивирусных стратегий.

Оболочечные вирусы объединяет наличие липопротеиновой оболочки вокруг нуклеокапсида, которую вирион получает при «выпочковывании» с клеточной мембраны. На Рис. 1, А схематически представлен вирион вируса гриппа А, типичного представителя семейства ОгЯютЫочШае. Нуклеокапсид включает 8 сегментов однонитевой РНК негативной полярности в комплексе с нуклеопротеином (ЫР) и белками полимеразного комплекса (РВ1, РВ2, РА). А Б

Нейраминидаза Гемагглютинин на на-м ма

Рис. 1. А: Схема вириона вируса гриппа А. В липидный бислой встроены «шипы» гликобелков НА, NA и белок М2 - ионный канал. Слой белка М1 ассоциирован с мембраной. Б: Реконструкция фрагмента оболочки вириона по данным криоэлектронной томографии и рентгеноструктурного анализа (Harris etal., 2006).

цепи НА2 входят в состав гомотримера эктодомена (Рис. 2, А). Заякоривающий (С-концевой) сегмент цепи НА2, который остается в мембране вириона после удаления эктодоменов бромелаином, включает (1) линкерную область, (2) трансмембранный (ТМ) домен (подчеркнуто) и (3) внутривирионный, или цитоплазматический (CT) домен. В то время как эктодомен гемагглютинина при кислом значении pH радикально перестраивается, гомотримерный комплекс TM-доменов сохраняет свою структурную целостность, создавая необходимое напряжение для формирования и расширения поры слияния. Пространственная организация гомотримера ТМ-доменов не определена. Отсутствует информация и об архитектуре «ножки» «шипа», включающей гомотример линкерных последовательностей, которые также несут функциональную нагрузку при слиянии мембран.

На сегодняшний день описаны 17 антигенных подтипов НА вируса гриппа А, которые согласно З-й-структуре эктодоменов образуют две эволюционные группы: Группу-1 (Н1-Группа) и Группу-2 (НЗ-Группа), включающие 3 клада (Н1, Н2, Н5, Н6, Н17); (Н8, Н9, Н12); (Н11, Н13, Н16) и 2 клада (НЗ, Н4, Н14); (Н7, НЮ, Н15), соответственно (Nobusawa et al., 1991, Pica and Palese, 2013). Стоит отметить, что большинство используемых в настоящее время вакцин по-прежнему остаются Групп- и подтип-специфичными. У вируса В антигенные подтипы не выделяют.

Структурные различия гомотримерных комплексов TM-доменов и линкерных последовательностей в контексте разных эволюционных Групп НА систематически не изучались. Можно предположить, что изучение этих характеристик, в частности, поможет лучше понять экспериментально наблюдаемые различия в параметрах слияния мембран при участии НА подтипов Н1, Н2 и НЗ (Körte et al., 1997; 1999).

Особое внимание в данной работе уделено крайне консервативной модификации определенных остатков цистеина в С-концевой области НА остатками высших жирных кислот (Рис. 2, Б). Эта пост-трансляционная модификация -пальмитилирование, или S-ацилирование - была обнаружена у вирусных белков более 30 лет назад (Schmidt & Schiessinger, 1979). Достаточно рано было показано, что не только пальмитиновая (гексадекановая, С 16:0), но и жирные кислоты других типов могут ковалентно присоединяться к белку (Schmidt, 1984). Однако настоящий интерес к этой липидной модификации возник недавно, когда были найдены ферменты - DHHC-ацилтрансферазы, выполняющие функцию переноса остатка жирной кислоты на клеточные белки-субстраты (Under & Deschenes, 2007). В геноме человека закодировано 23 таких фермента, но ни для одного из них пока не показана функция S-ацилирования какого-либо белка вируса.

Остатки высших жирных кислот, по-видимому, присоединяются к гемагглютинину вируса гриппа в раннем Гольджи, после тримеризации белка (Veit, 1993). Все 17 антигенных подтипов НА вируса гриппа А содержат как минимум три обязательных сайта ацилирования: один расположен у большинства подтипов на С-конце TM-домена и два - в СТ-домене (Рис. 2, Б). Специфического паттерна «узнавания» для пальмитилирования (как, например, в случае гликозилирования), не найдено. Однако остатки цистеина, которые локализованы у НА ряда подтипов в середине TM-домена (Рис. 2, Б), никогда не связывают остатки жирных кислот.

Данные о структурных предпочтениях остатков жирных кислот разной химической природы и единое представление относительно функции S-ацилирования в вирионе отсутствуют. Установлено, что пальмитилирование НА не требуется ни для прикрепления белка к мембране, ни для его внутриклеточного транспорта по эндоцитозному пути на поверхность вириона (Veit et al., 1991). Однако модификация жирными кислотами существенна для репликации вируса, поскольку рекомбинантные частицы, содержащие мутантные молекулы НА с заменой более одного сайта ацилирования, либо (в зависимости от штамма) очень плохо продуцируются, либо не продуцируются вовсе при получении их методом обратной генетики (Chen et al., 2005; Wagner et al., 2005).

До сих пор нет четкого понимания, на какой из стадий жизненного цикла вируса эта модификация необходима: влияют ли ковалентно связанные остатки жирных кислот на процесс слияния мембран и/или сборки дочерних вирионов и вовлечены ли они во взаимодействия с другими белками вириона. Ситуация осложняется разноречивыми экспериментальными данными, полученными для разных антигенных подтипов НА. Тип остатка жирной кислоты представляет особенный интерес, поскольку углеводородные цепи, различающиеся по длине только на два углеродных атома, демонстрируют значительную разницу в гидрофобности. Этот параметр может влиять на силу взаимодействия белка с мембраной и на силу белок-белковых взаимодействий.

Цель vi задачи исследования. Целью данной работы является исследование структуры С-концевой области (заякоривающего сегмента) гемагглютинина вируса гриппа и поверхностных белков других оболочечных вирусов и анализ ее роли в формировании вирионов.

Для достижения вышеописанной цели были поставлены следующие задачи: 1. Создать подход для исследования структурных свойств надмолекулярного комплекса линкерных последовательностей - «ножки» «шипа» гемагглютинина вируса гриппа разных антигенных подтипов/типов;

4

2. Разработать методологию изучения гомотримерной ассоциации трансмембранных доменов гемагглютинина вируса гриппа с применением экспериментальных подходов и компьютерного моделирования;

3. Отработать протокол анализа пост-трансляционной модификации остатками высших жирных кислот (Б-ацилирования) поверхностных белков, выполняющих функцию слияния мембран. Использовать в качестве объекта гемагглютинин вируса гриппа и ряд белков других семейств оболочечных вирусов. Сформулировать концепцию о полноте и гетерогенности Э-ацилирования белка в составе вириона;

4. Создать экспериментальные модели для исследования структурной и биологической значимости Б-ацилирования вирусных белков, включая (1) серию лабораторных реассортантов вируса гриппа А с поверхностными и внутренними белками, полученными от разных родительских штаммов/хозяев; (2) синтетический пептид, стехиометрически алкилированный гексадекановыми алифатическими цепями (имитирующими пальмитипирование), встроенный в липидные везикулы;

5. Изучить с применением современных методик молекулярного моделирования принципиальную возможность участия остатков жирных кислот в образовании гомотримерного комплекса трансмембранных доменов гемагглютинина при формировании вирионов.

Решение поставленных задач должно было дать новую структурную информацию о сегментах белков, входящих в состав оболочки вириона, изучение пространственной организации которых методом РСА затруднено.

Научная новизна и практическая значимость работы. Современное представление о патогенезе вируса гриппа и других оболочечных вирусов, среди которых описано много опасных патогенов человека и животных, предполагает понимание молекулярных перестроек белков вириона при проникновении вируса в клетку и морфогенезе дочерних вирионов. Однако экспериментальных исследований для понимания роли каждого компонента вириона в жизненном цикле вируса и его взаимодействия с системой везикулярного транспорта в клетке недостаточно. Это определяет актуальность исследования особенностей структуры поверхностных белков оболочечных вирусов, в частности, гидрофобных сегментов белков, встроенных в липидную мембрану. Кроме того, в связи с высокой изменчивостью вируса гриппа, риском новых пандемий и крайне скромным арсеналом средств борьбы с ним в эпидемических условиях, существует острая необходимость планирования и разработки новых антивирусных стратегий. В связи с этим выяснение молекулярных механизмов, лежащих в основе взаимодействия хозяина и патогена, представляется актуальным.

5

Протеолиз целых вирионов был впервые предложен в качестве подхода для изучения структурной организации области «ножки» шипа, включающей гомотример линкерных участков. Обнаружено, что локализация сайтов гидролиза ферментами разных классов определяется, главным образом, стерической доступностью зоны расщепления для молекулы фермента, а не собственно специфичностью фермента. В перспективе не исключена возможность прицельного разрушения поверхностных гликопротеинов специально подобранными ферментами с целью ограничить распространение вирусной инфекции.

Гидролиз протеазами поверхностных белков, выделенных из интактных вирионов неионным детергентом, непосредственно в мицелле, был предложен как способ экспериментального анализа упаковки трансмембранных доменов белков в составе природных олигомеров. Обнаруженные различия в гомотримерной упаковке трансмембранных доменов у гемагглютининов разных эволюционных групп вируса гриппа А, подтвержденные данными компьютерного моделирования, проясняют, почему невозможно формирование «смешанных» тримеров НА подтипов Н1 и НЗ, Н1 и Н7 (Sklyanskaya е al., 1988).

S-ацилирование вплоть до недавнего времени детектировали на основании метаболического мечения вирусов [ЗН]-пальмитатом и выяснения, в какой белок включается метка. Последующий хроматографический анализ пула связанных жирных кислот (Veit, 1991) не давал точной информации ни о полноте S-ацилирования белка, ни о типах реально присоединенных к белку остатков жирных кислот, ни об их распределении по потенциальным сайтам. Показано, что в клетке могут происходить метаболические трансформации меченого пальмитата в другой тип жирной кислоты еще до присоединения к белку (Schmidt, 1984). Мы предложили экстрагировать ацилированные пептиды в органическую фазу (сходно с методом экстракции липидов) из обработанных протеазами вирионов. Успешное применение масс-спектрометрического (MC) анализа для детекции гидрофобных пептидов привело к созданию уникального протокола, который до сих пор не имеет аналогов в мире.

Впервые показано, что в составе вирионов молекулы НА ацилированы стехиометрически: все потенциальные сайты модифицированы остатками жирных кислот. Далее, обнаружено дифференциальное S-ацилирование остатками пальмитата (С16:0), либо стеарата (С 18:0) в зависимости от локализации сайта ацилирования относительно границы липидного бислоя: только остаток цистеина, расположенный на границе ТМ- и СТ-доменов, может связать стеарат, в то время как остатки цистеина в СТ-домене ацилированы исключительно пальмитатами.

6

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Кордюкова, Лариса Валентиновна, Москва

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова»

Научно-исследовательский институт физико-химической биологии

имени А.Н. Белозерского

На правах рукописи

05201450111

КОРДЮКОВА Лариса Валентиновна

РОЛЬ СТРУКТУРЫ ПОВЕРХНОСТНЫХ БЕЛКОВ ОБОЛОЧЕЧНЫХ ВИРУСОВ В ФОРМИРОВАНИИ ВИРИОНОВ

03.01.03 - молекулярная биология

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научный консультант:

доктор химических наук, профессор Баратова Л.А.

Москва 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ...............................................................................4

ВВЕДЕНИЕ..........................................................................................................6

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ....................................................................................11

1. Вирус гриппа..................................................................................................11

1.1 .Классификация штаммов.........................................................................11

1.2. Структурная организация еириона вируса гриппа................................12

1.3. Оболочка еириона: липиды клеточной мембраны

и вирус-специфические белки....................................................................14

1.3.1 .Гемагглютинин...................................................................................18

1.3.1.1.Пространственная структура эктодомена..........................19

1.3.1.2. Эволюционные группы гемагглютинина..................................27

1.3.1.3.Перестройка при кислом рН....................................................30

1.3.1.4. «Внутренняя структурная неупорядоченность»...................35

1.3.1.5.3аякоривающий (С-концевой) сегмент....................................37

1.3.2.Нейраминидаз а....................................................................................43

1.3.3.Мембранный белок М2........................................................................47

1.3.4.Матриксный белок М1 и взаимодействие с гемагглютинином.....49

2. Липидиая модификации вирусных белков - 8-ацилирование..............55

2.1.Методы идентификации Б-ацилирования...............................................55

2.2.Локализация сайтов 8-ацилирования в белке..........................................58

2.3.Энзимология Б-ацилирования на примере клеточных белков.................62

2.4.Компартменты Б-ацилирования в клетке...............................................64

2.5.Биологическая роль Б-ацилирования.........................................................65

2.6. Типы остатков жирных кислот, присоединяемые к белку...................69

3. Масс-спектрометрические подходы в изучении вируса гриппа...............70

3.1.Принципы и разновидности масс-спектрометрии.................................70

3.2.Идентификация белков..............................................................................73

3.3.Протеомика вирионов................................................................................75

3.4. Тестирование вакцин.................................................................................76

3.5.Мониторинг штаммов: гено- и протеотипирование.............................77

3.6.Пост-трансляционные модификации......................................................79

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.............................................................................82

Р

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ............................102

1. Структурная организация линкерных последовательностей гемагглютинина вируса гриппа.................................................................102

1.1 .Протеолиз гемагглютинина вируса гриппа в интактных вирионах.... 102

1.1.1.Действие различных протеолитических ферментов на

вирионы вируса гриппа.......................................................................103

1.1.2.Действие бромелаина на вирионы вируса гриппа

в отсутствие восстанавливающих реагентов...............................107

1.1.2.1. Феномен фрагментации белка М1 в составе вирионов........110

1.1.3.Идентификация сайтов гидролиза гемагглютинина

в составе вирионов при помощи масс-спектрометрии..................118

1.2.Биоинформатические подходы для анализа упаковки

линкерных последовательностей в составе «ножки» «шипа»............132

2. Структурная организация трансмембранных доменов гемагглютинина вируса гриппа.................................................................135

2.1 .Протеолиз гемагглютинина вируса гриппа в составе мицелл.............135

2.2.Компьютерное моделирование гомотримерной

ассоциации трансмембранных доменов.................................................141

3. S-ацилирование поверхностных белков...................................................143

3.1 Дифференциальное S-ацилирование — характерная черта

«сливающих» белков оболочечных вирусов.............................................143

3.1.1.Гемагглютинин (НА) природных штаммов вируса гриппа А........143

3.1.2.Мутанты НА вируса гриппа А с заменами сайтов ацилирования.....................................................................................149

3.1.3.НА вируса гриппа В и гемагглютинин-эстераза-фъюжин

(HEF) вируса гриппа С......................................................................151

3.1.4.Белки других оболочечных вирусов..................................................153

3.2.Анализ биологической значимости S-ацилирования -

новые подходы..........................................................................................157

3.2.1 .Аминокислотные замены вблизи от сайтов ацилирования..........157

3.2.2. Лабораторные реассортанты - экспериментальная модель для исследования влияния других белков вириона на S-стеарилирование НА вируса гриппа А.........................................161

3.2.3.Дифференциальное ацилирование важно для локализации вирусного белка в рафтах?...............................................................168

3.2.4. Синтетический пептид, имитирующий Б-ацилированный

С-концевой сегмент НА, — модель для исследования структурной

роли ковалентно связанных остатков жирных кислот................170

3.3.Гипотеза об участии остатков жирных кислот в

гомотримерной ассоциации трансмембранных доменов НА...............177

4. Заключение.....................................................................................................180

ВЫВОДЫ............................................................................................................186

БЛАГОДАРНОСТИ..........................................................................................188

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.....................................191

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

А.о. - аминокислотный остаток

БСА - бычий сывороточный альбумин

БОВ - большие однослойные везикулы

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ГФИП - гексафторизопропанол (англ. HFIP, hexafluoroisopropanol)

ДГФХ - дигексаноилфосфатидилхолин

ДЛС - динамическое лазерное светорассеяние

ДМФХ - димиристоилфосфатидилхолин

Ж.к. - жирная кислота

КД - круговой дихроизм

МС - масс-спектрометрия

МГП - молекулярный гидрофобный потенциал (расчетные гидрофобно-

гидрофильные свойства поверхности белка)

ПААГ - полиакриламидный гель

РСА - рентгеноструктурный анализ

СБСС - сопряженная бесклеточная система синтеза

ТХУ - трихлоруксусная кислота

УФ - ультрафиолет

ФС - фосфатидилсерин

ФХ - фосфатидилхолин

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ЭПР - эндоплазматический ретикулум

ЯМР -ядерномагнитный резонанс

АРТ - Acyl-protein thioesterase

ВНА - bromelain treated НА, удаленный бромелаином эктодомен НА (3-МЕ - (3-меркаптоэтанол

СТ - cytoplasmic ta.il, цитоплазматический «хвост» (домен)

DRM - Detergent Résistant Membranes, устойчивые к детергенту мембраны

DHHC - мотив Asp-His-His-Cys в активном центре пальмитоил-ацил-трансфераз

Е-64 - Ь-гаранс-эпоксисукцинил-лейциламидо(4-гуанидино)бутан

ESI - Electro-Spray Ionization, электроспрей

Glp-Phe-Ala-pNA - пироглутамил- РЬе-А1а-/7-нитроанилид

GPI - glycosyl phosphatidylinositol, гликозилфосфатидилинозитол

НА - гемагглютинин

НА-ТМД-СТ - пептид, соответствующий последовательности С-концевого сегмента НА A/FPV/34 (H7N1), включая линкер, ТМ и СТ-домены (а.о. 518-563) НА-ТМДС21S-CT - пептид с заменой Cys21Ser в пептиде НА-ТМД-СТ Hd-MTS - hexadecyl-methanethiosulfonate, гексадецил-метантиосульфонат HEF - hemagglutinin esterase fusion, белок гемагглютинин-эстераза-фьюжин HIV - human immunodeficiency virus, вирус иммунодефицита человека HSQC - спектры гетероядерного одноквантового переноса когерентности MALDI - Matrix-Assisted Laser Desorption, МАЛДИ - матрично-активированная лазерная десорбционная ионизация MDCK - Madin-Darby canine kidney, клетки почки собаки NA-нейраминидаза

NDV - Newcastle Disease Virus, вирус болезни Ньюкасла PMSF - фенилметилсульфонилфторид

SARS-CoV - sudden acute respiratory syndrome coronavirus, коронавирус,

вызывающий острый респираторный синдром («атипичную пневмонию»)

SAS - solvent accessible surface, доступная растворителю поверхность

SFV - Semliki Forest Virus, вирус леса Семлики

ТСЕР - tris(2-carboxyethyl)phosphine, трис(2-карбоксиэтил)фосфин

ТМ - трансмембранный

TOF - Ionization Time-Of-Flight, времяпролетная 3D - трехмерный

TSP - trimethylsilyl propanoic acid, триметилсилилпропановая кислота

VSV — Vesicular Stomatitis Virus, вирус везикулярного стоматита

5

ВВЕДЕНИЕ

К группе оболочечных вирусов относятся многие опасные патогены, в том числе вирусы гриппа и респираторных инфекций, а также гепатитов, герпеса, геморрагических лихорадок, иммунодефицита человека и многие другие. Вирус гриппа (не считая, пожалуй, вируса иммунодефицита человека) на сегодняшний день является наиболее изученным из вирусных патогенов человека. Тем не менее, накопленных в науке данных явно недостаточно как для полного представления о механизмах инфицирования организма, так и для обеспечения надежной защиты человеческой популяции от ежегодных вспышек заболевания, эпидемий и пандемий.

Сегментированная организация генома вируса гриппа способствует обмену генетической информацией между различными штаммами при смешанной инфекции. Этот процесс называется реассортацией. В природе реассортация генов (генетический «шифт», англ. shift) при одновременном заражении организма вирусами разного происхождения может привести к появлению новых штаммов, обладающих пандемическим потенциалом. История XX-XXI веков знает четыре пандемии: 1918, 1957, 1968 и 2009 годов. Вирусы, вызвавшие пандемии 1957 (H2N2, азиатский грипп), 1968 (H3N2, Гонг Конг) и 2009 (HINlv) появились в результате реассортации генов вирусов гриппа человека и птиц. Пандемия 1918 года (H1N1, испанка) была наиболее сильной; она унесла несколько десятков миллионов жизней. Не ликвидирована угроза распространения в человеческой популяции высокопатогенного штамма H5N1, а весной 2013 года появилось сообщение из Китая о случаях заражения людей штаммами H7N9 (Lamb, 2013). Общее количество случаев заболеваемости и смертности на протяжении периодов между пандемиями на самом деле превосходит эти показатели для пандемий.

Средств борьбы с заболеваемостью недостаточно. Несмотря на неустанный активный поиск и дизайн новых антивирусных препаратов (Vanderlinden & Naesens, 2013), проблема лечения вирусных инфекций не

решена. Даже к наиболее эффективным из противогриппозных препаратов, к которым в настоящее время относятся ингибиторы нейраминидазы -занамивир (коммерческий препарат Реленза) и озелтамивир (Тамифлю) -достаточно быстро возникает резистентность. Вакцино-профилактика в случае вируса гриппа А осложнена высокой изменчивостью поверхностных антигенов. В связи с этим не ослабевает актуальность фундаментального изучения патогенеза вируса гриппа в плане анализа структуры отдельных компонентов вириона и их взаимодействий, с целью разработки в дальнейшем новых антивирусных стратегий.

Оболочечные вирусы проникают в клетку-хозяина в результате слияния вирусной мембраны с клеточной (Eckert & Kim, 2001). Вирусная оболочка может сливаться с плазматической мембраной клетки при нейтральном pH (парамиксо-, ретровирусы). Вирусные частицы других семейств (ортомиксо-, рабдо-, альфа-, флавивирусов) проникают внутрь клетки путем опосредованного клеточными рецепторами эндоцитоза, вслед за которым, при закислении среды, происходит слияние вирусной и эндосомальной мембран, приводящее к высвобождению вирусного нуклеокапсида в цитоплазму клетки (Hernandez и др., 1996; Lesear и др.,

2001). В случае вируса гриппа как взаимодействие с клеткой-хозяином, так и слияние мембран опосредуется трансмембранным белком гемагглютинином (Skehel & Wiley, 2000).

Согласно гипотезе последнего десятилетия, механизмы реакций слияния (англ. fusion) и деления (англ. fission) мембран, участвующие во множестве клеточных процессов, во многом сходны, но реализуются в обратном порядке (Chernomordik & Kozlov, 2003; Kozlov Sc Chernomordik,

2002). В случае оболочечных вирусов этап входа вируса в клетку,

сопровождающийся «разборкой» целостного вириона на отдельные

компоненты, в каком-то смысле «обратен» формированию вирионов. В

частности, матриксный слой, располагающийся под вирусной мембраной,

должен диссоциировать в процессе или после слияния мембран, пропуская

7

сегменты нуклеокапсида в цитоплазму. С другой стороны, взаимодействие вновь синтезированных в клетке белков Ml и гемагглютинина на этапе сборки необходимо для морфогенеза полноценных вирионов.

Несмотря на огромные достижения в области изучения механизма слияния мембран под воздействием вирусных белков-фузогенов, далеко не все детали этого процесса понятны. В частности, в то время как эктодомен гемагглютинина при кислом значении pH радикально перестраивается, гомотримерный комплекс трансмембранных доменов, по-видимому, сохраняет свою структурную целостность, создавая необходимое напряжение для расширения поры слияния. Пространственная организация гомотримера трансмембранных доменов гемагглютинина не определена. Отсутствует информация и об архитектуре «ножки» «шипа», локализованной в пограничной зоне между закристаллизованным эктодоменом и комплексом трансмембранных доменов. Линкерные последовательности, гомотример которых формирует «ножку» «шипа», также несут функциональную нагрузку при слиянии мембран (Park и др., 2003; Kim и др., 2011). Вероятно, по аналогии с эктодоменами структурная организация линкерных областей и трансмембранных доменов различается у разных антигенных подтипов гемагглютинина вируса гриппа А, что может быть одной из причин наблюдаемых различий в протекании реакции слияния в случае подтипов HI, Н2 и НЗ (Körte и др., 1997, 1999). Однако этот вопрос систематически не изучался.

Важной особенностью гемагглютинина является пост-трансляционная

модификация консервативных остатков цистеина в С-концевой области

остатками высших жирных кислот. Эта модификация - пальмитилирование,

или S-ацилирование - была впервые обнаружена более 30 лет назад именно у

вирусных, а немного позднее и у клеточных белков (Schmidt & Schlesinger,

1979; Schmidt и др., 1980). Достижения протеомики последних лет позволили

аннотировать от 300 до 500 пальмитилированных белков в клетках разных

типов (Ivaldi и др., 2012; Martin и др., 2011; Tom & Martin, 2013), указывая на

8

распространенность этой модификации. Регуляция пальмитилирования определяет протекание как физиологически нормальных, так и патологических процессов в клетке, включая канцерогенез и развитие многих нейродегенеративных заболеваний (Linder & Deschenes, 2007).

В отличие от клеточных, S-ацилирование вирусных белков необратимо (не изменяется на протяжении времени «жизни» белка). Поэтому эта липидная модификация вряд может играть у вирусов регуляторную, но, скорее, структурную роль. Показано, что пальмитилирование НА важно для репликации вируса. Рекомбинантные частицы, содержащие мутантные молекулы НА с заменой более одного сайта ацилирования, либо очень плохо продуцируются в клетке, либо вовсе не могут быть получены методом обратной генетики (Chen и др., 2005; Wagner и др., 2005). В связи с этим, идея в перспективе попытаться блокировать S-ацилирование вирусных белков (например, подавив соответствующие ферменты) представляется актуальной. Но в отличие от большого потока работ, посвященных DHHC-ацил-трансферазам, выполняющим перенос и ковалентное присоединение остатков жирных кислот на белки эукариотических клеток, пока не был охарактеризован ни один фермент, выполняющий эту работу для вирусов.

До сих пор нет четкого понимания, на какой стадии жизненного цикла вируса необходимо пальмитилирование: участвуют ли ковалентно связанные остатки жирных кислот в процессе слияния мембран и/или сборки дочерних вирионов и вовлечены ли они во взаимодействия с другими белками вириона. Ситуация осложняется разноречивыми экспериментальными данными, полученными для разных антигенных подтипов НА. Тип остатка жирной кислоты представляет особенный интерес, поскольку углеводородные цепи, различающиеся по длине только на два углеродных атома, демонстрируют значительную разницу в гидрофобности, что может влиять на силу белок-мембранных и белок-белковых взаимодействий.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы является исследование структуры С-концевой области (заякоривающего сегмента) гемагглютинина вируса гриппа и поверхностных белков других оболочечных вирусов и ее роли в формировании вирионов.

Для достижения вышеописанной цели решались следующие задачи:

1. Предложить подход для исследования структурных свойств надмолекулярного комплекса линкерных последовательностей - «ножки» «шипа» гемагглютинина вируса гриппа разных антигенных подтипов/типов;

2. Разработать методологию изучения гомотримерной ассоциации трансмембранных доменов гемагглютинина вируса гриппа с применением экспериментальных подходов и компьютерного моделирования;

3. Отработать протокол анализа пост-трансляционной модификации остатками высших жирных кислот (8-ацилирования) поверхностных белков, выполняющих функцию слияния мембран. Использовать в качестве объекта гемагглютинин вируса гриппа и ряд белков других семейств оболочечных вирусов. Сформулировать концепцию о полноте и гетерогенности 8-ацилирования белка в составе вириона;

4. Создать экспериментальные модели для исследования стру�