Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Трансмиссивность современных штаммов вируса гриппа в экспериментах in vivo

ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Трансмиссивность современных штаммов вируса гриппа в экспериментах in vivo"

На правах рукописи (f

ДУБРОВИНА Ирина Анатольевна

ТРАНСМИССИВНОСТЬ СОВРЕМЕННЫХ ШТАММОВ ВИРУСА ГРИППА В ЭКСПЕРИМЕНТАХ IN VIVO

03.02.02 - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 8 НОЯ 2013

Москва - 2013

005541326

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» СевероЗападного отделения Российской академии медицинских наук

Научный руководитель доктор биологических наук, доцент

Киселева Ирина Васильевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, Федеральное Ленева Ирина Анатольевна

государственное бюджетное учреждение

«Научно исследовательский институт

вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова»

РАМН, заведующая лабораторией

доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им.М.П.Чумакова» РАМН, заведующая лабораторией

Гамбарян Александра Сергеевна

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт гриппа» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится: « » ^¿(¿¿Ц/Ц 2013г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 001.026.01. в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им.М.П.Чумакова» РАМН по адресу: 142782, г. Москва, поселение Московский, поселок Института полиомиелита.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П.Чумакова» РАМН

Автореферат разослан: » ИОЛ^ЦЯ_2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук л л , ^ O.A. Медведкина

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Грипп - это тяжелая вирусная инфекция, которая поражает людей вне зависимости от возраста и национальности и остается серьезной проблемой здравоохранения во всем мире. Заболевания гриппом сопровождаются высокой смертностью, особенно у маленьких детей и пожилых людей (Thompson et al., 2003). Эпидемии гриппа происходят каждый год и охватывают до 15% населения Земли. Пандемии возникают каждые 10-40 лет. В 2009 году мир оказался на пороге первой пандемии 21-го века, вызванной вирусами, подобными А/Калифорния/7/2009 (HlNl)pdm.

Сегодня, наряду с уже повсеместно циркулирующим калифорнийским штаммом A (H1N1), потенциальную угрозу пандемии несут высоко патогенные вирусы гриппа птиц, которые уже преодолели видовой барьер, передаваясь от птиц к человеку (Zitzow, 2002). В дальнейшем могут произойти новые генетические изменения, которые позволят птичьим вирусам передаваться уже непосредственно от человека к человеку.

Три основных свойства вируса гриппа определяют его пандемические потенции: новизна штамма для иммунной системы, вирулентность и способность передаваться от человека к человеку, то есть трансмиссивность. Именно степень трансмиссивности циркулирующих штаммов определяет тяжесть вызываемых ими пандемий или эпидемий (Löwen et al., 2009). Несмотря на бесспорно ключевую роль трансмиссивности вируса гриппа в распространении эпидемических и пандемических штаммов, природа и механизмы их контагиозности продолжают обсуждаться. Поэтому существует насущная необходимость глубокого понимания проблемы трансмиссивности вируса гриппа. Раскрытие механизмов, лежащих в ее основе, позволит более эффективно контролировать грипп и изыскивать новые пути и методы его профилактики.

На сегодняшний день наиболее эффективным методом защиты от гриппа является вакцинопрофилактика. В последние годы живая гриппозная холодоадаптированная (ХА) реассортантная вакцина (ЖГВ) как средство защиты от гриппа заняла лидирующее положение в мире среди других профилактических противогриппозных препаратов. По мнению экспертов Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), использование живых противогриппозных вакцин является эффективным путем защиты восприимчивой популяции не только от сезонно возникающих эпидемий, но и глобальных пандемий гриппа.

Начиная с 1977 года регулярно публиковались результаты клинических исследований по выделению вакцинных штаммов ЖГВ, в которых (Rudenko et al., 1991; Murphy, 1993; Talbot, 2005; Nichol, 2006; Block, 2008; Mallory et al, 2011), за единственным исключением (Vesikari et al, 2006, 2008), не была зарегистрирована их передача при тесном контакте привитых и не привитых лиц. Только в работах Vesikari с соавт. (2006, 2008) описан единичный случай выделения вакцинного штамма вируса гриппа В американской вакцины FluMist® от ребенка, получившего препарат плацебо. Однако, в связи с изменением антигенной структуры циркулирующих вирусов, появлением новых эпидемических и пандемических вирусов, а также с опасностью циркуляции в человеческой популяции вирусов гриппа птиц и животных (в частности, свиней), требуется проведение новых, углубленных исследований трансмиссивности вакцинных штаммов.

Сегментированная природа генома, и, соответственно, способность к реассортации вируса гриппа является одной из основных причин возникновения пандемических вирусов и играет ключевую роль в адаптации к новому хозяину (Taubenberger, 2009). Известен ряд работ, касающихся изучения последствий для организма чувствительного хозяина реассортации двух «диких» вирусов. В частности, в экспериментах на мышах показано, что скрещивание низко патогенного вируса гриппа птиц A(H5N1) и вируса гриппа человеческого происхождения A(H3N2) может привести к формированию

реассортантов с повышенной вирулентностью (Li et al., 2010; Chen et al., 2008). Обнаружение в дикой природе межвидовых реассортантных вирусов гриппа, несущих гены вирусов человеческого и иного происхождения (Cong, 2010), свидетельствует о возможности наступления событий такого рода. Высокая эффективность скрещивания после одномоментного заражения хорьков смесью вируса гриппа птиц A(H5N1) и человека A(H3N2) с преобладанием реассортантов, несущих поверхностные антигены птичьего происхождения, делает реальной опасность такого рода встречи (Jackson, 2009).

Периодически в научной литературе обсуждается вопрос о возможности распространения среди населения штаммов живой гриппозной вакцины с их последующей реассортацией с циркулирующими вирусами. По мнению авторов таких статей, вакцинный штамм может обменяться генами с сезонным вирусом, что в свою очередь может привести к формированию реассортантного вируса с новыми, неизученными свойствами и повышенной вирулентностью. Однако, опубликована только одна работа, посвященная экспериментальному изучению реассортации «дикого» и ХА вакцинного штаммов (Parks, 2007). В ней было продемонстрировано, что скрещивание «дикого» вируса А/Сидней/5/97 (H3N2) с ХА вакцинным штаммом, подготовленным на его же основе, привело к созданию реассортантов, среди которых доминировали аттенуированные температурочувствительные варианты; ни один реассортант не приобрел вирулентность, превышающую таковую «дикого» родителя.

Таким образом, к моменту начала нашей работы систематических исследований подобного рода в мире не проводилось.

Все вышесказанное определяет важность изучения феномена трансмиссивное™ вируса гриппа, а доказательство необоснованности приведенных выше опасений позволит подтвердить безопасность применения ЖГВ не только в эпидемический, но и в пандемический по гриппу периоды.

Основной целью работы явилось изучение трансмиссивное™ и особенностей реассортации in vivo вирусов гриппа, обладающих разным уровнем вирулентности для экспериментальных животных.

Для решения поставленной цели в задачи исследования входило:

1. Отработка модели трансмиссивное™ вируса гриппа в экспериментах на морских свинках.

2. Изучение трансмиссивности пандемических, потенциально пандемических и сезонных штаммов вируса гриппа в экспериментах in vivo и сравнительная оценка степени их контагиозности для лабораторных животных.

3. Оценка возможности передачи холодоадаптированных вирусов (доноров атгенуации) и вакцинных штаммов ЖГВ от зараженных контактным животным.

4. Изучение особенностей реассортации сезонных и пандемически опасных вирусов гриппа с ХА штаммами в экспериментах in vivo.

Научная новизна исследования.

Впервые в России в экспериментах in vivo проведено систематическое изучение способности к трансмиссивности широкого спектра вирусов гриппа.

Показано, что разные штаммы вируса гриппа обладают способностью к передаче на расстоянии различной степени выраженности (от высокой до полного ее отсутствия). Наиболее трансмиссивными оказались вирус NIBRG-23 (H5N1), унаследовавший НА и NA от вируса гриппа птиц A/turkey/Turkey/1/2005, и выделенный от человека вирус гриппа свиней А/Индиана/10/2011 (H3N2)v. Вызвавший пандемию 2009 года вирус А/Калифорния/07/2009 (HlNl)pdm проявлял меньшую контагиозность.

В экспериментах на лабораторных животных впервые продемонстрировано полное отсутствие трансмиссивности ХА штаммов вируса гриппа (доноров атгенуации и вакцинных штаммов ЖГВ).

Установлено, что смешанная инфекция in vivo «диких» и ХА вирусов не приводит к формированию реассортантов, превышающих по своей вирулентности «дикие» родительские вирусы.

Теоретическая и практическая значимость работы.

В результате моделирования смешанной инфекции in vivo доказано отсутствие формирования при массовой вакцинации населения живой

гриппозной вакциной реассортантных вирусов, обладающих повышенным уровнем патогенности.

Показано, что реассортация in vivo происходит менее эффективно, если один из участников скрещивания является ХА вирусом.

Установлен факт интерференции ХА вирусов с вирусами «дикого» типа, что открывает новые перспективы применения живой гриппозной аттенуированной вакцины в пандемической ситуации.

Подтверждена безопасность массового применения не только сезонной, но и пандемической живой гриппозной вакцины.

Положения, выносимые на защиту.

«Дикие» вирусы гриппа обладают разной степенью трансмиссивности для экспериментальных животных (морских свинок).

Холодоадаптированные штаммы вируса гриппа активно реплицируются в ВДП экспериментальных животных, но не способны к передаче от вакцинированных контактным особям.

Теоретически возможная реассортация высоко вирулентных вирусов с ХА штаммами живой гриппозной вакцины не приведет к формированию реассортантов, обладающих непредсказуемо высоким уровнем вирулентности и трансмиссивности и потенциально способных вызвать новую эпидемию или даже пандемию, что подтверждает высокую безопасность применения ЖГВ.

Личный вклад автора в проведенные исследования заключается в его непосредственном выполнении всех разделов данной работы.

Внедрение результатов исследования. Подготовленные автором два вакцинных штамма ЖГВ на эпидемический сезон 2012-2013 гг. А/17/Виктория/2011/89 (H3N2), В/60/Висконсин/2010/125 депонированы в Государственную коллекцию вирусов Российской Федерации на базе ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России под номерами 2723, 2724 и переданы в производственные институты. Разработанное компьютерное обеспечение «Калькулятор фенотипов» внедрено в практику работы лаборатории вакцинных штаммов отдела вирусологии им. А.А.Смородинцева (ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН, Санкт-Петербург) и

используется для обработки массива данных, оценки фенотипических свойств полученных реассортантных вирусов.

Апробация диссертации осуществлялась на протяжении всего периода работы. Основные положения диссертации были доложены на 19 международных и российских научных конференциях: на Международной научно-практической конференции, посвященной Всемирному дню здоровья (Киев, Украина, 7-8 апреля 2010 г.); на 14-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века» (Пущино, 19-23 апреля 2010 г.); на 17-м Международном конгрессе медицинских наук (КСОМБ) (Гронинген, Нидерланды, 8-11 июня 2010 г.); на VII Международном конгрессе по контролю за гриппом (Гонконг, Китай, 3-7 сентября 2010 г.); на Международном научно-практическом конгрессе студентов и молодых ученых «Актуальные проблемы современной медицины» (Киев, Украина, 3^4- ноября 2010 г.); на Всероссийской конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (21-22 декабря 2010 г.); на X—й Всероссийской молодежной конференции Института физиологии Коми научного центра Уральского отделения РАН «Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике» (Сыктывкар, республика Коми, 19-21 апреля 2011 г.); на 15-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века» (Пущино, 19-23 апреля 2011 г.); на Международной научной конференции студентов и молодых учёных «Молодежь - медицине будущего», посвященной 135-летию со дня рождения Н.Д.Стражеско (Одесса, Украина, 28-29 апреля 2011 г.); на Четвертой конференции Европейской научной рабочей группы по гриппу (Е8\У1) (Мальта, 11-14 сентября 2011 г.); на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы эпидемиологии на современном этапе», посвященной 80-летию кафедры эпидемиологии и доказательной медицины ГОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М.Сеченова Минздравсоцразвития России (Москва, 13-14 октября 2011 г.); на Всероссийской молодежной конференции-школе «Нейробиология интегративных функций мозга» посвященной 120-летию создания

физиологического отдела им. И.П.Павлова НИИЭМ СЗО РАМН (Санкт-Петербург, 21-25 ноября 2011 г.); на Международном конгрессе «Человеческий фактор риска» Союза управления рисками в профилактической медицине (URMPM) (Лондон, Великобритания, 8-9 сентября 2012 г.); на Второй Российско-Германской неделе молодого ученого «Общество и здоровье» (Екатеринбург, 16-21 сентября 2012 г.); на Научной конференции «Грипп: вирусология, эпидемиология, профилактика, лечение», посвященной 45-летию ФГБУ «НИИ гриппа» Минсоцздравразвития России (Санкт-Петербург, 24—25 октября 2012 г.); на П-й Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург, 12-14 ноября 2012 г.); на XVI Всероссийской медико-биологической научной конференции молодых ученых с международным участием «Фундаментальная наука и клиническая медицина человек и его здоровье» (Россия, Санкт-Петербург, 20 апреля 2013 г.); на Международной конференции «Молекулярная эпидемиология актуальных инфекций» (Россия, Санкт-Петербург, 5-7 июня 2013 г.); на VIII Международном конгрессе по контролю за гриппом (ЮАР, Кейптаун, 5-10 сентября 2013), а также регулярно заслушивались на заседаниях отдела вирусологии им. А.А.Смородинцева ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН (2010-2012 гг.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них 5 в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 93 страницах текста, включая 27 таблиц и 7 рисунков. Список цитируемой литературы содержит 108 источников, из них 5 отечественных и 103 иностранных.

СОБСТВЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Вирусы. В работе были использованы вирусы гриппа типа А и В: (1) «дикие» вирусы гриппа, а также реассортанты для инактивированных гриппозных вакцин (VN/1203/PR8-IBCDC-RG (VN1203),

Indo/05/2005(H5N1)/PR8-IBCDC-RG (Indo/5), NIBRG-23), подготовленные на основе высоко урожайного вируса A/PR/8/34 (H1N1) (PR8) и вирусов гриппа птиц H5N1: А/Вьетнам/1203/2004, А/Индонезия/05/2005 и А/индюк/Турция/1/2005 соответственно, полученные из ВОЗ и Центра по контролю за заболеваемостью (CDC, Атланта, Джорджия, США). У всех реассортантов для инактивированных вакцин кливедж-сайт модифицирован таким образом, что в гемагглютинине вирусов отсутствует полиосновный участок, что делает вирус апатогенным. Антигенный профиль «дикого» вируса при такой реконструкции полностью сохранен. (2) ХА доноры аттенуации отечественной живой гриппозной вакцины, А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) (Л17) и В/СССР/60/69 (В60), а также (3) реассортантные вакцинные штаммы, полученные на их основе, являющиеся собственностью ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН (Санкт-Петербург).

Накопление вирусов проводили на 10—11—дневных развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ) (ООО "Племрепродуктор Назия", Ленинградская область, пос. Приладожский) при 32°С в течение 48 часов для вирусов гриппа А и 72 часов для вирусов гриппа В.

Оценку инфекционной активности вирусов проводили по методу Reed и Muench (1938). Титр вируса выражали в lg ЭИД5О/0,2 мл.

Температурочувствительность вирусов гриппа оценивали по результатам их титрования в РКЭ при оптимальной (32°С) и повышенной до 38-40°С температуре и выражали в виде разницы между титром вируса при

оптимальной температуре по сравнению с его титром при повышенной температуре инкубации (RCT, reproductive capacity at different temperatures). RCT40(38) = lg ЭИД50/0,2 мл при 32°C - lg ЭИД50/0,2 мл при 40°С(38°С). Вирусы считали температурочувствительными (is фенотип), если RCT40 составляла не менее 5,0-5,5 lg ЭИД50/0,2 мл, и температуроустойчивыми (non-ts фенотип), если этот показатель не превышал 3,0 lg ЭИД5о/0,2 мл (И.В.Киселева и др., 2005).

Подготовка реассортантных вакцинных штаммов ЖГВ проводилась по стандартной методике в РКЭ (Г.И.Александрова и др., 1977).

Макроскопические поражения зараженных вирусом гриппа куриных эмбрионов оценивали следующим образом: 0 - нет видимых изменений; 1 — минимальные поражения точечные кровоизлияния на коже; 2 - множественные кровоизлияния, повреждение кожного покрова; 3 - множественные кровоизлияния, повреждение кожного покрова, отставание в развитии; 4 — отек мозга, множественные повреждения кожного покрова, множественные кровоизлияния, отставание в развитии.

Животные. Морские свинки (самки-альбиносы) весом 300-350 г. полученные из ФГУП «Питомник лабораторных животных «Рапполово» РАМН (Ленобласть, Всеволжский район, Рапполово). Животные содержались в стандартных крысиных клетках при температуре 22°С и относительной влажности 25% и имели свободный доступ к пище и воде. Всего в работе было использовано 390 морских свинок.

Для изучения трансмиссивности различных штаммов вируса гриппа in vivo животных заражали интраназально вируссодержащим материалом по 100 мкл в каждый носовой ход без анестезии (не меньше 3-х особей на группу). Группа «плацебо» получала в том же объеме стерильный физиологический раствор. На 1, 2 и 3 сутки от начала эксперимента у всех животных собирали носовые смывы (в 1,0 мл стерильного физиологического раствора) и ткани легких, из которых готовили 10%-ные суспензии, которые затем использовали для изучения приживляемости вируса и клонирования изолятов. Согласно

протоколу эксперимента контактные и зараженные животные содержались в одной клетке или в клетках, находящихся на разном расстоянии друг от друга (от 5 см до 5 метров). Для получения из вируссодержащих смывов чистых клонов смывы титровали предельными разведениями в РКЭ.

Гуморальный иммунный ответ морских свинок определяли в стандартной реакции торможения гемагглютинации (РТГА), с использованием 1,0% взвеси эритроцитов кур или человека 0(1) Rh+ группы через 5 недель после заражения.

Анализ генома реассортантных штаммов проводили с помощью разработанного нами метода микс-ПЦР. Метод заключается в подборе специфических праймеров, сконструированных таким образом, чтобы с конкретной парой праймеров получить ПЦР-продукт для гена только одного из родительских вирусов - «дикого» вируса или донора аттенуации.

2. МОРСКАЯ СВИНКА - МОДЕЛЬ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ТРАНСМИССИВНОСТИ ВИРУСА ГРИППА

В отдельных зарубежных публикациях описаны преимущества использования морских свинок в качестве дешевой, неприхотливой и воспроизводимой модели для изучения трансмиссивное™ вируса гриппа (Yipeng et al., 2010; Löwen, Palese, 2007; Bouvier et al., 2010). Однако, к моменту начала нашей работы в России исследования такого рода не проводились. В этой связи на первом этапе работы был изучен ряд ключевых параметров, определяющих эффективность и воспроизводимость экспериментов по моделированию трансмиссивности различных штаммов вирусов гриппа.

Для изучения трансмиссивности и реассортации различных штаммов вируса гриппа in vivo прежде всего было необходимо подобрать оптимальную инфицирующую дозу. Нами проведены эксперименты по изучению приживляемости и выделяемости различных «диких» штаммов вируса гриппа в зависимости от инфицирующей дозы. Все исследованные вирусы отличались по динамике репродукции в ВДП. Наиболее эффективно размножался вирус А/Сидней/5/97 (H3N2), который был изолирован в носовых смывах уже при

заражающей дозе 1,0 ^ ЭИД50/0,2 мл. Вирусы А/Калифорния/07/2009 (HlNl)pdm и Ы1В1Ю 23 (Н51Ч1) удавалось обнаружить при заражающей дозе 3,0 ЭИД50/0,2 мл и выше.

При изучении передачи контактным животным оказалось, что вирус А/Сидней/5/97 (НЗЫ2) передавался незараженным морским свинкам даже в минимальной заражающей дозе (1,0 ^ ЭИД5о/свинку). Однако эта доза оказалась не эффективной для пандемического вируса А/Калифорния/07/2009 (Н11М1)рс1т. В этом случае, чтобы зарегистрировать факт передачи контактным животным, потребовалась доза, в 1000 раз большая. Для вируса М1В1Ш-23 дозой, при которой вирус регулярно выделялся не только у инфицированных, но и у контактных животных оказалась доза 7.0 (рис. 1).

__.___П

I мвркзгз 5.0 □ 7.0 18

Рис. 1. Подбор оптимальной заражающей дозы для изучения трансмиссивности «диких» штаммов вируса гриппа в экспериментах на морских свинках. А - Динамика выделения вирусов гриппа из смывов у зараженных животных. Животных заражали интраназально в дозе 1,0, 3,0, 5,0 и 7,0 ЭИД5о/свинку. -

А/Калифорния/07/2009 (Н1ЫГ)рёт, БсМ: - А/Сидней/5/97 (НЗЫ2), Ы1ВКС 23 -реассортантный штамм для инактивированной вакцины, содержащий гены НА и NA от высоко патогенного вируса гриппа птиц А/индюк/Турция/1/2005 (Н5Ш) с модифицированным кливедж-сайтом гена гемагглютинина, а гены, кодирующие внутренние белки (РВ2, РВ1, РА, ЫР, М и N8) - от высоко урожайного донора А/РЯ/8/34 (НШ1). Б -Динамика выделения вирусов гриппа из смывов у контактных животных.

Таким образом, были отработаны условия инфицирования морских свинок для получения воспроизводимых результатов. Эффективной инфицирующей дозой, при которой все изученные вирусы не только выделялись из носовых смывов зараженных животных, но и регулярно предавались контактным

А

7

I 2- 6

| 5

I 4 £

I 3

С

I 2

Б, х

II х

" о

Б\л/

11.0 нз.о

Бс1иЛ 1Ч1В1У3 23 % Ш 5.0 ^ □ 7.0

I__ш I И III

sw Бс1\

11.0 1® Н 3.0 \% \

морским свинкам, оказалась доза 7,0 lg. Было подтверждено, что морская свинка является высоко чувствительной и удобной моделью для изучения трансмиссивности вируса гриппа.

3. ТРАНСМИССИВНОСТЬ ВИРУСОВ ГРИППА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

Пандемический потенциал вируса гриппа во многом определяется его трансмиссивностью. Несмотря на важную роль трансмиссивное™ в распространении эпидемических и пандемических штаммов, природа этого явления продолжает обсуждаться. Механизмы передачи вируса гриппа от зараженных контактным животным включают в себя передачу: (1) посредством прямого контакта зараженных и незараженных животных, (2) непрямого контакта через предметы окружающей среды (например, корм), а также (3) воздушно-капельным путем через крупные (более 5 нм) или мелкие (меньше 5 нм) частицы. При этом крупные частицы передаются только на ограниченном расстоянии, как правило, оседая на предметах окружающей среды, а мелкие частицы распространяются в виде аэрозоля на значительное расстояние.

Нами был проведен ряд экспериментов по изучению возможности передачи вирусов гриппа среди инфицированных и контактных животных, размещенных в одной и той же клетке, в разных клетках на близком расстоянии (10-15 см) и на дальней дистанции (4—5 м). Было показано, что разные штаммы обладали способностью к передаче на расстоянии различной степени выраженности (от высокой до полного ее отсутствия).

Наиболее трансмиссивными оказались вирус гриппа свиней А/Индиана/10/2011 (H3N2)v, выделенный от человека, и вирус NIBRG-23 (H5N1), унаследовавший НА и NA от вируса гриппа птиц А/Индюк/Турция/1/2005 (табл. 1).

В мире продолжают регистрироваться случаи заражения людей вирусами H5N1. В том числе известны случаи, в которых можно предположить передачу вируса от человека к человеку. Так в работах (Ungchusak et al., 2005; Kandun et al. 2006; Wang et al., 2008) описаны случаи внутрисемейного заражения высоко патогенным вирусом гриппа птиц H5N1. Однако, устойчивая передача от

человека к человеку подтверждена не была. Полученные нами данные по уровню трансмиссивное™ вируса NIBRG-23 (H5N1) в экспериментах с морскими свинками, подтверждают опасения специалистов, о том, что вирусы гриппа птиц могут преодолеть межвидовой барьер и приобрести способность передаваться в человеческой популяции (Kima et al., 2009; Taubenberger et al., 2009). В этом случае велика вероятность селекции патогенного вируса с повышенной трансмиссивностью, что представляет реальную опасность для человечества. Вызвавший пандемию 2009 года вирус А/Калифорния/07/2009 (HlNl)pdm проявлял меньшую контагиозность.

Кроме того, при совместном содержании свинок, зараженных вирусами А/Калифорния/7/2009 (HlNl)pdm и NIBRG-23 (H5N1), у животных, инфицированных пандемическим вирусом, отмечено выделение из носовых смывов и легких реассортантов, содержащих гены как вируса А/Калифорния/7/2009 (HlNl)pdm, так и NIBRG-23 (H5N1). В обратном направлении передача вируса не происходила - у животных, зараженных вирусом H5N1, даже при непосредственном контакте со свинками, инфицированными H1N1, выделялся только H5N1 вирус.

В литературе описаны примеры изучения реассортантов птичьих вирусов H5N1 и вирусов, подобных А/Калифорния/7/2009 (HlNl)pdm, полученных с помощью обратной генетики (Cline et al., 2011; Imai et al., 2012; Zhang et al., 2013). Так, Cline с соавт. (2011) исследовали свойства реассортантов H5Nl/HlNlpdm, полученных методом обратной генетики, и показали, что у реассортантов, содержащих НА птичьего вируса, а остальные гены от вируса А/Калифорния/4/2009 (HlNl)pdm, повышенная репликация коррелирует с вирулентностью у мышей. В работе (Zhang et al., 2013) авторы изучили свойства 127 реассортантов, также полученных методом обратной генетики и содержащих различные сочетания генов от вирусов H5N1 и HINlpdm. Реассортанты, содержащие РА и NS гены от вируса HINlpdm, а остальные от птичьего вируса H5N1, передавались от зараженных животных контактным.

Эти данные подтверждают опасения о том, что в природе при скрещивании этих вирусов могут возникнуть реассортанты с повышенной

вирулентностью, способные передаваться от человека к человеку. В отличие от этих работ, в наших исследованиях реассортанты были получены естественным путем при совместном содержании животных, зараженных разными вирусами. Эффективность передачи вируса NIBRG-23 (H5N1) была значительно выше, чем пандемического вируса А/Калифорния/7/2009 (HlNl)pdm. Можно предположить, что полученные результаты подтверждают высокую потенциальную опасность адаптации вирусов гриппа птиц к организму человека, что может привести к массовому распространению этих вирусов в человеческой популяции, а также отражают свойства «калифорнийского» пандемического вируса, который, по мнению многих исследователей (Donaldson et al., 2009, Louie et al., 2009, Ye et al., 2010), не является столь высоко вирулентным для человека, каким был печально знаменитый вирус «испанки» H1N1, вызвавший пандемию 1918 года.

ХА донор аттенуации J117 и подготовленные на его основе вакцинные штаммы А/17/Калифорния/2009/38 (H1N1) (Н.В.Ларионова и др., 2011), А/17/индюк/Турция/05/133 (H5N2) (Larionova et al., 2011) и А/17/Сидней/97/76 (H3N2) (И.В.Киселева и др., 2000) не передавались при совместном содержании от одной свинки к другой. Аналогично, в опытах по инфицированию свинок донором аттенуации В60 было показано, что и этот ХА вирус не передавался при непосредственном контакте с неинфицированными животными. Все ХА вирусы и вакцинные штаммы также не передавались контактным животным, содержащимся отдельно от вакцинированных животных. Это логично, учитывая тот факт, что ни один из исследуемых вирусов этой группы не передавался даже внутри одной клетки. Наши данные согласуются с результатами исследований, которые постоянно публикуются, начиная с 1977 года. В многочисленных работах по выделению вакцинных штаммов не была зарегистрирована их передача при тесном контакте привитых и непривитых лиц (Rudenko et al., 1991; Murphy, 1993; Talbot et al., 2005; Nichol et al., 2006; Block et al., 2008; Mallory et al., 2011).

Таблица 1. Передача вирусов гриппа среди инфицированных и контактных морских свинок, содержащихся на разном расстоянии друг от друга

Морские свинки заражены: ТРАНСМИССИВНОСТЬ4

Расстояние между клетками

Внутри | 5-10 см 5 метров

«Дикие» штаммы вируса гриппа

мвію-2з (Н5Ы1)' да да да

А/Индиана/10/2011 (НЗШ) да да да

А/Сидней/5/97 (НЗШ) да да нет

А/Калифорния/07/2009 (НШ1)рс1т да да нет

ІпіІо/5(Н5Ш)' да да нет

А/Гонконг/1870/08 (НШ1) да нет нет

УШ203 (Н5Ш)3 да нет нет

ХА вирусы: доноры атгенуации и вакцинные штаммы ЖГВ

А/Ленинград/134/17/57 (Н2Ы2) нет нет нет

В/СССР/60/69 нет нет нет

А/17/Сидней/97/76 (НЗЫ2) нет нет нет

АЛ7/индюк/Турция/05/133 (Н5Ы2) нет нет нет

А/17/Калифорния/2009/38 (Н1Ы1) нет нет нет

А/17/Виктория/2011/89 (НЗЫ2) нет нет нет

В/60/Висконсин/2010/125 нет нет нет

'Вирус МІВІШ-23 (Н5Ы1) - реассортантный штамм для инактивированной вакцины, содержащий гены НА и NA от высоко патогенного вируса гриппа птиц А/индюк/Турция/1/2005 (Н5>П) с модифицированным кливедж-сайтом гена гемагглютинина, а гены, кодирующие внутренние белки (РВ2, РВ1, РА, ОТ, М и N8) -от высоко урожайного донора Л/Р11/8/34 (НШ1). 2Вирус 1пс1о/5 (Н5Ы1) -реассортантный штамм для инактивированной вакцины, содержащий гены НА и ИА от высоко патогенного вируса гриппа птиц А/Индонезия/05/2005 (Н5Ш) с модифицированным кливедж-сайтом гена гемагглютинина, а гены, кодирующие внутренние белки (РВ2, РВ1, РА, ЫР, М и N5) - от высоко урожайного донора А/РЯ/8/34 (НШ1). 3Вирус УМ 1203 (ИЗЖ) - реассортантный штамм для инактивированной вакцины, содержащий гены НА и ЫА от высоко патогенного вируса гриппа птиц А/Вьетнам/1203/2004 (Н5И1) с модифицированным кливедж-сайтом гена гемагглютинина, а гены, кодирующие внутренние белки (РВ2, РВ1, РА, ИР, М и N5) - от высоко урожайного донора Л/РІІ/8/34 (Н1Ш). 4Подтверждена прямым выделением вируса из носовых смывов и/или наличием приростов гуморальных антител через 5 недель от начала опыта.

Описан только один случай выделения вакцинного штамма американской вакцины РїиМівІ® от ребенка, получившего препарат плацебо (Уевікагі еі аі., 2006, 2008). Однако, при изучении выделенного изолята было показано, что он не утратил іь/са и аттенуирующих свойств, присущих вакцинному вирусу. В публикациях отечественных авторов (Лисіепко сЧ а1., 1996; Н.В.Ларионова и др.,

2012) передача вакцинных штаммов при тесном контакте привитых и не привитых лиц зарегистрирована не была.

Таким образом, можно заключить, что разные штаммы вируса гриппа обладают способностью к передаче на расстоянии различной степени выраженности. Также в экспериментах было продемонстрировано полное отсутствие трансмиссивности холодоадаптированных штаммов вируса гриппа, как доноров аттенуации, так и вакцинных штаммов живой гриппозной вакцины, подготовленных на их основе.

4. ФОРМИРОВАНИЕ РЕАССОРТАНТОВ ПРИ ИНТРАНАЗАЛЬНОМ ЗАРАЖЕНИИ ЖИВОТНЫХ СМЕСЬЮ ШТАММОВ ВИРУСА

ГРИППА

В последние годы живая гриппозная холодоадаптированная вакцина как средство защиты от сезонного и пандемического гриппа стала применяться не только в России и США, но также в Европе и Азии. Поэтому очень важно ответить на вопрос, возможно ли распространение среди населения штаммов живой гриппозной вакцины с их последующей реассортацией с циркулирующими вирусами и если возможно, то к каким последствиям это может привести. Реассортация - это фундаментальный механизм эволюции вирусов гриппа, который играет ключевую роль в появлении эпидемически значимых штаммов. Большое количество работ посвящено изучению изолятов, полученных в естественных условиях от птиц, свиней и других животных, а также от человека (Zhou et al., 1999, Yanlong et al., 2010; Spackman et al., 2009, Monne et al., 2013, Trebbien et al., 2013). Как правило, в этих работах основное внимание уделено филогенетическим взаимосвязям между штаммами вирусов гриппа. Однако, изучение фенотипических свойств реассортантов, выделенных в природе или полученных в лабораторных условиях, чрезвычайно важно для понимания механизмов возникновения штаммов, способных вызвать эпидемии и пандемии. Как уже отмечалось выше, при изучении передачи «диких» штаммов вируса гриппа среди морских свинок нами была показана их способность к передаче на расстоянии различной степени выраженности.

Вместе с тем нам не удалось продемонстрировать передачу ХА вирусов от инфицированных контактным животным. Тем не менее, нельзя полностью исключить теоретическую возможность наступления такого события, как одновременное инфицирование одного хозяина ХА и циркулирующим «диким» штаммом. Для понимания возможных последствий этих событий было смоделировано одномоментное интраназальное заражение морских свинок: (1) смесью, содержащей высоко трансмисивный вирус NIBRG-23 (H5N1) и донор аттенуации J117, (2) смесью содержащей два «диких» вируса NIBRG-23 (H5N1) и А/Калифорния/07/2009 (HlNl)pdm (табл. 2).

При заражении морских свинок смесью NIBRG-23 (H5N1) + JI17 было получено 9 клонов; анализ состава их генома показал, что все клоны были «тройными» реассортантами, несущими гемагглютинин от вируса NIBRG-23 (H5N1), содержащими NA, РВ2 от донора аттенуации, а РА ген - от вируса PR8. У двух клонов NP и М гены также принадлежали донору аттенуации, а у семи других — вирусу PR8. Все полученные клоны были разделены на три группы в зависимости от формулы генома. Анализ фенотипических свойств реассортантных вирусов показал, что все они обладали выраженным Is фенотипом, присущим донору аттенуации, то есть не размножались в куриных эмбрионах ни при 40°С, ни при 38°С, в отличие от другого родительского вируса - NIBRG-23 (H5N1), который при температуре инкубации 38°С проявлял выраженный температуроустойчивый фенотип. Кроме того реассортанты обладали холодоадаптированностью, размножаясь при 26°С.

Таким образом, полученные реассортанты вне зависимости от состава генома унаследовали фенотип, присущий донору аттенуации. Аналогичные результаты приводит Parks et al (2007) в исследовании, в котором продемонстрировано, что реассортанты эпидемического вируса А/Сидней/5/97 (H3N2) с ХА вакцинным штаммом не проявляют вирулентность, превышающую таковую «дикого» родителя.

Помимо оценки температурочувствительности как основного показателя аттенуированости и безвредности вакцинных штаммов, были охарактеризованы

макроскопические повреждения куриных эмбрионов, зараженных всеми полученными реассортантами, а в качестве контролей - донором аттенуации и вирусом NIBRG-23 (H5N1). Оценка макроскопических повреждений - это еще один дополнительный маркер, который позволяет более точно охарактеризовать полученные реассортанты. Все исследуемые нами реассортанты не повреждали эмбрионы сильнее «дикого» родителя.

Как отмечалось ранее, реассортация является одним из тех механизмов, который может привести к появлению новых штаммов с пандемическим потенциалом. Изучение взаимодействия между различными сегментами генома при скрещивании 2-х циркулирующих в природе штаммов явилось первым шагом к пониманию механизмов формирования реассортантов с повышенным уровнем вирулентности и трансмиссивности. Продолжающиеся распространение высоко патогенного птичьего гриппа в птицеводческих хозяйствах и продолжающиеся заражения людей, в том числе со смертельными исходами (Van Kerkhove et al., 2011) определяет необходимость изучения реассортантов именно между циркулирующими человеческими штаммами и вирусами гриппа птиц. Была изучена возможность формирования реассортантов при одномоментном инфицировании морских свинок смесью двух «диких» вирусов. Животных заражали интраназально смесью, содержащей вирусы А/Калифорния/7/2009 (HlNl)pdm и NIBRG-23 (H5N1). Было выделено 5 клонов (4 из носовых смывов и 1 из легких). 3 реассортанта имели различную комбинацию генов PR8, NIBRG-23, и А/Калифорния/7/2009 (HlNl)pdm («тройные» реассортанты), а 2 реассортанта унаследовали гены только от вирусов PR8 и А/Калифорния/7/2009 (HlNl)pdm («двойные» реассортанты).

Интересно, что два выделенных из носового смыва клона, обладающих идентичным «тройным» генным набором, приобрели

температурочувствительный фенотип, которым не обладал ни один из родительских вирусов. Три других реассортанта проявляли non-ts фенотип, характерный для «дикого» вируса А/Калифорния/7/2009 (HlNl)pdm. Кроме

того, складывается впечатление, что реассортация in vivo происходит менее эффективно, если один из участников скрещивания является ХА вирусом.

В эпидемический сезон среди населения, как правило, циркулирует не один, а 2—3 антигенно отличающихся штамма вируса гриппа. Именно поэтому гриппозная вакцина является тривалентной - содержит три актуальных для данного эпидемического сезона вакцинных штамма. В нашей работе мы попытались максимально приблизить эксперименты к реальной ситуации. Для этого было смоделировано одномоментное заражение морских свинок двумя «дикими» вирусами - А/Сидней/5/97 (H3N2) и А/Пекин/262/95 (H1N1), а в качестве третьего компонента скрещивания был выбран ХА вакцинный штамм пандемической ЖГВ - А/17/Калифорния/2009/38 (H1N1). Было выделено 3 клона (один из носовых смывов и два из суспензии легких). Анализ состава их генома показал, что два клона имеют гены, полученные в разных комбинациях от «диких» родителей, но не от донора аттенуации. Таким образом, в этом случае реассортация произошла только между двумя эпидемическими вирусами, и полученные клоны оказались «двойными» реассортантами. Третий клон, полученный при клонировании суспензии легких, унаследовал NP ген от донора аттенуации, НА и NS - от вируса А/Пекин/262/95 (H1N1), а остальные гены — от вируса А/Сидней/5/97 (H3N2), то есть был «тройным» реассортантом.

Анализ фенотипических свойств полученных реассортантов показал, что два клона имели фенотип, присущий вирусу А/Пекин/262/95 (H1N1), то есть проявляли non-ts фенотип только при температуре 38°С, а третий, выделенный из легких клон, обладал ярко выраженным non-ts фенотипом вируса А/Сидней/5/97 (H3N2), активно размножаясь как при 38°С, так и при 40°С. Два первых клона содержат в составе полимеразного комплекса как гены от вируса А/Пекин/262/95 (H1N1), так и от вируса А/Сидней/5/97 (H3N2), тогда как у третьего клона все полимеразные гены принадлежат вирусу А/Сидней/5/97 (H3N2). Видимо, этим и объясняется его более сильный non-ts фенотип.

Донор А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) имеет атгенуирующие мутации в пяти из шести внутренних генах (РВ2, РВ1, РА, М и NS). Ген, кодирующий белок NP, не содержит мутаций (Klimov et al., 1992) и не участвует в

формировании аттенуирующего фенотипа донора и подготовленных на его основе вакцинных штаммов (КПтоу е1 а1., 2001; Клвекуа й а1., 2004). Вероятно, этим и можно объяснить присутствие в реассортанте, выделенном из нижних дыхательных путей морской свинки, гена, формально принадлежащего аттенуированному донорскому вирусу.

Трудно представить себе ситуацию, при которой произойдет одновременное инфицирование человека вакцинным штаммом и циркулирующим «диким» вирусом. Вероятнее всего, если и произойдет коинфицирование, то последовательное. Поэтому был проведен ряд экспериментов по разномоментному заражени. морских свинок двумя вирусами гриппа, один из которых являлся ХА вакцинным штаммом, а второй - «диким» вирусом.

Внесение вирусов осуществляли последовательно с интервалом в 24 часа. В первой группе животных вначале вводился вакцинный штамм А/17/Калифорния/2009/3 8 (Н1Ы1), а затем «дикий» вирус А/Сидней/5/97 (НЗЫ2), а во второй группе наоборот, животных сначала заражали вирусом А/Сидней/5/97 (НЗЫ2), а затем - вакцинным штаммом. Мы изолировали 23 клона с различных сроков забора смывов. В первой группе наибольшее количество клонов было выделено в 1-е и 2-е сутки. На третьи сутки количество клонов уменьшилось. Скорее всего, это можно объяснить разностью репродукции в верхних дыхательных путях штаммов А/17/Калифорния/2009/38 (Н1Ш) и А/Сидней/5/97 (НЗШ) при моноинфекции и со сдвигом временной рамки при внесении второго вируса.

В первой группе сначала вносился вирус А/17/Калифорния/2009/38 (НШ1), при моноинфекций выделяющийся в смывах только двое суток (рис. 2). Через 24 часа животных этой группы заражали вирусом А/Сидней/5/97 (НЗЫ2), но для А/17/Калифорния/2009/38 (Н1Ы1) формально этот срок приходился уже на вторые сутки репродукции. Так как внесение вируса А/Сидней/5/97 (НЗЫ2) приходилось на пик репродукции вакцинного штамма А/17/Калифорния/2009/38 (НШ1), становится понятным большее количество клонов, изолированных на 1-е и 2-е сутки, чем на 3-й.

Аналогичная ситуация наблюдалась во второй группе, в ней также видна разница в количестве клонов в зависимости от срока забора смывов. Различной динамикой репродукции родительских вирусов можно объяснить отсутствие клонов в этой группе на третьи сутки.

Таблица 2. Состав генома и фенотипические свойства клонов, выделенных из носовых смывов и легких морских свинок, зараженных различными штаммами __вируса гриппа___

Вирусы Гены Фенотип

РВ2 1 РВ1 1 PA 1 НА 1 NP 1 NA 1 М | NS RCT« 1 RCT,„ RCT,6

Родительские вирусы

А/Ленинград/134/17/57 Л172 ЛІ7 Л17 Л17 Л17 Л17 Л17 Л17 ts ts ca

NIBRG-23' PR83 PR8 PR8 Тур' PR8 Тур PR8 PR8 ts non-ts non-ca

А/Калифорния/07/2009 Клф" Клф Клф Клф Клф Клф Клф Клф non-ts non-ts non-ca

А/Пекин/262/95 Пек5 Пек Пек Пек Пек Пек Пек Пек ts non-ts ca

А/Сидней/5/97 Сил6 Сид Сид Сид! Сид Сид Сид Сид non-ts non-ts non-ca

Р е а с с о р т а н т ы (клоны)

Реассортанты вирусов NIBRG-23 х А/Леніінград/134/17/57

№1 Л17 Л17 PR8 Тур Л17 Л17 Л17 Л17 ts ts ca

№2 Л17 Л17 PR8 Тур Л17 Л17 Л17 Л17 ts ts ca

Х»3 Л17 Л17 PR8 Тур PR8 Л17 PR8 Л17 ts ts ca

№4 Л17 Л17 PR8 Тур PR8 Л17 PR8 Л17 ts ts ca

№5 Л17 Л17 PR8 Тур PR8 Л17 PR8 Л17 ts ts ca

№6 Л17 Л17 PR8 Тур PR8 Л17 PR8 Л17 ts ts ca

№7 Л17 PR8 PR8 Тур PR8 Л17 PR8 PR8 ts ts ca

№8 Л17 PR8 PR8 Тур PR8 Л17 PR8 PR8 ts ts ca

№9 Л17 PR8 PR8, Тур PR8 Л17 PR 8 PR 8 ts ts ca

Реассортанты вирусов А/Калифорния/07/2009 х NIBRG-23

№10 PR8 PR8 PR8 Тур PR8 Клф PR8 PR8 ts ts ca

№11 PR8 PR8 PR8 Тур PR8 Клф PR8 PR8 ts ts ca

№12 PR8 Клф PR8 Тур PR8 Клф PR8 PR8 non-ts non-ts non-ca

№13 Клф Клф Клф Клф Клф Клф PR8 Клф non-ts non-ts non-ca

№14 Клф Клф PR8 Клф Клф Клф Клф Клф non-ts non-ts ca

Реассортанты вирусов А/Пекин/262/95 х А/Сидней/5/97 х А/17/Калифорния/2009/38

№ 15 Пек Сид Пек Пек Пек Сид Пек Пек ts non-ts н/и

№ 16 Сид Сид Сид Пек Л17 Сид Сид Пек non-ts non-ts н/и

№ 17 Пек Сид Сид Пек Пек Сид Пек Пек ts ts н/и

'Вирус NIBRG-23 (H5N1) - реассортантный штамм для инактивированной вакцины, содержащий гены НА и NA от высоко патогенного вируса гриппа птиц А/индюк/Турция/1/2005 (H5N1) с модифицированным кливедж-сайтом гена гемагглютинина, а гены, кодирующие внутренние белки (РВ2, РВ1, PA, NP, М и NS) - от высоко урожайного донора A/PR/8/34 (H1N1), 2 Ген принадлежит донору аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), 3 Ген принадлежит вирусу A/PR/8/34 (H1N1), 4 Ген принадлежит вирусу А/Калифорния/07/2009 (HlNl)pdm, Ген принадлежит вирусу А/Пекин/262/95 (H1N1), Ген принадлежит вирусу А/Сидней/5/97 (H3N2), 7 Ген принадлежит высоко патогенному вирусу А/индюк/Турция/1/05 (H5N1) с модифицированным кливедж-сайтом гена гемагглютинина.

Поскольку к этому моменту (5 суток после внесения вируса А/Сидней/5/97

(H3N2) и 4 суток после - вакцинного штамма А/17/Калифорния/2009/38

(Н1Ш)), при моноинфекции исследуемые вирусы из смывов уже не выделялись. Также меньшее количество вирусов в этой группе, видимо, можно объяснить тем, что первым в этой группе вносится штамм А/Сидней/5/97 (НЗЫ2) который лучше реплицируется в верхних дыхательных путях, чем вакцинный штамм А/17/Калифорния/2009/38 (НШ1).

Рисунок 2. Динамика репродукции вирусов гриппа в верхних и нижних дыхательных путях морских свинок при смешанной и моноинфекции

А - моноинфекция «диким» вирусом А/Сидней/5/97 (H3N2); Б - моноинфекция ХА вакцинным штаммом А/17/Калифорния/2009/38 (H1N1); В - одновременное заражение смесью А + Б; Г - заражение ХА вирусом Б за 24 часа до заражения «диким» вирусом А; Д -заражение ХА вирусом Б через 24 часа после заражения «диким» вирусом А. Sd wt -Моноинфекция «диким» вирусом А/Сидней/5/97 (H3N2); sw - Моноинфекция ХА вакцинным штаммом А/17/Калифорния/2009/38 (H1N1); (0) - Одновременное заражение смесью вирусов А/17/Калифорния/2009/38 (H1N1) и А/Сидней/5/97 (H3N2); (-24) -Заражение А/17/Калифорния/2009/38 (H1N1) вирусом за 24 часа до заражения А/Сидней/5/97 (H3N2); (+24) - Заражение А/17/Калифорния/2009/38 (H1N1) вирусом через 24 часа после заражения А/Сидней/5/97 (H3N2).

Для успешной передачи вирусу гриппа необходимо реплицироваться в верхних дыхательных путях в высоких титрах. Степень репродукции вируса является важным биологическим свойством, характеризующим различные штаммы вируса.

Мы изучили динамику репродукции вирусов при моноинфекции и сравнили ее с динамикой при заражении животных смесью вирусов (рис. 2).

Было показано, что ХА вакцинный вирус А/17/Калифорния/2009/38 (H1N1) был существенно ограничен в репликации в ВДП морских свинок по сравнению с «диким» вирусом А/Сидней/5/97 (H3N2). При всех трех использованных вариантах смешанной инфекции было продемонстрировано

Выделение вируса из носовых смывов

Выделение вируса из легких при одно- и разномоменшоы заражении

3 4

1 2 3 4 * ■ Sdwt S Sw ■ О Ж (+24) в (-24)

снижение инфекционного титра вируса в смывах относительно «дикого» родителя.

ВЫВОДЫ

1. Определены особенности репликации различных штаммов вируса гриппа в верхних дыхательных путях морских свинок. На основании полученных данных отработана воспроизводимая модель для изучения трансмиссивности вируса гриппа.

2. Впервые в экспериментах in vivo изучены особенности реассортации сезонных и пандемически опасных вирусов гриппа с холодоадаптированными штаммами. Установлено, что как одно-, так и разномоментное заражение морских свинок не приводит к формированию реассортантов, обладающих непредсказуемо высоким уровнем вирулентности и трансмиссивности. Показано, что реассортация ш vivo происходит менее эффективно, если один из участников скрещивания является холодоадаптированным вирусом.

3. Продемонстрировано полное отсутствие трансмиссивности у холодоадаптированных штаммов вируса гриппа (доноров аттенуации и вакцинных штаммов), что подтверждает безопасность массового применения как сезонной, так и пандемической живой гриппозной вакцины.

4. Впервые изучена трансмиссивность широкого спектра пандемических, потенциально пандемических и сезонных штаммов вируса гриппа в экспериментах in vivo и проведена сравнительная оценка степени их контагиозности для лабораторных животных. Показано, что «дикие» вирусы могут значительно различаться между собой по этому признаку.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ

ДИССЕРТАЦИИ

1. Киселева И.В., Ларионова Н.В., Баженова Е.А., Дубровина И.А., Исакова-Сивак И.Н., Григорьева Е.П., Донина С.А., Руденко Л.Г. Трансмиссивность вируса гриппа (экспериментальные данные) // Медицинский академический журнал. - 2010. - №4. — Т.10. - С. 240-248.

2. Дубровина И.А., Баженова Е.А., Киселева И.В., Бердыгулова Ж.А., Ларионова Н.В., Руденко Л.Г. Живая гриппозная вакцина для детей и взрослых: трансмиссивность в экспериментах in vivo // Эпидемиология и инфекционные болезни. — 2011. — №. 6. — С. 14-18.

3. Киселева И.В., Voeten J.T.M., Teley L.C.P., Ларионова Н.В., Дубровина И.А., Бердыгулова Ж.А., Баженова Е.А., van den Bosch Н., Heldens J.G.M., Руденко Л.Г. Анализ состава генома штаммов сезонной и пандемической живой гриппозной вакцины // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2011. - №4. - С. 29-36.

4. Kiseleva I., Dubrovina I., Bazhenova E., Fedorova E., Larionova N., Rudenko L. Possible outcomes of reassortment in vivo between wild type and live attenuated influenza vaccine strains // Vaccine. - 2012. - V.30. - P.7395-7399.

5. Дубровина И.А., Баженова E.A., Федорова E.A., Иванова Е.В., Ларионова Н.В., Киселева И.В. Изучение возможности реассортации эпидемических и вакцинных штаммов вируса гриппа в экспериментах in vivo //Медицинский академический журнал. - 2012. - Т.12. - С. 45-47.

6. Федорова Е.А., Исакова-Сивак И.Н., Кузнецова С.А., Кузнецова В.А., Дубровина И.А.. Баженова Е.А. Киселева И.В. Иммуногенность реассортантных вакцинных штаммов живой гриппозной вакцины, подготовлен-ных на основе вируса А/Новая Каледония/20/99 (H1N1), при интраназальном заражении морских свинок // Медицинский академический журнал. - 2012,- Т.12.- С. 57-59.

7. Киселева И.В., Баженова Е.А., Ларионова Н.В., Федорова Е.А., Дубровина И.А., Исакова-Сивак И.Н., Руденко Л.Г. Особенности реассортации современных штаммов вируса гриппа с донорами аттенуации живой гриппозной вакцины // Вопросы вирусологии. - 2013. - №5. - С. 26-31.

Подписано в печать 06.11.13 Формат 60х84'/і6 Цифровая Печ.л. 1.0 Тираж 100 Заказ 05/11 печать

Отпечатано в типографии «Фалкон Принт» (197101, г. Санкт-Петербург, ул. Большая Пушкарская, д. 54, офис 2)

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дубровина, Ирина Анатольевна, Санкт-Петербург



ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ» СЕВЕРО-ЗАПАДНОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

На правах рукописи

ÍU-5CH ¿CO-ZJJ

ДУБРОВИНА Ирина Анатольевна

ТРАНСМИССИВНОСТЬ СОВРЕМЕННЫХ ШТАММОВ ВИРУСА ГРИППА В ЭКСПЕРИМЕНТАХ IN VIVO

03.02.02 — вирусология

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

Доктор биологических наук, доцент

И.В. КИСЕЛЕВА

Санкт-Петербург 2013

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

__Стр.

ОГЛАВЛЕНИЕ 2

СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ 4

ВВЕДЕНИЕ 5

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11

1.1. Общая характеристика вируса гриппа

1.1.1. Структура вириона

1.1.2. Организация генома

1.1.3. Репликация вируса гриппа

1.2. Изменчивость вируса гриппа и адаптация к новым хозяевам

1.3. Патогенез вируса гриппа

1.3.1. Клиническая картина и гистопатологические изменения, вызываемые вирусами гриппа

1.3.2. Генетические факторы патогенности

1.4. Трансмиссивность вируса гриппа

1.4.1. Модели для изучения трансмиссивности

1.4.2. Возможные механизмы, лежащие в основе трансмиссивности

1.5. Специфическая профилактика гриппа

1.5.1. Инактивированные гриппозные вакцины

1.5.2. Живые гриппозные вакцины

1.5.3. Трансмиссивность вакцинных штаммов

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 29

2.1 Вирусологические методы

2.2. Методы работы с лабораторными животными

2.3. Серологические методы

2.4. Молекулярно-биологические методы

2.5. Компьютерное обеспечение «Калькулятор фенотипов»

2.6. Статистическая обработка данных

Глава 3. МОРСКАЯ СВИНКА - МОДЕЛЬ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ 40

ТРАНСМИССИВНОСТИ ВИРУСА ГРИППА

3.1. Отработка условий интраназального заражения

3.2. Подбор оптимальной инфицирующей дозы

3.3. Заключение

Глава 4. ТРАНСМИССИВНОСТЬ ВИРУСОВ ГРИППА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ 45

4.1. Трансмиссивность «диких» вирусов гриппа в экспериментах ш vivo

4.1.1. Контактная передача «диких» вирусов гриппа

4.1.2. Передача «диких» вирусов гриппа на ближней дистанции

4.1.3. Передача «диких» вирусов гриппа на дальней дистанции

4.2. Трансмиссивность холодоадаптированных вирусов гриппа

4.3. Взаимная передача вирусов гриппа от зараженных морских свинок свинкам, зараженным другими вирусами гриппа

4.4. Заключение

Глава 5. ФОРМИРОВАНИЕ РЕАССОРТАНТОВ ПРИ ИНТРАНАЗАЛЬНОМ 56 ЗАРАЖЕНИИ ЖИВОТНЫХ СМЕСЬЮ ШТАММОВ ВИРУСА ГРИППА

5.1. Динамика выделения вируса гриппа из носовых смывов

5.2. Одномоментное заражение животных смесью вирусов гриппа

5.2.1. Заражение морских свинок смесью, содержащей вирус NIBRG-23

(H5N1) и донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2)

5.2.2. Заражение морских свинок смесью двух «диких» вирусов

5.2.3. Заражение морских свинок смесью трех штаммов вируса гриппа

5.3. Разномоментное заражение животных смесью двух вирусов гриппа

5.4. Сравнительный анализ репродукции вирусов при смешанном заражении и моноинфекции

5.5. Трансмиссивноть реассортантов, полученных при принудительном скрещивании в морских свинках различных штаммов вируса гриппа.

5.6. Заключение

Глава 6. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

75

84

85

ПРИЛОЖЕНИЕ

СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВДП верхние дыхательные пути

ЖГВ живая гриппозная вакцина

ИГВ инактивированная гриппозная вакцина

JI17 донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2)

РГА реакция гемагглютинации

РКЭ развивающиеся куриные эмбрионы

РТГА реакция торможения гемагглютинации

ХА холодоадаптированный

ЭИД50 50%-ная эмбриональная инфицирующая доза вируса

att аттенуация, аттенуирующий фенотип (attenuation)

са холодоадаптированность (cold-adaptation, са фенотип)

НА гемагглютинин

NA нейраминидаза

non-ts способность к репродукции при температуре выше оптимальной

PCR полимеразная цепная реакция (polymerase chain reaction)

PR8 «дикий» вирус A/PR/8/34 (H1N1)

RCT40(38) репродуктивная способность при различных температурах

(reproductive capacity at different temperatures) RDE receptor-destroying enzyme

ts температурочувствительность (temperature sensitivity)

NIBRG-23 (H5N1) реассортант, подготовленный на основе высокоурожайного вируса

A/PR/8/34 (H1N1) (PR8) и вирусов гриппа птиц А/индюк/Турция/1/2005 (H5N1) Indo/5 (H5N1) реассортант, подготовленный на основе высокоурожайного вируса

A/PR/8/34 (H1N1) (PR8) и вирусов гриппа птиц А/Индонезия/05/2005 (H5N1) VN1203 (H5N1) реассортант, подготовленный на основе высокоурожайного вируса

A/PR/8/34 (H1N1) (PR8) и вирусов гриппа птиц А/Вьетнам/1203/2004 (H5N1)

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Грипп - это тяжелая вирусная инфекция, которая поражает людей вне зависимости от возраста и национальности и остается серьезной проблемой здравоохранения во всем мире. Заболевания гриппом сопровождаются высокой смертностью, особенно у маленьких детей и пожилых людей [85]. Эпидемии гриппа происходят каждый год и охватывают до 15% населения Земли. Пандемии возникают каждые 10—40 лет. В 2009 году мир оказался на пороге первой пандемии 21-го века, вызванной вирусами, подобными А/Калифорния/7/2009 (НШ1).

Сегодня, наряду с уже повсеместно циркулирующим калифорнийским штаммом А (НШ1), потенциальную угрозу пандемии несут высоко патогенные вирусы гриппа птиц, которые уже преодолели видовой барьер, передаваясь от птиц к человеку [102]. В дальнейшем могут произойти новые генетические изменения, которые позволят птичьим вирусам передаваться непосредственно от человека к человеку.

Три основных свойства вируса гриппа определяют его пандемические потенции: новизна штамма для иммунной системы, вирулентность и способность передаваться от человека к человеку, то есть трансмиссивность. Именно степень трансмиссивности циркулирующих штаммов определяет тяжесть вызываемых ими пандемий или эпидемий [47]. Несмотря на бесспорно ключевую роль трансмиссивности вируса гриппа в распространении эпидемических и пандемических штаммов, природа и механизмы их контагиозности продолжают обсуждаться. Поэтому существует насущная необходимость глубокого понимания проблемы трансмиссивности вируса гриппа. Раскрытие механизмов, лежащих в ее основе, позволит более эффективно контролировать грипп и изыскивать новые пути и методы его профилактики.

На сегодняшний день наиболее эффективным методом защиты от гриппа является вакцинопрофилактика. В последние годы живая гриппозная холодоадаптированная (ХА) реассортантная вакцина (ЖГВ) как средство защиты от гриппа заняла лидирующее положение в мире среди других профилактических противогриппозных препаратов. По мнению экспертов Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), использование живых противогриппозных вакцин является эффективным путем защиты восприимчивой популяции не только от сезонно возникающих эпидемий, но и глобальных пандемий гриппа.

Начиная с 1977 года регулярно публиковались результаты клинических исследований по выделению вакцинных штаммов ЖГВ от не привитых лиц, в которых [62,55,80, 57, 8,50], за единственным исключением [92,93], не была зарегистрирована их передача при тесном контакте привитых и не привитых лиц. Только в двух работах Уез1кап е1 а1 [92,93] описан

|

«1 Ч

единичный случай выделения вакцинного штамма американской вакцины Р1иМ1з1 от ребенка, получившего препарат плацебо. При этом у него не было отмечено никаких клинически выраженных симптомов, а полученный изолят не утратил Хь/са/аП свойства, присущие вакцинному вирусу. В отечественных публикациях [5,63] передача вакцинных штаммов отечественной ЖГВ при тесном контакте привитых и не привитых лиц зарегистрирована не была. Однако, в связи с изменением антигенной структуры циркулирующих вирусов, появлением новых потенциально опасных вирусов гриппа требуется проведение новых, углубленных исследований трансмиссивности вакцинных штаммов.

Периодически в научной литературе и средствах массовой информации поднимается вопрос о возможности распространения среди населения штаммов живой гриппозной вакцины с их последующей реассортацией с циркулирующими вирусами. По мнению авторов таких статей, вакцинный штамм может обменяться генами с сезонным вирусом, что в свою очередь может привести к формированию мутантного вируса с новыми, неизученными свойствами и повышенной вирулентностью.

Сегментированная природа генома, и, соответственно, способность к реассортации вируса гриппа является одной из основных причин возникновения пандемических вирусов и играет ключевую роль в адаптации к новому хозяину [84]. Известен ряд работ, касающихся изучения последствий реассортации для организма чувствительного хозяина двух «диких» вирусов. В частности, экспериментально показано, что скрещивание низко патогенного вируса гриппа птиц А(Н5Ш) и вируса гриппа А(НЗШ) человеческого происхождения может привести к формированию реассортантов с повышенной вирулентностью для мышей [41]. Обнаружение в дикой природе межвидовых реассортантных вирусов гриппа, несущих гены вирусов человеческого и иного происхождения [13] свидетельствует о возможности наступления событий такого рода. Высокая эффективность скрещивания после одномоментного заражения хорьков смесью вируса гриппа птиц А(Н5>Н) и человека А(НЗК2) с преобладанием реассортантов, несущих поверхностные антигены птичьего происхождения, делает реальной опасность такого рода встречи.

Что же касается экспериментального изучения реассортации «дикого» и ХА вакцинного штаммов, в доступной литературе имеется только одна работа, в которой продемонстрировано, что скрещивание «дикого» вируса А/Сидней/5/97 (НЗШ) с ХА вакцинных штаммом, подготовленным на его же основе, привело к созданию реассортантов, среди которых доминировали аттенуированные температурочувствительные варианты при этом ни один реассортант не приобрел вирулентность, превышающую таковую «дикого» родителя [60]. Таким образом, к моменту начала нашей работы систематических исследований подобного рода в мире не проводилось.

Все вышесказанное определяет важность изучения феномена трансмиссивное™ вируса гриппа, а доказательство необоснованности приведенных выше опасений позволит подтвердить безопасность применения ЖГВ не только в эпидемический, но и в пандемический по гриппу периоды.

Основной целью настоящей работы явилось изучение трансмиссивности различных штаммов вируса гриппа и особенностей реассортации in vivo вирусов гриппа, обладающих разным уровнем вирулентности для экспериментальных животных.

Для решения поставленной цели в задачи исследования входило:

1. Отработка модели трансмиссивности этих штаммов в экспериментах на морских свинках.

2. Изучение трансмиссивности пандемических, потенциально пандемических и сезонных штаммов вируса гриппа в экспериментах in vivo и сравнительная оценка степени их контагиозности для лабораторных животных.

3. Оценка возможности передачи ХА вирусов - доноров аттенуации и вакцинных штаммов ЖГВ - контактным животным.

4. Изучение особенностей реассортации сезонных и пандемически опасных вирусов гриппа с ХА штаммами в экспериментах in vivo.

Научная новизна исследования.

Впервые в России в экспериментах in vivo проведено систематическое изучение способности к трансмиссивности широкого спектра вирусов гриппа.

Показано, что разные штаммы вируса гриппа обладают способностью к передаче на расстоянии различной степени выраженности (от высокой до полного ее отсутствия). Наиболее трансмиссивными оказались вирус NIBRG-23 (H5N1), унаследовавший НА и NA от вируса гриппа птиц A/turkey/Turkey/1/2005, и выделенный от человека вирус гриппа свиней А/Индиана/10/2011 (H3N2)v. Вызвавший пандемию 2009 года вирус А/Калифорния/07/2009 (H1N1) проявлял меньшую контагиозность.

В экспериментах на лабораторных животных впервые продемонстрировано полное отсутствие трансмиссивности ХА штаммов вируса гриппа (доноров аттенуации и вакцинных штаммов ЖГВ).

Установлено, что смешанная инфекция in vivo «диких» и ХА вирусов не приводит к формированию реассортантов, превышающих по своей вирулентности «дикие» родительские вирусы.

Теоретическая и практическая значимость работы.

В результате моделирования смешанной инфекции in vivo обоснована несостоятельность опасений о возможности формирования при массовой вакцинации населения живой

гриппозной вакциной реассортантных вирусов, обладающих повышенным уровнем патогенности.

Показано, что реассортация ш vivo происходит менее эффективно, если один из участников скрещивания является ХА вирусом.

Установлен факт интерференции ХА вирусов с вирусами «дикого» типа, что открывает новые перспективы применения живой гриппозной аттенуированной вакцины в пандемической ситуации.

Подтверждена безопасность массового применения не только сезонной, но и пандемической живой гриппозной вакцины.

Положения, выносимые на защиту.

«Дикие» вирусы гриппа обладают разной степенью трансмиссивности для экспериментальных животных (морских свинок), которая далеко не всегда коррелирует с другими биологическими свойствами (уровнем репродукции в верхних дыхательных путях).

Холодоадаптированные штаммы вируса гриппа, активно реплицируясь в ВДП экспериментальных животных, не способны к передаче от вакцинированных контактным особям.

Теоретическая вероятность реассортации высоковирулентных вирусов с ХА штаммами живой гриппозной вакцины не приведет к формированию реассортантов, обладающих непредсказуемо высоким уровнем вирулентности и трансмиссивности и потенциально способных вызвать новую эпидемию или даже пандемию, что подтверждает высокую безопасность применения ЖГВ.

Личный вклад автора в проведенные исследования заключается в его непосредственном участии в выполнении всех разделов данной работы.

Внедрение результатов исследования. Подготовлены два вакцинных штамма ЖГВ на эпидемический сезон 2012-2013 гг. и депонированы в Государственную коллекцию вирусов Российской Федерации на базе ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России под номерами 2723, 2724, а также переданы в производственные институты. Разработанное компьютерное обеспечение «Калькулятор фенотипов» внедрено в практику работы лаборатории вакцинных штаммов отдела вирусологии им. А.А.Смородинцева (ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН, Санкт-Петербург) и используется для обработки массива данных, оценки фенотипических свойств полученных реассортантных вирусов.

Апробация диссертации осуществлялась на протяжении всего периода работы. Основные положения диссертации были доложены на 19 международных и российских научных конференциях: на Международной научно-практической конференции, посвященной Всемирному дню здоровья (Киев, Украина, 7-8 апреля 2010 г.); на 14-й

Международной Пущннской школе-конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века» (Пущино, 19-23 апреля 2010 г.); на 17-м Международном конгрессе медицинских наук (ISCOMS) (Гронинген, Нидерланды, 8-11 июня 2010 г.); на VII Международном конгрессе по контролю за гриппом (Гонконг, Китай, 3-7 сентября 2010 г.); на Международном научно-практическом конгрессе студентов и молодых ученых «Актуальные проблемы современной медицины» (Киев, Украина, 3-^4 ноября 2010 г.); на Всероссийской конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (21-22 декабря 2010 г.); на Х-й Всероссийской молодежной конференции Института физиологии Коми научного центра Уральского отделения РАН «Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике» (Сыктывкар, республика Коми, 19-21 апреля 2011 г.); на 15-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 19-23 апреля 2011 г.); на Международной научной конференции студентов и молодых учёных «Молодежь - медицине будущего», посвященной 135-летию со дня рождения Н.Д.Стражеско (Одесса, Украина, 28-29 апреля 2011 г.); на Четвертой конференции Европейской научной рабочей группы по гриппу (ESWI) (Мальта, 11-14 сентября 2011 г.); на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы эпидемиологии на современном этапе», посвященной 80-летию кафедры эпидемиологии и доказательной медицины ГОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М.Сеченова Минздравсоцразвития России (Москва, 13-14 октября 2011 г.); на Всероссийской молодежной конференции-школе «Нейробиология интегративных функций мозга» посвященной 120-летию создания физиологического отдела им. И.П.Павлова НИИЭМ СЗО РАМН (Санкт-Петербург, 21-25 ноября 2011 г.); на Международном конгрессе «Человеческий фактор риска» Союза управления рисками в профилактической медицине (URMPM) (Лондон, Великобритания, 8-9 сентября 2012 г.); на Второй Российско-Германской неделе молодого ученого «Общество и здоровье» (Екатеринбург, 16-21 сентября 2012 г.); на Научной конференции «Грипп: вирусология, эпидемиология, профилактика, лечение», посвященной 45-летию ФГБУ «НИИ гриппа» Минсоцздравразвития России (Санкт-Петербург, 24-25 октября 2012 г.); на П-й Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург, 12-14 ноября 2012 г.); на XVI Всероссийской медико-биологической на