Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эволюция высоковирулентного вируса гриппа A (H5N1) в экосистемах Северной Евразии

ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Эволюция высоковирулентного вируса гриппа A (H5N1) в экосистемах Северной Евразии"

0У4&1

На правах рукописи

Щелканов Михаил Юрьевич

Эволюция высоковирулентного вируса гриппа А (Н51Ч1) в экосистемах Северной Евразии (2005-2009 гг.)

Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук

03.02.02 - вирусология

2 3 СЕН ?0Ю

Научный консультант: академик РАМН, д.м.н., профессор Д.К. Львов

Москва, 2010

004609097

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук научно-исследовательском институте вирусологии имени Д.И. Ивановского РАМН.

Научный консультант: академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор

Дмитрий Константинович Львов

Официальные оппоненты: академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор

Николай Вениаминович Каверин

академик РАМН, доктор биологических наук, профессор

Олег Иванович Киселёв

доктор медицинских наук, профессор Юрий Захарович Гендон

Ведущая организация: Учреждении Российской академии медицинских наук научно-

исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи РАМН

Защита состоится «_»_2010 г. в_часов на заседании Диссертационного

Совета Д 001.020.01 при НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН по адресу: Москва, 123098, ул. Гамалеи, д. 16, конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН.

Автореферат разослан «_»_2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета Д 001.020.01 Доктор медицинских наук

Елена Ивановна Бурцева

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

1.1. Актуальность проблемы.

Вирусы гриппа А (Orthomyxoviridae Influenza A viras), обладающие высокой степенью изменчивости генома, являются этиологическими агентами опасных инфекционных заболеваний человека и животных, способных протекать в форме обширных эпизоотии, эпидемий и пандемий с высокой смертностью [Львов Д.К., 1974, 2010; Сергеев В.А., 1983; Киселёв О.И., 2003; Малеев В.В., 2006; Гендон Ю.З., 2008; Каверин Н.В., 2008].

Геном вируса гриппа А представлен 8 сегментами РНК негативной полярности: [РВ2, РВ1, РА, НА, NP, NA, M,NS], Описаны 16 типов НА (Н1-16) и 9 типов NA (N1-9). Из 144 теоретически возможных субтипов - комбинаций типов НА и NA - в настоящее время, известны 115(79.9%). Развитие молекулярно-генетических методов привело к накоплению большого количества полноразмерных нуклеотидных последовательностей генома, классификация которых позволила выделить отдельные генотипы для каждого сегмента [Lu G., 2007] - РВ2: А-С, E-L (11 генотипов); PB I : A-I (8 генотипов); РА: А-К (11 генотипов); НА: H1:A-D (4 генотипа); Н2:А-1 (9 генотипов); НЗ: A-D, F (5 генотипов); Н4: А-С (3 генотипа); Н5: А-С, Е-К (10 генотипов); Н6: А-0 (7 генотипов); Н7: A-F (6 генотипов); Н8: А (1 генотип); Н9: А-С, E-G, I, J (8 генотипов); Н10:А-Е (4 генотипа); HI 1: А-С (3 генотипа); H12: А, В (2 генотипа); Н13:А-С (3 генотипа); Н14: А (1 генотип); Н15:А (1 генотип); Н16: А, В, С (3 генотипа) (итого для НА: 16 подтипов, 70 генотипов); NP: А-Н (8 генотипов); NA: N1: A-L (12 генотипов); N2: A-G (7 генотипов); N3: A-D, F (4 генотипа); N4: А-С (3 генотипа); N5: B-D (3 генотипа); N6: А-Е (5 генотипов); N7: A-G (7 генотипов); N8: А-С (3 генотипа); N9: А, В (2 генотипа) (итого для NA: 9 подтипов, 46 генотипов); M: A-G (7 генотипов); NS: подтип 1: A-F (6 генотипов); подтип 2: А, В, D (3 генотипа) (итого для NS: 2 подтипа, 9 генотипов).

Природным резервуаром вируса гриппа А являются птицы водно-околоводного экологического комплекса - в первую очередь, подсем. речных уток (Anatinae Leach, 1820) сем. утиных (Anatidae Leach, 1820), а также сем. чайковых (Laridae Rafmesque, 1815) и крачковых (Sternidae Vigors, 1825). Из 115 известных, на сегодняшний день, субтипов вируса гриппа А, 114(99.1 %) изолированы от диких птиц. Современные молекулярно-генетические методы предоставляют всё больше информации о механизмах адаптации птичьих вариантов вируса к новым хозяевам. Поэтому грипп А следует рассматривать как зооантропонозную инфекцию [Львов Д.К., 1974, 2006; Webster R.G., 1976, 1992; Laver W.G., 1979; Lvov D.K., 1987,2008]. Преодолевая межвидовые барьеры, вирусы гриппа А способны проникать в популяции новых потенциальных хозяев, адаптироваться и циркулировать среди них достаточно продолжительное время.

Варианты вирусов гриппа А птиц, имея аффинность рецептор-связывающего сайта НА к 2'-3'-сиаловым кислотам, поражают, главным образом, эпителий кишечника птиц [Гамбарян A.C., 2007]. Инфекция слабовирулентными (LPAI - low pathogenic avian influenza)

1 Семейство Orthomyxoviriduc, в настоящее время, включает 5 родов: Influenza A virus (прототип - вирус гриппа А); Influenza В virus (вирус гриппа В); Influenza С virus (вирус гриппа С); Thogotuvirus (вирус Тогото); Isavirus (вирус инфекционной анемии лососевых) [Kawaoka Y., 2005].

вариантами этого вируса может протекать инаппарантн о, в форме энтерита. Высоковирулентные (HPAI - highly pathogenic avian influenza) варианты, связанные с подтипами НА / Н5 и НА / Н7, вызывают системное заболевание - классическую чуму птиц (КЧП) - при котором ведущими симптомами являются поражение нервной и сосудистой систем [Perroncito Е., 1878; Сюрин В.Н., 1998]. Молекулярным маркёром HPAI-фенотипа является обогащение сайта протеолитического нарезания НА базофильными аминокислотными остатками [Alexander D.J., 1986]. КЧП способна вызвать обширные эпизоотии с уровнем падежа, приближающимся к 100%. По мере роста численности людей и поголовья сельскохозяйственных птиц, такие эпизоотии становятся всё более масштабными, увеличивая риск преодоления вирусом межвидового барьера и формирования нового пандемического варианта [Львов Д.К., 1972,1974,2005; Сюрин В.Н., 1972; Webster R.G., 1976; Lvov D.K., 1987,2008].

Варианты вирусов гриппа А, адаптированные к млекопитающим, имея аффинность рецептор-связывающего сайта НА к 2'-6'-сиаловым кислотам, поражают эпителий слизистой оболочки верхних отделов респираторного тракта, в результате чего происходит дегенерация, некроз и отторжение пораженных клеток трахеи и бронхов [Гамбарян A.C., 2007; Львов Д.К., 2010]. Однако главным звеном в патогенезе гриппа А является поражение сосудистой и нервной систем, возникающее вследствие токсического действия вируса и стимулирования образования активных форм кислорода. Нарушение микроциркуляции является причиной возникновения геморрагических проявлений - от носовых кровотечений до геморрагического отека лёгких и кровоизлияний в вещество головного мозга [Киселёв О.И., 1994; Колобухина Л.В., 2001; Чучалин А.Г., 2006]. Вирусы гриппа А являются этиологическими агентами эпизоотической бронхопневмонии свиней; гриппа и тяжёлых пневмоний, осложнённых бактериальными коинфекциями, человека; заразного катара верхних дыхательных путей лошадей; заразного кашля верблюдов; эпизоотических бронхопневмоний морских млекопитающих [Горбунова A.C., 1973; Сюрин В.Н., 1998; Львов Д.К., 2005; Колобухина Л.В., 2008].

Вирусы гриппа А занимают важное место в структуре заболеваемости людей острыми респираторными вирусными инфекциями (ОРВИ), составляющими до 90 % от всех других инфекционных болезней [Гендон Ю.З., 2001; Киселёв О.И., 2003]. По данным Всемирной Организации здравоохранения (ВОЗ), только тяжёлыми формами гриппа в мире ежегодно заболевают 3-5 млн. человек. Заболеваемость гриппом в РФ - 25-35 млн., из них 45-60 % -дети. Экономический ущерб РФ от сезонного эпидемического гриппа составляет, в среднем, 80 млрд. руб. / год, или порядка 85 % экономических потерь от инфекционных болезней в целом [Онищенко Г.Г., 2002,2006]. Гриппозная инфекция играет важную роль в обострении хронических заболеваний и развитии осложнений, нередко являющихся причиной смерти больных: показано, что наличие хронических сердечно-сосудистых или лёгочных заболеваний повышает риск летального исхода при гриппе в 50-100 раз [Киселёв О.И., 1994; Колобухина Л.В., 2008].

В период пандемий заболеваемость и смертность от гриппа А приобретают катастрофические масштабы стихийного бедствия. Например, пандемия «испанки» (1918-

1919 гг.; прототип - A/Brevig Mission/1/18 (H1N1) [A, A, A, 1A, A, 1A, В, 1A]) привела к заражению 600 млн. и гибели 50-100 млн. (т.е. 30 % и 5 % населения Земли, соответственно). Пандемия «азиатского гриппа» (1957-1959 гг.; прототипный штамм - A/Singapore/1/57 (H2N2) [А, Е, В, 2А, А, 2А, В, 1А]) стала причиной гибели более 1 млн.; пандемия «гонконгского гриппа» (1968-1970 гг.; A/Hong Kong/1/68 (H3N2) [A, D, В, ЗА, А, 2А, В, IAJ) - около 1 млн.; крупная эпидемия «русского гриппа» (1977-1978 гг.; A/USSR/90/77 (H1N1) [А, А, В, IB, А, 1 А, В, 1А]) - около 300 тыс. человек [ГендонЮ.З., 1998; Супотницкий М.В., 2006]. Современная пандемия «свиного гриппа» (2009-2010 гг.; A/California/07/09 (H1N1) swl [С, D, Е, IB, A, IF, F, 1А]), на конец марта 2010 г., по данным ВОЗ, стала причиной более 17 тыс. смертей, потребовала масштабных затрат и усилий международного сообщества на проведение противоэпидемических мероприятий [Львов Д.К., 2010; Цыбалова Л.М., 2010].

Вероятность преодоления вирусом межвидового барьера резко возрастает в период обширных эпизоотий. В частности, пристальное внимание исследователей привлекает современная эпизоотия HPAI/H5N1, которая началась ещё в 1997 г. в Юго-Восточной Азии. Прототипным штаммом для первой волны эпизоотии 1997 г. стал A/chicken/HK/258/97 (H5N1) [G, G, Е, 5J, F, 1G, F, 1Е] (т.н. генотип 0, или H5J 0). Этот штамм сформировался в результате множественных реассортаций: источником НА стал A/goose/Guangdong/1/96 (H5N1) [К, G, D, 5J, F, 1J, F, 2А]; NA - A/teal/HK/W312/97 (H6N1) [G, G, E, 6B, F, 1G, F, 1E]; внутренних генов -A/teal/HK/W312/97 (H6N1) и A/quail/HK/Gl/97 (H9N2) [G, G, E, 9B, F, .2E, F, 1E] [Guan Y., 1999; Hoffmann E., 2000]. Вторая волна эпизоотии началась в 1999-2000 г., когда произошли новые реассортации, в которых участвовали A/goose/Guangdong/1/96 (H5N1) и A/duck/HK/Y280/97 (H9N2) [К, G, Е, 9С, F, 2В, F, 1Е], и сформировались HPAI / H5N1 / 01, принадлежащие реассортационным генотипам A-E [Guan-02, Hatta-01] (не следует путать их с НА-генотипами линии H5J). Третья волна эпизоотии была предсказана отечественными исследователями [Lvov D.K., 2004] осенью 2001 г., когда в популяциях диких птиц Дальневосточно-Притихоокеанского миграционного русла была обнаружена аномально высокая интенсивность циркуляции вирусов гриппа А (Н5). Осенью 2003 г. эпизоотия HPAI / H5N1 охватила Юго-Восточную Азию, и мы стали готовиться к проникновению вируса в Северную Евразию (сформулировав, в частности, цели и задачи настоящей работы). Весной 2005 г. HPAI / H5N1 проник на юг Западной Сибири и осенью того же года вдоль миграционных путей диких птиц - на п-ов Индостан, в Европу, Среднюю Азию, Закавказье, Ближний Восток и в Африку. Весной 2008 г. вирус завершил захват Северной Евразии, проникнув в её восточный сектор.

Распространение HPA1/H5N1 на территории Старого Света может иметь катастрофические последствия в случае появления у этого вируса эпидемического потенциала, так как, во-первых, у человечества отсутствует коллективный иммунитет к вирусам гриппа А (Н5), а во-вторых, из 467 людей, заболевших в результате заражения HPAI / H5N1 за 2003-2009 гг., 282 умерли, т.е. летальность достигает 60 % [www.who.int].

Поскольку Северная Евразия является крупнейшим гнездовым ареалом птиц водно-околоводного экологического комплекса, где происходят интенсивные межвидовые взаимодействия в системе «вирусы гриппа А - дикие и домашние птицы - млекопитающие», а

также активная амплификация вирусных вариантов в неиммунных популяциях сеголетних птиц, изучение эволюции HPAI/H5N1 на данной территории представляет не только фундаментальный, но и несомненный научно-практический интерес.

1.2. Цель исследования: изучение эволюции HPAI/H5N1 в процессе популяционных взаимодействий вируса, диких и домашних животных на основе комплексного эколого-вирусологического мониторинга в экосистемах Северной Евразии.

Работа выполнялась в соответствие с планом НИР «Популяционные взаимодействия в системе:вирусы гриппа - человек - животные» (госрегистрация № 0120.0 603538) и «Новые и возвращающиеся вирусные инфекции в системе биобезопасности государства» (госрегистрация № 0120.0 603544) НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН.

1.3. Задачи исследования:

> изучить характеристики циркуляции различных вариантов вируса гриппа А в экосистемах Северной Евразии накануне проникновения в них высоковирулентного вируса гриппа A (H5N1);

> установить и обосновать схемы проникновения HPAI/H5N1 в экосистемы Северной Евразии;

> изучить экологические, фенотипические и молекулярно-генетические характеристики, установить корреляции между гено- и фенотипом вариантов HPAI / H5N1, получивших распространение в Северной Евразии;

> выяснить пути распространения и схемы циркуляции HPAI / H5N1 на территории Северной Евразии.

1.4. Научная новизна работы заключается в том, что впервые были проанализированы причины и последствия проникновения вариантов HPAI / H5N1 - с полными генотипами [К, G, D, 5J 2.2, F, 1 J, F, 1Е] и [К, G, D, 5J 2.3.2, F, 1 J, F, 1Е] - в Северную Евразию, описан процесс их распространения и молекулярной эволюции. Это стало возможным благодаря включению современных молекулярно-генетических методов в технологическую цепочку эколого-вирусологических исследований, что также имеет инновационное значение: удалось интегрировать результаты экологических, вирусологических и молекулярно-генетических данных в единый комплекс, позволяющий вырабатывать достоверные среднесрочные прогнозы развития эпизоотии высоковирулентного вируса гриппа A (H5N1) в экосистемах Северной Евразии.

Впервые удалось добиться регулярного оперативного - в течение нескольких дней -получения молекулярно-вирусологических данных в ходе расшифровки эпизоотических вспышек HPAI / H5N1 в экосистемах Северной Евразии.

Разработаны новые высокоэффективные модели инфекции, вызванной HPAI/H5N1, в культурах клеток различного происхождения in vitro для разработки диагностических, лечебных и профилактических препаратов. Получен патент РФ № 2309983 (приоритет от 25.11.2005 г.) «Метод первичной изоляции штаммов вируса гриппа А, штамм virus A/duck/Novosibirsk/56/05 (H5N1) для приготовления диагностических и

профилактических препаратов, для оценки противовирусной активности различных соединений». С помощью этих моделей получены приоритетные данные о резистентности и чувствительности к действию ряда противогриппозных препаратов вариантов HPAI/H5N1, получивших распространение в экосистемах Северной Евразии.

Впервые рекомендованы производственные штаммы HPAI / H5N1, один из которых был использован для разработки и крупномасштабного производства отечественной ветеринарной вакцины.

1.5. Практическая ценность работы.

Показано, что в период 2001-2005 гг. HPAI/H5 отсутствовали на территории Северной Евразии, что является важным элементом доказательства интродукции этого вируса весной 2005 г..

Установлен этиологический агент - HPAI / H5N1 - для восьми крупных эпизоотических эпизодов на территории Северной Евразии, что позволило корректно спланировать систему противоэпизоотических мероприятий.

Показано, что HPAI/H5N1, получивший распространение в экосистемах Северной Евразии, содержит ряд молекулярных маркёров, повышающих тропизм к клеткам млекопитающих и эпидемический потенциал этого вируса.

В результате анализа генома и прямых биологических экспериментов на высокоэффективных моделях in vitro было установлено, что штаммы HPAI / H5N1 Северной Евразии чувствительны к коммерческим антигриппозным химиопрепаратам -ремантдину, озельтамивиру, арбидолу и рибавирину - что чрезвычайно важно с точки зрения подготовки к возможной эпидемии и пандемии HPAI/H5N1, а также химиотерапии и химиопрофилактики контингентов повышенного риска заболеваемости (персонала ПТФ, ветеринаров, охотоведов и т.д.).

Получен приоритет по депонированию в Государственную Коллекцию вирусов РФ (ГКВ РФ) 60 штаммов HPAI / H5N1 (2005-2009 гг.) и 1 штамма LPAI / H5N3 (2003 г.). Штамм A/chicken/Novosibirsk/64/05 предложен в качестве кандидата в вакцинные штаммы и используется для крупномасштабного производства отечественной ветеринарной вакцины «ФЛУ ПРОТЕСТ Н5».

1.6. Основные положения, выносимые на защиту:

В период 2001-2004 гг. - накануне проникновения в Северную Евразию HPAI / H5N1 - на данной территории этот вирус обнаружен не был. Это является одним из элементов доказательства проникновения HPAI / H5N1 в Западную Сибирь весной 2005 г..

♦> Вирус гриппа А, вызвавший эпизоотическую вспышку среди диких и домашних птиц в Барабинской низменности летом 2005 г., имел высоковирулентный фенотип, принадлежал к генотипу [К, G, D, 5J 2.2, F, 1J, F, 1Е] и был генетически близок к штаммам, изолированным на оз. Кукунор (пров. Цинхай, КНР) весной 2005 г.. Проникновение Цинхай-Сибирского генотипа (H5J 2.2) в Северную Евразию произошло во время весенней миграции диких птиц 2005 г. из Юго-Восточной Азии через оз. Кукунор и «Джунгарские ворота» (тектоническое понижение между Тянь-Шанем и Монгольским Алтаем).

❖ Цинхай-Сибирский генотип (H5J 2.2) HPAI/H5N1, начиная с весны 2005 г. и по настоящее время, обладает следующими молекулярно-генетическими характеристиками: сайт протеолитического нарезания НА - P337QGERRRKKRJGLF349 - обогащенный основными а.о., является маркёром HPAI-фенотипа; РСС НА соответствует птичьим вариантам вируса гриппа А с повышенной аффинностью к а2'-3'-сиаловым кислотам; в домене НА2 отсутствуют мутации, свойственные арбидол-резистентным штаммам; белок NA содержит делецию -C49NQSIITYENNTWVNQTYVN680TH0cm^bH0 штамма A/goose/Guangdong/1/96 (H5N1), что свидетельствует о принадлежности к генотипу Z; в белке NA отсутствуют мутации, характерные для озельтамивир-резистентных штаммов; белок РВ2 содержит сайт Кб27, РВ1 -Р,з, NSI - К41, S42, делецию A80IASS84 (относительно консенсуса HPAI/H5N1) и Е92, являющиеся маркёрами повышенного тропизма вируса к клеткам млекопитающих; в белке РВ1 содержится ORF (95-367 н.о. относительно ORF PB 1) для неструктурного белка PB1-F2, играющего важную роль в индукции апоптоза; белок М2 содержит L26, V27, А30, S3! и G34, определяющие чувствительность к адамантановым производным - ремантадину и амантадину. Таким образом, штаммы Цинхай-Сибирского генотипа (H5J2.2) содержат ряд маркёров повышенной вирулентности по отношению к клеткам млекопитающих, что увеличивает вероятность преодоления межвидового барьера. Вирус сохраняет аффинность РСС НА к а2'-З'-сиаловым кислотам, содержащимся на поверхности эпителия птиц. Штаммы Цинхай-Сибирского генотипа чувствительны к химиопрепаратам - ингибиторам нейраминидазной активности, функционирования протонных каналов, формируемых М2-тетрамерами, слияния мембран вириона и эндосомы, что подтверждается результатами как анализа генома, так и прямых экспериментов in vitro.

♦> Распространение HPAI/H5N1 Цинхай-Сибирского генотипа (H5J 2.2) в западном секторе Северной Евразии осенью 2005 г. происходило в южном направлении вдоль Индо-Азиатского миграционного русла (в результате чего вирус проник на п-ов Индостан) и в юго-западном направлении вдоль Восточно-Европейского миграционного русла диких птиц, которые занесли вирус на юг Русской равнины, в Черноморско-Прикаспийский регион, откуда HP AI / H5N1 проник в страны Восточной и Западной Европы, Закавказья, Ближнего Востока и Африки. В этот период эпизоотия охватывала всё новые популяции неиммунных хозяев, а потому генетический дрейф вируса был выражен слабо.

❖ Весной 2006 г. распространение HPAI/H5N1 Цинхай-Сибирского генотипа (H5J 2.2) происходило в направлении из зимовочных ареалов к гнездовым ареалам на территории Северной Евразии. В частности, в этот период вирус проник с дикими утками с п- ва Индостан в Восточную Сибирь, где вызвал на оз. Убсу-Нур (на границе Республики Тыва РФ и МНР) одну из крупнейших эпизоотий с высоким уровнем падежа среди диких птиц. При расшифровке этой эпизоотии были впервые обнаружены варианты Цинхай-Сибирского генотипа (H5J 2.2) Тувинско-Сибирской подгруппы.

•> В феврале 2007 г. в Подмосковье имели место 9 локальных эпизоотических вспышек (8 - в Московской, 1 - в Калужской обл.), этиологически связанных с HPAI/H5N1 Цинхай-Сибирского генотипа (H5J 2.2) и происходящих из единого источника на рынке «Садовод»

(Юго-Восточный адм. округ г. Москвы) в результате непреднамеренных рукотворных действий. Штаммы, изолированные при расшифровке этой эпизоотии, были генетически близки к штаммам, полученным осенью 2006 г. в Причерноморско-Каспийском регионе, имели ряд уникальных аминокислотных замен относительно консенсуса Цинхай-Сибирсхого генотипа (особенно в белке РВ1, все 8 аминокислотных замен оказались уникальными) и положили начало новой генетической подгруппе внутри генотипа H5J 2.2 - Ирано-Северокавказской.

❖ В сентябре 2007 г. эпизоотическая вспышка среди диких и домашних птиц на лимане Лебяжий вблизи юго-восточного побережья Азовского моря (Краснодарский край) была этиологически связана с HPAI/H5N1 Цинхай-Сибирского генотипа (H5J 2.2) Тувинско-Сибирской подгруппы.

❖ Эпизоотическая вспышка в северной части Кубано-Приазовской низменности в декабре 2007 г. с эпицентром на ПТФ «Гуляй-Борисовская» (Ростовская обл.) имела ряд экологических особенностей: указанная ПТФ стала источником массового заражения диких птиц наземного экологического комплекса - грачей (Corvus frugilegus), ворон (Corvus corone), голубей (Columba livia), воробьев (Passer montamis) и скворцов (Sturmis vulgaris) - у которых также наблюдали клинические проявления инфекции. Этиологический агент эпизоотии относился к Ирано-Северокавказской подгруппе Цинхай-Сибирского генотипа (H5J 2.2).

♦♦♦ Центром генетического разнообразия высоковирулентного вируса гриппа А птиц Цинхай-Сибирского генотипа (H5J 2.2) на территории западного сектора Северной Евразии является Кубано-Приазовская низменность.

•> Уровень вирулентности штаммов Цинхай-Сибирского генотипа (H5J 2.2) последовательно снижался в период 2005-2007 гг.. Наиболее выраженное снижение вирулентности обнаружено в штаммах от домашних птиц, наименее выраженое - в штаммах от диких птиц. Путём сопоставления фенотипических и молекулярно-генетических данных выявлены точечные аминокислотные замены, вероятно влияющие на снижение вирулентности.

❖ С весны 2005 г., когда HPAI/H5N1 начал распространяться в западном секторе Северной Евразии, и до весны 2008 г. в восточном секторе Северной Евразии не были обнаружены варианты HPAI / H5N1. В период 2005-2007 гг. на Дальнем Востоке - в Средне-Амурской низм. и юге Приморского края - методом ОТ-ПЦР обнаруживались лишь LPAI / Н5 (главным образом, среди, птиц водно-околоводного экологического комплекса). Проникновение HPAI/H5N1 в экосистемы восточного сектора Северной Евразии произошло весной 2008 г. с мигрирующими дикими птицами из южных провинций КНР и примыкающих территорий Вьетнама и Лаоса и было связано с Уссурийским генотипом (H5J 2.3.2).

♦> Эпизоотическая вспышка среди диких птиц на оз. Убсу-Нур летом 2009 г. была этиологически связана с HPAI/H5N1 Уссурийского генотипа (H5J 2.3.2). Проникновение вируса произошло из Юго-Восточной Азии вдоль Джунгарского миграционного русла.

❖ Цинхай-Сибирский (H5J2.2) генотип, распространённый в западном секторе Северной Евразии, отличается от Уссурийского (H5J 2.3.2), распространённого в восточном секторе, на 4.6-7.0 % по ORF НА; в среднем, - на 5.8 %. Внутри генотипа H5J 2.2 можно выделить 4 генетические подгруппы (Цинхайскую, Западносибирскую, Тувинско-Сибирскую и

Ирано-Северокавказскую), ORF НА которых отличаются, в среднем, на 1.5%; а внутри H5J 2.3.2 - 2 генетические подгруппы (Дальневосточно-Южнокитайскую и Западномонгольскую) и 2.1 %, соответственно.

1.7. Апробация диссертационной работы осуществлялась в ходе проведения ежегодных отчётных конференциях НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН 20012009 гг.; сессий Проблемной комиссии по гриппу РАМН; V Межрегиональной научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы здоровья населения Сибири: гигиенические и эпидемиологические аспекты» (Омск, Россия; 2526 ноября 2004 г.); X Национальной конференции Монгольской Народной Республики «Актуальные вопросы вирусологии» (Улан-Батор, МНР; 25 ноября 2004 г.); Международном семинаре «Изменение климата и здоровье населения России в XXI веке» (Москва, Россия; 56 апреля 2004 г.); III Всероссийской научно-практической конференции «Информационные технологии и математическое моделирование (ИТММ-2004)» (Анжеро-Судженск, Россия, 1112 декабря 2004 г.); Всероссийской научно-практической конференции «Качество образования: теория и практика» (Анжеро-Судженск, Россия, 10-11 декабря 2004 г.); Международной научно-практической конференции «Болезни диких животных» (Покров, Владимирская обл., Россия, 28-30 сентября 2004 г.); Международной конференции «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний» (Кольцово, Новосибирская обл., Россия; 8-10 сентября 2004 г.); Всероссийской научной конференции с участием зарубежных учёных «Сибирская зоологическая Конференция» (Новосибирск, Россия; 15-22 сентября 2004 г.); Международной научной конференции «Современные проблемы эпизоотологии» (Краснообск, Новосибирская обл., Россия; 30 июня 2004 г.); Российской научно-практической конференции «Узловые вопросы борьбы с инфекцией» (Санкт-Петербург, Россия; 1-2 декабря 2004 г.); III Всероссийской конференции с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, Россия; 2024 января 2004 г.); Ш-го Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, Россия; 14-18 марта 2005 г.); Second European Influenza conference (Valetta, Malta; September 11-14, 2005); Российской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» (Сосновка, Новосибирская обл., Россия; 25-27 октября 2005 г.); XI международной научной конференции «Современные проблемы информатизации в прикладных задачах» (Воронеж, Россия; 15-20 января 2006 г.); XII Международной орнитологической конференции (Ставрополь, Россия; 31 января -5 февраля 2006 г.); VI Научно-практической конференции «Проблемы прогнозирования чрезвычайных ситуаций» (п. Никола, Иркутская обл., Россия; 5-7 сентября 2006 г.); VI International conference «Options for the Control of Influenza» (Toronto, Canada; June 17-23, 2007); 6-ой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2007» («Генодиагностика-2007») (Москва, Россия; 28-30 ноября 2007 г.); IV Международного ветеринарного конгресса по птицеводству (Москва, Россия; 0811 апреля 2008); XIV International congress of virology (Istanbul, Turkey; August 10-15, 2008); Международной научно-практической конференции «Проблемы совершенствования

межгосударственного взаимодействия в подготовке к пандемии гриппа» (Новосибирск, Россия; 9-10 октября 2008 г.); VI Научно-практической конференции «Инфекционные болезни и антимикробные средства» (Москва, Россия; 2-3 октября 2008 г.); International conférence «New trends in infectious diseases» (Lyon, France; November 26-28, 2008); 8Л Asia-Pacific congress of médical virology «Emerging zoonotic viruses in Northern Asia-Pacific ecosystems» (Hong Kong; February 24 - March 02, 2009); Международной научно-практической конференции «Перспективы сотрудничества государств-членов ШОС в противодействии угрозе инфекционных болезней» (Сосновка, Новосибирская обл., Россия; 14-15 мая 2009 г.); Международной конференции «Emerging influenza viruses: H5N1, H1N1» (Marburg, Germany; February 15-16, 2010).

Диссертационная работа получила рекомендации к защите в Диссертационном Совете Д 001.020.01 на совместном заседании Совета по предварительной экспертизе диссертационных работ по специальности «Вирусология» при НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН и Отдела экологии вирусов НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН (Протокол № 7 от 27.05.2010).

1.8. Научные публикации по теме диссертации.

Результаты диссертационной работы отражены в 61 научной публикации: в 26 статьях (в том числе, опубликованных в периодических научных изданиях из списка ВАК - 22); в 1 главе монографии; в 2 статьях научных сборников; в 32 тезисах научных конференций (13 -российских; 1 - Национальной конференции МНР; 13 - международных, проводимых в России; 5 - международных зарубежных).

1.9. Структура диссертационной работы (488 с. машинописного текста): «Содержание» (9 с.), «Введение» (Юс.); «Обзор литературы» (175 с., 108 рис., 18 табл.); «Собственные исследования» (178 е., 66 рис., 63 табл.); «Обсуждение полученных результатов» (25 с., 7 рис., 4 табл.); «Выводы» (2 с.), «Дополнительные материалы» (89 с.; список использованной литературы содержит 1256 наименований, из которых 521 - на русском языке).

2. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Материалы и методы.

Сбор полевого материала - клоакальных смывов и внутренних органов от диких и домашних птиц - осуществляли в процессе планового мониторинга ключевых точек Северной Евразии, а также при расшифровке эпизоотий (табл. 1, рис. 1). Полевой материал доставлялся в лабораторию в сосудах Дьюара с жидким азотом (-196 °С) и хранился в низкотемпературны холодильниках при температуре не выше - 50 °С; все промежуточные операции осуществлялись без разрыва холодовой цепочки с применеием сухого льда (- 74 °С) [Львов Д.К., 1995,2008].

Обратную транскрипцию с последующей полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР) для индикация РНК вируса гриппа А в полевом матерале и вирусосодержащих образцах после

Таблица 1 (начало). Данные о штаммах" НРА1 / Н5Ы1 (2005-2009 гг.), депонированных в ГКВ РФ.

Месяц, год Регион Месяц, год Регион Номер депонента в ГКВ РФ Клиническая форма" \% ТСШи/ мл для спэв

Июль 2005 г. (генотип Н5.1 2.2) (п. 2.3.1) Юг Западной Сибири (Новосибирская обл.) дикие А^геЬе/1УоУО$1Ыг8к/29/05 2372 БКП 5.7

Среднее значение: 5.7

домашние А/(1искЛ\'оусшЫг5к/56/05 2371 БЛН 7.7

А/аисШоуо81Ыг5к/67/05 2376 СПГ 10.2

А/сЫскеп/Моуоз1Ыг5к/64/05 2373 СПГ 11.2

А/сЫскеп/1<оуоз1Ыг8к/65/05 2374 СПГ 10.7

А/сЫскеп/№>уоз1Ыгек/66/05 2375 СПГ 10.7

Среднее значение: 10.1

Ноябрь 2005 г. (генотип Н5Л 2.2) (п. 2.3.2) Дельта Волги (Астраханская обл., Республика Калмыкия) дикие A/Cygnus о1ог/А$«гак(1ап/?и(05-2-1/05 2379 БЛН 3.7

АД^пив о1ог/АЯгакЬап/Л5105-2-2/05 2380 БЛН 4.2

АЛ^пиз о1ог/А81гакЬап/А5№5-2-3/05 2381 БЛН 4.2

А/Судши о1ог/А«1гакЬап/Л8105-2-4/05 2382 БЛН 3.7

А/Суепш о1пг/А$(гакЬап/А?Ю5-2-5/05 2383 БЛН 5.2

A/Cygnus о1ог/Л$1гакЬап/А5Ю5-2-6/05 2384 БЛН 5.2

А/Сует» о1ог/А5»гакЬап/Л8Ю5-2-7/05 2385 БЛН 5.7

A/Cygnus о1ог/А81гакЬап/А5Ю5-2-8/05 2386 БЛН 4.2

A/Cygnus о1ог/А81гакЬап/А8№5-2-9/05 2387 БЛН 3.2

A/Cygllus о1ог/Л5(гакЬап/А$Ю5-2-10/05 2388 БЛН 4.7

Среднее значение: 4.4

Июнь 2006 г. (генотип Н5.1 2.2) (п. 2.3.3) Озеро Убсу-Нур (Республика Тыва) дикие А^геЬе/Тууа/Туу0б-1/06 2393 БЛН 8.0

А^геЬе/Тууа/Туу06-2/06 2394 БЛН 8.5

А/согтогаШ/Тууа/Гуу06-4/06 2396 БКП 5.0

А/соо1/Тууа/Туу06-6/06 2397 БЛН 5.0

А^геЬе/Тууа/Туу06-8/06 2395 СПГ 8.0

АЛет/Тууа/Туу06-18/06 2399 БКП 5.0

Среднее значение: 6.6

Февраль 2007 г. (генотип Н5.1 2.2) (п. 2.3.4) Подмосковье (Московская обл., Калужская обл.) домашние A/chicken/Moscow/l/07 (Одинцовский р-н МО) 2403 СПГ 4.0

А/сЫскеп/Мовсоуг/гДЛ (Домодедовский р-н МО) 2404 СПГ 4.5

А/сЫскеп/Мо5со«'/3/07 (Подольский р-н МО) 2405 СПГ 4.0

А/сЫскеп/Мозсо\у/4/07 (Нарофоминский р-н МО) 2406 СПГ 4.0

А/еоо5е/Мо5сош/5/07 (Талдомский р-н МО) 2407 СПГ 4.0

A/ch¡cken/Moscow/6/07 (Волоколамский р-н МО) 2408 СПГ 4.5

А/еЬ1скеп/Мо5Сош/7/07 (Раменский р-н МО) 2409 СПГ 4.5

А/сЫскеп/Мозсо\у/8/07 (Дмитровский р-н МО) 2410 СПГ 4.0

А/сЫскеп/Мо5со\у/9/07 (Боровский р-н КО) 2414 СПГ 4.0

Среднее значение: 4.2

'Жирным шрифтом выделены штаммы, для которых имеются сиквенсы полноразмрных геномов в базе данных вепВапк; «МО» - Московская область, «КО» - Калужская область. " «БКП» - без клинических проявлений, «БЛН» - больная, «СПГ» - свежепогибшая птица.

Таблица 1 (окончание). Данные о штаммах' НРА1 / Н5М1 (2005-2009 гг.), депонированных в ГКВ РФ.

Сентябрь 2007 г. I § (генотип Н5.1 2.2) | § Ц' (п. 2.3.5) | ? Регион Экологиче екая группа птиц Штамм Номер депонента в ГКВ РФ Клиническая форма" igTCHV мл для спэв

Северо-восточная часть акватории Азовского моря (Краснодарский край) дикие A/Cygnus cygnus/Krasnodar/329/07 2421 БЛН 3.5

Среднее значение: 3.5

домашние A/c(i¡cken/Krasnodar/300/07 2418 БЛН 3.5

A/chicken/Krasnodar/301 /07 2419 БЛН 3.0

A/chicken/Krasnodar/302/07 2420 БЛН 3.5

Среднее значение: 33

Декабрь 2007 г. (генотип H5J 2.2) (п. 2.3.6) Юго-западная часть Русской Равнины (Ростовская обл.) дикие A/pigeon/Rostov-on-Don/6/07 2423 БКП 6.5

A/pigeon/Rostov-on-Don/7/07 2424 БКП 5.5

A/heron/Rostov-on-Don/11/07 2425 БКП 6.0

A/pigeon/Rostov-on-Don/21/07 2426 БКП 6.0

A/rook/Rostov-on-Don/26/07 2427 БКП 6.5

A/rook/Rostov-on-Don/27/07 2428 БКП 6.0

A/tree sparrow/Rostov-on-Don/28/07 2429 БКП 6.0

A/starling/Rostov-on-Don/39/07 2435 БКП 6.0

Среднее значение: 6.1

домашние A/chicken/Rostov-on-Don/31 /07 2430 БЛН 7.5

A/chicken/Rostov-on-Don/32/07 2431 БЛН 7.0

A/chicken/Rostov-on-Don/33/07 2432 СПГ 7.0

A/chicken/Rostov-on-Don/34/07 2433 СПГ 7.5

A/chicken/Rostov-on-Don/35/07 2434 СПГ 7.0

A/muscovy duck/Rostov-on-Don/51/07 2436 СПГ 7.0

A/chicken/Rostov-on-Don/52/07 2437 СПГ 7.5

Среднее значение: 7.2

Апрель 2008 г. (генотип H5J 2.3.2) (п. 2.5.1) Суйфун-Ханкайская низменность (Приморский край) дикие A/Anas crecca/Primorje/8/08 2441 БКП 4.0

Среднее значение: 4.0

домашние A/chicken/Primorje/1/08 2440 СПГ 4.5

A/chicken/Primoije/11/08 2442 СПГ 4.0

A/chicken/Primoij e/12/08 2443 СПГ 4.5

Среднее значение: 43

Июнь 2009 г. (генотип H5J 2.3.2) (п. 2.5.2) Озеро Убсу-Нур (Республика Тыва) дикие A/grebe/Tyva/3/09 2461 СПГ 3.0

A/grebe/Tyva/5/09 2462 СПГ 2.0

A/grebe/Tyva/8/09 2463 СПГ 2.5

A/bean goose/Tyva/10/09 2464 СПГ 2.5

A/grebe/Tyva/15/09 2465 СПГ 3.0

A/grebe/Tyva/16/09 2466 БКП 2.0

Среднее значение: 2.5

Жирным шрифтом выделены штаммы, для которых имеются сиквенсы полноразмрных геномов в базе данных вепБапк; «МО» - Московская область, «КО» - Калужская область. " «БКП» - без клинических проявлений, «БЛН» - больная, «СПГ» - свежепогибшая птица.

Рисунок 1. Клинические признаки заболевания КЧП, этиологически связанной с HPAI/H5N1, у диких и домашних птиц:

А - характерные движения - высокое поднятие киля - у больного красноголового нырка (Aythya ferina)',

Б - больная домашняя утка (Anas platyrhynchos domestícus) в период заваливания головы: на спине у основания шеи видны признаки дерматита и гиперемии кожного покрова; помутнение роговицы;

В - инъекция сосудов двенадцатиперстного участка кишечника и изменение структуры поджелудочной железы красноголового нырка (Aythya ferina);

Г-цианоз и отек слизистой оболочки пищевода с точечными кровоизлияниями у домашней курицы (Gallus gallus domestícus)]

Д - парез нижних конечностей у больного лебедя-шипуна (Cygnus olor)-,

Е - утыкание клюва в дно лодки, искривление шеи, заваливание тела на киль у больного лебедя-шипуна (Cygnus olor)]

Ж - инъекция сосудов двенадцатиперстного отдела кишечника и брыжейки у больного лебедя-шипуна (Cygnus olor);

3 - поздняя стадия заболевания у чомги (Podiceps cristatus): отчётливо выражены признаки нейроинфекции;

И - ранняя стадия заболевания у лысухи (Fúlica atra): малоподвижность и дыхательная недостаточность при отсутствии признаков нейроинфекции на фоне умеренного энтерита;

К - кровоизлияние в жировую ткань у инфицированной домашней курицы (Gallus gallus domestícus);

Л - полнокровие сосудов кишечника у инфицированного сизого голубя (Columba livia)',

М - полнокровие сосудов кишечника и изменение структуры поджелудочной железы у мёртвого инфицированного грача (Corvus frugilegus).

изоляции проводили с использованием праймеров, специфичных для сегментов NP, НА / Н5 и НА/Н7, а ОТ-ПЦР в реальном времени (ОТ-ПЦР-РВ) - М и НА/Н5 [Киреев Д.Е., 2007; Гребенникова Т.В., 2008].

Изоляцию вируса проводили путём заражения 9-10-дневных развивающихся куриных эмбрионов в аллантоисную полость, а также клеточных линий СПЭВ и MDCK [Шубладзе А.К., 1949; Соминина А.А., 2006], предоставленных РККК при НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН.

Идентификацию штаммов осуществляли с помощью РГА, РТГА [Hirst G.K., 1941; МУ 3.3.2.1758-03], ИФА [МУ 3.3.2.1758-03Бутенко A.M., 2008], РН [Шубладзе А.К., 1949; Дерябин П.Г., 2008], биологических микрочипов [Мирзабеков А.Д., 2003;

Гребенникова Т.В., 2008], ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР-РВ с набором специфических праймеров, а также - в ряде случаев - с помощью секвенирования нуклеотидных последовательностей полноразмерного вирусного генома или его фрагментов [Sanger F., 1977; Прилипов А.Г., 2008].

Изучение спектра клеточного тропизма штаммов HPAI/H5N1 проводили с использованием перевиваемых клеточных линий MDCK, СПЭВ, ВНК-21, HEL, Vero-E6, Mpf, L929, СС81, CRFK, предоставленных РККК при НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН [Каталог РККК, 1999], а также первичной культуры клеток ФЭК [Дерябин П.Г., 2007].

Изучение чувствительности штаммов НРА1/H5N1 к химиопрепаратам in vitro проводили при заражении клеточной линии СПЭВ. Снижение уровня репродукции вируса в присутствие препаратов - солянокислого ремантадина (АО «Адамантан», РФ), солянокислого амантадина («Олайнфарм», Латвия), рибавирина (виразол) (ICN Pharmaceutical, США), арбидола («Мастерлек» РФ) - по сравнению с контролем без препарата оценивали по уровню ЦПД, титра в РТГА и с помощью ИФА [Ленёва И.А., 1994; Львов Д.К., 2006].

Депонирование прототипных штаммов осуществляли в ГКВ РФ (табл. 1) [Фадеева Л.Л., 2008], а нуклеотидных последовательностей - в международную базу данных GenBank [Benson D.A., 2010].

Анализ нуклеотидных последовательностей проводили с использованием собственных информационных технологий на основе MS Excel, MatLab и WinStatics [Shchelkanov M.Yu., 1997; Щелканов М.Ю., 1998].

2.2. Мониторинг вирусов гриппа А на территории Северной Евразии в период 2001-2004 гг..

В период 2001-2004 гг. на территории Северной Евразии изолировались только низковирулентные штаммы вирусов гриппа А, включая Н5 (рис. 2). Штамм LPAI А/Anas platyrhynchos/Chany Lake/9/03 был депонирован в ГКВ РФ (Удостоверение ГКВ 2366).

Отсутствие высоковирулентных штаммов вируса гриппа А (Н5) в Северной Евразии на протяжении 2001-2004 гг. является одним из элементов доказательства проникновения HPAI / H5N1 в Западную Сибирь весной 2005 г..

Северо-западный Прикаспий

Южная часть Приморья (2003-2004)

№N8 Н4М8 Н6№ НШ4 ВБН ПМВП^

Рисунок 2. Изоляция низковирулентных штаммов от диких и домашних птиц в ключевых точках Северной Евразии (2001-2004 гг.).

2.3. Развитие эпизоотии НРА1 / Н51Ч1 в западном секторе Северной Евразии, начиная с весны 2005 г..

2.3.1. Расшифровка эпизоотии с высоким уровнем падежа среди диких и домашних птиц на юге Западной Сибири летом 2005 г. (см. рис. 12) позволила ретроспективно установить, что этиологическим агентом является НРА1/Н5Ш [К, в, Б, 5.1 2.2, Р, и, Р, 1Е], который генетически близок к штаммам, изолированным от диких птиц на оз. Кукунор (пров. Цинхай КНР) в мае 2005 г., и вместе с ними формирует Цинхай-Сибирский генотип, получивший позднее международное обозначение Н5.1 2.2 (рис. 3). Молекулярные маркёры биологических свойств этого генотипа НРА1 / Н5Ы1 представлены в табл. 2.

По данным ОТ-ПЦР, заражённость в очаге эпизоотии домашних птиц была свыше 95 %, диких - 35-50 % (главным образом, - водного экологического комплекса: речных уток (АпаИпае) и больших поганок (РоЛсерБ сгШМия)). Методом биопробы на модели РКЭ и перевиваемых клеточных линий были изолированы 6 штаммов НРА1/Н5>11 из клоакальных смывов и внутренних органов диких птиц без клинических проявлений, а также от погибших и больных домашних птиц (табл. 1). В клеточных культурах эти штаммы репродуцировались без добавления трипсина. Чувствительность клеточных линий последовательно возрастала в ряду

ВНК-21 -> HEL-* Vcro-Еб MDCK-* СПЭВ. Штамм A/chicken/Novosibirsk/64/05, обладавший рекордным уровнем как продуктивности in vitro, так и титров антисывороток в РТГА, был выбран в качестве вакцинного кандидата: этот штамм используется для крупномасштабного производства отечественной ветеринарной вакцины «ФЛУ ПРОТЕКТ Н5».

Рисунок 3. Иерархическая структура нуклеотидных последовательностей полноразмерных ORF НА (1 707 н.о.) для прототипных штаммов HPAI / Н5, визуализированная с помощью UPGMA-апгоритма. Названия штаммов, изолированных в Чановской котловине летом 2005 г., выделены рамкой.

2.3.2. Расшифровка эпизоотии с высоким уровнем падежа среди лебедей-шипунов (Cygniis olor) в нижнем поясе дельты Волги в ноябре 2005 г. (см. рис. 12) показала, что этиологическим агентом был HPAI/H5N1, в генетическом отношении, близкий к западносибирским штаммам того же года (см. п. 2.3.1) и вместе с ними формирующий т.н. западносибирскую подгруппу Цинхай-Сибирского генотипа (рис. 4, 13, табл. 8-9).

Все лебеди-шипуны (100 %) с клиническими признаками заболевания были положительны в ОТ-ПЦР.

Генетические характеристики почти всех изолированных штаммов были идентичны западносибирским; исключение составлял только штамм A/Cygnus olor/Astrakhan/Ast05-2-4/05, который содержал сайт Ебгу вместо К(,27 в белке РВ2, что свойственно большинству штаммов от птиц.

Таблица 2. Молекулярные маркёры биологических свойств Цинхай-Сибирского генотипа.

Белок вируса Сайт Аминокислотная последовательность Потенциальные биологические свойства

РВ2 627 К Повышенный тропизм вируса к клеткам млекопитающих.

РВ1 13 Р Повышенный тропизм вируса к клеткам млекопитающих.

РВ1- F2 1-90 н.о. 95-367 относительно ORFPB1 Неструктурный беяок, играющий важную роль в индукции апоптоза.

НА 337349 pqgerrrkkrIg LF Сайт протеолитического нарезания гемагглютинина, обогащённый основными а.о., свидетельствует о HPAI-фенотипе.

202 Е РСС, высокоафинный к а2'-3'-сиаловым кислотам, содержащихся на поверхности клеток кишечника птиц.

238 0

240 G

376 Q Чувствительность к арбидолу .

388 Q

397 К

467 к

NA 49-68 CNQSIITYENN TWVNQTYVN Делеция относительно штамма A/goose/Guangdong/1/96 (H5N1) является маркёром вирулентности по отношению к курам (т.н. генотип Z).

99 Е Чувствительность к ингибиторам нейраминидазной активности - озельтамивиру * и занамивиру.

255 Н

273 R

275 N

М2 NS1 26 L Чувствительность к ингибиторам каналообразующей активности тетраметров М2 - ремантадину и амантадину.

27 V

30 А

31 S

34 G

41 К Повышенный тропизм к клеткам млекопитающих.

42 S

80-84 AIASS Делеция относительно консенсуса HPAI / H5N1 повышает тропизм к клеткам млекопитающих

92 Е Повышенный тропизм к клеткам млекопитающих.

Подтверждено прямыми экспериментами in vitro.

2.3.3. Расшифровка эпизоотии с высоким уровнем падежа среди диких птиц на оз. Убсу-Нур летом 2006 г. (см. рис. 12) выявила этиологическую роль Цинхай-Сибирского генотипа НРА1/Н5Ш. В окрестностях этого озера полностью отсутствуют сельскохозяйственные птицы, что подчёркивает ведущую и самостоятельную роль диких птиц в распространении вируса и поддержании эпизоотий.

Были изолированы семь штаммов НРА1/Н5Ш (табл.1). Анализ генома показал отличие тувинских штаммов 2006 г. от североевразийских штаммов 2005 г. - позднее выяснилось, что мы впервые обнаружили варинаты этого вируса Тувинско-Сибирской генетической подгруппы (рис. 13, табл. 8-9). На филогенетическом древе (рис.5) тувинские штаммы 2006 г. формировали отдельный кластер вместе с индо-пакистанскими штаммами

весны-лета 2006 г., дистанцируясь от цинхайских штаммов 2006 г. - в отличие от западносибирских штаммов 2005 г., которые группировались вместе с цинхайскими штаммами весны-лета того же года.

Межкластерное расстояне (число замен и.о.)

О 5 10 15 20 25 30

A/whooper swan/Mongolia/7/05 A/bar headed goose/Qinghai/5/05 A/great black headed gull/Qinghai/2/05 A/bar headed goose/Qinghai/3/05 АЛэаг headed goose/Qinghai/2/05 A/bar headed goose/Qinghai/1/05 Afchicken/lnner Mongolia/64/05 АЪаг headed goose/Qinghai/4/05 AV/hooper swan/Qinghai/1/05 A/ruddy shelduck/Qinghai/1/05 А/с|1|скепЯатЬоу/570-2/05 A/chicken/Kurgan/3/05 A/chicken/Kurgan/05/05 A/whooper swan/Mongolia/13/05 A/pied magpie/Liaoning/7/tl5 ¿Vgrebe/Novosibirsk/29/05 A/duck/Novosibirsk/56/05 A/goose/Cnmea/615/05 A/chicken/Cnmea/08/05 A/chicken/Cnmea/04/05 A/Cygnus olor/Astrakhan/Ast05-2-3/05 A/Cygnus olor/Astrakhan/Ast05-2-7/05 A/Cygnus olor/Astrakhan/Ast05-2-9/05 A/Cygnus olor/Astrakhan/Ast05-2-8/05 A/Cygnus olor/Astrakhan/Ast05- 2-1/05

A/duck/Kurgan/08/05 A/Cygnus olor/Astrakhan/Ast05-2-6/05 A/Cygnus olor/Astrakhan/Ast05-2-5/05 A/Cygnus olor/Astrakhan/Ast05-2-4/05 A/Cygnus olor/Astrakhan/Ast05-2-2/05 A/Cygnus olor/Astrakhan/Ast05-2-10/05

Рисунок 4. Иерархическая структура нуклеотидных последовательностей ORF НА (1 707 н.о.) для лрототипных штаммов вируса гриппа А Цинхай-Сибирского генотипа (H5J 2.2), визуализированная с помощью UPGMA-алгоритма. Названия штаммов, изолированных от лебедей-шипунов (Cygnus о lor) в период эпизоотии в нижнем поясе дельты Волги (ноябрь 2005 г.), взяты в рамку.

н

-

Межкластерное расстояте (ч*ло замен и.о.) О 2 4 б 8 10 12 14 16

A/bar headed goose/Qnghai/5/2005 A/Great black headed gull/Qinghai/2/05 Mjrovm headed gu№Qinghai/1f2005 A/bar headed goose/Qinghai/3/2005 A/bar headed goose/Qinghai/9/2005 A/bar headed goose/Qinghai/8/2005 A/bar headed goose/Qinghai/10/2005 A/C-rea black headed gulJ/Oinghai/3/05 A/bar-headed goose/Qmghai/5/06 A/bar-headed goose/Qinghai/S/06 A/bar-headed goose/Qingha/J/06 A/bar-headed goose/Qinghai/3/06 A/bar-headed goose/Qinghai/2/06 A/bar-headed goose/0inghai/l/06 A/bar headed goose/Qinghai/2/2005 A/bar headed goose/QinghaiM/2005 A/bar headed goose/Qinghai/1/2005 A/duckJNovosibirsk/56/2005 AAvhoober swan/Qinghai/1/05 A/ruddy shelducWQinghai/1/D5 A/grebetfJovos>birsk/2ai2005 A/grebe/Tyva/ryvOM/Ob A/grebe/Tyva/Tyv06.2/06

A/chtd-enyfJavapur/7972/Об A/chi cken/lndiaNIV33491/06 A/chicken/lndia/NIV33437/0e A/duck/Omsk/l822rtl6 I A/grebe/Tyva/Tyv06.1/06 A/Whooper swan/Mongoli a/2/06 Wcommon goldeneye/Mongo!ia/12/06

i J A/chicken/Sihala/NARC3303 <4/06 A/goose/lahwe-Pakistan/NARC-3321M/06

IA/chicken/Afghanistan/1573-7/06 A/chickeuWghanistar>/1573-47/06

A/great cormocant/Qinghai/3/2005 A/Greatblack headed gull/Qingtiai/1/05 A/Cygnus olor/Astralhan/Ast05-2-3«5 A/Cygnus olor/Astrakhan/Ast05-2-7/05 A/Cygnus olor/Asirakhan/Ast05-2-9/05 A/Cygnus olor/Astrakhan/Ast05-2.OT5 A/Cygnus olor/Astrakhan/Ast05-2-1/05 A/Cygnus olor/Astrakhan/Ast05-2~6/05 A/Cygnus olor/Aslrakhan/Ast05-2-5/05 A/Cygnus olor/Astraktian/Asi05-2-4/05 A/Cygnus clor/As:rakhan/A5!05-2-2/05 A/Cygnus olor/Astrakhan/Ast05-2-10/05

Рисунок 5. Иерархическая структура нуклеотидных последовательностей ORF НА (1 707 н.о.) для прототипных штаммов вируса гриппа А Цинхай-Сибирского генотипа (H5J 2.2), визуализированная с помощью SL-алгоритма. Убсунурские штаммы 2006 г. взяты в рамку.

2.3.4 .Расшифровка эпизоотии с высоким уровнем падежа среди сельскохозяйственных птиц в Подмосковье (Московская и Калужская области) в феврале 2007 г. (рис. 12) позволила установить этиологическую роль Цинхай-Сибирского генотипа HPAI/H5N1.

Штаммы HPAI/H5NI были получены из всех 9 локальных эпизоотий (табл. 1). Анализ генома (на примере прототипного A/chicken/Moscow/2/07) выявил наибольшую гомологию с группой штаммов, изолированных в Причерноморско-Каспийском регионе зимой 2005—

2006 гг., что согласуется и с наличием большого числа общих аминокислотных замен (табл. 3).

170 554

Аминокислотные замены D-»N в НА и V-»I в РА прослеживаются, начиная с цинхайских штаммов, но большинство относятся к периоду зимы 2005-2006 гг..

Вместе с тем, подмосковные штаммы 2007 г. заметно отличаются, в молекулярно-генетическом отношении, от всех других штаммов HPAI / H5N1 Цинхай-Сибирского генотипа (H5J 2.2). В четырёх генах - РВ2, РВ1, НА и NP - имеется 12 уникальных аминокислотных замен (табл. 4), которые нигде, кроме этого штамма, не встречаются. Более того, все аминокислотные замены в белке РВ1 относительно консенсуса HPAI/H5N1 являются уникальными. На филогенетическом древе (рис. 6) эти штаммы формируют отдельную генетическую подгруппу, получившую название «Ирано-Северокавказская».

2.3.5. Расшифровка эпизоотии с высоким уровнем падежа среди диких и домашних птиц в юго-восточной части побережья Азовского моря (Краснодарский край) в сентябре

2007 г. (рис. 12) выявила дальнейшую стратификацию Цинхай-Сибирского генотипа (H5J2.2) на две генетические подгруппы: Тувинско-Сибирскую и Ирано-Северокавказскую.

Анализ генома изолированных штаммов (табл. 1) позволил выявить значительную генетическую близость A/chicken/Krasnodar/300/07 (изолирован на ПТФ «Лебежья-Чепигинское») и A/Cygnus cygnus/Krasnodar/329/07 (изолирован в ур. Лиман Лебяжий), что свидетельствует о том, что вирус проник на ПТФ из популяции диких птиц.

Внутри Цинхай-Сибирского генотипа (H5J 2.2) выделялся кластер, содержащий штаммы, изолированные на территории Кубанско-Приазовской низменности. Внутри этого кластера (заключенного в прямоугольную рамку на рис. 7) чётко дифференцировались две генетические подгруппы: Тувинско-Сибирская и Ирано-Северокавказская (табл. 8-9). Первой из них принадлежат штаммы A/chicken/Krasnodar/{300,329}/07 и содержат ряд аминокислотных замен как общих с тувинскими штаммами 2006 г. (табл. 5), так и уникальных для штаммов данной эпизоотии (табл. 6).

2.3.6. Расшифровка эпизоотии с высоким уровнем падежа среди диких и домашних птиц в северной части Кубано-Приазовской низменности (Ростовская область) в декабре 2007г. подтвердила продолжающуюся молекулярную эволюцию Цинхай-Сибирского генотипа.

Экологические особенности распространения инфекции заключались в активном вовлечении в эпизоотический процесс диких птиц наземного комплекса - грачей (Corvusfrugilegus), ворон (Corvus corone), голубей (Columba livid), воробьев (Passer moniamis)

и скворцов (Stttrnus vulgaris) - которые в огромных количествах скапливаются в окрестностях населённых пунктов и птицефабрик в осенне-зимний период, во время сезонных кочёвок.

Таблица 3. Аминокислотные замены в генах штамма А/с1искеп/Мо8со\лг/2/07 относительно консенсуса, которые встречаются в ограниченном числе штаммов НРА1/Н51Ч1 Цинхай-Сибирского генотипа (Н50 2.2).

Белок Позиция Замена в A/chicken/ Moscow/2/07 Штаммы, имеющую такую же аминокислотную замену относительно консенсуса, что и A/chicken/Moscow/2/07 Консенсус

126 R A/Cygnus cvgnus/Iran/754/06 К

РВ2 338 I A/Cygnus cygnus/Iran/754/06; A/chicken/Sudan/1784-{7,10}/06 V

РА 554 I A/bar-headed goose/Qinghai/2/05 V

52 A A/cat/Dagestan/87/06; A/Cygnus cygnus/Iran/754/06 ; A/chicken/Krasnodar/01/06; A/chicken/Adygea/203/06. т

НА 170 N A/bar-headed goose/Qinghai/ {1 -10} /05; A/brown-headed gull/Qinghai/1/05; A/Great black-headed gull/Qinghai/{1 -3}/05 A/great cormorant/Qinghai/3/05; A/ruddy shelduck/Qinghai/1/05; A/whooper swan/Qinghai/1/05; A/grebe/Novosibirsk/29/05; A/duck/Novosibirsk/56/05; A/duck/Novosibirsk/02/05; A/wild duck/Omsk/103-01/05; D

A/whooper swan/Mongolia/13/05; A/pied magpie/Liaoning/7/05; A/chicken/Inner Mongolia/64/05; A/chicken/Tambov/570-2/05; A/chicken/Crimea/{04,08}/05; A/goose/Crimea/615/05; A/cat/Dagestan/87/06; A/chicken/Adygea/203/06; A/duck/Egypt/1300-NAMRU3/07.

171 D A/chicken/Afghanistan/1207/06; A/cat/Dagestan/87/06; A/Cygnus cygnus/Iran/754/06; A/chicken/Adygea/203/06; A/grebe/Tyva/Tyv06- (1,2,8 ¡/06. N

10 H A/chicken/Afghanistan/1207/06; A/Cygnus cygnus/Iran/754/06; A/grebe/Tyva/Ty v06- {1,2,8} /06; A/duck/Tuva/01/06. Y

NP 373 T A/bar headed goose/Qinghai/ {1-4,9,10 }/05; A/great black headed gull/Qinghai/{2,3}/05; A/whooper swan/Qinghai/1/05. A

397 S A/chicken/Afghanistan/1207/06; A/Cygnus cygnus/Iran/754/06; A/grebe/Tyva/Tyv06-{l,2,8}/06; A/duck/Tuva/01/06. N

NA 44 С A/Cygnus olor/Italy/808/06 R

A/Cygnus olor/Astrakhan/AstO 5-2-8/2005 A/Cygnus olor/Astrakhan/Ast05-2-9/2005 A/Cygnus olor/Astrakhan/Ast05-2-7/2005 A/goose/Krasnoozerka /627 /2005 A/Cygnus olor/Astrakhan/Asffl5-2-2/2005 A/Cygnus olor/Astrakhan/Ast05-2-6/2005 A/Cygnus olor/Aslrakttan /ASÎ05-2-10/20D5 A/Cygnus olor/Astrakhan /Ast05-2-4/2D05 A/Cygnus oior/Astrakhan/AstO 5-2-5/2005 A/duck/Kurgan/08/2005 A/Cygnus olor/Astrakhan/Ast05-2-1/2005 A/Cygnus olor/Astrakhan/AstOS-2-3/2005

A/guinea fowl/Nigeria/ 957-12/2006 A/ostrich/Nigena/1047-25/2006 А/chicken/Nigerla/1047-30/2006 A/chlcken/Nlaerla/1047-54/2006

Северная Евразия западней p. Енисей;

осенняя миграция 2005 г..

Африка (Нигерия); зимовка 2005-2006 гг..

A/cat/Oermany/606/2006 A/swan /©ermany/R65 /2006 A/Cygnus olor/Croatia/1/2005

A/gret>e/Tyra/Ty«06-8/2006 A/grebe/Tyva/Tyv06-2/ 2006 A/grebe/Tyva/Tyv06-1/ 2006 A/duck/Tuva/01/2006

Оз. Убсу-Нур (Республика Тыва. РФ); гнездовой период 2006 г..

A/chicken/Afghanistan/1207/ 2006 I Афганистан; зимовка 2005-2006 гг.

A/chlcken/Adygea /203/2006 A/cat/Dagestan /87/2006 A/Cygnus cyqnus/lran/764/2006

Причерноморско-Каспийскмй регион; зимовка 2005-2006 гг..

A ehielten Moscew 2 2007 |Подм»ск»»>» (февраль 2007 г.) I

A/chicken/Krasnodar/01/2006 I

A/bar-headed goose/Qinghai /9 /2005 A/great black-headed gull/Qinghai/3/2005 A/bar-headed goose/Qinghal/10/2005 A/bar-headed goose/Qinghai /9 /2005 A/great black-headed gull/Qlnghal/2/2005 A/bar-headed goose/Qinghai/5/2005 A/brown-headed gutl /Qinghal/1 /2005 A/bar-headed goose/Qinghai/3/2005 A/bar-headed goose/Qlnghal/1 / 2005 A/wtiooper swan/Mongolla/13/2005 A/bar-headed goose/Qinghai/2/2005 A/great black-headed gull/Qinghal/1/2005 A/great cormorant/Qinghai/3/2005 A/bar-headed goose/Qlnghai/4/2005 A/whooperswan/Qinghai/1/2005 A/ruddy sheMuck/QInghai/1/2005_

A/gretie/N<M>slWrsk/29/2005 A/duck/Novosibirsk/02/2005

Оз. Кукунор

(провинция Цинхай, КНР);

весенняя миграция 2005 г. и местные птицы.

A/pied magpie/uaoninq/7/2005

A/duck/Novosibirsk/56/2005

Север-восток КНР; осенняя миграция 2005 г

Юг Западной Сибири; послегнездовой период 2005 г..

A/chlcken/Crlmea/04/2005 А/chicken/Crimea/08/2005 A/chlcken/Tambov/570-2 /2005 А/goose/Crimea/ 615/2005 A/wild duck/Omsk/103-01/ 2005 A/chlcken/lnner Mongolia/64/2005 A/Cygnus olor/itaiy/808/2006

A/great crested grebe/Bavarla/22/2006 I A/duck/Ewpl/1300-NAMRU3/2007 I Африка; зимовка 2007 г.. I

A/busard/B»ana/5/2006 А/swan/Bavaria/21/2008 A/tufted duck/Bavaria/9/2006 A/goosander/Bavarla/20/2006 A/mallard/Bavaria/1/2006 A/swan /Bavaria/ 6 /2006 A/falcon/Bavaria/15/2006 A/chltken/Volgograd/236/2006

A/chicken/Sudan/1784-7/2006 A/chicken /Sudan/1784-10/ 2006

Европа;

весенняя миграция 2006 г.

Африка (Судан); осенняя миграция 200В г.

А/chicken/ Kurgan/3/2005 А/chicken/Kurgan/05/2005 A/whooper swan/Mongolia/7/2005

Межкластерное расстояние (%)

Рисунок 6. Иерархическая структура ORF НА (1 707 н.о.) штаммов HPAl / H5N1 Цинхай-Сибирского генотипа (H5J 2.2), визуализированная с помощью SL-алгоритма. Жирным шрифтом выделен подмосковный штамм 2007 г.. Компактные кластеры, соответствующие некоторым хронологическим группам штаммов, заключены в рамки.

Таблица 4. Уникальные' аминокислотные замены в генах штамма А/сЫскеп/Мозсо\«/2/07 по сравнению со штаммами НРА1 / Н5Ж Цинхай-Сибирского генотипа (ЬЫ 2.2).

Белок Позиция Замена в A/chicken/ Moscow/2/07 Консенсус Альтернативная замена относительно консенсуса

РВ2 50 I М отсутствуют

64 М I отсутствуют

38 н Y отсутствуют

113 т I отсутствуют

212 м L отсутствуют

618 к Е отсутствуют

646 I М отсутствуют

РВ1 654 N S G - A/duck/Kurgan/08/05; A/Cygnus olor/Croatia/1/05; A/Cygnus olor/Astrakhan/Ast2005-2- {1 -10}/05; A/swan/Germany/R{65,606}/06. А - А/chicken/Nigeria/{1047-{25,30,54},957-12}/06.

678 G S отсутствуют

741 Т А отсутствуют

Все аминокислотные замены в белке РВ1 уникальны

РА Нет уникальных аминокислотных замен

НА 545 М L отсутствуют

NP 90 R К отсутствуют

NA Нет уникальных аминокислотных замен

М1 Нет уникальных аминокислотных замен

NS1 Нет уникальных аминокислотных замен

Уникальными считаются те аминокислотные замены относительно консенсуса, которые встречаются

только в белках штамма A/chicken/Moscow/2/07.

Таблица 5. Аминокислотные замены в белках вирусных штаммов А/с1"нскеп/Кгазпос1аг/{300, 329}/07 относительно консенсуса, которые встречаются в ограниченном числе штаммов НРА1 / Н5Г\11 Цинхай-Сибирского генотипа (H5J 2.2).

Белок Позиция Замена A/chicken/ Krasnodar/ {300,329)/07 Штаммы с такой же заменой, что и в A/chicken/Krasnodar/ {300,329J/07 Консен-сусный символ для генотипа H5J 2.2 Альтернативные замены

РВ2 473 Т A/grebe/Tyva/Tyv06-{1,2, 8} /06 М отсутствуют

РВ1 182 I A/grebe/Tyva/Tyv06-{1, 2, 8}/06 т отсутствуют

451 L A/grebe/Tyva/Tyv06-{1, 2, 8}/06 V I- A/chicken/Krasnodar/123/06

РА 213 К отсутствуют R отсутствуют

272 Е отсутствуют D G - A/guinea fowl/Nigeria/957-12/06, A/ostrich/Nigeria/1 047-25/06

11 I A/grebe/Tyva/Tyv06-{1,2, 8}/06, A/chicken/Afghanistan/1207/06 V отсутствуют

НА 12 N A/duck/Egypt/1300-NAMRU3/07 S отсутствуют

512 S A/grebe/Tyva/Tyv06-{1,2, 8}/06, A/duck/Tu va/01 /06 А L- A/chicken/Mahachkala/05/06

NA 320 L A/grebe/Tyva/Tyv06-{1,2, 8}/06, A/duck/Tuva/01 /06 Р S- A/chicken/Navapur/Nandurbar /India/7972/06, A/chicken/Navapur/Nandurbar /India/7966/06

A'goose'Geangdong/l 96 генотип 1 генотип 23 генотип 2.1 А генотип 22

_I A/Cygnus olor/A$trakhan/Ast0$-2-8/05

~ A/Cygnus olor/Astrattan/AsfO 5-2-9/05 — A/Cygnus olor/Astrakhan /Ast0$-2-7/05 A/goose_Kr3snoo2erk«/627/2005

- A/Cygnus olor/Astrakhan /Ast05-2-10/05 A/Cygnus olor/Astrakhan/A$t05-2-2/05

- A/Cygnus olor/Astrakhan/A6t05-2-4/05 A/Cygnus olor/Astrakhan/Ast05-2-5/05 A/Cygnus o!of/Astrakhan/Ast05-2-6/05 A/ducK/Kurgan/08/05 A/Cygnus ofor/Astrakhan/A6t05-M/05 A/cat/Qermarry/$06/06 A/sw»n/Oermany/R65/08 A/Cygnus olor/Astravtian/AstOS-2-3/05 A/cygnus olor/Cro»tia/1/05 A/guinea fowl/Nigeria/957-12 /06 A/osWch/Nlgerla/1047-25/06 A/chlcfcen/Nlgerla/1047-30/06 A/chlcken/Nigeria/1047-54/06 A/domestlc goose/PaWodar/1 /05

_|A/grebe/Tyva/Tyy06-2/06

J ' A/grebe/Tyva/Ty*05-S/05

1-A/grebe/Tyva /Tyv06-1 / 08

j A/ehUk«n/Krastto<Ur/300/07 'WCygnus eygnus/Krasnodar/329J07 A/duck/Tuva/01/06 A/chlcken/Afghanistan/1207/08 A/cat/Dagestan/87/06 A/cftlcken/Krasnodar/123/06 A/chlcken/Adygea/203/06 A/Cygnus cygnus/Iran/754/08 A/chlcken/Moscow/2/07 A/chicken/Russia Krasnodar/2/07 A/chicken/Krasnod.il/Ol /08 A/bar headed goose/Qmghal/9 /65 A/Great black headed gull/Qlnghai/3 /05 A/bar headed goose/Qinghal/t 0/05 A/bar headed goose/ffinghal/8/05 A/Great black headed gull/Qlnghai/2/05 A/bar headed go0s«/OJn0haf/5/O5 A/bar headed goose/Qlnghal/3/05 A/brown headed guli/Qlnghal/1 /05 A/bar headed goose/Qinghai/1/05 A/whooper swan/Mongolia /13 /05 A/bar headed goose/Qlnghal/2/05 i— A/Great black headed guil/Qlnghai/1 /05 '— A/great cormorant/Qingfial/3/05 A/bar headed goose/Qinghal/4/05 A/ruddy shelduck/Oinghai/1/ 05 A/wtiooper swan/Qlnghal/1 /05 A/chicken/Mahachkala/05/OS A/grebe/Novosibirsk/29/05

_r A/chlcken/Crlmea/04/05

J L A/chlcken/Crimea/08/05 fl ■ A/duck/Novosiblrsk/02 /05

f-A/p/ed magpie/Uaonlng/7/05

1-A/duck/Novosibirsk/56 /05

--A/cWcken/Tambov/570-2/05

r—j1-A/goose/Crimea/Bl 5 /05

'-A/wMd duck/Omsk/103-01 /05

1-A/chlcken/ inner Mongolia/ 64/05

A/cygnus olor/ltaly/803/06 A/great crested grebe /Bavaria/22/06 A/duck/Egypt/1300-NAMRU3/07 A/chicken/Sudan/1784-10/06 A/chlcken /Sudan /1784-7/ 08 A/chicken/Kurgan/3/05 A/chicken/Kurgan/05/05 A/buzzard /Bavaria /5 /05 A/swan/Bavarta/21/08 A/tufted duck/Bavaria/9 /06 A/goo san de r/Bavaria /20 /0 6 A/mallard/Bavaria/1/06 A/swan/Savarfa/8/0$ A/falcon /Bavarta/15/08 A/Thlcken/VoIgograd/236/0B A/wfiooperswan/Mongolia/7/05

Межкластерное расстояние. %

Рисунок 7. Филогенетические древо для последовательностей гена НА штаммов вируса (H5J 2.2) генотипа. Штаммы из урочища Лиман Лебяжий выделены жирным шрифтом полностью; у остальных штаммов из Краснодарского края жирным шрифтом выделена часть названия «Krasnodar».

полноразмерных нуклеотидных гриппа A (H5N1) Цинхай-Сибирского

Таблица 6. Уникальные' аминокислотные замены в белках штаммов А/с1тскеп/Кгазпо(1аг/{300, 329}/07 относительно консенсуса для НРА1 / Н5Ы1 Цинхай-Сибирского генотипа (НЫ 2.2).

м о 5 и Позиция | Замена в белке штаммов А/сШскеп/Кгавпоёаг/ {300,329}/07 и ;►> и я и 0 Ы 1 Альтернативная замена относительно консенсуса

РВ2 354 V отсутствует

495 I V отсутствует

РА 213 К я отсутствует

272 Е Б в - А^шпеа йэ\у1/Г%епа/957-12/06, А/овйсЬМйепаЛ047-25/06

НА 102 в А О - А/сЫскеп/Уо1йОйгас1/236/06

178 I Я отсутствует

ИА 39 Ь Н - А/сЫскеп/№уариг/№пс1игЬаг/1пс11а/7972/06, А/сЫскеп/№уариг/№пс1игЬаг/1п&а/7966/06

41 И в отсутствует

412 Е к отсутствует

64" М I отсутствует

только в белках штаммов A/chicken/KJasnodar/{300,329}/07.

Приводящая к этому нуклеотидная замена не влияет на последовательность белка N52, так как находится в сплайсируемом участке.

Результаты обследования полевого материала методом ОТ-ПЦР свидетельствуют о том, что этиологическим агентом эпизоотии был НРА1/Н5>П. Вирус проник в популяции диких птиц наземного экологического комплекса и обнаружен у 60% (9/15) врановых птиц, 58% (7/12) голубей, 20 % (1 / 5) скворцов, 10 % (1 /10) полевых воробьев.

Из собранного полевого материала были изолированы 15 вирусных штаммов (8 - от диких, 7 -от домашних птиц) (табл. 1). Группа гуляй-борисовских штаммов образует плотный кластер внутри Ирано-Северокавказской подгруппы, наиболее близкий к штамму А/сЫскеп/Мозсо\у/2/07 (см. п. 2.3.4) (рис. 8). Уникальные аминокислотные замены, имеющиеся в белках изолированных штаммов, можно разбить на четыре группы (табл. 7): 1. уникальные для группы гуляй-борисовских штаммов, но не штамма А/сЫскеп/Мо5со\у/2/2007 (13 сайтов в РВ2, РА, НА, ИР, ИА, М2); 2. уникальные как для группы гуляй-борисовских штаммов, так и для штамма А/сЫскеп/Мо5сои'/2/2007 (4 сайта в РВ2, РВ1, NP); 3. уникальные для штамма А/сЫскеп/Мо5СО\у/2/2007, но которые не воспроизвелись для группы гуляй-борисовских штаммов (8 сайтов в РВ2, РВ1, НА); 4. уникальные для единственного изолированного штамма: 1273 вместо консенсусного У27з в РВ1 у А/р1зеоп/Коз1оу-оп-Ооп/6/07, а также У2?з вместо консенсусного 1273 в РА у АМаг1т}>/К.О81оу-оп-Ооп/39/07. Штаммы из «московско-иранской» подгруппы образца декабря 2007 г. сохранили 4 уникальные аминокислотные замены, впервые отмеченные у штамма А/сЫскеп/Мо8со\у/2/07, и приобрели 13 новых уникальных замен, не встречающихся в других штаммах Цинхай-Сибирского генотипа.

о>. Кукумор (КНР), ««сна 2005 г.: tor Западной Сиомрм, пето 2005 с.

Altai-headed gooseQhn)haM05. A'gebe Novosibirsk 29 05....

Осенняя миграция 2005 г.: Западная Европа гима 2005-2006 гг.:

A liuck Kurgan 08 05, А Судим olor'Asftaklia» АЯ05-2 105, A swan GetmanyH65 Об, ...

oí. Увс-Нур. пето 2006 г.: Иран. 2006 г.: Причерноморско-Каслийский регион, 2006-2007 гг.: Подмосковье, >има 2007 г.:

A giebe TyvaTyvOG.1 Об. ACygnns cygniis Iran 75406, A chicken Krasnodar 123 06, A cat Daqertan 97 06. A'chlcken Moscow 2 07. ACygnns cygmn Krasnodar 329 07....

Осенняя миграция 2005 г.: A chicken Tula 4 05. A qoose Ciimea615 05....

Египет и ближний Восток. 2006-2007 гг.:

Atnikey EgyptF2 06. A chicken Egypt 12379H3-CLEVB 06. A turkey Israel 345 06, A chicken Gaza 450 06. A chicken Egypt R3 07, A goose £ fypt R4 07. ...

Монголия, лето 2005 г.:

Европа. весенняя миграция 2006 г.:

A'whooper swan Mongolia 7 05. A chicken Volgograd 236 06, AmalUidBavailal 06,...

Осенняя миграция 2005 г.: Краснодарский край, зима 2006 г.: Африка 2005-2007 гг.:

A 'chlcken Kurgan 3 05. A'chlcken Kiasnodai 0106, A chicken Sudan'17947 06. A chicken Nlgeita 1071-107. A'chlcken Ghana 3158-NAMRU3 07..

юг Западной Смоири. лето 2005 г.: осенняя миграция 2005 г.:

AdiickHovoslblr6k5605. A pied magpie tiaonlng7 05, A'chlcken Crime* 09 05,...

dA'stailHiq Rostov-on-Don^ 07 A chicken Rostov-on-Don 35 07 Atiiiiscovy duck Rostov-on-Ooii 5107 A pigeon Rosfov-on-Don 607 A rook Rostov-on-Don?6 07 A/c hie k en/Mosc ow/2£)7 I-A/cat/Dagesfan/137/06

J AfchickeiVAdygea/2GM36

'-A/Cygnus cygnus/!ran/754/06

A/chic к en/Russia/Krasnodar/2Ji37

A/grebe/Tyva/Tyv06-&Ü6

A/grebe/Tyva/Ty>06-2/06

Aft) re b e/Tyva/Ty\06-1 /06

A^Crgnus CYgr>us/Kr*snofjar/329/07

A/cti ic к e n/Kra sno d аг/ЗООЮ7

A/duck/Tuva/01/Q6

A/e hick en/Afghani si a r</1297/06

¡58

а. ж

¿Si

ill P <2 ч ¿•so о с

АУсЬ|СкеаЛппег МопдоНаЛэ4£15

Рисунок 8. Филогенетическое древо (в форме крупных кластеров с перечислением характерных штаммов) гемагглютинина 163 штаммов Цинхай-Сибирского (Н5й 2.2) генотипа вируса гриппа А (Н5М1), для которых в базе данных СелВапк имеются полноразмерные нуклеотидные последовательности. Иерархическая структура кластера, содержащего штаммы юга европейской части России, представлена полностью (жирным шрифтом выделены штаммы из эпицентра рассматриваемой эпизоотической вспышки).

Таблица 7 Аминокислотные замены, обладающие различной степенью уникальности, в белках группы гуляй-борисовских штаммов' НРА1 / Н51М1.

Белок Позиция Замена в белках гуляй-борисовских штаммов Замена в белке штамма A/chicken/ Moscow/2/2007 Консенсус Альтернативные замены в той же позиции относительно консенсуса

Аминокислотные замены, уникальные для группы гуляй-борисовских штаммов, но не штамма А/сЫскеп/Мозсо\у/2/2007

РВ2 73 R О О отсутствуют

РА 269 К R R отсутствуют

451 А S S отсутствуют

31 Н О о отсутствуют

56 R к к отсутствуют

НА 99 N I i в - А/Ьаг-Ьеаёе<1 goose/Qinghai/l/05; Т - А/Ьаг-ИеасЫ goose/Qinghai/2/05; АЛуИоорег swan/Mongolia/13/05; V - А/Ьаг-11еас1ес1 йоо&е/01пйЬа1/5/05

NP 323 т А А отсутствуют

46 V А А отсутствуют

NA 63 L V V А - А/сЫскеп/Ти1а/4/05; А/Суятк о1ог/СгоаИа/1/05

102 V I I отсутствуют

288 R о Q отсутствуют

М2 68 I V V отсутствуют

81 R Q 0 отсутствуют

Аминокислотные замены, уникальные как для группы гуляй-борисовских штаммов, так и для штамма А/с)нскеп/Мо$солу/2/2007

РВ2 64 М м I отсутствуют

РВ1 113 Т т I V - A/bar-headed goose/Qinghai/3/05

618 К к Е отсутствуют

NP 90 R R К отсутствуют

Аминокислотные замены, уникальные для штамма А/сЫскеп/Мо8со\у/2/2007, но не для группы гуляй-борисовских штаммов

РВ2 50 М I м отсутствуют

38 Y Н Y отсутствуют

212 L М L отсутствуют

646 М I М отсутствуют

РВ1 654 S N S в - АЛ1иск/Кшвап/08/2005; A/Cygnus о1ог/СгоаИа/1/2005; A/Cygnus о1ог/А5й-ак11ап/А812005-2- {1 -10}/2005; АЛмап/СегтапуЛ1{65,606}/2006. А - А/сЫскепЛ^епа/ {1047-{25,30,54},957-12}/2006.

678 S G S отсутствуют

741 А Т А отсутствуют

НА 545 L м L отсутствуют

Имеются в виду пять штаммов, подвергнутых секвенированию: A/pigeon/Rostov-on-Don/6/07, А/гоокЛ1о51оу-оп-Ооп/26/07, А/сЫскеп/Ко8Юу-оп-Ооп/35/07, А/51аг1^/Ко5Юу-оп-Ооп/39/()7 и А/тшсоуу ^ск/Ко8Юу-оп-Ооп/51/07.

2.4. Мониторинг вирусов гриппа А в восточном секторе Северной Евразии в период 2005-2007 гг..

Вплоть до весны 2008 г. (см. п. 2.5.1) в восточном секторе Северной Евразии не были обнаружены ни проявления КЧП у диких и домашних птиц, ни вирусы HPAI/H5N1. В указанный период на юге Приморского края были изолированы 1 штамм LPAI / Н4 и 1 штамм LPAI / Н7. Методом ОТ-ПЦР на территории Среднеамурской низм. выявлена циркуляция LPAI / Н5, главным образом, среди, птиц водно-околоводного, и LPAI / Н7 - среди птиц наземного экологического комплекса (рис. 9).

Рисунок 9. Доля положительных результатов в ОТ-ПЦР на НА / Н5 и НА / Н7 вируса гриппа А среди диких птиц на территории Среднеамурской низменности (2005-2007 гг.).

15.0 13.0 S® | 11.0 ■ | 9.0 ■ ,0- | 5,0 ■ i 5 3,0 -4 1,0. 1 1.» 1А 1 ,3 □ HA/H ■ HA/H 5 7

2.2 0 0 0 | 5. 5 3,9 0 ol 7 1.3 1 • 6

Обслелпятм 39 33 11 |i I «8 2005 15 30 11 а is 1 ж 8 200« 26 29 11 48 § il * о ж • • 2007 80 92 'II i! i в| Л О

2.5. Развитие эпизоотии НРА1 / №N1 в восточном секторе Северной Евразии, начиная с весны 2008 г..

2.5.1. Расшифровка эпизоотии среди диких и домашних птиц на юге Дальнего Востока (Приморский край) весной 2008 г. (рис. 12) выявила этиологическую роль НРА1 / Н5Ш нового для Северной Евразии генотипа.

Из полевого материала, собранного в д. Воздвиженка (Уссурийский р-н Приморского края) в апреле 2008 г., были изолированы 4 штамма НРА1 / Н51Ч1 (табл.1). Филогенетический анализ показал принадлежность воздвиженских штаммов к генотипу Н5.12.3.2 (получившему название «Уссурийский»; рис. 10) с генотипической формулой [К, в, Б, 5: 2.3.2, Б, и, Р, 1Е].

Ещё при первичном обследовании полевого материала было установлено, что структура НА и ИА изолированных штаммов из Приморья отличается от штаммов Цинхай-Сибирского генотипа 2.2, поскольку между ними имелись существенные различия в картине гибридизации с нуклеотидными зондами биологического микрочипа чипа (рис. 11). Действительно, оказалось, что гомология изолированных приморских штаммов со штаммами Цинхай-Сибирского генотипа составляет для НА 92.9-95.3 %, для ЫА - 94.1-95.3 %. Таким образом, гибридизационный профиль биочипа может быть использован для первичного генотипирования высоковирулентных штаммов вируса гриппа А (Н5Ш). Сайт

2 1 Генетическое расстояние, % Рисунок 10. Филогенетический

A/chickenA/iet Nam/10/D5 Aíduck/Viet Nam/12/05 A/chicken/Pninotje/1/08 A/Anas crecco;Primoije¿W08 /Vchicken/Guangdong/178/04 A/duck/Hunan/733/04 2.3.2. 2.3

A/chicken/Guangdong/191/04 2.3,1.

/Vduck/Hunan/15/04 2.3.3.

A/Guangxi/1/05 2.3.4

A/chicken/Langkat/BBPV1-576/05 2.1.2.

Aflndonesia/5/05 2.1.3. 2.1

A/chicken/lndonesia/7/ОЗ 2.1.1

A/duck/Guangxi/13/04 2.4

А/дгеЬеЯута/ТуЛ6-1/06 A/Cygnus cygnus/Krasnodar/329/D7 Тувинско-Сибирская подгруппа 2.2

A/chicken/Moscow/2/D7 Mook/Rostov-on-Don/26/07 Ирано-Северокавказская 2.2. подгруппа , á

Atgrebe/Movosibirsk/29/05 A/Cygnus olor/Astrakhan/Ast05-2-1/05 2.2. Западносибирская подгруппа ra а. X X I ю

A/Great black headed gull/Qinghai/2/05 2.2.Цинхайская подгруппа 5 ё

АЛЫскеп/Куо1о/3/04 2.5

A/chicken/Guangdong/1/96 Ранний предшественник

анализ нуклеотидных последовательностей ORF НА

штаммов, изолированных в с. Воздвиженка (выделены жирным шрифтом)

Рисунок 11. Результаты субтипирования вируса гриппа А с помощью биочипов: А - структура биочипа;

Б-картина гибридизации при анализе А/сЬюкеп/Моуоз1Ыгек/64/05 (НбЖ) Цинхай-

Сибирского генотипа (ЬЫ 2.2); В-картина гибридизации при анализе А/сЫскеп/Рптопе/1/08 (Н51М1) Уссурийского генотипа (Н5и 2.3.2).

протеолитического разрезания НА у A/chicken/Primorje/1/08 и A/Anas crecca/Primorje/8/08 характерен для генотипа 2.3.2: P337QRERRRKRGLF34S; он имеет делецию К345 по сравнению с Цинхай-Сибирским генотипом (P337QGERRRKKRGLF349). Остальные свойства соответствуют Цинхай-Сибирскому генотипу (табл. 2).

2.5.2. Расшифровка эпизоотии среди диких птиц на озере Убсу-Нур (Республика Тыва) в июне 2009 г. (рис.12) выявила расширение ареала HPAI/H5N1 Уссурийского генотипа (H5J 2.3.2); 2. появление внутри этого генотипа собственных генетических подгрупп.

Из собранного полевого материала были изолированы 12 вирусных штаммов, 6 из которых были депонированы в ГКВ РФ (табл. 1). Анализ генома показал их принадлежность к HPAI/H5N1 генотипа H5J 2.3.2. Наиболее близкой последовательностью ORF НА для убсунурских штаммов 2009 г. являются штаммы, изолированные на монгольской стороне того же озера в мае того же года.

Клинические признаки заболевания у диких птиц во время эпизоотии 2009 г. (связанной с генотипом H5J 2.3.2) существенно отличались от эпизоотии 2006 г. (связанной с генотипом H5J 2.2), когда ведущим симптомом было поражение ЦНС. В 2009 г. ведущим симптомом была интоксикация, что приводило к вялости и птиц и притуплению у них чувства опасности.

Инфекционный титр убсунурских штаммов 2009 г. снижен по сравнению со штаммами от диких птиц, изолированных на юге Приморья в апреле 2008 г.. Таким образом, циркуляция HPAI/H5N1 генотипа H5J 2.3.2 в восточном секторе Северной Евразии - также, как и циркуляция генотипа 2.2 в западном секторе Северной Евразии - сопровождается расширением ареала и снижением инфекционности.

2.6. Причины и последствия проникновения HPAI / H5N1 в экосистемы Северной Евразии (2005-2009 гг.).

2.6.1. Распространение и генетическая дивергенция Цинхай-Сибирского (HSJ 2.2) генотипа HPAI/H5N1 необходимо начать описывать с осени 2001 г., когда в ходе планового мониторинга2 ключевых точек Северной Евразии сотрудники НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН зафиксировали аномально высокую интенсивность циркуляции LPAI / Н5 (ранее изолированных на Алтае) в популяциях диких птиц, совершавших осенний перелёт к зимовочным ареалам (главным образом - в Юго-Восточной Азии) вдоль Дальневосточно-Притихоокеанского миграционного русла (рис. 12). На территории Юго-Восточной Азии - в условиях колоссальной плотности диких и домашних птиц и интенсивных популяционных взаимодействий - могла произойти селекция вирусных вариантов и превращение LPAI —* HPAI, о чём было доложено в октябре 2003 г. на Международной конференции «Options for the control of Influenza V» в Окинаве [Lvov D.K., 2004]. Через три месяца стало ясно, что сделанный прогноз полностью оправдался - в конце 2003 г. HPAI / H5N1 вызвал в Юго-Восточной Азии масштабную эпизоотию.

После начала эпизоотии HPAI / H5N1 осенью 2003 г. был сделан второй прогноз: в одну из ближайших вёсен этот вирус проникнет на территорию Северной Евразии с перелётными дикими птицами вдоль одного из миграционных русел - Джунгарского (проходящего через «Джунгарские ворота» - тектоническое понижение между Тянь-Шанем и Монгольским Алтаем) и Дальневосточно-Притихоокеанского (вдоль тихоокеанского побережья Азии). Тогда

2 Результаты этих исследований не вошли в диссертационную работу, но упоминуются в данном разделе для придания целостности изложению материала.

же - в рамках подготовки к возможным эпизоотическим событиям - были сформулированы цели и задачи настоящей диссертационной работы, начаты научно-организационные мероприятия по подготовке мониторинговых исследований в предполагаемых районах прорыва вируса.

Подмосковье зима 2007

Алтай осень 1991

Западная Сиоирь 2005-2008

Западная Европа

2005-2009

Озеро Увс-Нур весна 2006

Дельта Волги осень 2005

Озеро Ханк; осень 2001

Oiepo Ханка весна 2008

Oíepo Убсу-Нур весна 2009

Ростов-на-Дону осень 2007

Краснодар 2006.2008

Озеро Кукунор пров. Цинхаи весна 2005-2009

Турция

2005-2008

Индостан 2005-2009

Рисунок 12. Причины и последствия проникновения НРА1/Н51\11 Цинхай-Сибирского (Н5и2.2) и Уссурийского (Н5и 2.3.2) генотипов в Северную Евразию: весна 2005 г. - лето 2009 г..

Результаты расшифровки эпизоотии с высоким уровнем падежа среди диких и домашних птиц на юге Западной Сибири летом 2005 г. (см. п. 2.3.1) подтвердили сделанное предположение: близость западносибирских и цинхайских штаммов (рис. 3) свидетельствует в пользу того, что занос HPAI / H5N1 в Северную Евразию (на юг Западной Сибири и, вероятно, далее на север вплоть до побережья Северной Ледовитого океана) произошёл во время весенней миграции диких птиц 2005 г. из Юго-Восточной Азии через оз. Кукунор и «Джунгарские ворота» (рис. 12).

Третий прогноз заключался в том, что во время осенней миграции 2005 г. дикие птицы разнесут вирус вдоль пролётных путей и в зимовочные ареалы. Этот прогноз также подтвердился: осенью 2005 г. ареал Цинхай-Сибирского генотипа охватил весь западный сектор Северной Евразии, Среднюю Азию, Индостан, Закавказье, Ближний Восток и Африку. Этот прогноз тоже полностью оправдался. В частности, крупная эпизоотия среди лебедей-шипунов (Cygnus olor) в нижнем поясе дельты Волги в ноябре 2005 г. (см. п. 2.3.2) произошла на одном из наиболее интенсивных «перекрёстков» миграционных путей диких птиц.

Источником вируса стали мигрирующие дикие утки (Aythyafuligula), только после прилёта которых заболевание распространилось среди местных лебедей-шипунов.

Генетическая близость штаммов HPAI / H5N1 с юга Западной Сибири (июль 2005 г.) и из нижней дельты Волги (ноябрь 2005 г.) свидетельствует о том, что, распространяясь в течение этих четырёх месяцев во всё новых популяциях неиммунных хозяев, когда генетический дрейф не является условием избегания вирусом иммунного прессинга, варианты Цинхай-Сибирского генотипа не претерпели существенных генетических изменений. Однако попав в зимовочные ареалы - в Африке и на п-ове Индостан - где высокая плотность популяций диких птиц водно-околоводного экологического комплекса сочетается с их значительной иммунной прослойкой, вирус вынужден был начать генетический дрейф, в результате которого в гнездовые ареалы Северной Евразии весной 2006 г. с мигрирующими птицами должны были вернуться генетически модифицированные варианты вируса. Это был наш четвёртый прогноз, который также подтвердился в процессе последующего эколого-вирусологического мониторинга.

Возвращение HPAI/H5N1 из зимовочных ареалов в гнездовые происходило не всегда теми же путями, что и занс весной. Например, генетическая близость убсунурских штаммов (июнь 2006 г.) (см. п. 2.3.3) с индо-пакистанскими штаммами зимы-весны и дистантность от цинхайских штаммов весны того же года (рис. 5) свидетельствует о том, что занос вируса в Убсунурскую Котловину весной 2006 г. произошёл не из Юго-Восточной Азии вдоль Джунгарского миграционного русла (как это было весной 2005 г. - см. п. 2.3.1), а вдоль восточного ответвления Индо-Азиатского миграционного русла с восточносибирскими утками, инфицирование которых произошло во время зимовки в 2005 / 2006 гг. на п-ве Индостан (рис. 12), где они смешиваются с популяциями западносибирских уток, встретившихся с вирусом весной-летом 2005 г.. Утки, вернувшиеся в Западную Сибирь весной 2006 г. занесли туда близкородственные убсунурским варианты (н-р, A/duck/Omsk/1822/06 (H5N1) на рис. 5). Другие филогенетически близкие варианты HPAI/H5N1 из GenBank не могут считаться предшественниками убсунурских штаммов, так как были изолированы позже - осенью-зимой 2006 г. в Южной Корее и в 2007 г. в Юго-Восточной Азии: осенью 2006 г. убсунурские варианты вируса были занесены туда вдоль Джунгарского пролётного русла. Варианты Тувинско-Сибирской генетической подгруппы, впервые обнаруженные во время убсунурской эпизоотии 2006 г., вдоль миграционных русел диких птиц распространились в западном направлении и вызвали, в частности, эпизоотию в окрестностях лимана Лебяжий вблизи юго-восточного побережья Азовского моря в сентябре 2007 г. (см. п. 2.3.5).

В то время, как Срединный Регион Северной Евразии был местом зарождения Тувинско-Сибирской генетической подгруппы, в Причерноморско-Каспийском регионе сформировалась другая - Ирано-Северокавказская генетическая подгруппа - с которой мы впервые столкнулись при расшифровке эпизоотии среди сельскохозяйственных птиц в Подмосковье в феврале 2007 г. (см. п. 2.3.4). Естественные миграции птиц в феврале на территории Подмосковья отсутствуют (за исключением локальных перемещений зимующих птиц). Однако Москва, являясь крупнейшим транспортным узлом в европейской части России, включена в систему транспортировки сельскохозяйственной продукции и

сельскохозяйственных птиц. То, что именно последние стали источником завозного вируса, свидетельствует покупка птицы всеми владельцами заражённых подворий на рынке «Садовод», который рассматривается как вторичный очаг при неизвестном первичном эпизоотическом очаге. Вирус был завезён на московский рынок в мёрзлой подстилке вольеров с птицами из одного из неназванных до сих пор регионов Северного Кавказа. Таким образом, эта эпизоотия имела непреднамеренное рукотворное происхождение.

Варианты Ирано-Северокавказской генетической подгруппы вызвали и обширную эпизоотчискую вспышку в северной части Кубано-Приазовской низменности в декабре 2007 г. (см. п. 2.3.6). Широкое вовлечение в эпизоотический процесс птиц наземного экологического комплекса (рис. 1.J1-M), которые в огромных количествах скапливаются в окрестностях населённых пунктов и ПТФ осенне-зимний период, во время сезонных кочёвок, было связано с попаданием отходов ПТФ «Гуляй-Борисовская» в примыкающие антропогенные биоценозы.

Кубано-Приазовская низменность является местом пересечения нескольких миграционных путей диких птиц, идущих из Западной Сибири в Африку и из Европы в Африку, Закавказье и Ближний Восток (рис. 12); в мягкие зимы здесь зимуют птицы вводно-околоводного комплекса. На территории южной оконечности Русской равнины выявлена циркуляция обеих генетических подгрупп Цинхай-Сибирского генотипа - Тувинско-Сибирской и Ирано-Северокавказской. Таким образом, Кубано-Приазовская низменность является центром генетического разнообразия Цинхай-Сибирского генотипа (H5J 2.2).

2.6.2. Распространение и генетическая дивергенция Уссурийского (H5J 2.3.2) генотипа НРА1/H5N1 в Северной Евразии началось в апреле 2008 г., когда на одном из подворий в д.Воздвиженка (Уссурийский р-н Приморского края; рис.12) в апреле 2008 г. произошёл падёж невакцинированных сельскохозяйственных птиц (см. п. 2.5.1). Источником заноса HPAI/H5N1 генотипа H5J 2.3.2 стали, по-видимому, чирки-свистунки (Anas сгесса): для них получен наибольший процент ОТ-ПЦР-позитивных результатов как в целом по югу Приморья (31.8%), так и для окрестностей с.Воздвиженка (62.5%), а штамм А/Anas crecca/Primorje/8/08 идентичен A/chicken/Primorje/1/08. Ретроспективно было установлено, что на данной территории имели место три основные волны миграции диких уток (вид с доминирующей численностью указан первым): 1. чирки-клоктуны и кряквы; 2. кряквы и чирки-трескунки; 3. чирки-свистунки. Сбор полевого материала был проведён в узком временном диапазоне, когда вдоль Суйфун-Ханкайской низменности осуществляли миграцию заражённые популяции чирков-свистунков. Наиболее близкими, в генетическом отношении, к воздвиженским штаммам 2008 г. являются штаммы генотипа 2.3.2, ранее изолированные в южных провинциях КНР, Вьетнама и Лаоса (рис. 10), где располагается и центр зимовочного ареала чирков-свистунков.

Весной 2009 г. Уссурийский генотип (2.3.2) вызвал эпизоотию на оз. Убсу-Нур (см. п. 2.5.2), где тремя годами ранее «полыхал» Цинхай-Сибирский генотип (2.2) (см. п. 2.3.3). Расшифровка этой эпизоотии показала, что генотип 2.3.2 не только расширяет свой ареал в восточном секторе Северной Евразии (рис. 12), но и генетически дивергирует: убсунурские штаммы 2009 г. (как с российской, так и с монгольской стороны озера) дистанцируются от

воздвиженских штаммов 2008 г. (табл. 8-9), формируя самостоятельную генетическую подгруппу (рис. 13).

2.6.3. Современная (2009 г.) генотипичеекая структура высоковирулентного вируса гриппа А (HSN1) на территории России представлена на рис. 13 и в табл. 8-9.

Цинхай-Сибирский (H5J 2.2) генотип, распространённый в западном секторе Северной Евразии, отличается от Уссурийского (H5J 2.3.2), распространённого в восточном секторе (рис. 28), по ORF НА на 4.6-7.0 % (табл. 8); в среднем, - на 5.8 % (табл. 9).

Рисунок 13. Иерархическая структура нуклеотидных последовательностей полноразмерных ORF НА для прототипных штаммов HPAI/H5N1 генотипов Цинхай-Сибирского (H5J 2.2) и Уссурийского (H5J 2.3.2), визуализированная с помощью UPGMA-алгоритма. Названия штаммов, изолированных на оз. Убсу-Нур летом 2009 г., взяты в рамку.

Внутри Цинхай-Сибирского генотипа (H5J 2.2) можно выделить 4 генетические подгруппы (Цинхайскую, Западносибирскую, Тувинско-Сибирскую и Ирано-Северокавказскую), ORF НА которых отличаются, в среднем, на 1.5 %; а внутри Уссурийского генотипа (H5J 2.3.2) - 2 генетические подгруппы (Дальневосточно-Южнокитайскую и Западномонгольскую) со средней генетической дистанцией 2.1 % (табл. 9).

Таблица 8. Диапазон генетических расстояний (минимум - максимум) для ORF НА штаммов HPAI / H5N1 из различных эпизоотических вспышек Северной Евразии: число нуклеотидных замен (левый нижний угол таблицы) и процентное различие (правый верхний угол таблицы).

Эпизоотия Цинхай-Сибирский генотип (H5J 2.2) Уссурийский генотип (H5J 2.3.2)

Цинхайская подгруппа Западносибирская подгруппа Тувинско-Сибирская подгруппа Ирано-Северокавказская подгруппа Тувинско-Сибирская подгруппа Ирано-Северокавказская подгруппа Дальневосточно-Южнокитайская подгруппа Западно-монгопьская подгруппа

Оз. Цинхай (май-июнь 2005 г.) (п. 2.3.1) Западная Сибирь (июль 2005 г.) (п. 2.3.1) Дельта Волги (ноябрь 2005 г.) (п. 2.3.2) Оз. Убсу-Нур (июнь 2006 г.) (п. 2.3.3) Подмосковье (февраль 2007 г.) (л. 2.3.4) Краснодарский край (сентябрь 2007 г.) (п. 2.3.5) Ростовская область (декабрь 2007 г.) (п. 2.3.6) Приморский край (апрель 2008 г.) (п. 3.10) Оз. Убсу-Нур (июнь 2009 г.) (п. 3.11)

Оз. Цинхай (май-июнь 2005 г.) 0.41 1.52 7 26 0.53 - 1.46 0.70 - 1.76 0.94 - 2.11 1.23 - 2.05 1.82 - 2.69 1.46 - 2.34 4.63 - 5.04 5.62 - 6.21

Западная Сибирь (июль 2005 г.) 9-25 0.53 0.53 9 9 0.64 - 0.88 0.88 - 1.23 1.17 - 1.17 1.76 - 1.82 1.41 - 1.41 4.92 - 4.98 5.92 - 6.15

¡Дельта Волги |{ноябрь2005г.) 12 - 30 11 - 15 0 - °'70 и 12 1.05 - 1.52 1.35 - 1.52 1.87 - 2.11 1.58 - 1.76 4.86 - 5.04 5.74 - 6.09

|Оз. Убсу-Нур ¡(июнь 2006 г.) 16 - 36 15 - 21 18 - 26 о -° 741 1.23 - 1.52 1.00 - 1.29 1.46 - 1.76 5.21 - 5.45 6.09 - 6.50

[Подмосковье Н 91 г (февраль 2007 г.) | 20 - 20 23 - 26 21 - 26 0-0 2.11 - 2.11 0.47 - 0.47 5.62 - 5.62 6.50 - 6.68

Краснодарский край I 31 - 46 | (сентябрь 2007 г.) 1 30 - 31 32 - 36 17 - 22 36 - 36 0-0 2.34 - 2.34 5.92 - 5.92 6.80 - 6.97

IРостовская область (декабрь 2007 г.) 25 - 40 24 - 24 27 - 30 25 - 30 8-8 40 - 40 0-0 5.68 - 5.68 6.68 - 6.85

Приморский край (апрель 2008 г.) 79 - 86 84 - 85 83 - 86 89 - 93 96 - 96 101 - 101 97 - 97 0-0 1.99 - 2.17

Оз. Убсу-Нур (июнь 2009 г.) 96 - 106 101 - 105 98 - 104 104 - 111 111 - 114 116 - 119 114 - 117 34 - 37 0.29 0.29 5 5

Таблица 9. Средние генетические расстояния в форме числа нуклеотидных замен (левый нижний угол) и процентных различий (правый верхний угол) между генетическими подгруппами НРА! / Н5Ж, выявленными в экосистемах Северной Евразии.

Таксон Генотип H5J 2.2 Генотип H5J 2.3.2

генотип подгруппа Цинхайская Западносибирская Тувинско-Сибирская Ирано-Северокавказская Дальневосточно-Южнокитайская Западномонгольская

H5J 2.2 Цинхайская 16.8 \ 0.98 1.12 1.77 1.80 4.87 5.96

Западносибирская 19.2 6.0 \ 0.35 1.55 1.58 4.94 5.93

Тувинско-Сибирская 30.2 26.5 13.6 \ 0.80 1.89 5.59 6.55

Ирано-Северокавказская 30.8 26.9 32.3 2.7/0.16 5.67 6.74

H5J 2.3.2 Дальневосточно-Южнокитайская 83.2 84.3 95.4 96.8 0/0 2.08

Западномонгольская 101.7 101.2 111.9 115.0 35.5 5.0/0.29

Таблица 10. Обратные величины титров в РТГА антисывороток к протипным штаммам НРА1/Н5М1.

Антисыворотка против штамма Штамм Западносибирская \ подгруппа Тувинско-Сибирская подгруппа Ирано- Северокавказская подгруппа Дальневосточно- Южнокитайская подгруппа Западномонгольская подгруппа

АМисШоуоз1Ыг8к/56/05 Западносибирская подгруппа 320 320 320 160 160

А/дгеЬе/Тууа/Туу06-1 /06 Тувинско-Сибирская подгруппа 320 640 320 160 160

А/сЫскеп/Мовсо\л//2/07 Ирано-Северокавказская подгруппа 320 320 320 160 160

А/сЫскеп/Рптог]е/1/08 Дальневосточно-Южнокитайская подгруппа 80 80 80 160 80

А/дгеЬе/Тууа/3/09 Западномонгольская подгруппа 160 80 80 160 160

Рисунок 14. Схема формирования новых генетических вариантов вруса гриппа А вследствие асимметрии условий циркуляции вируса в популяциях птиц водно-околоводного экологического комплекса в их гнедовых (весна-лето) и зимовочных (осень-зима) ареалах.

Условные обозначения:

~ интактная особь; - инфицированная особь; ■о - инфицированная особь на фоне

наличия противовирусных антител; ■^Ь—у - иммунная особь;

О - вирус гриппа А.

Важно подчеркнуть, что оба генотипа близки в серологическом отношении (табл. 10), что обоснвывает продолжение использования вакцины на основе штамма 2005 г..

Формирование генетических подгрупп связано с асимметрией условий циркуляции вируса гриппа А во время зимовочного и гнездового периодов в популяциях птиц водно-околоводного экологического комплекса - основном природном резервуаре этого вируса. В

первом случае, в зимовочных ареалов скапливаются предельно высокие концентрации птиц с максимально высоким уровнем коллективного иммунитета, что стимулирует вирус к интенсивному генетическому дрейфу. Новые вирусные варианты амплифицируются после появления неиммунных птенцов в весенне-летний период (рис. 14).

Рисунок 9. Динамика инфекционных титров in vitro у штаммов HPAI/H5N1 Цинхай-Сибирского (H5J 2.2) генотипа от диких и домашних птиц в процессе развития эпизоотии в западном секторе Северной Евразии.

Обозначения: О - дикие птицы; А - домашние птицы;

Аналитические выражения для линий трендов инфекционных титров (t-время, отсчитываемое от начала мая 2005 г.):

домашние птицы: ТСЮ5о=10.560 - 0.272 * t; дикие птицы: ТСЮ5о=5.922 - 0.066 * t.

Таблица 8 (начало). Точечные аминокислотные замены а белках штаммов НРА1 / Н5№1 Цинхай-Сибирского генотипа (Ь^ 2.2).

Штаммы * аминокислотные замены |

РВ2 РВ1 РВ1- Г2 РА НА

А/{*}/05 1 А/{*}/{06-07) нет нет нет нет N,71 1

А/аисШоуоз1Ь1г5к/5б/05 1 А^геЬе/№>уоз1Ыг5к/29/05 м Е6, 1^193 А22| К718 м Узоо ¿3 Q2f)4 га нет Тб18 ¿3 Н371 ¿3

АЛ1иск/№)УО5!Ыг5к/56/05 1 АЛ^^пиэ о1ог/А81гаИ1ап/А8Ю 5-2-{1-10}/05 А 69 1 Е69 нет нет нет и 1 N„0 1 га

А/аисШоуозМгекЛб/ОЗ 1 А^геЬе/Тууа/ТулЮб-{1,2,8}/06 Аб9 1 Еб9 М47З Т ш Т(82 ▼ Е2 ▼ н нет нет V,, т у А; ,2 ▼ N,7, ▼ ы

А/Уиск/№)Уоз|Ып;к/56/05 1 | А/сЫскеп/Мо5со-»/2/07 м50 л. ¡64 т А69 1 Еб9 К|26 ▼ У338 ▼ ■ 1 ■ 1|13 ▼ 1-212 I , Еб18 ▼ М«6 М ■ ^ ■ А74| 1 * , нет У554 0 Т52 й N,71 Т 0,7, 1^545 И

М1 Мб4| ы м N ы Кб|8| К4 Сб7й| ы

1 АЛ)иск/Моуо81Ыгек/56/05 1 А/{ *} /Кгазпос]аг/ {* ] /07 АбЧ 1 Е6, 1з54 М473 т Т473 У495 й Т182 Т 1182 у45, т 1 -451 нет 1*213 й И272 1м V,, т 1„ 8,2 А|02 Р,02 N,7, ▼ 0,7. К,78 й А512 ▼ $512

А/аиск/Ыоуо51Ыг8к/5б/05 | А/ {*} /Яобйу-ОП-ООП/ {*} /07 1« Мм А«» Еет (27З й К126 т 1*126 У338 Т Ьз8 1цз ▼ Т„з Еб18 ▼ Кб18 нет К-269 ы $451 |А4М| У554 ▼ 1554 <3з. ¿1 Т52 К56 Ая И ¡99 ы N,7, Т 0,71

Группа штаммов заключается в фигурные скобки. Если названия штаммов в группе различается только по небольшому фрагменту, то в фигурные скобки заключается перечень этих фрагментов, а общая часть пишется один раз. Символом «*» обозначается произвольный фрагмент. При указании множества штаммов, указываются только те замены, которые встречаются во всех без исключения штаммах этого множества.

" Жирным шрифтом выделены замены относительно консенсусной последовательности генотипа 2.2; |в рамку) заключены замены, являющиеся уникальными для рассматриваемых российских штаммов генотипа 2.2 (т.е. не встречалась среди российских штаммов до развития данной эпизоотии); |в рамку на сером фоне} заключены замены, которые уникальны не только для всего генотипа 2.2 (как российских, так и описанных в других странах); » -замена, встречающаяся в штаммах как данной, так и последующих или предыдущих эпизооти{};ж< - замены, встречающиеся только в штаммах данной эпизоотии.

Таблица 8 (окончание). Точечные аминокислотные замены в белках штаммов НРА1 / Н5Ж Цинхай-Сибирского генотипа (Н^ 2.2).

Штаммы аминокислотные замены

NP NA М1 М2 N81 N82

А/{*}/05 4 А/ {*} / {06—07} У.о 4 Ню N3,7 4 §397 нет нет нет о202 4 С202 М50 4 У50 1б0 4 т«,

АЛ1иск/Моуоз1Ыг8к/56/05 4 А^геЬе/Ноуо51Ыг$к/29/05 4 ^403 м29 й 4 У,43 нет нет нет нет

АЛ1иск/Моуоз!Ыг5к/56/05 4 А/Су^иэ о1ог/А81гакЬап/А5Ю5-2-{1-10(/05 Т4ОЗ 4 АцОЗ Ьш 4 У,43 нет нет нет нет

АЛЗиск/Моуоз1Ыг5к/56/05 4 А^геЬе/Тууа/ТууОб- (1,2,8}/06 V,» Ш N3,7 У ЕЗ Т403 4 А403 Ьш 4 У,43 Р320 У ЕЗ нет нет О202 У И М50 Щ 1б0 и

А/йисШоУов1Ыпк/56Ю5 | A/chicken/Moscow/2/07 У,о ▼ Ню К90 У и Аз 73 У ^373 N397 У §397 Т403 4 А403 й 1-143 4 У,43 нет нет О2о2 У С202 м50 У У50 1<ю У Тбо

А/аисШоуоз1Ыг8к/56/05 1 А/ {*) /Кгазпоёаг/ {*} /07 ▼ Ню N3,, У §397 Т403 4 А403 039 й в4| м Ьнз 4 Уш Рз20 ▼ Ьз20 К412 •м нет нет 1б4 ы 15202 У С202 М50 У У50 1б0 У Тбо

А/аисШоУозНигек/Зб/ОЗ 1 1 А/ {*} /Яо бЮу-опЛЭоп/ {*} /07 У,0 ▼ Ню Код У Им Аэ23 А373 У Тз,з N397 ▼ Бз97 Т403 4 А403 А46 УбЗ 1102 1 ы Ьиз 4 Уш 0288 |К2Я«| нет У68 й (381 (¿1 1^202 У Сгог М50 У \'5(, 1*0 У Тбо

фигурные скобки заключается перечень этих фрагментов, а общая часть пишется один раз. Символом «*» обозначается произвольный фрагмент. При указании множества штаммов, указываются только те замены, которые встречаются во всех без исключения штаммах этого множества. ^^^^

" Жирным шрифтом выделены замены относительно консенсусной последовательности генотипа 2.2; |в рамку| заключены замены, являющиеся уникальными для рассматриваемых российских штаммов генотипа 2.2 (т.е. не встречалась среди российских штаммов до развития данной эпизоотии); |в рамку на сером фоне| заключены замены, которые уникальны не только для всего генотипа 2.2 (как российских, так и описанных в других странах); <У » - замена, встречающаяся в штаммах как данной, так и последующих или предыдущих эпизоотий; - замены, встречающиеся только в штаммах данной эпизоотии.

Таблица 9. Возможное влияние аминокислотных замен в белках штаммов НРА1 / Н5М Цинхай-Сибирского генотипа (Н^ 2.2) на уровень вирулентности.

Позици я Вирулентность Функциональная область * белка Процесс, на который

Белок повышен ная понижен ная предположительно влияет замена

69 Е А Домен Формирование и

73 II нековалентного функционирование

РВ2 221 А Т связывания с С-концом РВ1 полимеразного комплекса РВ2-РВ1-РА

473 М Т N1.8 Импорт РНП в ядро

212 Ь м ЫЬБ Импорт РНП в ядро

294 (3 н Ферментативный полимеразный центр Функционирование

РВ1 451 V ь полимеразного комплекса РВ2-РВ1-РА

618 Е к Домен Формирование и

678 8 в нековалентного функционирование

741 А N связывания с Ы-концом РВ2 полимеразного комплекса РВ2-РВ1-РА

| РА 213 Я К N1,8 Импорт РНП в ядро

Участок удлинения

512 А 8 при высвобождении

НА пептида слияния Слияние мембран вириона и

С-концевой эндосомы

545 Ь М трансмембранный домен

10 У Н

323 А Т

№ 373 А Т N1,8 Импорт РНП в ядро

397 N 8

403 Т А

¡М-концевой

ЫА 29 м I трансмембранный домен Сборка дочерних вирионов

М2 68 I V С-концевой Взаимодействие М2 с М1

81 я цитоплазматическии

V домен

N81 64 I М Взаимодействие с сигнальными

202 Б в неизвестна системами инфицированной

клетки

50 м V Конец а-спирали N2

N82 60 I т Основание а-спирали С1 Экспорт РНП из ядра

Северная Евразия является крупнейшим в мире гнездовым ареалом птиц водно-околоводного экологического комплекса, который связан миграционными руслами с четырьмя зимовочными ареалами: Африкой, Индостаном, Юго-Восточной Азией и Северной Америкой. Кроме того, в мягкие зимы птицы могут зимовать на юге Русской равнины, в Причерноморско-Каспийском регионе. Цинхайская и Зпадномонгольская генетические подгруппы связаны с

зимовочным ареалом вдоль Джунгарского, Тувинско-Сибирская - вдоль Индо-Азиатского, Ирано-Северокавказская - вдоль восточноевропейского, Дальневосточно-Южнокитайская -вдоль Дальневосточно-Притихоокеанского, Западномонгольская - вдоль Джунгарского миграционного русла.

2.6.4. Динамика уровня вирулентности штаммов высоковирулентного вируса гриппа А птиц Цинхай-Сибирского генотипа (2005-2007гг.) представлена в табл. 1 и на рис. 9. Снижение репродуктивного потенциала in vitro наиболее выражено у домашних и менее выражено - у диких птиц. ЦПД в культуре клеток СПЭВ проявлялось через 16-24 ч для штаммов 2005 г., и 36-72 ч - для штаммов 2006-2007 гг..

Анализ аминокислотных замен между различными группами штаммов с известными последовательностями полноразмерного генома представлен в табл. 8. Точечные мутации в функционально-важных участках генома вируса гриппа А, способные влиять на снижение вирулентности штаммов представлены в табл. 9.

3. ВЫВОДЫ.

1. Результаты эколого-вирусологического мониторинга свидетельствуют о том, что накануне проникновения в Северную Евразию высоковирулентного вируса гриппа A (H5N1) в 2001 -2004 гг. на данной территории, по-видимому, циркулировали только слабовирулентные штаммы вируса гриппа А (включая Н5).

2. Установлено, что проникновение высоковирулентного вируса гриппа A (H5N1) НА-генотипа 2.2 (получившего название «Цинхай-Сибирский генотип») в популяции диких и домашних птиц Северной Евразии произошло во время весенних миграций диких птиц с оз. Кукунор в северо-западной провинции Цинхай КНР вдоль Джунгарского пролётного русла. Дальнейшее распространение этого вируса в западном секторе Северной Евразии и в Африке происходило осенью 2005 г. вдоль миграционных путей диких птиц, связывающих Западную Сибирь и южную часть Русской равнины.

3. Установлено, что до весны 2008 г. высоковирулентный грипп A (H5N1) птиц встречался лишь в западном секторе Северной Евразии (западнее р. Енисей; самая восточная эпизоотия - среди диких птиц на озере Убсу-Нур в июне 2006 г.) и относился к Цинхай-Сибирскому генотипу.

4. Показана возможность возникновения рукотворных эпизоотий, этиологически связанных с высоковирулентным вирусом гриппа A (H5N1) птиц в отсутствие сезонных миграций диких птиц - на примере эпизоотии среди домашних птиц в Подмосковье в феврале 2007 г..

5. Установлено, что циркуляция высоковирулентного вируса гриппа A (H5N1) птиц Цинхай-Сибирского генотипа в западном секторе Северной Евразии сопровождалась дивергенцией на две генетические подгруппы, получившие названия «Тувинско-Сибирская» и «Ирано-Северокавказская».

6. Выявлен центр генетического разнообразия высоковирулентного вируса гриппа А (Н5Ш) птиц Цинхай-Сибирского генотипа на территории западного сектора Северной Евразии -Кубано-Приазовская низменность - на территории которой установлена циркуляция Тувинско-Сибирской и Ирано-Северокавказской генетических подгрупп, а также показана циркуляция вируса в популяциях птиц как водно-околоводного, так и наземного экологического комплекса.

7. Показано снижение уровня вирулентности штаммов вируса гриппа А (Н5>11) птиц Цинхай-Сибирского генотипа, изолированных в период 2005-2007 гг.. Наиболее выраженное снижение вирулентности обнаружено в штаммах от домашних птиц, наименее выраженное -в штаммах от диких птиц. Путём сопоставления фенотипических и молекулярно-генетических данных выявлены точечные аминокислотные замены, вероятно влияющие на снижение вирулентности.

8. Установлено, что проникновение высоковирулентного вируса гриппа А (Н51*И) в экосистемы восточного сектора Северной Евразии произошло весной 2008 г. с мигрирующими дикими птицами из южных провинций КНР и примыкающих территорий Вьетнама и Лаоса и было связано с генотипом Н5.12.3.2.

9. Установлено, что весной 2009 г. высоковирулентный вирус гриппа А (ЮМ) НА-генотипа 2.3.2 проник по Джунгарскому миграционному руслу в Котловину Больших Озёр Западной Монголии, где вызвал эпизоотию с высокой смертностью на оз. Убсу-Нур как на территории МНР, так и в РФ (в Республике Тыва).

10. Определена генотипическая структура штаммов высоковирулентного вируса гриппа А (ГОШ) птиц, изолированных на территории Северной Евразии, включающая 2 генотипа: Цинхай-Сибирский (Н5.Г 2.2) и Уссурийский (Н512.3.2); первый из них подразделяется на 4 генетические подгруппы (Цинхайскую, Западносибирскую, Тувинско-Сибирскую и Ирано-Северокавказскую), второй - на 2 генетические подгруппы (Дальневосточно-Южнокитайскую и Западномонгольскую). Сформулированы экологические принципы формирования генетических подгрупп.

4. ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ.

4.1. Список научных публикаций * по теме диссертационной работы:

1*. ЛьвовД.К., Ямникова С.С., ФедякинаИ.Т., ..., ЩелкановМ.Ю., идр. Экология и эволюция вирусов гриппа в России (1979-2002 гг.) // Вопросы вирусологии. - 2004. - Т. 49. -№3.-С. 17-24.

2. Петренко М.С., Щелканов М.Ю., Юдин А.Н. и др. Системная интеграция вирусологических, экологических и картографических исследований на основе

* Зввздочкой отмечены номера публикаций в периодических научных изданиях из списка ВАК.

современных информационных технологий // В сб.: III Всероссийская конференция с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, Россия; 20-24 января 2004 г.). - М.: Научно-издательский Центр ММА им. И.М. Сеченова, 2004. - С. 159.

3. Львов Д.К., Щелканов М.Ю., Громашевский В.Л. Влияние климатических факторов на циркуляцию природноочаговых вирусных инфекций в Северной Евразии // В сб.: Изменение климата и здоровье населения России в XXI веке. Труды международного семинара (Москва, Россия, 5-6 апреля 2004 г.). - М.: АдамтЪ, 2004. - С. 84-105.

4*. Львов Д.К., Ковтунов А.И., Яшкулов К.Б...... Щелканов М.Ю. и др. Проблемы

безопасности в связи с новыми и вновь возникающими инфекциями // Вестник РАМН. -2004,-№5.-С. 20-25.

5. Разумова Ю.В., Щелканов М.Ю., Дурыманова A.A. и др. Филогенетическое родство вариантов вируса гриппа А, выявленных у диких птиц на юге Западной Сибири и в других регионах Евразии // В сб.: Сибирская зоологическая Конференция. Материалы Всероссийской научной конференции с участием зарубежных учёных (Новосибирск, Россия; 15-22 сентября 2004 г.). - Новосибирск, 2004. - С. 398.

6. Львов Д.К., Дерябин П.Г., Щелканов М.Ю., Ковтунов А.И. и др. Мониторинг новых и возвращающихся вирусных инфекций на территории России и сопредельных стран // В сб.: Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний. Материалы Международной Конференции (Кольцово, Новосибирская область, Россия; 810 сентября 2004 г.). - Новосибирск: ЦЭРИС, 2004. - С. 68-69.

7. Разумова Ю.В., Щелканов М.Ю., Терновой В.А. и др. Циркуляция вирусов гриппа А в популяциях диких птиц на территории юга Западной Сибири (данные 2002 г.) // В сб.: Современные проблемы эпизоотологии. Материалы международной научной конференции (Краснообск, Новосибирская область, Россия; 30 июня 2004 г.). - Новосибирск, 2004. -С. 212-215.

8. Разумова Ю.В., Щелканов М.Ю., Юрлов А.К. и др. Особенности циркуляции вирусов гриппа А в популяциях диких птиц на юге Западной Сибири // Журнал инфекционной патологии. - 2004. - Т. 11. -№ 3-4. - С. 91-94.

9. Разумова Ю. В., Щелканов М.Ю., Терновой В.А. и др. Филогенетические и экологические особенности вариантов вируса гриппа А, циркулирующих в популяциях диких уток на юге Западной Сибири // В сб.: Болезни диких животных. Труды Международной научно-практической конференции (Покров, Владимирская область, Россия; 28-30 сентября 2004 г.). - Покров, 2004. - С. 85-89.

10. Львов Д.К., Щелканов М.Ю., Ямникова С.С., Громашевский В.Л. Краткие итоги долговременного мониторинга природных очагов вирусных инфекций Северной Евразии // В сб. (в 2 тт.): Актуальные проблемы здоровья населения Сибири: гигиенические и эпидемиологические аспекты. Материалы V Межрегиональной научно-практической конференции с международным участием (Омск, Россия; 25-26 ноября 2004 г.). - Омск, 2004. - Т. 2. - С. 156-164.

11. Щелканов М.Ю., Стариков Н.С., БуруноваВ.В. и др. О целесообразности интеграции информационных технологий, разработанных для поддержки вирусологических и социально-гигиенических исследований // В сб. (в 2 тт.): Актуальные проблемы здоровья населения Сибири: гигиенические и эпидемиологические аспекты. Материалы V Межрегиональной научно-практической конференции с международным участием (Омск, Россия; 25-26 ноября 2004 г.). - Омск, 2004. - Т. 2. - С. 171-173.

12. Разумова Ю.В., Щелканов М.Ю., ЧаусовЕ.В. и др. Результаты мониторинга вируса гриппа А на территории Барабинско-Кулундинской низменности (юг Западной Сибири) в

2002-2003 гг. IIВ сб. (в 2 Т.): Актуальные проблемы здоровья населения Сибири: гигиенические и эпидемиологические аспекты. Материалы V Межрегиональной научно-практической конференции с международным участием (Омск, Россия; 25-26 ноября 2004 г.). - Омск, 2004. - Т. 2. - С. 174-176.

13. Shestopalov A.M., Tserennorov D., Shchelkanov M.Yu., etal. To the study of circulation of influenza and West Nile viruses in the natural biocenoses of Mongolia // In: Current topics of virology. Abstract Book of X National Mongolian Conference (Ulaanbaatar, Mongolia; November, 25, 2004). - Ulaanbaatar, 2004. - P. 122-123.

14. Славский A.A., Щелканов М.Ю., Львов Д.Н. и др. Разработка базы знаний по миграционному поведению птиц с целью анализа возможных переносов возбудителей инфекционных заболеваний // В сб. (в 2-х тт.): Информационные технологии и математическое моделирование (ИТММ-2004). Материалы III Всероссийской научно-практической конференции (Анжеро-Судженск, Россия; 11-12 декабря 2004 г.). - Томск: Изд-во Том. Ун-та, 2004. - Т. 1. - С. 92-93.

15. Щелканов М.Ю., Громашевский В.Л., Епанчинцева A.B. и др. Применение геоинформационных технологий для повышения качества подготовки специалистов-вирусологов // В сб.: Качество образования: теория и практика (в 2-х тт.). Материалы Всероссийской научно-практической конференции (Анжеро-Судженск, Россия; 1011 декабря 2004 г.). - Томск: Изд-во НТЛ, 2004. - Т. 1. - С. 214-216.

16. Щелканов М.Ю., Шестопалов A.M., Романюха A.A. и др. Современные проблемы математического моделирования распространения вирусных инфекций // В сб.: Биотехнология: состояние и перспективы развития (в 2-х тт.). Материалы Ш-го Московского Международного Конгресса (Москва, Россия, 14-18 марта 2005 г.). - М.: «Экспо-биохим-технологии», РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2005. - Т. 1. - С. 187-188.

17*. Разумова Ю.В., Щелканов М.Ю., Дурыманова A.A. и др. Молекулярно-генетическое разнообразие вируса гриппа А в популяциях диких птиц на юге Западной Сибири // Вопросы вирусологии. - 2005. - Т. 50. - № 4. - С. 31-35.

18. Львов Д.К., Щелканов М.Ю., Власов H.A. и др. Изоляция вируса гриппа A/H5N1 от домашних и диких птиц в период эпизоотии в Западной Сибири (июль 2005 г.)//В сб.: Генодиагностика инфекционных болезней. Материалы Российской научно-практической конференции (Сосновка, Новосибирская область, Россия; 25-27 октября 2005 г.). -Новосибирск, ЦЭРИС, 2005. - С. 133-136.

19. Щелканов М.Ю., Шестопалов A.M., ЦэрэнноровД. и др. Комплексное вирусологическое обследование птиц Западно-Сибирского пролетного пути: результаты исследований по гранту РФФИ-03-04-49158//В сб.: Генодиагностика инфекционных болезней. Материалы Российской научно-практической конференции (Сосновка, Новосибирская область; Россия, 25-27 октября 2005 г.). - Новосибирск, ЦЭРИС, 2005. - С. 170-173.

20. Щелканов М.Ю., Власов H.A., Киреев Д.Е. и др. Клинические признаки заболевания у птиц, вызванного высокопатогенными вариантами вируса гриппа A/H5N1, в эпицентре эпизоотии на юге Западной Сибири (июль 2005 г.)//Журнал инфекционной патологии. -2005.-Т. 12.-№3-4.-С. 121-124.

21. Щелканов М.Ю., Петренко М.С., Стариков Н.С. и др. Внедрение современных информационных технологий в процесс молекулярно-вирусологических исследований // В сб.: Современные проблемы информатизации в прикладных задачах. Сборник трудов по итогам XI международной научной конференции (Воронеж, Россия; 15—20 января 2006 г.). - Выпуск 11.- Воронеж: Изд-во «Научная книга», 2006. - С. 66-67.

22. Славский A.A., Щелканов М.Ю., Петренко М.С. и др. Применение марковских цепей для описания миграционных путей птиц с целью прогнозирования заносов вирусных

инфекций//В сб.: Тезисы XII Международной орнитологической Конференции (Ставрополь, Россия; 31 января - 5 февраля 2006 г.). - Ставрополь: Изд-во СГУ, 2006. -С. 485-486.

23*. Львов Д.К., Щелканов М.Ю., Дерябин П.Г. и др. Изоляция штаммов вируса гриппа A/H5N1 от домашних и диких птиц в период эпизоотии в Западной Сибири (июль 2005 г.) и их депонирование в Государственную Коллекцию вирусов РФ (08 августа 2005 г.) // Вопросы вирусологии. - 2006. - Т. 51. - № 1. - С. 11-14.

24*. Львов Д.К., Прилипов А.Г., Щелканов М.Ю. и др. Молекулярно-генетический анализ биологических свойств высокопатогенных штаммов вируса гриппа A/H5N1, изолированных от диких и домашних птиц в период эпизоотии в Западной Сибири (июль

2005 г.) // Вопросы вирусологии. - 2006. - Т. 51. - № 2. - С. 15-19.

25*. Львов Д.К., Федякина И.Т., Щелканов М.Ю. и др. Действие in vitro противовирусных препаратов на репродукцию высокопатогенных штаммов вируса гриппа A/H5N1, вызвавших эпизоотию среди домашних птиц летом 2005 г. // Вопросы вирусологии. - 2006. -Т. 51.-X» 2.-С. 20-22.

26*. Щелканов М.Ю., Громашевский В.Л., Львов Д.К. Роль эколого-вирусологического районирования в прогнозировании влияния климатических изменений на ареалы арбовирусов // Вестник РАМН. - 2006. - № 2. - С. 22-25.

27*. Львов Д.К., Щелканов М.Ю., Дерябин П.Г. и др. Эпизоотия среди лебедей-шипунов (Cygnus olor) в нижней дельте Волги (ноябрь 2005 г.), вызванная высокопатогенным вирусом гриппа А / H5N1 // Вопросы вирусологии. - 2006. - Т. 51. - № 3. - С. 10-16.

28*. Разумова Ю.В., Щелканов М.Ю., Золотых С.И. и др. Результаты мониторинга вируса гриппа А в популяциях диких птиц на юге Западной Сибири (данные 2003 г.) // Вопросы вирусологии. - 2006. - Т. 51. - № 3. - С. 32-37.

29. Щелканов М.Ю., Петренко М.С., Стариков Н.С. и др. Информационные технологии в современных молекулярно-вирусологических исследованиях // Врач-аспирант. - 2006. -№ 3. - С. 286-287.

30. Львов Д.К., Щелканов М.Ю., Дерябин П.Г. Мониторинг и прогнозирование чрезвычайных эпидемических ситуаций, обусловленных новыми и возвращающимися инфекциями // В сб.: Материалы VI научно-практической конференции «Проблемы прогнозирования чрезвычайных ситуаций» (п. Никола, Иркутская обл., Россия; 0507 сентября 2006 г.). - Иркутск: МЧС РФ, 2006. - С. 77-78.

31*. Шестопалов A.M., Золотых С.И., Щелканов М.Ю. и др. Результаты двухлетнего обследования диких птиц на территории Западной Монголии на присутствие вируса гриппа // ЖМЭИ. - 2006. - N 5. - С. 55-59.

32*. Львов Д.К., Щелканов М.Ю., Дерябин П.Г. и др. Изоляция высокопатогенных (HPAI) штаммов вируса гриппа A/H5N1 от диких птиц в очаге эпизоотии на озере Убсу-Нур (июнь

2006 г.) и их депонирование в Государственную Коллекцию вирусов РФ (03 июля 2006 г.) // Вопросы вирусологии. - 2006. - Т. 51. - № 6. - С. 14-18.

33*. Дерябин П.Г., Львов Д.К., Исаева Е.И, ..., Щелканов М.Ю. Спектр клеточных линий позвоночных, чувствительных к высокопатогенным вирусам гриппа А/крачка/Южная Африка/61 (H5N3) и А/крачка/Новосибирск/56/05 (H5N1)// Вопросы вирусологии. - 2007. -Т. 52.-№ 1,-С. 45^7.

34. Lvov D.K., Shchelkanov M.Yu., Deryabin P.G., et al. High pathogenic avian flu (HPAI) H5N1: causes and consequences virus penetration into Northern Eurasia // Proceedings of VI International Conference «Options for the Control of Influenza» (Toronto, Canada; June, 1723,2007). - Toronto, 2007. - P. 31.

35*. Киреев Д.Е., Аканина Д.С., Гребенникова Т.В. и др. Разработка тест-систем для выявления и типирования вируса гриппа А на основе полимеразной цепной реакции // Вопросы вирусологии.-2007.-Т. 52,-№4.-С. 17-22.

36*. Щелканов М.Ю., Ананьев В.Ю., Львов Д.Н. и др. Комплексный эколого-вирусологический мониторинг на территории Приморского края (2003-2006) // Вопросы вирусологии. - 2007. - Т. 52. - № 5. - С. 37-48.

37. Львов Д.К., Щелканов М.Ю. О терминологической состоятельности применения категорий «патогенность» и «вирулентность» // В кн.: Сборник трудов 6-ой Всероссийской научно-практической Конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2007» («Генодиагностика-2007») (Москва, Россия; 28-30 ноября 2007 г.). -М., 2007. - T. I.-C. 203.

38. Львов Д.К., Щелканов М.Ю., Дерябин П.Г. и др. Расшифровка эпизоотической вспышки, вызванной высоковирулентным вирусом гриппа А / H5N1 Цинхай-Сибирского генотипа, на птицеферме «Лебяжье-Чепигинский» (Брюховецкий район Краснодарского края) в августе-сентябре 2007 г.//В кн.: Сборник трудов 6-ой Всероссийской научно-практической Конференции с международным участием «Молекулярная диагностика-2007» («Генодиагностика-2007») (Москва, Россия; 28-30 ноября 2007 г.). - М., 2007. -T. I. - С. 204-208.

39. Львов Д.К., Щелканов М.Ю., Дерябин П.Г. и др. Причины и последствия проникновения высоковирулентного вируса гриппа А на территорию Северной Евразии: Новые данные об эволюции вируса // В кн.: Сборник трудов 6-ой Всероссийской научно-практической Конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2007» («Генодиагностика-2007») (Москва, Россия; 28-30 ноября 2007 г.). - М., 2007. - T. I. -С. 209-210.

40. Львов Д.К., Щелканов М.Ю., Прилипов А.Г. и др. Молекулярно-генетические особенности высоковирулентного варианта вируса гриппа А/H5N1, вызвавшего локальную эпизоотическую вспышку в Подмосковье в феврале 2007 г. // В кн.: Сборник трудов 6-ой Всероссийской научно-практической Конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2007» («Генодиагностика-2007») (Москва, Россия; 28-30 ноября 2007 г.). - М„ 2007. - T. I. - С. 211-214.

41*. Львов Д.К., Щелканов М.Ю., Прилипов А.Г. и др. Молекулярно-генетическая характеристика штамма A/ch¡cken/Moscow/2/2007(H5Nl) из очага эпизоотии высокопатогенного гриппа А среди сельскохозяйственных птиц в Подмосковье (февраль 2007 г.) // Вопросы вирусологии. - 2007. - Т. 52. - № 6. - С. 40-47.

42. Lvov D.K., Shchelkanov M.Yu., Prilipov A.G., et al. Emerging zoonotic viruses in Northern Asia-Pacific ecosystems//Proceedings of 8lh Asia Pacific Congress of Medical Virology «Emerging zoonotic viruses in Northern Asia-Pacific ecosystems» (Hong Kong; February 24-March 02, 2009). - Hong Kong: Asia Pacific Society of Medical Virology, 2009. - P. 68.

43*. Львов Д.К., Щелканов М.Ю., Дерябин П.Г. и др. Эпизоотия среди диких и домашних птиц, вызванная высоковирулентным вирусом гриппа A/H5N1 гентипа2.2 (Цинхай-Сибирский) на пути осенних миграций в северо-восточной части бассейна Азовского моря (Краснодарский край) // Вопросы вирусологии. - 2008. - Т. 53. - № 2. - С. 14-19.

44. Львов Д.К., Щелканов М.Ю., Прилипов А.Г. и др. Эволюция вируса гриппа H5N1 в природных биоценозах Северной Евразии: глобальные последствия//В сб.: Материалы IV Международного ветеринарного Конгресса по птицеводству (Москва, Россия; 0811 апреля 2008 г.). - М„ 2008. - С. 87-92.

45. Казарян A.C., Луницин A.B., Кушнир А.Т., Щелканов М.Ю. Изучение некоторых биологических свойств изолятов вирусов гриппа, выделенных в Московской области и

Республике Тыва // В сб.: Материалы IV Международного ветеринарного Конгресса по птицеводству (Москва, Россия; 08-11 апреля 2008 г.). - М., 2008. - С. 105-109.

46*. Яшкулов К.Б., Щелканов М.Ю., Львов С.С. и др. Изоляция вирусов гриппа А (Orthomyxoviridae, Influenza A virus), Дхори (Orthomyxoviridae, Thogotovirus) и болезни Ньюкасла (Paramyxoviridae, Avulavirus) на о. Малый Жемчужный в северо-западной части акватории Каспийского моря // Вопросы вирусологии. - 2008. - Т. 53. - № 3. - С. 34-38.

47. Львов Д.К., Дерябин П.Г., Щелканов М.Ю. и др. Грипп и другие новые и возвращающиеся инфекции северной Евразии: глобальные последствия // Вестник Российской военно-медицинской академии. - 2008. - № 3 (23). - Приложение 2. - Часть I. -С. 5.

48*. Львов Д.К., Щелканов М.Ю., Прилипов А.Г. и др. Расшифровка эпизоотической вспышки среди диких и домашних птиц на юге европейской части России в декабре

2007 г. // Вопросы вирусологии. - 2008. - Т. 53. - № 4. - С. 18-23.

49*. Львов Д.К., Щелканов М.Ю., Власов H.A. и др. Первый прорыв нового для России генотипа 2.3.2 высоковирулентного вируса гриппа A/H5N1 на Дальнем Востоке // Вопросы вирусологии. - 2008. - Т. 53. - № 5. - С. 4-8.

50. Колобухина Л.В., Меркулова Л.Н., Щелканов МЛО. и др. Новые возможности этиотропной терапии гриппа // В сб.: Материалы VI научно-практической конференции «Инфекционные болезни и антимикробные средства» (Москва, Россия; 02-03 октября

2008 г.). - М.: ГЕОС, 2008. - С. 33-35.

51. Львов Д.К., Щелканов М.Ю., Дерябин П.Г. и др. Распространение высоковирулентного вируса гриппа А субтипа H5N1 на территории Северной Евразии: данные 2008 г. // В сб.: Материалы международной научно-практической конференции «Проблемы совершенствования межгосударственного взаимодействия в подготовке к пандемии гриппа» (Новосибирск, Россия; 9-10 октября 2008 г.). - Новосибирск: ЦЭРИС, 2008. -С. 39-41.

52. Lvov D.K., Shchelkanov M.Yu., Burtseva E.I., et al. Circulation of influenza viruses in Northern Eurasia - global consequences (ecology, evolution, drug resistance, virulence) // In: Materials of International Conference «New trends in infectious diseases» (Lyon, France; November, 26-28, 2008). - Lyon: INSERM, 2008. - P. 46.

53. Львов Д.К., Слепушкин A.H., Бурцева Е.И., Щелканов М.Ю. и др. Роль Центра экологии и эпидемиологии гриппа при ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН в системе эпиднадзора за циркуляцией вирусов гриппа в России // В сб.: Грипп и гриппоподобные инфекции (включая особо опасные формы гриппозной инфекции): фундаментальные и прикладные аспекты изучения. Бюллетень проблемной комиссии по гриппу РАМН / Ред.: В.И. Покровский, Д.К. Львов, О.И. Киселёв, Ф.И. Ершов. - СПб.: Изд-во «Роза мира», 2008. - С. 23-29.

54. Львов Д.К., Щелканов М.Ю., Колобухина Л.В. Сбор, хранение и транспортировка полевых материалов // В сб.: Медицинская вирусология / Ред. Академик РАМН Д.К. Львов. - М.: МИА, 2008. - С. 293-300.

55. Lvov D.K., Shchelkanov M.Yu., Prilipov A.G., et al. Emerging zoonotic viruses in Northern Asia-Pacific ecosystems//Proceedings of 8th Asia Pacific Congress of Medical Virology «Emerging zoonotic viruses in Northern Asia-Pacific ecosystems» (Hong Kong; February 24 -March 02,2009). - Hong Kong: Asia Pacific Society of Medical Virology, 2009. - P. 68.

56*. Щелканов М.Ю., Прилипов А.Г., Львов Д.К. и др. Динамика вирулентности штаммов высоковирулентного вируса гриппа А/H5N1 генотипа 2.2, изолированных на территории России в 2005-2007 гг. // Вопросы вирусологии. - 2009. - Т. 54. - № 2. - С. 8-17.

57. Дерябин П.Г., Ботиков А.Г., Львов Д.К., Щелканов М.Ю. и др. Создание и характеристика коллекции высоковирулентных штаммов вируса гриппа А/H5N1, циркулирующих на территории Российской Федерации//В сб.: Материалы Международной научно-практической конференции «Перспективы сотрудничества государств-членов ШОС в противодействии угрозе инфекционных болезней» (Сосновка, Новосибирская обл., Россия; 14-15 мая 2009 г.). - Новосибирск: ЦЭРИС, 2009. - С. 87-89.

58 . Казарян А.С., КушнирА.Т., Щелканов М.Ю., Львов Д.К. Вирулентность прототипных штаммов вируса гриппа А / H5N1 // Ветеринария. - 2009. - № 7. - С. 24-26.

59. Гущина Е.А., Федякина И.Т., Щелканов М.Ю. и др. Морфологическая идентификация неизвестных вирусов в изолятах от чирка-клоктуна и белолобого гуся // В сб.: Материалы XXIII Российской конференции по электронной микроскопии (РКЭМ-2010) (Черноголовка, Московская область, Россия; 31 мая-04 июня 2010 г.). - М.: Научный совет РАН по электронной микроскопии, 2010. - VIII-19.

60*. Lvov D.K., Shchelkanov M.Yu,, Prilipov A.G., etal. Evolution of HPAI H5N1 virus in Natural ecosystems of Northern Eurasia (2005-2008) // Avian Diseases. - 2010. - V. 54. - P. 483-495.

61. Shchelkanov M.Yu., Prilipov A.G., LvovD.K. Evolution of emerging influenza viruses in Northern Eurasia//In: Materials of International Conference "Emerging influenza viruses (H5N1, H1N1)" (15-16 February, 2010, Marburg, Germany). - Marburg: Koch-Mechnikov Forum,2010.-P. 31.

4.2. Благодарности.

Искреннюю благодарность хочется выразить моему научному консультанту академику РАМН Дмитрию Константиновичу Львову, чьи энциклопедические знания, колоссальный опыт, чудовищная работоспособность и талант организатора служили мне ориентиром и оказывали существенную помощь при выполнении данной работы. Олицетворяя живую связь между легендарным прошлым и настоящим отечественной вирусологии, Дмитрий Константинович не только проявлял необходимую требовательность (без которой, к слову, данная работа рисковала таки остаться незаконченной), но и собственным примером демонстрировал, как следует преодолевать объективные трудности на пути к поставленной цели. И в походной палатке, и в академической обстановке Дмитрий Константинович неизменно являл собой образец блестящего учёного и строго наставника.

Неоценимую помощь в процессе выполнения настоящей работы оказывали моя жена, Вероника Вячеславовна Бурунова, и мой сын, Егор Михайлович Щелканов, привыкшие к моему частому отсутствию дома, ждавшие меня из экспедиций, но неизменно поддерживавшие меня в трудные моменты.

Несмотря на многочисленные увещевания, мне не удалось избежать лёгкой формы manía grandiosa, в результате чего объёмы первых двух вариантов диссертации существенно превышали разумные пределы. Некоторые коллеги оказались настолько тактичны, что прежде, чем объявить диагноз, нашли в себе силы внимательно прочесть мои рукописи: Д.К. Львов (научный консультант), Е.И. Бурцева, Н.Л. Варич, А.Л. Забережный (официальные рецензенты

на апробации)3, АЛ. Беляев, C.B. Грибенча, П.Г. Дерябин, В.Т. Иванова, JI.B. Колобухина, JI.B. Урываев - их конструктивные замечания существенно способствовали повышению качества изложения материала.

Я благодарен всем сотрудникам НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, которые поддерживали необходимую научную среду, без которой диссертационная работа не могла бы состояться. Однако некоторые подразделения Института необходимо поблагодарить особо. В первую очередь, это Лаборатория экологии вирусов, в которой я провёл лучшие годы своей жизни: Д.Н. Львов (зав. лаб.), C.B. Альховский, В.А. Аристова, H.H. Байкова, Г.М. Белоножкина, Е.И. Вакар, И.В. Галкина, [Т.М. Горелова|, |В.Л. Громашевский|, Г.М. Ерина, М.В. Иванова, Т.Н. Морозова, [Т.М. Москвина|, Е.С. Прошина, Е.И. Самохвалов, Е.Г. Самохвалова, И.Т. Федякина, В.М. Чумаков, В.Н. Якунченкова. Свою научную деятельность я начинал в Лаборатории биотехнологии, и её заведующий |М.М. Гараев| до последнего момента был незаменимым старшим товарищем. Сотрудники Лаборатории экспериментальной экологии всегда являлись ближайшими коллегами, работы которых во многом определили и содержание настоящей диссертации: С.С. Ямникова (зав. лаб.), B.C. Богданова, В.В. Волкова, М.Н. Санков, |Б.В. Синицын|. Секвенирование нуклеотидных последовательностей проводилось в Лаборатории молекулярной генетики, сотрудники которой довели этот процесс до совершенства: А.Г. Прилипов (зав. лаб.), А.Г. Воронина, Е.Л. Гурьев, М.М. Журавлёва, М.В. Лаврентьев, В.В. Мохонов, А.Б. Поглазов, Г.К. Садыкова, Е.В. Усачёв, О.В. Усачёва, А.Г. Шаталов, О.В. Шляпникова. Молекулярная диагностика и работа с биологическими микрочипами проводилась в Лабораториях прикладной вирусологии (А.Д. Забережный - зав. лаб.), средств специфической профилактики вирусных болезней (Т.И. Алипер - зав. лаб.), молекулярной диагностики (Т.В. Гребенникова - зав. лаб.; Д.С. Аканина, Д.Е. Киреев). Работу с лабораторными животными великолепно обеспечивали сотрудники вивария особо опасных инфекций: М.В. Чернова (зав. лаб.), Е.В. Чернова. Большую научно-методическую помощь оказывали сотрудники Лаборатории этиологии и эпидемиологии гриппа: |À.H. Слепушкин!, Е.И. Бурцева (зав. лаб.), А.Л. Беляев, В.Т. Иванова, В.В. Лаврищева, C.B. Трушакова, Т.А. Оскерко, Е.Л. Феодоритова, Е.С Шевченко. Консультирование по клиническим проблемам осуществляли сотрудники Клинического отдела: С.Г. Чешик, Л.В. Колобухина (зав. отделом), Д. Н. Львов, Л.Н. Меркулова, В.М. Стаханова, И.В. Шахгильдян. Изучение эффективности химиопрепаратов проводилось при участии сотрудников Лаборатории химиотерапии вирусных инфекций: Г.А. Галегов (зав. лаб.). Неоценимую помощь при депонировании штаммов оказывали сотрудники Лаборатории Государственной Коллекции вирусов: Л.Л. Фадеева, П.Г. Дерябин (зав. лаб.), А.Г. Ботиков, Л.В. Панина, Е.В. Сухно. Обеспечение клеточными культурами и технологическую поддержку осуществляла Лаборатория культур тканей: Р.Я. Подчерняева (зав. лаб.), О.В. Бакланова, О.М. Гринкевич, O.A. Лопатина, Г.Р. Михайлова, А.Д. Петрачёв, Е.Л. Фирсова, М.Н. Щеплин. Ценнейшую информацию и ценные советы

3 Здесь и далее используется алфавитный принцип перечисления (за исключением руководителя структурного подразделения, который всегда указывается первым). Приношу свои извинения коллегам, что из-за ограничения по объёму не имею возможности указывать учёные степени и звания, а также полные имена и отчества.

поставляли сотрудники Лабораторий физиологии вирусов (Н.В. Каверин - зав. лаб.; Н.Л. Варич, К.С. Кочергин-Никитский, П.С. Крылов, И.А. Руднева, A.A. Шилов), механизмов вирусного патогенеза (О.П. Жирнов - зав. лаб.; В.В. Сырцев), субвирусных структур (Смирнов Ю.А. - зав. лаб.; Е.А. Говоркова), энзимологии (Л.В. Урываев - зав. лаб.; Т.М. Соколова), биологии и индикации арбовирусов (A.M. Бутенко - зав. лаб.; |С.Я. Гайдамович|, В.Ф. Ларичев, Н.В. Хуторецкая), клеточной инженерии (A.A. Кущ -зав. лаб.), сравнительной вирусологии (И.Ф. Баринский - зав. лаб.; Л.М. Алимбарова), синтеза пептидов (В.А. Шибнев - зав. лаб.; Т.М. Гараев). Электронно-микроскопические данные были получены в Лаборатории структуры и морфогенеза вирусов: С.М. Клименко (зав. лаб.), В.Б. Григорьев, Е.А. Гущина, М.И. Калинин, Ф.В. Лисицын, A.A. Маныкин. Поддержку информационных технологий осуществлял системный администратор Института A.A. Кученков и инженер И.Д. Зорков. Безукоризненная транспортная логистика выполнялась силами ГОЧС: К.О. Герюгов (начальник), Акинфиев Н.М.. Бесперебойное финансирование и материально-техническое обеспечение исследований проводилось во многом благодаря финансово-экономическому (З.С. Щуренко - руководитель) и техническому (А.Е. Киселёв -руководитель) отделам, а также бухгалтерии (В.П. Кулакова - глав, бух.) Института.

Участвуя в совместных экспедициях и научных проектах, я многому научился у сотрудников других научно-исследовательских учреждений, кого, пользуясь случаем, хотел бы поблагодарить - ГНЦ ВБ «Вектор»: И.Г. Дроздов (директор), A.M. Шестопалов (руководитель отдела зоонозных инфекций), А.Ю. Алексеев, В.А. Евсеенко, A.B. Епанчинцева, A.B. Зайковская, С.И. Золотых, Ю.В. Кононова, Ю.В. Разумова, А.Г. Дурыманов; Всероссийский Центр кольцевания птиц: К.Е. Литвин (руководитель), |Е.Н. Гуртовая|, Е.В. Сыроечковский, С.П. Харитонов; Ветклиника «ЗП»: В.В. Романов (директор); ВНИИЗЖ:

A.B. Варкентин, М.В. Жалин, A.B. Иголкин, Т.Б. Манин, А.Е. Пичуев, A.B. Фролов, И.А. Чвала, Л.О. Щербакова, С.С. Яковлев; ЦНМВЛ: М.В. Калмыков (директор), О.Н. Виткова; Институт гриппа РАМН: О.И. Киселёв (директор), М.Ю. Еропкин, A.A. Соминина; НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова: В.В. Зверев (директор); ЦНИИЭМ РАМН:

B.И. Покровский (директор), В.В. Малеев, Г.А. Шипулин, С.Б. Яцышина; ГНУ ВНИИВВМ РАСХН: Д.В. Колбасов (директор), A.C. Казарян, В.В. Куринов, А.Т. Кушнир; ИСЭЖ СО РАН: A.B. Друзяка, А.К. Юрлов; Национальный Центр по изучению природноочаговых инфекций МНР: Даважав Авмед, Т. Алтантсетсен, Дамдиндорж Цэрэнноров, Отгонбаатар Дашдаваа; НГУ: C.B. Нетёсов (проректор), Л.В. Шестопалова.

Выполнение данной работы было бы невозможно без большого количества квалифицированных и добросовестных сотрудников различных учреждений в различных регионах нашей страны. Среди тех, кто оказывал неоценимую помощь в работе и проявлял искреннюю заинтересованность, я должен с благодарностью назвать4 Управление Роспотребнадзора по Республике Калмыкия: К.Б. Яшкулов (руководитель), Андрющенко A.B., Л.П. Бойченко, В.Д. Гаряев, Е.О. Джеваков, Т.Л. Никулина, [A.B. Канаев|, Б.Я. Канкаева, Н.З. Коджиева, |А.М. Монкилов|, В.Х. Очиров, С.П. Савченко, Н.В. Сангаджиева,

4 Учреждения перечислены в хронологическом порядке начала работы с ними.

Jl.A. Слюсарева, С.Б. Тельджиев, В.Б. Утнасунов, В.Г. Харинов, Н.М. Чимидова; ФГУЗ «ЦГЭ в Республике Калмыкия»: С.Д. Джамбинов (глав, врач), Е.С. Бембеева, Б.Ц. Бушкиева, Т.А. Дарбакова, Л.Б. Михаляева, Б.Г. Хейчиев; Управление Россельхознадзора по Республике Калмыкия: Б.Н. Сапронов (руководитель), A.A. Акданов, A.A. Клецов; Управление Росприроднадзора по Республике Калмыкия: Э.Б. Габунщина (руководитель); Управление Роспотребнадзора по Астраханской обл.: А.И. Ковтунов (руководитель), Ф.Б. Габбасов, В.Д. Дыбаль, P.M. Ибрагимов, Е.А. Леонтьев, Е.А. Одолевский, П.Ф. Чекризов, В.П. Шатилов; ФГУЗ «ЦГЭ в Астраханской обл.»: А.Ф. Джаркенов (зам. глав, врача), Н.П. Артюх, Л.Н. Куликова; Управление ветеринарии Астраханской обл.: A.B. Васильев (руководитель); Управление Роспотребнадзора по Приморскому краю: МасловД.В. (руководитель),

B.А. Дуюнов, С.А. Коломеец, В.А. Мирошников, П.Л. Оропай, В.М. Снытко; ФГУЗ «ЦГЭ в Приморском крае»: В.Ю. Ананьев (глав, врач), A.B. Ардашев, Н.И. Баранов, Е.Г. Бурухина, Т.Н. Вершкова, В.Н. Гореликов, Е.А. Доскач, В.Н. Кожан, A.C. Кокарев, А.И. Малый, O.A. Столбун, С.А. Ульянова, О.В. Цой, Г.Н. Яровенко; Ханкайское отделение AHO «Примсансервис»: Ф.Ф. Клешнев (руководитель); Управление Россельхознадзора по Приморскому краю: С.А. Дымов (руководитель), С.Р. Абгарян, А.И. Белов, А.Ф. Кабанов, A.B. Кириллов, Э.С. Мун, С.А. Мягков, Л.А. Снигирь, H.H. Сокол, Т.П. Челедина; Управление ветеринарии Приморского края: В.А. Волков (руководитель), В.В. Бандеев, Т.М. Власенко, И.П. Короткова, E.H. Любченко, В.И. Семёнов, И.Ф. Тихонова, O.A. Уманец, В.Н. Флягин, A.B. Щербаков; ФГУ «Специнспекция "Тигр"»: В.В. Гапонов (руководитель); Управление охотнадзора Приморского края: Т.С. Арамилева (руководитель), H.H. Грачёв, О.Ф. Исхаков,

C.И. Коптев, А.Л. Суровый, А.И. Сысик, А.И. Черторинский, Н.И. Шмаков; Ханкайское охотобщество: H.A. Розенко (председатель), В.Л. Болкун, В.Д. Гулаг, C.B. Даниленко, О.В. Каравайкин, В.Н. Косар, A.C. Молчанов, И.А. Творогов; Хасанское охотобщество:

A.B. Сычёв (председатель), A.A. Беляев, В.Д. Лобода, C.B. Романютенко, И.В. Сулимов,

B.А. Чубриков, И.В. Чубриков, О.П. Ярёма; Зарубинское охотобщество «Примохота»: В.Ф. Книга (председатель), Т.Н. Кучеров, В.В. Скульбин, O.P. Трихонин; Уссурийское охотобщество: В.И. Никитин (председатель), A.B. Евтушенко, В.Н. Ковалёв, В.П. Ухаботин; Управление Роспотребнадзора по Еврейской АО: В.А. Янович (руководитель), Е.С. Мироненко; ФГУЗ «ЦГЭ в Еврейской АО»: В.И. Буртник (глав, врач), Л.Н. Авдошина, В.В. Мужеровский, И.П. Снеткова, Н.И. Шапиро; Специнспекция по особо охраняемым природным территориям Еврейской АО: Ю.Г. Лапин, М.С. Сухоногов, A.B. Торлов; Управление ветеринарии Еврейской АО: М.В.Юдаев (руководитель), В.З. Тёмкин, И.В. Головина, H.A. Шерстюк; Управление Россельхознадзора по Хабаровскому краю, Еврейской авт. и Сахалинской областям: О.И. Новокрещенов, А.Б. Волков (руководитель), A.B. Козуб (зам. в Сахалинской обл.), С.А. Мокров (зам. в Еврейской АО), Г.Ю. Антонов, A.B. Бычков, Е.В. Древаль, Ю.И. Дымов, В.Н. Исаков, В.Л. Казанцев, П.П. Кукишев, Н.М. Малышенко, С.А. Прохоренко, В.А. Рябченков, О.Г. Савин, О.О. Сапожников, М.В. Спиртов, C.B. Ташлыков, С.Г. Хмельник, В.И. Черкашин; Управление Россельхознадзора по Иркутской обл.: Б.П. Самарский (руководитель), C.B. Грохотов, Н.В. Зенков; Управление ветеринарии Иркутской обл.: Б.Н. Балыбердин (руководитель), И.В. Мельцов, В.В. Журавлёв,

Е.И. Кашин; Управление Россельхознадзора по Республике Тыва: А.О. Кенден, А.Т. Оюн (руководитель), М.Ш. Арапчор, P.A. Базыр-оол, Н.К. Балчийнаа, М.Д. Докпер-оол,

A.M. Донгур-оол, Н.В. Дресвянникова, Б.А. Медведев, A.A. Монгуш, Ч.Б. Оюн, В.Ф. Слезюк, И.К. Солчак, A.A. Ужуланов, В.И. Шарбин; Управление ветеринарии Республики Тыва: P.M. Монгуш (руководитель), Б.Н. Махмутова, Л.К. Сарыглар; Государственный природный биосферный заповедник «Убсунурская котловина»: В.И. Канзай (директор), С.Б. Донгак; ФГУЗ «ЦНЭ в Республике Тыва»: О.Д. Ховалыг (руководитель); Управление Россельхознадзора по Республике Хакассия: C.B. Машуков (Руководитель), С.Ю. Артёмова, Д.С. Коссович, A.B. Лубышев, Г.Ю. Ульчугачев; Агентство ГОЧС Республики Тыва: Н.М. Монгуш (директор); Управление Россельхознадзора по Республике Бурятия: В.В. Смолин (руководитель), П.Е. Шмулевич, В.Т. Носков; Управление Россельхознадзора по Республике Карелия, Архангельской обл. и Ненецкому авт. окр.: А.П. Щигарцов (руководитель),

B.И. Клочков, Г.В. Колосов; Агентство лесного и охотничьего хозяйства Архангельской обл.: Н.С. Кротов; Охотобщество «Сафари»: P.A. Ахмадулин, Г.А. Бурцев, A.A. Заика, В.В. Захаров, А.П. Лавриков, A.B. Лукьянов, В.В. Ремизов, А.Н. Самохин, И.Г. Силкин; Управление Россельхознадзора по Краснодарскому краю: A.C. Фонтанецкий (руководитель), Т.В. Ермизина, А.Н. Лысенков, Е.А. Митенко, Д.В. Степанов, И.А. Щербина; Управление Россельхознадзора по Ростовской обл.: С.Н. Лысенко (руководитель), В.И. Белоусов, А.И. Левинцов, В.В. Мартыновченко, С.П. Морозов, В.В. Стешенко; Департамент особо охраняемых природных территорий Сахалинской обл.: С.И. Котельников (руководитель),

A.A. Костин, В.К. Мамонтов, В.И. Теплов, В.А. Яковлев; Государственный природный заповедник «Курильский»: Е.М. Григорьев (директор), М.А. Антипин, В.А. Зуев, C.B. Панков, Н.В. Ступина; Управление Росприроднадзора по Хабаровскому краю: Д.М. Гранкин; ФГУЗ «ЦГЭ в Сахалинской обл.»: И.А. Подолянко (глав, врач), М.А. Громова, О.В. Еловский, Е.Е. Калаева, Ц.Б. Цыжипова; Сахалино-Курильское Управление Федерального Агентства по рыболовству: K.P. Акуев (руководитель), М.В. Игнатов; Управление Роспотребнадзора по Хабаровскому краю: В.А. Orr (руководитель); ФГУЗ «ЦГЭ в Хабаровском крае»: Ю.А. Гарбуз (глав, врач), В.И. Резник; ФГУЗ «Хабаровская противочумная станция» Л.И. Иванов (руководитель), Н.П. Высочина, Н.И. Здановская, A.C. Лапин, Н.М. Пуховская; Управление Роспотребнадзора по Магаданской области: В.Р. Саухат (руководитель); ФГУЗ «ЦГЭ в Магаданской обл.»: С.Н.Григорьев (глав, врач), М.В.Довгаль, Ю.В.Еремеева; Управление Роспотребнадзора по Чукотскому авт. окр.: Г.Б. Лебедев (руководитель), А.К. Ефанов,

B.Н. Кирин; ФГУЗ «ЦГЭ в Чукотском авт. окр.»: И.Ю. Феделеш (глав, врач), Т.В. Ардашева, Е.А. Сахарова, С.А. Цуприк; ГУЗ «Чукотская окружная больница»: А.И. Маслов (глав, врач), Е.А. Исхакова, Н.М. Ищенко, P.A. Пономаренко.

4.3. Сокращения.

ВОЗ - Всемирная Организация Здравоохранения;

ГКВ РФ - Государственная Коллекция вирусов Российской Федерации при НИИ вирусологии

им. Д.И. Ивановского РАМН;

ИФА - иммуноферментный анализ;

КЧП - классическая чума птиц;

НИР - научно-исследовательская работа;

ОРВИ - острая респираторная инфекция;

ОТ-ПЦР - обратная транскрипция с последующей лолимеразной цепной реакцией; ОТ-ПЦР-РВ - ОТ-ПЦР в реальном времени; РГА - реакция гемагглютинации;

РККК - Российская коллекция клеточных культур при НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН;

РН - реакция нейтрализации;

РТГА - реакция торможения гемагглютинации;

СПЭВ - перевиваемая линия клеток почки эмбриона свиньи;

ПТФ - птице-товарная ферма;

ФЭК - фибробласты эмбриона курицы;

ЦГЭ - Центр гигиены и эпидемиологии;

ВНК-21 - baby hamster kidney - перевиваемая линия клеток почки новорожденного сирийского хомячка;

СС81 - cat embryo fibroblasts - перевиваемая клеточная линия фибробластов эмбриона кошки;

CRFK - Crandell-Rees feline kidney - перевиваемая линия клеток почки кошки;

HEL - human embryo lung - перевиваемая линия клеток лёгкого эмбриона человека;

HPAI - highly pathogenic avian influenza - высоковирулентный грипп А птиц;

L929 - clone 929 of L line - клон 929 линии L клеток из мезенхимы лабораторной мыши

{Mus musculus) линии СЗН/Ап;

LPAI - low pathogenic avian influenza - слабовирулентный грипп А птиц;

MDCK - Madin-Darby canine kidney - перевиваемая линия клеток почки собаки;

Mpf- Mustela putorius furo brain - перевиваемая клеточная линия глиомы хорька;

TCID50 - 50 % tissue culture infection dose - 50 %-ая инфекционная доза для клеточной

культуры;

Vero-E6 - vervet-obtained monkey kidney, clone E6 - перевиваемая линия клеток почки африканской зелёной мартышки, клон Еб.

Заказ № 16-а Подписано в печать 07.06.2010 Тираж 300 экз. Усл. п.л. 2

: ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30

(Л/^/У www.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Щелканов, Михаил Юрьевич

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность проблемы.

Цель исследования.

Задачи исследования.

Научная новизна работы.

Практическая ценность работы.

Основные положения, выносимые на защиту.

Апробация диссертационной работы.

Научные публикации по теме диссертации.

Структура диссертационной работы.

ОБЗОР НАУЧНОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава I. Краткий обзор истории изучения гриппа.

§ 1.1. Данные о гриппе до открытия этиологического агента.

1.1-1. Описание гриппа Гиппократом.

1.1-2. «Крестьянская лихорадка» и «английская потница» в IX- XVIII веках

1.1-3. Этимология терминов «грипп» и «influenza».

1.1 -4. Эпидемии гриппа в XIX- начале XX века.

1.1-5. Классическая чума птиц.

1.1-6. Заразный катар верхних дыхательных путей лошадей.

1.1-7. Эпизоотическая бронхопневмония свиней.

1.1 -8. Haemophilus influenzae - ложный этиологический агент гриппа А.

§ 1.2. Открытие вируса гриппа А.

1.2-1. Установление филътруемости этиологического агента гриппа (1918 г.) 28 1.2-2. Изоляция вируса гриппа А от свиней (Artiodactyla: Suidae, Sus) (1930 г.)

1.2-3. Изоляция вируса гриппа А от людей (Primates: Hominidae, Homo) (1933 г.)

1.2-4. Разработка технологии культивирования вируса гриппа А в развивающихся куриных эмбрионах (1935 г.).

1.2-5. Открытие гемагглютииирующей активности вируса гриппа А (1941 г.)

1.2-6. Открытие нейраминидазой активности вируса гриппа А (1942 г.).

§ 1.3. Пандемии гриппа XX-XXI веков.

1.3-1. Пандемия «испанки» (H1N1) (1918-1919 гг.).

1.3-2. Создание (1947 г.) Глобальной Программы ВОЗ по мониторингу гриппа

1.3-3. Пандемия «азиатского гриппа» (H2N2) (1957-1958 гг.).

1.3-4. Пандемия «гонконгского гриппа» (H3N2) (1968-1970 гг.).

1.3-5. Крупная эпидемия «русского гриппа» (H1N1) (1977-1978 гг.).

1.3-6. Пандемия «свиного» гриппа A (H1N1) swl (2009 г.).

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Щелканов, Михаил Юрьевич

ВЫВОДЫ. 398

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Щелканов, Михаил Юрьевич, Москва

1. Список использованной литературы.406

2. Список использованных сокращений.4691. Благодарности.4841. ВВЕДЕНИЕ.1. Актуальность проблемы.

3. Цель исследования: изучение эволюции НРА1/Н5Ы1 в процессе популяционных взаимодействий вируса, диких и домашних животных на основе комплексного эколого-вирусологического мониторинга в экосистемах Северной Евразии.

4. Впервые удалось добиться регулярного оперативного в течение нескольких дней -получения молекулярно-вирусологических данных в ходе расшифровки эпизоотических вспышек HPAI / H5N1 в экосистемах Северной Евразии.

5. Впервые рекомендованы производственные штаммы HPAI/H5N1, один из которых был использован для разработки и крупномасштабного производства отечественной ветеринарной вакцины.

6. Практическая ценность работы.

7. Показано, что в период 2001-2005 гг. HPAI / Н5 отсутствовали на территории Северной Евразии, что является важным элементом доказательства интродукции этого вируса весной 2005 г.

8. Установлен этиологический агент HPAI/H5NI - для восьми крупных эпизоотических эпизодов на территории Северной Евразии, что позволило корректно спланировать систему противоэпизоотических мероприятий.

9. Показано, что HPAI/H5N1, получивший распространение в экосистемах Северной Евразии, содержит ряд молекулярных маркёров, повышающих тропизм к клеткам млекопитающих и эпидемический потенциал этого вируса.

10. Основные положения, выносимые па защиту:

11. В период 2001-2004 гг. накануне проникновения в Северную Евразию HPAI / H5N1 - на данной территории этот вирус обнаружен не был, что является одним из элементов доказательства проникновения HP AI / H5N1 в Западную Сибирь весной 2005 г.

12. Центром генетического разнообразия высоковирулентного вируса гриппа А птиц Цинхай-Сибирского генотипа (H5J 2.2) на территории западного сектора Северной Евразии является Кубано-Приазовская низменность.

13. Научные публикации но теме диссертации.

14. Глава I. Краткий обзор истории изучения гриппа.§ 1.1. Данные о гриппе до открытия этиологического агента.1.1-1 .Описание гриппа Гиппократом (1лжжратг|с;) (460-377 до н.э.) (рис.1) считается первым (412 г. до н.э.) научным описанием этого заболевания.

15. Дошедшие до нас сочинения Гиппократа объединены в Сборник,содержащий 72 сохранившиеся книги 96,97. Особый интерес вконтексте гриппа имеет книга «Эпидемии», хотя Гиппократу и не былиизвестны этиологические агенты инфекционных заболеваний.