Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительная характеристика структурно-функциональных изменений органов и тканей мышей с врожденной патологией, индуцированной инактивированным и инфекционным вирусом гриппа

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Сравнительная характеристика структурно-функциональных изменений органов и тканей мышей с врожденной патологией, индуцированной инактивированным и инфекционным вирусом гриппа"

российская академия МЕДИЦИНСКИХ НАУК ИНСТИТУТ ПОЛИОМИЕЛИТА И ВИРУСНЫХ ЭНЦЕФАЛИТОВ

На правах рукописи

РГ6 од

1 3 !

быковская Светлана Ивановна

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ИЗМЕНЕНИИ ОРГАНОВ И ТКАНЕЙ КЫШЕИ С ВРОЖДЕННОЙ ПАТОЛОГИЕЙ, ЩЩУЩРОВАННОИ ИНАКТИВИРОВАИНЫН И ИНФЕКЦИОННЫМ ВИРУСОМ ГРИППА

ОЗ. 00. Об -• ВИРУСОЛОГИЯ

•АВТОРЕФЕРАТ

диссертации'на соискание ученой степени кандидата биологических наук

НОСКВА - 1995

РАБОТА ВЫПОЛНЕНА В НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКОМ ИНСТИТУТЕ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И НИКРОБИОЛОГИЙ Ш. Н. Ф. ГАНАЛЕИ РАИН

Научные руководители:

- действительный член РАЕН, доктор медицинских наук, профессор В. А. ЗУЕВ, доктор медицинских наук А. К. Харитонова

Официальные оппонента: доктор медицинских наук'н. В. Логинова

доктор биологических наук Н. Б. Королев

Ведлаая организация - Государственный научно-исследовательский

институт стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов нк. /1. А. Тарасевича

Зашита состоится 1995 года в часов

на заседании специализированного совета Л. 001. 27.01 при Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов РАЕН (142782. кос-ковская область, п/о Институт полиомиелита к вирусных энцефалитов)

С диссертацией нохно ознакомится в библиотеке института полиомиелита и вирусных энцефалитов РАНН.

Автореферат разослан " ¿0 " ___ 1995 года.

Ученый секретарь специализированного совета

0. А. Кедведкина

В последние годы в ряду возбудителей врожденных вирусных инфекций, характеризующихся чертами медленного инфекционного процесса. оказались вирусы простого герпеса, цитомегалии. аденовирусы, вирус гепатита В, вирус гриппа и др. /В. И. Вотяков, 1987; В. А. Зуев 1988/..

Особый интерес представляет собой вирус гриппа в связи с постепенный накоплением клкническчх и экспериментальных данных о роли вируса гриппа в патологии плода и новорожденного. /Р. А. Хон-торович. 1987/.

Авторы, изучавшие недленные инФекщта, высказывали весьма разноречивые суждения о происхождении характерных поражений органов и тканей. Нногие связывали это с процессами внутриклеточной репродукции вируса, заканчивавшейся разрушением клетки, либо с Формированием воспалительного процесса или иммунной реакцией. /В. И. Вотяков, 1987; В. А. Зуев 1988/.

* Вместе с тем, в последние годы накапливается все больаее количество Фактов; свидетельствующих о том. что повреждение вируса-ни клеток й тканей может осуществляться действием поверхностных вирусных структур, не требуя при этом вирусной репродухдии.

Следует подчеркнуть, что идея токсического действия вируса / как раз на примере'вируса гриппа/ была высказана и получила первое экспериментальное обоснование сорок лет назад /Л.Я. Закстель-ская 1953/. Позднее было показано, что введение дезентегрирован-ных озвучиванием инфекционных частиц вируса гриппа может вызывать у нышей гистологические изменения, сходные с таковыми в результате введения живого вируса. / н.Каго, 1961/.

Наконец, сравнительно недавно установлена способность неин-Фекциониого для мышей штамма вируса гепатита В индуцировать у них церебральные и печеночные поражения без доказательств вирусного размножения. / Н.Шо. 1961/.

Способность вирионов повреждать клетки без процесса репро-гукции свойственна и некоторый другим вирусан., Она особенно подробно изучена у парамиксовирусов, а недавно описана и для вируса тнунодеФицита человека. /В. И. Покровский, в. В. Покровский, 1988,

Л. А. Печатников. 1992/.

С номента зарождения проблейы медленных вирусных инфекций опреде'ляюшло роль в успешном ее развитии сыграли и продолжают играть морфологические исследования. Именно норфологический критерий позволил выяснить основные особенности патогенеза многих медленных вирусных инфекций и до сих пор остается единственным, возводящим верифицировать медленную вирусную инфекцию любой этиологии. /В. Д. Тимаков и В. А. Зуев. 1977; В. А. Зуев. 1988;/. Высказанное положение в особой степени

Отсюда понятно значение морфологического анализа органов и тканей, особенно при изучении новых Форм инфекционного процесса, вызываемого уже. известными возбудителями.

В 197Т г. лаборатории микробиологии латентных инфекций НИЭН ин. Н. Ф. Гамалеи была впервые описана медленная гриппозная инфекция у кышей. родившихся от санок, зараженных вирусом гриппа во время беременности. /В. А. Зуев Е. П. Нирчинк. А. М. Харитонова, открытие Н 383 1990/.

Открытие этой необычной для вируса гриппа новой Формы инфекционного процесса оказалось возможный, благодаря многолетнему изучению трупов больных животных.

С поношыо различных нетодов исследования установлении необычные поражения органов и тканей, характеризующиеся первично-дегенеративным характером их повреждения , а также развитием ГУбко-образного состояния в белом веществе головного и спинного нозга. /А. Н. Харитонова, 1991/.

Позднее патология, столь характерная для медленной гриппозной инфекции, была обнаружена у потомства мышей, родившихся от санок, которым во время беременности внутривенно был введен инак-тивированный (неинфекционный! вирус гриппа, ный) вирус гриппа /Е. Л. Норозова В. А. Зуев , А. и: Харитонова, 1986/.

Цель и задачи исследования: В связи с вышеизложенным цель» работы является специальное изучение характера структурно - функциональных изменений в органах и тканях кышей, родившихся от са-

цок, который в период беременности однократно внутривенно вводили кнактивированшй исрус гриппа.

В соответствии с поставленной цель» в задачи исследования входило:

1. Изучение влияния инактивированного вируса гриппа на патологию беременности и потомства у шаей.

2. Патонорфологическое исследование органов и тканей потомства иьией с врожденной патологией. индуцированной кнактивкроваа-нш бйрусон гриппа.

3. Сравнительный качественный и количественный анализ пораженных органов и тканей у потомства шлей при врожденной патоло-гшг, индуцированной йнактивированнш и инфекционным вирусом гриппа.

Научная новизна и практическая ценность: Впервые экспериментально исследован один из важнейших механизмов повреждающего действия вируса гриппа на клетки органов и тканей организма в процессе Формирования медленной гриппозной кнФекдии. При этом установлено, что внутривенное 'введение инактивированного вируса гриппа беременным животнын приводит к патологии беременности и ' снижению плодовитости за счет гибели плодов.

• Среди родившегося потонства, с высокой частотой наблюдается Формирование патологического процесса, клинически сходного с та-' ковш при медленной гриппозной инфекции, развивающейся у потомства мышей, родившихся от сакок, зараженных интраназально в период беременности ияфеюшшкн* вирусом гриппа.

Сопоставление и количественный анализ пато-гистологических изменений в органах и тканях нызат пол действием как инфекционного, так и инактивированного вируса гриппа выявило их абсолютную идентичность и позволило рассматривать повреждающее действие вируса как результат реализации биологической активности его поверхностных структур, что и было впоследствии подтверждено опытами с вирусспецифической нейраниаидазой.

Работа носит теоретический характер, однако» полученные ре-

зультаты обосновывают целесообразность "антинейрамшидазкого" направления в экспериментальной разработке схен и нетсдов лечения медленной гриппозной инфекции.

Основные положения, выносикие на защиту:

1. Внутривенное введение беременный мкааи инактивированного вируса гриппа вызывает у потомства развитие патологического процесса, клинически и пато-гистологически сходного с таковын при медленной гриппозной инфекции.

2. Возмохность внутривенного введения различных, в том числе и высоких концентраций инактивированного вируса гриппа беременным санкам, мышей позволяет количественно исследовать повреждавшее действие вируса на клетки органов®и тканей и. тем самым, экспериментально моделировать первично-дегенеративные процессы, характерные для медленной гриппозной инфекции.

3. Наиболее глубокие деструктивные изменения ннактивирован-ный вирус гриппа вызывает в центральной нервной системе ( спонги-озная энцефалопатия ), а также тяжелые изменения в иммунокомпе-тентных органах ( особенно в тимусе ).

4. Неханизн повреждающего действия вируса при медленной гриппозной инфекции обусловлен токсической активностью поверхностных структур вириона и главным образом вирусной нейрамияида-зой.

Апробация работы: Натериалы диссертации докладывались на заседании Ученого совета НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи РАНН (1988г.), на научной конференции отдела медицинской микробиологии ШШЭН ин. Н. Ф. Гамалеи РАНН ( 1990 г.), ( 1994 г.), на международном симпозиуме " 100 Years of virology " ( 1992 г.).

публикации: По теме диссертации опубликовано 4 печатных работ.

Обьен и структура работа: Работа изложена на 126 страницах машинописного текста, иллюстри>ована25 рисунками с 61 фотографией и 2 таблицами.

Библиографический указатель включает 128 наименований работ

- 5 -

отечественных и зарубежных авторов.

Диссертационная работа состоит из введения. 2-х глав обзора литературы. 3-х глав собственных экспериментальных исследований, обсуждения . выводов и списка цитированной литературы.

Настоящая- работа проведена в ранках программы ГКНТ 069706 и вш'триинститугской програнны "Персистенция микроорганизмов и патология

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ КАТЕРИАЛН й НЕТОДЫ

1 Животные. В экспериментах использовали ншей линии C57BL/6 . и колонии CHX йолученных из .питомников * Светлые горы " и •Столбцовая" РАНН, а так же полученное от них потомство.

Б работе с вирусами использовали 9-дневные куриные эмбрионы.

2 Вирусы. В работе использовали аллантоисный и адаптированный* к мышам препарат вируса гриппа А /НШ/ штамм VSN, а так же вирусы PR8 /Н1Ш и Alchi Я13Н2/. Нмшшый препарат вируса поддерживали интраназальнын заражением мышей линии C57BL/B и колон-нии СНК /весон ю-12 грани/.

Супернатант полученный от мышей использовали в качестве ви-руссодержалего материала.

Для получение инактивированного вируса вирус содержащую ал- • лаятоисняэ жидкость очшали по общепринятой нетодике полученный вирус подвергали облучению дозой 1,8 Ирад на гамма установке •Исследователь*.

3 Вирусологические методы, каждый препарат вируса гриппа после облучения испытывали на ннфекдионвость. гемаглютинируюшу» и нейракинидазную активность.

В работе использовали препараты вируса со следующими характеристиками:

8.0 9.0

- инфекционный титр -ю - ю ■> эид 50/мл

- б -

5.0 6.0 -10 - 10 ЛД 50/НЛ - титр гемаглютикинов /Г. А. / -1: 512 - 1:1024 облученный вирусный препарат

- инФекяионный титр

- титр гемаглютининов

- титр нейраминидазы

О

-1:128 - 1:1021 -1:64 -1:128

Определение гемагглютинируюшей и нейранинидазкой активности проводили по общепринятой методике.

Среды. Для вирусологических исследований использовали стандартные растворы Хенкса. Эрла. ТЕБ-буфера /рн = 7,2/. среду 199.

4 норфологнческие методы, для морфологического изучения были взяты головной и спиной мозг, гипофиз,щитовидная железа, тимус, селезенка, лимфотические узлы, надпочечник, семенник или яичник, сердце, легкие .печень и почки. Ероне зтого гипофиз, тимус и семенники Фиксировали глютар-альдегидон и заливали в зпон для электронной микроскопии. Органы животных взвешивали. Фиксировали в различных жидкостях /Корн/а, Буэна. сулеме-Форноле. 7 Формалине /. обезвоживали в спиртах восходяшей концентрации и заливали в парафин. Для избежания артефактов при заливке головного и сникого мозга в парафин применяли метод заливки в целлуидин. Для гистологических исследований срезы окрашивали гематоксилином и эозином, а также по методам В. Ф. найоровой. Ниссля и ван-Гизон; Для морфометрических исследований азурон-П и эозином. .

5 норфометрические методы. Для определения клеточной кинетики метбдон морфометрии были взяты тимусы, селезенки и лимфотические узлы. Органы взвешивали и готовили гистологические препараты При морфометрии препаратов использовали сетку Автандилова для подсчета плошади функциональных зон; эту же сетку, лишенную точек, применяли в качестве ограничителя поля зрения для определения плотности клеток. Определяли также относительную плошадь раз-

летных функциональных зон /S/ и плотность клеток на I нн /Р/.

6. гистохимические методы. Определение активности окислительно- востановительных и лизосомалышх Ферментов проводили на свежезамороженных или Фиксированных в карбол-форналине срезах подученных на зайораживашен микротоме Фирмы " Рейхарт *. Были использованы следующие методы : Нахлоса, Гскори- и Фишера.

7. Электронно-ншсроскопические методы, для электронно-микроскопического изучения тинуса. гнпоФнзы и семенники мышей Фикси-

. ровали 2 часа в i,5z растворе глютар-альдегида я 16 часов в U растворе четырех-окиси оскня. После обезвоживания кусочда-органа заключали в аралдит. Срезы готовили на микротоке LEB 8300 и просматривали на электронном микроскопе -JEH 100 В при ускорявшем напряжении 80 SV.

8. статичтичекие методы.

. 1. Титры вирусов эид н ЛД вычисляли по методу Reed 50 50

Huench.

г. Достоверность числовых результатов оценивали по критерию Стыодента.

3. При статистачекой обработке данных норфонетрии применяли кепараметрический критерий Уилкинсона- Нана-Уитни.

Достоверным сиитали различия, начиная с р< 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЯ

ИНДУЫШЯ ИНАКТИВИРОВАННБМ ВИРУСОМ ГРИППА ВР02ДЕШЮЙ ПАТОЛОГИИ й ПАТОЛОГИЯ БЕРЕМЕННОСТИ У НЫ1ЕН.

* в 1977 году в нашей лаборатории была впервые опи сана медленная гриппозная инфекция у шлей, родившихся от санок, зараженных вирусом гриппа во время берененности.

С помошью различных методов исследования /морфологических, морфометрических, эдектронноникроскопических и др. / были об-

- с - •

наряжены структурные изменения нейронов и губкообразные очаги в сером и белом веиестве головного и* спинного нозга. Позднее патология, столь характерная для медленной гриппозной инфекции, была обнаружена у потомства мышей, родившихся от санок, которым во время беременности внутривенно был введен инактивированннй (неинфекционный) вирус гриппа.

с этой целью суспензию вируса гриппа А кнактивировали на гамма-установке "Иследователь дозой 1,8 Негорад ..

Избранный режим облучения полностью лишал вирус инфекдкон-ности, практически не влияя на уровень генагглютинирушей и ней-раминидазной активностей. Полученный препарат кнактивнрованпого вируса по о, 5 - 1.0 мл вводили однократно внутривенно интактнын самкам линии С57ВЬ/б или аутбредныи самхан колонки Ж.

Штат, рожденных от этих санок, регулярно взвешивали к наблюдали в течении 4 - месяцев.

В полученных пометах регистрировали от 65 до 83 г особей с признаками медленно прогрессирующей патологии.

Клинически такая патология впервые обнаруживалась через 5-7 дней после рождения. У таких нышат наблюдали признаки отставания в нассе тела и росте, которые к концу их жизни не редко достигали 2-.3- кратных величин. Так, если среднее значение нассы тела у здоровых сибсов соответствовало 18.0 -21.5 г. то у шпат с патологией зта величина колебалась от 5,3 до 7.9 г.

Нышата в ранние сроки жизни отличались повышенной возбудимостью, у них наблюдалось учашенное дыхание, иногда сопровождаемое судорогами, нарушение походки выявлялось в ранние сроки - уже на 10-12 -й день, в дальнейшем походка становилась шаткой, нарушалась' координация движений. У животных развивалась кахексия и в возрасте 1.5-2 месяцев они погибали.

Использование генетически различных животных позволило выявить неодинаковую частоту появления у них в пометах потонства с описанными признаками тяжелой патологий. Так. если в понетах нашей колонии БНК частота такой патологии колебалась от 2,4 до 28

7., то в пометах мышей линии C57BL/6 она достигала 65-75 или даже 83 '/..

Внесте с тем частота патологии в неныпей степени зависила от штаммовой принадлежности вируса, хотя штамн вируса PR 8/Н1Н1/. по-видимону, -ножет представлять собой некоторое исключение, учитывая высокий процент поражения потомства у мышей колонии SHX.

Патогистологические изменения в организме таких ншей резко отличались от наблюдавшихся при острой гриппозной инфекции. V животных, рожденных от санок, получавших инъекцию инактивированного вируса гриппа, прежде всего обращало на себя внинание отсутствие признаков* воспалительного процесса и наличие первично-дегенеративных изменений, Особенно резко выраженных в ЕНС, инмунокомпе-тентных органах и в эндокринной систене.

•Для выяснения механизма деястшю штт&тфШППШ ЩШ гриппа, в часности установление роли поверхностных структур вири-она, активность которых сохранялась при облучении были поставлены следующие опыты.

Берененнын самкан 'Внутривенно вводили:

а) нейранинидазу полученную из холерного вибриона.

б) коммерческую нейранинидазу Фирмы СИГНА.

в) нейранинидазу полученную из вируса гриппа А штамн VSH (Н1Н1) (институт . вирусологии РАМН, Т. А. Буссе.)

Нейранинидазу растворяли в аллантоисной жидкости и вводили внутривенно по о, 5нл. Потомство с признаками тяжелой патологии и характерной паталогоанатомической картиной было обнаружено только при введении беременным самкан нейраминидазы, полученной из вируса гриппа А. > '

- Понимо развития у потомства медленно прогрессирующего патологического процесса нани были отмечены также признаки патологии берененности у самок, которым вводили инактивированный вирус, а именно, снижение плодовитости и повышение гибели плодов.

Для изучения влияния полученного препарата на плодовитость кышей были поставлены следующие опыта:

10 санкан колонии БНК на 3-й деделе беременности внутривенно вводили по 1.0 мл живого вируса гриппа А штамм иэн. Контрольным животным вводили по 1,0 мл аллантоисной жидкости, через 24 часа животных выводили из опыта эфиром, вскрывали и подсчитывали число живых и мертвых плодов у каждой самки. V контрольных животных количество живых плодов составляло 9вх, в то время как у опытных лишь 65'/..

Влияние инактивкрованного вируса на потомство было установлено во второй опыте поставленном по той же схеме.

10 самкам колонии ЭНК вводили в той же дозе однократно внутривенно инактивированный вирус на 3-й неделе беременности. Контролем служили ю санок, которым внутривенно вводили нормальную аллантоисную жидкость. По количеству плодов было установлено, что инактивированный вирус гриппа на зох снижает плодовитость животных.

ПАТОНОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ОРГАНОВ И ТКАНЕЙ У НШЕИ С ВРОХДЕННОЯ ПАТОЛОГИЕЙ. ИНДУЦИРОВАННОЙ ИНАКТИВКРОВАННШ ВИРУСОМ ГРИППА.

Детальный морфологический анализ, проведенный с помошыо различных методов исследования, позволил выявить весна важные общие патологические закономерности, возникающие в организме мышат рожденных от санок получавших инактивированный вирус.

Нами установлена, что наиболее серьезные деструктивные изменения развиваются в Центральной Нервной систене. они выражались ввиде спонгиозноя энцефалопатии достигающей наибольшей выраженности гипоталанусе и стволовых отделах головного нозга. а также гиперхронатозе, пикнозе нейронов и очаги выпадения их в коре и нозжечке.

Помимо этого в белой веществе головного и спинного мозга ннело несто снижение компактности ткани нозга и появление крупных вакуолей.

- и -

Весна важное значение имеет Факт обнаружения нани тяжелых деструктивных поражений нейронов в паравентрикулярнон, аркуатном и вентро-медиальном ядрах, которые представляют' собой адреногипо-Физотропную зону гипоталамуса, где вырабатываются пусковые Факторы регулирующие гормонопоэз передней доли гипофиза.

Изненение гормонопоэза гипофиза, который вырабатывает горно-ны регулирующие действие всех эндокринных желез, подтверждается поражениями обнаруженными нами в так называемых "железах мишенях" (в щитовидной железе, надпочечниках, семенниках и яичниках). Так в щитовидной железе при микроскопическом исследовании обнаруженна гидропическая дистрофия Фолликулярного эпителия, а в семминиках и яичниках нарушение спериатогинеза и овогинеза.

Весьма характерные изменения были обнаружены в иммунокомпе-тентных органах подопытных животных. В отдельных случаях преиму-иественно у иыяат, выведенных из опыта в агональнон состоянии, отмечалось резкое уменьшение массы тимуса, отек капсулы н полнокровие ее. ткань тимуса на разрезе была серо-розового' цвета, дольчатое строение было плохо выражено.

Наиболее выраженные изменения в тинусе обнаруживались у животных. выведенных из опыта на бо-я день, а именно: капсула тину-са не выявлялась. Опорные ретикулоэпителиальные клетки,, составляющие каркас тимуса, подвергались лизису, лишь среди жировой ткани были видны кучки свободно лежащих измененных лимфоцитов.

При макроскопическом обследовании селезенки этих животных отмечалось также резкое уменьшение разнеров и массы этого органа и лимфатических узлов, на разрезе не был виден Фолликулярный аппарат, пульпа не давала соскоба.

При микроскопии окрашенных срезов.обращало на себя внимание резкое нарушение структуры селезенки. ЛинФоидные фолликулы среди <расной пульпы не обнаруживались. -Герменативные центра также не зыли видны, отсутствовала накрофагальная реакция.

В красной пульпе селезенки обраиало на себя внимание резкое гвеличенне количества бластных форм, преимущественно за счет не-

Г 12 -

гакариогоггов, а также увеличение количества плазнатических кле-. ток, капсула селезенки выглядела бледной, слабо окрагсенной эози-" нон, реакция бласттрансфорнации вокруг трабекул селезенки также отсутствовала.

При гистохимическом изучение тинусов и селезенок нышат, родившихся от самок, инъецированных инактивированным вирусом гриппа. было установлено значительное уменьшение активности лизосо-нальных Ферментов кислой фос фатазы и В - глюкоронидазы активность которых выявлялась,в ретикуло-эпителиальных клетках и нак- . ■ роФагах тимуса и селезенки.

Электро-никроскопическое изучение тинуса позволило выявить тонкие ультраструктурные изменения в различных клеточных элементах коры и мозгового вешества тимуса.

Анализ полненных результатов показывает, что эти нарушения инеют определенную закономерность, которую можно рассматривать как динанику развития патологического процесса в органе пр» введении инактивированного вируса гриппа.

Отмечено, что в первую очередь реагируют структуры гистоге-матотических барьеров и сосуды мозгового слоя.так как в них обнаруживаются серьезные деструктивные изменения, а именно- набухание и резкая вакуолизация эндотелиальной выстилки, кроме того, в эндотелии капилляров, покимо различной величины вакуолей, обнаружено большое количество иикропиноцитозных пузырьков, что указывает на резкое повышение пронидаености эндотелия.

Поражение этих' систек возникавшие возножно в пренатальном периоде йРй трасплацентарнон прникновении инактивированного вируса. после введения его беременным сайкам приводит к глубочайшим сдвиган в линфоидной системе плода, что способствует развитию ин-нунодифщшта приводящего животное к гибели.. Следует подчеркнуть, что не смотря на тщательное изучение изменений, возникающих во внутренних органах нышат. рожденных от самок получавших инактиви-рованный вирус ни в одном случае не было обнаружено воспалительных изменений, •

В почках наблюдалась только белковая дистрофия эпителия извитых канальцев, а в печени среди гепатодитов встречались очаги кроветворения расположедные главным образон по ходу сосудов.

Сходство клинических и патапогоанатомяческих признаков у ны-иат с медленной гриппозной инФекаией и животных рожденных от санок получавших ^активированный вирус гриппа заставило нас дополнительно провести сравнительное изучение наиболее выраженных параметров характеризующих этот процесс.

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ПАТОЛОГИИ, РАЗВИВАШЕИСЯ У ПОТОМСТТВЛ ИЫБЕИ ПРИ МЕДЛЕННОЙ ГРИППОЗНОЙ ИНФЕКЦИИ И В РЕЗУЛЬТАТЕ ВВЕДЕНИЯ БЕРЕМЕННЫЙ САМКАМ ИНАКТИВИРОВАННОГО ВИРУСА ГРИППА.

Для исследования были использованы ныла линии С5? в1/6. I группа. Было взято 45 мышат 30-60 и 75-и дневного возраста, { из 10- пометов) с признаками медленной гриппозной инфекции, матери которых были инфицировании живым вирусом гриппа. П группа.45 мышат того же возраста, ( из 10 пометов), рожденных от санок, которым однократно внутризенно вводили инактивированный вирус гриппа'А /Н1Н1/ штамн УБН.

Контроль 45 мышат того же возраста,( из 10 пометов) рожденных от здоровых сакок.

Все подопытные мышата имели клинические признаки, описанные нами как признаки, характерные для медленной гриппозной инФекаии.

При вирусологическом исследовании животных 1 группы из крови, легких, печени, почках и селезенки был Еыделен вирус гриппа

1.0- 3.0 .

с инфекционным титром: ю - 10 эид 50/нл.

Вкрусологичекие исследования контрольных гивотных. а также икаей группы-2 дали отрицательный результат..

Различной была и частота возникновения патологий; в первой группе она сотавляла от 4 до 16 . .тогда как во 2- группе она составляла 60-ео г.. Клинически иышата. рожденные от самок 1-группы отличались неподвижностью, резкой кахексией а иедленним угасанием. нышата 2-группы были подвижны, лепсо возбудимы н внезапно по-

. »

гибли. Средний вес контрольного животного составлял - 19.9 г средний вес кышат 1-группы - б. 7 г средний вес мышат 2-группы' -

6,8 Г

Весьна четкие различия в состоянии икмуноконпетентных орпа-нов у мышат выше указанных групп отмечались в тимусе: резкое опустошение коркового слоя тимуса и инверсия слоев у мышей 1 группы резко отличались от глубоких деструктивных изменений, -вы-, явленных нами в центральном органе иммунитета, тимусе, у мышей 2 группы. •

для последних характерно тотальное уменьшение ( почти исчезновение) . массы тимуса вследствие гибели рэтикуло-элителиалных клеток, составляющих строну тинусэ.

Для определения активности тимуса взяты параметры, характеризующие его основную Функцию - генерацию Т - . лимфоцитов: количество тиноцитов (клеточность) на весь орган и "отдельно по зонам (в коре как в месте собственно генерации клеток и в нозговом веществе как несте средоточения наиболее зрелой популяции тиноцитов), а также количество бластов и нитозов в коре как прямые признаки генерации клеток в тимусе. Бласты и нитозы рассматриваются в сунне, так как их изненения однонаправленнн.

Для'характеристики периферической части системы инмунитета исследована селезенка, .так как в ней сосредоточен набор легко измеримых структурных эквивалентов целого ряда инмунных процессов. Так. обьеи белой пульпы позволяет судить об иммунологической активности селезенки в целом, количество бластов в т- зоне, которая содержит значительную примесь В клеток. - о периферической генерация Т - лимфоцитов и об активности Т - В - взаимодействий, обьен гернинативных центров (ГШ - об активности периферической генерации В - лимфоцитов(предшественников аок и клеток памяти), объем полей плазнатизадш ШШ - о конечной дифференцировке в -лимфоцитов в плазматические клетки: соотношение объемов ГЦ ПП -о "стадии диФФерешщровки В - лимфоцитов., совокупность, структурных

( »

сдвигов селезенки дает возможность косвенно судить о состоянии РеГУЛЯТОРНЫГ п027ляшй Т- линФоцитов.

Кроме того> в селезенке легко оценивать обьен и структуру зкстрамедуллярного кроветворения (соотношение грануло- и эрнтро-цитарного ростков, зрелых и незрелых клеток внутри ростков). Это позволяет косвенно судить о состоянии костномозгового кроветворения и регуляторных лимфоцитов.

Объем кроветворения в селезенке значительно возрастал в обеих опытных группах .Этот фенонен з условиях патологии обычно связан с редукцией костномозгового кроветворения. В какой степени он играет компенсаторную роль, зависит от структуры кроветворения.

Во всех исследованных группах наблюдались зритро-, граяуло-и негакаркощггарный ростки. В эритровдтарнон ростке у интактных животных нормоцита преобладали над более незрелыми . формами. В обеих опытных группах преобладавшими становятся эритробласты. и эритропоэз приобретает незавершенный характер.

На графиках а и б дана комплексная характеристика состояния, икмуяной системы. Круг представляет собой сбалансированную иммунную систему интактных мышей, где 10 радиусов сответствуют-отдельным параметрам, принятым за 1.

Радиусы 1 - ч характеризуют тимус, 5-7 селезеночное кроветворение. 6-Ю белу» пульпу селезенки.

На радиусы нанесены точки, соответствующе значениям параметров в опытных группах. Эти значения выражены в доле по отношению к 1. -

Соединения точек образуют Фигуры, дахше представление о степени и характере отклонений от сбалансированного состояния ин-нуняой систены.

В группе 1 граФих а увеличены 4 паранетра из 10: и 9. центральная и периферическая генерация т-линФоцитов. 5. насса кроветворения, б. показатель незрелости зритродитарного ростка.

Остальные б параметров, отражающие массу и структуру центрального т-отдела радиусы 1.2.3.' и перефирических Т- и В-отдеяов

, >

Конпдексная характеристика иммунной системы

а- влияние инфекционного вируса гриппа б- влияние инактивированного вирусса гриппа

Радиусы: 1 удельная клеточность тимуса. 2 -плотность тимодитов коры. 3 - плотность тимонитов мозгового вещества, 4 - сумма удельных бластов и митозов коры тимуса, 5 - удельный обьем кроветворения, б - относительное количество эритробластов, 7 - удельный грануло-поэз. в - сумма удельных обьемов ГЦ и ПП, 9 - плотность бластов Т- зоны селезенки, 10 - удельный обьем белой пульпы селезенки.

■ Зона параметров: тинуса- горизонтальная штриховка, белая'пульпа селезенки -клетка, селезеночное кроветворение - вертикальная штриховка.

• >

- 178.10., а также радиус 7. -величина гранулопоэза. сильно редуцированы.

В группе 2 график б сильно редуцированы все паранетры, кроне гипертрофированных насс зкстр'анедуллярного кроветворения и показателя незрелости эритропоэза.

Характер отклонений иммунной системы от сбалансированного состояния позволяет заключить, что в обеих опытных группах имеет место комбинированная, затрагивающая как Т-, так к В-отделы, ии-мшслогическая недостаточность, сильнее выраженная в группе 2.

Гипертрофия селезеночного кроветворения, увеличение показателя незрелости эритропозза и редукция гранулопоэза свидетельствуют о дефекте Т-лимфопитов, регулирующих кроветворение. Ннохест-венные признаки иммунологической недостаточности позволяют пред-яолехить, что гипертрофиропаняая репродукция центральных и периферических Т-лимФоцитов в группе 1 ведет к образованию функционально неполноценных Т-клеток. .

Таким образом сравнительное изучение этих параметров показало, что изменения, наблюдаемые нани при медленной гриппозной инфекции и вызванные в организме берененной самки непрерывно репро-дуцируюшнся вирусом, происходят по законам,' наблюдаемый при инфекционном процессе, а изненения, обнаруженные нами у нышат. рожденных от самок, инъецированных инактизированным вирусом гриппа, свидетельствуют о тяжелой поражении организна плода, вызванного переходом через трансплацентарный бдрьер большого количества токсических продуктов - вирусов. -ВЫВОДЫ

1. Внутривенное введение инактивированного вируса гриппа беременным санкам мышей приводит к патологии беременности и снижению плодовитости за счет гибели плодов.

2. Внутривенное введение беременным самкан нышей инктивиро-ванного вируса гриппа вызывает у потомства мышей развитие медленно прогрессирушего патологического процесса, клинически выражающегося отставанием в росте и массе тела, нарушением координации

- 18 - •

движения, нараставшей кахексией и летальным исходом.

3. Появление нышат с описанными вше патологическими признаками наиболее часто обнаруживается при использовании кышэи линии С5ТВ1Уб.

4. наиболее серьезные деструктивные изменения развиваются.в ЦНС в виде спонгиозной энцефалопатии, достигавшей наибольшей выраженности в гипатолаиусе и стволовых отделах головного нозга.

5. Характерные изменения происходят в иииунокомпетентных ор-. ганах: тимусе, селезенке и' линФоузлах. В тимусе обнаруживается глубокая деструкция ретикуло-эпитёлиальных клеток.

6. Изменения в адечогипоФизе сопровождается нарушениями структуры "желез - иишеней , а именно: *»

- гидропической дистрофией эпителия щитовидной железы;

- тотальной гибелью спернатогенного эпителия в семенниках;

- гибелью яйцеклеток в яичниках.

7. Проведенный с помошью норфометрии количественный анализ клеточной кинетики имнуноконпетентных органов позволил выявить комбинированную иммунологическую недостаточность, затрагивающую Т- и В системы.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Патонорфологические изменения органов и тканей нышей с. врожденной патологией, индуцированной ннактивированным вирусом гриппа. / Быковская С.И., Зуев В.А.. Харитонова А.К.// вопр.виру-сол. - 1991.-4. - С. 286 - 269..

2. Норфофункциональные изменения в инмуннокомпитентных органах нышей с врожденной патологией, индуцированной ннактивированным вирусом гриппа. / Быковская а И., Зуев В. А., Харитоновал. Н. // Вопр. вирусол. - 1992 .-1. - С. 156 - 159.

3. Норфометрический анализ инмуннологической недостаточности у мышат, развивающейся в результате трансплацентарной передачи живого или инактивированного вирусса гриппа А. /линднер д. П. .Сте-

t ценко 0. н., Иирчник Е. П.. Быковская С. И.. Харитонова А. Н.. Зуев " В. А. // Вопр. вирусол. - 1990.-1. - С. 16 - 19.

4. Property of different viral to laduce the spongiform encephalopathy./ Zyev" v. A. .Kharltonova A. H.. BrKovsKaya C.I. .and ChuvaKova Z.K. // International symposium "100 Years of virology" ST. Petersburg -1992. -C. 102.

Отпечатан в типографии НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи ■ Заказ 79, тирах 80, подписан в печать 24.04.95г. Адрес: 123098, г. Москва, уд. Гамалеи, д.18

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Быковская, Светлана Ивановна

ВВЕДЕНИЕ

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ПРОБЛЕМЫ МЕДЛЕННЫХ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ

ГЛАВА г. СВОЙСТВО ВИРУСА ГРИША ВЫЗЫВАТЬ МЕДЛЕННУЮ ФОРМУ ЙШЩШНОГО ПРОЦЕССА

ЧАСТЬ II. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Животные

2. Вирусы

3. Вирусологические методы

4. Морфологические методы

5. Морфометрические методы

6. Гистохимические методы

7. Электронно- микроскопические методы

8. Статистичекие методы

ГЛАВА 2. ИНДУКЦИЯ ИНАКТИВИРОВАШШ ВИРУСОМ ГРИППА БРОЛЩЕН-НОЙ ПАТОЛОГИИ И ПАТОЛОГИИ БЕРЕМЕННОСТИ У МЫШЕЙ . 38 Заключение

Введение Диссертация по биологии, на тему "Сравнительная характеристика структурно-функциональных изменений органов и тканей мышей с врожденной патологией, индуцированной инактивированным и инфекционным вирусом гриппа"

Актуальность проблемы : Прошло ровно 40 лет с того времени, когда впервые были сформулированны основные положения учения о медленных вирусных инфекциях / 121 /. За этот период накоплен огромный фактический материал, охватывающий все стороны проблемы.

Прежде всего постоянно продолжает увеличиваться число самих медленных вирусных инфекций, количество которых сегодня уже превышает сорок нозологических форм. Заболевания поражают не только животных, но и людей, они встречаются во всех странах мира / 50 /. В последнее десятилетие открыты не только новые медленные вирусные инфекции, но и достигнуты большие успехи в расшифровке иммунологических и молекулярных механизмов патогенеза многих из них. Получены принципиально новые данные о тех медленных вирусных инфекциях, в изучении которых на протяжении многих лет не было достигнуто прогресса. Наконец, разработаны практические меры по предупреждению некоторых медленных вирусных инфекций, особенно для групп с повышенным риском заражения, а также предприняты первые шаги в лечении этих смертельных заболеваний / 49, 50 /.Кроме того выяснилось, что у многих давно и хорошо известных вирусов имеется способность вызывать медленный инфекционный процесс в результате внутриутробного заражения плода.

Наиболее ярким примером служит врожденная краснуха, когда "безобидный" для взрослых людей вирус, в результате внутриутробного заражения плода может приводить к развитию синдрома врожденной краснухи и прогрессирующего краснушного панэнцефалита.

В последующие годы в ряду возбудителей врожденных вирусных инфекций, характеризующихся чертами медленного инфекционного процесса, оказались вирусы простого герпеса, цитомегалии, аденовирусы, вирус гепатита В / 15, 41 /.

Особый интерес представляет собой вирус гриппа вследствие его убиквитарности, а также в связи с постепенным накоплением клинических и экспериментальных данных о роли вируса гриппа в патологии плода и новорожденного / 40, 52, 53, 61, 63, 73, 74, /.

Авторы, изучавшие медленные инфекции, высказывали весьма разноречивые суждения о происхождении характерных поражений органов и тканей. Многие связывали это с процессами внутриклеточной репродукции вируса, заканчивающейся разрушением клетки, либо с формированием воспалительного процесса или иммунной реакцией / 15,38, 46, 52 /.

Вместе с тем, в последние годы накапливается все большее количество фактов, свидетельствующих о том, что повреждение вирусами клеток и тканей может осуществляться под действием поверхностных вирусных структур, в отсутствие репродукции самого вируса, т.е.,иными словами, вирусы могут выступать как токсины. / 31,33,110/.

Следует подчеркнуть, что идея токсического действия вируса / как раз на примере вируса гриппа/ была высказана и получила первое экспериментальное обоснование сорок лет назад /31, 32/.

Позднее было показано, что введение дезентегри-рованных озвучиванием инфекционных частиц вируса гриппа может вызывать у мышей гистологические изменения, сходные с таковыми в результате введения живого вируса /110 /,

Наконец, сравнительно недавно установлена способность неинфекционного для мышей штамма вируса гепатита В индуцировать у них церебральные и печеночные поражения без доказательств вирусного размножения. /48, 50 /.

Способность вирионов повреждать клетки без процесса репродукций свойственна и некоторым другим вирусам. Она особенно подробно изучена у парамиксовирусов, а недавно описана и для вируса иммунодефицита человека. / 71, 72, 80, 114/.

С момента зарождения проблемы медленных вирусных инфекций определяющую роль в успешном ее развитии сыграли и продолжают играть морфологические исследования. Именно морфологический критерий позволил выяснить основные особенности патогенеза многих медленных вирусных инфекций и до сих пор остается единственным, позволяю- -шим верифицировать медленную вирусную инфекцию любой этиологии / 2, 42, 43, 49, 78, 79, /.

Высказанное положение в особой степени относится к подострым трансмиссивным губкообразным энцефалопатиям (ПТГЭ) - группе медленных инфекций, вызываемых приона-ми, состоящими из безнуклеинового инфекционного низкомолекулярного белка.

Именно при ПТГЭ повреждающее действие возбудителя характеризуется развитием губкообразного состояния в центральной нервной системе / 1, 44, 45, 78, 99, 115 /. Отсюда понятно значение морфологического анализа органов и тканей, особенно при изучении новых форм инфекционного процесса, вызываемого уже известными возбудителями.

В 1977 г, в нашей лаборатории была впервые описана медленная гриппозная инфекция у мышей, родившихся от самок, зараженных вирусом гриппа во время беременности / 50 /. Открытие этой необычной для вируса гриппа новой формы инфекционного процесса оказалось возможным, благодаря многолетнему морфологическому и вирусологическому анализу органов и тканей больных животных.

С помощью различных методов исследования у этих животных были установлении необычные поражения органов и тканей, характеризующиеся первично-дегенеративными изменениями, а также развитием губкообразного состояния в белом веществе головного и спинного мозга / 23, 24, 47, 48 /.

Позднее патология, столь характерная для медленной гриппозной инфекций, была обнаружена у потомства мышей, родившихся от самок, которым во время беременности внутривенно был введен инактивированный (неинфекционный) вирус гриппа / 81, 128 /.

Цель и задачи исследования: В связи с вышеизложенным целью работы является специальное изучение характера структурно - функциональных изменений в органах и тканях мышей, родившихся от самок, которым в период беременности однократно внутривенно вводили инактивиро-ванный вирус гриппа.

В соответствии с поставленной целью в задачи исследования входило:

1. Изучение влияния инактивированного вируса гриппа на патологию беременности и потомства у мышей.

2. Патоморфологическое исследование органов и тканей потомства мышей с врожденной патологией, индуцированной инактивированным вирусом гриппа.

3. Сравнительный качественный и количественный анализ пораженных органов и тканей у потомства мышей при врожденной патологии, индуцированной инактивированным и инфекционным вирусом гриппа.

Научная ношена и практическая ценность: Впервые экспериментально исследован один из важнейших механизмов повреждающего действия вируса гриппа на клетки органов и тканей организма в процессе формирования медленной гриппозной инфекции. При этом установлено, что внутривенное введение инактивированного вируса гриппа беременным животным приводит к патологии беременности и снижению плодовитости за счет гибели плодов.

Среди родившегося потомства, с высокой частотой наблюдается формирование патологического процесса, клинически сходного с таковым при медленной гриппозной инфекции, развивающейся у потомства мышей, родившихся от самок, зараженных интраназапьно в период беременности инфекционным вирусом гриппа.

Сопоставление и количественный анализ пато-гис-тологических изменений в органах и тканях мышат под действием как инфекционного, так и инактивированного вируса гриппа выявило их абсолютную идентичность и позволило рассматривать повреждающее действие вируса как результат реализации биологической активности его поверхностных структур, что и было впоследствии подтверждено опытами с вирусспецифической нейраминидазой.

Работа носит теоретический характер, однако полученные результаты обосновывают целесообразность и "антинейраминидазного" направления в экспериментальной разработке схем и методов лечения медленной гриппозной инфекции.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Внутривенное введение беременным мышам инактивированного вируса гриппа вызывает у потомства развитие патологического процесса, клинически и пато-гисто-логически сходного с таковым при медленной гриппозной инфекции.

2. Возможность внутривенного введения различных, в том числе и высоких концентраций инактивированного вируса гриппа беременным самкам мышей позволяет количественно исследовать повреждающее действие вируса на

- ю клетки органов и тканей и, тем самым, экспериментально моделировать первично-дегенеративные процессы, характерные для медленной гриппозной инфекции.

3. Наиболее глубокие деструктивные изменения инактивированный вирус гриппа вызывает в центральной нервной системе ( спонгиозная энцефалопатия ), а также тяжелые изменения в иммунокомпетентных органах ( особенно в тимусе ).

4. Механизм повреждающего действия вируса при медленной гриппозной инфекции обусловлен токсической активностью поверхностных структур вириона и главным образом вирусной нейраминидазой.

- 11

Апробация работы: Материалы диссертации докладывались на заседании Ученого совета НИИЭМ им, Н.Ф. Гамалеи РАМН (1988г.), на научной конференции отдела медицинской микробиологии НИИЭМ им. Н.Ф, Гамалеи РАМН ( 1990 г.), ( 1994 г.), на международном симпозиуме " 100 Years of virology " ( 1992 г.).

Публикации: По теме диссертации опубликовано 4 печатных работ.

Обьем и структура работ»: Работа изложена на 125 страницах машинописного текста, иллюстрирована 25 рисунками, 2 таблицами.

Библиографический указатель включает 128 наименований работ отечественных и зарубежных авторов.

Диссертационная работа состоит из введения, 2-х глав обзора литературы, 3-х глав собственных экспериментальных исследований, обсуждения, выводов и списка цитированной литературы.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Быковская, Светлана Ивановна

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, детальный морфологический анализ, проведенный с помощью различных методов исследования, позволил выявить весьма важные обшие патологические закономерности, возникающие в организме мышат, рожденых от самок, инъецированных инактивированным вирусом гриппа.

Нами установлено, что наиболее серьезные деструктивные изменения развиваются в ЦНС, они выражаются в виде спонгиозной энцефалопатии, достигающей наибольшей выраженности в гипатоламуее и стволовых отделах головного мозга.

Весьма характерны также изменения в иммунокомпе-тентных органах: тимусе,селезенке и лимфоузлах. Более всего паражается центральный орган иммунитета- тимус, где происходит глубокая деструкция ретикуло-эпителиальных клеток, составляющих строму тимуса и эндотелия ти-мусных капилляров и венул, выполняющих барьерную функцию. Поражение этих систем, возникает, возможно, в пре-натальном периоде при трансплацентарном проникновении инактивированного вируса. Введение его беременным самкам приводит к глубочайшим сдвигам в лимфоидной системе плода, что способствует развитию иммунодефицита, вызывающего гибель животного.

ГЛАВА 4. СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ПАТОЛОГИИ, РАЗВИВАЮЩЕЙСЯ У ПОТОМСТТВА МЫШЕЙ ПРИ МЕДЛЕННОЙ ГРИППОЗНОЙ ИНФЕКЦИИ И В РЕЗУЛЬТАТЕ ВВЕДЕНИЯ БЕРЕМЕННЫМ САМКАМ ШАКТИВИРОВАННОГО ВИРУСА ГРИППА.

В данной главе приведены результаты сравнительного изучения наиболее важных параметров, характеризующих как медленную гриппозную инфекцию, вызванную непрерывно репродуцирующимся вирусом гриппа, так и изменениями в организме плода, возникающими при однократном внутривенном введении беременным самкам инактивированного вируса гриппа.

Для исследования были использованы мышы линии С57

ВЬ/6.

I группа.

Было взято 45 мышат 30-60 и 75-и дневного возраста, ( из 10 пометов) с признаками медленной гриппозной инфекции, матери которых были инфицированны живым вирусом гриппа.

II группа.

45 мышат того же возраста,( из 10 пометов), рожденных от самок, которым однократно внутривенно вводили инактивированный вирус гриппа А /НШ/ штамм

Контроль

45 мышат того же возраста,( из 10 пометов) рожденных от здоровых самок.

Все подопытные мышата имели клинические признаки, описанные нами как признаки, характерные для медленной гриппозной инфекции.

Эфтаназия животных производилась методом шейной дислокации в указанные выше сроки.

При вирусологическом исследовании животных 1 группы из крови, легких, печени, почках и селезенки был

1,0 3,0 выделен вирус гриппа с инфекционным титром: 10 - 10 ЭИД 50/мл.

Вирусологичекие исследования контрольных животных, а также мышей группы-2 дали отрицательный результат.

Различной была и частота возникновения патологий: в первой группе она сотавляла от 4 до 16 , тогда как во 2- группе она составляла 60-80 % /см. таблица 1 /.

Клинически мышата, рожденные от самок 1-группы отличались неподвижностью, резкой кахексией и медленным угасанием.

Мышата 2-группы были подвижны, легко возбудимы и внезапно погибли.

Средний вес контрольного животного составлял

19,9 г средний вес мышат 1-группы - 6,7 г средний вес мышат 2-группы - 6,8 г