Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка системы получения реассортантных штаммов для живой гриппозной вакцины в культуре клеток MDCK

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Разработка системы получения реассортантных штаммов для живой гриппозной вакцины в культуре клеток MDCK"

ИСАКОВА Ирина Николаевна

РАЗРАБОТКА СИСТЕМЫ ПОЛУЧЕНИЯ РЕАССОРТАНТНЫХ ШТАММОВ ДЛЯ ЖИВОЙ ГРИППОЗНОЙ ВАКЦИНЫ В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК МБСК

03.00.06 - Вирусология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2007

003055468

Работа выполнена в Государственном Учреждении Научно-исследовательском институте экспериментальной медицины Российской Академии Медицинских Наук

Научный руководитель

доктор биологических наук Киселева Ирина Васильевна

Официальные оппоненты

академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор

Каверин Николай Вениаминович

доктор биологических наук Еропкин Михаил Юрьевич

Ведущая организация

Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов имени Л.А. Тарасевича

Защита диссертации состоится « апреля 2007 года в часов на заседании диссертационного совета Д 001.043.01 при научно-исследовательском институте гриппа Российской Академии Медицинских Наук по адресу: ГУ НИИ гриппа РАМН (197376, Санкт-Петербург, ул. проф Попова, д. 15/17)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ гриппа РАМН.

Автореферат разослан « 2А » марта 2007 г.

//

Ученый секретарь , // ,

диссертационного совета, к.м.н. v / ^ ' Лобова Т.Г.

Актуальность проблемы

Гриппозная инфекция занимает значительное место в инфекционной патологии человека. По данным ВОЗ, грипп и другие острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ) достигают 95% всех случаев инфекционных заболеваний (Frank е.а., 1970; Baker, 1987) При обычных ежегодных эпидемиях гриппом болеет до 20% населения земного шара, а во время пандемий это число может возрастать в 3-4 раза В развитых странах грипп является основной причиной смертности от инфекционных заболеваний (Nicholson, 2003). В России ежегодно регистрируют от 27,3 до 41,2 млн. случаев заболеваемости гриппом и другими ОРВИ (Карпухин, 1985) Основным средством борьбы с вирусными инфекциями, в том числе и с гриппом, остается вакцинация (Смородинцев, 1949, 1984; Glezen, 1980; Rudenko е.а., 1993; Couch, 2000, Muñoz е.а., 2000 и др.). Наиболее перспективными в индукции защитного иммунитета являются живые гриппозные вакцины (ЖГВ) (Александрова, Климов, 1994; Wareing е.а., 2001).

В настоящее время основным субстратом для подготовки как живых, так и инактивированных гриппозных вакцин являются развивающиеся куриные эмбрионы (РКЭ). На состоявшемся в 1995 году в Женеве очередном совещании ВОЗ обсуждались вопросы о целесообразности перевода производства гриппозных вакцин на восприимчивые культуры клеток млекопитающих. Особо отмечалось, что «...в случае возникновения пандемии будет необходимо в кратчайшие сроки существенно увеличить объемы производства вакцин, что трудно осуществить при использовании в качестве субстрата РКЭ, т.к. поставка на производство высококачественных эмбрионов требует заблаговременного планирования...» (Меморандум ВОЗ, 1995) По итогам совещания были вынесены рекомендации разработать в ближайшее время подходящие клеточные системы для подготовки и культивирования гриппозных вакцин. Наиболее перспективными в этом плане клеточными линиями были названы перевиваемые культуры MDCK и Vero.

Многие научные лаборатории и фармацевтические компании мира в настоящее время занимаются разработкой культуральных инактивированных гриппозных вакцин, и вакцины, подготовленные в культурах Vero (Influject, Baxter) и MDCK (Influvac ТС, Solvay) уже лицензированы для сезонной профилактики гриппа в Европе (Whilschut е а., 2006). Не менее актуален перевод производства живой гриппозной вакцины с куриных эмбрионов на клеточные культуры, что позволит нарабатывать большие объемы вакцины для иммунизации всех групп населения.

Штаммы для живых гриппозных вакцин готовят методом реассортации между современным эпидемическим вирусом и хорошо охарактеризованным лабораторным штаммом -донором аттенуации. Доноры аттенуации для отечественной ЖГВ были получены с помощью серийных пассажей эпидемических вирусов гриппа в куриных эмбрионах при пониженной до 25°С температуре, в результате чего они приобрели способность, бессимптомно репродуцируясь

в верхних дыхательных путях человека, стимулировать выработку противовирусного иммунитета (А1ехапс1гоуа, БтогосКг^еу, 1965; Александрова и др, 1968, 1994, 1997). Вакцинный штамм должен наследовать от эпидемического вируса два поверхностных антигена - гемагглютинин и нейраминидазу, а от донора аттенуации шесть внутренних генов (формула генома 6:2) (Меморандум ВОЗ, 1987). Также допускается присутствие в геноме вакцинного штамма третьего гена от эпидемического родителя (формула генома 5:3) (Приказ №156/29 Минздрава РФ, 1998). Если методика подготовки реассортантных вакцинных штаммов в РКЭ описана в литературе достаточно подробно (Александрова, 1977; Полежаев и др., 1974, 1978, 1980; Сох е.а., 1979 и др ), то соответствующая методика подготовки вакцинных реассортантов в культуре клеток на данный момент отсутствует.

Таким образом, в свете всего вышеизложенного, основной целью настоящей работы явилась разработка условий получения реассортантных штаммов для живой гриппозной вакцины в культуре клеток МОСК.

Для решения поставленной цели в задачи исследования входило: 1 Изучение особенностей репродукции эпидемических вирусов гриппа А и В, а также холодоадаптированных доноров аттенуации в культуре клеток МОСК. по сравнению с общепринятым субстратом - развивающимися куриными эмбрионами.

2. Разработка оптимальных условий для скрещивания эпидемических вирусов гриппа А и холодоадаптированного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (Н2Ы2) в культуре клеток МБСК и последующей селекции реассортантных вакцинных штаммов.

3. Разработка новых, культуральных, маркеров аттенуации для первичного скрининга реассортантов-кандидатов в вакцинные штаммы.

4. Изучение генетической стабильности «яичных» и «культуральных» вакцинных штаммов после их пассирования в куриных эмбрионах и/или в культуре клеток МОСК.

5. Изучение эффективности использования культуры клеток МОСК для изоляции вакцинных штаммов ЖГВ от привитых лиц.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Современные эпидемические вирусы А(НЗЫ2), выделенные и накопленные в РКЭ, могут в процессе пассирования в культуре клеток МОСК утрачивать способность активно размножаться в куриных эмбрионах, а также чувствительность к эритроцитам кур. Для эпидемических вирусов гриппа А(НШ1) и В, а также ХА доноров аттенуации такого явления не наблюдалось.

2. Стандартная схема реассортации, позволяющая эффективно изолировать в системе куриных эмбрионов реассортанты с вакцинной формулой генома, является неэффективной при получении вакцинных штаммов ЖГВ в культуре клеток МОСК. Модификация данной методики, а именно увеличение соотношения инфекционных титров скрещиваемых вирусов

до 10000000 (донор аттенуации) . 1 (эпидемический вирус) позволило регулярно получать реассортанты с вакцинной формулой генома в культуре клеток 3. Четкие различия в проявлении фенотипических свойств между эпидемическими и холодоадаптированными вирусами гриппа в культуре клеток \1DCK. позволяют использовать данные особенности в качестве культуральных маркеров аттенуации при первичном скрининге вакцинных штаммов для ЖГВ. 4 Вакцинные штаммы ЖГВ, подготовленные в куриных эмбрионах и культуре клеток МОСК, являются генетически стабильными после их пассирования в РКЭ или в культуре клеток не только при оптимальной, но и при повышенной температуре инкубации.

Научная новизна работы

Впервые показано, что современные вирусы гриппа А(НЗК2) в процессе пассирования в культуре клеток МОСК утрачивают способность активно репродуцироваться в системе РКЭ, а также сродство к куриным эритроцитам. Вирусы гриппа А(НШ1), В, а также ХА доноры аттенуации сохраняют эти свойства при пассировании в клеточном субстрате.

Разработаны условия получения в культуре клеток МОСК вакцинных реассортантов, наследующих все гены, кодирующие внутренние белки вириона, от донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (Н2№).

Впервые получены данные о проявлении в культуре клеток МОСК температуроустойчивого (лол-й) фенотипа эпидемических вирусов гриппа А и В, чувствительных к повышенной температуре инкубации в системе куриных эмбрионов (/5 фенотип).

Показано, что культура клеток МОСК является более чувствительной системой по сравнению с куриными эмбрионами для выявления температурочувствительности донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (Н2№). 7> фенотип донора аттенуации В/СССР/60/69 определяется в равной степени в РКЭ и культуре клеток МОСК. Свойство культуры клеток МОСК выявлять различия в температурочувствительности эпидемических и ХА вирусов гриппа позволяет рекомендовать его в качестве нового й маркера аттенуации.

Впервые показана стабильность фенотипических признаков и сохранность кодирующих мутаций у вакцинных штаммов ЖГВ, пассированных в куриных эмбрионах и/или культуре клеток МОСК не только при оптимальной, но и при повышенной температуре.

Впервые изучена эффективность использования культуры клеток МОСК для выделения вакцинных штаммов от лиц, привитых отечественной живой гриппозной вакциной

Практическая значимость работы

Предложенная в работе методика получения реассортантных штаммов для культуральной живой гриппозной вакцины может быть использована в области практического здравоохранения для производства этого препарата.

Представленные культуральные ts и са маркеры аттенуации могут быть использованы как факторы отбора вакцинных штаммов для живой гриппозной вакцины, производимой в культуре клеток, а также на развивающихся куриных эмбрионах.

Высокая чувствительность культуры клеток MDCK позволяет адекватно оценивать приживляемость вакцинных штаммов у лиц, привитых живой гриппозной вакциной, ее генетическую стабильность и трансмиссивность.

Штаммы А/17/Калифорния/04/6 (H3N2) и А/17/Малайзия/04/11 (H3N2), полученные на развивающихся куриных эмбрионах в ходе выполнения работы, были переданы для производства живой гриппозной вакцины в НПО «Микроген», г. Иркутск.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы представлены на Всероссийской конференции молодых исследователей «Физиология и медицина» (Санкт-Петербург, 2005), Международной конференции «The second European Influenza Conference» (St. Julian, Malta, 2005), Конференции молодых ученых, посвященной 115-летию ГУ НИИЭМ РАМН (Санкт-Петербург, 2005), 5-й Научно-практической конференции с международным участием «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань, 2006), Научно-практической конференции молодых ученых с международным участием «Вчеш майбутнього» (Одесса, 2006), Межвузовской научной конференции «XXXIV неделя науки СПбГПУ» (Санкт-Петербург, 2006).

Диссертационная работа была апробирована на заседании научной конференции отдела вирусологии им. акад. A.A. Смородинцева ГУ НИИЭМ РАМН 27 декабря 2006 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 5 статей и 7 тезисов докладов. Поданы заявки на 2 патента Российской Федерации.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы (4-х глав), описания материалов и методов исследования, пяти глав собственных исследований, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы Работа изложена на 121 странице машинописного текста, иллюстрирована 13 рисунками и 24 таблицами. Список литературы содержит 229 наименований, в том числе 57 отечественных и 172 зарубежных.

Личный вклад автора заключается в непосредственном участии в выполнении всех разделов данного исследования - изучении фенотипических характеристик эпидемических и холодоадаптированных вирусов гриппа в куриных эмбрионах и культуре клеток MDCK, получении ряда реассортантов вирусов гриппа в культуре клеток MDCK и определении состава их генома методом ПЦР-рестрикционного анализа, исследовании генетической стабильности вакцинных штаммов ЖГВ, выделении и типировании вакцинных изолятов от детей, привитых живой гриппозной вакциной, проведении статистической обработки и анализе полученных

данных. Автор признателен д.б.н. Киселевой И.В. за предоставление материалов по составу генома реассортантов, подготовленных в развивающихся куриных эмбрионах, к.б.н. Ларионовой Н.В за помощь в изучении фенотипических характеристик ряда эпидемических вирусов гриппа.

СОБСТВЕННЫЕ РЕЗУЛЬ ТА ТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В работе были использованы различные эпидемические штаммы вирусов гриппа А и В из коллекции Центра по контролю за заболеваемостью (Атланта, США) и из Музея штаммов Института гриппа РАМН. Холодоадаптированные вирусы гриппа получены из Музея штаммов отдела вирусологии НИИ экспериментальной медицины РАМН. Культивирование вирусов проводили на 10-11-дневных РКЭ, полученных с птицефабрики «Синявинская» (г. Синявино, Кировский район) и в культуре клеток MDCK, полученной из АТСС (Манассас, Виргиния, США, Cat. No CCL-34). Клеточную линию поддерживали в среде DMEM, содержащей 10% сыворотки эмбрионов коров («Биолот», Санкт-Петербург). Инфекционную активность вируса гриппа определяли титрованием вируссодержащего материала на РКЭ или в культуре клеток MDCK с коэффициентом 10, рассчитывали по методу Reed & Muench (1938) и выражали в lg ЭИД(ТЦИД)50/мл. Для определения температурочувствительности и холодоадапти-рованности вирусов гриппа проводили их одновременное титрование при различных температурах. Количественно разницу в уровне репродукции вируса гриппа при разных температурах выражали в lg ЭИД(ТЦИД)50/мл величиной RCT (reproductive capacity at different temperatures), которая представляет собой разницу между инфекционным титром вируса при оптимальной температуре 32°С и титром при исследуемой температуре.

Для заражения клеток MDCK использовали трехдневную монослойную культуру. Заражение клеточного монослоя проводили по общепринятой методике, при этом для культивирования вирусов использовали поддерживающую среду DMEM, содержащую 2 мкг/мл трипсина ТРСК. Клетки инкубировали при различных температурах в атмосфере 5% ССЬ в инкубаторах фирмы Joan (Франция). Наличие вируса в лунках определяли в РГА с эритроцитами кур (0,5%) и/или человека группы 0 (I), Rh+ (1,0%) и/или морской свинки (1,0%). Для клонирования вирусной смеси методом бляшек использовали 6-луночные полистироловые планшеты («SARSTEDT», Германия), при этом после процедуры заражения клеточный монослой покрывался 0,8%-ным раствором агарозы («Serva», США), который получался смешиванием равных объемов 1,6%-ной агарозы и двукратной среды DMEM, приготовленной из сухой полнокомпонентной среды DMEM, «Himedia», Индия. После застывания агарозы планшеты помещались в ССЬ-инкубатор и инкубировались 3 суток при температуре 32°С или 6-7 суток при

26°С. Накопление вирусов из бляшек проводили под жидкой средой в 12-луночных полистироловых планшетах.

Подготовку реассортантов в РКЭ проводили по методике, описанной в работе Г.И. Александровой (1977). Рекомбинацию проводили путем одновременного инфицирования пяти РКЭ смесью родительских вирусов, взятых в пропорции 1:1 (с инфекционным титром 6 или 7 lg ЭИД5о/0,2 мл). Зараженные эмбрионы инкубировали в течение 48 часов при 32°С, после чего вирусная смесь дважды пассировалась при 26°С (инкубация в течение 6 суток) в присутствии крысиной гипериммунной сыворотки против донора аттенуации (селективные пассажи). После двукратного клонирования вирусной смеси предельными разведениями полученные реассортанты проверялись в РТГА с гипериммунными крысиными сыворотками к эпидемическому вирусу и донору аттенуации. Реассортанты, унаследовавшие антигенные свойства эпидемического родителя, использовали для определения состава их генома посредством ПЦР-рестрикционного анализа.

Определение состава генома исследуемых реассортантов проводили по методу, описанному Klimov с соавт. (1995). Метод основан на амплификации фрагментов вирусных РНК длиной около 150-300 нуклеотидов, содержащих уникальные последовательности, характерные только для определенных штаммов вируса гриппа. Последующая обработка амплифицированных фрагментов ДНК специфическими рестриктазами позволяет определить принадлежность генов реассортантных штаммов к эпидемическому или ХА родителю. Все необходимые праймеры заказывали в фирме «Литех» (Москва). Реактивы и рестриктазы, а также маркер молекулярного веса получали в компании «СибЭнзим» (Новосибирск).

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью системного пакета программ «StatsDirect, Version 2,5,7».

ОСОБЕННОСТИ РЕПРОДУКЦИИ ВИРУСОВ ГРИППА В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК MDCK

Перевод производства живой гриппозной вакцины с РКЭ в культуру клеток MDCK диктует необходимость в первую очередь оценить способность клеточного субстрата поддерживать репродукцию вирусов гриппа - как холодоадаптированных доноров аттенуации, так и циркулирующих эпидемических вирусов. Не менее важным является вопрос о возможных изменениях биологических свойств вирусов гриппа в результате пассирования в культуре клеток млекопитающего, что может сказываться на процессе подготовки вакцинного штамма. В этой связи мы проанализировали особенности размножения эпидемических вирусов гриппа, выделенных и культивируемых в РКЭ, а также ХА вариантов в культуре клеток MDCK по

сравнению с РКЭ при оптимальных условиях инкубации, а также проследили за изменением биологических свойств этих вирусов при их пассировании в клеточном субстрате.

Сравнение ростовых характеристик эпидемических и ХА вирусов гриппа в РКЭ и

культуре клеток МОСК при оптимальной температуре инкубации.

Изучение способности эпидемических и ХА вирусов гриппа, накопленных в РКЭ, к репродукции в культуре клеток МОСК показало, что все исследованные вирусы эффективно накапливались в клеточном субстрате, и их инфекционные титры, определенные в культуре МОСК, колебались в пределах 5,8-9,5 ^ ТЦИД50/мл. Сравнение инфекционной активности «яичных» эпидемических и ХА вирусов гриппа А(НШ1), А(П2М2), А(ПЗЫ2) и В параллельно в куриных эмбрионах и клетках МОСК при оптимальной температуре инкубации 32°С показало, что большинство исследованных вирусов гриппа А проявляли сходный уровень репродуктивной активности в этих субстратах, и разница в инфекционных титрах между двумя системами не превышала 1,2 ^ ЭИД(ТЦИД50)/мл. Следует подчеркнуть, что способность размножаться в тканевой культуре более активно, чем в РКЭ, была свойственна только современным вирусам гриппа А(НЗШ), тогда как эпидемические вирусы А(НШ1) и ХА донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (Н2Ы2) (Лен/17) не проявляли выраженного тропизма к клеточному субстрату. Для вирусов гриппа В была характерна несколько большая вариабельность в чувствительности к двум субстратам. Так, некоторые вирусы данной группы размножались предпочтительнее в клеточном субстрате, тогда как у других наблюдался выраженный тропизм к куриным эмбрионам, но во всех случаях разница в инфекционных титрах, определенных в РКЭ и культуре клеток, не превышала 2,4 ^ ЭИД(ТЦИД5о)/мл. Представленные данные демонстрируют высокую чувствительность линии клеток МОСК к современным циркулирующим вирусам гриппа, а также подтверждают данные литературы о том, что ХА вирусы гриппа, полученные многочисленными пассажами в системе РКЭ, активно репродуцируются в клеточной системе без предварительной к ней адаптации (А1ехапс1гоуа е.а., 2000; АисЫеу е.а., 2005).

Изменение биологических свойств эпидемических и ХА вирусов гриппа в результате серийных пассажей в культуре клеток МОСК

Так как в процессе своей подготовки вакцинный штамм с поверхностными антигенами современных вирусов будет проходить несколько (5-7) пассажей непосредственно в культуре клеток МОСК, предполагается важным установить, как повлияет подобное пассирование на такие свойства вируса, как активность репродукции в РКЭ и культуре клеток МОСК, а также чувствительность к эритроцитам разного происхождения.

Для этого мы изучили репродуктивную активность различных вирусов гриппа параллельно в куриных эмбрионах и культуре клеток МОСК до и после их пятикратного пассирования в культуре клеток. Так, изучение эпидемических вирусов А/Калифорния/7/04 (Н3№) и А/Висконсин/67/05 (НЗШ) показало, что после их непродолжительного пассирования в культуре

клеток они утрачивали способность активно размножаться на аллантоисных мембранах куриных эмбрионов, тогда как способность репродукции в культуре клеток сохранялась на прежнем уровне. Для эпидемических вирусов гриппа А(НШ1), В, а также доноров аттенуации Лен/17 и В/СССР/60/69 (В/60) не выявлено каких-либо значимых изменений в чувствительности к этим субстратам до и после пассирования в культуре МОСК.

Мы также проследили за изменением сродства разных эпидемических вирусов гриппа А(НШ1), А(НЗШ) и В, а также доноров аттенуации Лен/17 и В/60 в процессе пассирования культуре клеток МОСК к эритроцитам разного происхождения, для чего определяли титры в РГА до и после их пятикратного пассирования в культуре клеток МОСК со следующими эритроцитами: а) куриным (0,5%), б) человека группы 0 (I), Ин- (1,0%), в) морской свинки (1,0%). Было обнаружено, что сродство вирусов гриппа А(НЗК2) к куриным эритроцитам существенно снижается (разница между титрами РГА составляла 6-7 1о§г) в процессе размножения в культуре МОСК, тогда как сродство к эритроцитам млекопитающих в данном случае почти не меняется. На идентификацию вирусов гриппа А(НШ1) и В, а также вирусов устаревшей антигенной структуры (доноров аттенуации Лен/17 и В/60) происхождение эритроцитов не влияло - как исходные, так и пассированные доноры одинаково хорошо агглютинировали все виды изученных эритроцитов. Полученные выше данные указывают на то, что при работе с современными вирусами гриппа, особенно с вирусами А(НЗМ2), пассируемыми в клетках МОСК, не следует пользоваться исключительно только куриными эритроцитами, т.к. они не позволяют с максимальной чувствительностью выявлять наличие вируса в культуральной среде. С другой стороны, применение куриных эритроцитов вместе с эритроцитами млекопитающих может быть весьма информативным при подготовке вакцинных штаммов, в частности при анализе перспективных реассортантов, косвенно указывая на принадлежность НА эпидемическому родителю или донору аттенуации. Таким образом, можно заключить, что особенность современных вирусов гриппа А(Н31<12) плохо агглютинировать эритроциты кур и менее активно репродуцироваться в РКЭ усиливается по мере адаптации этих вирусов к культуре клеток, и поэтому адекватно оценивать ростовые свойства культуральных реассортантных штаммов, прошедших в процессе их подготовки ряд пассажей в клеточном субстрате, возможно только при использовании культуры клеток МОСК.

РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ ПОДГОТОВКИ РЕАССОРТАНТОВ В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК МОСК

При разработке методики подготовки реассортантных штаммов для живой гриппозной вакцины в кулиуре клеток МОСК мы отталкивались от соответствующей методики, применяемой при подготовке вакцины в развивающихся куриных эмбрионах (Г.И. Александрова, 1977; Ф.И. Полежаев и др., 1980).

Получение вакцинных реассортантов в развивающихся куриных эмбрионах

Методика подготовки вакцинных реассортантов в РКЭ, включающая скрещивание эпидемического вируса и донора аттенуации Лен/17, взятых в равных соотношениях по их инфекционной активности, и последующую селекцию реассортантов при пониженной температуре в присутствии сыворотки к донору, оказалась высокоэффективной для получения реассортантов с вакцинной формулой генома в РКЭ. Так, анализ 159 реассортантов, подготовленных данным способом на основе различных эпидемических родительских вирусов А(НШ1) и А(НЗ№), показал, что 70 клонов (44%) обладали формулой генома 6:2, наследуя все 6 внутренних генов от донора аттенуации, а 28,3% реассортантов унаследовали 5 из 6 внутренних генов донора аттенуации (формула генома 5:3). Анализ частоты передачи реассортантам отдельных генов от родительских штаммов приведен на рисунке 1 -а. Интересно, что данная методика позволяла реассортантным штаммам наследовать гены, кодирующие белки полимеразного комплекса, от донора аттенуации в 90% и более случаев. Частота передачи М, ИР и N8 генов от аттенуированного родителя была несколько ниже (70,4-75,5%), однако сохранялась на высоком уровне, что позволяло эффективно получать реассортанты с вакцинной формулой генома.

РВ2 РВ1 РА НА ИР МА |СЗдонор аттенуации И эпидемический вирус|

РВ2 РВ1 РА НА № МА М N5 ¡□донор аттенуации И эпидемический вирус!

Рисунок 1. Частота передачи реассортантам генов от родительских вирусов в процессе подготовки: а) в куриных эмбрионах; б) в культуре клеток МОСК.

Получение культуральпыхреассортантов при скрещивании донора аттенуации А/Ленииград/134/17/57 (Н21У2) и эпидемических вирусов A(HЗN2), взятых в равных соотношениях

Мы попытались использовать те же методические приемы, применявшиеся для подготовки вакцинных реассортантов в РКЭ, для получения вакцинных реассортантов в культуре клеток МОСК. Однако в данном случае наблюдалась совершенно иная картина наследования реассортантами внутренних генов от донора аттенуации Лен/17. В таблице 1 приведена частота образования реассортантов с различной формулой генома при подготовке в клетках МОСК, где родительские вирусы брались для скрещивания в соотношении «1 : 1» по их инфекционной активности.

Лишь 4 из 70 (5,7%) проанализированных клонов содержали все 6 внутренних генов от ХА родителя. При этом анализ частоты перехода отдельных генов от донора аттенуации реассортантам показал, что в 87-91% случаев клоны обладали генами, кодирующими белки полимеразного комплекса, от донора Лен/17 (рис.1-б). Тот факт, что реассортанты, содержащие эти гены от донора аттенуации, обладали выраженным свойством температурочувствительности, подтверждает ведущую роль генов полимеразного комплекса в манифестации /5 фенотипа вирусов гриппа (К1ипоу е.а., 2001). Высокая же частота наследования реассортантами ЫР, М, а также N8 генов (61,4%, 58,6% и 70,0% соответственно), от эпидемического родителя указывает на неслучайный характер переноса этих генов от вирулентного вируса.

Таблица 1. Эффективность получения реассортантов с различной формулой генома между донором аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (Н2Ы2) и эпидемическими вирусами А(НЗЫ2)

в культуре клеток МРСК_

Формула генома Лен/17 и* Число реассортантов (70) Состав генома реассо| угантов

РВ2 РВ1 РА НА № ИА М N8

6 : 2 (5.7%) 4 171 17 17 17 17 17

5:3 (32.9%) 10 17 17 17 17 ■М 17

6 17 17 17 17 V/! 17

4 17 17 17 лм wt 17 17

3 17 17 17 ч/г 17 17

4:4 (15.7%) 4 17 17 17 17 wt wt «Л

4 17 17 17 wt 17

3 17 17 17 Ы wt 17

3:5 (30.0%) 19 17 17 17 «Я wt wt

1 17 17 иЛ XVI wt 17 wt

1 М 17 17 ы wt 17

2:6 (7.1%) 3 17 17 т wt

1 ЧЛ и* 17 \У1 17 ЧЛ

1 4/1 17 17 м \У1 wt wt wt

1 : 7 (8.6%) 2 ^ 17 wt

4 ■«я 17 wt wt

Гены унаследованы ОТ' эпидемического вируса, (%) 9 (12,9) 10 (14,3) 6 (8,6) 70 (100) 43 (61,4) 70 (100) 41 (58,6) 49 (70,0)

донора аттенуации, (%) 61 (87,1) 60 (85,7) 64 (91,4) 0 (0) 27 (38,6) 0 (0) 29 (41,4) 21 (30,0)

'донор аттенуации - А/Ленинград/134/17/57 (Н2Ш) 2«дикие» родители. А/Вайоминг/3/03 (НЗШ), А/Веллингтон/О 1/04 (НЗШ), А/Калифорния/7/2004 (НЗЫ2), А/Малайзия/О 1/04 (НЗШ), А/Висконсин/67/05 (НЗШ).

Селекция реассортантов в развивающихся куриных эмбрионах и культуре клеток МОСК после скрещивания донора аттенуации А/Лепииград/134/17/57 (Н2Ы2) и эпидемического вируса в куриных эмбрионах

Уникальное свойство культуры клеток МБСК поддерживать преимущественно репликацию реассортантов, содержащих ОТ и N8 гены от эпидемического родителя, было нами наглядно продемонстрировано на примере одной пары родительских вирусов - донора Лен/17 и

эпидемического вируса А/Новая Каледония/20/99 (111 N1), где скрещивание вирусов проводилось в куриных эмбрионах, а все последующие этапы - параллельно в РКЭ и культуре МБСК (рис.2). В данном случае в системе РКЭ получались исключительно реассортанты, содержащие 5 или 6 внутренних генов от донора аттенуации, тогда как в культуре клеток \1DCK было получено большое разнообразие вариантов с различным составом генома с предпочтительным поддержанием репродукции вирусов, содержащих ИР и N8 гены от эпидемического родителя.

А/Ленинград/134/17/57 (Н2И2) х А/Новая Каледония/20/99 (№N1) (скрещивание в куриных эмбрионах)

Селективные пассажи

и клонирование в куриных эмбрионах

1

Селективные пассажи

и клонирование в культуре клеток МОСК

I

6 2 реассортанты - 50% (6 из 12) 5.3 реассортанты - 50% (6 из 12) другие комбинации - 0% (0 из 12)

6:2 реассортанты - 9% (3 из 33) 5.3 реассортанты - 3% (1 из 33) другие комбинации - 88% (29 из 33)

Рисунок 2. Частота селекции реассортантов донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (Н2Ш) и эпидемического вируса А/Новая Каледония/20/99 (НШ1) с различной формулой генома в разных системах культивирования

Подобное расхождение в составах генома реассортантов, полученных из единого материала скрещивания в РКЭ при использовании для селекции и клонирования двух разных субстратов, говорит о принципиальных различиях этих систем в способности поддерживать репродукцию тех или иных реассортантных вирусов. Если в куриных эмбрионах преимущество получают реассортанты, содержащие практически все внутренние гены от донора аттенуации, то в клеточной системе такие клоны очевидно селектируются гораздо хуже, и поддерживается преимущественно репликация реассортантов, содержащих несколько внутренних генов от эпидемического родителя. Данный эксперимент наглядно продемонстрировал необходимость модификации самой методики реассортации в культуре клеток МОСК.

Использование для скрещивания различных соотношений эпидемического вируса и

холодоадаптировапного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (Н2Ш)

Для того чтобы преодолеть такой недостаток культуральной системы, как направленное поддержание репродукции реассортантов, содержащих гены М и N8 от эпидемического родительского вируса, были предприняты попытки изменить соотношение инфекционных титров

донора аттенуацнн и эпидемического вируса на этапе скрещивания в пользу донора. Мы провели эксперимент по скрещиванию эпидемических вирусов и донора аттенуации не только в соотношении 1 : 1, но и при десяти- и стократном преобладании донора аттенуации (табл.2). В данном эксперименте нам не удалось изолировать реассортанты, содержащие все шесть внутренних генов от донора аттенуации, однако анализ частоты перехода в реассортанты внутренних генов от родительских вирусов показал, что при увеличении концентрации донора аттенуации значительно увеличивался процент перехода в реассортанты проблемных генов - ОТ, М и N8 (табл.2).

Таблица 2 Частота наследования внутренних генов реассортантами от эпидемического или холодоадаптированного вируса в зависимости от соотношения взятых для скрещивания родительских вирусов

Соотношение донор2: Число реассортантов Гены от' Частота наследования генов'

РВ2 РВ1 РА 1МР М N8

1 : 1 21 «дикого» родителя 6 28.6% 7 33.3% 7 33.3% 19 90.5% 17 81.0% 19 90.5%

донора аттенуации 15 71 4% 14 66 7% 14 66 7% 2* 9 5% 4** 19 0% 2* 9 5%

10: 1 13 «дикого» родителя 3 23 1% 3 23 1% 2 15 4% 9 69 2% 8 61 5% 11 84 6%

донора аттенуации 10 76 9% 10 76 9% 11 84 6% 4 30.8% 5 38.5% 2 15 4%

100: 1 12 «дикого» родителя 1 8 3% 3 25 0% 1 8 3% 6 50% 5 41.7% 6 50%

донора аттенуации 11 91.7% 9 75 0% 11 91.7% 6* 50% 7** 58.3% 6* 50%

все реассортанты содержат поверхностные антигены от «диких» родителей донор аттенуации -А/Ленинград/134/17/57 (Н2Ы2), 3«дикие» родители А/Калифорния/7/2004 (НЗЫ2), А/Малайзия/О 1/04 (НЗЫ2), А/Висконсин/67/05 (НЗЫ2) различия между группами достоверны при: *р=0,02; **р=0,05

Поэтому на следующем этапе разработки методики мы использовали для скрещивания донор аттенуации Лен/17 и эпидемический вирус А/Малайзия/О 1/04 (Н3№) с еще большим преобладанием донора, а именно в соотношении 10000 : 1 (рис.З-о). В данном случае нам удалось изолировать исключительно варианты с формулой генома 5.3 и 4:4, содержащие 4 или 5 генов от донора аттенуации (табл.3). То есть, число различных вариаций состава генома реассортантов резко сократилось по сравнению с использованием на этапе скрещивания вирусов, взятых в равных соотношениях, и при этом выход реассортантов с формулой генома 5:3 значительно увеличился (60% против 32%, р=0,008). Однако необходимо отметить, что в этом опыте нам также не удалось получить 6.2 реассортанты, содержащие все шесть внутренних генов от донора аттенуации.

В связи с этим, в следующем эксперименте мы еще более увеличили составляющую донора аттенуации по сравнению с эпидемическим вирусом на этапе скрещивания (рис.3-б). Примечательно, что в данном случае полученные реассортанты наследовали от донора аттенуации либо 5 внутренних генов, либо все шесть, при этом процент выхода 6:2 реассортантов достигал 61% (табл 3).

б)

эпидемяческии вирус

донор аттенуации

эпидемческии вирус

Рисунок 3. Инфекционная активность использованных для скрещивания донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (НЗЫ2) и эпидемического вируса А/Малайзия/О 1/04 (НЗШ)

Таблица 3. Эффективность получения в культуре клеток МОСК. реассортантов с различной формулой генома при использовании разных соотношений

взятых для скрещивания родительских вирусов_

Формула генома Лен/17 : Число реассортантов Состав генома реассортантов

РВ2 РВ1 РА НА № МА м

Соотношение «донор аттенуации: эпидемический вирус» = 10000:1

5 : 3 (58.8%) 4 17 17 17 \\'Г 17 М 17

4 17 17 17 М ЧЛ 17 17

2 17 17 Ч/\. 17 4/1 17 17

4:4(41.2%) 4 17 17 чл 17 Ш 17

1 17 17 Ч1\. ЧЛ 17 17

2 17 17 17 ЧЛ ч/1 17

Гены унаследованы от: «дикого» родителя, % 0 0% 7 41.2% 0 0% 17 100% 7 41.2% 17 100% 0 0% 10 58 8%

донора аттенуации, % 17 100% 10 58.8% 17 100% 0 0% 10 58 8% 0 0% 17 100% 7 41 2%

Соотношение «донор аттенуации: эпидемический вирус» = 10000000:1

6:2 (60.9%) 28 17 17 17 17 17 17

5 : 3 (30.1%) 9 17 17 17 Ш 17 17

7 17 17 17 чл ЛУ1 17 17

2 17 17 17 чЛ 17 17

Гены унаследованы от: «дикого» родителя, % 0 0% 0 0% 0 0% 46 100% 7 15 2% 46 100% 2 4.3% 9 19 6%

донора аттенуации, % 46 100% 46 100% 46 100% 0 0% 39 84.8% 0 0% 44 95.7% 37 80 4%

'донор аттенуации - А/Ленинград/134/17/57 (Н2Ы2), 2«дикий» родитель: А/Малайзия/О 1/04 (Н3№)

Таким образом, только используя соотношение «донор аттенуации : эпидемический вирус», равное 10000000 : 1 на этапе скрещивания, стало возможно регулярно получать реассортанты с вакцинной формулой генома в культуре клеток МОСК. Поэтому данный методический прием может быть рекомендован для регулярного получения вакцинных реассортантов для живой гриппозной вакцины в культуре клеток МОСК

РАЗРАБОТКА КУЛЬТУРАЛЬНЫХ МАРКЕРОВ АТТЕНУАЦИИ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ ЖИВОЙ ГРИППОЗНОЙ ВАКЦИНЫ

Наличие у вакцинных штаммов адекватных маркеров аттенуации, коррелирующих с безвредностью для человека, во многом определяет успешное получение реассортантов для живой гриппозной вакцины.

«Яичные» маркеры аттенуации штаммов живой гриппозной вакцины. Уже в течение многих лет для оценки биологических свойств вакцинных реассортантов используют маркеры температурочувствительности маркер) и холодоадаптированности (са маркер), т.е. активность репродукции вируса в куриных эмбрионах при повышенной (40°С для вирусов гриппа А и 38°С для вирусов гриппа В) и пониженной температуре (25-26°С) соответственно. Эти маркеры могут быть эффективными, если эпидемический вирус, взятый для скрещивания, обладает противоположными свойствами (лоя-й и поп-са фенотипом) Мы показали, что большинство современных эпидемических вирусов проявляют высокую чувствительность к повышенным температурам при размножении в РКЭ, в результате чего теряется возможность использовать й фенотип доноров аттенуации, определенный в РКЭ, в качестве критерия аттенуации реассортантных вирусов Кроме того, на примере некоторых эпидемических вирусов гриппа А показано, что са маркер, определенный в данной системе, также может быть неинформативным, т.к. показатели КСТгб таких вирусов практически неотличимы от донора аттенуации. Поэтому необходим поиск новых маркеров аттенуации, позволяющих дифференцировать ХА штаммы от эпидемических вирусов с любыми фенотипическими признаками.

Особенности репродукции эпидемических и холодоадаптированных вирусов гриппа А и В в культуре клеток МОСК и куриных эмбрионах при повышенной температуре инкубации

Мы провели сравнительное исследование способности эпидемических и ХА вирусов гриппа А и В к репродукции в РКЭ и культуре клеток МОСК при температуре инкубации 25-40°С Анализ ростовых характеристик эпидемических вирусов гриппа и доноров аттенуации в РКЭ и культуре клеток МОСК при повышенной температуре выявил различия в чувствительности этих субстратов. Показано, что все исследованные эпидемические вирусы гриппа А(НПчИ), А(Н2Ш), А(НЗШ) и В, независимо от их температурочувствительности в РКЭ, в культуре клеток МОСК проявляли высокую степень температуроустойчивости, сохраняя высокие инфекционные титры

вплоть до 40°С (для вирусов гриппа А) и 38°С (вирусы гриппа В). Изучение репродукции ХА вирусов гриппа при повышенной температуре выявило, что культура клеток MDCK является более чувствительной системой по сравнению с куриными эмбрионами и позволяет выявлять ts фенотип доноров атгенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) и В/СССР/60/69, а также вакцинных штаммов на их основе уже при 37°С и 38°С соответственно.

Культуральпые ts и са маркеры аттепуации вакцинных штаммов ЖГВ. Суммируя полученные данные, нами был выбран оптимальный температурный режим инкубации вирусов гриппа в культуре клеток, позволяющий четко дифференцировать все эпидемические вирусы гриппа от ХА вирусов (рис.4, а-6). Из рисунка 4-а видно, что в культуре клеток при температуре 37°С титр всех ХА вирусов гриппа А снижался по сравнению с титром при 32°С на 3,5 lg ТЦИДго/мл и более, тогда как RCT37 эпидемических вирусов не превышала 1,2 lg ТЦИД50/мл (р<0,001).

холодоадаптироеанные

5 -¡UßVtU-1

_ г т т

4 -■■■TT

эпидемические вирусы "™И~М~Ш"|™Ж|

а : | | М М

„_____I I I I I

.3 -

123456789 10 11 12 13 14

холодоадаптированны

6 вирусы

а -i-

4-krr-

^ эпидемические вирусы ■ ■ у

Hrhtrtfiili Hill

15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32

Рисунок 4. Сравнительный анализ инфекционной активности в культуре клеток MDCK эпидемических и холодоадаптированных вирусов гриппа: а - типа А при 32°С и 37°С; б - типа В при 32°С и 38°С.

По оси абсцисс - исслсдованиыс вирусы гриппа, по оси ординат - разница в репродукции вируса при 32°С и 37°С (а) или 32°С и 38°С (б), выраженная в lg ТЦИД„/мл (RCTJ7 RCT,8), обомачения I - A/PR/8/34 (HINI), 2-А/Новая Калсдония/20/99 (НINI), 3 - А/Ленинград/134/57 (H2N2), 4 - А/Сиднсй/5/97 (H3N2), 5 - А/Калифорния/7/04 (H3N2), 6 - А/Санкт-Пстсрбург/11/01 (HIN I), 7 - А/Астрахань/68/01 (HIN 1), 8 - А/Малайзия/01/04 (H3N2), 9 - А/Воронсж/511 /00 (H3N2), 10 - А/Лснинград/134/17/57 (H2N2), 11 - А/Лснинград/134/47/57 (H2N2), 12 - A/17/Новая Калсдония/99/145 (Н INI), 13 - А/17/Малаизия/04/11 (H3N2), 14 - А/17/Калифорния/04/6 (H3N2), !5-B/Lec/40, 16 - В/Россия/69, 17 - В/Шандонг/07/97, 18 - В/Гонконг/330/01,19- В/Иоганнссбург/05/99,20 - В/Пекин/184/93, 21 - В/Джилин/01/03, 22 - В/Архангсльск/312/99, 23 - В/Гаваии/13/04, 24 - В/Пснсильвания/02/96, 25 - В/Вашингтон/О 1/96,26 - В/Луизиана/01/96, 27 - В/Висконсин/03/96, 28 - В/СССР/60/69, 29 - В/60/Панама/90/4/Е, 30 -В/60/Пстсрбург/95/20, 31 - В/60/Гомконг/01/22, 32 - В/60/Джилнн/03/1

холодоадаптироеанные

-¡иши-1

т TT

1 1 III

эпидемические вирусы Ulli

X Hill

х 1 х Hill

TfiTf 1

I

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

вирусы т

эпидемические вирусы

lüiiriiiilt tt

15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32

Следует отметить, что все исследованные эпидемические и ХА вирусы гриппа А в культуре MDCK также достоверно отличались между собой и по признакам RCT38, RCT39 и RCT40, что может быть использовано в качестве дополнительных ts маркеров аттенуации. Для вирусов гриппа типа В (рис.4-б) инкубация только при температуре 38°С позволила отличать эпидемические вирусы от холодоадаптированных в культуре клеток MDCK. Так, титр эпидемических вирусов в культуре MDCK снижался при данной температуре не более чем на 2 lg ТЦИД50/мл по сравнению с титром при оптимальной температуре, тогда как RCT38 ХА вирусов составляла 3-5 lg ТЦИД50/мл (р<0.01)

Для разработки культурального маркера холодоадаптированности (са маркер) мы провели сравнительное изучение репродукции вирусов гриппа типов А и В в куриных эмбрионах и культуре клеток при 26°С. В большинстве случаев нам не удалось выявить различий в чувствительности этих субстратов - почти все исследованные вирусы проявляли в эмбрионах и культуре клеток сопоставимый уровень репродукции: доноры аттенуации и вакцинные штаммы с одинаковой интенсивностью воспроизводили са фенотип в обеих системах культивирования, тогда как эпидемические вирусы проявляли выраженный поп-са фенотип, одинаково плохо размножаясь при 26°С как в культуре клеток, так и в куриных эмбрионах. Однако показано, что могут встречаться единичные случаи, когда эпидемический вирус природно адаптирован к размножению в клетках млекопитающих при низкой температуре, хотя в куриных эмбрионах в данных условиях вирус почти не размножается В данном случае са маркер является неинформативным при отборе реассортантов с вакцинной формулой генома, и тем очевиднее становится ценность описанного выше культурального ts маркера аттенуации

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ СТАБИЛЬНОСТЬ ШТАММОВ ЖИВОЙ ГРИППОЗНОЙ ВАКЦИНЫ

Крайне важным аспектом безопасности применения ЖГВ является подтверждение ее высокой генетической стабильности Традиционно стабильность фенотипических и генетических признаков вакцинных штаммов изучают в экспериментах на РКЭ после их серийного пассирования при оптимальной температуре инкубации 32-33°С (Киселева и др, 2002) или анализируя постоянство свойств изолятов, выделенных от привитых животных (Marsh, 2003; Киселева и др , 2005) или людей (Руденко и др , 1988; Klimov е.а , 1995, 1996, 2001; Belshe, 2004; Cha е.а., 2000, Davenport еа, 1977). В литературе встречаются упоминания о том, что последовательные пассажи ХА вакцинных штаммов при повышенной температуре инкубации могут привести к реверсии «дикого» фенотипа вируса (Банников и др., 2004; Маркушин и др., 2006). Поэтому представлялось необходимым провести дополнительную оценку стабильности генетических и фенотипических свойств реассортантных вакцинных штаммов ЖГВ, подготовленных как в РКЭ, так и в культуре клеток MDCK, при пассировании не только при

оптимальной, но и при повышенных температурах инкубации. Нами было продемонстрировано, что вакцинные штаммы ЖГВ типа А, подготовленные в РКЭ, сохраняли свои признаки температурочувствительности и холодоадаптированности после пятикратного пассирования в куриных эмбрионах как при оптимальной (32°С), так и при повышенной температуре 37°С. Данный факт подтверждается также тем, что температура 37°С является оптимальной при репродукции ХА вирусов гриппа А в куриных эмбрионах, и со стороны этой системы на вирус не существует селективного давления. Интересно, что попытка пассирования ХА вирусов гриппа А в РКЭ при температуре 39-40°С не увенчалась успехом - уже на втором пассаже инфекционный вирус не определялся. Это говорит о невозможности обратной переадаптации ХА вирусов к исходному фенотипу вирулентного родителя, свидетельствуя о высокой генетической стабильности аттенуирующих мутаций в их геноме.

При изучении генетической стабильности культуральных реассортантных штаммов, а также исходного донора аттенуации Лен/17 при их пассировании в культуре клеток МОСК, мы показали, что, как и в случае пассирования ХА вирусов в РКЭ при оптимальной температуре, серийные пассажи в клеточной культуре при 32°С не приводили к изменению фенотипических характеристик исследуемых вирусов, а также к замене маркерных мутаций, характерных для аттенуированных вирусов. Более того, пассажи ХА вирусов в клетках при температуре 37°С приводили к абортированию инфекции уже на втором пассаже. Этот факт однозначно свидетельствует о невозможности ХА вирусов вызывать продуктивную инфекцию в нижних отделах респираторного тракта привитых лиц, поскольку, в отличие от РКЭ, культура клеток МОСК адекватно отражает реальную степень вирулентности вирусов гриппа Таким образом, нами была продемонстрирована высокая степень генетической стабильности ХА реассортантных штаммов ЖГВ после пассирования как в РКЭ, так и культуре клеток МОСК.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК МОСК ДЛЯ ИЗОЛЯЦИИ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ ЖГВ ОТ ПРИВИТЫХ лиц

Последней задачей настоящего исследования являлась оценка возможности использования культуры клеток МОСК для выделения вакцинных штаммов ЖГВ от привитых лиц, поскольку наличие оптимальной системы для выделения вакцинных изолятов играет важную роль при оценке генетической стабильности штаммов ЖГВ, а также ее трансмиссивности. Мы изучили эффективность использования культуры МОСК и РКЭ для реизоляции вакцинных штаммов от детей 3-6 лет, привитых коммерческой «яичной» ЖГВ. В недавних исследованиях московских (Иванова и др., 2003, 2004, 2006) и петербургских ученых (Шушоуэ е.а., 2004) отмечается все меньшая частота выделения ряда эпидемических вирусов гриппа в системе РКЭ, они приобретают все больший тропизм к клеткам млекопитающих. Вакцинные штаммы для коммерческой ЖГВ готовят в РКЭ, поэтому следовало ожидать, что они должны максимально

эффективно выделяться именно в системе куриных эмбрионов. Однако сравнительное исследование показало, что компоненты A(HINI) и A(H3N2) выделяются в двух системах практически одинаково, тогда как компонент В достоверно чаще выделялся в клетках MDCK (р=0,008) Можно предположить, что при репликации в верхних дыхательных путях восприимчивых людей чувствительность вакцинного вируса к РКЭ может несколько снижаться, и только с использованием культуры клеток млекопитающих возможно адекватно оценивать вышеперечисленные характеристики вакцинных вирусов.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что последовательное пассирование в культуре клеток MDCK современных эпидемических вирусов гриппа A(H3N2) приводит к утрате их чувствительности к эритроцитам кур, а также способности активно размножаться в куриных эмбрионах.

2. Показано, что схема подготовки реассортантных вакцинных штаммов ЖГВ, разработанная для системы РКЭ, является неэффективной для их подготовки в культуре клеток MDCK.

3. Увеличение используемого при скрещивании соотношения инфекционных титров донора аттенуации и эпидемического вируса до 10000 . 1 привело к эффективному получению реассортантов с формулой генома 5:3. Дальнейшее увеличение этого соотношения до 10000000 : 1 позволило повысить частоту выхода реассортантов с вакцинной формулой генома 6:2 до 60%.

4. Разработаны культуральные ts и са маркеры аттенуации, позволяющие отбирать реассортантные вакцинные штаммы, подготовленные как в культуре клеток MDCK, так и в развивающихся куриных эмбрионах.

5. Вакцинные штаммы ЖГВ, подготовленные в системе РКЭ и культуре клеток MDCK, являются генетически стабильными после их пассирования в куриных эмбрионах и/или в культуре клеток MDCK.

6. Культура клеток MDCK является эффективной системой для выделения вакцинных штаммов от лиц, привитых «яичной» живой гриппозной вакциной.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи:

1. Киселева И.В., Ларионова Н.В., Литвинова О.М., Иванова В.В., Исакова И.Н., Медведева

Т.Е., Александрова Г.И., Руденко Л.Г. Изменение признака температурочувствительности как

отражение эволюционной изменчивости эпидемических штаммов вируса гриппа // Мед Акад.

Журн,- 2002 - Т.2 - №3,- С.49-57.

2. Киселева И В., Ларионова H В., Исакова И.Н., Руденко Л.Г. Генетическая стабильность холодоадаптированных вирусов гриппа // Вопр. Вирусол.- 2006.- №4.- С.13-16.

3. Ларионова Н.В., Киселева И.В., Литвинова О.М., Исакова И.Н., Руденко Л.Г. Фенотипические особенности эпидемических штаммов вируса гриппа В разных лет выделения // Вопр. Вирусол - 2006 - №5.- С.38-41.

4. Исакова И.Н., Ларионова Н.В., Олейник Е.С., Киселева И.В. Культура клеток MDCK как перспективный субстрат для подготовки живых гриппозных вакцин // Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины / АГМА.- Астрахань-Волгоград-Москва, 2006,- С.200-203.

5 Исакова И.Н., Киселева И.В., Ларионова Н.В., Олейник Е.С., Руденко Л.Г. Лабораторные маркеры аттенуации штаммов живой гриппозной вакцины // Вопр. Вирусол,- 2007.- №4 (в печати).

Тезисы:

6. Larionova N., Kiseleva I., Isakova I., Litvinova O., Klimov A., Rudenko L. Naturally occurring temperature-sensitive strains of influenza В virus // In Abstract book of "IVW-2004 Conference".-2004, 24-26 May, Lisbon, Portugal. Poster session A.- P.92-97.

7. Ларионова H.B., Киселева И.В., Исакова И.Н., Литвинова О.М., Руденко Л Г. Критерии отбора эпидемических вирусов гриппа при подготовке живой реассортантной вакцины // Научно-практическая конференция с международным участием «Медицинские иммунобиологические препараты для профилактики, диагностики и лечения вирусных инфекций», 10-11 ноября 2004 г. Москва. С 40-41.

8 Исакова И.Н., Ларионова Н.В., Олейник Е С., Амосова А.Ф., Киселева И.В. Новое поколение профилактических препаратов против гриппа: культуральная живая гриппозная вакцина // Всероссийская конференция молодых исследователей «Физиология и медицина». 14-16 апреля 2005 г. Санкт-Петербург. С.47.

9. Исакова И.Н., Ларионова Н.В., Киселева И.В. Стабильность генетических и фенотипических признаков отечественной живой холодоадаптированной реассортантной гриппозной вакцины // Всероссийская конференция молодых исследователей «Физиология и медицина». 14-16 апреля 2005 г. Санкт-Петербург. С.47.

10. Isakova I., Kiseleva I., Larionova N., Rudenko L. Genetic and phenotypie stability of Russian live attenuated cold-adapted reassortants influenza vaccine // The second European Influenza Conference. 11-14 October 2005. St. Julian, Malta P.60.

11. Олейник E.C., Исакова И.Н. Особенности репродукции эпидемических и холодоадаптированных вирусов гриппа в различных системах инкубации // Научно-практическая конференция молодых ученых с международным участием «ВЧЕН1 МАИБУТНЬОГО», 25-26 октября 2006 г., Одесса,- С.83.

12. Олейник Е С., Исакова И.Н., Киселева И.В., Ларионова Н.В. Отработка этапов подготовки живой гриппозной реассортантной вакцины в культуре клеток MDCK // Межвузовская научная конференция «XXXIV неделя науки СПбГПУ», 20-25 ноября 2006 г. Санкт-Петербург. С.76.

Лицензия ЛР №020593 от 07.08.97

Подписано в печать 19.03.2007. Формат 60x84/16. Печать цифровая. Усл. печ. л. 1,0 Тираж 100. Заказ 1399Ь.

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в Цифровом типографском центре Издательства Политехнического университета. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29 Тел.: 550-40-14 Тел./факс. 297-57-76