Роль вируса гриппа и его поверхностных белков в развитии дисфункции клеток эндотелия

Азаренок, Анастасия Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль вируса гриппа и его поверхностных белков в развитии дисфункции клеток эндотелия
ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Роль вируса гриппа и его поверхностных белков в развитии дисфункции клеток эндотелия"

АЗАРЕНОК АНАСТАСИЯ АЛЕКСАНДРОВНА

РОЛЬ ВИРУСА ГРИППА И ЕГО ПОВЕРХНОСТНЫХ БЕЛКОВ В РАЗВИТИИ ДИСФУНКЦИИ КЛЕТОК ЭНДОТЕЛИЯ

03.02.02. - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 и НАР 224

¿-и I I

Санкт-Петербург - 2014

005546052

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт гриппа» Министерства здравоохранения

Российской Федерации

Научный руководитель:

Жилинская Ирина Николаевна доктор биологических наук Официальные оппоненты:

Исаков Валерий Александрович, доктор медицинских наук, профессор кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии с курсом ВИЧ-медицины ГОУ ВПО «Первый СПбГМУ им. акад.И.П.Павлова» Росздрава.

Киселева Ирина Васильевна, доктор биологических наук, ФГБУ «НИИ экспериментальной медицины» СЗО РАМН, зав. лаб. вакцинных штаммов отдела вирусологии им. A.A. Смородинцева.

Ведущая организация: Федеральное бюджетное государственное учреждение «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучию человека Российской Федерации

Защита диссертации состоится 2/. OY./ У в 11 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций

Д 208.131.01 при ФГБУ «Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России (123098, Москва, ул. Гамалеи, д. 16).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России (123098, Москва, ул. Гамалеи, д. 16)

Автореферат разослан « ? » ЖAfi I (Ls

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор медицинских наук

Бурцева Елена Ивановна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Грипп представляет собой инфекцию, занимающую доминирующее положение в структуре инфекционной заболеваемости, как по числу случаев заболевания, так и по наносимому экономическому ущербу [Киселев и др., 2010; Львов и др., 2010]. Однако, несмотря на интенсивное изучение возбудителя этой инфекции с момента его открытия и до наших дней, патогенез гриппа остается предметом интереса большого числа исследователей. Это связано в первую очередь с установленным фактом, что вирус гриппа вызывает не только нарушения дыхательной системы, но и поражает нервную систему, кишечник, а также вызывает изменения в системе гемостаза [Богомолов и др., 2001; Жилинская и др.,2003;]. Механизм этих множественных нарушений при гриппе до сих пор невыяснен. Взаимосвязь гриппозной инфекции и нарушений гемостаза клиницисты отмечали еще в 60-е года прошлого века [Сергеев и др., 1962]. Подтверждением этой взаимосвязи явилась эпидемия 20092011 гг., во время которой наблюдались тяжелые осложнения в виде энцефалопатий и тромбогеморрагических пневмоний, ключевым моментом в развитии которых явилось повреждение эндотелия кровеносных сосудов вирусом гриппа [Цинзерлинги др.,2011; Горфинкель и др.,2011]. Кроме того, эпидемиологические данные также указывают на то, что имеется корреляция между ежегодными эпидемиями гриппа и ростом числа больных, страдающих сердечно-сосудистыми заболеваниями [Богомолов и др., 2001; Carrat et al., 2006; Wong et al., 2006]. Так как среди причин развития сердечнососудистых заболеваний дисфункция эндотелия занимает одно из первых мест [Петрищев, 2003], то можно предполагать, что в случае подтверждения способности вируса гриппа поражать эндотелий кровеносных сосудов человека, гриппозная инфекция может представлять угрозу возникновения сердечно-сосудистой патологии. Поэтому, представляло интерес выяснить, влияет ли гриппозная инфекция на развитие дисфункции эндотелия.

Эндотелий кровеносных сосудов в настоящее время рассматривается не просто как барьер между кровью и окружающими тканями, но как диффузный эндокринный орган, пронизывающий все системы opraHH3Ma[Furchgott_1999; Гомазков 2000; Лупин-ская и др.,2008]. Основной функцией эндотелия является поддержание гемостаза, то есть непрерывного тока крови, но кроме этого клетки эндотелия участвуют в процес-

сах воспаления, ангиогенеза и т.д. В связи с этим эндотелий оказывается мишенью для большинства патогенов, как бактериальных, так и вирусных.

Большое число исследований посвящено воздействию на эндотелиальные клетки таких вирусов, как вирус иммунодефицита, цитомегаловирус, вирусы-возбудители геморрагических лихорадок [Bibas et al., 2011; Popovic et-al., 2012; Brown et al., 2011]. Ha этом фоне количество работ, посвященных влиянию вируса гриппа и его белков на клетки эндотелия, крайне незначительно и проведение подобных исследований при изучении патогенеза гриппозной инфекции представляется актуальным [Klenk et а1.,2005]. Фундаментальные исследования по изучению механизмов взаимодействия вируса гриппа с клетками эндотелия в России не проводятся. Имеется ряд сообщений о патоморфологических исследованиях клеток эндотелия при гриппозной инфекции [Цинзерлинг, 1977; Горфинкель и др.,2011], а также клинические исследования, касающиеся терапии ДВС-синдрома и геморрагических пневмоний при гриппе [Рогано-ва, 2009]. Монографий на данную тему, а также защищенных кандидатских и докторских диссертаций не имеется. В основе работы лежат данные, полученные доктором биологических наук Жилинской И.Н. (сотрудником ФГБУ НИИ гриппа МЗ РФ) - докторская диссертация «Роль вирусных белков в патогенезе гриппозной инфекции», 2003 год.

Цель и задачи исследования. Целью работы было показать возможность репродукции вируса гриппа в клетках эндотелия сосудов человека и выявить роль вируса гриппа и его поверхностных белков — гемагглютинина и нейраминидазы — в развитии дисфункции эндотелиальных клеток.

Для достижения поставленной цели планировалось решить следующие задачи:

1). Выявить особенности репродукции эпидемически актуальных штаммов вируса гриппа человека и птиц в культуре клеток эндотелия человека EAhy926.

2). Оценить воздействие эпидемически актуальных штаммов вируса гриппа и его поверхностных белков на дыхательную активность митохондрий эндотелиальных клеток.

3) Выяснить воздействие эпидемически актуальных штаммов вируса гриппа и

его поверхностных белков на апоптоз клеток эндотелия.

4) Изучить влияние эпидемически актуальных штаммов вируса гриппа и его поверхностных белков на выживаемость клеток эндотелия.

5) Оценить развитие дисфункции эндотелия под воздействием эпидемически актуальных штаммов вируса гриппа и его поверхностных белков по активности человеческого тканевого активатора плазминогена.

Научная новизна работы. Доказано, что вирус гриппа способен репродуцироваться в клетках эндотелия человека in vitro (на модели клеточной культуры EAhy926). На модели клеточной культуры репродукция вируса гриппа была зарегистрирована вирусологическим, молекулярно-биологическим и электронно-микроскопическим методами, а также была подтверждена при изучении аутопсийного материала легких, мозга и сердца.

Впервые показано развитие дисфункции эндотелия под воздействием вируса гриппа и его поверхностных белков с использованием нескольких критериев: по развитию апоптоза, по угнетению метаболизма клеток эндотелия, по активации тканевого активатора плазминогена.

Развитие апоптоза было подтверждено данными по активации каспазы-3 и регистрации аннексии V положительных апоптотических клеток. Впервые было показано, что вирус гриппа типа А вызывает активацию каспазы-3 в эндотелиальных клетках через 30 минут после их инфицирования. Аналогичные данные получены и для поверхностных белков исследуемых вирусов — гемагтлютинина и нейраминидазы. Исследуемые штаммы вируса гриппа и их поверхностный белок нейраминидаза вызывали развитие апоптоза на ранних сроках воздействия (4-8часов), что регистрировалось по появлению аннексии V положительных клеток (6% от общего числа клеток). При изучении воздействия другого поверхностного белка - гемагглютинина - было показано, что, несмотря на активацию каспазы-3, гемагглютинин вируса гриппа вызывает гибель эндотелиальных клеток только по некротическому пути.

Показано угнетение метаболизма клеток эндотелия как цельным вирусом гриппа типа А, так и его поверхностными белками, что регистрировалось по изменению активности внутриклеточных дегидрогеназ.

Выявлена активация процесса фибринолиза (увеличение активности тканевого активатора плазминогена) под влиянием вируса гриппа и его поверхностных белков в клетках эндотелия человека in vitro (на модели клеточной культуры EAhy926) и in vivo (в эуглобулиновой фракции крови крыс). Можно предположить, что механизмом активации процесса фибринолиза может служить мимикрия аминокислотных последовательностей тканевого активатора плазминогена в структуре гемагглютинина и нейра-минидазы.

Теоретическая и практическая значимость работы. Возможность репродукции вируса гриппа типа А в клетках эндотелия человека как in vitro, так и in vivo имеет большое значение для практической медицины, так как открывает новый аспект патогенеза гриппозной инфекции. Показано, что репродукция вируса гриппа приводит к изменению морфологии клеток эндотелия, к угнетению метаболизма, развитию апоп-тоза и активации тканевого активатора плазминогена. Все перечисленные критерии указывают на то, что гриппозная инфекция приводит к прямому повреждению эндоте-лиальных клеток, которое выражается в развитии дисфункции. Все эти данные согласуются с клинической картиной при гриппозной инфекции.

Таким образом, впервые показана важная роль клеток эндотелия в патогенезе гриппозной инфекции. Полученные данные указывают на необходимость комплексной терапии при гриппе, а также открывают новые подходы в разработке противогриппозных препаратов. Кроме того, становится очевидным, что развитие дисфункции эндотелия при гриппозной инфекции может привести к развитию сердечно-сосудистой патологии в виду ежегодных эпидемий гриппа.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Вирус гриппа типа А способен репродуцироваться в клетках эндотелия кровеносной системы человека.

2. Вирус гриппа типа А и его поверхностные белки вызывают дисфункцию эн-дотелиальных клеток, которая выражается:

а) в развитии апоптоза.

б) в угнетении метаболизма эндотелиальных клеток;

в) в активации процесса фибринолиза путем увеличения активности тканевого активатора плазминогена.

3. Поверхностные белки вируса гриппа типа А - гемагглютинин и нейраминида-за - также вызывают развитие дисфункции эндотелия по тем же параметрам, что и цельный вирус гриппа.

Личный вклад автора. Автором выполнен основной объем работ по всем разделам диссертации: изучению репродукции вирусов гриппа, выявлению активности каспазы-3, исследованию дыхательной активности и апоптоза, изучению активности активатора плазминогена в клетках эндотелия. Автором проведен анализ использованной литературы и полученных данных; подготовлены материалы по основным публикациям; сформулированы выводы диссертации.

Внедрение результатов работы. Все исследования входили в плановую научную тематику лаборатории молекулярной вирусологии и генной инженерии ФГБУ НИИ гриппа МЗ РФ.

Материалы исследования используются в учебном процессе в курсе тематического усовершенствования, сертификационном курсе и курсе профессиональной переподготовки по специальности «Вирусология» на базе кафедры медицинской микробиологии ГБОУ СЗГМУ им.И.И.Мечникова.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы представлены на Международной конференции «Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями» Санкт-Петербург 2010г.; Четвертой научно-практической конференции «Актуальные вопросы инфекционной патологии» Санкт-Петербург 2010г.; Всероссийской научно-практической конференции по медицинской микробиологии и клинической микологии(ХУ Кашкинские чтения) Санкт-Петербург 2012 г.; Юбилейной научно-практической конференции «Грипп: эпидемиология, вирусология и лечение» Санкт-Петербург, 2012г.; Всероссийской научно-практической конференции по медицинской микробиологии и клинической микологии(ХУ1 Кашкинские чтения) Санкт-Петербург 2013 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 работ, из них - 6 статей в журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации. Объем работы составляет 183 страницы машинописного текста, включая 6 таблиц и 31 рисунок. Список литературы из 328 наименований, из них 49 отечественных и 279 зарубежных.

Основные результаты, изложенные в диссертации, получены в соавторстве с Жилинской И.Н., Прочухановой А.Р., Ильинской Е.В., Сироткиным А.Н., Козловой Н.М., Еропкиной Е.М., Царевой Т.Р. и Сорокиным Е.В. - сотрудниками ФГБУ НИИ гриппа РАМН МЗ РФ; Ляпиной Л. А. и Оберган Т.Ю. - сотрудниками кафедры защитных систем крови МГУ, Москва; Харченко Е.П. - сотрудником Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М.Сеченова РАН; Люблинской О.Г. и Зени-ным — сотрудниками Института цитологии РАН.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Вирусы. Исследовали три штамма вируса гриппа: 1) Эпидемический штамм вируса гриппа человека А/Брисбейн/10/2007 (НЗШ);

2) реассортантный штамм вируса гриппа птиц А/курица/Курган/5/05 N81-81/5:3(Н5Ш). Этот штамм получен методом обратной генетики в лаборатории молекулярной вирусологии и генной инженерии НИИ гриппа; геном включает следующие гены: а) полимеразы РВ2 и РА, нуклеопротеин (ЫР), неструктурные белки (ЫБ) - от вируса А/РЯ/8/34(НШ1); полимераза РВ1 - от вируса А/Техас/1/77 (НЗЫ2); б) гемагг-лютинин (НА) от дикого штамма А/курица/Курган/5/05 (Н5Ш), модифицированный по сайту расщепления; в) нейраминидаза (ЫА) и мембранные белки (М) - от дикого вируса птиц А/курица/Курган/02/05 (Н5Ш);

3) Пандемический штамм А/Санкт-Петербург/2/2009(Н1Ш) рс!т 09. Все вирусы получены из лаборатории эволюционной изменчивости вирусов гриппа.

Клеточные культуры. Репродукция вируса гриппа изучалась на культуре клеток эндотелия человека ЕАЬу926, любезно предоставленной д-ром Корой Джин Эй-джел из Отдела патологии университета Северной Каролины. Клеточную линию ЕАЬу926 поддерживали в среде ОМЕМ/Т - 12 с Хепесом и Ь- глутамином, содержащей 10% сыворотки эмбрионов коров («Биолот», Санкт-Петербург). Для сравнения

была взята культура клеток MDCK из коллекции клеточных культур НИИ гриппа, культивируемая по общепринятой методике. Заражение клеточного монослоя проводили путем адсорбции вируса при 37° С в атмосфере 5% С02 (инкубатор фирмы SANYO, Япония) в поддерживающей среде DMEM, содержащей 2 мкг/мл трипсина TPCK(«Sigma»,). Через час после адсорбции клетки отмывали и инкубировали в той же среде в течении 72 часов.

Инфекционную активность вируса гриппа в культуре клеток определяли титрованием вируссодержащего материала в суточной культуре EAhy926 и суточной культуре MDCK с коэффициентом разведения 10 и рассчитывали по методу Reed & Muench (1938). Инфекционную активность вирусов оценивали по ТЦД50 и в РГА с куриными эритроцитами по общепринятому методу через 72 часа после заражения.

Полимеразная цепная реакция. Выделение вирусной РНК проводили с использованием наборов для выделения нуклеиновых кислот РИБО-сорб ЦНИИ эпидемиологии, Москва, РФ (модификация метода Boom R. et al., 1990), согласно инструкции производителя. Синтез кДНК проводился с использованием двух праймеров: универсального для всех сегментов вируса гриппа А - 12-членного праймера, комплементарного 5'-концу вирионной PHK(IAUPF), и универсального для всех сегментов вируса гриппа А - 13-членного праймера комплементарного 5'-концу матричной PHK(IAUPR). ПЦР проводили на амплификаторе Rotor Gene 6000. Анализ данных проводили прямым сравнением значений Ct.

Электронно-микроскопический анализ клеточной культуры EAhy926 , ин-тактной и инфицированной вирусом гриппа А (доза заражения вирусом 0,01 ТЦЦ50 /кл, время репродукции вируса 24 часа), был выполнен на микроскопе JEM-1011. Клетки фиксировали в 2% глютаральальдегиде на 0,1 M какодилатном буфере (рН 7,4) в течение часа при комнатной температуре, постфиксировали в 1% четырехокиси осмия на том же буфере в аналогичных температурных условиях. Материал обезвоживали в этаноле восходящей концентрации и заключали в смесь эпона и аралдита. Ультратонкие срезы изготавливали на ультратоме LKB-100.

Иммуногистохимический анализ аутопсийного материала легких, мозга и сердца от пациентов, умерших в эпидемию 2009-2010гг., был предоставлен Ленинградским областным патологоанатомическим бюро г. Санкт-Петербурга. Анализиро-

вали ткани легких методом иммуногистохимии с моноклональными антителами (МКА) к гемагглютинину (НА) и нуклеоиротеину (NP) вируса гриппа и выявляли их с помощью системы визуализации фирмы Novolink (Novocastra), включающей в себя реакцию с ДАБ-хромогеном.

МКА к НА вируса гриппа HlNlpdm09 и к NP белку вируса гриппа А были получены в лаборатории биотехнологии диагностических препаратов НИИ гриппа. В качестве контроля был использован аутопсийный материал от пациентов, умерших с признаками прогрессирующей легочной дисфункции и явлениями острого респираторного дистресс-синдрома, не имевших диагноза « грипп».

Выделение белков вируса гриппа. Гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA) выделяли из сконцентрированного и очищенного вируса гриппа. С этой целью вирусы ресуспендировали в Na-ацетатном буфере (50 тМ ацетат Na, 2 mM NaCl, 0,2 mM EDTA; pH 7,0) и разрушали 7% октилглюкозидом в течение 2 ч при +4П С. Затем материал центрифугировали при 15000 об/мин в течение 1 ч (ротор Beckman SW50.1). К супернатанту, содержащему НА и NA, добавляли 2 %-ный водный раствор бромида цетримония (СТАВ, Sigma) до конечной концентрации 0.1%. Образец наносили на анионообменную колонку (1x3 см; сорбент DEAE-Sephadex А-50; Pharmacia Fine Chemicals), предварительно уравновешенную стартовым буфером (50 mM Tris-HCl, 0.1% октилглюкозид; pH 7 для штамма А/курица/Курган/05/2005 и тот же буфер pH 7.5 для штамма А/Брисбейн/10/2007). NA элюировали 20 мл стартового буфера , НА -20 мл элюирующего буфера (50 шМ Tris-HCl, 0.5М NaCl, 0,1% Triton Х-100, pH 7,5). Каждую фракцию диализовали против буфера STE в течение 72 ч для удаления остатков октилглюкозида и Triton Х-100. Контроль чистоты выделенного материала осуществлялся при помощи электрофореза в полиакриламидном геле по методу Лэммли с последующим анализом гелей на денситометре GS-800 (Bio-Rad Laboratories).

МТТ-тест. Метаболизм клеток эндотелия оценивали с помощью МТТ-теста на общую активность внутриклеточных дегидрогеназ, который широко используется для биохимической оценки выживаемости клеток в культуре [Mossman Т.,1983]. Метод основан на восстановлении диметилтиазолил-дифенилбромид тетразолия митохонд-риальными и цитоплазматическими дегидрогеназами метаболически активных клеток.

Клетки EAhy926 вносили в 96 луночные планшеты в концентрации 32000кл/лунку в 100 мкл культуральной среды. На следующий день клетки либо заражали вирусами по общепринятой методике, либо обрабатывали поверхностными белками исследуемых вирусов в разной концентрации и с разным временем экспозиции. После экспозиции клеток или с вирусом, или с белком культуральную среду удаляли, к клеткам добавляли раствор МТТ-реактива в бессывороточной культуральной среде в концентрации 5мг/мл и инкубировали 3 часа в С02-инкубаторе. Затем раствор красителя сливали и заменяли на 96° спирт на 30 минут. Далее планшеты помешали в спектрофотометр Thermofisher VarioScan и снимали показания при длине волны 540 нм.

Иммуногистоцитохимическое определение активности каспазы-3. Суточный монослой клеток EAhy926 был выращен на предметных стеклах, предварительно покрытых полилизином. Затем клетки либо заражали вирусами по общепринятой методике, либо обрабатывали поверхностными белками исследуемых вирусов в разной концентрации и с разным временем экспозиции. Зараженные и контрольные клетки на предметных стеклах фиксировали смесью ацетон:этанол (1:1), после чего их обрабатывали с помощью набора для выявления МКА к каспазе-3 (фирма Novocastra). Визуализацию первичных антител проводили вторичными антителами, конъюгирован-ными с полимером, сцепленным с пероксидазой (фирма Novolink). Далее следовала окраска ДАБ хромогеном и подкрашивание ядер гематоксилином Майера.

Оценка процессов апоптоза методом проточной цитометрии. 2 500 000 эндо-телиальных клеток вносили в лунки 6-ти луночного планшета (Sarstedt,Австрия). Суточный монослой клеток либо заражали вирусами по общепринятой методике, либо обрабатывали поверхностными белками исследуемых вирусов в разной концентрации и с разным временем экспозиции, после чего производили дезинтеграцию монослоя в 0,02% растворе ЭДТА (Биолот,РФ) и переносили клеточную суспензию в микропробирки. Для определения количества клеток в состоянии и апоптоза использовали FITC Annexin V kit 1 (BD Biosciences, США). Аннексии V позволяет выявить экспрессию фосфатидилсерина на наружной поверхности мембраны и, таким образом отделить нормальные жизнеспособные клетки от апоптотических. Эндотелиальные клетки окрашивали аннексином V согласно инструкции производителя. Анализ образцов произ-

водили с помощью проточной цитометрии на приборе Epics XL (Becman Coulter, США), снабженном аргоновым лазером с длиной волны 488 нм. Опыт производили в трех повторностях, количество клеток в состоянии некроза и апоптоза выражали в процентах от общего количества анализируемых клеток.

Активность активатора плазмииогена (t-PA) определяли по методу Кудряшо-ва и сотр.(1974). Активность t-PA in vitro определяли в суточном монослое клеток EAhy926, которые либо заражали вирусами по общепринятой методике, либо обрабатывали поверхностными белками исследуемых вирусов в разной концентрации и с разным временем экспозиции. Зараженные и контрольные клетки замораживали при -20°С. После оттаивания суспензию наносили на стандартные фибриновые пластины (непрогретые и прогретые при 86° С в течение 30 мин). Далее пластины инкубировали при 37° С в течение 20-24 ч и регистрировали результаты по разнице площадей зон лизиса на непрогретых и прогретых пластинах. Разница площадей зон лизиса характеризует величину активности t-PA. Активность t-PA in vivo определяли в эуглобулиновой фракции плазмы крови белых беспородных крыс на стандартных фибриновых пластинах.

Поиск мимикрических последовательностей аминокислот в структуре вирусных белков и t-PA осуществляли с помощью компьютерных программ.

Статистическую обработку данных проводили с применением программного обеспечения Microsoft Exel.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

Репродукция исследуемых штаммов вируса гриппа типа А в эндотелиаль-ных клетках.

Инфекционная активность вируса гриппа типа А в культуре клеток EAhy926 Для оценки возможности репродукции вируса гриппа типа А (подтипов H3N2 H5N1 и HINlpdm 09), культуру клеток эндотелия инфицировали вирусами в дозах 0,01 ТЦД50/кл, 0,001 ТЦД50/кл и 0,0001 ТЦД50/кл. Инфекционную активность вирусов оценивали по ТЦД5о/мл и в реакции гемагглютинации (РГА) с куриными эритроцитами (таблица 1).

Как видно из таблицы 1, все исследуемые вирусы были способны репродуцироваться в клеточной культуре ЕАЬу926. Так, через 24 часа после заражения, инфекционная активность вирусов А/Брисбейн/10/2007(НЗШ) и

Таблица 1

Репродукция вируса гриппа А в клетках эндотелия ЕАЬу926 и в МОСК.

Вирусы гриппа

Инфекционный титр вируса ТЩЫмл).

EAhy926

MDCK

Титр в РГА (1% куриные эритроциты).

EAhy926

MDCK

Время, после заражения (ч)._

24 48 72

А/Брисбейн/10/2007 (H3N2)

2,3

3,4

3,50

4,12

5,0

5,2

1/32

1/64

1/12

1/256

1/1024

А/Курган/5/05/NS 1 -81/5:3 (H5N1)

2,4

3,4

3,48

4,03

4,23

4,5 5

1/16

1/64

1/128

А/Санкт-Петербург/2/2009 (HlNl)pdm 09

3,5

4,0

4,16

4,8

5,3

5,5

1/32

1/128

1/12

1/64

1/128

1/256

А/Курган/5/05/Ы81-81/5:3 (Н5Ы1) составляла 2,3 и 2,4 ^ ТЦД50/мл соответственно. Инфекционный титр вируса А/Санкт-Петербург/2/2009 (НШ1) рс1т 09 был несколько выше - 3,5 ^ ТЦД5о/мл. Титр вирусов в культуральной жидкости в РГА составлял 1/16 для вируса А/Курган/5/05/Ы81-81/5 :3 (Н5Ы1) и 1/32 для вирусов А/Брисбсйи/10/2007(НЗ№) и А/Санкт-Петербург/2/2009 (НШ1)рс1ш 09.

Через 48 часов после инфицирования клеток исследуемыми вирусами, их инфекционная активность возрастала на 0,5-1,0 ^ ТЦД50/мл. Гемагглютинирующая активность вирусов также возрастала до 1/64-1/128. Культивирование вирусов гриппа в клетках эндотелия в течение 72 часов приводило к увеличению инфекционной активности вируса, приблизительно на 1 ^ ТЦД5о/мл, по сравнению с культивированием вируса в течение 24 часов и, приблизительно, на 0,5 ^ ТЦЦ50/МЛ — в течении 48 часов.

Необходимо отметить, что инфекционный титр вируса в клетках эндотелия и титр их в РГА был ниже, чем в культуре клеток МБСК, которая является пермиссив-ной культурой для вируса гриппа (таблица 1). Так инфекционная активность всех трех исследуемых вирусов в клетках ЕАЬу926 была на 1,5 — 2 ^ ТЦД50/мл ниже, чем в

клетках MDCK, а их гемагглютинирующая активность в 2 - 4 раза меньше чем в MDCK. Возможно, это объясняется особенностями физиологии эндотелиапьных клеток.

Выявление РНК, исследуемых вирусов, в культуре клеток EAhy926. Для

подтверждения возможности репродукции исследуемых вирусов в эндотелиальных клетках линии EAhy926 была проведена ОТ-ПЦР. Эндотелиальные клетки были инфицированы исследуемыми вирусами (заражающая доза 0,01ТЦД50/кл), и через 24 часа после заражения были разрушены замороживанием и оттаиванием. Постановка ПЦР в реальном времени подтвердила наличие синтеза и вирусной РНК (вРНК), и матричной РНК (мРНК) в эндотелиальных клетках, инфицированных вирусом гриппа человека и птиц.

Выявление вирусных частиц исследуемых штаммов вируса гриппа, в культуре клеток EAhy926 электронно - микроскопическим методом. Был также проведен электронно-микроскопический анализ культуральной среды инфицированных клеток. Культуральная среда отбиралась через 24 часа после инфицирования культуры клеток исследуемыми вирусами (заражающая доза 0,01ТЦД50/кл). На электронограмме были получены снимки полноценных вирусных частиц вируса гриппа А/Санкт-Петербург/2/2009 (H1N1) pdm09.Аналогичная картина была характерна для вирусов А/Брисбейн/10/2007(НЗЫ2) и A/KypraH/5/05/NSl-81/5:3 (H5N1).

Иммуногистоцитохимическое исследование аутопсийного материала от больных, умерших в эпидемию гриппа 2009-2010гг. Репродукция вируса гриппа типа А в клетках эндотелия кровеносных сосудов человека in vivo была зарегистрирована при исследовании аутопсийного материала легких, пациентов, умерших в эпидемию 2009-2010 гг. Исследование проводили иммуногистоцитохимически с помощью МКА к гемагглютинину(НА) и нуклеопротеину(МР) вируса гриппа типа А.

тм

Рисунок 1. Иммуногистохимический анализ локализации НА и № вируса гриппа А (НШ1) рс!т 09 в аутопсийном материале легких пациентов.

а, Ь - интактные клетки; с - локализация НА в клетках: эндотелия сосудов, альвеолярного эпителия, тканевых макрофагах ;с1 - локализация № в клетках эндотелия сосудов и в тканевых макрофагах. Обозначения: Э-эндотелий; А-альвеолярный эпителий; ТМ-тканевой макрофаг.Увеличение 100Х с иммерсией; окрашивание клеток ДАБ-хромагеном с последующей окраской гематоксилином Майера.

Как видно из рисунка 1(с), был выявлен НА вируса гриппа НШ1 рёш 09, который локализовался на плазматической мембране и в цитоплазме клеток эндотелия мелких кровеносных сосудов, клеток альвеолярного и бронхиолярного эпителия и внутри альвеолярных и тканевых макрофагов. Это видно по коричневому окрашиванию ДАБ-хромогена, которое отсутствует в интактных клетках. № антиген этого вируса регистрировался в тех же клетках и тканях, что и НА, но был локализован в ядрах клеток, что отражает особенности репродукции вируса гриппа (рис. Ы).

Таким образом, данные полученные вирусологическим, молекулярно-биологическим, электронно-микроскопическим и иммуногистохимическим методами, указывают на то, что исследуемые штаммы вируса гриппа типа А репродуцируются в

клетках эндотелия человека как in vitro, так и in vivo.В связи с этим представляло интерес оценить возможные последствия репродукции вируса гриппа в клетках эндотелия.

Дисфункция клеток эндотелия при воздействии исследуемых вирусов гриппа и их поверхностных белков

Электронно-микроскопический анализ морфологии клеточной культуры эндотелия, инфицированной вирусом гриппа типа А. При электронно-микроскопическом анализе морфологии клеток, инфицированных исследуемыми штаммами вируса гриппа, отмечалось увеличение количества диктиосом и расширение цистерн аппарата Гольджи, а также увеличение количества цистерн шероховатого эндоплазматического ретикулюма. Кроме этого, в инфицированных клетках регистрировалось увеличение количества миелоидных телец. Все это указывает на изменение морфологии эндотелиальных клеток зараженных вирусом гриппа.

Изменение дыхательной активности клеток эндотелия при воздействии исследуемых вирусов гриппа. Дыхательную активность клеток эндотелия изучали по активности дегидрогеназ (митохондриальных и цитоплазматических) с помощью МТТ-теста. С этой целью клетки инфицировали вирусом гриппа и измеряли суммарную дегидрогеназную активность (ДГА) в период от 0 до 72 часов, при двух дозах заражения - 0,01ТЦД50/кл и 0,001ТЦД50/кл.

• ,s

■ vs "Ч

---СПб 0.01 ТЩ50/О1

----Курган 0.01ТЦЦ50/кл

--БрисбеРн 0 01ТЦД50/КЛ

24 48 72

NTH -1-f- \

. — Брисбейн 0.001 ТЦД50/Ы1

---Курган 0.0011ЦД50/КЛ

---СПб 0.001 ТЦД50/И1

Рисунок 2. Изменение общей дегидрогеназной активности в культуре клеток ЕАЬу926 при воздействии исследуемых вирусов гриппа типа А:

а - Доза заражения вирусами 0,0) ТЦЦ50/КЛ; б - Доза заражения вирусами 0,001ТЦД5о/кл Брисбейн - вирус гриппа А/Брисбейн/10/2007 (НЗЫ2); Курган - вирус гриппа А/курица/Курган/5/05 Ш1-81/5:3(Н51\11); СПб - вирус гриппа А/Санкт-Петербург/2/2009 (НШ1)рс1т 09; р<0,05 , Из рисунка 2 видно, что снижение общей ДГА при заражении вирусом в дозе

0,01ТЦД50/кл значительно превосходило тот же показатель при меньшей дозе заражения 0,001ТЦД5о/кл и зависело от времени репродукции вируса. Так, через 18 часов после заражения, метаболизм клеток снижался, в среднем, на 40% при дозе 0,01Т1ДД5(/кл и на 20% при дозе 0,001ТЦД50/кл. Через 48 часов метаболизм клеток снижался на 70% : при дозе 0,01ТЦД50/кл и на 40% при дозе 0,001ТЦД50/кл. Существенных различий в ; активности воздействии трех исследуемых штаммов вируса гриппа типа А не отмече-! но.

Изменение дыхательной активности клеток эндотелия при воздействии нейраминидазы и гемагглютинина. Для изучения дыхательной активности дегидро-геназ клетки под воздействием поверхностных белков вируса гриппа клетки обрабатывали гемагглютинином и нейраминидазой в концентрациях 10 - 100 мкг/мл в течение от 0 до 72 часов. На рисунке 3 представлены данные о воздействии гемагглютинина вируса гриппа А/Брисбейн/10/2007(НЗЫ2) на клетки культуры ЕА11у92б.

Рисунок 3. Влияние НА вируса гриппа А/Брисбейн/10/2007 (НЗШ);на изменение общей де-гидрогеназной активности в культуре клеток ЕАЬу926. р<0,05

Как видно из рисунка 3,через сутки после воздействия НА в концентрации 100 мкг/мл снижение общей ДГА составляло 60%, в концентрации 50 мкг/мл -20%, в концентрации 10 мкг/мл - не выявлено. НА в концентрации 10 мкг/мл оказывал воздейст-

вие на клетки только через 48 часов, снижая метаболизм клеток на 5%, и через 72 часа - на 30%. Статистически значимых отличий в активности гемагглютинина исследуемых штаммов вируса не обнаружено.

Воздействие NA на исследуемые клетки графически отражено на рисунке 4. Через 24 часа ЫА в концентрации 100 мкг/мл вызывала снижение общей ДГА клеток на 60%, в концентрации 50 мкг/мл - на 50% (рис.4). Статистически значимых отличий в активности ЫА исследуемых штаммов вируса гриппа не обнаружено.

ч.

- V.

V. \

--100 м»

— - - 10мм — копт роль

Рисунок 4. Влияние нейраминидазы вируса гриппа А/Брисбейн/10/2007 (НЗШ) на изменение общей дегидрогеназной активности в культуре клеток ЕАИу926. р<0,05

Таким образом, можно говорить о том, что как цельный вирус, так и поверхностные белки (НА и ЫА) достоверно снижают общую дегидрогеназную активность клеток эндотелия, которая характеризует такие важные аспекты клеточного метаболизма, как процесс клеточного дыхания и продукция АТФ, то есть приводит к развитию гипоксии клетки.

Апоптоз клеток эндотелия под воздействием вирусов гриппа и их поверхностных белков. Апоптоз эндотелиоцитов - ключевой момент в развитии дисфункции эндотелия. В качестве маркеров апоптоза нами были выбраны активация каспазы-3 (регистрировали иммуноцитохимически) и экспозиция фосфатидилсерина с внутреннего слоя мембраны клеток в наружный (регистрировали с помощью проточной цито-метрии).

Изучение активации каспазы-3 в клетках эндотелия под воздействием вируса гриппа и его поверхностных белков. Активация каспазы-3 была выявлена на ранней стадии заражения -0,5 - 1,5часа после воздействия вируса и не зависела от за-

ражающей дозы(0,01 ТЦД50/КЛ, 0,001 ТЦД50/кл,) и подтипа вируса. Исследуемые штаммы вируса гриппа активировали каспазу-3 уже через 30 минут после инфицирования клеток.

Поверхностные белки вирусов гриппа также активировали каспазу-3 через 30 минут после воздействия их на клетки эндотелия. Сравнительный анализ активации каспазы-3 белками показал, что при тех же сроках воздействия (0,5 - 1,5часа) минимальная концентрация ЫА, вызывавшая активацию, была в 10 раз меньшей, чем концентрация НА (0.1 мкг/мл и 1мкг/мл соответственно).

Исследование апоптоза и эндотелиальных клеток под воздействием исследуемых вирусов гриппа. Эндотелиальные клетки инфицировали исследуемыми вирусами гриппа в дозе 0,01ТЦД5о/кл и анализировали с помощью проточной цитометрии. Как видно из рисунка 5 б (правый нижний квадрат), количество аннексии V положительных клеток к 6 часам достигало 6,41% - для вируса гриппа Н51М1 по сравнению с контролем (Рис.5 а), 4,8% - для НШ1рс1т 09 и НЗЫ2,а затем снижалось и к 10 часам достигало уровня контроля (Рис.5 в).

АпУ ГЙС

2ч 4ч бч 8ч

Время, после заражения

В_____

Рисунок 5. Интенсивность апоптоза в культуре клеток EAhy926 после инфицирования исследуемыми штаммами вируса гриппа типа А.

а - доля клеток (% от общего количества анализируемых клеток) в состоянии апоптоза в контроле; б - после 6 часов культивирования с вирусом гриппа А/Курган/5/05/Ш1-81/5:3 (H5N1), заражающая доза 0,01ТЦД5о/кл; в - гистограмма, отражающая количество аннексии V положительных клеток в зависимости от времени воздействия вируса; по результатам 3-х независимых экспериментов представлены средние значения (Mis); р<0.01

Исследование апоптоза эндотелиалъных клеток под воздействием нейрами-нидазы вируса гриппа. Все NA исследуемых штаммов вируса гриппа в концентрации, равной 10 мкг/мл, вызывали экспозицию фосфатидилсерина через 4-8 часов после воздействия (Рис.6).

8 Р==!!==!== =

g 7 ЕШШШё. I ............................

Ф 6 |5 - 3 < S 3 о 4 г 1 -о ■■ I ■ NAH3N2 «NAH5N2 ■ Контроль

.Si щш

1 m L......iv.

4ч 6ч 8ч 10ч

Время, после воздействия

Рисунок 6. Изменение количества аннексии V положительных клеток в зависимости от времени воздействия NA исследуемых штаммов вируса в концентрации 10мкг/мл.

По горизонтали - время воздействия белка, по вертикали - среднее значение количества аннексии V положительных клеток (в %); представлены средние значения (M±s) по результатам 3-х независимых экспериментов, р<0.01

Исследование апоптоза эндотелиальных клеток под воздействием гемагг-лютинина вируса гриппа. Количество аннексии V положительных клеток при воздействии гемагглютинина исследуемых штаммов вируса гриппа на разных сроках воздействия (4,6,8,10 часов) и с использованием различных концентраций гемагглютинина (50 мкг/мл, 25 мкг/мл ) не превышало таковое в контроле (Рис.7 б) Как видно из рисунка 7 а НА вируса А/Санкт-Петербург/2/2009 (HlNl)pdm 09 в концентрации 50 мкг/мл через 6 часов после воздействия не вызывал появления аннексии V положительных клеток (Рис.7 а, квадрат АВ2).Аналогичная картина регистрировалась для НА вирусов подтипов H5N1 и H3N2.

1 ]

Рисунок 7. Количество аннексии V положительных клеток в зависимости от времени воздействия

' НА исследуемых штаммов вируса гриппа типа А.

а - гистограмма распределения клеток через 6 часов после воздействия НА вируса гриппа А/Санкт-' Петербург/2/2009 (HIN 1 )pdm 09; б - Количество аннексии V положительных клеток в зависимости I от времени воздействия НА исследуемых штаммов вируса в концентрации 50мкг/мл и 25мкг/мл: по I горизонтали — время воздействия белка, по вертикали - среднее значение количества аннексии V по-( ложительных клеток ( в %); представлены средние значения (M±s) по результатам 3-х независимых экспериментов, р<0.01

Таким образом, только исследуемые штаммы вируса гриппа и их нейраминидаза стимулировали апоптоз эндотелиальных клеток.

Оценка активности тканевого активатора плазминогена под влиянием исследуемых вирусов гриппа типа А и их поверхностных белков Повышение активности тканевого активатора плазминогена (t-PA) имеет большое диагностическое значение, как индикатор развития дисфункции эндотелиальных клеток, так как в норме активатор плазминогена накапливается в эндотелии и выделяется только при активации или повреждении этих клеток.

АВ4 15,at2.8 АВЗ 0.8±0.7

* Î&jC

IАВ1 83.2*2,8 АВ2 0,09*0,06

0.9 ' 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 ■ 0,2 0,1

Ш НА H5N1 50 мкг/мл Ш НА H5N1 25мкг/мл П НА H3N2 50 мкг/мл В НА H3N2 25 мкг/мл H НА H1N1pdm 50 мкг/мл □ НА H1N1pdm 25 мкг/мл ■ контроль

Активность тканевого активатора плазминогена в эндотелиальных клетках под влиянием исследуемых штаммов вируса гриппа типа А оценивали в суточном монослое клеток эндотелия ЕАЬу926 через 12, 18, 24 и 48 часов после заражения вирусами гриппа подтипов Н5Ш, НЗЫ2 и НШ1рс1т 09.

Как видно из рисунка 8, вирусы подтипов Н5Ы1 и Н1Ы1рс!т 09 стимулировали повышение активности ^РА через 12 часов после заражения - 20 мм2 для Н5Ш и 14 мм2 для НШ1рс1т 09соответственно по сравнению с контролем(10мм2).

и I

12 18 24 48 Время после заражения^

Рисунок 8. Изменение активности ^РА в культуре клеток ЕАЬу926 инфицированных исследуемыми штаммами вируса гриппа типа А (заражающая доза 0,01 ТЦЦ50Л01); р<0,05.

Затем, через 18 часов после заражения клеток вирусом, активность 1-РА снижалась до контрольных величин, а к 24 часам снова наблюдался подъем активности ^РА - 15 мм2 для Н51Ч1 и 14 мм2 для НШ1рёт 09, к 48 часам активность ^РА снижалась до уровня контроля. Несколько иная картина наблюдалась для вируса гриппа подтипа НЗЫ2 (Рис.8). Характер временных изменений активности 1-РА оставался тем же, что и для двух других исследуемых штаммов, но значения активности 1-РА через 18 и 24 часа, после заражения вирусом, были значительно больше - 17 и 26 мм2 соответствен-

Активность тканевого активатора плазминогена в эндотелиальных клетках линии ЕАЬу926 под влиянием гемагглютинина исследуемых штаммов вируса гриппа типа А Результаты воздействия гемагглютинина исследуемых штаммов вируса гриппа на активность 1-РА представлены на рисунке 9.

Рисунок 9.Изменение активности t-PA под влиянием НА вируса гриппа типа А в культуре клеток j ЕАЬу926;концентрация гемагглютинина 5 мкг/мл; р<0,05.

НА вируса гриппа А/Брисбейн/10/2007 (H3N2) и А/курица/Курган/5/05 NS1-

81/5:3(H5N1) вызывал увеличение активности t-PA только через 18 часов после воз-

2 2 действия - 14 и 13 мм" соответственно по сравнению с контролем(10мм ), к 24 часам

активность t-PA возрастала до величин - 18 и 17 мм2 , а затем снижалась к 48 часам до уровня контроля (Рис.9). НА вируса гриппа А/Санкт-Петербург/2/2009(НШ1)рс1т 09 при воздействии на культуру EAhy926 через 12 часов вызывал повышение активности t-PA до значения 17мм ; к 24 часам активность t-PA достигала максимальных значений - 22 мм2, к 48 часам активность t-PA при воздействии НА снижалась до контрольных величин (Рис.9).

Активность тканевого активатора плазминогена под влиянием гемагглютинина исследуемых штаммов вируса гриппа типа А in vivo Активность t-PA под влиянием гемагглютинина исследуемых вирусов изучали in vivo, вводя НА в дозе 50 ' мкг/кг массы тела белым беспородным лабораторным крысам и регистрируя результаты через 10 минут (Рис.10).

I 23

S 20

lí

№ 1 ¡ i i

J * hri

I Контроль Ш НА H3N2 □ НА H1N1pdm а НА H5N1

Время, ч

Рисунок Ю.Изменение активности t-PA под влиянием гемагглютининов (НА) вирусов гриппа типа А in vivo в эуглобулиновой фракции крови крыс через 10 минут после внутривенного введения НА в дозе 50мкг/кг массы тела (контроль принят за 100%); р<0,01.

Как видно из рисунка 10 НА вируса А/Санкт-Петербург/2/2009 (HlNl)pdm 09 при внутривенном введении повышал активность t-PA в 4 раза по сравнению с контролем, НА вируса А/курица/Курган/5/05 NS1-81/5:3(H5N1) - в 4,5 раза, а НА вируса А/Брисбейн/10/2007 (H3N2) - в 5 раз по сравнению с контролем.

Активность тканевого активатора плазминогена в эндотелиальных клетках линии EAhy926 под влиянием нейраминидаз штаммов А/Брисбейн/10/2007 (H3N2) и А/курица/Курган/5/05 NS1-81/5-.3 (H5N1) Изменения активности t-PA при воздействии нейраминидазы вируса гриппа подтипов H3N2 и H5N1 представлены на рисунке 11.

Рисунок 11 Изменение активности ^РА под влиянием нейраминидазы^А) вируса гриппа типа А подтипов НЗЫ2 и Н5Ы1 в культуре клеток ЕАЬу926.Концентрация нейраминидазы 5 мкг/мл, р<0,05.

Увеличение активности 1-РА регистрировалось через 12 часов после воздействия ЫА вируса гриппа А/Брисбейн/10/2007 (НЗЫ2) на клеточную культу-

ру(12мм2).Наибольшие значения активности t-PA приходились на 18 и 24 часа после воздействия (15 и 16мм2 соответственно по сравнению с контролем), к 48 часам уровень активности t-PA снижался до 12 мм2 (Рис.11).

Для NA вируса гриппа А/курица/Курган/5/05 NSl-81/5:3 (H5N1) получены сходные данные. Так, через 12 часов после воздействия активность t-PA достигала величины 11 мм2, к 18 часам - 14 мм2. Максимальное значение активности t-PA после воздействия NA - 16,25 мм2. К 48 часам следовало снижение активности t-PA до уровня контроля (Рис.11).

Активность тканевого активатора плазминогена под влиянием нейра-

минидазы исследуемых штаммов вируса гриппа типа A in vivo

Активность t-PA под влиянием NA вируса гриппа подтипа H3N2 изучали in vivo, вводя NA в дозе 50 мкг/кг массы тела белым беспородным лабораторным крысам и регистрируя результаты через 10 минут. Изменения активности t-PA представлены на рисунке 12.

Рисунок 12 Изменение активности t-PA под влиянием нейраминидазы(ТЧА) вируса гриппа типа А ' подтипа H3N2 in vivo в эуглобулиновой фракции крови крыс через 10 минут после внутривенного j введения NA в дозе 50мкг/кг массы тела (контроль принят за 100%); р<0,01.

Нейраминидаза вируса гриппа А/Брисбейн/10/2007 (H3N2), введенная внутривенно в кровь крыс, через 10 минут после введения вызывала подъем активности t-PA, превышающее контрольные значения в 3 раза (Рис.12).

Таким образом, как сами исследуемые вирусы, так и их поверхностные белки стимулировали акитивность тканевого активатора плазминогена как в культуре клеток, так и in vivo.

Сравнение последовательностей аминокислот тканевого активатора плазминогена и поверхностных белков вирусов гриппа подтипов H5N1, H3N2 и HlNlpdm 09. В структуре всех исследованных белков вируса гриппа обнаружены последовательности аминокислот, мимикрирующие последовательности аминокислот тканевого активатора плазминогена. Так, гемагглютинин вируса гриппа А/Санкт-Петербург/2/2009(Н1Ш)рс1т 09 имеет четыре аминокислотные последовательности (65-75 ак; 150-158 ак; 338-347 ак; 338-346 ак) сходных с аминокислотной последовательностью активатора плазминогена, обозначаемой как «крингл 2» и четыре аминокислотные последовательности (119-129 ак; 343-353 ак; 539-547 ак; 503512 ак) сходных с аминокислотной последовательностью активатора плазминогена, обозначаемой как домен «трипсин - подобная сериновая протеаза» - пептидаза S1. При этом процент идентичных аминокислот был достаточно значимым - от 45 до 63%, процент взаимозаменяемых аминокислот составлял от 18 до 36%.Эти данные аналогичны данным, полученным нами ранее, при сравнении первичной структуры гемагглютининов вируса гриппа H5Nln H3N2 с последовательностью аминокислот тканевого активатора плазминогена [Жилинская и др.,1996].

Аналогичную картину наблюдали и при сравнении мимикрических последовательностей в структуре нейраминидазы. Нейраминидаза вируса гриппа HlNlpdm 09 имеет три аминокислотные последовательности (324-337 ак; 355-372 ак;360-372 ак) сходные с аминокислотной последовательностью t-PA, обозначаемой как «пептидаза S1 »,четыре последовательности (248-263 ак; 229-237 ак; 250-258 ак; 280-288 ак) сходные с аминокислотной последовательностью t-PA , обозначаемой как «крингл 2» и участок аминокислотной последовательности 228-237 ак сходный по первичной структуре с участком активатора плазминогена, соответствующим эпи-дермальному фактору роста (ЭФР-домен). Эти данные аналогичны данным полученным нами ранее по сравнению первичных структур нейраминидаз вирусов гриппа H5N1h H3N2 с последовательностью аминокислот тканевого активатора плазминогена [Жилинская и др., 1996].

выводы

1).Установлено, что все три исследованные штамма вируса гриппа типа А, подтипов H3N2, H5N1 и HINlpdm 09, репродуцируются в культуре клеток эндотелия кровеносных сосудов человека. In vivo, репродукция вируса гриппа была подтверждена по наличию антигенов (НА и NP) в эндотелии аутопсийного материала легких, сердца и мозга больных, умерших в эпидемию 2009-2010гг.

2) Исследованные штаммы вируса гриппа типа А, подтипов H3N2, H5N1 и HINlpdm 09, вызывают угнетение метаболизма клеток эндотелия до 40% в первые сутки после инфицирования клеток и до 70% на вторые сутки. Воздействие поверхностных белков исследованных штаммов вируса гриппа А, (НА и NA) также приводит к снижению метаболизма клеток эндотелия. Наиболее активным белком в этом тесте является NA, которая подавляет метаболизм клеток, в среднем, на 50%, тогда как НА - на 20%.

3) Вирус гриппа типа А стимулирует активацию каспазы-3 в культуре клеток эндотелия EAhy926 на ранней стадии их инфицирования вирусом. НА и NA также стимулируют активацию каспазы-3 в клетках эндотелия. При этом NA активирует каспазу-3 в концентрации в 10 раз меньшей, чем НА.

4) Вирус гриппа типа А стимулирует появление фосфатидилсерина на поверхности клеток эндотелия EAhy926, через 2-4 часа после заражения, что выражается в появлении ранне - апоптотических аннексии V положительных клеток в количестве 6% от общего количества клеток. NA вызывала появление аннексии V положительных клеток в количестве 6%. НА вируса гриппа не вызывал появление аннексии V положительных клеток.

5) Вирус гриппа типа А вызывает двухкратное повышение активности тканевого активатора плазминогена человека (t-PA), по сравнению с контролем, в культуре эндотели-альных клеток EAhy926. НА и NA вируса гриппа также стимулируют увеличение активности t-PA in vitro и in vivo.

6) В структуре НА и NA имеются аминокислотные последовательности сходные с аминокислотными последовательностями тканевого активатора плазминогена человека - ключевого регуляторного белка гемостаза.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИИ

1. Жилинская И.Н., Ляпина Л.А., Оберган Т.Ю., Решетникова О.Ю., Шалджян A.A., Азаренок A.A., Васин A.B., Киселев О.И. Активация фибринолиза белками вирусов гриппа человека и птиц.// «Тромбоз, гемостаз, реология». -2011. - №4(48) - С.70-77. Издание ВАК

2. Жилинская И.Н., Азаренок A.A., Ильинская Е.В., Прочуханова А.Р., Воробьев C.JL, Сорокин Е.В., Царева Т.Р. Репродукция вируса гриппа в клетках эндотелия кровеносных сосудов человека.// «Вопросы вирусологии». - 2012. -т.57 №2 - С.20-23. Издание ВАК

3. Прочуханова А.Р., Азаренок A.A., Жилинская И.Н. Детекция вируса гриппа A (HINlv) в культуре клеток эндотелия и аутопсийном материале легких, сердца и головного мозга.// Материалы конференции «Молекулярная диагно- • стика 2010» Москва - 2010 - С.206-207. Издание ВАК

4. Азаренок A.A., Еропкина Е.М., Прочуханова А.Р., Шалджян A.A., Козлова Н.М., Жилинская И.Н., Козелецкая К.Н. Воздействие вирусов гриппа А и их поверхностных белков на метаболизм клеток эндотелия кровеносных сосудов человека.//«Вопросы вирусологии» - 2013 - №3 - С.25-27. Издание ВАК.

5. Азаренок A.A. Прочуханова А.Р., Зенин В.В., Люблинская О.Г., Жилинская И.Н. Способность вирусов гриппа и их поверхностных белков стимулировать апоптоз и некроз клеток эндотелия.// «Цитология». - 2013 - №6(55) - С.430-435. Издание ВАК

6. Азаренок A.A., Ляпина Л.А., Оберган Т.Ю., Харченко Е.П., Козлова Н.М., Жилинская И.Н. Изменение активности тканевого активатора плазминогена клеток эндотелия под воздействием вируса гриппа типа А и его поверхностных белков.// «Тромбоз, гемостаз, реология» - 2014 - №1 - С.70-77. Издание ВАК

7. Азаренок A.A., Прочуханова А.Р., Даниленко Д.М., Жилинская И.Н. Репродукция вируса гриппа A (HINlv) в клетках эндотелия кровеносных сосу-дов.//Материалы международной конференции «Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями» Санкт-Петербург - 20 Юг -С.44

8. Жилинская И.Н., Ляпина Л.А., Смирнова Т.Д., Азаренок A.A. Белок РВ1 - F2 вируса гриппа птиц H5N1 обладает фибринолитической активностью. //Материалы 1 Ежегодного Всероссийского конгресса по инфекционным болезням. - 2009 - т.7, приложение 1, - С.69

9. Цинзерлинг В.А., Воробьев С.Л., Зарубаев В.В., Беляевская C.B., Эсауленко Е.В., Григорьева И.В., Дедов В.А., Грудинин М.П., Бузицкая Ж.В., Елпаева Е.А., Прочуханова А.Р., Азаренок A.A., Жилинская И.Н. Патогенетические

аспекты гриппа в период эпидемии, вызванной вирусом HINlv в 2009 — 2010 г.// «Архив патологии». - 2011 - №6(13) - С.21-25

10. Grudinin М., Komissarov A., Pisareva М., Stukova М., Buzitskaya J., Elpaeva Е., Slita A., Romanovskaya - Romanko E., Azarenok A., Prochkhanova A., Kiselev O. Pandemic influenza in Russia: detection and molecular characterization of the HINlv virus. //Influenza and Other Respiratory Viruses, - 5 (Suppl.l), 395-415.

11. Азаренок A.A., Прочуханова A.P., Ильинская E.B., Зенин В.В., Люблинская О.Г., Еропкина Е.М., Жилинская И.Н..Новый аспект патогенеза гриппозной инфекции.Тезисы.// «Проблемы медицинской микологии» - 2012 - №2(14) • С. 64

12. Люблинская О.Г., Азаренок A.A., Прочуханова А.Р., Козлова Н.М., Жилинская И.Н., Исследование проницаемости мембран клеток эндотелия под воздействием вируса вируса гриппа А.// «Грипп: эпидемиология, профилактика и лечение» сборник статей и тезисов. СПб - 2011г. - С.71

13. Азаренок A.A., Еропкина Е.М., Козлова Н.М., Жилинская И.Н. Подавление дыхательной активности митохондрий под влиянием вируса гриппа типа А.// «Грипп: эпидемиология, профилактика и лечение» сборник статей и тезисов. СПб - 201 Ir-С.71

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает искреннюю и глубокую благодарность своему научному руководителю доктору биологических наук Жилинской Ирине Николаевне и всему коллективу лаборатории молекулярной вирусологии и генной инженерии в особенности Прочуха-новой А.Р. за практическую помощь на всех этапах работы. Автор выражает огромную признательность сотрудникам НИИ гриппа: Грудинину М.Г., Писаревой М.М., Шалд-жяну A.A., Ильинской Е.В., Козловой Н.М., Еропкиной Е.М., Даниленко Д.М., Слите A.B., Смирновой Т. Д., Литвинчук Л.Ф., а также сотрудникам МГУ - Ляпиной Л.А. и Оберган Т.Ю., сотрудникам ЦИН РАН - Зенину В.В. и Люблинской О.Г., сотруднику Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М.Сеченова РАН - Харченко Е.П.

Подписано в печать 27.02.14 Формат 60х84'/16 Цифровая Печ. л. 1.2 Тираж 100 Заказ 16/02 печать

Типография «Фалкон Принт» (197101, г. Санкт-Петербург, ул. Большая Пушкарская, д. 54, офис 2)

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Азаренок, Анастасия Александровна, Санкт-Петербург

ФГБУ Научно-исследовательский институт гриппа МЗ РФ

На правах рукописи

042014566X4

Азаренок Анастасия Александровна

РОЛЬ ВИРУСА ГРИППА И ЕГО ПОВЕРХНОСТНЫХ БЕЛКОВ В РАЗВИТИИ ДИСФУНКЦИИ КЛЕТОК ЭНДОТЕЛИЯ

03.02.02 - вирусология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель - доктор биологических наук Жилинская И.Н.

Санкт-Петербург 2014

СОДЕРЖАНИЕ

№ стр

ВВЕДЕНИЕ 7

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12

Глава 1. Структура вируса гриппа 13

1.1 Гемагглютинин 13

1.2 Нейраминидаза 19

1.3 Мембранный белок М2 22

1.4 Мембранный белок М1 24

1.5 Нуклеопротеин 27

1.6 РНК-зависимая-РНК-полимераза 29

1.6.1 Белок PB 1 29

1.6.2 Белок РА 32

1.6.3 Белок РВ2 34

1.7 Неструктурные белки NS1 и NS2 (NEF) 3 7

1.7.1 Неструктурный белок NS1 37

1.7.2 Неструктурный белок NS2 (NEF) 40

Глава 2 Структурно-функциональные свойства эндотелия кровеносных сосудов человека 42

2.1 Анатомо-физиологическая характеристика 42

2.2 Роль эндотелия в раннем воспалительном ответе 44

2.2.1 Адгезионные молекулы 45

2.2.2 Вазодилататоры 47

2.2.3 Вазоконстрикторы 51

2.2.4 Сосудистый эндотелий и система фибринолиза 53 Глава 3. Дисфункция эндотелия 55

3.1 Изменение секреторной активности эндотелия 56

3.2 Апоптоз эндотелиальных клеток 57

3.3 Взаимосвязь процессов апоптоза, гемостаза и воспаления 59

3.4 Вирусные инфекции и эндотелий 61

3.4.1 ДНК-содержащие вирусы 61

3.4.2 РНК-содержащие вирусы 63 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 70

1.1 Вирусы 70

1.2 Клеточные культуры 71

1.2.1 Культура эндотелиальных клеток человека линии ЕАИу926

1.2.2 Культура клеток МБСК 72

1.3 Методы оценки репродукции вируса гриппа типа А 72

1.3.1 Определение инфекционной активности вируса гриппа 72

1.3.2 Полимеразная цепная реакция 73

1.3.3 Электронная микроскопия 74

1.4 Иммуногистохимический анализ аутопсийного материала 74

1.5 Выделение поверхностные белков исследуемых вирусов гриппа типа А 75

1.6 Оценка метаболизма эндотелиальных клеток линии ЕАЬу926 с помощью МТТ-теста 76

1.7 Определение активности каспазы-3 иммуноцитохимиче-ским методом 77

1.8 Оценка жизнеспособности эндотелиальных клеток линии ЕАЬу926 78

1.9 Выявление раннеапоптотических эндотелиальных клеток линии ЕА11у926 78

1.10 Определение активности тканевого активатора плазмино- ^ гена

1.10.1

1.10.2 1.11

1.12

Глава 1. 1.1 1.2

1.3

1.4

1.4.1

1.4.2

1.4.3

Глава 2. 2.1

2.2

Определение активности тканевого активатора плаз- 79 миногена в эндотелиальных клетках линии ЕАЪу926

Определение активности тканевого активатора плаз-миногена in vivo

Компьютерный поиск сходных аминокислотных последовательностей в белках человека и вирусе гриппа

Статистическая обработка полученных данных 82

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 83

Репродукция вируса гриппа типа А в эндотелиальных клетках

Инфекционная активность исследуемых штаммов вируса гриппа в культуре клеток ЕАЬу926

Выявление РНК, исследуемых штаммов вируса, в культуре клеток ЕАЬу926 с помощью ПЦР Выявление вирусных частиц исследуемых штаммов вируса, в культуре клеток ЕАЬу926 электронно-микроскопическим методом

Иммуногистоцитохимическое исследование аутопсийно-го материала от больных, умерших в эпидемию гриппа 2009-2010 гг.

Иммуногистохимический анализ аутопсийного материала легких

Иммуногистохимический анализ аутопсийного материала мозга

Иммуногистохимический анализ аутопсийного материала сердца

83 83 85

Дисфункция клеток эндотелия при воздействии ис- ^ следуемых вирусов гриппа и их поверхностных белков

Электронно-микроскопический анализ морфологии клеточной культуры эндотелия, инфицированной вирусом 94 гриппа

Изменение метаболизма эндотелиальных клеток линии ЕА11у926 при воздействии исследуемых штаммов вируса гриппа типа А и его поверхностных белков д7

104

105

2.2.1 Изменение метаболизма эндотелиальных клеток линии ЕАЬу926 при воздействии исследуемых штаммов вируса гриппа типа А 97

2.2.2 Изменение метаболизма клеток эндотелия при воздействии гемагглютинина исследуемых штаммов вируса гриппа 99

2.2.3 Изменение метаболизма клеток эндотелия при воздействии нейраминидазы вируса гриппа А/Брисбейн/10/2007 (НЗЫ2) и А/курица/Курган/5/05 К81-81/5:3(Н5Ш) 102

2.3 Апоптоз клеток эндотелия под воздействием вируса

гриппа типа А и его поверхностных белков

2.3.1 Активация каспазы-3 в клетках эндотелия под воздействием исследуемых штаммов вируса гриппа и его поверхностных белков 104

2.3.1.1 Активация каспазы-3 в клетках эндотелия под воздействием исследуемых штаммов вируса гриппа

2.3.1.2 Активация каспазы-3 в клетках эндотелия под воздействием поверхностных белков исследуемых штаммов вируса гриппа 107

2.3.2 Оценка жизнеспособности эндотелиальных клеток линии ЕАЬу926 под воздействием вируса гриппа типа А

и его поверхностных белков 108

2.3.2.1 Оценка жизнеспособности эндотелиальных клеток линии ЕАЬу926 под воздействием исследуемых штаммов вируса гриппа типа А. 108

2.3.2.2 Оценка жизнеспособности эндотелиальных клеток линии ЕАЬу926 под воздействием гемагглютинина исследуемых штаммов вируса гриппа 110

2.3.2.3 Оценка жизнеспособности эндотелиальных клеток линии ЕА11у926 при воздействии нейраминидазы исследуемых штаммов вируса гриппа 111

2.3.3 Выявление аннексии V положительных клеток в культуре клеток эндотелия ЕА11у926 под воздействием вируса гриппа типа А и его поверхностных белков 114

2.3.3.1 Выявление аннексии V положительных клеток при инфицировании клеток ЕАЬу926 исследуемыми штаммами вируса гриппа 114

2.3.3.2 Выявление аннексии V положительных клеток при воздействии на клетки ЕАЪу926 нейраминидазы вируса гриппа типа А подтипов НЗЫ2 и Н5Ш

2.3.3.4 Выявление аннексии V положительных клеток при

воздействии на клетки EAhy926 гемагглютинина ^ ^ исследуемых штаммов вируса гриппа

2.4 Оценка активности тканевого активатора плазминогена под влиянием вируса гриппа типа А и его поверхностных белков 120

2.4.1 Оценка активности тканевого активатора плазминогена в эндотелиальных клетках линии EAhy926 под влиянием исследуемых штаммов вируса гриппа типа А 120

2.4.2 Оценка активности t-PA в эндотелиальных клетках EAhy926 под влиянием гемагглютинина исследуемых 121 штаммов вируса гриппа

2.4.3 Оценка активности t-PA под влиянием гемагглютинина исследуемых штаммов вируса гриппа in vivo

2.4.4 Оценка активности t-PA в эндотелиальных клетках EAhy926 под влиянием нейраминидазы вирусов А/Брисбейн/10/2007 (H3N2) и А/курица/Курган/5/05 123 NSl-81/5:3 (H5N1)

2.4.5 Оценка активности t-PA под влиянием нейраминидазы вируса А/Брисбейн/10/2007 (H3N2) in vivo

2.5 Сравнение последовательностей аминокислот тканевого активатора плазминогена и поверхностных белков вирусов гриппа подтипов H5N1, H3N2 и HlNlpdm 09. 125 ОБСУЖДЕНИЕ 134

ВЫВОДЫ 146

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК 148

124

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Грипп представляет собой инфекцию, занимающую доминирующее положение в структуре инфекционной заболеваемости, как по числу случаев заболевания, так и по наносимому экономическому ущербу. Однако, несмотря на интенсивное изучение возбудителя этой инфекции с момента его открытия и до наших дней, патогенез гриппа остается предметом интереса большого числа исследователей. Это связано в первую очередь с установленным фактом, что вирус гриппа вызывает не только нарушения дыхательной системы, но и поражает нервную систему, кишечник, а также вызывает изменения в системе гемостаза [3, 11]. Механизм этих множественных нарушений при гриппе до сих пор невыяснен. Взаимосвязь гриппозной инфекции и нарушений гемостаза клиницисты отмечали еще в 60-е года прошлого века [39]. Подтверждением этой взаимосвязи явилась эпидемия 2009-2011 гг., во время которой наблюдались тяжелые осложнения в виде энцефалопатий и тромбогеморрагических пневмоний, ключевым моментом в развитии которых явилось повреждение эндотелия кровеносных сосудов вирусом гриппа [7, 26]. Кроме того, эпидемиологические данные также указывают на то, что имеется корреляция между ежегодными эпидемиями гриппа и ростом числа больных, страдающих сердечно-сосудистыми заболеваниями [168; 3; 143; 162; 89; 310]. Так как среди причин развития сердечно-сосудистых заболеваний дисфункция эндотелия занимает одно из первых мест, то можно предполагать, что в случае подтверждения способности вируса гриппа поражать эндотелий кровеносных сосудов человека, гриппозная инфекция может представлять угрозу возникновения сердечно-сосудистой патологии. Поэтому, представляло интерес выяснить, влияет ли гриппозная инфекция на развитие дисфункции эндотелия.

Эндотелий кровеносных сосудов в настоящее время рассматривается не просто как барьер между кровью и окружающими тканями, но как диффузный эндокринный орган, пронизывающий все системы организма [6]. Основной функцией эндотелия является поддержание гемостаза, то есть непрерывного тока крови, но кроме этого клетки эндотелия участвуют в процессах воспаления, ангиогенеза

и т.д [128; 6; 27]. В связи с этим эндотелий оказывается мишенью для большинства патогенов, как бактериальных, так и вирусных. Большое число исследований посвящено воздействию на эндотелиальные клетки таких вирусов, как вирус иммунодефицита, цитомегаловирус, вирусы-возбудители геморрагических лихорадок [212; 154]. На этом фоне количество работ, посвященных влиянию вируса гриппа и его белков на клетки эндотелия, крайне незначительно и проведение подобных исследований при изучении патогенеза гриппозной инфекции представляется актуальным. Фундаментальные исследования по изучению механизмов взаимодействия вируса гриппа с клетками эндотелия в России не проводятся. Имеется ряд сообщений о патоморфологических исследованиях клеток эндотелия при гриппозной инфекции [32, 7, 26], а также клинические исследования, касающиеся терапии ДВС-синдрома и геморрагических пневмоний при гриппе [Рогано-ва, 2009]. Монографий на данную тему, а также защищенных кандидатских и докторских диссертаций не имеется. В основе работы лежат данные, полученные доктором биологических наук Жилинской И.Н. (сотрудником ФГБУ НИИ гриппа МЗ РФ) - докторская диссертация «Роль вирусных белков в патогенезе гриппозной инфекции», 2003 год.

Цель и задачи исследования. Целью работы было показать возможность репродукции вируса гриппа в клетках эндотелия сосудов человека и выявить роль вируса гриппа и его поверхностных белков - гемагглютинина и нейраминидазы -в развитии дисфункции эндотелиальных клеток.

Для достижения поставленной цели планировалось решить следующие задачи:

1). Выявить особенности репродукции эпидемически актуальных штаммов вируса гриппа человека и птиц в культуре клеток эндотелия человека ЕАЬу926.

3) Выяснить воздействие эпидемически актуальных штаммов вируса гриппа и его поверхностных белков на апоптоз клеток эндотелия.

Научная новизна работы. Доказано, что вирус гриппа способен репродуцироваться в клетках эндотелия человека in vitro (на модели клеточной культуры EAhy926). На модели клеточной культуры репродукция вируса гриппа была зарегистрирована вирусологическим, молекулярно-биологическим и электронно-микроскопическим методами, а также была подтверждена при изучении аутоп-сийного материала легких, мозга и сердца.

Развитие апоптоза было подтверждено данными по активации каспазы-3 и регистрации аннексии V положительных апоптотических клеток. Впервые было показано, что вирус гриппа типа А вызывает активацию каспазы-3 в эндотелиаль-ных клетках через 30 минут после их инфицирования. Аналогичные данные получены и для поверхностных белков исследуемых вирусов - гемагглютинина и ней-раминидазы. Исследуемые штаммы вируса гриппа и их поверхностный белок нейраминидаза вызывали развитие апоптоза на ранних сроках воздействия (4-8часов), что регистрировалось по появлению аннексии V положительных клеток (6% от общего числа клеток). При изучении воздействия другого поверхностного белка - гемагглютинина - было показано, что, несмотря на активацию каспазы-3, гемагглютинин вируса гриппа вызывает гибель эндотелиальных клеток только по некротическому пути.

Теоретическая и практическая значимость работы. Возможность репродукции вируса гриппа типа А в клетках эндотелия человека как in vitro, так и in vivo имеет большое значение для практической медицины, так как открывает новый аспект патогенеза гриппозной инфекции. Показано, что репродукция вируса гриппа приводит к изменению морфологии клеток эндотелия, к угнетению метаболизма, развитию апоптоза и активации тканевого активатора плазминогена. Все перечисленные критерии указывают на то, что гриппозная инфекция приводит к прямому повреждению эндотелиальных клеток, которое выражается в развитии дисфункции. Все эти данные согласуются с клинической картиной при гриппозной инфекции.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Вирус гриппа типа А способен репродуцироваться в клетках эндотелия кровеносной системы человека.

2. Вирус гриппа типа А и его поверхностные белки вызывают дисфункцию эндотелиальных клеток, которая выражается:

а) в развитии апоптоза.

б) в угнетении метаболизма эндотелиальных клеток;

в) в активации процесса фибринолиза путем увеличения активности тканевого активатора плазминогена.

3. Поверхностные белки вируса гриппа типа А - гемагглютинин и нейрами-нидаза - также вызывают развитие дисфункции эндотелия по тем же параметрам, что и цельный вирус гриппа.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, из них - 6 статей в журналах, рекомендованных ВАК.

Основные результаты, изложенные в диссертации, получены в соавторстве с Жилинской И.Н., Прочухановой А.Р., Ильинской Е.В., Сироткиным А.Н., Козловой Н.М., Еропкиной Е.М., Царевой Т.Р. и Сорокиным Е.В. - сотрудниками ФГБУ НИИ гриппа РАМН МЗ РФ; Ляпиной Л. А. и Оберган Т.Ю. - сотрудниками кафедры защитных систем крови МГУ, Москва; Харченко Е.П. - сотрудником Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М.Сеченова РАН; Люблинской О.Г. и Зениным - сотрудниками Института цитологии РАН.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Согласно современным данным, большинство вирусов способны поражать клетки эндотелия кровеносных сосудов хозяина. К ним относятся как ДНК-, так и РНК-содержащие вирусы, такие как герпесвирусы, вирусы гепатита В и С,

Информация о работе

Азаренок, Анастасия Александровна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2014
ВАК 03.02.02

Диссертация

Роль вируса гриппа и его поверхностных белков в развитии дисфункции клеток эндотелия - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы