Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Мутагенный потенциал вируса гриппа

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Мутагенный потенциал вируса гриппа"

Г-.'о О А - 1 ДЫ\ 19ь8

На правах рукописи

УДК 575.224.46

ЧЕРЕДНИЧЕНКО ОКСАНА ГЕННАДЬЕВНА МУТАГЕННЫЙ ПОТЕНЦИАЛ ВИРУСА ГРИППА 03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Республика Казахстан Алматы 1998

Работа выполнена п лаборатории генетическою мониторинга Института обшей leiieniKii и цитологии МП-АН PK

Научные руководители:

Официальные ohiioiichii.i :

Ведущая организация :

Члеп-корр. АН PK, доктр биологических наук, профессор Ахмагуллнна II.Б. Кандидат бполо! пческнх наук доценг Бняшева З.М.

Доктор биоло| нческнх наук, профессор Бшалнеп A.C. Кандидат бполо! нческнх наук Джансугурова Л.Б.

Институт общей г спешки им. Н.И.Вавилова РАН

Защита состоится " 1998 года в и ча'.ов на

заседаннидиссершционного совета Д14/А.01.01 в Казахском государственном национальном университете имени аль-Фарабн но адресу:

480078, г. А л маты, проспект аль-Фарабн - 71, Учебный корпус ГУК-6 КазГУ, биологический факультет, ауд. 214.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке КазГУ имени аль-Фарабн.

Автореферат разослан " ? ^ " O/tTJ $ ¡993 года

Ученый секретарь /

диссерт ационно! о совета . /faiy.my' ^ Колумбаеви С.Ж.

Актуальность теми. В последние годы генетики весьма активно включи;шсг. з изучение (гпследственнои природы различных патологии человека. Возникли два основных направления: а) исследование связи наследственных заболеваний с конкретными нарушениями генетической структуры и их локализацией; б) исследование вклада растущего уровня различных шютоксикантов среды в формирование и развитие наследственных повреждений в организме человека. Помимо действия радиационных и химических факторов большую актуальность стали приобретать эффекты, так называемых, биогенных мутагенов. D их число прочно вошли различные ДНК- и РНК-содержащие вирусы. Б условиях осложнения экологической, эпидемиологической и социальной ситуации изучение генетических эффектов вирусов представляет особый интерес. А также анализ вирусиндуцнрованного -мутагенеза сопряжен с анализом вклада вирусов в естественный мутационный процесс.

В данной работе п качестве предполагаемого мутагена избран внрур гриппа. Научный и практический интерес к мутагенезу, индуцируемому этим вирусом, связан с весьма широким его распространением в природе, частотой встречаемости с ним человека и особенностями его структурной н генетической организации, обуславливающими особенности взаимодействия с чувствительными клетками организма.

Цель ti задачи исследования. Цель: Изучить способность вируса гриппа индуцировать генные и хромосомные нарушения в генеративных и соматических клетках Drosophíla melanogastcr, выявить последствия вируенндуцнрованного мутагенеза в организме человека. Оценить мутагенный потенциал вируса гриппа в изучаемых системах.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

1.провести анализ различных видов генетических эффектов вируса гриппа на Drosophíla melanogaster п условиях вскармливания им личинок и инъецирования взрослых самцов;

2.изучение качественных к количественных закономерностей проявления выявляемых изменений;

3.выявить особенности мутагенного действия вируса гриппа на культуры клеток человека н Drosophíla melanogastcr.

4. провести цнтогенетический анализ лимфоцитов периферической крови больных гриппом;

5. сравнительное изучение мутагенной активности цельного вируса и его структурных компонентов;

Научная новизна работы. Впервые дана комплексная оценка мутагенности вируса гриппа in vivo и in vitro, т.е. в условиях эксперимента и естественного инфицирования организма. Впервые

обнаружено дестабилизирующее действие вируса гриппа на структуру пслнтенных хромосом Drosophila melanogaster - сильное помпообразование и лизис при обработке их исследуемым вирусом. Впервые выявлена некоторая специфичность лепивия вируса гриппа -показано, что он нарушает процесс формирования крыла и в частности жилки Ml+2, а также 7 из 15 изученных рецессивных легальных мутаций локализованы в районе 2В9-10- -ЗС10-11. Проведена оценка мутагенного потенциала вируса гриппа. Показано, что он может быть отнесен к мутагенам средней активности, причем его мутагенность не зависит от способности вируса размножаться в той или иной клеточной системе. Доказано, что за мутагенность вируса гриппа ответственен ею нуклеиновый компонент.

Практическая и теоретическая ценность. Полученные данные вносят существенный вклад в изучение природных факторов, вызывающих мутации у различных организмов, подтверждая, в частности, тот факт, что вирусы могут быть причиной как спонтанных, так и нндуцнрованых мутаций. Отсюда вирусы должны рассматриваться не только как болезнетворные агенты, но и как факторы, играющие значительную роль в наследственных вариациях различных организмов. Представленные данные углубляют знания о генетическом взаимодействии вирусов и клеток. Показано, что микроядерный тест может использоваться для первичной оценки генотоксического действия вируса гриппа на организм человека.

Основные положс11пн,выносимые на защиту.

- Доказательства способности вируса гриппа вызывать летальные мутации и нарушать структуру полнтенных хромосом у Drosophila melanogaster.

- Вирус гриппа как мутагенный фактор не только вызывает морфологические изменения у имаго, но также индуцирует рецессивные летальные мутации в генеративных клетках дрозофилы.

- Мутагенный эффект вируса гриппа не зависит от его способности размножаться в клеточной системе, но зависит от стадии клеточного цикла.

- Вирус гриппа приводит к образованию хромосомных аберраций в клетках человека как in vivo, так и in vitro.

- Мутагенность вируса гриппа определяется его нуклеопротеидным компонентом.

Апробация. Основные положения работы доложены и обсуждены на научной конференции "Актуальные проблемы вирусологии" (п. Гвардейский, 1994), на биологической межвузовской конференции молодых ученых и студентов КазГУ (1995, 1997), на межлабораторном

семинаре ИОГиЦ МН-АН РК и межкафедральном семинаре биологического факультета КазГУ им. аль-Фарабн.

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 8 работ, в том числе 6 статен.

Структура н объем диссертации. Диссертационная работа изложена на -^страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, раздела, включающего описание объектов и методов исслевования, 4 разделов, содержащих описание экспериментальных работ, обсуждения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 209 наименования работ отечественных и зарубежных авторов. Работа содержит 12 таблиц и 25 иллюстраций, в том числе 20 фотографий.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Вирус. В опытах использовали эталонный штамм вируса гриппа А -вирус птичьей чумы (ВЧП), штамм Вейбридж. Антигенная формула H7N7. Вирус активно репродуцируется на куримых эмбрионах ^ЭИД = 8,0 (ЭИД - 50% эмбриональная инфекционная доза).

Препарат РНП (рибонуклеопротенд). За препарат РНП вируса ■ гриппа принимали гомогенат хорионаллантоисной оболочки (ХАО) куриного эмбриона, приготовленного через 3,5 ч. после заражения, до образования поверхностных белков (продолжительность репродукции вируса гриппа - 8 ч.). В качестве контроля использовали аллантоисную жидкость и ХАО незараженных куриных эмбрионов того же возраста (Жуматовидр., 1972).

Drosophila melanogaster. В работе были использованы лабораторные генетические линии normal (oregon R); Base - линия мух с инверсиями sc . InS sc в Х-хромосоме, маркированная генами : В - полосковидные глаза, w - абрикосового цвета глаза; yellow - тело желтого цвета и линия, содержащая делению Dfi(l)RA-I9v), затрагивающую район 1F1-2-2B9-I0 и дупликацию Dp(l)yY67g, перекрывающую район IF3-3C10-II. Питательные среды готовились по стандартной методике (Какпаков, 1977). Опытные н контрольные варианты линий мух развивались при температуре 25°" С.

Инактивация вируса гриппа. Инактивацию вируса гриппа осуществляли прогреванием вируссодержашей аллантоисной жидкости куриных эмбрионов при 56°*С в течение 1,5 ч. Инфекционносгь и гемагглютиннрующую активность нативного и инактивированнОго

вирусов проверяли путем заражения куриных эмбрионов и постановки НГА (реакция гемагглютмнации) с куриными эритроцитами.

Определение мутагеннопактишюстивируса гриппа. Мутагенное действие вируса гриппа изучали при двух способах воздействия: скармливанием суспензии вируса и инъекцией его взрослым самцам. Влияние РНП вируса гриппа оценивали только при кормлении. В первом варианте личинок двухдневного возраста в течение ч выдерживали в суспензии исследуемого материала или в Сезвируспон аллантоисной жидкости (контроль). Во втором варианте - испытуемый материал (0,11 мг вирусной суспензии) вводили 2-х дневным самцам с помощью иглы, изготовленной из стеклянного микрокапилляра.

Мутагенную активность вируса гриппа оценивали путем учета сцепленных с полом рецессивных летальных мутаций по методу Меллер-5 с использованием линии Base (Тихомирова 1990).

Генетическое картирование летальных мутации у Drosophila melanogaster. Для выяснения цитогенетической локализации полученных мутаций самок, содержащих леталь в гетерозиготном состоянии скрещивали с самцами, содержащими дупликацию (Dp(l)yY67g) и делецию (Df(l)RA-19v) (Беляева и др., 1974). О локализации мутаций в участках, перекрываемых делениями и дупликациями, судили по наличию или отсутствию и количественному соотношению самцов или самок, содержащих делецию и дупликацию.

Определение фазы летального действия мутации. Для определения стадии развития, на которой проявляется летальное действие мутации yli(l) (i=l-15), проводили массовые скрещивания виргинных самок генотипа yli(l)/Basc с самцами Base. Самки в течение двух часов откладывали яйца в чашки Петри со стандартной средой в популяционном ящике. Подсчитывали количество отложенных яиц, через сутки количество вылупившихся личинок первого возраста - из них гемизиготных по летальной мутации самцов, содержащих желтые крючья ротового аппарата. Далее подсчитывали количество этих самцов, доживших до 2-го и 3-го личиночного возраста. Также определяли количество личинок, сформировавших пупариум, и вылетевших имаго.

Обработка слюнных желез. Слюнные железы инкубировали в аллантоисной суспензии вируса гриппа, суспензии инактшшрованного вируса, препарате РНП, а также в соответствующих контрольных суспензиях. Инкубация проводилась с использованием различных рзюеденнй и временных отрезков. В качестве контроля слюнные железы выдерживали в аллантоисной суспензии и гомогенате ХАО кгтораженных куриных эмбрионов того же возраста. Выделение,

фнксашчо и npiiroToineniie препаратоп слюнных желез проводили по общепринятой методике (Айзензон и др. 1980).

Культнлпропапие лимфоцитов периферической крови человек?. В экспериментах гепользовалн культуру лимфоцитов периферической крови здоровых допоров и людей, больных гриппом. Культивирование лимфоцитов проводили по макрометоду при +37°' С в течение 72 часов (Moorhead et al. i960).

Обработка лимфоцитов вирусом гриппа Лимфоциты

периферической крови человека на 64-; 69-; 71-м часах культивирования, соответствующих S, G2, М стадиям клеточного цикла, осаждали с помощью центрифугирования и в течение 40 минут инкубировали с вирусом гриппа (10® ЭИД) при температуре +37°*С. Далее отмывали неадсорбированный вирус питательной средой Игла, вновь " центрифугировали, добавляли кулътуральную среду и продолжали культивировать до 72 часов. Приготовление препаратов хромосом проводили по общепринятой методике.

Учет хромосомных аберраций. Анализ хромосомных аберраций проводили без визуального кариотипировання на рутинно окрашенных азур-эознном по Романовскому-Гимза зашифрованных препаратах. От каждого индивидуума анализировали не менее 100 метафаз. Учитывали все типы повреждений хромосом,, за исключением пробелов (Бочков 1972).

Микроядерный тест. Препарата мазков периферической крови готовили общепринятым методом. Фиксацию проводили в 96% этиловом спирте в течение 30 минут и окрашивали по Романовскому-Гимза 25-30 минут. Анализ микроядер проводили в эритроцитах периферической крови по методике Ильинских H.H. и др. (1992). Подсчитывали 2000 эритроцитов от каждого индивидуума.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 1. Изучение мутагенной активности вируса гриппа

Анализ мутагенной активности вируса гриппа мы начали с опытов на Drosopliila melanogaster - излюбленном объекте генетики, особенно широко используемым при изучении качественных и количественных параметров мутации. Учитывалась также неспособность вируса гриппа инфицировать дрозофилу, что позволит качественнее оценить мутагенность вируса, не затемненного патологическими процессами в организме. Учитывали рецессивные летальные мутации н X-хромосоме. В завершение работы проведен сравнительный анализ

мутагенного потенциала вируса гриппа в клепках человека in vivo и in vitro.

l.i. Индукция вирусом гришгл летальн ых My iani.ii в X-хромосоме Drosophila ineianogabter

Рецессивные летальные мутации представляют наиболее частый тип мутации, возникающих у дрозофилы под влиянием мутагенов или спонтанно. Они легко обнаруживаются в Х-хромосоме, составляющей 20% всего генома дрозофилы (Айала, Кайгер, 198Ь) л удобны для проведения качественной характеристики у гетерозиготных самок. Такой тест широко используется при исследовании мутагенных свойств различных агентов. Изучение мутагенного действия вируса гриппа на Drosophila melanogaster мы предварили оценкой его влияния на развитие личинок и формирование имаго.

Вскармливание личинок суспезией вируса гриппа приводило к гибели значительной их части. Морфологический анализ вылетевших имаго показал, что в контрольных сериях встречаются обычные для любой культуры дрозофил дефекты развития - смятые и частично раздвинутые крылья, маленькие добавочные жилки. Частота встречаемости этих дефектов составляла (3,19±2,2)%. В опытных же сериях, т.е. у мух, развившихся из личинок, обработанных суспензией вируса гриппа, выявлялись различного рода морфологические отклонения, частота которых доходила до (19,23±3,45)% (Р<0,01).

Наиболее частыми изменениями были вырезки на крыльях, обычно типа minute. Довольно часто встречаясь частичное добавление или редукция некоторых жилок крыла,---либо самого крыла, отвилки на жилках, сморщенные » недоразвитые крылья. В подавляющем большинстве случаев нарушался процесс формирования медиальной жилки, M1+2, что указывло на определенную степень избирательности действия вируса гриппа. Т. о. большинство индуцированных вирусом изменений затрагивало размеры, форму и жилкование крыльев. Такие результаты можно объяснить двумя причинами: во-первых, эволюционно и онтогенетически крылья закладываются позже остальных органов, в связи с чем они более изменчивы как спонтанно, так и под действием мутагенных факторов, в нашем случае, вируса гриппа, а, во-вторых, суспензией вируса обрабатывали личинок дрозофил второго возраста, в течение 48 часов, - этот период развития сопровождается активным ростом крыловых имагинальных дисков (Гинтер, Булыжников, 1978). Как правило, эти изменения были асимметричными. Кроме того морфологические дефекты крыльев у самцов возникали в 2 раза чаще, чем у самок, что возможно связано с

большей чувствительностью к вирусу гриппа мух гетерогаметного

пола.

Для изучения наследуемости этих отклонении проводили скрещивания морфологически дефектных самок и самцов с мухами линии oregon R (дикий тип) и анализировали потомство каждой особи. В FI и F2 мух с аналогичными изменениями фенотипа обнаружено не было. Следовательно наблюдаемые морфологические отклонения у имаго, развившихся из вскормленных суспензией вируса гриппа личинок, относятся в основном к модификациям, т.е. морфозам.

Выявление рецессивных сцепленных с полом летальных мутаций проводили в условиях обработки дрозофил суспензией вируса гриппа двумя способами (вскармливание личинок и инъецирование имаго) методом Меллер-5 с использованием линии Base.

В первом варианте опыта (кормление личинок дрозофилы суспензией вируса гриппа) проанализировано 2027 , а во втором (инъецирование самцов) - 2024 Х-хромосом или культур F2. Из них - 41 в первом варианте (2,02±0,31)% (Р<0,01) и 26 (1,28±0,24)% (Р<0,01) во втором содержали полные рецессивные летали, т.е. среди мух F2 отсутствовали гемизнготные самцы с желтой окраской тела. Содержание рецессивных летальных мутаций в контроле не превышало - (0,46±0,20)% и (0,19±0,10)% соответственно.

Таким образом, вскармливание личинок второго возраста суспензией вируса гриппа и его инъецирование имаго приводит к превышению над уровнем мутирования в контроле в 5 и более раз, что принято считать как средний мутагенный эффект (Wurder.,et а!., 1984).

При инъецировании вирусов гриппа имаго дрозофилы было выделено 26 рецессивных летальных мутаций в Х-хромосоме, 15 из них анализировали более подробно с учетом их летального действия, картирования и цитологической характеристики.

Результаты определения фазы летального действия мутаций, индуцированных вирусом гриппа в Х-хромосоме, представлены на гистограмме (рисунок I). Анализ полученных данных показывает, что мутации ylll(l) и уМ4(1) вызывают гибель на эмбриональной стадии, мутации у!4(1), у17(1) и у112(1) приводят к гибели личинок в конце первого личиночного возраста, а мутации yl I, 2, 3, 5, 6, 8, 9, 15(1) - в конце второго личиночного возраста. Мутации у110(1) и у113(1) проявляют условнолетальный эффект или.температурочувствительны.

Они в гемнзнготном состоянии полностью детальны.при 18°' С, а при 25° С отдельные особи (не более 4,67%) выживают. Из 12 личинок с мутацией у110(1), доживших до третьего личиночного возраста, 8 сформировали нормальный пупариум с вылетом 6 мух нормального фенотипа. Аналогичная ситуация наблюдается у гемизигот по мутации

Г.|б«яь г.ичииок, сэдв^*эи,их p ir>C"haKU4 летальные »/yu1;по

______. "T1^"1-" цу-^чи^ -

0 - % вылупившихся личинок от числа отложенных яин;

Ш - гемизнгот первого возраста;

•□ - гемнзнгот второго возраста.

Рисунок 1.

у!!3(1): из 7 личинок третьего возраста только 3 сформировали пупарнум с вылетом 2 мух.

Таким образом, индуцированные вирусом гриппа рецессивные летальные мутации сцепленные с полом, по-видимому, затрагивают эспрессию генов, функционирующих на разных стадиях развития дрозофилы.

Цитогенетнческий анализ полнтенных Х-хромосом в слонш :х железах дрозофил, несущих рецессивные летальные мутации, индуцированные вирусом гриппа, не выявил каких-либо явчых хромосомных изменений. Кариотип мутантных линий, в общем, соответствовал кариотипу контрольной линии yellow, в которой индуцировались мутации. Можно предположить, что эти летали, вероятно, были малыми делениями или точечными мутациями.

Для выяснения цнтогенетической локализации мутаций проводили делеционно-дупликационный анализ (Рисунок 2).

О локализации мутаций в участках, перекрываемых делециямн и дупликациями, судили по наличию или отсутствию и количественному отло'ненню самцов или самок, содержащих делецию н дупликацию. Результаты, представленные в таблице 1 показывают, что ни одна мугаиия не попала в район делении (DO, так как в F1 возникли гегерознготные по летальной мутации желтые самки, содержащие

Il

Схема скрешипаний для проведения делецнонно-дупликационного анализа.

У

Df(I)RA-I9

Р о

х d'

Base желтые

Dp(l)yY67g

серые

у

Base

У

Base

FI у

Dp(l)yY67g Dp(l)yY67g

желтые серые

желтые , серые

.....Х-хромосома, содержащая РЛМСП, маркированная геном

у - тело желтого цвета

Base - линия мух с инверсиями sc InS sc в Х-хромосоме Df(l)RA-l9 - делеция затрагивающая р-н IF1-2-2B9-I0 Dp(l)yY67g - дупликация перекрывающая р-н IF3-3CI0-11

делению. Однако появление гемизнготных по летальной мутации желтых самцов, с дупликацией в генотипе в достаточном количестве и хорошей жинеспособности (рецессивные летальные мутации сцепленные с полом перекрываются дупликацией этого района Х-хромосомы), позволило локализовать летали 2 и 15 в районе 2В9-10-ЗСЮ-И, не содержащим делению и перекрываемому дупликацией.

Летали 3, 5, 8, 12, 13, вероятно, расположены у правой или левой границы дупликации, в связи с пониженной жизнеспособностью гемизнготных по летальной мутации желтых самцов. Остальные мутации находятся вне районов, перекрываемых делецней и дупликацией.

Наиболее заметное различие между изученными вирусами, препаратами ДНК различного происхождения, а также огромным количеством известных физических и химических мутагенов состоит в том, что они, как правило, затрагивают избирательно ограниченное число определенных генов, в то время как действие мутагенов других классов лишено подобной специфичности Гсршензон, 1991). В нашем случае изучение мутаций,, индуцированных вирусом гриппа, также это подтвердило - 2 из 15 леталей расположены в районе 2В9-10 - ЗС10-11, а также 5 у прапой или левой границы чтого района.

Рисунок 2

/

Таблица I.

Влияние мутации на жизнеспособнэсл в гомозиготе и гемнзиготе с делецией и дупликацией.

Мутация Самки с DF Самцы с Dp

У Base У Base

1 12 18 0 25

2 42 18 21 45

3 39 30 3 3

4 69 36 0 33

5 57 30 3 21

6 33 15 0 6

7 42 33 0 3

8 33 27 3 3

9 57 6 0 9

10 36 6 0 9

11 54 18 0 3

12 42 36 3 3

13 51 45 3 9

14 63 21 0 3

15 54 24 27 IS

1.2 Влияние вируса гриппа и его Р1Ц1 на политенные хромосомы Drosophila melanogaster

Сравнительное изучение мутагенной активности вируса гриппа и его РНП проводили на политенных хромосомах Дрозофилы, культивируемых in vitro.

Нативнын вирус гриппа вызывает необратимые изменения политенных хромосом, вплоть до их лизиса. Характер нарушения структуры хромосом зависит от концентрации вируса, используемого для обработки клеток. В клетках слюнных желез дрозофилы, обработанных вирусом гриппа большой концентрации (10* -107 ЭЙД), политенные хромосомы приобретают помпообразный вид, укорачиваются, плохо окрашиваются, не освобождаются из ядра, остаются в клубке. В основе укорочения хромосомы, по-видимому, лежит процесс сближения рядом расположенных дисков, в дальнейшем рисунок . дисков вообще утрачивается и образуются "помпоны". Морфология "помпонов" варьирует в широких пределах. Эго может

быть сильно укороченная, но сохраняющая рисунок поперечной и-черчснности хромосома или глыбка рыхлого материала, в которой выявляется лишь несколько поперечных полос, или же полностью бесструктурная хлопьевидная масса. Т.о. политенные хромосомы диссоциируют на составляющие хроматиды, а затем, в результате дальнейшего разрыхления, - в гранулярную сеть и лизируются.

Инкубация in vitro слюнных желез личинок Drosophila melanogaster в суспезии вируса меньшей концентрации (10s -105 ЭИД) также приводит к дестабилизации политенных хромосом, они укорачиваются, становятся рыхлыми, приобретают вод ленточных структур. При этом разрыхление плотных дисков происходит без пуфо- и помпообразования и завершается постепенным лизисом хромосом. Дальнейшее уменьшение концентрации (Ю3 -10г ЭИД) вируса, а также -культивирование слюнных желез в аллантоисной суспензии без вируса гриппа (в качестве контроля) не изменяет нормальную структуру политенных хромосом.

При изучении мутагенного действия вирусов принципиально важно установить, обладают ли мутагенностью инактивированные вирусы и какой из компонентов вируса (нуклеиновая кислота или белок) ответственен за это свойство. Общеизвестно, что РНК вируса гриппа не обладает биологической активностью и функционирует только в составе РНП. Поэтому для анализа мутагенности нуклеиновых компонентов этого негативно-геномного вируса, мы использовали препарат его РНП. При этом исходили из многочисленных данных о том, что наибольшее количество РНП в зараженных клетках накапливается к 3-3,5 часам после инфицирования, до образования поверхностных гликопротендов, полная сборка вируса происходит через 6-8 часов (Жуматов и др. 1972). Поэтому за препарат РНП мы принимали гомогенат клеток, приготовленных через 3,5 часа после заражения. Биологическая активность этого препарата определялась предварительным заражением куриных эмбрионов.

Культивирование слюнных желез дрозоф|шы в суспензии РНП (101 -101 ЭИД) обнаружило разрыхление плотных дисков политенных хромосом, без пуфо- и помпообразования. Хромосомы приобретают вид беспорядочных ленточных структур, которые плохо окрашиваются, , практически не расправляются, оставаясь в клубке, иными словами, при обработке слюнных желез дрозофилы препаратами РНП и натнвного вируса обнаруживаются сходные изменения. Однако эффективность РНП значительно выше, он активен в 10 и 100' раз меньших концентрациях, чем нативный вирус.

ИнактивнрованныП вирус, сохраняющий активность

поверхностных белков (титр в РГА 1:256) не вызывает структурных

нарушений хромосом, а суспензия РНП, выделенная еше до образования этих белков, напротив, ведет к необратимым изменениям. Эти данные согласуются с данными Бужиевской Т.И. (1954), не обнаружившей цитогснстнческой активности у белковой противогриппозной вакцины.

Исходя из того, что РНК вируса гриппа не обладает биологической активностью и функционирует только в составе РНП, активность которого мы показали выше, можно предполагать, что активирующим началом в РНП-комплексе является какой-либо из внутренних белков вируса гриппа, входящим в этот комплекс. Это предположение, возможно, подтверждается данными некоторых авторов (1Лшег, е1 а!., 1993), которые использовали плазмиду, кодирующую внутренний белок КР вируса гриппа человека и защитили мышей не только от штамма вируса гриппа из которого взят ген но и от другого штамма, выделенного из природы более,чем через 30 лет после первого.

Таким образом, нами получены достаточно прямые доказательства того, что дестабилизирующую активность вируса гриппа, по отношению к структуре хромосом, несет на себе РНП вируса, а не его поверхностные белки.

1.3 Цнтогснетнческне нарушения в лимфоцитах периферической крови людей ¡n vivo

Несмотря на все преимущества дрозофил для качественной и количественной оценки мутаций, индуцированных вирусами, они не могут предоставить реальной оценки опасности для человека этих мощных факторов окружающей среды с которыми он встречается неоднократно » течение жизни.

В последние годы накопилось достаточно сведений о том, что не только онкогенные, но и многие инфекционные вирусы способны индуцировать различного типа хромосомные аномалии в клетках человека и животных. Подобные данные получены разными авторами относительно вирусов кори, герпеса, краснухи, паротита и др. (Ильинских и др., 1984, Бужневская, 1984) связи с этим нами предпринята оценка влияния вируса гриппа на генетический аппарат клеток человека. Традиционно в подобных целях принято использовать лимфоциты и эритроциты периферической крови.

В эпидемический период (Алматы, декабрь 1995г.) у 12 больных активной формой гриппа и у 5 реконвалесцентов из этой же группы изучали уровень хромосомных аберраций в лимфоцитах и

формирование микроядер в эритроцитах. Больные обследовались в течение 4 дней после начала заболевания и через 2,5 месяца после клинического выздоровления.

Контрольную группу составили 5 клинически здоровых доноров, не болевших в последние 3 месяца инфекционными заболеваниями и не подвергавшихся радиационным и химическим воздействиям.

Как свидетельствуют полученные данные у больных гриппом в остром периоде заболевания частота клеток с хромосомными нарушениями составляет (16,20±1,073)%, тогда как в контроле этот показатель равен (1,86±0,5)%. При этом среди клеток, имеющих структурные изменения хромосом, встречаются клетки с нарушениями числа хромосом - (3,08±0,48)%. Это в основном гипо- или гнперплондные клетки, однако у некоторых больных довольно часто встречались полиплоидные клетки или клетки с эндоредуплякацней хромосомного набора. В контрольной группе, т.е. у здоровых доноров, этот показатель составляет (1,40±0,4)%. Таким образом, у больных гриппом частота лимфоцитов периферической крови с аномалиями хромосомного аппарата в 8,9 раз выше, чем в контрольной группе (Р<0.01).

У реконвалесцентов (через 2,5 месяца после выздоровления) частота хромосомных нарушений снижается практически до контрольного уровня и составляет - (2,90±0,5)% (Р<0,05).

В клетках больных гриппом встречались аберрации кпк хроматидного, так и хромосомного типов. Аберрации хроматидного типа были представлены преимущественно одиночными ацентрическими фрагментами, разрывами, нехватками и обменами, хромосомного типа - парными фрагментами и разрывами, также встречались кольца и дицентрик» н др.

Для выявления мутагенного действия вируса гриппа in vivo мы использовали еще один цнтогенетический тест - микроядерный.

Обнаружено достоверное возрастание числа эритроцитов g микроядрами. Так, у больных гриппом в остром периоде заболевания уровень эритроцитов с микроядрами достиг (3,6±0,35)% по сравнению <■ контролем (0,3±0,01)%(Р<0,01).

У реконвалесцентов через 2,5 месяца после клинического выздоровления отмечается почти полная нормализация частоты эритроцитов, содержащих мнкроядра, - средний уровень которых составляет (0,4±0,08)%.

С целью выявления соответствия частоты хромосомных аберрации и лимфоцитах уровню микроядер в эритроцитах периферическом крови был проведен корреляционный анализ (Рисунок 3).

Выявлено, что образование микроядер тесно связано с частотой фрагментов хромосомного и хроматндного типов т~0,87+0,15 (Р<0,01, где Р - достоверность выборочного колффицнента корреляции) в острый период заболевания. В то же время частота эритроцитов с микроядрами слабее коррелирует с общей частотой структурных нарушений в лимфоцитах периферической крови г=0,55+0,26 (Р>0,01) Аналогичные данные получены при анализе хромосомных нарушении в лимфоцитах и микроядер в эритроцитах периферической крови здоровых доноров и реконвалесцентов (г=0,81+0,21 (Р<0,01), г=0,50+0,31 (Р>0,01) соответственно) (рисунок 3).

Уровень цитогснеткческих нарушений в лимфоцитах и эритроцитах периферической крови больных гриппом

больны* гриппом

Ряд 1 - всех цитогенетическнх нарушений Ряд 2.- хромосомных и хроматидных фрагментов Ряд 3 - эритроцитов с мнкроядрами

Рисунок 3.

Отсутствие более тесной корреляции между общей частотой структурных нарушений в лимфоцитах и частотой микроядер в эритроцитах периферической крови, вероятно, связано с тем, что не все структурные аберрации формируют хромосомные и хроматидные фрагменты, например внутри- и межхромосомные обмены.

Тем не менее, данные корреляционного анализа свидетельствуют о том, что в формировании микроядер основную роль играют отставшие фрагменты хромосом, а так как они составляют основную массу структурных нарушений в клетке, то микроядерный тест довольно точно отражает картину генотокснческого действия вируса гриппа.

Таким образом, данные цитогенетического анализа выявили способность вируса гриппа индуцировать цитогеиетичеекне нарушения различного типа, которые достаточно активно элиминируют в течение 2,5-3 месяцев.

1.4 Цитогеиетичеекне нарушения в лимфоцитах периферической крови людей in vitro

Действие инфекционных факторов на генетические структурь! клеток вне ерганизма имеет определенные отличия от воздействия на клетки целого организма. При воздействии инфекционного агента на человека и животных его мутагенный эффект опосредуется организмом, в то время как клетки в культуре вступают в непосредственный контакт с вирусом.

Прямая оценка интенсивности мутагенеза у человека сложна, и практически невозможно определить вклад отдельных мутагенных факторов в общий генетический груз. Исходя из сложности организации условий популяционного эксперимента и возможности более качественной и количественной оценки индуцируемых вирусом гриппа нарушений нами проведено изучение прямого воздействия вируса гриппа на клетки в опытах in vitro.

Мы заражали первичную культуру лимфоцитов 10® ЭИД вируса гриппа А (ВЧП), на 64-; 69- и 71-м часу культивирования, соответствующих S, Gi, М стадиям клеточного цикла.

При воздействии вирусом на культуры лимфоцитов, находящихся в фазе М возникало сравнительно меньшее количество цитогенетнческнх нарушений (10,8±2,19)%. В фазе М обнаружено больше хроматидных (9,4±2,06)% повреждений, чем хромосомных (1,4±0,83)%, что скорее всего вызвано преобразованием потенциальных нарушений, возникших на более ранних стадиях клеточного цикла или непосредственным воздействием вируса гриппа на одну из хроматид хромосомы. На этой стадии нарушаются также качественные показатели митотнческого режима, так, судя по тому, что уже разделившиеся лимфоциты содержали два, три и более ядер можно предположить, что вирус гриппа, воздействуя на стадию метафазы, вызывает также нарушение митотнческого аппарата клетки

(дезорганизация веретена деления, поражение функции клеточных центре»).

Наибольший процент, индуцированных вирусом гриппа нарушений связан с воздействием в фазах S и G2 (!9,9±2,82)% и (23,0±2,97)% соответственно), при этом хрома гидные изменения обизружньались в 2 раза чаще, чем хромосомные. При действии инфекционного агента на стадии синтеза пли в постсинтетической стадии поражается, как правило, одна матрица ДНК хромосомы, в связи с этим и индуцируется больше хромат идных нарушении. Контрольный уровень составил (2,00±0,62)%.

Аналогичная картина наблюдается и у больных гриппом (преобладание хроматидных аберраций), отсюда можно предполагать, чго вирус гриппа проявляет свое мутагенное действие в S или Gi стадиях клеточного цикла.

Эти данные в какой-то степени согласуются с результатами экспериментов по обработке слюнных желез дрозофилы суспензией вируса гриппа, при которых обнаруживалось сильное нарушение структуры политенных хромосом (деспирализация, помпообразование, лизис), находящихся к конце S или начале G2 стадии клеточного цикла.

Таким образом, вирус гриппа может проявлять свое мутагенное действие на разных стадиях клеточного цикла.

Во всех вариантах эксперимента in vitro, при заражении культур лимфоцитов вирусом гриппа среди хромосомных нарушений встречались аберрации как хроматидного, так и хромосомного типов. Аберрации хроматидного типа были представлены преимущественно одиночными ацентрическими фрагментами, разрывами и дефишенеями, хромосомного типа - парными фрагментами и разрывами, ацентрическими и центрическими кольцами, днцентриками и обменами различных типов. Кроме того в эксперименте in vitro встречались клетки с множественными нарушениями хромосомного аппарата и нарушением спнралнзацни хромосом - отдельных и всего набора, как нсспирализованные, так и суперспирализованные.

В контроле структурные аномалии представлены хроматидными разрывами, одиночными и парными ацентрическими фрагментами.

По-видимому различия частот хромосомных аномалий в условиях in vivo и in vitro связаны с возможностью прямого контакта инфекционного материала в эксперименте с клеткой-мишенью, а также выбором оптимальной для заражения стадии клеточного цикла и др.

Таким образом, изучение частоты хромосомных аберраций в культуре лимфоцитов крови, индуцированных прямым их заражением вирусом гриппа, подтвердило достоверность увеличения частоты хромосомных перестроек у больных гриппом.

Данные литературы свидетельствуют о наличии специфики в типах повреждений хромосом, вызываемых ионизирующим излучением в сравнении с типами аберраций, индуцируемыми химическими мутагенами. Так, под воздействием облучения в клетках чаще возникают нарушения хромосомного типа (Пилинская и др., 1994, Гаиинл и др., 1994), в частности асимметричные хромосомные обмены (диценгрические хромосомы), которые считаются испытанным индикатором мутагенного воздействия радиоактивного излучения (Нуапэ, 1982); при химическом мутагенезе, наоборот, преобладают хроматидные нарушения (Дружинин и др., 1995). Инфекция же вирусом гриппа в наших исследованиях приводила преимущественно к образованию одноннтевых разрывов ДНК, и как следствие, -повышению числа структурных аберраций хроматидного типа.

В опытах на дрозофиле мы установили, что мутагенность вируса, гриппа обусловлена содержащемся в нем рнбонуклеопротеидным компонентом. Отсюда сходство действия . химических мутагенов и гриппозной инфекции вполне логично. . .'>

Кроме того, исходя из способности вируса гриппа индуцировать различные генетические эффекты у ОгоборИНа те1апо§а51ег, человека и культуры их клеток, очевидно, что мутагенность вируса гриппа не зависит от его способности размножаться в клетке.

Проведенные исследования позволяют рассматривать вирус гриппа не только как возбудителя острой инфекции, но также в качестве довольно сильного мутагена с широкой распространенностью в популяции человека. В условиях острой инфекции возникает быстрое и массовое повреждение хромосомного аппарата клеток. В непермиссивной клеточной системе вирус гриппа и его вирусные нуклеиновые кислоты индуцируют мутации на хромосомном и генном уровне.

Таким образом доказательства мутагенной активности вируса гриппа получены тремя путями: а) обнаружением его способности индуцировать генные мутации в половых клетках и вызывать морфозы крыла у ОгозорЬПа ше1апо2а51ег; б) выявлением множественных хромосомных аберраций в культурах периферической крови человека, подвергшихся воздействию вируса гриппа; в) обнаружением хромосомных аберраций и микроядер в клетках периферической крорн больных при острой гриппозной инфекции.

ВЫВОДЫ

I. Мутагенный потенциал вируса гриппа изучен с использованием сравнительного анализа индуцируемых им генетических эффектов на

DiCsophiia melanogaster и человека, а также культуры их клеток. По частоте индуцируемых в этих системах мутаций вирус гриппа может быть отнесен к мутагенам средней активности и должен рассматриваться не только как возбудитель инфекционного заболевания, но и как один из наиболее распространенных биогенных генотокснкантов.

2. Вирус гриппа вызывает морфозы крыла , в частности, меняет паттерн (нормальную картину формирования) жилки Ml+2.

3. Из 15 изученных рецессивных летальных мутаций сцепленных с полом 7 локализованы в районе 2В9-10 - 3C10-U Х-хромосомы Drosophila melanogaster.

4. В лимфоцитах и эритроцитах периферической крови людей, больных гриппом в остром периоде заболевания, частота цитогенетнческих аномалий достоверно превышала контрольный уровень. Повторное обследование этих лиц через 2,5 месяца после выздоровления (реконвалесценты) указывает на элиминацию большинства индуцированных нарушений. Исходя из результатов корреляционного анализа мнкроядерный тест можно рекомендовать для первичной оценки генотокснческого действия вирусов гриппа на организм человека.

5. Установлено, что обнаруживаемые генетические эффекты не зависят от способности вируса гриппа размножаться в изучаемых клеточных системах.

6. Множественные хромосомные аберрации обнаружены в лимфоцитах, подвергшихся действию вируса гриппа in vitro на разных стадиях клеточного цикла.

7. Сравнительный анализ способности индуцировать нарушения генетического аппарата в клетках слюнных желез дрозофилы цельным вирусом, его РНП и суспензией компонентов поверхностных белков, указывает, что мутагенность вируса гриппа определяется биологически активным РНП комплексом.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Чередниченко О.Г., Бияшева З.М., Ахматуллнна Н.Б. Индукция вирусом гриппа летальных мутаций в Х-хромосоме Drosophila melanogaster // "Актуальные проблемы вирусологии".: Тез. докл. - п. Гвардейский., 1994. - Часть I. - С. 40.

2. Бияшева З.М., Чередниченко О.Г., Ахматуллнна Н.Б. Генетические эффекты вируса гриппа: летальные мутации в половых

хромосомах Drosophila melanogaster II Известия АН РК. Серия биол! -|9','5. - N4. С. 21-25.

3. Билик-ва З.М., Чередниченко О.Г., Ахматуллнна Н.Б. Сравнительный анализ мутагенной активности вируса гриппа и его РНП на Drosophila melanogaster// Вестник КазГУ. Серия биол. - 1995.-N 2. С. 27-29.

4. Чередниченко О.Г., Ахматуллнна Н.Б. Цитогенетическне нарушения в лимфоцитах периферической крови больных гриппом // Известия МН-АН РК Серия биол. -1996.- N 6. С. 65-70.

5. Ахматуллнна Н.Б., Чередниченко О.Г. Микроядерный тест в оценке генот оксического действия вируса гриппа in vivo II Известия МН-АН РК Серия биол. - 1996,- N 6. С. 38-42.

6. Чередниченко О.Г., Бияшева З.М., Ахматуллнна Н.Б. Влнянне вируса гриппа и его РНП на политенные хромосомы Drosophila melanogaster// Вестник МН-АН РК,- 1997. - N 1. С. 5T-5fl

1. Чередниченко О.Г. Цитогенетическне нарушения в лимфоцитах периферической крови людей in vivo и in vitro, инфицированных вирусом гриппа // Тез. докл. конф. молодых ученых. - Алматы.- КазГУ. -1998.

8. Бияшева З.М., Чередниченко О.Г. Цитогенетическне эффекты вируса гриппа Н Вестник КазГУ. Серия биол.- 1998.- N 4. С. 131-134.

Чередниченко Оксана Геннадьевна Грипп внруенныц мутагеиди: потенциалы Биология гы.тымдараныц кандидаты гылмми дэрежеа ушин Коргайтын диссертация 03.00.15 - генетика

ТСЖЫРЫМ

Тож^ркбс жоне табиги жагдайда журпзшген зсрггсулсрдщ пошжссшдс грипп вирусыныц мутагендтнше Gipiiinii рст жан-жаклм бага бгрщдь

Грипп вирусыныц ocepiiicii Drosophila mclanogaslcr-mbiGbiHUurm иолитсщц хромосомасыныц кей жсрлсршдс помпа пайла болса, кей жерлернпц бузылатъпщыгы Kopcerlnfli. Сойтш ол хромасоманыц бой тузу TopTi6i б узы лады. Грипп вирусы Drosophila mclanogastcr-шыбынына арнайы осер crrcfli, мысалы, ол канат тузшу ( ocipecc Ml+2 талшыгы) ироцссш бузады, жоне ол тугызатын рсцсссипп ол! мутациялардын кепшшш 2В-10- 3C10-II аймактарда орналаскан болып ШЫК.ТЫ.

Со1щай-ак грипп вирусыныц мутагсшй потенциалына бага 6cpLrmi. Оиыц MyrareitnLniri барлык клеткаларда (мрдси кобеш кдбшеттшгше байланысты болмаса да, они орташа 6e;icciwi мутагендерге жаткызу мумкшднт Kopccniimi.

Грипп вирусыныц мутагендшгше оныц нуклешдж компоненп жауанты сксщип долслдсши.

Cherednichenko Oksana O.

Mutagenic potencial of the influenza virus Thesis for the Degree of the Candidate of Biological Sciences 03.00.15-genetics

SUMMARY

The complex t timation of the influenza virus mutagenecity have been given firstly in vivo and in vitro, that is in the conditions of experiment and natural infection of organism. The destabilization action of the influenza virus to the structure of politenic chromosomes Drosophila melanogitster, which is expressed in the powerful pump formation and resolution of chromosomes.

Some specifity of influenza virus action wias found. It was shown that, given virus disturbs the wing forming process, in particular the vein Ml + 2 . It is found that 7 among 15 studied recessive lethal mutations are localised in the 2B9-10-3C10-11 area.

Influenza virus mutagenic potential estimation was made. It was shown that it can be considered as mutagens of the average activityr it being known that its mutagenecity doesn't depends on the vims ability to reproduce in different cell system.

It is proved that the virus nuclein component is responsible for the virus mutagenecity.