Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетические основы аттенуации холодоадаптированного штамма-донора для живых гриппозных вакцин - A/Краснодар/101/35/59(H2N2)

ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Генетические основы аттенуации холодоадаптированного штамма-донора для живых гриппозных вакцин - A/Краснодар/101/35/59(H2N2)"

На правах рукописи

Ш':-2"

ТЕРЕХОВ Андрей Вадимович

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ АТПЩУАЦИИ ХОЛОДОАДАПТИРОВАННОГО ШТАММА-ДОНОРА ДЛЯ ЖИВЫХ ГРИППОЗНЫХ ВАКЦИН - А/КРАСНОДАР/101/35/59(Н2Ш)

03.02.02 - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2014

г 9 МАП 2С14

005549173

Работа выполнена в ФГБУ «НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» Российской академии медицинских наук

Научные руководители: доктор медицинских наук

Маркушин Станислав Георгиевич;

кандидат биологических наук Цфасман Татьяна Михайловна

Официальные оппоненты:

заведующий лабораторией этиологии и эпидемиологии гриппа ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России

заведующий лабораторией биотехнологии ФГБУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов доктор биологических наук

имени М.П. Чумакова» РАМН Шевелев Алексей Борисович

Ведущая организация: ФГБУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи» Минздрава РФ.

Защита диссертации состоится 26 июня 2014 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 001.035.01 в ФГБУ «НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» РАМН по адресу: 105064, г. Москва, Малый Казенный пер., д. 5 А.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» РАМН.

Автореферат разослан «16» мая 2014 г

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

доктор медицинских наук Бурцева Елена Ивановна

Ирина Владимировна Яковлева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы.

Имеющийся к настоящему времени опыт применения холодоадаптированной (ХА) живой гриппозной вакцины в России и США показал, что этот препарат обладает наибольшей эффективностью при массовой вакцинации против гриппа, особенно детей. Следует отметить, что в отличие от инактивированных гриппозных вакцин живая вакцина способна защитить от инфекции дрейфовыми вариантами. В настоящее время для получения живой ХА гриппозной вакцины в России используют ХА штамм А/Ленинград/134/17/57(H2N2) [Александрова, Климов 1994], а в США - ХА штамм А/Энн Ap6op/6/60(H2N2) [Herlocher et al.,1996]. Эти штаммы-доноры аттенуации получены путем пассажей при пониженной температуре и их генетические маркеры были хорошо изучены [Гендон, 2011]. Однако, применяемый в России ХА штамм-донор А/Ленинград/134/17/57 оказался генетически гетерогенным [Киселева и сотр.2005] и обнаружил повышенную реактогенность для маленьких детей [Александрова, Климов 1994]. Учитывая это обстоятельство в НИИВС им. И.И. Мечникова был получен новый ХА штамм-донор аттенуации A/Kpaci годар/101 /35/59(H2N2) и выявлены мутации в РНК-сегментах его генома, кодирующих «внутренние» белки [Гендон Ю.З. и сотр, 2013]. Данный штамм обладал приемлемыми фенотипическими характеристиками. Однако до настоящего времени остается неясным, какие гены штамма А/Краснодар/101/35/59 (H2N2) содержат ключевые генетические детерминанты, ответственные за аттснуацию данного штамма (ts и ait фенотип). Эту проблему мы попытались решить с помощью создания панели одногенных и полигенных реассортантов, используя методы обратной генетики, с последующим изучением фенотипических и генотипических характеристик сконструированных реассортантов.

Также под вопросом остается возможность получения ХА реассортантов - кандидатов в живые гриппозные вакцины на базе ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2Ы2), которые обладают хорошими защитными свойствами, необходимыми для живых гриппозных вакцин. Всестороннее изучение биологических свойств реассортантов, полученных при скрещивании ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2К2) с эпидемическими штаммами вируса гриппа А, является необходимым условием для реальной оценки перспективности данного штамма как эффективного донора аттенуации для живых гриппозных вакцин.

Цели и задачи исследования.

Целью работы являлось изучение генетических основ аттенуации холодоадаптированного штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2Н2), а также исследование возможности ХА штамма А/Краснодар/101/3 5/59(Н2И2) образовывать при скрещивании с эпидемическими штаммами вируса гриппа ХА реассортанты, которые могли быть использованы по своим характеристиками в качестве живых гриппозных вакцин.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Получить ХА реассортанты путем классического скрещивания ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2Н2) с эпидемическими штаммами вируса гриппа А - А/Кумамото/102/02(НЗЫ2) и А/Берн/07/95(НШ1).

2. Изучить фенотипические характеристики ХА реассортантов, полученных при скрещивании ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2№) и эпидемических штаммов А/Кумамото/102/02(НЗШ) и А/Берн/07/95(НШ1).

3. Проанализировать антигенную специфичность и иммуногенность полученных ХА реассортантов.

4. Провести анализ генома полученных ХА реассортантов с помощью метода секвенирования.

5. Исследовать защитную эффективность ХА реассортантов, полученных между ХА штаммом А/Крашодар/101/35/59(Н2Ы2) и эпидемическим штаммом А/Берн/07/95(НШ1).

6. Заклонировать все 8 генов ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(Н21Ч2) в плазмиду pHW2000.

7. Получить с помощью трансфекции наборы одногенных и полигенных реассортантов между ХА штаммом А/Краснодар/101/35/59(Н2Ы2) и вирулентным штаммом АЛУЗИ/З3 (II1N1).

8. Исследовать й и са фенотип одногенных и полигенных реассортантов между ХА штаммом А/Краснодар/101/3 5/59(Н2№) и ААУ8Ы/33(НШ1).

9. Изучить аН фенотип одногенных и полигенных реассортантов, полученных между вирулентным штаммом вируса гриппа АЛУЭМ/ЗЗ и ХА штаммом вируса гриппа Л/Краснодар/101/35/59(Н2Ы2).

Научная новизна работы

Впервые исследованы генетические основы аттепуации ХА штамма А/Краснодар/101/35/59 - нового донора аттенуации для живых гриппозных вакцин. Показано, что РВ1 и N8 -гены данного штамма содержат ключевые детерминанты, определяющие его й и аН фенотип.

Анализ полученных нами реассортантов свидетельствует о доминировании генов, содержащих детерминанты, ответственные за сМ-фенотип, в составе генома реассортантов. Это говорит о безопасности применения живых гриппозных вакцин во время гриппозной эпидемии.

Показано, что ХА штамм А/Краснодар/101/35/5 9(Н2Ы2) является перспективным штаммом-донором аттенуации для ХА реассортантов, кандидатов в живые гриппозные вакцины.

Создана панель праймеров, позволяющая определять наследование генов у реассортантов вируса гриппа А сероподтипов Н2Ы2, НЗЫ2 и НШ1.

Практическая значимость.

Доказана возможность использования ХА штамма А/Краснодар/101/35/59 (H2N2) в качестве штамма-донора для живых рекомбинантных гриппозных вакцин.

Разработаны основные элементы плазмидной технологии для получения живых реассортантных гриппозных вакцин на базе клонированных 6 генов, кодирующих «внутренние» белки ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2Ы2) и 2-х клонированных генов, кодирующих поверхностные белки от любого эпидемического штамма вируса гриппа типа А. Это позволит в более короткие сроки получать вакцинные штаммы вируса гриппа, минуя трудоемкую стадию анализа генома реассортантов.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Все исследованные реассортанты, полученные нами при скрещивании ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(H2N2) и вирулентных штаммов А/Берн/07/95(Н IN 1 ) и А/Кумамото/102/02(НЗЫ2), обладают генетическими и фенотипическими маркерами, необходимыми для рекомбинантных живых гриппозных вакцин.

2. ХА штамм A/Kpaci i од ар/101/35/59(H2N2) можно рассматривать как перспективный донор аттенуации при получении ХА реассортантов для живой гриппозной вакцины.

3. Анализ одногенных и полигенных реассортантов, полученных с помощью обратной генетики между ХА штаммом А/Краснодар/101/35/59 (H2N2) и вирулентным штаммом A/WSN/33, свидетельствует о том, что ключевые детерминанты, ответственные за ts и au фенотип, локализованы в РВ1- гене и NS - гене штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2Ы2).

4. Анализ полученных нами реассортантов между ХА штаммом А/Краснодар/101/35/59(Н2Ы2) и вирулентным штаммом A/WSN/33(H1N1) указывает на доминирование генов, содержащих генетические детерминанты, ответственные за att фенотип, в составе генома реассортантов.

Этот факт говорит о безопасности применения живых гриппозных вакцин во время гриппозной эпидемии.

Апробация материалов диссертации и публикации

Материалы диссертации доложены на конференциях молодых учёных ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН (Москва, 2011, 2012, 2013), Young scientist workshop «Methods to study Influenza virus» (Berlin, Germany, 2011), первой всероссийской научной конференций молодых ученых-медиков «Инновационные технологии в медицине XXI века» (Москва, 2012), V Международной школе молодых учёных но молекулярной генетике «Непостоянство генома» (Звенигород, 2012).

Апробация диссертации состоялась 17 октября 2013 г. на научной конференции отдела вирусологии ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН.

По теме диссертации опубликовано 6 научных работ, включая 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и струюура диссертации

Материалы диссертации изложены на 92 страницах машинописного текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований с обсуждением полученных данных, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 20 таблицами и 2 рисунками. Библиография включает 95 отечественных и зарубежных источников.

Личный вклад автора заключается в непосредственном участии в выполнении всех разделов данного исследования, а также в проведении анализа полученных данных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

Вирусы, культуры клеток, куриные эмбрионы. В работе использовали ХА штамм-донор аттенуации А/Красподар/101 /3 5/59(H2N2), эпидемический

штамм A/KyMaMOTo/102/02(H3N2), эпидемический штамм

А/Берн/07/95(Н1Ш), эпидемический штамм А/Чили/01/83(НШ1), эпидемический штамм А/Москва/904/77(НШ1), штамм A/WSN/33(H1N1). Реассортанты, А/Кумамото/Rl, А/Кумамото/Ы2, А/КумамотоЖЗ были получены путем рекомбинации ХА штамма А/Краснодар/101/35/59 (H2N2) с эпидемическим штаммом АЛСумамото/102/02(НЗЫ2), реассортанты А/Берн/Rl, А/Берн/Я2 были получены путем рекомбинации ХА штамма А/Краснодар/101/35/59 (H2N2) с эпидемическим штаммом А/Берн/07/95. В работе использовали 9-11 дневные куриные эмбрионы (птицекомбинат «Птичное»), линия клеток MDCK была получена из института Пастера, Франция. Клетки MDCK и линию клеток 293Т культивировали по стандартной методике на среде Игла MEM (ФГУП «ПИПВЭ им. М.П. Чумакова» РАМН, Московская обл.) с 5% фетальной сывороткой телят фирмы «HyClone» (США). Линия клеток 293Т была получена из Американской коллекции АТСС.

Для определения инфекционного титра вирусов в ЭИД5о и накопления вирусов для последующих опытов куриные эмбрионы заражали по стандартной методике 10-кратными разведениями вируса в аллантоисную полость [Шубладзе А.К. и Гайдамович СЛ., 1954]. Наличие вируса в аллантоисной жидкости определяли по реакции гемагглютииации с 0,5% суспензией эритроцитов кур. Инфекционный титр вируса в ЭИДзо/0,2 мл рассчитывали по методу Кербера. Для определения ts и са фенотипа исследуемых штаммов проводили титрование одновременно при оптимальной, пониженной и повышенной температуре. Разницу в уровне репродукции вируса гриппа при разных температурах выражали величиной RCT (reproductive capacity at different temperatures), которая определяется как разница между инфекционным титром вируса при оптимальной температуре 34°С и титром при исследуемой температуре, измеряемым в lg ЭИД5о/0,2 мл.

Для получения реассортантов на основе ХА штамма вируса гриппа А/Краснодар/101/35/59 (H2N2) и эпидемических штаммов А/Кумамото/102/02(ПЗЮ) и А/Берн/07/95(Н1М) применяли метод рекомбинации (кросс-реактивации) описанный Полежаевым с сотрудниками (1978) и модифицированный в нашей лаборатории. Вируссодержащую аллантоиснуго жидкость разводили средой MEM 1:10 и вносили в чашки Петри. Инактивацию вируса осуществляли с помощью УФ-установки, снабженной УФ-лампой G8W Т5, Germicidal,288 mm. Инфицированные эмбрионы инкубировали в течение 18 час. при 32°С. Затем аллантоисную жидкость отсасывали и пассировали дважды в куриных эмбрионах в присутствии анти-сыворотки к сероподтипу H2N2 при 26°С. Полученные реассортанты клонировали в куриных эмбрионах методом предельных разведений.

Для определения репродукции вируса в лёгких мышей [Неведомская Г.Н. и др., 1992] группы самок беспородных мышей или самок мышей линии Balb/c (по 5-10 штук на группу) заражали интраназально под лёгким эфирным наркозом анализируемыми вирусами в инфекционном титре 107,5 ЭИД50/0,2мл (по 50 мкл на мышь). Через 72 часа после заражения у мышей извлекали легкие. Инфекционный титр вируса в 10% суспензии лёгких мышей определяли на куриных эмбрионах и выражали в ЭИД5о/0,2мл.

Для определения защитной эффективности ХА реассортантов группы мышей иммунизировали под лёгким эфирным наркозом реассортантами в инфекционном титре 106,5 ЭИД50/0,2мл (по 50 мкл на мышь). Затем через 21 день мышей повторно иммунизировали теми же штаммами. По прошествии 10 дней мышей заражали дикими, вирулентными штаммами и через 3 дня из мышей извлекали лёгочную ткань и определяли репродукцию вируса в легких.

Для изучения нейровирулентности реассортантов для мышей-сосунков использовали несколько модифицированную методику Сугиуры

[Sugiura A. et al, 1979]. В экспериментах использовали мышей-сосунков из пометов самок беспородных белых мышей. Вируссодержащую жидкость в дозе 104'° ЭИД50/50мкл вводили интрацеребрально. Наблюдение за инфицированными мышами проводили в течение последующих двух недель.

Выделение вирусной РНК из аллантоисной жидкости или из вируса, концентрированного центрифугированием, проводили при помощи набора для очистки РНК из сыворотки крови (ООО «Лаборатория Изоген», (Москва) в соответствии с рекомендацией производителя.

ПЦР ставили с высокоточной полимеразой Tersus ( ЗАО «Евроген», Москва) в соответствии с рекомендациями производителя.. Обратную транскрипцию ставили отдельно от ПЦР при помощи ревертазы M-MuLV («СибЭнзим», г. Новосибирск). ПЦР-продукты анализировали методом электрофореза в 1,5% агарозном геле, содержащем 1 мкг/мл бромистого этидия, под напряжением 5 вольт/см. Очистку полученных ПЦР-продуктов из легкоплавкой агарозы осуществляли при помощи набора компании Fermentas

Плазмиды и бактерии.

В экспериментах использовали плазмиду pHW2000 [Hoffmann et al., 2000], разработанную для получения вируса гриппа методом обратной генетики. Плазмида pHW2000, а также плазмиды со вставками генов штамма вируса гриппа A/WSN/ЗЗбыли любезно предоставлены доктором Вебстером (Мемфис, США). Для накопления плазмид использовали штамм Exoli DHSalpha. Работа с бактериями, рестрикция и лигирование проводились по стандартным методикам [Маниатис и др., 1984] или в соответствии с рекомендациями производителя для соответствующих ферментов (Т4-лигаза, рестриктазы Esp31 и ЕсоЗП).

Компетентные клетки были созданы по методике Ханаана [Ханаан, 1998].

Секвепирование.

Для секвенирования использовались ПЦР-продукты, очищенные на колонках Wizard («Promega», США). Секвенирование проводилось фирмой Евроген на автоматическом секвенаторе MegaBACE-500. Для анализа нуклеотидных последовательностей, а также для подбора праймеров для ПЦР и секвенирования, использовали пакеты программ VectorNTI 10.0. Синтез праймеров осуществлялся фирмой «Литех» (Москва).

Трансфекция

Трансфекцию проводили при помощи реагента Lipofectamine LTX (Invitrogen) либо в кокулмуру клеток 293Т и MDCK по методике, описанной ранее [Hoffmann et al.,2000], либо в однодневный монослой клеток 293Т (плотность клеточного монослоя около 70%) в соответствии с методикой, прилагаемой к реагенту Lipofectamine LTX.

Статистическая обработка результатов экспериментов.

Статистическая обработка проводилась с использованием среднего квадратического отклонения и коэффициента Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение ХА реассортантов, полученных классическим методом кросс-реактивации.

На первых этапах работы были исследованы ts и са фенотип партнеров по скрещиванию. ХА штамм А/Краснодар/101/35/59 полностью утратил способность размножаться при 40°С и 38°С, но хорошо размножался при 34°С и 26°С. При заражении куриных эмбрионов ХА штаммом инфекционные титры вируса при 34°С составляли 1075 ЭИД5О/0.2мл, при 26°С - 1055 ЭИД50/0.2 мл, и при 38°С - менее 101" ЭИД50/0,2 мл. В то же время, титры вирулентного штамма А/Кумамото/102/02 (H3N2) составляли 106 5 ЭИД50/О,2мл при 40°С, а при 26°С этот штамм не размножался. Другой эпидемический штамм А/Берн/07/95 активно размножался при 38°С (титр -

1065 ЭИД50/0,2мл), при 34°С (титр - 1075 ЭИД50/0,2 мл) и так же не размножался при 26°С (Табл. 1).

Таблица 1. Титр вируссодержащей жидкости в куриных эмбрионах у штаммов-партнёров по реассортации

Штаммы-партнеры по реассортации Титр вируссодержащей жидкости в куриных эмбрионах, ЭИД5(/0,2 мл

При 26° При 34° При 38°-40°

АЛСраснодар/101/35/59(Н2№) 5.5 7.5 <1.0

А/Кумамота/102/02(ЮЫ2) <1.0 7.5 6.5

А/Берн/07/95(ШШ) <1.0 7.5 >6.5

Реассортанты были получены методом кросс-реактивации, используя инактивированные УФ-облучением вирулентные штаммы. Таким методом в нашей лаборатории были получены: 3 реассортанта на основе дикого штамма А/Кумамото/102/02(НЗЫ2) и 2 реассортанта на основе штамма А/Берн/07/95(НШ1).

Тя и са маркеры являются важнейшими маркерами аттенуации для реассортантов-кандидатов в живые гриппозные вакцины. Поэтому на следующем этапе были исследованы данные генетические признаки у полученных реассортантов. Как видно из таблицы 2, все реассортанты, полученные при скрещивании ХА штамма А/Краснодар/101/35/59 и вирулентного штамма А/Кумамото/102/02, в отличие от своего вирулентного родителя утеряли способность размножаться при 40°С. С другой стороны, все полученные реассортанты приобрели способность к активному размножению при пониженной температуре 26°С. Реассортанты, полученные при скрещивании ХА штамма А/Краснодар/101/35/59 и вирулентного штамма А/Берн/07/95 также практически утеряли способность к размножению при 38°С, однако приобрели способность к размножению при 26°С (табл. 3). Полученные факты свидетельствуют о том, что все изученные реассортанты обладают четко выраженным & и са фенотипом.

Таблица 2. Титр вируссодержащей жидкости в куриных эмбрионах у реассортантов, полученных при скрещивании ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2Ш') и вирулентного штамма А/Кумамото/102/02(НЗИ2)_

Номер реассортанта или вирус Титр вируссодержащей жидкости в куриных эмбрионах, ^ (ЭИД5о'0Д мл) К-СТ признак (различие в репродукции при заданной и оптимальной температуре) ^(ЭИД5о/0,2мл)

При 2б°С При 34°С При 40°С ыст26 ЯСТцо

А/Кумамото/Ш 5.0 7.5 <1.0 2,5 7.5

А/ Кумамото Ж2 6.0 8.0 <1.0 2 8.0

А/ Кумамото Я13 5.5 7.5 <1.0 2 7.5

А/Кумамото /102/02 <1.0 7.5 6.5 7.5 1

А/Краснодар/101/35/59 5.5 7.5 <1.0 2 7.5

Таблица 3. Титр вируссодержащей жидкости в куриных эмбрионах у реассортантов, полученных при скрещивании ХА штамма А/Краснодар/101/35/59 (Н2Ы2)и вирулентного штамма А/Берн/07/95(НШ1)

Номер реассортанта или вирус Титр вируссодержащей жидкости в куриных эмбрионах, ^ ЭИДад'0,2 мл ЖТ признак (различие в репродукции при заданной и оптимальной температурой) 1йЭИДя/0,2мл

При 26° При 34° При 38° кст25 Р1СТИ

А/Бсрн/Я1 5.0 7.5 <1.0 2,5 7.5

А/Берн 1Ю. 5.0 >8.0 <1.0 3 8.0

А/Берн/07/95 <1.0 7.5 >6.5 7,5 I

А/Краснодар/101/35/59 5.5 7.5 <1.0 2 7.5

На таблице 4 представлены данные по анализу антигенной специфичности реассортантов, полученных при скрещивании ХА штамма А/Краснодар/101/35/59 и вирулентного штамма А/Кумамото/102/02. Как видно из таблицы, титры сывороточных антител в РЗГА при взаимодействии вирусов с антисывороткой к НЗШ серотипу достигали высоких значений (1:640), в то время как ни один из полученных реассортантов не реагировал с антисывороткой к Н2М2-серотипу. На таблице 5 представлены данные по анализу антигенной специфичности реассортантов, полученных при скрещивании ХА штамма А/Краснодар /101/35/59 и вирулентного штамма А/Берн/07/95. Реассортанты активно реагировали с антисывороткой к НШ1 —

серотипу, и не реагировали с антисывороткой к Н2Ш-серотипу. Полученные

данные свидетельствовали о том, что реассортанты унаследовали ген,

кодирующий гемагглютинин, от вирулентных штаммов.

Таблица 4. Анализ антигенной специфичности реассортантов, полученных при скрещивании ХА штамма А/Краснодар/101/3 5/59(Н2Ю) и вирулентного

Исходные штаммы и реассортанты Титр сывороточных антител в РЗГА при взаимодействии вирусов с антисыворотками

Анти-НЗЫ2 Анти-Н2№

АЛСумамото/102/02(НЗ№) 1:640 <1:10

А/Краснодар/101/35/59(Н2№) <1:10 1:320

А/КумамотоЛИ 1:640 <1:10

Л/КумаиотоЖ2 1:640 <1:10

А/Кумамото/Ю 1:640 <1:10

Таблица 5. Анализ антигенной специфичности реассортантов, полученных при скрещивании ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2Ш) и вирулентного

Исходные штаммы и реассортанты Титр сывороточных антител в РЗГА при взаимодействии вирусов с антисыворотками

А1ГГИ-НШ1 Анти-Н2Ы2

А/Берн/7/95(Н1Ш) 1:320 <1:10

А/Краснодар/101/35/59(Н2№) <1:10 1:320

А/Берн/Ш 1:160 <1:10

А/Берн/М 1:320 <1:10

Представляло интерес исследовать также иммуногенную активность полученных реассортантов при интраназальном введении вирусного материала мышам. В таблице 6 представлены данные по изучению иммуногенности реассортантов, полученных при скрещивании ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2Ш) и вирулентного штамма

А/Кумамото/102/02(НЗ№). Как видно из таблицы, титр антител в сыворотке крови мышей, иммунизированных интраназально реассортантами А/Кумамото/Ш, А/Кумамото/112, А/Кумамото/ЯЗ в дозе 6,5 ^ после двукратной иммунизации равнялся соответственно 1:80-1:160,1:160 и 1:80. В таблице 7 представлены данные по изучению иммуногенности

реассортантов, полученных при скрещивании ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2Ы2) и вирулентного штамма А/Берн/07/95(НШ1). Как видно из данной таблицы, титр антител в сыворотке крови мышей, иммунизированных диким штаммом А/Берн/07/95(Н1Ы1), равнялся 1:320. Титры антител в сыворотке крови мышей, иммунизированных реассортантами А/Берн/Ш и А/Берн/К2, равнялись соответственно 1:801:160 и 1:320. Полученные факты свидетельствуют о сравнительно высокой иммуногенности полученных й- реассортантов на базе штамма А/Краснодар/101/35/59 (Н2Ш).

Таблица 6. Иммуногенная активность реассортантов, полученных при скрещивании ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2Ю) и вирулентного штамма А/Кумамото/102/02(НЗМ2)._

Сыворотка Антигены

А/Кумамото/102/02 А/Кумамото/Ш А/КумамотоЖ2 А/Кумамото/КЗ

АЛСумамото/102/02 320 320 160 160

А/Кумамото/Ш 320 80-160 - -

АЛСумамотоЖ2 320 - 160 -

А/КумамотоЛ13 160 - - 80

Неимунная <10 <10 <10 <10

Таблица 7. Иммуногенная активность реассортантов, полученных при скрещивании ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2Ш) и вирулентного

Сыворотка Антигены

А/Берн/07/95 А/Берн/Ш А/Берн/Я2

АЛЗерн/07/95 160 320 320

А/Берн/Ш 160 80 -

А/Берн®2 320 - 320

Неимунная <10 <10 <10

Далее был проведен анализ генома реассортантов, полученных методами «классической» реассортации. Из множества доступных методов был выбран метод секвенирования. Предварительно мы провели подбор эффективных праймеров для каждого РНК-сегмента генома реассортантов, что позволило оптимизировать работу. Результаты анализа генома

реассортантов, полученных при скрещивании ХА штамма А/Краснодар/101 /35/59(Н2№) и вирулентного штамма

А/Кумамото/102/02(НЗЫ2) представлены в таблице 8.

Таблица 8. Результаты анализа генома реассортантов, полученных при скрещивании ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2Ш) и вирулентного штамма А/Кумамото/102/02(НЗИ2)._____

Ген Реассортант НА ЫА РВ1 РВ2 РА ЫР М N8

А/Кумамото/Ш ДТ ДТ ХА ЬХАл, ■¿ХА;,:;

АЛСумамотоЖ2 ДТ ДТ •' ХА ■ -МХА1"; . ХА ■ ХА

А/Кумамото^З ДТ ДТ ХА ХА ХА

Как видно, все исследованные реассортанты имели 6 генов, кодирующих «внутренние» белки от ХА штамма, и 2 гена, кодирующих поверхностные белки-гликопротеиды от вирулентного штамма АЛСумамото/102/02(НЗК2). Следующая таблица показывает результаты анализа генома реассортантов полученных при скрещивании ХА штамма А/Краснодар/101/35/5 9(Н2Ш) и вирулентного штамма А/Берн/07/95(Н1Ш). Как видно из таблицы 9, данные реассортанты также унаследовали 6 генов, кодирующих «внутренние» белки от ХА штамма, и 2 гена, кодирующие гемагглютюшн и нейраминидазу, от вирулентного штамма А/Берн/07/95.

Таблица 9. Результаты анализа генома реассортантов, полученных при скрещивании ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2Ш) и вирулентного штамма А/Берн/07/95(НШ1)._____

Ген Реассортант"—^ НА ИА РВ1 РВ2 РА ИР м

А/Берн/Ю ДТ ДГ

А/Берн/М ДТ ДГ ХА ХА

Полученные данные свидетельствуют о том, что полученные реассортанты, во-первых, имеют наиболее оптимальное сочетание генов, и, во-вторых, имеют гены, кодирующие нейраминидазу, от вирулентных штаммов.

В опытах на мышах нами также была исследована защитная эффективность ХА реассортантов А/Бсрн/М и А/Берн/112. Мышей вакцинировали дважды интраназалыю ХА реассортантами в дозе 6 ^ ЭИД5О/0,05 мл с последующим инфицированием различными дозами вирулентного родительского штамма А/Берн/07/95(НШ1) и дрейфовых вариантов А/Чили/01/83(НШ1) и А/Москва/904/77(НШ1). Титры вируса в легких при заражении невакцинированных мышей составляли: для штамма А/Берн/07/95 - 3,5 ЭИД50/0.2 мл, для штамма А/Чили/01/83(Н1Ш) - 2 ^ ЭИД5о/0,2 мл и для штамма А/Москва/904/77(НШ1) - 1 ^ ЭИД50/0,2 мл. У вакцинированных мышей в легких не наблюдалось вирусного размножения как при заражении родительским штаммом А/Берн/07/95(НШ1), так и при заражении дрейфовыми вариантами. Этот факт свидетельствует о том, что ХА реассортанты, полученные нами, обеспечивают защиту не только против родительского вируса, но и против дрейфовых вариантов вируса гриппа.

Таблица 10. Защитная эффективность ХА реассортнатов, полученных при скрещивании между ХА А/Краснодар/101/59(Н2Ы2) и вирулентным штаммом А/Берн/07/95(НШ1)_

Дикий штамм вируса гриппа А Титр дикого вируса в легких мышей 1% ЭИДзо/0,2 мл

Контроль, невакцинированные мыши Мыши, вакцинированные ХА реассортантами

А/Берн/Ш А/Берн/И2

А/Берн/07/95 3,5 0 0

А/Чили/01/83 2,0 0 0

А/Москва/904/77 1,0 0 0

• Приведены данные одного га 3-х опытов.

Изучение реассортантов между ХА штаммом А/Краснодар/101/35/59(Н2ГО) и вирулентным штаммом А/\У8ГШЗ(НШ1), полученных методом обратной генетики.

На первой стадии работы был исследован й и са фенотип одногенных реассортантов между ХА штаммом А/Краснодар/101/35/59 и штаммом

АЛУ8М/33 (табл. 11). Было показано, что исходный эпидемический штамм А/АУ8Ы/33(НШ1) обладал одинаковой репродуктивной способностью при 34°С и 38°С и не размножался при 25°С.

Таблица 11. Изучение « и са фенотипа одногенных реассортантов между штаммами вируса гриппа АДУ8Ы/33(НШ1) и ХА А/Краснодар/101/35/59(Н2Ю)

Исходные вирусы и реассортанты Генотип реассортанта Титр вируса lg ЭИДзо/0,2 мл Фенотип

34°C 38°C 25°C

A/WSN/33 РВ2 РВ1 PA HA NP NA M NS 6,5±0,5 6,25±0,4 1,0

А/Краснодар/ 101/35/59 PBS )'A HA NP K\ M NS 6,25±0,5 <1,0 5,5±1,0 ts, ca

1 РВ1 PA HA NP NA M NS 5,0±0,5 4,5±0,5 <1.0

2 РВ2 JRBJ PA HA NP NA M NS 6^±0,32 1,5+0,4 1,5±0,4 is

3 РВ2 PBl > PA HA NP NA M NS 6,25±0Д5 б,5±ОД8 1,5±0,4

4 РВ2 PB1 PA HA NP NA M NS 5,75±0,74 6,0±0,86 <1,0

5 РВ2 PBl PA HA NP NA Й NS 4,75±0,25 3,75±0,2 <1,0

6 РВ2 PBl PA HA NP NA M NS 6,5±0,4 <1.0 U±0,57 Is

РНК- сегменты генома АА¥$№33 - выделены черным шрифтам РНК-сегменты генома А/Краснодар/101/35/101 - выделены серой заливкой

С другой стороны ХА вакцинный штамм хорошо размножался в куриных эмбрионах при 34°С и не размножался при повышенной температуре (38°С). Однако, включение генов ХА штамма в геном вирулентного штамма A/WSN/33(H1N1) сопровождалось различными эффектами. В частности, добавление единичных РНК-сегментов из генома штамма А/Краснодар/101/35/59, кодирующих белки РВ1 и NS1/NS2 в геном вирулентного штамма приводило к появлению реассортантов, неспособных к размножению при 38°С, либо обладающих слабым размножением в этих условиях. Включение единичных РНК-сегментов, кодирующих белки ХА штамма РВ2, РА и NP приводило к появлению реассортантов, не отличающихся по is и са фенотипу от вирулентного штамма A/WSN/33. А РНК-сегмент, кодирующий белки ХА штамма М1/М2, включенный в геном вирулентного штамма, давал полученным реассортантам промежуточную степень размножения при 38° С.

Включение большего количества РНК-сегментов генома ХА штамма в геном вирулентного штамма АЛУБМ/ЗЗ приводило к появлению большего числа реассортантов, обладающих ts фенотипом, а также большей выраженностью этого фенотипа. Дополнительное включение РВ1-гена от ХА штамма в состав реассортантов имело следствием формирование у этих реассортантов выраженного ¿у фенотипа. К аналогичному эффекту приводило дополнительное включение ЫБ-гена от ХА штамма в геном полигенных реассортантов (Табл. 12).

Таблица 12. Изучение ¿5 и са фенотипа полигенных реассортантов между штаммами вируса гриппа ЛУШЗШЗЗ (НШ1) и ХА А/Краснодар/101/35/59 (Н2Ю)_'____

Исходные вирусы и реассортанты Генотип реассортанта Титр вируса ЭИД»/0,2 мл Фенотип

34°С 38°С 25°С

АЛУБШЗ РВ2 РВ1 РА НА ИР ИА М № 6,5±0,5 6,5±0,4 <1,0

А/Краснодар/101 /35/59 РВ2 РВ1 РА НА № 1ЧА М N¡4 6,0±0,5 <1,0 5,5±1,0

7 РВ2 РЕИ РА НА да ИА м иэ 6,5±0,24 <1,0 2,5±1,0 м

8 РВ2 РВ1 РА НА да ИА м N3 б,0±0,56 4,25±1,0 <1,0

9 РВ2 ■ РВ1-- 1'Д НА да ЫА м N8 6,0±0,5 1,0 1,5±0,4 ts

10 РВ2 РВ1 РА НА да ИА м .N8 5,5±0,75 <1,0 <1,0 м

11 РВ2 РВ1 РА НА да КА м N8 5,0±1,0 3,75±0,75 <1,0

12 РВ2 РВ1 РА НА да ЫА м. N5-. 5,5±0,78 <1,0 <1,0 и

13 РВ2 РВ1 РА НА да КА м N8- 5,5±0,75 <1,0 <1,0 и

14 РВ2 РВ1 РА НА да ИА м N8' 5,25±0,2 <1,0 1,5±0,4 к

15 РВ2 РВ1 РА НА да ЫА м N5 5,5±0,75 <1,0 <1,0

При изучении са фенотипа реассортантов, т.е. способности размножаться при 25°С, было установлено, что вирулентный штамм АЛУБЫ/ЗЗ практически не размножался при 25°С, в то время как ХА штамм активно размножался при данной температуре до титров 5,5-6,0 Все полученные одногенные реассортанты характеризовались слабым размножением при 25°С, не превышая титров Ю10- 1015 ЭИД5о/0.2мл. Из полученных данных можно предположить, что для активного размножения ХА штамма при 25 °С необходима функциональная активность большей части, если не всей совокупности, мутантных белков ХА штамма.

На следующем этапе нашей работы мы попытались исследовать вирулентность наших одногенных реассортантов для мышей (Табл. 13). Аттенуация реассортантов оценивалась по их способности реплицироваться в легочной ткани мышей после интраназальной инокуляции. Инфицирование вирулентным штаммом приводило к размножению вируса в назальном эпителии мышей и в легких, в то время как репликация вакцинного штамма наблюдалась только в верхних дыхательных путях.

Таблица 13. Размножение одногенных реассортантов между штаммами вируса гриппа ШЪМ/33(НШ1) ИХА А/Краснодар/101/35/59 (Н2Ю) в респираторном тракте мышей при интраназальном введении._

Исходные вирусы и реассортанты Генотип реассортанта Титр вируса в носоглотке мышей эи/ь/ 1.0 8) Титр вируса в легких мышей (^ЭИДя/ 1-ОЕ) Фенотип

АЛУ8№33 РВ2 РВ1 РЛ НА ИР КА М N8 5,5±0,50 5,16±0,56

А/Краснодар/101 /35/59 РВ2 РВ1 РА НА № ЫА м N3 3,5±0,50 <1,0 ап

1 РВ2 РВ1 РА НА ЫР ЫА м N5 5,0±0,25 4,5±0,81

2 РВ2 РВ1 РА НА № ЫА м ЫБ 4,40±0,14 2,0±0,70 ап

3 РВ2 РВ1 -РА НА МА м N8 4,5±1;0 3,5±0,91 оЯ(+/-)

4 РВ2 РВ1 РА НА ИА м N5 4,5±0,81 5,0±0,50

5 РВ2 РВ1 РА НА № ИА :М N8 4,6±0,62 3,5±0,40 ап(Щ

6 РВ2 РВ1 РА НА ИР ЫА М N8 3,0±0,70 <1,0 аи

Как и ожидалось, все одногенные реассортанты реплицировались в назальной полости мышей. Однако было обнаружено, что степень размножения одногенных реассортантов в легочной ткани мышей значительно колебалась. Одногенные реассортанты, содержащие единичные гены из генома вакцинного штамма, кодирующие белки РВ2 и ЫР, размножались в легких мышей с такой же интенсивностью, как и вирулентный штамм А/^Л^Ы/ЗЗ. Реассортанты, содержащие единичные РВ1-ген или Ив-ген от ХА вакцинного штамма, значительно снизили либо полностью утратили способность размножаться в легких мышей.

Дополнительное включение генов ХА штамма в геном вирулентного штамма в большинстве случаев приводило к более выраженному проявлению аттенуационного фенотипа. Во всех изученных комбинациях генов из геномов вакцинного и вирулентного штамма просматривается доминирование РВ1 и NS-генов, полученных от ХА вакцинного штамма А/Краснодар/101/35/59 в отношении att фенотипа (табл. 14).

Таблица 14. Размножение полигенныхреассортантов между штаммами вируса гриппа АШЫ/33(НШ1) и А/Краснодар/101/35/59(Н2Ж) в респираторном тракте мышей при интраназальном введении.__

Исходные вирусы и реассортанты Генотип реассортанта Титр вируса в носоглотке мышей (lg ЭИД50/ 1-0 g) Титр вируса в легких мышей (Ig ЭИД50/ 10 g) Фенотип

A/WSN/33 РВ2 РВ1 РА НА NP NA M NS 4,5±0,40 5,5±0,40

А/Краснодар/101 /35/59 РВ2 РВ1 РА 'НА NP NÂ-, M \s 3,5±0,70 <1,0 ail

7 РВ2 РВ1 .РА- НА NP NA M NS 4,0±0,40 2,0±0,40 att

8 КВ2" РВ1 РА НА № NA M NS 5,0±0,61 6,0±0,40

9 РВ2 tPBl. РА НА NP NA M NS 5.ШЛ2 2,0±1,10 att

10 РВ2 РВ1 РА НА NP NA M ■HS 3,5±0,40 <1,0 att

11 РВ2 РВ1 РА НА \1' NA M, NS 4,25±0,53 4,75±0,24

12 РВ2 РВ1 РА НА NP NA M NS 3,5±0,65 <1,0 att

13 РВ2 РВ1 РА НА NP NA M NS 3,75±0,32 <1,0 att

14 РВ2 РВ1 РА НА NP NA M NS 3,75±0,93 <1,0 att

15 РВ2 РВ1 РА НА NP NA M NS 3,25±0,53 <1,0 att

Вместе с тем, одногенные реассортанты с включением РА-гена и М-гена от ХА штамма обладали сниженной способностью к размножению в легких мышей по сравнению с вирулентным штаммом, что указывало на то, что эти реассортанты были частично атгенуированы. Мы можем предположить, что эта частичная атгенуация может объясняться либо наличием экстрагенной супрессии, либо эффектом констелляции генов.

Известно, что штамм АЛУЗЫ/ЗЗ обладает нейровирулентостью для мышей [8сЬи1тап, Ра1е5е, 1977; вгщшга, иес1а, 1979]. В этой связи представляло интерес исследовать нейровирулентность полученных нами

одногенных и полигенных реассортантов. Предварительные эксперименты показали, что штамм А/Краснодар/101/35/59 не вызывал гибель мышей-сосунков при интрацеребралыюм заражении.

Таблица 15. Изучение нейровирулентности одногенных и полигенных реассортантов между штаммами вируса гриппа А/1¥БЬ!/33(N¡N1) И ХА А/Краснодар/101/35/59(Н2Ш)._'_____

Исходные вирусы и реассортанты Генотип реассортанта Нейровирулентность для мышей сосунков

А/игеШЗ РВ2 РВ1 РА НА ЫР ИА М 11/13

А/Краснодар/101/ 35/59 РВ2 РВ1 РА НА-- м- № 0/9

1 РВ2 РВ1 РА НА ЫР ЫА М ыя 11/11

2 РВ2 да: РА НА ЫР ЫА м ЫБ 0/10

3 РВ2 РВ1 РА НА ЫР КА м ЫБ 2/10

4 РВ2 РВ1 РА НА Щр" ЫА м № 6/9

5 РВ2 РВ1 РА НА ЫР ЫА м № 4/10

6 РВ2 РВ1 РА НА ЫР ЫА м N3 - ^ 0/8

7 РВ2 РВ! " НА"! НА ЫР ЫА м № 0/11

8 РВ2 РВ1 РА НА да-: ЫА м N8 9/9

9 РВ2 РВ1 РА ■ НА № ЫА м N8 3/13

10 РВ2 РВ1 РА НА ЫР ЫА м N8 0/8

11 РВ2 РВ1 РА НА ЫР ЫА м- № 0/9

12 РВ2 РВ1 РА НА ЫР ЫА м 2/10

13 РВ2 РВ1 РА НА ЫР ЫА м кэ 11/13

14 РВ2 РВ1 РА ПА ЫР ИА м 0/9

15 РВ2 РВ1. РА НА ЫР ЫА м N8 11/11

Как видно из таблицы 15, включение генов ХА штамма в геном штамма АЛУБК/ЗЗ сопровождалось различными эффектами. Включение РВ1 гена или N5 гена в геном штамма АЛУБМ/ЗЗ приводило либо к полной потере нейровирулентости, либо к её существенному снижению. Реассортанты с включением РВ2-гена или ИР-гена от ХА штамма обладали значительно более высокой вирулентостыо.

В целом, при изучении нейровирулентности реассортантов для мышей-сосунков аттенуационный фенотип был более выражен, поскольку наблюдался у большего количества реассортантов.

В определенной степени и са фенотип мог быть обусловлен мутациями в генах, кодирующих «поверхностные» белки вириона:

гемагглютинин и нейраминидазу. Чтобы выяснить этот вопрос, нами были получены реассортанты между штаммом АЛУЗЫ/ЗЗ и ХА штаммом, которые включали единичные гены, кодирующие НА и ИА-гены от ХА штамма. Как видно из таблицы 16, оба реассортанта по 15 и са фенотипу не отличались от вирулентного штамма АЛУЗЖЗЗ.

Таблица 16. Изучение и са фенотипа реассортантов между штаммами вируса гриппа А/1¥БШЗЗ(НШ1) ИХА А/Краснодар/10¡/35/59(112N2), унаследовавших единичные гены, кодирующие НА- и ЫЛ- белки ХА штамма

Исходные вирусы и реассортанты Генотип реассортанта Титр вируса lg ЭИДя/0,2 мл Фенотип

34°С 38°С 25°С

A/WSN/33 РВ2 РВ1 | РА НА NP NA M NS 6,5±0,5 6,25±0,4 1,0

А/Краснодар/101 /35/59 РВ2 РВ1 РА ЯА. NP ,NA M NS 6,0±0,5 <1,0 5,5±1,0 ls, са

16 РВ2 РВ1 РА НА NP NA М NS 6,0±0,5 6,0±0,5 1,0

17 РВ2 РВ1 РА НА NP NA М NS 5,0±0,4 5,5±0,5 1,0

При анализе реассортантов видно, что они различаются по своим характеристикам. В этой связи появляется возможность распределения их в несколько групп. В группу I попадают реассортанты, сходные по своим характеристикам с вирусом дикого типа. В данную группу можно поместить одногенные реассортанты 1, 3, 4 (РВ2, NP) и полигенные реассортанты 8, 11. В группу II можно включить реассортанты, тождественные по характеристикам ХА вакцинному штамму: одногенные реассортанты 2, 6 (РВ1, NS), и полигенные реассортанты 7, 9, 10, 14, 15. Реассортанты с промежуточными характеристиками можно включить в группу III. Все исследованные реассортанты, входящие в эту группу, размножались в носовом эпителии мышей, однако с разной интенсивностью. Так, в частности, реассортанты, входящие в группу Illa, активно размножались в назальном эпителии, в то время как входящие в группу Illb размножались значительно хуже (М, РА). Перенос PBl-гена или NS- гена ХА штамма в геном вируса A/WSN/33 приводил к значительному снижению репродукции соответствующих одногенных реассортантов при 38°С, а также полному

подавлению репродукции вируса в легких мышей и снижению летальности мышей сосунков. Обзор характеристик полигенных реассортантов показывает, что любое включение комбинации генов ХА-штамма - донора аттенуации, в состав которой входят РВ1- ген или NS-ген, вызывает повышение экспрессии как ts фенотипа, так и att фенотипа. Полученные результаты позволяют сделать вывод, что PBl-ген и NS-ген ХА штамма А/Краснодар/101/35/59 содержат ключевые детерминанты, определяющие ts фенотип и ait фенотип данного ХА штамма. В этом отношении штамм А/Краснодар/101/35/59 несколько отличается от хорошо изученных штаммов -доноров А/ Энн Арбор /6/60 и А/Ленинград/134/17/57, у которых детерминанты, определяющие ts фенотип и ait фенотип связаны с генами, кодирующими белки РВ1 и РВ2.

ВЫВОДЫ.

1. Реассортанты, полученные при скрещивании ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(H2N2) и эпидемических штаммов А/Кумамото/102/02(H3N2) и А/Берн/07/95(НШ1), обладают биологическими свойствами, необходимыми для реассортантов-кандидатов в живые гриппозные вакцины.

2. Анализ одногенных и полигенных реассортантов, полученных методами обратной генетики между ХА штаммом А/Краснодар/101/35/59(H2N2) и вирулентным штаммом A/WSN/33(H1N1), свидетельствует о том, что РВ1- ген и NS- ген ХА штамма содержит ключевые детерминанты, ответственные за ts фенотип и att фенотип данного штамма.

3. Анализ att фенотипа полигенных реассортантов свидетельствует о доминировании генов, содержащих детерминанты, ответственные за att фенотип в составе генома реассортантов. Этот факт позволит сделать вывод о

безопасности применения живых гриппозных во время гриппозной эпидемии.

4. Полученные факты свидетельствуют об отсутствии мутаций, ответственных за формирование is фенотипа, в генах ХА штамма А/Краснодар/101/35/59, кодирующих поверхностные белки НЛ и NA.

5. XA штамм А/Краснодар/101/35/59(H2N2) можно рассматривать как перспективный штамм-донор для реассортантов-кандидатов в живые гриппозные вакцины.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Terekhov A. Analysis of reassortants on the base of А/Krasnodar/101/35/59(H2N2) cold-adapted strain and H1N1 and H3N2 wild-type influenza virus strains / Terekhov A. // Young scientist workshop «Methods to study influenza virus». Berlin, Germany. - 2011. - P. 48-49.

2. Терехов A.B. Анализ реассортантов, полученных на основе ХА штамма вируса гриппа А/Краснодар / Терехов A.B., Цфасман Т.М., Маркушин С.Г. // V Международная школа молодых ученых по молекулярной генетике «Непостоянство генома». Звенигород. - 2012. - С. 64.

3. Терехов A.B. Получение холодоадаптированных (ХА) реассортантов-кандидатов в живые гриппозные вакцины на базе нового штамма-донора аттенуации А/Краснодар/101/35/59(Н2Ы2) и выявление генетических детерминант, ответственных за его полезные биологические свойства, с помощью методов генной инженерии / Терехов A.B., Цфасман Т.М., Маркушин С.Г. // Первая всеросийская научная конференция молодых ученых-медиков «Инновационные технологии в медицине XXI века». Москва. - 2012.- С. 316-317.

4. Терехов A.B. Генетические основы аттенуации холодадаптированного штамма А(Н2Ы2)/Краснодар/101/3 5/59 - донора для живых гриппозных вакцин / Терехов A.B., Цфасман Т.М., Маркушин С.Г., Коптяева И.Б.,

Лисовская К.В., Кост В.Ю. // Эпидемиология и вакцииопрофилакгика. -2013.-№3(70).-С. 70-77.

5. Терехов A.B. Изучение att-фенотипа реассортантов между вирулентным штаммом гриппа A(HlNl)/WSN/33 и вакцинным холодоадаптированным штаммом вируса гриппа А(Н2К2)/Крас1Юдар/101/35/59 / Терехов A.B., Цфасман Т.М., Маркушин С.Г., Коптяева И.Б., Лисовская К.В., Кост В.Ю. // Эпидемиология и вакцинопрофиластика. - 2013. - № 5 (72). - С. 41-47.

6. Терехов A.B. Генетические основы аттенуации холодадаптированного штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2Ы2) / Терехов A.B., Кост В.Ю., Цфасман Т.М., Маркушин С.Г. // Материалы конференций молодых ученых. Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова Российской академии медицинских наук, 2008-2013 гг. Москва. - 2013. - С. 260-272.

Подписано в печать:

13.05.2014

Заказ № 10018 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Терехов, Андрей Вадимович, Москва

Федеральное государственное бюджетное учреждение «НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» Российской академии медицинских наук

На правах рукописи

04201458669

Терехов Андрей Вадимович

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ АТТЕНУАЦИИ ХОЛОДОАДАПТИРОВАННОГО ШТАММА-ДОНОРА ДЛЯ ЖИВЫХ ГРИППОЗНЫХ ВАКЦИН - А/КРАСНОДАР/Ю1/35/59(Н2М2)

Специальность 03.02.02 - "Вирусология" Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научные руководители: доктор медицинских наук Маркушин Станислав Георгиевич, кандидат биологических наук Цфасман Татьяна Михайловна.

Москва-2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.....................................................................................4

ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................................6

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ......................................................................11

1.1 Вирус гриппа.............................................................................................11

1.1.2 Цикл размножения вируса гриппа.............................................12

1.1.3 Функции белков...........................................................................14

1.1.4 Генетическая изменчивость вируса гриппа..............................17

1.2 Живые гриппозные вакцины....................................................................19

1.2.1 Инактивированные вакцины.......................................................19

1.2.2 Живые гриппозные вакцины......................................................20

1.2.3 История вопроса...........................................................................21

1.2.4 Холодоадаптированные вакцины...............................................22

1.2.5 Классический метод получения ЖГВ........................................28

1.3 Обратная генетика.....................................................................................30

1.3.1 История вопроса...........................................................................30

1.3.2 Создание живых гриппозных вакцин (ЖГВ)............................35

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..............................................................38

2.1 Материалы.................................................................................................38

2.1.1 Реактивы....................................................................................... 38

2.1.2 Лабораторные штаммы вирусов.................................................38

2.1.3 Клеточные линии и куриные эмбрионы....................................39

2.1.4 Плазмиды......................................................................................39

2.2 Методы.......................................................................................................39

2.2.1 Получение реассортантов...........................................................39

2.2.2 Определение инфекционного титра вирусов в ЭИД50 и накопление вирусов для последующих опытов.................................40

2.2.3 Концентрирование вирусов........................................................40

2.2.4 Оценка патогенности вирусов для мышей................................41

2.2.5 Определение защитной эффективности ХА реассортантов.... 42

2.2.6 Оценка нейровирулентности вирусов для мышей...................42

2.2.7 Реакция задержки гемагглютинации.........................................42

2.2.8 Выделение вирионной РНК........................................................42

2.2.9 Получение ПЦР-продуктов для последующего секвенирования .................................................................................................................43

2.2.10 Подбор праймеров для последующего секвенирования........43

2.2.11 Очистка ПЦР-продуктов...........................................................44

2.2.12 Секвенирование..........................................................................44

2.2.13 Компьютерное обеспечение.....................................................45

2.2.14 Подготовка компетентных клеток...........................................45

2.2.15 Вставка необходимых генов в плазмиды................................45

2.2.16 Выделение макси количеств плазмидной ДНК......................47

2.2.17 Трансфекция клеток плазмидами.............................................48

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ..............................................................................:......49

3.1 Изучение фенотипа реассортантов между ХА штаммом А/Краснодар/101/35/59(Н21Ч2) и эпидемическими штаммами..................49

3.2 Изучение роли отдельных генов ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2К2) в поддержании его ts, са и att фенотипа на основе реассортантов, полученных методом обратной генетики..............60

ГЛАВА 4.ОБСУЖДЕНИЕ....................................................................................72

4.1 Изучение фенотипа реассортантов между ХА штаммом А/Краснодар/101/35/59(Н2Ы2) и эпидемическими штаммами..................72

4.2 Изучения роли отдельных генов ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2№) в поддержании его ts, са и att фенотипа на основе реассортантов, полученных методом обратной генетики..............75

ВЫВОДЫ...............................................................................................................78

БЛАГОДАРНОСТИ..............................................................................................79

Список литературы...............................................................................................80

ПРИЛОЖЕНИЕ.....................................................................................................90

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

293Т - культура клеток почек человека 293Т

ак - аминокислотные остатки

БОЕ - бляшкообразующие единицы

вРНК - геномная РНК вируса

ГАЕ - гемагглютинирующая единица

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ЖГВ - живая гриппозная вакцина

кРНК - +РНК, полностью комплементарная вРНК вируса гриппа

КЭ - куриные эмбрионы

мРНК - матричная РНК

нукл. - нуклеотиды

об/мин - обороты в минуту

ОТ - реакция обратной транскрипции

ОТ-ПЦР - реакция обратной транскрипции, проводимая в одной пробирке с ПЦР

ПЦР - полимеразная цепная реакция ПААГ - полиакриламидный гель

РЗГА - реакция задержки (торможения) гемагглютинации

РНК - рибонуклеиновая кислота

РНП - рибонуклеопротеин

ХА - холодоадаптированный (о штамме)

ЭИД50/0,1мл - эмбриональная инфекционная доза вируса в 0,1мл ЭПР - эндоплазматический ретикулюм ЦПД - цитопатическая доза

att - attenuated (ослабленный, аттенуированный) (о фенотипе) са - cold adapted (холодоадаптированный) (о фенотипе)

НА - hemagglutinin (гемагглютинин) Ml - matrix protein (матриксный белок)

MDCK - Madine-Darby Canine Kidney cell culture (перевиваемая культура клеток почки коккер-спаниэля) NA - neuraminidase (нейраминидаза) NEP - nuclear export protein (белок ядерного экспорта) NES - nuclear export signal (сигнал ядерного экспорта) NLS - nuclear localization signal (сигнал ядерной локализации) NP - nucleoprotein (белок нуклеопротеида) NS - nonstructural protein (неструктурный белок)

РА - polymerase acidic protein (одна из трёх субъединиц полимеразы вируса)

РВ1 - polymerase basic protein 1 (одна из трёх субъединиц полимеразы вируса)

РВ2 - polymerase basic protein 2 (одна из трёх субъединиц полимеразы вируса)

PKR - protein kinase R (протеинкиназа R)

RCT - reproductive capacity at different temperatures (различие в титрах репродукции при оптимальной и заданной температуре) ts - temperature sensitive (температурочувствительный) (о штаммах или о фенотипе)

WSN - штамм вируса гриппа A/Wisconsin/33 (H1N1)

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

Имеющийся к настоящему времени опыт применения холодоадаптированной (ХА) живой гриппозной вакцины в России и США показал, что этот препарат обладает большой эффективностью при массовой вакцинации против гриппа, особенно детей. Следует отметить, что в отличие от инактивированных гриппозных вакцин живая вакцина способна защитить от инфекции дрейфовыми вариантами. В настоящее время для получения живой ХА гриппозной вакцины в России используют ХА штамм А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) [1] , а в США - ХА штамм А/Энн Арбор/6/60 (H2N2) [36].

Эти штаммы-доноры аттенуации получены путем пассажей при пониженной температуре обладают ts, са и ait фенотипом, то есть не способны к репродукции при повышенной температуре, хорошо репродуцируются при пониженной температуре и аттенуированы для животных и людей. Генетическая и фенотипическая стабильность ХА штаммов, а также мутации, которые отвечают за их фенотип хорошо изучены [3]. Однако применяемый в России ХА штамм-донор А/Ленинград/134/17/57 оказался генетически гетерогенным [6], и обнаруживал повышенную реактогенность для маленьких детей [1]. Учитывая это обстоятельство в НИИВС им. И.И.Мечникова был получен новый ХА штамм-донор аттенуации А/Краснодар/101/35/59(Н2Н2) и выявлены мутации в РНК-сегментах его генома, кодирующих «внутренние» белки [4]. Данный штамм обладал приемлемыми фенотипическими характеристиками. Однако до настоящего времени остается неясным, какие гены штамма А/Краснодар/101/35/59 (H2N2) содержат ключевые генетические детерминанты, ответственные за аттенуацию данного штамма (ts и att фенотип). Эту проблему мы попытались решить с помощью создания панели

одногенных и полигенных реассортантов, используя методы обратной генетики, с последующим изучением фенотипических и генотипических характеристик сконструированных реассортантов.

Также под вопросом оставалась возможность получения ХА реассортантов - кандидатов в живые гриппозные вакцины на базе ХА штамма А/Краснодар/101/3 5/5 9(Н2Ы2), которые обладают хорошими защитными свойствами, необходимыми для живых гриппозных вакцин. Всестороннее изучение биологических свойств реассортантов, полученных при скрещивании ХА штамма А/Краснодар/101/3 5/5 9(Н2Ы2) с эпидемическими штаммами вируса гриппа А является необходимым условием для оценки перспективности данного штамма как эффективного донора аттенуации для живых гриппозных вакцин.

Цели и задачи исследования.

Целью работы являлось изучение генетических основ аттенуации холодоадаптированного (ХА) штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2М2), а также исследование возможности ХА штамма А/Краснодар/101/3 5/59(Н2И2) образовывать при скрещивании с эпидемическими штаммами вируса гриппа реассортанты, которые могут быть использованы по своим характеристиками как живые гриппозные вакцины.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Получить реассортанты путем классического скрещивания ХА штамма А/Краснодар/101/3 5/5 9(Н2Ы2) с эпидемическими штаммами вируса гриппа А А/Кумам ото/102/02(НЗМ2) и А/Берн/07/95(НШ1), в условиях, которые способствуют формированию реассортантов с поверхностными антигенами от эпидемических штаммов и внутренними генами от ХА штамма.

2. Изучить фенотипические характеристики реассортантов, полученных при скрещивании ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2Н2) и

эпидемических штаммов А/Кумамото/102/02(НЗЫ2) и А/Берн/07/95(НШ1): ts, са и аттенуированный фенотип.

3. Проанализировать иммуногенность полученных реассортантов.

4. Провести анализ генома полученных реассортантов с помощью метода секвенирования.

5. Исследовать защитную эффективность реассортантов, полученных между ХА штаммом А/Краснодар/101/35/59 (H2N2) и эпидемическим штаммом А/Берн/07/95(Н1Ш).

6. Клонировать 8 генов ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2Ш) в плазмиду pHW2000.

7. Получить с помощью трансфекции наборы одногенных и полигенных реассортантов между ХА штаммом А/Краснодар/101/35/59(Н2Ы2) и вирулентным штаммом A/WSN/33(H1N1).

8. Исследовать ts и са фенотип одногенных и полигенных реассортантов между ХА штаммом А/Краснодар/101/35/59(Н2Ш) и A/WSN/33(H1N1).

9. Изучить att фенотип одногенных и полигенных реассортантов, полученных между вирулентным штаммом вируса гриппа A/WSN/33 и ХА штаммом вируса гриппа А/Краснодар/101/35/59(Н2Ш).

Научная новизна работы

Впервые исследованы генетические основы аттенуации ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2М2) - нового донора аттенуации для живых гриппозных вакцин. Показано, что РВ1 ген данного штамма содержит ключевые детерминанты, определяющие его ts и att фенотип.

Анализ полученных нами реассортантов свидетельствует о доминировании генов, содержащих детерминанты, ответственные за att-фенотип, в составе генома реассортантов. Это говорит о безопасности возможного применения живых гриппозных вакцин во время эпидемии гриппа.

Показано, что ХА штамм А/Краснодар/101/35/59(Н2Ш) является перспективным штаммом-донором аттенуации для ХА реассортантов, кандидатов в живые гриппозные вакцины.

Создана панель праймеров, позволяющая определять наследование генов у реассортантов вируса гриппа А сероподтипов Н2М2, НЗШ и НШ1.

Практическая значимость.

Показана возможность использования ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2Н2) в качестве штамма-донора для живых рекомбинантных гриппозных вакцин.

Разработаны основные элементы плазмидной технологии для получения живых реассортантных гриппозных вакцин на базе клонированных 6 генов, кодирующих « внутренние» белки ХА штамма А/Краснодар/101/35/59 (Н2Ы2) и 2-х клонированных генов, кодирующих поверхностные белки от любого эпидемического штамма вируса гриппа типа А. Это позволит в более короткие сроки получать вакцинные штаммы, вируса гриппа, минуя трудоемкую стадию анализа генома реассортантов.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Все исследованные реассортанты, полученные нами при скрещивании ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2Ы2) и вирулентных штаммов А/Берн/07/95 (Н1N1) и А/Кумамото/102/02(НЗ№), обладают генетическими и фенотипическими маркерами, необходимыми для рекомбинантных живых гриппозных вакцин.

2. ХА штамм А/Краснодар/101/35/59(Н2Ш) можно рассматривать как перспективный донор аттенуации при получении ХА реассортантов для живой гриппозной вакцины.

3. Анализ одногенных и полигенных реассортантов, полученных с помощью обратной генетики между ХА штаммом А/Краснодар/101/35/59(Н2Ы2) и вирулентным штаммом А^8Ы/33(НШ1), свидетельствует о том, что ключевые детерминанты, ответственные за и а и

фенотип, локализованы в РВ1 и N8 гене штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2Ы2).

4. Анализ полученных нами реассортантов между ХА штаммом А/Краснодар/101/35/59(Н2Ы2) и вирулентным штаммом АЛУ8]ч[/33(НШ1) указывает на доминирование генов, содержащих генетические детерминанты, ответственные за аи фенотип, в составе генома реассортантов. Этот факт говорит о безопасности применения живых гриппозных вакцин во время гриппозной эпидемии.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Вирус гриппа

1.1.1 Общая характеристика вируса гриппа

Вирусы гриппа Л, В и С принадлежат семейству Orthomyxoviridae. Это оболочечные вирусы, обычно сферической формы (реже филаментозной), диаметром около 80 нм. Геном вируса гриппа А (о котором мы будет говорить в дальнейшем) состоит из 8 сегментов (-)РНК, которые кодируют 13 белков [53; 94].

Далее мы рассмотрим строение вириона вируса гриппа А.

Рисунок 1. Строение вируса гриппа [11]

Вирус гриппа имеет липопротеидную оболочку, которая является производной гыазмалеммы клетки-хозяина. В эту оболочку встроены поверхностные белки-антигены гемагглютинин (НА) и нейраминидаза (ЫА), а также ионные каналы (белок М2). Под липидной оболочкой располагается слой М1-белка (матриксного белка). К М1 белку присоединён рибонуклеопротеидный комплекс (РНП), который состоит из (-)РНК, которая

упакована с помощью NP белка, и присоединенных к ним трёх полимеразных белков РВ1, РВ2 и РА [21].

1.1.2 Цикл размножения вируса гриппа

Вирус гриппа присоединяется к N-ацетилнейраминовой (сиаловой) кислоте на поверхности клетки-хозяина. Часть сиаловой кислоты узнается НА белком вируса гриппа, который затем к ней присоединяется. Это инициирует эндоцитоз, благодаря которому вирус проникает в клетку. Затем внутри эндосомы начинает повышаться рН, что является частью естественного клеточного механизма пиноцитоза, и осуществляется при помощи протонных помп. При этом протоны из эндосомы пассивно закачиваются внутрь вирусной частицы с помощью М2 белка, что вызывает "разрыхление" внутренних структур вириона, и ослабление связей между вирусными белками. Благодаря закислению среды в эндосоме, конформация НА белка меняется, и он сливается с её оболочкой, тем самым создавая пору, через которую внутрь клетки может выйти РНП-комплекс вируса гриппа.

После освобождения от оболочки, РНП перемещается в ядро клетки с помощью сигналов ядерной локализации белков вируса. В ядре происходят все действия вируса с его генетическим материалом. РНК-зависимая РНК полимераза на основе (-)вРНК синтезирует два типа (+)РНК: матричная -необходима для синтеза вирусных белков, а другая — комплиментарная (кРНК), из который затем будут синтезировать (-)вРНК для потомства вируса. Стоит отметить, что поли(А) конец вРНК получается благодаря тому, что в первоначальной цепочке вРНК имеется последовательность 5-7 урацилов (соответсвенно, полученные из вируса мРНК не нуждаются в полиаденилировании). Однако cap конец отсутствует. Полимеразные белки забирают cap 5' конец у мРНК клетки и присоединяют его к мРНК вируса. Это процесс в англоязычной литературе называется cap snatching ("захватывание кэпа").

Host pre-mRNA

splice

(*) mRNAs

Golgt apparatus

(+) mRNAs

Рисунок 2. Жизненный цикл вируса гриппа [53].

После присоединения cap мРНК готова к транспортировке и трансляции, как и любая мРНК клетки. Однако вРНК транспортируется из ядра с помощью Ml и NS2(NEP) белков. Ml взаимодействет с РНК и NP белком, связывая их с NS2(NEP), и затем полученный комплекс покидает ядро клетки и выходит в цитоплазму.

С помощью мРНК вируса и рибосом клетки в просвет ЭПР синтезируются белки НА, NA и М2, которые затем транспортируются в аппарат Гольджи для пост-трансляционной обработки. Все три полученных белка имеют сигналы апикального сортинга ("apical sorting signals"), которые направляют их к плазмалемме, где впоследствии происходит сборка вирусов.

Отпочковывание новых вирусов инициируется накоплением Ml белка в цитоплазме вблизи плазмалеммы. НА белок всё ещё прикреплен к сиаловой кислоте, когда отпочковывание вирусов уже завершено. За отделение вируса от мембраны клетки отвечает NA белок, который отрезает отпочковавшуюся вирусную частицу от сиаловой кислоты и даже удаляет кусочки этой кислоты от поверхности мембраны вируса [53; 21; 65].

1.1.3 Функции белков

Гемагглютин (НА) - один из поверхностных белков, состоит из двух субъединиц: НА1 и НА2. Они соединяются друг с