Разработка и использование препаратов растительного происхождения в технологиях создания гриппозных вакцин

Мазуркова, Наталья Алексеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка и использование препаратов растительного происхождения в технологиях создания гриппозных вакцин
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Разработка и использование препаратов растительного происхождения в технологиях создания гриппозных вакцин"

На правах рукописи

Мазуркова Наталья Алексеевна

РАЗРАБОТКА И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПРЕПАРАТОВ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ В ТЕХНОЛОГИЯХ СОЗДАНИЯ ГРИППОЗНЫХ

ВАКЦИН

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

1 3 ДЕК 2012

КОЛЫДОВО-2013

005057285

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»

Научные консультанты:

Трошкова Галина Павловна, доктор биологических наук, профессор Рябчикова Елена Ивановна, доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты:

Белявская Валентина Александровна

доктор биологических наук, профессор, ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», зав. сектором отдела научно-методической подготовки персонала по работе с возбудителями особо опасных инфекций Гуляева Людмила Федоровна

доктор биологических наук, профессор, ФГБУ «НИИ молекулярной биологии и биофизики» СО РАМН, зав. лабораторией молекулярных механизмов канцерогенеза Киселева Ирина Васильевна

доктор биологических наук, ФГБУ «НИИ экспериментальной медицины» СЗО РАМН, зав. лабораторией вакцинных штаммов

Ведущая организация

Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности, РАСХН, г. Щелково, Московская область

Защита состоится «01» марта 2013 г. в 9-00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.020.01 при ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» по адресу: р.п. Кольцово, Новосибирского района, Новосибирской области, 630599; тел: (383) 336-74-28

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»

Автореферат разослан < ноября 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор

ТТрошкова Галина Павловна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. В России ежегодно регистрируют от 27,3 до 41,2 млн. случаев гриппа и других ОРВИ (Stohr К., 2002). Субтип вируса гриппа A/H5N1 (грипп птиц, «птичий грипп») обладает наиболее высоким пандемическим потенциалом из 15 известных (Chang S. et al., 2007). Полагают, что его генетическая реассортация с сезонным вирусом гриппа человека может привести к появлению высоко патогенного пандемического варианта (Octaviani СР. et al., 2011).

Важной частью противоэпидемических мероприятий по ограничению распространения гриппа и снижению смертности является вакцинопрофилактика, осуществляемая с помощью живых и инактивированных вакцин. В настоящее время оба типа гриппозных вакцин в России производятся на развивающихся куриных эмбрионах. Этот субстрат далеко не идеален: помимо возможной контаминации инфекционными агентами, получение куриных эмбрионов и, соответственно, вакцин на их основе, может быть блокировано при вспышке гриппа птиц. В этих условиях альтернативой может стать использование в качестве субстрата перевиваемых линий клеток (ПЛК*), позволяющее развернуть быстрое и масштабное изготовление культуральных вакцин (Merten O.W., 2002; Genzel Y. et al., 2009). ВОЗ с 1995 г. рекомендует разрабатывать и производить гриппозные вакцины с использованием в качестве субстрата ПЛК, аттестованных в соответствии с международными требованиями (WHO, 1995, 2005). В России имеется аттестованный в соответствии с требованиями ВОЗ банк клеточной линии MDCK (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор») (Радаева И.Ф. и др., 2005).

Важнейшей характеристикой вакцинных препаратов является безопасность, повысить которую можно, исключив, или ограничив использование компонентов животного происхождения в производстве вакцин (Ulmer J.B. et al., 2006).

*Списон сокращений - на обороте автореферата.

Государственные агентства, контролирующие производство фармацевтической продукции в Европе (European Medicine Evaluation Agency, EMEA) и США (Food and Drug Administration, FDA) призвали ведущие фармацевтические компании исключить или ограничить использование компонентов животного происхождения в производстве вакцин (Castle Р. et al., 1999). Это подчеркивает актуальность разработки технологий, позволяющих заместить компоненты животного и человеческого происхождения продуктами растительной природы. Ряд исследователей разрабатывает среды для культур клеток млекопитающих, свободные от животных компонентов. Так, при производстве культуральных гриппозных вакцин перевиваемые линии клеток выращивают в бессывороточных питательных средах: MDCK - в средах MDSS2 и MDSS2N (Франция) (Merten O.W., 2002), EpiSerf (Gibco) (Голландия) (Brands R. et al., 1996; Palache AM. et al„ 1999), UltraMDCK (BioWHITTAKER); Vero - в среде EM (Axell Biotechnologies) (Австрия) (Kistner О., 1998, 1999, 2001).

В России в настоящее время не существует отечественных бессывороточных и малосывороточных культуральных питательных сред для клеток MDCK и Vero - субстрата гриппозных вакцин, а импортные дороги, и их использование нерентабельно. Следовательно, разработка отечественных культуральных сред, не содержащих сыворотку, или содержащих ее сниженные концентрации, является крайне актуальной. Наибольший интерес для культуральных технологий гриппозных вакцин, которые должны быть не только рентабельны, но и отвечать все более жестким критериям биологической безопасности, могут представлять среды на основе ферментативных гидролизатов растительного сырья. Стоимость вакцинного препарата также важна для обеспечения вакциной против гриппа всего населения (Позиция ВОЗ, 2005), и она может быть значительно снижена при применении отечественных питательных сред на основе ферментативных гидролизатов доступного растительного сырья.

Замена препаратов животного происхождения (сыворотки и трипсина в

составе питательных сред, желатина (желатозы) в составе стабилизатора для ЖГВ) на растительные продукты является еще одной возможностью повышения безопасности гриппозных культуральных вакцин.

Безопасность гриппозных вакцин может быть также повышена за счет использования синтетических пептидов, соответствующих консервативным аминокислотным (АК) последовательностям сайтов гемагглютинина, которые вызывают иммунный ответ. Такие вакцины могут обеспечить защиту от всех типов вируса гриппа, включая пандемические штаммы, и их разработка рекомендована ВОЗ (WHO, Geneva, 1997).

Цель исследования. Цель настоящей работы — разработать и апробировать препараты на основе материалов растительного происхождения для получения эффективных и безопасных культуральных и пептидных гриппозных вакцин. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Сконструировать бессывороточные и малосывороточные питательные среды на основе ферментативного гидролизата соевой муки, полученного с использованием растительного протеолитического фермента бромелаина.

2. Апробировать бессывороточные и малосывороточные питательные среды на основе ферментативных гидролизатов соевой и рисовой муки, полученных с помощью бромелаина и трипсина, для культивирования перевиваемых линий клеток MDCK и Vero и оценить их влияние на морфологические, пролиферативные и кариологические характеристики клеток, а также на чувствительность клеток к штаммам вируса гриппа, используемым для производства инактивированной и живой гриппозной вакцины.

3. Оценить возможность замены трипсина на растительные протеазы папаин и бромелаин в составе питательных сред на основе ферментативных гидролизатов растительного сырья и определить оптимальные условия их применения для максимального накопления в перевиваемых линиях клеток MDCK и Vero штаммов вируса гриппа для производства инактивированной (субтипов A/H1N1, A/H3N2 и типа В) и живой вакцины (субтипа A/H5N2).

4. Провести сравнительное исследование ультраструктурных параметров репродукции вируса гриппа А/17/утка/Потсдам/86/92 (H5N2) в культурах клеток MDCK и Vero при культивировании в экспериментальных средах на основе растительных компонентов и контрольных средах и при замене трипсина на папаин и бромелаин.

5. Разработать и апробировать стабилизатор на основе ферментативного гидролизата соевой муки, полученного с помощью бромелаина, в качестве средства сохранения в процессе лиофильного высушивания максимальной инфекционной активности выращенного в перевиваемой линии клеток MDCK вакцинного штамма вируса гриппа субтипа A/H5N2.

6. Определить оптимальные условия использования растительных препаратов (питательных сред, ферментов и стабилизатора) на основных стадиях разработки живой культуральной вакцины против вируса гриппа субтипа A/H5N2 в роллерах.

7. Оценить генетическую и фенотипическую стабильность вакцинного штамма вируса гриппа субтипа A/H5N2, выращенного на перевиваемой линии клеток MDCK с использованием растительных препаратов (питательных сред, ферментов и стабилизатора), а также его иммуногенность на экспериментальных моделях животных.

8. Оценить влияние растительного имуномодулятора Иммуномакс на иммунный ответ экспериментальных животных при иммунизации их синтетическими пептидами НА1 гемагглютинина вируса гриппа субтипа A/H3N2.

Научная новизна. В результате проведенных исследований впервые:

- сконструирована кулыуральная малосывороточная питательная среда на основе ферментативного гидролизата соевой муки, полученного с помощью растительного протеолитического фермента бромелаина, и изучены ее физико-химические свойства;

- доказана пригодность и перспективность применения разработанной питательной среды на основе ферментативного гидролизата соевой муки для наработки перевиваемых линий клеток MDCK и Vero и вируса гриппа;

- экспериментально обосновано применение растительных протеаз (папаина и бромелаина) в составе гидролизатных питательных сред и определены оптимальные биотехнологические условия их использования для накопления в перевиваемых линиях клеток MDCK и Vero вируса гриппа в производстве инактивированной и живой вакцины, позволяющие обеспечить выход вирусной массы, сравнимый с таковым при применении трипсина;

- экспериментально установлено, что использование экспериментальных сред на основе ферментативных растительных гидролизатов и растительных протеаз не влияет на морфогенез и репродуктивную активность вируса гриппа субтипа A/H5N2 при культивировании его в клетках MDCK и Vero;

экспериментально показано, что применение стабилизатора, сконструированного на основе ферментативного гидролизата сои, полученного с помощью бромелаина, обеспечивает в процессе лиофильного высушивания максимальное сохранение инфекционной активности наработанного в клетках MDCK вакцинного штамма вируса гриппа субтипа A/H5N2;

- экспериментально показано, что использование растительных препаратов не влияет на генетическую стабильность вакцинного штамма вируса гриппа субтипа A/H5N2 и на параметры иммунного ответа при введении этого штамма лабораторным животным;

экспериментально показано, что применение растительного иммуномодулятора Иммуномакс в качестве адъюванта усиливает иммунный ответ на синтетические пептиды из вариабельного и консервативного сайтов НА1 гемагглютинина вируса гриппа A/H3N2.

Приоритет и новизна научных разработок диссертации защищены 2 патентами РФ (№ 2330885, № 2377295).

Практическая значимость работы. Экспериментально обосновано использование растительных препаратов (питательных сред, ферментов, стабилизатора) на основных стадиях роллерной технологии разработки безопасной и эффективной кульгуральной живой вакцины против гриппа субтипа A/H5N2.

Показаны экономические преимущества применения питательной среды на основе ферментативного гидролизата соевой муки, полученного с использованием бромелаина, для создания и производства кулыуральных гриппозных вакцин.

Установленные параметры применения растительных препаратов при разработке и производстве культуральных гриппозных вакцин обеспечат повышение их безопасности.

Внедрение растительных препаратов в производство культуральных гриппозных вакцин позволит отказаться от дорогостоящих импортных компонентов.

Положения, выносимые на защиту.

1. Экспериментальная питательная среда на основе ферментативного гидролизата соевой муки, полученного с помощью растительного протеолитического фермента бромелаина, содержащая сниженное количество (с 5-10 % до 2 и 3 %) сыворотки, пригодна для культивирования перевиваемых линий клеток MDCK и Vero, являющихся субстратом для культуральных гриппозных вакцин.

2. Использование растительных ферментов бромелаина и папаина в составе питательных сред на основе ферментативных гидролизатов сои и риса позволяет получать высокие инфекционные титры вирусов гриппа (9,0-9,5 lg ТЦД50/мл) для производства инактивированной и живой вакцин в перевиваемых линиях клеток MDCK и Vero. Максимальное накопление вакцинных штаммов вируса гриппа для живой и инактивированной гриппозной вакцины в клеточных линиях MDCK и Vero при использовании растительных препаратов (сред и ферментов) зависит от

множественности инфекции, вида и концентрации протеазы, адаптации штаммов вируса к клеткам. Для живой гриппозной вакцины критическим является время сбора «урожая» вируса.

3. Стабилизатор, содержащий 10 % сахарозы и 5 % соевого гидролизата, полученного с помощью бромелаина, обеспечивает сохранение инфекционной активности вакцинного штамма вируса гриппа А/17/утка/Потсдам/86/92 (Н5К2), выращенного в перевиваемой клеточной линии МЭСК при использовании питательной среды на основе ферментативного гидролизата сои и в присутствии бромелаина, на стадии сублимационного высушивания и при хранении в течение 1 года.

4. Усовершенствование технологии приготовления живой культуральной гриппозной вакцины субтипа А/Н5И2 с использованием растительных препаратов включает (1) наработку клеток МИСК в роллерах в малосывороточной (2 %) среде на основе ферментативного гидролизата сои, полученного с использованием бромелаина; (2) накопление в присутствии 20 мкг/мл бромелаина холодоадаптированного вакцинного штамма вируса гриппа А/17/утка/Потсдам/86/92 (Н5Ы2) в выращенных клетках; (3) введение в культуральную вируссодержащую жидкость стабилизатора, содержащего 10 % сахарозы и 5 % соевого гидролизата, полученного с помощью бромелаина; (4) сублимационное высушивание.

5. Сухие культуральные (МИСК) вакцинные образцы, содержащие штамм вируса гриппа субтипа А/Н5№, полученные с использованием растительных препаратов, генетически стабильны и иммуногенны для мышей. При двукратной интраназальной иммунизации животных они индуцируют выработку системных и локальных антител не только к гомологичному вирусу, но и к высокопатогенным вариантам вируса гриппа птиц А/Н5Ш.

6. Применение растительного иммуномодулятора Иммуномакс обеспечивает усиление иммунного ответа у мышей при иммунизации синтетическими пептидами из вариабельного и консервативного сайтов тяжелой цепи

гемагглютинина вируса гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2), без дополнительного введения адъюванта Фрейнда.

Внедрение результатов работы. Разработаны и утверждены в ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» СОП на основные стадии создания живой культуральной гриппозной вакцины субтипа A/H5N2 с использованием растительных препаратов: СОП № 3-007/01-12 «Получение ферментативного гидролизата соевой муки с использованием бромелаина», СОП № 3-006/01-12 «Выращивание клеток перевиваемых линий MDCK и Vero в роллерах в питательной среде на основе ферментативного гидролизата соевой муки, полученного с использованием бромелаина», СОП № 3-005/01-12 «Репродукция холодоадаптированного вируса гриппа А/17/утка/Потсдам/86/92 (H5N2) в присутствии бромелаина или папаина в перевиваемой клеточной линии MDCK, выращенной в роллерах в питательной среде на основе ферментативного гидролизата соевой муки, полученного с использованием бромелаина». Разработаны технические условия «Ферментативный гидролизат соевой муки, полученный с помощью бромелаина, для научных исследований, сухой». Результаты работы внедрены в практику преподавательской работы кафедры фармацевтической технологии и биотехнологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Новосибирский государственный медицинский университет».

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на 7-й, 8-й и 9-й Международных конференциях «Новые информационные технологии в медицине и экологии» (Гурзуф, Украина, 1999, 2000, 2001), Международной научно-практической конференции, посвященной 50-летию НИИ проблем биологической безопасности «Биотехнология в Казахстане: Проблемы и перспективы инновационного развития» (Алматы, Казахстан, 2008), Международной научно-практической конференции «Проблемы совершенствования межгосударственного взаимодействия в подготовке к пандемии гриппа» (Новосибирская область, Кольцове, 2008), Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2010.

Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2010), Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы науки и образования» (Варадеро, Куба, 2011), Международной научно-практической конференции «Новые технологии, инновации, изобретения» (Мальдивские острова, 2011), Международной научно-практической конференции «Приоритетные направления развития науки, технологий и техники» (Рим-Флоренция, Италия, 2011), Международной научно-практической конференции «Инновационные медицинские технологии» (Москва-Париж, Россия-Франция, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 40 печатных работ, в том числе 21 статья (16 статей - в журналах, рекомендованных ВАК), 2 патента и 17 тезисов докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 305 страницах текста, состоит из глав: «введение», «обзор литературы», «материалы и методы», «результаты и обсуждение», «заключение», «выводы» и списка литературы, который содержит 482 источника, из них 79 отечественных и 403 -иностранных. Диссертация включает 66 таблиц и 20 рисунков.

Личный вклад автора. Идея, тема и план диссертации сформулированы автором на основании многолетних исследований (1985-2011 г. г.). Основная часть результатов получена и представлена для опубликования автором самостоятельно, а также при участии д-ра мед. наук, проф. Подчерняевой Р.Я. (исследования сред на клеточных линиях МОСК(И) и Уего(В)), д-ра мед. наук, проф. Исаевой Е.И. (вирусологические исследования на клеточных линиях МОСК(Н) и Уего(В)), канд. мед. наук Михайловой Г.Р. (кариологический анализ), д-ра биол. наук, проф. Рябчиковой Е.И. (электронно-микроскопические исследования), д-ра биол. наук, проф. Трошковой Г.П. (получение гидролизатов с использованием трипсина), д-ра хим. наук Баратовой Л.А. (аминокислотный анализ), Скарнович М.О. (сублимационное высушивание образцов), канд. хим. наук Самукова В.В (синтез пептидов). Вклад в работу других авторов отражен в публикациях по теме диссертации.

Автором лично или под ее руководством проведены: разработка оптимальных условий проведения гидролиза соевой муки с использованием бромелаина; изучение ростовых свойств питательных сред на основе гидролизатов растительного сырья; определение оптимальных условий роллерного культивирования перевиваемых линий клеток MDCK и Vero в экспериментальных питательных средах на основе гидролизатов растительного сырья; определение оптимальных условий выращивания вакцинных штаммов вируса гриппа для производства живой и инактивированной гриппозной вакцины в роллерах в клетках MDCK и Vero при использовании растительных препаратов; изучение иммуногенных и протективных свойств лиофильно высушенных культуральных вакцинных образцов, содержащих штамм вируса гриппа субтипа A/H5N2, полученных с использованием растительных препаратов; а также изучение иммуногенности вакцинных конструкций на основе синтетических пептидов в экспериментах на животных. Все материалы, использованные в диссертационной работе, проанализированы и обобщены лично автором.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Разработка технологии приготовления питательной среды на основе соевого гидролизата

Конструирование качественных питательных сред (ПС) относится к одному из главных технологических процессов в производстве культуральных вакцин. Химический состав ПС, чистота входящих в нее компонентов оказывают значительное влияние на качество клеточных культур и, как следствие, на наработку вирусов. Поскольку сыворотка крови может содержать контаминанты клеточных культур, то проблема разработки бессывороточных ПС на основе использования ферментативных гидролизатов растительных белков имеет важное значение для клеточных технологий.

Производство ПС на основе ферментативных белковых гидролизатов -сложная многооперационная технология, включающая последовательные процессы предварительного выбора источника белка и протеолитического

фермента, проведение гидролиза, очистку и высушивание полученного гидролизата, контроль его качества и дальнейшее приготовление на основе наработанного гидролизата стерильной питательной среды, а также контроль ее пригодности для культивирования клеток и вирусов. Изучение и оптимизация этих процессов необходимы для разработки культуральных вакцин на основе растительного сырья.

В ходе выполнения работы нами разработана малосывороточная питательная среда на основе ферментативного гидролизата соевой муки для ПЛК MDCK и Vero. При разработке технологии получения гидролизата сои была использована растительная протеаза бромелаин. Оптимальные параметры процесса гидролиза устанавливали, варьируя физико-химические параметры (температура, рН), связанные с максимумом активности фермента, определяя оптимальную продолжительность реакции и соотношение основных компонентов: субстрат:вода и ферментхубстрат. Критерием завершения процесса гидролиза служило постоянство величины аминного азота. Были определены условия гидролиза с использованием бромелаина, приводящие к максимальному выходу целевого продукта. Отработана технология получения соевого гидролизата с использованием бромелаина и получены образцы гидролизата со стандартными физико-химическими характеристиками.

Аминокислотный состав соевого гидролизата, полученного с использованием бромелаина, определен на аминокислотном анализаторе «Мультихром» в НИИ физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского МГУ. Суммарное количество аминокислот в гидролизате соевой муки, полученном с помощью бромелаина, составило 541,32 мг/г, в нем преобладают моноаминодикарбоновые АК: глутаминовая и аспарагиновая кислоты. Вдвое меньше в гидролизате содержание алифатических кислот (аргинин, лейцин, лизин, пролин и серин), наименьшее - серосодержащих АК: цистина и метионина. Отсутствуют глутамин и гетероциклическая АК триптофан. АК состав гидролизата учитывали при конструировании сбалансированного состава питательной среды для культур клеток MDCK и Vero. При конструировании

питательной среды была определена концентрация ферментативного гидролизата (от 1,25 до 3,2 г/л), обеспечивающая содержание аминного азота в пределах 120±40 мг/л, что соответствует содержанию такового в традиционных синтетических питательных средах (199 М - 80 мг/л, Игла MEM - 180±30 мг/л, RPMI-1640 - 200±40мг/л, F-12 - 130±30 мг/л по каталогу «Gibco Invitrogen Corpo ration»).

Сконструированная ПС для культивирования клеток MDCK и Vero включает в себя сбалансированный солевой раствор Хенкса, источник питательных веществ и ростстимулирующих факторов в виде растительного гидролизата, дополнительно введенные аминокислоты (L-глутамин, L-цистин, L-триптофан, L-метионин), глюкозу и некоторые витамины (табл. 1).

Таблица 1

Состав питательной среды на основе ферментативного гидролизата соевой муки, полученного с использованием бромелаина

№ п/п Наименование компонента Допустимые пределы изменения (мг/л) Оптимальные количества (мг/л) (М±т) (п=10)

1. гидролизат соевой муки 1250,0-3200,0 3000,00±0,15

2. Ь-глутамин 100,00-300,00 292,00±0,05

3. Ь-триптофан 5,00-10,50 10,00±0,07

4. Ь-метионин 15,00-20,00 15,00±0,09

5. Ь-цистин 10,00 - 40,00 28,00±0,12

6. холин хлорид 1,00-3,00 1,00±0,08

7. фолиевая кислота 0,20-1,10 1,00±0,03

8. никотинамид 0,20-1,10 1,00±0,05

9. кальция пантотенат 0,25 - 1,10 1,00±0,07

10. пиридоксаль гидрохлорид 0,20 - 1,10 1,00±0,09

11. тиамин гидрохлорид 0,20-1,10 1,00±0,05

13. мио-инозитол 0,20-2,10 2,00±0,06

14. рибофлавин 0,02 - 0,20 0,10±0,03

15. глюкоза 1000,00-3000,00 1000,00±0,15

16. сбалансированный солевой раствор Хенкса до 1 л 1 л

Примечание: М - среднее арифметическое; ш - ошибка среднего; п - число опытов.

Все исследованные физико-химические показатели среды были в пределах значений, характерных для синтетических питательных сред (199М, Игла, Игла MEM, RPMI-1640).

Пригодность среды для культивирования клеток линий MDCK и Vero была изучена в сравнительных исследованиях пролиферативных, морфологических и кариологических характеристик клеток, выращенных в сконструированной среде и в ранее разработанных нами средах на основе гидролизатов сои и риса, полученных с помощью трипсина (Трошкова Г.П. и др., 2006), а также в контрольных синтетических средах при разных концентрациях сыворотки крови плодов коровы (СКПК). Использовали клеточные линии MDCK и Vero, полученные из российских коллекций культур клеток (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», пгт Кольцове Новосибирской области) (обозначены MDCK(I) и Vero(I)) и (Института вирусологии им. Д.И. Ивановского МЗСР РФ, Москва) (обозначены MDCK (II) и Vero(B)).

Пролиферативная активность клеток - необходимая характеристика любых клеточных линий, культивируемых в питательных средах и используемых в качестве субстрата для приготовления иммунобиологических препаратов. Для изучения возможного влияния гидролизатных сред на клетки MDCK и Vero данный параметр оценивали при культивировании в течение 10 пассажей в экспериментальных и контрольных питательных средах в культуральных флаконах. Использование ПС на основе растительных гидролизатов с 3 % сыворотки обеспечивает в течение 10-и пассажей достоверно (р<0,05) более высокую пролиферативную активность клеток культуры Vero(B), чем контрольная среда DMEM с 3 % сыворотки, а среда с 2 % сыворотки -достоверно (р<0,05) более высокую пролиферацию клеток культуры MDCK(II) по сравнению с контрольными средами SFM4 MegaVir и DMEM, содержащими 2 % СКПК. Использование питательных сред на основе гидролизатов рисовой и соевой муки с 2 % сыворотки обеспечивает наработку клеток культуры MDCK(I) с пролиферативными параметрами, аналогичными таковым при использовании контрольной среды Stem Alpha.MDCK, что существенно

позволит снизить затраты на их культивирование. Аналогичные результаты были получены при культивировании обеих клеточных линий в экспериментальных средах в роллерах (табл. 2).

Таблица 2

Ростовые характеристики клеток MDCK и Vero из разных коллекций при культивировании в роллерах в экспериментальных и контрольной средах

плк Питательная среда Концентрация сыворотки (%) Количество клеток х 105 (кл/см2) (M±m)(n=6) Индекс пролиферации (М±ш) (п=6)

Vero(I) ОМЕМ (контроль) 5 1,90±0,01 5,8±0,01

Соевый гидролизат (бромелаин) 3 1,90±0,01 5,8±0,01

Соевый гидролизат (трипсин) 1,80±0,02 5,5±0,06

Рисовый гидролизат (трипсин) 1,75±0,01 5,5±0,09

MDCK(I) ОМЕМ (контроль) 5 1,75±0,06 5,5±0,12

Соевый гидролизат (бромелаин) 2 1,60±0,01 5,0±0,09

Соевый гидролизат (трипсин) 1,65±0,05 5,2±0,11

Рисовый гидролизат (трипсин) 1,55±0,03 5,0±0,06

Vero(B) ОМЕМ (контроль) 5 1,50±0,03 5,0±0,01

Соевый гидролизат (бромелаин) 3 1,60±0,05 5,3±0,06

MDCK(II) ОМЕМ (контроль) 5 1,50±0,02 5,0±0,12

Соевый гидролизат (бромелаин) 2 1,47±0,01 4,9±0,06

Примечание: М — среднее арифметическое; т — ошибка среднего; п — число опытов.

Важной характеристикой при оценке ростовых свойств питательных сред

является морфология клеток. Морфология клеток культур Vero и MDCK при

культивировании в экспериментальных питательных средах не отличалась от

таковой при использовании среды DMEM. Клетки формировали отчетливый

ровный монослой через 48-72 ч, сохраняли типичную фибробластоидную (Vero)

и эпителиоидную (MDCK) форму, в цитоплазме не отмечалось признаков вакуолизации. Ультраструктура клеток линий MDCK и Vero при культивировании на экспериментальных средах также не отличалась от таковых при использовании контрольной среды. В клетках MDCK не наблюдалось признаков дистрофических изменений, они содержали крупное ядро, отчетливое ядрышко и «нормальный» набор органоидов, в том числе большое количество эндосомальных структур, видимых в инвертированном микроскопе как вакуоли. Клетки Vero имели среднюю электронную плотность, крупные ядра с хорошо выраженным ядрышком, узкие цистерны ЭПР, небольшой аппарат Гольджи, лизосомальные структуры были представлены мелкими электронно-плотными лизосомами и миелино-подобными фигурами.

При культивировании в экспериментальных средах не наблюдалось признаков дистрофических изменений органоидов и появления жировых включений. Таким образом, использование питательных сред на основе гидролизатов рисовой и соевой муки не вызывает изменений морфологических параметров клеток культур Vero и MDCK по сравнению с таковыми при использовании контрольных синтетических сред.

Кариологические параметры входят в набор основных характеристик перевиваемых линий клеток, они определяют видовую принадлежность клеток, постоянство хромосомного набора при длительном культивировании, наличие маркерных хромосом.

Кариологические характеристики, согласно требованиям ВОЗ, используют при аттестации культур-продуцентов иммунобиологических препаратов (Грачев В.П. и др., 2008). Возможные изменения кариотипа клеток MDCK(II) изучали при культивировании в питательных средах на основе растительных гидролизатов и в контрольной среде в течение 10 пассажей, на протяжении которых клетки MDCK(II) имели стабильный кариотип. Модальное число хромосом для всех препаратов составляло 77-78, что соответствует нормальному кариотипу собаки, 2n=78 (Reiman N. et al., 1996). Пределы изменчивости по числу хромосом - 67-83. При просмотре 1000 метафазных

пластинок каждого препарата доля полиплоидных клеток составляла 1 % в контроле (культивирование клеток в течение 10 пассажей в среде БРМ4 Ме§а\Чг) и 0 %, 0,3 % и 0,6 % для клеток, культивированных в течение 10 пассажей в средах на основе соевых гидролизатов, полученных с помощью бромелаина и трипсина, и трипсинового гидролизата риса, соответственно. Дифференциальное окрашивание показало, что кариотип клеток МОСК(Н) во всех препаратах характеризуется присутствием нормальных акроцентрических хромосом и 1-3 маркерных хромосом с медианной или субмедианной центромерой. Таким образом, кариологические характеристики клеток МОСК(П) не претерпевают заметных изменений в течение 10 пассажей в экспериментальных питательных средах.

Анализ кариотипа клеток Уего(В) показал, что линия гиподиплоидная (2п=60), при культивировании в контрольной среде (БМЕМ) число хромосом колеблется от 49 до 58. Количество клеток с околополиплоидным числом хромосом (108-110) составляет 3 %. Модальный класс в контроле (в начале и в конце периода культивирования) составляют клетки с 54-55 хромосомами (62 %), что не отличается от наблюдаемого в опыте для клеток Уего(В), культивируемых в среде на основе соевого гидролизата, полученного с помощью бромелаина (54-55 (65 %)). Аналогичны были и пределы изменчивости по числу хромосом - 49-58. В подавляющем числе опытных клеток, культивируемых в течение 10 пассажей в экспериментальных средах на основе трипсиновых гидролизатов сои и риса, количество хромосом составило 57-58 (62 % и 61 % - при использовании в составе среды соевого и рисового гидролизата, соответственно), что незначительно превышает контрольный уровень. Пределы изменчивости по числу хромосом были 51-60. При анализе 1000 метафазных пластинок каждого препарата полиплоиды не обнаружены. Дифференциальное окрашивание выявило во всех клетках линии Уего(В) и в опыте, и в контроле, характерные маркерные хромосомы (одна длинная метацентрическая хромосома и 3 хромосомы с дополнительными С-полосами), которые являются стабильными перестройками для данной линии. Таким

образом, ПЛК Vero(B) при культивировании в экспериментальных средах в течение 10 пассажей сохраняет кариотип, свойственный донору линии -обезьяне (Новохатский А.С. и др., 1985).

Обязательным требованием безопасности культуральных вакцин является отсутствие контаминации клеток бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами. В ПЛК MDCK(II) и Vero(B), культивируемых в течение 40 пассажей в экспериментальных и контрольных питательных средах, не выявлены контаминанты, регламентированные РД 42-28-10-89.

Разработанные рецептуры питательных сред на основе ферментативных гидролизатов рисовой и соевой муки, полученных с помощью трипсина и бромелаина, могут применяться для культивирования ПЛК MDCK и Vero, используемых, в частности, в качестве клеточного субстрата для культуральных гриппозных вакцин. Среды обеспечивают наработку клеток культур с кариологическими, морфологическими и пролиферативными параметрами, аналогичными таковым при использовании сред Stem Alpha.MDCK и SFM4 MegaVir (клетки MDCK) и DMEM (клетки Vero).

Оценка возможности использования растительных препаратов для выращивання вакцинных штаммов вируса гриппа в клеточных линиях

MDCK и Vero

Использование ПЛК для разработки вакцин требует контроля безопасности препаратов, так как они могут накапливать микроорганизмы из питательных сред, сывороток и трипсина в процессе пассирования. Технология получения вакцин на ПЛК должна сводить к минимуму данный риск путем исключения или уменьшения компонентов животного происхождения по всей технологической цепи. Использование в технологии приготовления культуральной гриппозной вакцины ПС на основе ферментативных гидролизатов растительного сырья и замена фермента животного происхождения (трипсина) на растительные протеазы позволит сделать такую вакцину более безопасной. Репродукцию штаммов вируса гриппа A (A/Solomon Islands/03/06 (H1N1) и A/Wisconsin/67/2005 (H3N2)) и В (B/Malaysia/2506/2004)

для производства ИГВ изучали на клетках MDCK и Vero, выращенных в питательных средах на основе ферментативных гидролизатов рисовой и соевой муки, полученных с использованием трипсина и бромелаина. Репродуктивная активность штаммов вирусов гриппа А и В была сравнима на клетках линий MDCK(I) и Vero(I) (данные не приведены), выращенных в экспериментальных средах на основе ферментативных гидролизатов риса и сои с пониженной до 2 и 3 %, соответственно, концентрацией СКПК, и в обычно применяемой для выращивания клеток синтетической среде с концентрацией 5 % СКПК (табл. 3).

Таблица 3

Репродукция вакцинных штаммов гриппа А и В на клетках MDCK(I) при культивировании в экспериментальных питательных средах на основе соевых ферментативных гидролизатов

Штамм Ростовая среда Титр вируса через 3 суток

(+ СКПК, %) после инфекции (lg

ТЦД5о/мл) (M±m) (n=5)

A/Solomon Islands/03/06 (H1N1) Гидролизат сои (трипсин) (5) 9,00±0,01

Гидролизат сои (трипсин) (2) 8,70 ±0,05*

Гидролизат сои (бромелаин) (5) 9,50±0,03

Гидролизат сои (бромелаин) (2) 9,10±0,07

ЭМЕМ (5) 9,30±0,11

ЭМЕМ (2) 7,20±0,01

A/Wiscons¡n /67/2005 (H3N2) Гидролизат сои (трипсин) (5) 8,80±0,05

Гидролизат сои (трипсин) (2) 8,30±0,02*

Гидролизат сои (бромелаин) (5) 9,10±0,06

Гидролизат сои (бромелаин) (2) 9,00±0,05

БМЕМ (5) 9,20±0,01

ЭМЕМ (2) 5,80±0,05

B/Malaysia /2506/2004 Гидролизат сои (трипсин) (5) 8,50±0,03

Гидролизат сои (трипсин) (2) 8,10±0,01

Гидролизат сои (бромелаин) (5) 9,00±0,12

Гидролизат сои (бромелаин) (2) 8,90±0,03

ЭМЕМ (5) 8,50±0,07

ОМЕМ (2) 5,70±0,02

Примечания: М - среднее арифметическое; гп - ошибка среднего; п - число опытов;

*, * - отличия от соответствующих показателей при ОМЕМ+5 % СКПК по ¡-критерию

Стьюдента при р<0,05.

Изучали репродуктивную активность и ростовые характеристики

холодоадаптированного рессортантного вакцинного штамма вируса гриппа

А/17/утка/Потсдам/86/92 (H5N2), используемого в отечественной технологии производства аллантоисной интраназальной ЖГВ против вируса гриппа птиц (Миронов А.Н. и др., 2009) на клеточных линиях MDCK(I) и Vero(I) при использовании питательных сред на основе ферментативных растительных гидролизатов и контрольной среды Stem Alpha.MDCK при внесении во все среды 2, 3 и 5 % СКПК. Репродукцию штамма А/17/утка/Потсдам/86/92 (H5N2) в присутствии трипсина изучали на клеточной культуре MDCK(I), выращенной в экспериментальных питательных средах на основе гидролизата рисовой муки (получен с помощью трипсина) и гидролизатов соевой муки (получены с помощью трипсина и бромелаина), и в контрольной среде Stem Alpha.MDCK в присутствии 5 % СКПК. Значения инфекционного и гемагглютинирующего титров в опыте и контроле были практически одинаковы (табл. 4).

Уменьшение концентрации сыворотки до 2 % в составе экспериментальных ростовых питательных сред не снижало репродуктивную активность реассортанта на клетках MDCK(I) по сравнению с использованием 5 % СКПК.

Таким образом, при получении вируса гриппа А/17/утка/Потсдам/86/92 с использованием клеточной культуры MDCK(I) можно заменить дорогостоящую импортную питательную среду Stem Alpha.MDCK на разработанные нами среды на основе растительных ферментативных гидролизатов, содержащие сниженную концентрацию (2 %) СКПК.

Аналогичные исследования репродукции штамма А/17/утка/Потсдам/86/92 на клетках Vero(I) показали возможность замены синтетической среды DMEM с 5 % сыворотки на экспериментальные среды с 3 % СКПК (см. табл. 4).

Для формирования инфекционных вирионов вируса гриппа необходимо протеолитическое расщепление предшественника вирусного гемагглютинина (Byassard D. et al., 1997), осуществляемое протеазами клетки-хозяина (Steinhauer D. et al., 1998). Специфичность этих протеаз достаточно высока, поэтому расщепление гемагглютинина вируса гриппа человека происходит в ограниченном наборе клеток-хозяев, а для расщепления гемагглютинина этих

вирусов в клетках нечеловеческого происхождения необходимо добавление трипсина (К1епк НО. е1 а1., 1975) или подобных ему протеаз.

Таблица 4

Репродукция вакцинного штамма А/17/утка/Потсдам/86/92 (Н5И2) в присутствии трипсина на клетках МЭСК(1) и Уего(1) с использованием сред на основе растительных гидролизатов

Клеточная Ростовая Содержание Титр вируса гриппа через 3 сут

линия питательная сыворотки после инфицирования клеток

среда (%) Инфекционный, Обратный

lg ТЦЦ50/мл, титр в РГА

(Х±т) (п=10)

MDCK(I) Stem 5 9,60±0,01 128

Alpha.MDCK 3 9,45±0,01 128

(контроль) 2 9,50±0,06 128

Гидролизат риса 5 9,35±0,03 128

(трипсин) 3 9,25±0,02 128

2 9,30±0,08 128

Гидролизат сои 5 9,25±0,01 128

(трипсин) 3 9,10±0,03 128

2 9,20±0,07 128

Гидролизат сои 5 9,55±0,01 128

(бромелаин) 3 9,50±0,05 128

2 9,50±0,01 128

Vero(I) DMEM 5 8,50±0,07 64

(контроль)

Гидролизат риса 5 8,50±0,07 64

(трипсин) 3 8,70±0,09 64

Гидролизат сои 5 8,45±0,01 64

(трипсин) 3 7,90±0,09* 64

Гидролизат сои 5 9,20±0,01* 128

(бромелаин) 3 8,90±0,01 128

Примечания: М - среднее арифметическое; ш - ошибка среднего; п - число опытов; *, * - отличия от показателя в контроле по ^критерию Стьюдента при р<0,05.

В наших экспериментах трипсин, получаемый из поджелудочной железы крупного рогатого скота, был заменен на растительный протеолитический фермент класса гидролаз - папаин, имеющий широкую субстратную специфичность и расщепляющий практически любые пептидные связи, за

исключением образованных остатками пролина (Levison SW. et al., 2000). Мы применили также другой растительный протеолитический фермент класса гидролаз, бромелаин, использовавшийся для извлечения гемагглютинина из частиц рекомбинантного штамма вируса гриппа X-31(H3N2) (Skehel J.J. et al., 1975; Мукажанова Г.Н. и др., 1981) и вируса гриппа A/PR/8/34(HlNl) (Смирнова Ю.А., 2009).

В предварительных экспериментах были определены оптимальные концентрации растительных протеаз (4 и 20 мкг/мл среды для папаина и бромелаина, соответственно) в составе питательных сред для репродукции вакцинного штамма А/17/утка/Потсдам/86/92 (H5N2) в клетках MDCK(I) и Vero(I). При использовании папаина максимальные значения инфекционного титра реассортанта А/17/утка/Потсдам/86/92 (H5N2) в клеточных линиях MDCK(I) и Vero(I), выращенных в экспериментальных на основе гидролизатов соевой и рисовой муки и контрольных средах, были достоверно ниже (на 0,5-1,0 lg) соответствующих значений титров, полученных при использовании трипсина. Замена трипсина на папаин приводила также к снижению (в 2 раза) и гемагглютинирующих титров как на клетках MDCK(I), (табл. 5), так и на клетках Vero(I) (данные не приведены). Максимальный выход реассортанта, выращенного в присутствии папаина на клетках MDCK(I) и Vero(I) с использованием питательных сред на основе гидролизатов соевой и рисовой муки, был в 3-10 раз меньше, чем в присутствии трипсина (см. табл. 5). Однако этот уровень биологической активности вируса является достаточным для обеспечения необходимой дозы в составе ЖГВ, которая по технической документации для вируса гриппа типа А соответствует 6,5 lg ЭИД5О/0,2мл. Замена трипсина на бромелаин при культивировании вируса А/17/утка/Потсдам/86/92 (H5N2) на клетках MDCK(I) и Vero(I), выращенных в экспериментальных и контрольных питательных средах, не привела к снижению инфекционных титров реассортанта (см. табл. 5). Значения гемагглютинирующих титров вируса на клетках MDCK(I) и Vero(I) не различались в опыте с бромелаином и в контроле с трипсином (см. табл. 5).

Таким образом, растительные ферменты папаин и бромелаин могут быть использованы вместо фермента животного происхождения трипсина при наработке вакцинного реассортанта А/17/утка/Потсдам/86/92 на ПЛК МОСК(1) и Уего(1), обеспечивая достаточно высокую продукцию вируса.

Таблица 5

Репродукция вакцинного штамма А/17/утка/Потсдам/8 6/92 (Н5К2) на клеточной линии МОСК. (I) с использованием сред различного состава

Ростовая питательная среда Фермент в поддерживающей среде Титр вируса гриппа через 3 сут после инфицирования клеток

Инфекционный, lg ТЦЦ50/мл, (М±ш)(п=10) Обратный титр в РГА

Stem Alpha.MDCK + 2 % СКПК Трипсин 9,50±0,06 128

Папаин 8,50±0,07* 64

Бромелаин 9,30±0,05 128

Без фермента 5,50±0,14 32

Гидролизат риса (трипсин) + 2 % СКПК Трипсин 9,30±0,08 128

Папаин 8,60±0,06 64

Бромелаин 9,40±0,11 128

Без фермента 5,80±0,0б 32

Гидролизат сои (трипсин) + 2 % СКПК Трипсин 9,20±0,07 128

Папаин 8,50±0,09 64

Бромелаин 9,40±0,12 128

Без фермента 5,00±0,09 16

Гидролизат сои (бромелаин) + 2 % СКПК Трипсин 9,50±0,07 128

Папаин 8,70±0,11 64

Бромелаин 9,50±0,01 128

Без фермента 6,00±0,05 32

Примечания: М - среднее арифметическое; ш - ошибка среднего; п - число опытов; * -различия от соответствующих показателей с трипсином по ^критерию Стьюдента при р<0,05.

Сравнительное исследование ультраструктурных параметров репродукции вируса гриппа А/17/утка/Потсдам/86/92 (Н5№) не выявило различий морфогенеза вируса в разных экспериментальных системах, когда для культивирования клеток МЕ)СК(1) и Уего(1) использовали разработанные автором экспериментальные среды на основе растительных компонентов. Не было также выявлено отличий от контроля, когда клетки культивировали на

стандартных питательных средах. Не выявлено и различий ультраструктурных параметров морфогенеза вируса гриппа А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5Ы2) при культивировании клеток Уего(1) и МПСК(1) на экспериментальных и контрольных средах при замене трипсина на папаин и бромелаин.

Аттенуированный холодоадаптированный мастер-штамм

А/Ленинград/134/17/57 (Н2Ш), на основе которого получен холодоадаптированный реассортант А/17/утка/Потсдам/86/92 (Н5№), содержит в генах 10 мутаций, 8 из которых привели к замещению аминокислот в белках РВ1, РВ2, РА, М1, М2 и N82 (ОЬепс1оп У., 1998). Используемый в данном исследовании штамм А/17/утка/Потсдам/86/92 (Н5Ы2) унаследовал от мастер-штамма 7 генов, кодирующих 6 внутренних белков вириона и нейраминидазу. Необходимо было изучить возможное влияние растительных компонентов в составе питательных сред на генетические и фенотипические признаки данного штамма, для чего изучали признаки стабильности са+25 и 1з"40 штамма Л/Н5Ы2, полученного на клеточных линиях МЭСК(1) и УсгоС!) при использовании растительных протеаз и питательных сред на основе растительных гидролизатов. Исследование фенотипической стабильности в процессе двух пассажей холодоадаптированного реассортанта при 33 °С в присутствии папаина или бромелаина в монослойных культурах клеток МОСК(1) и Уего(1), выращенных в экспериментальных питательных средах на основе растительных гидролизатов, не выявило изменений 1з"40- и са+25- фенотипа вируса: во всех случаях холодоадаптированный реассортант не размножался при 40 °С, но сохранял способность к репродукции при 25 °С (табл. 6).

Анализ стабильности мутаций, приведших к замене аминокислот в отдельных генах холодоадаптированного реассортанта, проводили путем сравнения нуклеотидных последовательностей соответствующих участков генома культурального вируса (выращенного на клетках МОСК(1) и Уего(1) при использовании растительных протеаз и экспериментальных питательных сред на основе растительных гидролизатов) и исходного аллантоисного холодоадаптированного реассортанта. Структура генов РВ1, РВ2, РА, М и N5

аллантоисного и культурального холодоадаптированного реассортанта была идентична структуре исходных генов, что позволяет сделать вывод о стабильности мутаций, приводящих к замене АК в сегментах РВ1, РВ2, РА, М и NS данного вируса, выращенного на клетках MDCK(I) и Vero(I) при использовании растительных протеаз и питательных сред на основе гидролизатов рисовой и соевой муки (см. табл. 6).

Таблица 6

Фенотипическая и генетическая стабильность образцов вакцинного штамма А/17/утка/Потсдам/86/92, полученных на клетках MDCK(I) при использовании растительных протеаз и питательных сред на основе гидролизатов риса и сои

Ростовая питательная среда Фермент в поддерживающей среде tS_40- фенотип Са 25- фенотип Основные мутации в генах вакцинного штамма, характерные для штамма-прародителя А/Ленинград/134/17/57 (Н2Ш)

РВ2-1459" РВ1-819" РА-107* РА-1045' м- 969' NS-798'

Stem Alpha. MDCK +2 % СКПК Трипсин + + Т т С Т А А

Папаин + + т т С Т А А

Бромелаин + + т т С Т А А

Гидролизат риса (трипсин) +2 % СКПК Трипсин + + т т с Т А А

Папаин + + т т с т А А

Бромелаин + + т т с т А А

Гидролизат сои (трипсин) +2 % СКПК Трипсин + + т т с т А А

Папаин + + т т с т А А

Бромелаин + + т т с т А А

Гидролизат сои (бромелаин) +2 % СКПК Трипсин + + т т с т А А

Папаин + + т т с т А А

Бромелаин + + т т с т А А

Исследование репродукции вакцинного штамма вируса гриппа А/17/Утка/Потсдам/86/92 (Н5№) на клетках Уего(1) и МБСК(1), выращенных в экспериментальных питательных средах, показало, что штамм способен в присутствии трипсина хорошо размножаться, достигая титров, совпадающих с максимальными титрами вируса, выращенного на тех же культурах клеток при использовании контрольных питательных сред. Замена фермента животного происхождения трипсина на растительные протеазы папаин или бромелаин при

культивировании вируса гриппа А/17/утка/Потсдам/86/92 (Н5Ы2) на клеточных культурах Уего(1) и МОСК(1), выращенных в присутствии питательных сред на основе ферментативных гидролизатов рисовой и соевой муки, практически не влияет на уровень репродукции вируса при замене трипсина на бромелаин, и приводит к незначительному снижению урожая при использовании папаина. Изучение са+25 и 15"40-признаков у вируса гриппа А/17/утка/Потсдам/86/92, выращенного в присутствии растительной протеазы (папаина или бромелаина) на клетках Уего(1) и МОСК(1), культивируемых в питательных средах на основе растительных гидролизатов, выявило стабильность этих признаков.

Изучение особенностей культивирования вакцинного штамма вируса гриппа А/17/утка/Потсдам/86/92 в роллерах на клеточной линии МЭСК с использованием растительных препаратов

Технология изготовления культуральных ЖГВ включает этапы наработки клеточного субстрата, получения на клеточном субстрате вирусного материала с высоким титром, его стабилизацию и сублимационное высушивание, каждый из этапов должен быть оптимизирован.

Линии клеток МОСК(1), адаптированные к росту в роллерах в

малосывороточных питательных средах на основе растительных гидролизатов,

оценивали на предмет их способности продуцировать вакцинный штамм вируса

гриппа А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5Ы2) в титрах, достаточных для

коммерческой наработки. Выход вируса был исследован в зависимости от

условий процесса его размножения, таких как множественность инфекции, вид

и концентрация протеазы в поддерживающей среде и время сбора урожая.

Множественность заражения в диапазоне от 0,01 до 1,0 ТЦЦ5о/кл. не влияла на

значения инфекционной активности, но влияла на динамику накопления вируса

в максимальных титрах. Так, при множественности заражения 0,3 ТЦД5о/клетку

максимальные урожаи инфекционного вируса для вакцинного штамма в клетках

МОСК(1) были получены в присутствии трипсина или бромелаина через 48 ч,

дальнейшее культивирование штамма приводило к снижению инфекционных

титров, которые через 96 ч после заражения составили 5,9-6,5 ^ (рис. 1 А, Б, В).

Следовательно, для производства культуральных ЖГВ необходимо определить

Фермента поддерживающей среде:

—*— Цромялаи« -»-гилли* —1'рилг.нн ■

— ОМШ tTWHrtíHHOM

Рис. 1. Динамика накопления вируса гриппа A/H5N2 в присутствии различных протеаз при культивировании в клетках MDCK (I), выращенных в экспериментальных и контрольных питательных средах

оптимальное время сбора максимального урожая активного вируса для каждого используемого вакцинного штамма.

Полученные результаты показывают, что клетки МОСК(1) активно растут в роллерах в ПС, содержащих гидролизаты риса и сои, полученные с помощью

трипсина и бромелаина, при пониженном до 2 % содержании СКПК. Выращенные таким образом клетки при культивировании в упомянутых средах без сыворотки, в присутствии 4 мкг/мл папаина или 20 мкг/мл бромелаина, эффективно поддерживают продукцию штамма А/17/утка/Потсдам/86/92 при множественности инфекции от 0,01 до 1,0 ТЦД50/кл.

Для обоснования рекомендаций по практическому применению папаина, бромелаина и ПС на основе растительных гидролизатов при получении вируса гриппа А/17/утка/Потсдам/86/92 (Н5№) на клетках МБСК(1) в роллерах была проверена его фенотипическая и генетическая стабильность при репродукции в присутствии этих препаратов. Структура генов РВ1, РВ2, РА, М и N8 реассортанта была идентична структуре исходных генов, что позволяет сделать вывод о стабильности мутаций, приводящих к замене АК в сегментах РВ1, РВ2, РА, М и N8 генома реассортанта при культивировании на роллерах с использованием растительных препаратов. Культивирование реассортанта в данных условиях не изменяло также и его 15-40- и са+25- фенотип.

Изучение возможности использования растительных компонентов в составе защитных сред при сублимационном высушивании полученного в перевиваемых клеточных линиях вакцинного штамма вируса гриппа А/17/утка/Потсдам/86/92

Одним из факторов, влияющим на качество гриппозной вакцины, является

состав защитной среды, используемой при сублимационном высушивании штамма. В данной работе в качестве стабилизаторов для культуральных вакцинных гриппозных образцов были использованы пять различных защитных сред, которые, за исключением сахарозо-желатиновой среды (САЖ), не содержат компонентов животного происхождения. Лиофильное высушивание вакцинных образцов проводили на адсорбционно-криогенном аппарате для сублимационного высушивания биологических материалов, разработанном в ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (Онищенко Г.Г. и др., 2006). Лучшими защитными свойствами обладал стабилизатор, состоящий из смеси 10 % сахарозы и 5 % ферментативного гидролизата соевой муки (Стабилизатор № 5). Снижение титра образцов с этим стабилизатором составляло 0,5-0,65 что было ниже, чем при использовании САЖ (0,6-0,95 Проверка стабильности образцов

через различное время хранения, а также тесты на термостабильность (экспозиция образцов при 37 °С в течение 7 сут) подтвердили эффективность защитного состава на основе смеси сахарозы и гидролизата соевой муки для лиофилизации культуральных вакцинных образцов (табл. 7 и 8).

Таблица 7

Биологическая активность сухих культуральных (МОСК) вакцинных образцов, содержащих штамм А/17/утка/Потсдам/86/92 (Н5Ы2), через различные промежутки времени хранения при температуре 8±2 °С

Ростовая питательная среда Фермент в поддерживающей среде Стабилизатор Специфическая активность образцов (^ТЦДзо/мл, М±т, п=3) через ... месяцев:

0 3 6 9 12

ОМЕМ Трипсин САЖ 8,00 ±0,07 7,80 ±0,08 7,35 ±0,11* 7,05 ±0,12* 7,10 ±0,06*

ПССБ Бромелаин САЖ 8,50 ±0,05 8,20 ±0,11 7,85 ±0,07* 7,65 ±0,14* 7,50 ±0,12*

Бромелаин Стабилизатор №5 8,80 ±0,02 8,70 ±0,11 8,55 ±0,14 8,40 ±0,09 8,15 ±0,07*

Примечание: М - среднее арифметическое; ш - ошибка среднего; п - число опытов; * -отличия от соответствующих показателей в начальных точках (0 месяцев) хранения образцов по ^критерию Стьюдента при р<0,05.

Использование предложенного стабилизатора, содержащего 10 % сахарозы и 5 % гидролизата соевой муки, полученного с помощью бромелаина, позволяет более эффективно, по сравнению с другими стабилизаторами, проводить высушивание с максимальным сохранением инфекционного титра вируса гриппа А/17/утка/Потсдам/86/92 (Н5№), входящего в состав культуральных вакцинных образцов, наработанных с использованием растительных препаратов. В качестве белкового носителя в стабилизаторе использованы только компоненты растительной природы, что существенно с точки зрения безопасности вакцинного препарата.

Основные этапы предлагаемой нами роллерной технологии приготовления культуральной (МОСК) ЖГВ субтипа А/Н5Ы2 базируются на использовании препаратов растительного происхождения: питательных сред, ферментов и стабилизатора. Проведенное исследование показало, что

Инфекционность культуральных вакцинных образцов, содержащих штамм А/17/утка/Потсдам/86/92 (П5Ы2), после лиофилыюго высушивания* и термодеградации

Культура клеток Ростовая питательная среда на основе Фермент в поддерживающей среде Специфическая активность образцов ОйТЩЫмл, М±ш, п=4)

Вирус-содержащая жидкость Вирус-содержащая жидкость с добавлением стабилизатора Лиофильно высушенный вакцинный образец Лиофильно высушенный вакцинный образец после термодеградации

МОСК (I) Гидролизата риса, полученного трипсином Папаин 8,50±0,11 8,30±0,07»* 7,70±0,11** 6,50±0,11

Бромелаин 9,30±0,07 9,00±0,05** 8,30±0,07 7,50±0,07

Гидролизата сои, полученного трипсином Папаин 8,60±0,05 8,50±0,11** 7,50±0,05** 6,40±0,05

Бромелаин 9,20±0,06 9,10±0,07** 8,20±0,06 7,40±0,06

Гидролизата сои, полученного бромелаином Папаин 8,40±0,05 8,20±0,06** 7,25±0,06** 6,20±0,05

Бромелаин 9,30±0,12 9,30±0,08** 8,50±0,05 7,50±0,12

ОМ ЕМ Трипсин 9,50±0,06 9,30±0,05** 8,00±0,07* 7,10±0,06

Уего(1) Гидролизата риса, полученного трипсином Папаин 7,80±0,09 7,70±0,06** 6,70±0,05 5,90±0,09

Бромелаин 9,30±0,07 9,30±0,05** 8,40±0,06 7,50±0,07

Гидролизата сои, полученного трипсином Папаин 7,50±0,09 7,40±0,06** 6,30±0,09**' 5,20±0,09

Бромелаин 8,90±0,06 8,90±0,07** 8,00±0,06 7,00±0,06

Гидролизата сои, полученного бромелаином Папаин 8,00±0,06 7,90±0,05** 7,00±0,06** 5,90±0,06

Бромелаин 9,10±0,06 9,10±0,07** 8,10±0,06 7,30±0,06

ОМНМ Трипсин 8,50±0,06 8,40±0,07** 7,30±0,06*** 6,20±0,06

Примечания: М - среднее арифметическое; ш - ошибка среднего; п - число опытов; * - в качестве стабилизатора использовали САЖ; по I -критерию Стьюдента'. * - отличия от соответствующих показателей вируссодержащей жидкости с добавлением стабилизатора при р<0,05; ** - отличия от соответствующих показателей лиофильно высушенных образцов после термодеградации при р<0,05.

генетические и фенотипические признаки реассортантного штамма

А/17/утка/Потсдам/86/92 (Н5№) не изменяются при культивировании в клетках

М0СК(1) с использованием растительных препаратов. Однако, известно, что

вирусы гриппа могут антигенно отличаться даже в случае полной идентичности

АК состава НА, в частности, вследствие различных путей гликозилирования

при культивировании в различных системах (Кауепп Ы.У. й а!., 1995; Ка^^ег

Б. е1 а1., 2004). Это обстоятельство определило необходимость изучения

иммуногенных свойств вакцинного штамма вируса гриппа.

Изучение иммуногенности и протективной активности на лабораторных животных сухих вакцинных образцов, содержащих штамм вируса гриппа А/17/утка/Потсдам/86/92, приготовленных с использованием растительных

препаратов

Иммуногенность экспериментальных культуральных образцов, содержащих штамм А/17/утка/Потсдам/86/92 (Н5№), оценивали в соответствии со схемой применения аллантоисной вакцины «Ультрагривак», ранее апробированной нами при проведении ее клинических испытаний. Двукратная с интервалом 10 и 21 сут в дозе 6,5 ^ ТЦД5о/0,05 мл иммунизация мышей линии СВА образцами, полученными в культуре клеток МОСК(1) в разных условиях, приводила к образованию специфических к гомологичному штамму антител (табл. 9). Наибольшие титры антител в сыворотке отмечены при введении образцов, наработанных в присутствии бромелаина на клетках МОСК(1), выращенных в ПС с соевой гидролизатной основой. Они были сопоставимы с титрами при иммунизации мышей вакциной «Ультрагривак (см. табл. 9). При использовании и вакцины «Ультрагривак», и экспериментальных образцов, предпочтительнее схема иммунизации с 10-суточным интервалом.

Интересно, что полученные сыворотки обнаруживали активность в РТГА не только с гомологичным вирусом, но и с вирусами гриппа птиц субтипа Н5М1 (штаммы А/СЫскеп/8и2(Ыка/Моу-11/2005 и А/СЫскеп/Ки^ап/05/2005). Титры антител в этом случае были ниже, чем полученные при использовании в РТГА гомологичного штамма А/17/утка/Потсдам/86/92 (А/Н5К2), однако они были сравнимы с титрами, выявленными при введении мышам аллантоисной вакцины «Ультрагривак», с данными вирусами А/Н5Ш (см. табл. 9).

Иммуногенная активность культуральных (МОСК) вакцинных образцов, содержащих штамм А/17/утка/Потсдам/86/92, в опытах на мышах, иммунизированных двукратно с интервалом 10 и 21 сут, в РТГА

Условия получения экспериментальных образцов Среднегеометрические титры АТ в сыворотках мышей, иммунизированных экспериментальными образцами, со штаммами вируса гриппа (М±8т, п=6)

Питательная среда на основе Фермент А/17/Утка/Потсдам/86/92 (Н5Ы2) А/СЫскеп/З^аИса/Ыоу-11/2005 (Н5Ы1) А/СЫскеп/Кигяап/05/2005 (Н5Ы1)

10 сут 21 сут 10 сут 21 сут 10 сут 21 сут

Гидролизата риса, полученного трипсином Папаин 14,3* (6,1-33,4) 11,3* (5,3-24,3) 10,1* (4,2-24,3) 9,0* (5,2-15,5) 11,3 (5,3-24,3) 10,1 (5,6-18,3)

Бромелаин 64,0* (33,4-122,7) 22,6 (15,2-33,7) 22,6 (10,6-48,5) 12,7 (7,0-23,0) 18,0 (10,4-31,1) 16,0 (8,3-30,7)

Гидролизата сои, полученного трипсином Папаин 20,2* (13,8-29,3) 22,6 (10,5-48,5) 12,7* (7,0-23,0) 9,0* (5,2-15,5) 11,3 (7,6-16,9) 8,0 (4,2-15,3)

Бромелаин 161,3 (66,8-389,2) 80,4 (33,3-193,7) 28,5 (12,2-66,7) 18,0 (7,7-42,0) 14,3 (7,0-29,1) 14,2 (10,6-19,2)

Гидролизата сои, полученного бромелаином Папаин 22,6* (10,5-48,5) 22,6 (6,8-74,8) 14,3* (7,0-29,1) 9,0* (6,7-12,1) 11,3 (4,6-27,6) 10,1 (6,9-14,7)

Бромелаин 162,5 (65,7-394,5) 80,6 (33,4-194,6) 32,0 (12,8-80,3) 28,5 (16,5-49,3) 14,3 (6,1-33,4) 14,3 (8,2-24,6)

БМЕМ Трипсин 57,0* (33,0-98,6) 32,0 (16,7-61,3) 14,3* (8,2-24,6) 14,3 (7,0-29,1) 14,3 (7,0-29,1) 10,1 (4,8-21,4)

Вакцина гриппозная «Ультрагривак» 181,0 (60,1-545,5) 64,0 (16,1-254,4) 32,0 (10,4-98,8) 25,4 (12,0-53,8) 14,3 (4,1-49,9) 14,3 (8,2-24,6)

Контроль(плацебо) 2,8* (1,5-5,2) 2,8* (1,9-4,2) 3,2* (1,8-5,8) 2,8* (1,6-5,4) 2,8* (1,5-5,5) 2,6* (1,4-4,2)

Примечание: М - среднее арифметическое; 8т - стандартное отклонение; п - число опытов; * - отличия от соответствующих показателей, полученных для вакцины «Ультрагривак», по и-критерию Манна-Уитни при р<0,05.

Таблица 10

Иммуногенная активность культуральных (МБСК(1)) вакцинных образцов, содержащих реассортант А/17/утка/Потсдам/86/92 (Н5Ы2), в опытах на мышах, иммунизированных двукратно с интервалом 10 сут, по данным в РН

Ростовая питательная среда на основе Среднегеометрические титры АТ в сыворотках мышей, иммунизированных экспериментальными образцами, со штаммами вируса гриппа (М±8т) (п=6)

А/17/утка/Потсдам /86/92 (Н5Ш) А/СЫскеп/51ш1а1ка/ Моу-11/2005(Н5Ш) А/СЫскеп/Кш^ап /05/2005 (Н51М1)

Гидролизата риса (трипсин) 22,6 (9,3-55,2) 10,1 (4,8-21,4) 6,4 (4,4-9,2)

Гидролизата сои (трипсин) 40,3 (16,7-97,3) 10,1 (3,4-30,1) 10,1 (6,9-14,7)

Гидролизата сои (бромелаин) 40,3 (27,7-58,7) 10,1 (6,9-14,7) 10,1 (4,6-24,1)

Вакцина гриппозная «Ультрагривак» 40,3 (22,3-73,0) 10,1 (6,9-14,7) 10,1 (3,7-27,2)

Контроль (плацебо) 2,8 (1,5-5,2) 3,2* (1,5-6,7) 2,8* (1,9-4,2)

Примечания: М - среднее арифметическое; - стандартное отклонение; п — число опытов; *Гидролизат получен с помощью трипсина; * - отличия от показателей, полученных для вакцины «Ультрагривак», по и-критерию Манна-Уитни при р<0,05.

Двукратная с интервалом 10 сут в дозе 6,5 ^ ТЦЦ5о/0,05 мл иммунизация мышей культуральными вакцинными образцами, полученными в разных условиях, вызывала образование специфических к гомологичному штамму антител, выявляемых в реакции нейтрализации (табл. 10). Как и в РТГА, наибольшие титры антител в сыворотках мышей были обнаружены при введении им экспериментальных образцов, наработанных в присутствии бромелаина на клетках МЭСК(1), выращенных в питательных средах на основе соевых гидролизатов. Титры нейтрализующих антител к вирусам субтипа Н5Ш (А/СЫскеп/51кс1а1ка/Моу-11/2005 и А/СЫскеп/Киг§ап/05/2005) были ниже в 2-4 раза по сравнению с титрами при использовании гомологичного вируса, но были сравнимы с титрами, выявленными при иммунизации мышей

аллантоисной вакциной «Ультрагривак (см. табл. 10).

Двукратное интраназальное введение культуральных вакцинных образцов,

содержащих штамм А/17/утка/Потсдам/86/92, с интервалом в 10 сут в дозе 106'5

ТЦЦ5о обеспечивало защиту мышей от заражения вирулентным вирусом гриппа

птиц A/Chicken/Kurgan/05/2005(H5Nl) в дозе 25 ЛД,0 в 71,0-86,7%, что

сравнимо с показателями для аллантоисной вакцины «Ультрагривак» (табл. 11).

По показателю средней продолжительности жизни при заражении мышей 25

ЛД50 вируса гриппа значения в группах животных, иммунизированных

культуральными образцами и вакциной «Ультрагривак», были сравнимы и

достоверно выше, чем в контрольной группе (см. табл. 11).

Изучение изменений иммунного ответа на пептид-белковые конъюгаты под влиянием пептидоглнкана растительного происхождения Иммуномакс на лабораторных животных.

Универсальные синтетические гриппозные вакцины преимущественно

конструируются на основе консервативных последовательностей NP, М2е и НА, так как такие вакцины могут обеспечить перекрёстную защиту против многих субтипов вируса гриппа A (Lanying Dua. et al., 2010). Рассматриваются также «родовые» вакцины на основе НА, содержащие консервативные области белка (Palese Р., 2006). У НА каждого субтипа есть несколько протяженных консервативных районов в тяжелой (НА1) и легкой (НА2) субъединицах, в которых практически не наблюдается АК замен в процессе дрейфовой эволюции подтипа. Одним из наиболее интересных районов является С-конец НА1, образующий часть «ножки» НА, где для сохранения структурных напряжений необходима высокая консервативность АК.

В работе исследованы иммуногенные свойства конъюгата синтетического пептида, представляющего консервативную последовательность 15 последних С-концевых АК остатков НА1 гемагглютинина субтипа A/H3N2, с бычьим сывороточным альбумином (БСА), а также конъюгат пептида из области антигенного сайта А с БСА (табл. 12).

Таблица 11

Показатели выживаемости мышей, иммунизированных экспериментальными культуральными вакцинными образцами, содержащими штамм А/17/утка/Потсдам/86/92 (Н5№), и вакциной «Ультрагривак», и контрольных после заражения 25

ЛД50 вируса гриппа Л/сЫскеп/Ки^ап/05/2005 (Н5М1)

Характеристика образцов Количество погибших животных на ... сутки после заражения Число выживших животных к 14 сут СПЖ (сут) М±8т Доля выживших, КЗ (%)

Клеточная линия Среда 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

]УЮСК(1) ПСРТ (п=30) 0 0 0 0 0 0 2 3 1 0 0 0 0 24* 12,77±2,53* 80,0

ПССТ(п=30) 0 0 0 0 0 0 0 4 1 0 0 0 0 26' 13,03±2,20* 83,3

ПССБ (п=30) 0 0 0 0 0 0 0 3 1 0 0 0 0 26* 13,23±1,99* 86,7

Уего(1) ПСРТ (п=31) 0 0 0 0 0 0 3 4 2 0 0 0 0 22* 12,17±2,88* 71,0

ПССТ (п=30) 0 0 0 0 0 0 1 3 3 0 0 0 0 23' 12,67±2,48* 76,6

ПССБ (п=30) 0 0 0 0 0 0 2 4 2 0 0 0 0 22♦ 12,40±2,72* 73,3

Вакцина гриппозная «Ультрагривак» (п=30) 0 0 0 0 0 0 1 2 1 0 0 0 0 26* 13,20±2,09* 86,7

Контроль(плацебо)(п=30) 0 0 0 0 0 1 5 14 10 0 0 0 0 0 8,10±0,80 0

Примечания: М - среднее арифметическое; Бщ - стандартное отклонение; п-число животных в группе; * - отличие от контроля по критерию X ; * - отличие от контроля по и-критерию Манна-Уитни при р<0,05.

Влияние пептидогликана растительного происхождения Иммуномакс на активность антипептидных сывороток в реакции нейтрализации (М±ш, п=6)

Сыворотка против Титры вирусов (lg ТЦЦ50/мл) в присутствии сывороток

A/PR/8/34 (H1N1) A/Aichi/2/68 (H3N2) А/Англия/42 /72 (H3N2) А/ПортЧалмерс /1/73 (H3N2)

Нормальная 8,50±0,11 7,80±0,05 5,20±0,06 4,50±0,09

БСА+ адъювант Фрейнда 8,30±0,12 7,50±0,09 5,00±0,05 4,00±0,06

Иммуномакс 7,80±0,11 7,10±0,06 4,40±0,06 4,00±0,11

БСА+Иммуномакс 7,50±0,05 6,70±0,06 4,20±0,07 3,30±0,12

(136-147)-БСА+ адъювант Фрейнда 8,50±0,12 3,50±0,07'ф 4,50±0,07* 4,00±0,09

(136-147)-БСА+ Иммуномакс 7,70±0,06 2,00±0,05" 3,90±0,06 3,40±0,05

(314-328)-БСА+ адъювант Фрейнда 8,20±0,05 4,50±0,12' * 2,50±0,06" 2,00±0,07

(314-328)-БСА+ Иммуномакс 7,80±0,11 3,25±0,05" 1,70±0,06" 1,50±0,09

(136-147)-БСА+ (314-328)-БСА+ адъювант Фрейнда 8,30±0,07 3,00±0,1Г* 2,35±0,12" 1,75±0,05*

(136-147)-БСА+ (314-328)-БСА+ Иммуномакс 7,85±0,09 1,75±0,12" 1,60±0,09" 1,00±0,11

A/Aichi/2/68 8,0±0,09 0" 1,00±0,13" 1,20±0,07"

Примечания: М - среднее арифметическое; т - ошибка среднего; п - число опытов; ' -отличия от соответствующих показателей при БСА+Иммуномакс, * - отличия от соответствующих показателей с Иммуномаксом по I - критерию Стьюдента при р<0,05.

В связи с тем, что большинство синтетических антигенов являются слабыми иммуногенами по сравнению с более сложными природными, для повышения иммунного ответа на пептидные конъюгаты в работе использовали иммуномодулятор Иммуномакс, представляющий собой кислый пептидогликан растительного происхождения, обладающий иммуноадъювантным эффектом.

Двукратное внутрибрюшинное введение Иммуномакса в дозах 20 и 5 мкг

одновременно с первичной и вторичной иммунизацией животных конъюгатами

без адъюванта Фрейнда вызывало достоверное повышение нейтрализующего

эффекта сывороток, полученных на конъюгаты в сочетании с адъювантом

Фрейнда (см. табл. 12). При введении в пептидный препарат Иммуномакса достоверно возрастали доля выживших мышей, зараженных вирусом гриппа А/А¡сЬ¡/2/68, (табл. 13) и средняя продолжительность их жизни (табл. 14).

Таблица 13

Влияние Иммуномакса на устойчивость мышей, иммунизированных пептид-

белковыми конъюгатами, к заражению вирусом гриппа А/А1сЫ/2/68 _ (по % выживаемости) (М±ш, п=6)_

Иммуноген Выживаемость мышей (%) после введения иммуногена и:

0,9 %-ный раствор №С1 Иммуномакс при введении

внутрибрюшинно двукратно внутримышечно двукратно внутрикожно однократно

Контроль 1 (неиммунные мыши) 1,67±1,17 8,05±0,35 8,10±1,41 7,85±1,07

Контроль 2 (БСА) 2,18±0,59 8,67±1,47 8,50±1,45 8,25±1,13

(136-147)-БСА 30,00±0,87" 45,00±1,05" 44,07±1,25'* 41,96±1,18"*

(314-328)-БСА 15,00±1,37" 27,50±1,09'* 28,40±1,96'* 26,05*0,63"

Смесь: (136-147)-БСА и (314-328)-БСА 35,00±2,83' 55,00±2,15'* 50,50±0,89'* 49,13±1,74"

Примечания: М-среднее арифметическое; ш- ошибка среднего; п- число опытов; " -отличия от соответствующих показателей при БСА,' - отличия от соответствующих показателей без Иммуномакса по ^критерию Стьюдента при р<0,05.

Использование в экспериментах на мышах других схем введения Иммуномакса с синтетическими антигенами, а именно: двукратное внутримышечное введение препарата в дозах 40 и 1 мкг при первичной и повторной иммунизации конъюгатами пептид-БСА, соответственно, или однократное внутрикожное введение препарата после повторной иммунизации пептидами за 24 ч до заражения вирусом гриппа, также приводило к достоверному повышению устойчивости животных к гриппозной инфекции по сравнению с использованием конъюгатов, сочетано введенных с адъювантом Фрейнда (см. табл. 13 и 14). При однократном внутрикожном введении Иммуномакса для достижения защитного эффекта, аналогичного таковому при использовании двукратного внутрибрюшинного или внутримышечного введения, потребовалась уменьшенная в 2,5 и 4,1 раза, соответственно, доза Иммуномакса (10 мкг на мышь). Более выраженный эффект при всех способах

введения Иммуномакеа наблюдался при иммунизации животных смесью двух конъюгатов: (136-147)- БСА и (314-328)-БСА совместно с препаратом, по сравнению с применением одного конъюгата (см. табл. 12, 13 и 14).

Таблица 14

Усиление защиты мышей, иммунизированных конъюгатами пептид-БСА, от

Иммуноген Средняя продолжительность жизни (сутки) после введения иммуногена и:

0,9 %-й раствор ИаС1 Иммуномакс при введении:

внутрибрюшин но двукратно внутримышечно двукратно внутрикожно однократно

Контроль 1 (неиммунные мыши) 6,25±0,43 8,15±0,52 8,05±0,56 7,55±0,45

Контроль 2 (БСА) 6,45±0,43 8,54±0,77 8,13±0,09 7,85±0,11

(136-147)-БСА 10,40*0,12* 12,40±0,36" 11,95±0,12*" 11,65±0,14А"

(314-328)-БСА 9,00±0,12А 11,14±0,72А" Ю,75±0,13" 10,40±0,15а"

Смесь: (136-147)-БСА и (314-328)-БСА 11,08±0,52А 13,10±0,79ж" 12,65±0,07а" 12,25±0,13а"

отличия от соответствующих показателей с БСА, " - отличия от соответствующих показателей с Иммуномаксом по I - критерию Стьюдента при р<0,05.

В целом эксперименты на мышах демонстрируют отчетливый иммунноадъювантный эффект Иммуномакеа при сочетанном применении с синтетическими пептидами, конъюгированными с БСА, позволяющий заменить им адъювант Фрейнда, обычно используемый в экспериментах на животных.

Использование нетоксичного растительного иммуномодулятора Иммуномакс позволяет уменьшить дозу иммуноадъюванта и сократить число иммунизаций конъюгатами. Так, для достижения выраженного иммунологического ответа на пептиды в опытах с Иммуномаксом требовалось только две иммунизации, тогда как для обеспечения такого же уровня иммунологической активности пептидов, введенных с адъювантом Фрейнда, необходимы три иммунизации. Иммуномакс может быть использован для совершенствования вакцинопрофилактики гриппа с помощью синтетических пептидов.

выводы

1. Разработана питательная среда на основе гидролизата сои, полученного с использованием растительной протеазы бромелаина, с низким содержанием сыворотки (2 % и 3 %), для перевиваемых линий клеток MDCK и Vero, являющихся субстратом культуральной гриппозной вакцины.

2. Показана пригодность питательных сред на основе ферментативных гидролизатов сои и риса, полученных с помощью трипсина и бромелаина, для наработки перевиваемых линий клеток MDCK и Vero. Использование экспериментальных сред не приводит к изменению пролиферативных, морфологических и кариологических характеристик культур клеток, а также их чувствительности к штаммам вируса гриппа, используемым для производства инактивированной и живой гриппозной вакцины по сравнению с контролем.

3. Установлена возможность замены трипсина на растительные протеазы папаин и бромелаин в составе питательных сред на основе ферментативных гидролизатов сои и риса, и определены оптимальные условия их применения для максимального накопления в перевиваемых линиях клеток MDCK и Vero штаммов вируса гриппа, используемых для производства инактивированной и живой гриппозной вакцины.

4. Показано, что использование экспериментальных сред на основе ферментативных растительных гидролизатов и растительных протеаз не влияет на морфогенез и репродуктивную активность вируса гриппа А/17/утка/Потсдам/86/92 (H5N2) при культивировании его в клетках MDCK и Vero.

5. Разработан стабилизатор, содержащий 10 % сахарозы и 5 % гидролизата сои, полученного с помощью бромелаина, и показана возможность его использования для сохранения в процессе лиофильного высушивания и в течение 1 года хранения максимального инфекционного титра выращенного в перевиваемой линии клеток MDCK холодоадаптированного вакцинного штамма вируса гриппа А/17/утка/Потсдам/86/92 (H5N2).

6. Впервые определены технологические приемы использования растительных препаратов (питательная среда на основе гидролизата сои, полученного с помощью бромелаина; растительная протеаза бромелаин; стабилизатор на основе сахарозы и гидролизата сои) на основных стадиях разработки живой культуральной гриппозной вакцины субтипа А/Н5№ в роллерах.

7. Установлено, что использование растительных препаратов при получении лиофильно высушенных образцов вакцинного штамма вируса гриппа субтипа Л/115Ы2 не влияет на его генетическую и фенотипическую стабильность, а также на иммуногенность для лабораторных животных. Штамм индуцирует образование системных и секреторных антител не только к гомологичному вирусу, но и к высокопатогенным вариантам вируса гриппа птиц А/Н5Ш.

8. Растительный иммуномодулятор Иммуномакс при сочетанном использовании с синтетическими пептидами из вариабельного и консервативного сайтов тяжелой цепи гемагглютинина вируса гриппа А/НЗК2 усиливает иммунный ответ на пептиды у лабораторных животных, показаны его адъювантные свойства.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК:

1. Мазуркова H.A., Исаева Е.И., Подчерняева Р.Я. Пептидное картирование моноклональных антител к тяжелой цепи гемагглютинина вируса гриппа H3N2 // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2006. - № 4. - С. 19-23.

2. Онищенко Г.Г., Мазуркова H.A., Трошкова Г.П., Радаева И.Ф., Мартынец Л.Д., Сумкина Т.П., Ким И.И., Нечаева Е.А., Дроздов И.Г. Оптимизация технологии производства живой культуральной противогриппозной вакцины с использованием питательной среды на основе гидролизатов белков растительного происхождения //Биотехнология. - 2007. - № 3. - С. 31-37.

3. Мазуркова H.A., Трошкова Г.П., Радаева И.Ф., Нечаева Е.А., Дроздов И.Г. Использование растительной протеазы при разработке живой культуральной гриппозной вакцины // Биотехнология. - 2008. - № 3. - С. 63-69.

4. Мазуркова H.A., Трошкова Г.П., Сумкина Т.П., Колокольцова Т.Д., Скарнович М О., Кабанов A.C., Шишкина Л.Н., Сергеев А.Н. Сравнительный анализ репродукции штаммов вируса гриппа в перспективных для производства культуральных вакцин клеточных линиях при использовании питательной среды на основе гидролизата белков рисовой муки // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2008. - № 4. - С. 234-238.

5. Мазуркова H.A., Рябчикова Е.И., Трошкова Г.П., Гетманова Т.Н., Сумкина Т.П., Шишкина Л.Н., Сергеев А.Н. Изучение морфологических и пролиферативных характеристик клеток Vero и MDCK при культивировании в питательных средах на основе гидролизатов растительных белков // Клеточные технологии в биологии и медицине. — 2009. - № 2. — С. 117-120.

6. Данлыбаева Г.А., Мазуркова H.A., Матюшина P.O., Трошкова Г.П., Подчерняева Р.Я. Питательная среда на основе гидролизата рисовой муки для культивирования клеток и определение чувствительности к вирусам гриппа // Клеточные технологии в биологии и медицине. — 2009. - № 2. — С. 113-116.

7. Мазуркова H.A., Дешева Ю.А., Рябчикова Е.И., Терновой В.А., Трошкова Г.П. Шишкина Л.Н., Сергеев А.Н., Руденко Л.Г. Репродукция холодоадаптированного вакцинного штамма вируса гриппа H5N2 в клеточных культурах MDCK и Vero при использовании растительных протеаз и питательных сред на основе гидролизатов рисовой и соевой муки // Биотехнология. - 2010. - № 1. - С. 68-76.

8. Мазуркова H.A., Рындюк H.H., Шишкина Л.Н., Терновой В.А., Туманов Ю.В., Булычев Л.Е., Скарнович М.О., Кабанов A.C., Панченко С.Г., Алейников Р.П., Ильина Т.Н., Кузубов В.И., Мельников С.Я., Миронов А.Н., Коровкин С.А., Сергеев А.Н, Дроздов И.Г. Результаты клинических испытаний реактогенности, безопасности и иммуногенности гриппозной аллантоисной интраназальной живой вакцины «Ультрагривак» (тип A/H5N2) // Вестник РАМН. - 2010 - №. 3. - С. 15 - 20.

9. Исаева Е.И., Мазуркова H.A., Скарнович М.О., Трошкова Г.П., Шишкина Л.Н., Подчерняева Р.Я. Оптимизация роллерного культивирования вакцинных штаммов вирусов гриппа А и В в культурах клеток MDCK и Vero при использовании компонентов растительного происхождения // Биотехнология. -2010.-№ 6.-С. 21-27.

(Isaeva E.I., Mazurkova N.A., Skarnovich М.О., Troshkova G.P., Shishkina L.N., and Podchernyayeva R.Ya. Optimization of Roller Culturing of Influenza Virus Vaccine Strains in MDCK and Vero Cell Cultures using Plant Origin Components // Applied Biochemistry and Microbiology. - 2011. - V. 47. - № 8. - P. 737-743).

Ю.Исаева Е.И., Мазуркова H.A., Подчерняева Р.Я. Иммуногенность синтетических фрагментов из области вариабельных и консервативного сайтов тяжелой цепи гемагглютинина вируса гриппа H3N2 // Биотехнология. - 2011. -№ 1. - С. 14-22.

(Isaeva E.I., Mazurkova N.A., Podchernyayeva R.Ya. Immunogenicity of Synthetic Fragments Corresponding to Variable and Concervative Sites of H3N2 Influenza Virus Hemagglutinin Heavy Chain //Applied Biochemistry and Microbiology. -2011. - V. 47. -№8.-P. 723-729). П.Михайлова Г.Р., Мазуркова H.A., Подчерняева Р.Я., Рябчикова Е.И., Трошкова Г.П., Шишкина JI.H. Морфологическая и кариологическая характеристики клеток MDCK и Vero(B) при культивировании в питательных средах на основе растительных гидролизатов // Вопросы вирусологии. - 2011. -№2. - С. 9-14.

12. Мазуркова H.A., Трошкова Г.П., Шишкина Л.Н., Ставский Е.А., Дроздов И.Г. Создание питательной среды на основе гидролизата сои, полученного с использованием бромелаина, для клеток MDCK и Vero и оценка в них ростовых свойств вакцинных штаммов вируса гриппа // ЖМЭИ. - 2011. - № 1. - С. 86-90.

13. Мазуркова H.A., Дешева Ю.А., Шишкина Л.Н., Ставский Е.А., Руденко Л.Г. Использование растительных компонентов в роллерном культивировании вакцинного реассортантного штамма вируса гриппа H5N2 // ЖМЭИ. - 2011. -№ 2. - С. 88-92.

14. Мазуркова H.A., Дешева Ю.А., Шишкина Л.Н., Ставский Е.А., Руденко Л.Г. Иммуногенность образцов вакцинного штамма вируса гриппа H5N2, полученных при роллерном культивировании в средах с растительными компонентами // ЖМЭИ. -2011. - № 3. - С. 48-52.

15. Шишкина Л.Н., Мазуркова H.A., Терновой В.А., Булычев Л.Е., Туманов Ю.В., Скарнович М.О., Кабанов A.C., Рындюк H.H., Кузубов В.И., Миронов А.Н., Ставский Е.А., Дроздов И.Г. Оценка иммуногенности и безопасности гриппозной аллантоисной интраназальной живой вакцины «Ультрагривак» при двукратной иммунизации // ЖМЭИ. - 2011. - № 4. - С. 92-96.

16. Исаева Е.И., Мазуркова H.A., Подчерняева Р.Я. Сравнительное изучение иммуногенности культуральных и пептидных противогриппозных вакцин // ЖМЭИ. - 2011. - № 5. - С. 44-50.

Патенты:

1.Сандахчиев Л. С., Нечаева Е. А., Вараксин Н. А., Рябичева Т. Г., Мазуркова Н. А., Гендон Ю. 3., Маркушин С. Г., Акопова И. И., Коптяева И. Б. Способ получения живой культуральной вакцины против вируса гриппа // Патент РФ № 2330885, опубл. в БИ № 22 от 10.08.2008.

2.Трошкова Г.П., Мартынец Л.Д., Сумкина Т.П., Мазуркова H.A. Питательная среда для культивирования клеток млекопитающих // Патент РФ № 2377295, опубл. в БИ № 36 от 27.12.2009.

Статьи в журналах и других изданиях: 1. Трошкова Г.П., Мазуркова H.A., Сумкина Т.П., Мартынец Л.Д., Шишкина Л.Н., Карабинцева НО. Технология получения гидролизата сои с использованием протеолитического фермента бромелаина и оценка ростовых

свойств питательной среды на его основе для перевиваемых культур клеток // Современные наукоемкие технологии. - 2010. - № 1. - С. 45-47.

2. Мазуркова H.A. Иммуногенные свойства синтетических пептидных фрагментов гемагглютинина вируса гриппа A/H3N2 // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. - 2011. - № 5. - С. 100102.

3. Мазуркова H.A., Скарнович М.О., Трошкова Г.П., Шишкина Л.Н. Оптимизация процесса сублимационного высушивания культуральных холодоадаптированных вакцинных образцов вируса гриппа A/H5N2 // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. -2011,-№5.-С. 98-100.

4. Шишкина Л.Н., Мазуркова H.A., Сергеев А Н., Терновой В.А., Туманов Ю.В., Булычев Л.Е., Петрищенко В.А., Скарнович М.О., Кабанов A.C., Рындюк H.H., Панченко С.Г., Алейников Р.П., Ильина Т.Н., Миронов А Н., Мельников С.Я., Кузубов В.И., Коровкин С.А., Дроздов И.Г. «Проведение 2-ой фазы клинических испытаний иммуногенности и безопасности гриппозной аллантоисной интраназальной живой вакцины «Ультрагривак» при двукратной иммунизации» // Достижения современной биотехнологии: Сб. науч. тр. Л1од ред. проф. И.Г. Дроздова. - Новосибирск, 2008. - С. 103-111.

5. Подчерняева Р.Я., Данлыбаева Г.А., Мазуркова H.A., Бакланова О.В., Честков

B.В., Табаков В.Ю. Адаптация клеток MDCK к росту в мало- и бессывороточной питательных средах // Клеточные культуры Информационный бюллетень. Выпуск 25, СПб: Изд-во Политехи. Ун-та, 2010,

C.74-79.

Материалы конференций:

1. Мазуркова H.A., Богрянцева МП., Трошкова Г.П. Сухие стерильные малосывороточные питательные среды на основе гидролизатов для культивирования клеток млекопитающих // Материалы Международной научной конференции «Разработка и производство диагностических сухих питательных сред и микросистем», посвященной 70-летию НПО «Питательные среды», Махачкала, май 1998, С. 16-17.

2. Мазуркова H.A., Трошкова Г.П., Мартынец Л.Д., Богрянцева М.П. Бессывороточные и малосывороточные сухие стерильные питательные на основе ферментативных гидролизатов для культивирования клеток-продуцентов вирусных антигенов // Труды VII Международной конференции «Новые информационные технологии в медицине и экологии», Украина, Крым, Гурзуф, 31 мая - 11 июня 1999, С. 220-221.

3. Мазуркова H.A., Мартынец Л.Д., Богрянцева М П., Кирова Е.В., Трошкова Г.П. Ростстимулирующие белки как компонент питательных сред для культивирования клеточных культур // Труды VIII Международной конференции «Новые информационные технологии в медицине и экологии», Украина, Крым, Гурзуф, 6-10 июня 2000, С. 95-96.

4. Трошкова Г.П., Богрянцева МП., Юдин A.B., Мазуркова H.A., Мартынец Л.Д. Некоторые аспекты производства и применения бессывороточной питательной среды на основе ферментативного гидролизата сои // Труды IX Международной конференции «Новые информационные технологии в медицине и экологии», Украина, Крым, Гурзуф, 31 мая -11 июня 2001, С. 211212.

5. Мазуркова H.A., Трошкова Г.П., Сумкина Т.П., Шишкина Л.Н., Сергеев А Н., Дроздов И.Г. Репродукция штаммов вируса гриппа в перспективных для производства культуральных вакцин клеточных линиях при использовании питательных сред и ферментов растительного происхождения // Биотехнология в Казахстане: Проблемы и перспективы инновационного развития: Междунар. Науч. - практич. конф., посвящ. 50-летию науч.- исслед. ин-та пробл. биол. Безопасности (19- 21 мая 2008 г., Алматы). — Алматы. -2008.-Сб.-С. 282-283.

6. Мазуркова H.A., Шишкина Л.Н., Сергеев А.Н., Терновой В.А., Туманов Ю.В., Булычев Л.Е., Петрищенко В.А., Скарнович М О., Кабанов A.C., Сергеев A.A., Панченко С.Г., Рындюк H.H., Кузубов В.И., Миронов А.Н., Мельников С.Я., Коровкин С.А., Дроздов И.Г. Результаты клинических испытаний иммуногенности и безопасности гриппозной аллантоисной интраназальной живой вакцины «Орвакс» при двукратной иммунизации людей в возрасте от 18 до 60 лет // Биотехнология в Казахстане: Проблемы и перспективы инновационного развития: Междунар. науч.-практич. конф., посвящ. 50-летию науч.-исслед. ин-та пробл. биол. безопасности (19-21 мая 2008 г., Алматы). -Алматы. - 2008. - Сб. - С. 461 - 462.

7. Данлыбаева Г.А., Мазуркова H.A., Матюшина P.O., Трошкова Г.А., Подчерняева Р.Я. Использование питательной среды на основе гидролизата рисовой муки для культивирования клеток и определение чувствительности к вирусам гриппа // Биотехнология в Казахстане: Проблемы и перспективы инновационного развития: Междунар. науч.-практич. конф., посвящ. 50-летию науч.-исслед. ин-та пробл. биол. безопасности (19- 21 мая 2008 г., Алматы). — Алматы. - 2008. - Сб. - С.268 - 269.

8. Мазуркова H.A. Проведение 2-й фазы клинических исследований гриппозной аллантоисной интраназальной живой вакцины «Орвакс» (тип A/H5N2) при двукратной иммунизации // Проблемы совершенствования природной, техногенной и пожарной безопасности населения и территорий муниципальных образований субъектов Российской федерации Сибирского федерального округа: Материалы науч.-практич. конф. (17 сент. 2008 г., Новосибирск). — Новосибирск, 2008. — С. 76 - 77.

9. Мазуркова H.A., Шишкина Л.Н., Сергеев А Н., Булычев Л.Е., Терновой В.А., Туманов Ю.В., Петрищенко В.А., Сергеев A.A., Скарнович М О., Кабанов A.C., Рындюк H.H., Панченко С.Г., Алейников Р.П., Ильина Т.Н., Миронов А.Н., Мельников С.Я., Кузубов В.И., Коровкин С.А., Дроздов И.Г.

«Клинические исследования гриппозной аллантоисной интраназальной живой вакцины «Орвакс» (тип A/H5N2)» // Тезисы в сборнике Международной научно-практической конференции «Проблемы совершенствования межгосударственного взаимодействия в подготовке к пандемии гриппа», г. Новосибирск, 9-10 октября 2008 г. С. 76-78.

10. Катлинский A.B., Семченко A.B., Дроздов И.Г., Коровкин С.А., Миронов А Н., Мельников С.Я., Дылдина Н.В., Руденко Л.Г., Мельников С.А., Черникова Н.К., Хамитова М.Ф., Сергеев А.Н., Шишкина Л.Н., Мазуркова H.A., Кузубов В.И., Рындюк H.H., Голубев Д А. Доклинические и клинические исследования живой препандемической вакцины против гриппа птиц // IX Межгосударственная научно-практическая конференция «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств - участников Содружества Независимых Государств». - Волгоград. - 30 сентября - 2 октября 2008 г. - С. 89-90.

11. Рындюк H.H., Алейников Р.П., Кузубов В.И., Мазуркова H.A., Шишкина Л.Н., Сергеев АН., Миронов А.Н., Мельников С.Я., Коровкин С.А. «Клиническое исследование живой аллантоисной интраназальной гриппозной вакцины «Ультрагривак» (тип A/H5N2)» // Международная научно -практическая конференция (14-15 мая 2009 г., Новосибирск, Россия). -Новосибирск: Изд-во «ЦЭРИС», - 2009. - С. 261.

12. Рябчикова Е.И., Таранов О.С., Спицына Ю.Е., Гончаренко А.К., Мазуркова H.A., Демина O.K. Вирус гриппа H5N1: инфекционный процесс in vitro и in vivo // Тезисы в сборнике Научной конференции «Медицинская геномика и протеомика», 9-13 сентября 2009 г., г. Новосибирск, Россия, С. 61.

13. Сумкина Т.П., Мартынец Л.Д., Мазуркова H.A., Трошкова Г.П., Нечаева Е.А. Сравнительный анализ питательных сред на основе ферментативных гидролизатов соевой муки // Тезисы Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2010. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», Москва, 9-10 ноября 2010 г., С. 106-107.

14. Мазуркова H.A., Дешева Ю.А., Шишкина Л.Н., Руденко Л.Г. Роллерная технология производства культуральной (MDCK) гриппозной вакцины с использованием растительных компонентов // Тезисы Международной научной конференции «Актуальные проблемы науки и образования», Куба, Варадеро, 20-31 марта 2011 г., «Международный журнал экспериментального образования, 2011, № 5. С. 38.

15. Мазуркова H.A. Определение специфичности антигриппозных моноклональных антител с помощью синтетических пептидов // Тезисы Международной научной конференции «Приоритетные направления развития науки, технологии и техники», Италия (Рим), 10-17 апреля 2011 г., «Успехи современного естествознания», 2011, № 5, С. 115.

16. Мазуркова H.A., Исаева Е.И., Трошкова Г.П., Шишкина Л.Н., Подчерняева Р.Я. Роллерное культивирование клеток MDCK и Vero в питательных средах на основе растительных гидролизатов для производства гриппозной вакцины // Тезисы Международной научной конференции «Инновационные медицинские технологии», Россия-Франция (Москва-Париж), 18-25 марта 2011 г., «Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований», 2011, №8, С. 114.

17. Мазуркова H.A., Сумкина Т.П., Трошкова Г.П. Разработка питательной среды на основе соевого гидролизата, полученного с использованием бромелаина, для клеток MDCK. II Тезисы Международной научной конференции «Новые технологии, инновации, изобретения», Мальдивские острова, 16-23 марта 2011 г., «Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований», 2011, №6, С. 38-39.

Мазуркова Наталья Алексеевна

РАЗРАБОТКА И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПРЕПАРАТОВ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ В ТЕХНОЛОГИЯХ СОЗДАНИЯ ГРИППОЗНЫХ ВАКЦИН

Автореф. дисс. на соискание ученой степени доктора биологических наук

Подписано в печать 20.11.2012 г. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 2,0. Тираж 100 экз. Заказ № 126 Типография «Срочная полиграфия», ИП Малыгин Алексей Михайлович 630090, Новосибирск, пр-т Академика Лаврентьева, 6/1, оф. 104

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АК - аминокислота

БСА - бычий сывороточный альбумин

ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения

ГНЦ ВБ - Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии

ЖГВ - живая гриппозная вакцина

ИГВ - инактивированная гриппозная вакцина

КЗ - коэффициент защиты

МГУ — Московский Государственный Университет

МЗСР - Министерство здравоохранения и социального развития

НИИ - научно-исследовательский институт

ОРВИ - острая респираторная вирусная инфекция

ПЛК - перевиваемая линия клеток

ПС - питательная среда

ПСРТ - питательная среда на основе гидролизата риса, полученного

с помощью трипсина'

ПССБ - питательная среда на основе гидролизата сои, полученного

с помощью бромелаина

ПССТ - питательная среда на основе гидролизата сои, полученного

с помощью трипсина

РАСХН - Российская академия сельскохозяйственных наук

РГА - реакция гемагглютинации

РТГА - реакция торможения гемагглютинации

РФ - Российская Федерация

САЖ - сахарозо-желатиновая среда

СКПК - сыворотка крови плодов коровы

СОП - стандартная операционная процедура

ТЦЦ50 - 50 %-ная тканевая цитопатическая доза

ФБУН - Федеральное бюджетное учреждение науки

ЭИД50 - 50 %-ная эмбриональная инфицирующая доза

А - аденин

С - цитозин

НА1 - тяжелая цепь гемагглютинина

НА2 - легкая цепь гемагглютинина

М1 - матриксный белок вируса гриппа

М2 - белок ионного канала вируса гриппа

MDCK - культура клеток почки взрослой самки кокер-спаниеля

NS1 - неструктурный белок 1 вируса гриппа

РА - полимеразный белок РА вируса гриппа

РВ1 - полимеразный белок РВ1 вируса гриппа

РВ2 — полимеразный белок РВ2 вируса гриппа

Т - тимин

Vero - культура клеток почки взрослой африканской зеленой мартышки

WHO - Всемирная организация здравоохранения

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Мазуркова, Наталья Алексеевна, Кольцово

Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»

На правах рукописи

05201350476

Мазуркова Наталья Алексеевна

Разработка и использование препаратов растительного происхождения в технологиях создания гриппозных вакцин

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Диссертация

на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научные консультанты:

доктор биологических наук, профессор Г.П. Трошкова

доктор биологических наук, профессор Е.И. Рябчикова

Кольцово - 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

Главы Стр.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕН™ 5

ВВЕДЕНИЕ 7

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 18

1.1. Гриппозные вакцины в современном арсенале иммунопрофилактики 18

1.1.1. Инактивированные гриппозные вакцины 19

1.1.2. Живые аттенуированные гриппозные вакцины 25

1.2. Эффективность и объемы современного производства гриппозных вакцин 29

1.3. Подходы к созданию гриппозных вакцин нового поколения 35

1.3.1. Рекомбинантные вакцины 37

1.3.2. ДНК-вакцины 40

1.3.3. Растительные вакцины 41

1.3.4. Синтетические вакцины на основе пептидов 42

1.3.4.1. Вакцины на основе консервативных последовательностей протеинов М2е и NP вируса гриппа 46

1.3.4.2. Вакцины на основе консервативных последовательностей протеина НА 48

1.3.4.3. Вакцины на основе комбинаций вариабельных и консервативных эпитопов различных протеинов вируса гриппа 49

1.4. Культуральные гриппозные вакцины 52

1.4.1. Клеточные линии в качестве субстрата культуральных гриппозных вакцин 56

1.4.2. Инактивированные культуральные гриппозные вакцины 60

1.4.3. Живые культуральные гриппозные вакцины 62

1.4.4. Питательные среды, ферменты, стабилизаторы, используемые

при производстве культуральных гриппозных вакцин 63

1.5. Адыованты для повышения иммуногенности гриппозных вакцин 75

1.6. Иммуномодуляторы, используемые для повышения эффективности гриппозных вакцин 78

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 85

2.1. Материалы 85

2.2. Методы 87

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 107 3.1. Разработка технологии приготовления питательной среды

на основе соевого гидролизата 107

3.1.1. Конструирование питательной среды на основе соевого гидролизата, полученного с использованием бромелаина, для перевиваемых линий клеток MDCK и Vero 107

3.1.2. Изучение влияния экспериментальных питательных сред на биологические свойства перевиваемых линий клеток MDCK и

Vero 121

3.1.2.1. Изучение пролиферативных, морфологических и кариологических характеристик перевиваемых линий клеток MDCK и Vero при культивировании в экспериментальных питательных средах 123

3.1.2.2. Контроль контаминации перевиваемых линий клеток MDCK и Vero при культивировании в экспериментальных питательных средах 138

3.2. Оценка возможности использования питательных сред на основе растительных компонентов для выращивания вакцинных штаммов вируса гриппа в перевиваемых линиях клеток MDCK и Vero 145

3.2.1. Исследование репродукции вакцинных штаммов для изготовления инактивированной гриппозной вакцины на перевиваемых линиях клеток MDCK и Vero, выращенных в экспериментальных питательных средах 145

3.2.2. Исследование репродукции вакцинных штаммов для изготовления живой гриппозной вакцины на перевиваемых линиях клеток MDCK и Vero, выращенных в экспериментальных питательных средах 153

3.2.3. Изучение влияния ферментов растительного происхождения на репродуктивную активность вакцинных штаммов вируса гриппа

в перевиваемых линиях клеток 158

3.2.3.1. Изучение возможности замены трипсина на растительные протеазы папаин и бромелаин при культивировании вакцинных штаммов вируса гриппа в клетках MDGK ; 158

3.2.3.2. Оценка возможности применения растительных протеаз для культивирования вакцинного штамма вируса гриппа А/17/утка/Потсдам/86/92 в перевиваемых линиях клеток

MDCK и Vero 164

3.2.4. Оценка наработки вакцинного штамма вируса гриппа А/17/утка/Потсдам/86/92 в перевиваемых линиях клеток

MDCK и Vero при использовании растительных препаратов 166

3.2.5. Ультраструктурные характеристики репликации вакцинного штамма вируса гриппа А/17/утка/Потсдам/86/92 в перевиваемых линиях клеток MDCK и Vero при использовании растительных препаратов 169

3.2.6. Фенотипическая и генетическая стабильность холодоадаптированных реассортантных вакцинных штаммов вируса гриппа при культивировании на клеточных линиях

MDCK и.Vero с использованием растительных препаратов 177

3.2.6.1. Определение фенотипических признаков са+25 и ts".)0 реассортантных вакцинных штаммов вируса гриппа A/H1N1, A/H3N2 и В 177

3.2.6.2. Оценка фенотипической и генетической стабильности вакцинного штамма вируса гриппа А/17/утка/Потсдам/86/92 при культивировании на клеточных линиях MDCK и Vero с

использованием растительных препаратов 180

3.3. Изучение особенностей культивирования клеточных линий MDCK и Vero в экспериментальных питательных средах

в роллерах 183

3.4. Изучение особенностей культивирования вакцинных штаммов вируса гриппа, используемых для производства инактивированной вакцины, в роллерах с использованием растительных препаратов 189

3.5. Изучение особенностей культивирования вакцинного штамма вируса гриппа А/17/утка/Потсдам/86/92 в роллерах с использованием растительных препаратов 202

3.5.1. Изучение особенностей культивирования вакцинного штамма вируса гриппа А/17/утка/Потсдам/86/92 в роллерах на клеточных линиях MDCK и Vero с использованием растительных препаратов 203

3.5.2. Изучение влияния растительных препаратов

на генетическую и фенотическую стабильность полученного в роллерах на клеточных линиях MDCK и Vero вакцинного штамма вируса гриппа А/17/утка/Потсдам/86/92 211

3.6. Изучение возможности использования растительных компонентов в составе защитных сред при сублимационном высушивании полученного в перевиваемых клеточных линиях вакцинного штамма вируса гриппа

А/17/утка/Потсдам/86/92 214

3.7. Изучение иммуногенности и протективной активности на лабораторных животных сухих вакцинных образцов, содержащих штамм вируса гриппа А/17/утка/Потсдам/86/92, приготовленных с использованием растительных препаратов 221

3.8. Изучение изменений иммунного ответа лабораторных животных на пептид-белковые копъюгаты под влиянием пептидогликана растительного происхождения Иммуномакс 235 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 254 ВЫВОДЫ 269 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 271 ПРИЛОЖЕНИЯ 296

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АБ - антибиотики

АК - аминокислота

АМН - Академия медицинских наук

АТ - антитело

БОЕ - бляшкообразующая единица

БСА - бычий сывороточный альбумин

ВАЖ - вирусаллантоисная жидкость

вг - вирус гриппа

вкж - вируссодержащая культуральная жидкость

ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения

впгп - высокопатогенный грипп птиц

ГНЦВБ - Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии

ГФ - Государственная фармакопея

ЖГВ - живая гриппозная вакцина

ИТВ - инактивированная гриппозная вакцина

ид50 - 50 %-ная инфицирующая доза

ип - индекс пролиферации

ИФА — иммуноферментный анализ

КЗ - коэффициент защиты

КРИМ - конкурентный радиоиммунологический метод

ЛДзо - 50 %-ная летальная доза

мАТ - моноклональное антитело

МГУ — Московский Государственный Университет

МЗиСР - Министерство здравоохранения и социального развития

МИБГТ - медицинский иммунобиологический препарат

НИИ - научно-исследовательский институт

НПО - научно-производственное объединение

ОРВИ - острая респираторная вирусная инфекция

ПЛ1С - перевиваемая линия клеток

ПС - питательная среда

ПСРТ - питательная среда на основе гидролизата риса, полученного

с помощью трипсина

ПССБ - питательная среда на основе гидролизата сои, полученного

с помощью бромелаина

ПССТ - питательная среда на основе гидролизата сои, полученного

с помощью трипсина

РАМН - Российская академия медицинских наук

РГА - реакция гемагглютинации

РИА - радиоиммунологический анализ

РКЭ - развивающийся куриный эмбрион

РМН - реакция микронейтрализации

РН - реакция нейтрализации

РНП - рибонуклеопротеид

РТГА - реакция торможения гемагглютинации

РФ - Российская Федерация

САЖ - сахарозо-желатиновая среда

СЗО - Северо-Западное отделение

СКПК - сыворотка крови плодов коровы

СПЖ - средняя продолжительность жизни

ТЦД50 - 50 %-ная тканевая цитопатическая доза

ФБУН - Федеральное бюджетное учреждение науки

ФГБУ - Федеральное государственное бюджетное учреждение

ФГУГТ - Федеральное государственное унитарное предприятие

ФС - фармакопейная статья

ЦТЛ - цитотоксический лимфоцит

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ЭП - эритроциты петуха

ЭПР - эндоплазматический ретикулум

ЭИД50 - 50 %-ная эмбриональная инфицирующая доза

А - аденин

С - цитозин

Е - глутаминовая кислота

G - глицин

Glu - глутаминовая кислота

Gly - глицин

НА - гемагглютинин вируса гриппа

НА1 - тяжелая цепь гемагглютинина

НА2 - легкая цепь гемагглютинина

IgA - иммуноглобулин А

IgG - иммуноглобулин G

М1 - матриксный белок вируса гриппа

М2 - белок ионного канала вируса гриппа

MDCK - культура клеток почки взрослой самки кокер-спаниеля

МНС - белки главного комплекса гистосовместимости

NP - нуклеопротеидный белок вируса гриппа

NS1 - неструктурный белок 1 вируса гриппа

РА - полимеразный белок РА вируса гриппа

РВ1 - полимеразный белок РВ1 вируса гриппа

РВ2 - полимеразный белок РВ2 вируса гриппа

Т - тимин

Vero - культура клеток почки взрослой африканской зеленой мартышки

ВВЕДЕНИЕ

Грипп является одним из самых распространенных вирусных респираторных заболеваний человека, поражающим, по данным ВОЗ, во время сезонных эпидемий от 10 до 20 % всего населения и до 40-60 % пожилых людей. Число случаев тяжелой формы заболевания гриппом доходит до 3-5 миллионов в год, а количество летальных исходов - до 250-500 тыс. [318]. В России ежегодно регистрируют от 27,3 до 41,2 млн. случаев гриппа и других ОРВИ [407]. Во время пандемий эти показатели могут возрастать в 3-4 раза. В прошлом столетии отмечено три пандемии гриппа, вызванные вирусами субтипов А/НШ1 (1918 г.), А/Н2Ш (1957 г.), А/НЗЫ2 (1968 г.). В последние годы активно обсуждается вопрос о возможности возникновения новой пандемии гриппа [459, 425, 261]. Из известных 15 субтипов вируса гриппа А субтип А/1-15М1 (грипп птиц, «птичий грипп») обладает наиболее высоким пандемическим потенциалом: высоко летален (смертность людей достигает 60 %), быстро мутирует и вступает в реассортацию с вирусами других субтипов, циркулирующими среди птиц и различных животных, в том числе млекопитающих [135, 444]. Полагают, что генетическая реассортация вируса гриппа субтипа А/Н5Т\Г1 с сезонным вирусом гриппа человека может привести к возникновению нового высоко патогенного пандемического варианта [332].

Важной частью противоэпидемических мероприятий по ограничению распространения инфекции, вызванной вирусом гриппа, и снижению смертности во всех группах человеческой популяции является вакцинопрофилактика, осуществляемая с помощью живых и инактивированных вакцин. В настоящее время в России единственным разрешенным субстратом для производства обоих типов гриппозных вакцин являются развивающиеся куриные эмбрионы. Этот субстрат далеко не идеален: помимо возможной контаминации инфекционными агентами, получение куриных эмбрионов и, соответственно, производство аллантоисных вакцин может быть блокировано при вспышке гриппа птиц. В связи с этим становится особенно актуален перевод производства гриппозных вакцин на иной субстрат, которым могут

стать перевиваемые клеточные линии, использование которых позволяет развернуть быстрое и масштабное изготовление культуральных вакцин [305]. Следовательно, разработка эффективных культуральных вакцин, в том числе и против пандемического гриппа, - вопрос крайне важный.

ВОЗ с 1995 г. рекомендует разрабатывать и производить гриппозные вакцины с использованием в качестве субстрата перевиваемых культур клеток, аттестованных в соответствии с международными требованиями к клеточным субстратам [463]. Возможность изготовления инактивированных культуральных вакцин убедительно доказана при использовании клеток Vero и MDCK. Так, в Европе разработаны и разрешены к применению для сезонной профилактики гриппа культуральные инактивированные вакцины, приготовленные на клеточных линиях MDCK (Influvac ТС, Solvay) и Vero (Influject, Baxter) [470]. В России зарегистрирована субъединичная гриппозная вакцина Гриппол®Нео, содержащая иммупоадъювант Полиоксидоний® (производства ФК «ПЕТРОВАКС», Россия) и протективные антигены (гемагглютинин и нейраминидаза) эпидемически актуальных, выращенных в клетках MDCK, штаммов вируса гриппа субтипов A (H1N1 и H3N2) и типа В (производства «Солвей Биолоджикалз Б.В.», Нидерланды) [10]; в настоящее время вакцина Гриппол®Нео не выпускается.

В случае пандемии, когда у большей части населения отсутствует специфический иммунитет, однократная иммунизация живой вакциной может оказаться более эффективной, чем аналогичная инактивированной. В связи с этим ВОЗ рекомендует, учитывая высокую урожайность штаммов ЖГВ, перейти с выпуска ИГВ на ЖГВ. Это позволит в течение 6-и месяцев произвести достаточное количество вакцины для иммунизации всех групп населения [464], а перевод производства ЖГВ с куриных эмбрионов на клеточные культуры позволит сократить эти сроки до 2-3-х месяцев. Важную роль в разработке безопасной и эффективной живой культуральной вакцины против пандемического и сезонного гриппа должны сыграть новые технологии на основе клеточных культур.

Использование культуральных технологий требует наличия сертифицированных клеточных линий. Линия клеток Vero уже более 20 лет разрешена ВОЗ для производства вирусных вакцин для человека [309]. В ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (Россия) имеется аттестованный в соответствии с требованиями ВОЗ банк клеточной линии MDCK [58].

В настоящее время в России несколькими исследовательскими группами ведутся разработки живой культуральной гриппозной вакцины. В НИИ гриппа разрабатывается живая рекомбинантная delNS-вакцина на основе штаммов вируса гриппа с делетированным геном NS1 и культуры клеток Vero [28]. В ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» совместно с НИИ экспериментальной медицины СЗО РАМН ведется разработка живой вакцины «Вектор-Флю» против пандемического гриппа A/H1N1 на основе вакцинного штамма А/17/Калифорния/2009/38 с использованием линии клеток MDCK и импортной бессывороточной среды [45]. -

Безопасность вакцинных препаратов является их важнейшей характеристикой. В 1999 г. государственные агентства, контролирующие производство фармацевтической продукции в Европе (European Medicine Evaluation Agency, EMEA) и в США (Food and Drug Administration, FDA), призвали ведущие фармацевтические компании исключить или ограничить использование компонентов животного происхождения в производстве вакцин [132], что подчеркивает актуальность разработки технологий, позволяющих заменять препараты животного и человеческого происхождения продуктами растительной природы. Ряд исследователей разрабатывают среды для культур клеток млекопитающих, свободные от животных компонентов. Так, при производстве культуральных гриппозных вакцин перевиваемые линии клеток выращивают в бессывороточных питательных средах: MDCK - в средах MDSS2 и MDSS2N (Франция) [305], EpiSerf (Gibco) (Голландия) [92, 330], UltraMDCK (BioWHITTAKER); Vero - в среде ЕМ (Axell Biotechnologies) (Австрия) [257, 258, 259].

В России в настоящее время не существует отечественных бессывороточных и малосывороточных культуральных питательных сред для клеток MDCK и Vero, а импортные дороги, что делает их использование нерентабельным при масштабном производстве. Следовательно, разработка для клеточного субстрата гриппозных вакцин отечественных культуральных сред, не содержащих сыворотку или содержащих ее в сниженных концентрациях, является крайне актуальной. Среды на основе ферментативных гидролизатов растительного сырья могут быть весьма перспективными для культуральных технологий гриппозных вакцин, которые должны отвечать все более жестким критериям биологической безопасности.

В соответствии с критериями безопасности при производстве культуральной гриппозной вакцины крайне важно вместо препаратов животного происхождения (сыворотки и трипсина в составе питательных сред, желатина (желатозы) в составе стабилизатора для живой вакцины) использовать растительные продукты.

Стоимость вакцинного препарата имеет немаловажное значение для

v *

обеспечения вакциной против пандемического гриппа всего населения [53], и она может быть значительно снижена при применении отечественных питательных сред на основе ферментативных гидролизатов доступного растительного сырья.

Биотехнологический подход на основе использования синтетических пептидов, соответствующих АК последовательностям тех сайтов гемагглютинина, которые распознаются иммунной системой и вызывают протективный иммунный ответ, является еще одним способом повышения безопасности гриппозных вакцин. Вакцины на основе консервативных сайтов могут обеспечить защиту против всех типов вируса гриппа, включая появляющиеся пандемические штаммы. ВОЗ одобрила рекомендации по разработке и

Информация о работе

Мазуркова, Наталья Алексеевна
доктора биологических наук
Кольцово, 2013
ВАК 03.01.06

Диссертация

Разработка и использование препаратов растительного происхождения в технологиях создания гриппозных вакцин - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы