Совершенствование методов выявления вируса гриппа птиц А/Н5N1 путем создания высокочувствительных диагностических систем

Левченко, Наталия Витальевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Совершенствование методов выявления вируса гриппа птиц А/Н5N1 путем создания высокочувствительных диагностических систем
ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Совершенствование методов выявления вируса гриппа птиц А/Н5N1 путем создания высокочувствительных диагностических систем"

ЛЕВЧЕНКО Наталия Витальевна

4848734

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА ГРИППА ПТИЦ A/H5N1 ПУТЕМ СОЗДАНИЯ ВЫСОКОЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ СИСТЕМ

03.02.02 - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

' ^ ИЮН 2011

Новосибирск - 2011

4848734

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении здравоохранения «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Научный руководитель: доктор биологических наук

Жарникова Ирина Викторовна

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Бочаров Евгений Федорович

доктор медицинских наук, профессор Базиков Игорь Александрович

Ведущая организация: Вирусологический центр 33 центрального

научно-исследовательского испытательного института министерства обороны РФ

Защита состоится « 24 » июня 2011 г. в 9-00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.020.01 при ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотреб-надзора по адресу: 630559, р.п. Кольцово, Новосибирского района, Новосибирской области, тел. (8-383) 336-74-28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.

Автореферат разослан « » \sl-tClJE.> 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

sMfuxut/-

Трошкова Г.П.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Приобретение способности вируса гриппа птиц (ВГП) вызывать заболевание человека, заканчивающееся в ряде случаев летальным исходом, привлекло внимание вирусологов и эпидемиологов к всестороннему изучению возбудителя инфекции, путей его распространения, разработки эффективных мер диагностики, профилактики и лечения данного заболевания (Бектемиров Т.А., 2005; Липатов с соавт., 2005; Гендон Ю.З., 2006; Львов Д.К., 2006; Онищенко Г.Г., 2006; Peizis J.S. et а!., 2007 и др.). В 2009 г. в 15 странах выявлено свыше 400 случаев тяжелых заболеваний человека с высокой летальностью, вызванных гриппом птиц H5N1, однако в нашей стране заболевание людей этой инфекцией не зарегистрировано (Крылов П.С. с соавт., 2009). По данным ВОЗ, на 21 апреля 2011 г. всего в мире зарегистрировано 552 лабораторно подтвержденных случаев заболевания людей гриппом птиц H5N), из которых 322 закончились летально. С 2005 г. на территории России в различных регионах на путях миграции перелетных птиц отмечались быстро распространяющиеся эпизоотии среди дикой и домашней птицы, вызванные высокопатогенным ВГП се-ротипа H5N1, что потребовало принятия эффективных противоэпидемических мер по защите от данного заболевания не только домашней птицы, но и людей (Онищенко Г.Г. с соавт., 2006).

В первую очередь, это относилось к разработке эффективных способов индикации данного вируса в объектах биотической и абиотической природы. Если во внутренних органах больной или погибшей от вируса гриппа птицы концентрация патогена позволяла не только изолировать отдельные препараты вируса, но и осуществлять его индикацию с использованием иммунохимических и геннодиагностических методов, то выявлять ВГП в объектах окружающей среды, включая воду открытых водоемов, являющуюся фактором передачи инфекции, до настоящего времени не представлялось возможным из-за его низкой концентрации в данных объектах. В связи с этим, разработка новых высокочувствительных и специфичных методов индикации возбудителя, сочетающих возможность осуществлять динамическое, селективное концентрирование ВГП из сильно загрязненных проб воды неограниченного объема, является весьма актуальной задачей, решение которой позволит совершенствовать вирусологический и эпидемиологический мониторинг за данной инфекцией.

Цель исследования - повышение эффективности методов индикации ВГП путем совершенствования суспензионного диагностикума и разработки маг-ноиммуносорбентов (МИС) для концентрирования патогена и последующего использования в иммунохимических и геннодиагностических реакциях.

Основные задачи исследования:

1. Усовершенствовать индикацию ВГП путем применения разработанного суспензионного диагностикума на основе латексной матрицы;

2. Создать МИС для избирательного концентрирования ВГП;

3. Разработать технические устройства, обеспечивающие концентрирование на МИС ВГП, присутствующего в водных объектах в низких концентрациях;

4. Обосновать перспективы получения и использования МИС для выявления ВГП птиц в количественном иммунофлуоресцентном анализе (КИФА);

5. Экспериментально обосновать возможность повышения выявляемое™

ВГП в иммуноферментном анализе (ИФА) после предварительного селективного концентрирования патогена из исследуемого материала на МИС;

6. Изучить возможность выявления ВГП, сконцентрированного на МИС, в полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР).

Научная новизна. Для специфической индикации ВГП научно обоснованы и разработаны новые диагностические препараты. Диагностикум латексный предназначен для осуществления скрининговых исследований объектов окружающей среды при концентрации патогена 50 нг/мл и выше.

Для концентрирования ВГП, присутствующего в воде в очень низких концентрациях, не позволяющих его обнаружить известными методами (реакция иммунофлуоресценции (РИФ), ИФА, ОТ-ПЦР, созданы МИС на основе алюмосиликата, магнитного порошка и полиглюкина, активированные перхлоратом натрия, применяемые при индикации ВГП с использованием иммунохимических (КИФА), (ИФА) и геннодиагностических (ОТ-ПЦР) методов. Указанные индикационные методы позволяют специфически выявлять 0,25 пг/мл и выше ВГП, присутствующего в воде, объем которой может достигать сотен литров.

Для обеспечения динамического, селективного концентрирования ВГП на МИС из воды открытых водоемов впервые разработана установка «Аквадиамаг».

Приоритетность выполненных исследований подтверждена патентом РФ на полезную модель № 64784 от 10.07.2007 г. «Установка для микробиологического мониторинга объектов водной среды», патентом РФ № 2339694 от 27.11.2008 г. «Диагностическая тест-система для выявления вируса гриппа птиц A/H5N1» и патентом РФ № 2395094 от 20.07.2009 г. «Способ получения раствора, используемого в качестве разводящей жидкости и среды высушивания эрит-роцитарных и латексных диагностикумов».

Теоретическая н практическая значимость работы. Основная теоретическая значимость работы заключается в определении научных аспектов и подходов к созданию индикационных систем для выявления ВГП, присутствующего в водных объектах окружающей среды в низких концентрациях, не позволяющих его обнаруживать традиционными индикационными методами.

Для осуществления скрининговых исследований, направленных на выявление ВГП создан специфический латексный диагностикум. При индикации вируса в методах КИФА, ИФА и ОТ-ПЦР использованы МИС, позволяющие избирательно концентрировать патоген из объектов окружающей среды с низкой концентрацией вируса.

Полученные результаты исследований подтверждены межлабораторными испытаниями в Федеральном государственном учреждении здравоохранения «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Роспо-требнадзора (СтавНИПЧИ) «макетов приборов «Аквадиамаг-1» и «Аквадиамаг-2», акт испытаний утвержден директором СтавНИПЧИ 12.05.2006 г.; «Тест-системы диагностической магноиммуносорбентной для выявления вируса гриппа птиц им-муноферментным анализом (ИФА) и количественным иммунофлуоресцентным анализом (КИФА)», акт испытаний утвержден директором СтавНИПЧИ 12.05.2006 г.; а также «Тест-системы диагностической магноиммуносорбентной для выявления вируса гриппа птиц иммуноферментным методом», акт испытаний утвержден директором ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН 03.07.2006 г.

По материалам проведенных исследований составлены Методические рекомендации «Применение магнитных иммуносорбентов для селективного концентрирования вируса гриппа птиц A/H5N1 с последующей постановкой имму-ноферментного анализа и полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией», утвержденные директором СтавНИПЧИ и директором ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН в ноябре 2008 г.

Результаты диссертационных исследований, представленные на конкурсе «Лучшая научно-исследовательская разработка» (Ставрополь-2007 г.) по теме «Технические устройства и диагностические тест-системы, обеспечивающие тысячекратное повышение эффективности обнаружения вируса гриппа птиц», заняли первое место и награждены дипломом.

На «Тест-систему иммуноферментную для выявления вируса гриппа птиц A/H5N1 (МИС - ИФА - Грипп птиц - СтавНИПЧИ)» оформлены: пусковой регламент № 01897080-13-09 на производство, технические условия -ТУ 9388-020-01897080-2009, инструкция по применению, утвержденные директором СтавНИПЧИ на основании решения ученого совета института от 21 мая 2010 г., протокол № 5.

Материалы диссертации используются на курсах первичной специализации и усовершенствования врачей по особо опасным инфекциям, в лекциях и практических занятиях по индикации и применению МИС в мониторинге за ВГП в СтавНИПЧИ.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Для эффективной индикации ВГП в реакции агглютинации латекса (РАЛ) теоретически и экспериментально обоснована конъюгация латексов с иммуноглобулинами против патогена, позволяющая получать активные, специфичные иммунобиологические препараты.

2. При исследовании сильно загрязненных проб неограниченного объема применение разработанных МИС и сконструированных технических средств для работы с ними упрощает, ускоряет процесс избирательного концентрирования ВГП, повышая выявляемость патогена.

3. Разработанные методы селективного концентрирования ВГП на МИС с последующей индикацией в иммунохимических (КИФА, ИФА) и геннодиагности-ческих (ОТ-ПЦР) реакциях позволяют увеличить чувствительность анализов и использовать их при вирусологическом мониторинге объектов окружающей среды.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на VII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского Саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников содружества независимых государств» (Оболенск, 3-5 октября 2006 г.); IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 26-27 апреля 2007 г.); Международной научно-практической конференции «Проблемы совершенствования межгосударственного взаимодействия в подготовке к пандемии гриппа» (Новосибирск, 9-10 октября 2008 г.); научно-практической конференции молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора «Биологическая безопасность в современном мире» (Оболенск,

21-22 апреля 2009 г.); Международной научно-практической конференции «Перспективы сотрудничества государств-членов ШОС в противодействии угрозе инфекционных болезней» (Новосибирск, 14-15 мая 2009 г.); X межгосударственной научно-практической конференции «Актуальные проблемы предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения государств-участников СНГ» (Ставрополь, 5-6 октября 2010 г.).

Публикации. Основное содержание диссертации, выполненной в рамках проекта «Технические устройства и диагностические системы, обеспечивающие тысячекратное повышение эффективности обнаружения возбудителя гриппа птиц в окружающей среде» (2007 г.), научно-исследовательских работ (НИР) по темам «Создание твердофазных магнитоуправляемых тест-систем, обеспечивающих эффективный мониторинг за возбудителями опасных бактериальных и вирусных заболеваний» при поддержке со стороны гранта Президента РФ ведущих научных школ НШ-2486.2008.7. и «Совершенствование экспрессных методов лабораторной диагностики гриппа птиц и детекции его возбудителя в объектах внешней среды» (2008-2010 гг., № Государственной регистрации 01.2008.021.34), отражено в 16 опубликованных научных работах, в том числе три из них - в периодических изданиях из перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК РФ, а также в 3 Патентах РФ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы и приложений. Работа изложена на 153 страницах машинописного текста, иллюстрирована 19 рисунками, 12 таблицами. Список использованной литературы содержит 208 источников, в том числе 76 зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследований

В работе использовали высокопатогенный вариант ВГП A (H5N1), выделенный от больной утки в 2005 г. в Новосибирской области во время эпизоотической вспышки среди домашних птиц, депонированный в Государственную коллекцию вирусов как Grebe/Novosibirsk/29/05 (H5N1) (Львов Д.К.с соавт., 2006).

Инактивированный ВГП, иммунные асцитические жидкости мышей к нему предоставлены ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН в рамках совместно выполненной НИР, за что приношу глубокую благодарность д.м.н., профессору Дерябину П.Г. и с.н.с., к.м.н. Исаевой Е.И., участвующих в их получении. Специфические иммуноглобулины класса G (Ig G) выделяли фракционированием каприловой кислотой по методу, описанному Steibuch G., Andran R. (1969). Конъюгацию иммуноглобулинов с флуоресцеинизоцианатом (ФИТЦ) (C2iHuN05S) фирмы «Sigma» проводили по X. Шторц (Stortz, 1987). Контроль конъюгатов на наличие непрореагировавшего флуорохрома осуществляли методом восходящей хроматографии на бумаге (Носков Ф.С., 1985). Иммуноперокси-дазные конъюгаты получали методом перйодатного окисления по Р.К. Nakane, A. Kawaoi (1974). Рабочий титр и специфическую активность конъюгатов определяли по методике М. Clark и A. Adams (1977) в «сэндвич» - варианте ИФА.

Геннодиакгностические исследования проводили в соответствии с действующими нормативными документами: методическими рекомендациями "Организация мониторинга заносов и распространения гриппа птиц в природных условиях на территории Российской Федерации" MP 01/15701-8-34 от 26.12.2008; Инструкцией по применению тест-системы для выявления РНК вируса гриппа А и идентификации субтипов Н5 и Н7 методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции. Так же использовали тест-систему «АмплиСенс ® Influenza virus H5N1-FRT» для выявления РНК вируса ipunna А и идентификации субтипа H5N1 методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции с гибри-дизационно-флуоресцентной детекцией.

Количественное определение белка проводили сравнением поглощения спектра белков при 280 и 260 нм на спектрофотометре СФ-46 (Практическая химия белка, 1989). В качестве матриц использовали алюмосиликат (ТУ 6-09-01-356-76), представляющий собой тонкодисперсный продукт, содержащий в своем составе двуокись кремния. В качестве магнитного порошка -окись железа (III) ГОСТ 4173-77. Модификаторами сорбентов являлись: декстран (полиглюкин) - полисахарид, с молекулярной массой 0,5x109, выпускаемый комбинатом медпрепаратов «Красноярск» и перхлорат натрия - ТУ 6-09-3582-74. Микроструктуру поверхности магнитных сорбентов (МС) исследовали по методу, описанному в работе Д. Фрайфелдера (1980). Удельную поверхность МС определяли по методу А.А. Клячко-Гурвича (1961), основанному на низкотемпературной адсорбции азота. Суммарный объем и радиус пор определяли по методу Н.В. Кельцева (1984). Подсчет диаметра магнитных частиц проводили на автоматическом счетчике частиц ТС 10ТМ («ВЮ-RAD», США). Лиофилизацию препаратов осуществляли в камере LZ-9c (Чехия). Специфичность полученных диагностических систем оценивали с использованием вакцины для профилактики гриппа (тривалентной инактивированной полимер-субъединичной) - «Гриппол плюс», представляющей собой протективные антигены (гемагглютинин и нейра-минидазу), выделенные из очищенных вирусов гриппа типов А и В, выращенных на куриных эмбрионах (предприятие-производитель ООО ФК «ПЕТРОВАКС»), и коммерческих вакцин против гепатитов А и В в разведениях 1:2, 1:10, 1:100. Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием компьютерной программы Microsoft Office Excel, 2007.

Совершенствование индикации вируса гриппа птиц путем разработки иммунодиагностических препаратов Получение латексиого диагностикума

Химические свойства латексных микроносителей относительно постоянны и поддаются более легкой и точной характеристике. Латексную основу - акролар К получали из института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН. Для получения качественного диагностикума необходимы иммунные сыворотки или асцитические жидкости с высоким титром и специфичностью. Для сенсибилизации матрицы использовали (IgG), выделенные из иммунной асцитической жидкости мышей, иммунизированных ВГП A/H5N1. Получение латексного диагностикума осуществляли по методу, изложенному в патенте РФ № 2012888 от 15.05.1994 г. с нашими модификациями. В

результате экспериментов установлено, что оптимальной концентрацией белка (IgG) для сенсибилизации латексного носителя является 100 мкг/мл. Белковый стабилизатор, используемый при производстве и постановке реакции, готовили путем добавления к 5 мл белка куриного яйца 10 мл 5 %-ого натрия фосфорнокислого трехзамещенного 12 водного (Na3P04xl2H20), последующего прогревания на кипящей водяной бане, доведения рН до 7,2. Раствор разводили 1:1000 и добавляли 0,001 % азид натрия. Затем его использовали в качестве разводящей жидкости и среды высушивания латексных диагностикумов. Для получения лио-фильно высушенного препарата осадок ресуспендировали в разработанном универсальном растворе, разливали в ампулы и лиофилизировали, что позволило защитить латексные диагностикумы от разрушения при замораживании и лиофи-лизации, транспортировать препараты в любых температурных режимах и продлить их срок годности без потери специфической активности (Патент РФ № 2395094 от 20.07.09 г.). Серологическая активность диагностикума сохранялась не менее двух лет (срок наблюдения). Всего было приготовлено семь серий латексных диагностикумов. В результате постановки реакции установлено, что их чувствительность составила 25-50 нг белка инактивированного антигена ВГП A/H5N1. При контроле специфичности диагностикума перекрестных реакций не выявлено. Дисперсия случайной выборки из результатов эксперимента по определению чувствительности латексного диагностикума (восемь результатов с чувствительностью 25 нг/мл, два - 50 нг/мл) составила 111,1111, среднее отклонение - 8, стандартное отклонение - 10,5409. На основе полученного препарата скомпонована тест-система, состоящая из латексного диагностикума, разводящей жидкости, положительного контроля и скарификатора дискового. Аналогичный по чувствительности и специфичности диагностикум для выявления антигена ВГП A/H5N1 приготовлен с использованием вместо латексных микрочастиц формалинизированных и обработанных вторичным алкилсульфатом натрия эритроцитов барана. При аналогичных условиях постановки чувствительность и специфичность реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) с эритроцитарным диа-гностикумом были идентичны реакции агглютинации латекса (РАЛ). Однако недостаточная чувствительность РАЛ и РНГА не позволяет их использовать для обнаружения ВГП в объектах окружающей среды. Поэтому описанные далее исследования посвящены изысканию способов повышения эффективности выявления ВГП за счет их селективного концентрирования на МИС.

Разработка метода селективного концентрирования вируса гриппа птиц из объектов окружающей среды с помощью магноиммуиосорбентов и устройств для работы с ними Создание и характеристика магноиммуиосорбентов

Для гриппа птиц ведущее эпидемиологическое значение имеет водный путь передачи инфекции, поэтому обследование открытых водоемов играет важную роль, так как в воде (особенно холодной) возбудитель сохраняется длительное время. Традиционными методами выявить ВГП в водных объектах очень трудно в связи с тем, что его концентрация в водоеме значительно ниже порога чувствительности известных методов диагностики. В связи с этим, для обеспечения селективного концентрирования ВГП из проб большого объема водной среды

были разработаны МИС.

В качестве основной матрицы для получения МИС применяли алюмосиликат, окись железа (Fe203) и полиглюкин, модифицированные перхлоратом натрия. Полученный сорбент высушивали при (100-110) °С в течение 30 мин, измельчали и методом рассева через сито выделяли фракции с размером частиц до 10 мкм. Структура МС представлена корпускулярной системой, которая состоит из частиц кремнезема, покрытых полимером - полиглюкином, связанных друг с другом в пространственном каркасе. В результате окислительных процессов на поверхности МС за счет действия перхлората натрия образуются альдегидные группы, взаимодействующие с аминогруппами белка. Данный препарат имел удельную поверхность - 66 м!г, объем пор - 1,24 см1/г и радиус пор - 38 нм. В полученных препаратах концентрация альдегидных групп составила 0,61 мг-экв/г, что обеспечивало возможность фиксации на поверхности гранул достаточного количества IgG. Иммобилизацию IgG против ВГП проводили в объеме 2 мл и концентрацией белка 2 мг/мл на 0,4 г МС. Смесь инкубировали, отмывали, удерживая в колбе МИС постоянным магнитом. С целью стабилизации МИС готовили его 10 %-ную взвесь в фосфатно-солевом буферном растворе, разливали в ампулы и лиофильно высушивали. Срок годности сенсибилизированной твердой фазы составлял 2 года (срок наблюдения). Полученные таким образом МИС использовали для проведения селективного концентрирования на его поверхности антигена ВГП и постановки КИФА, ИФА и ОТ-ПЦР с целью его выявления.

Разработка и использование установок для селективного концентрирования вируса гриппа птиц на магноиммуносорбентах

Главной проблемой при использовании существующих методов индикации возбудителей является большое количество ложноотрицательных и ложно-положительных результатов, обусловленных часто ничтожно малым количеством патогена в исследуемом материале и присутствием загрязнений различного характера, мешающих протеканию индикационных реакций (Нефедова В.В. с соавт., 2001 и др.). В стоячих водоемах пробу берут в ограниченном количестве и в ней не всегда будет достаточное количество возбудителя для последующего обнаружения. В связи с этим, нами разработаны технические устройства, обеспечивающие селективное концентрирование ВГП из воды или других объектов, кон-таминированных возбудителем. При этом исследуемые вирусы, присутствующие во всем объеме прокаченной жидкости, концентрируются на небольшом количестве МИС (до 20 мг), подвергающегося затем исследованию в КИФА, ИФА или ОТ-ПЦР на наличие патогена.

Техническое устройство, обеспечивающее концентрирование ВГП из воды объемом до 10 л, представляет собой бутыль или колбу с исследуемой жидкостью, которая самотеком по тонкой силиконовой трубке протекает в другую емкость, расположенную по уровню ниже. На определенном участке силиконовая трубка соединяется с тонкой стеклянной трубкой диаметром 1,5-2,5 мм, куда вносят 0,2 мл 10 %-ной взвеси МИС, удерживаемых в трубке постоянным магнитом. Скорость протекания жидкости через систему регулируется зажимом и достигает 5-20 мл/мин (рис. 1).

1 - колба с суспензией пробы;

2 - зажим;

3-постоянныймагнит;

4 - МИС против ВГП;

5 - соединительные трубки;

6 - колба для приема пробы.

Рис. 1. Концентрирование антигена ВГП на МИС

После протекания исследуемой жидкости постоянный магнит удаляют и МИС потоком жидкости извлекается из систем трубок в пробирку или флакон для дальнейшего анализа.

Для исследования стоячей воды открытых водоемов, достигающих несколько сот литров, сконструирована установка для микробиологического (вирусологического) мониторинга (рис. 2). На данную установку получен патент РФ на полезную модель № 64784 от 12.12.2007.

Рис. 2. «Аквадиамаг» для концентрирования патогенов из воды открытых водоемов с помощью МИС

Установка «Аквадиамаг» представляет собой плавающую платформу, на которой находится насос, прокачивающий через силиконовые трубки жидкость водоема через 3 последовательно расположенные съемные магнитные «ловушки» с МИС и дополнительную магнитную «ловушку» с МИС, расположенную в стеклянной трубке, закрепленной в замкнутом магнитном ноле. Регулировка водяного потока через «ловушки» осуществляется непосредственно на самом устройстве с помощью электронного стабилизатора оборотов насоса. Наличие аккумуляторов и насоса «Аквадиамаг» обеспечивают прокачивание жидкости из стоящих водоемов, где предполагается наличие различных патогенов в объеме до 1 ООО л за 1215 ч непрерывной работы. За этот период через четыре магнитные «ловушки» с МИС, на поверхности которых могут быть иммобилизованы IgG не только против ВГП, но и против других возбудителей, прокачиваются сотни литров воды, из

которой селективно концентрируются на МИС соответствующие патогены. После извлечения МИС из «ловушек» сконцентрированный ВГП может быть обнаружен иммунохимическими методами (КИФА, ИФА) или геннодиагностическим методом (ОТ-ПЦР).

Количественный иммунофлуоресценгный анализ с использованием

магноиммуносорбентов для обнаружения возбудителя гриппа птин в объектах окружающей среды

Иммунофлуоресцентный метод выявления различных возбудителей опасных инфекционных болезней находит широкое применение. Нами получены IgG флуоресцентные для обнаружения антигенов ВГП с рабочим разведением 1:16 и апробирован КИФА с использованием МИС, определены параметры его постановки, чувствительность и специфичность. Прибором, регистрирующим уровень свечения магнитных гранул, служил люминесцентный микроскоп ЛЮМАМ Р-8, оборудованный фотометрической насадкой ФМЭЛ-14. К насадке подсоединяли источник тока УБПВ-1 и вольтметр В7-76 (цифровой универсальный). Диаметр зонда фотометрической насадки, с помощью которого выявляли уровень свечения МИС, составлял 0,5 мм. После обнаружения в поле зрения гранул сорбента, закрывали нолевую диафрагму и снимали цифровые показания уровня свечения 10-15 гранул на вольтметре. Интенсивность флуоресценции МИС (М) представляла собой разницу между среднеарифметическими показателями уровня свечения гранул и фона: (М) = М гранул — М фона. За положительные принимались результаты, при которых уровень флуоресценции опытных гранул в два и более раз превышал аналогичный показатель контрольных (Ефременко В.И., 1999; Жарникова И.В., 2004). В результате исследований скомпонована гест-система диагностическая, состоящая из 10 %-ной взвеси МИС против ВГП; IgG флуоресцентных против ВГП; инактивированного ВГП A/H5N1 (положительный контроль); фосфатно-солевого буфера, предметных стекол, магнита постоянного и скарификатора. Общая схема постановки КИФА представлена на рисунке 3.

МИС

Инкубация 30 мин при 37 °С, отмывка

Инкубация 30 мин при 37 С, отмывка

Количественный учет КИФА

Рис. 3. Схема постановки КИФА с использованием в качестве твердой фазы МИС

Для определения возможности выявления антигенов ВГП в воде объемом 5000 мл с низкой концентрацией патогена (2 иг/мл) использовали описанное техническое устройство. При этом, в стеклянную трубку с внутренним диаметром 1,5 мм вносили 0,1 мл 10 %-ной взвеси МИС. Проведенные исследования показа-

1 1

ли возможность инструментальной диагностики антигенов ВГП с использованием МИС в КИФА, включая пробы окружающей среды (вода) с низкой концентрацией патогена. Результаты КИФА с использованием МИС для обнаружения ВГП A/H5N1, а также данные по чувствительности и специфичности метода приведены в таблице 1.

Таблица 1

Результаты изучения чувствительности и специфичности МИС _при выявлении антигенов ВГП A/H5N1 в КИФА_

Исследуемый Антигенный материал Концентрация ВГП в пробе воды объемом 500D мл или разведение вакцин от исходного Отношение уровня флуоресценции опытных гранул МИС (Ml) к контрольным (М2) в относительных показаниях вольтметра (М1/М2)

1 серия МИС 2 серия МИС 3 серия МИС

Инактивированный ВГП птиц A/H5N1 1 пг/мл 2,0 1,8 1,9

2 пг/мл 2,2 2,0 2,1

10 пг/мл 3,2 3,1 3,3

20 пг/мл 4,4 4,2 4,3

«Гриппол плюс» 1/2 1,1 1,0 1,0

1/10 1,0 1,0 1,2

Антиген вируса гепатита А 1/2 0,9 0,9 0,9

1/10 1,1 1,0 0,9

Антиген вируса гепатита В 1/2 1,1 0,9 1,0

1/10 1,0 1,0 1,0

Отр. контроль 0 1,1 1,0 0,9

Проведенные исследования показали возможность выявления антигенов ВГП в объеме 5000 мл воды с концентрацией патогена 2 пг/мл и выше.

Дисперсия случайной выборки из результатов эксперимента по определению чувствительности МИС + КИФА (девять результатов с чувствительностью 2 пг/мл и один - 1 пг/мл в 5000 мл воды) составила 2,5; среднее отклонение - 0,9; стандартное отклонение - 1,5811.

Разработка иммуноферментиого метода индикации вируса гриппа птиц с использованием магноиммуносорбентов

Для обнаружения возбудителей различных инфекционных болезней бактериальной и вирусной природы широко применяют методы с использованием специфических антител, меченных ферментом. Чувствительность и специфичность ИФА обусловлена не только степенью чистоты и активности используемых ингредиентов, но и свойствами твердой фазы, которая должна сохранять имму-нохимические свойства и стабильность фиксированных веществ, обладать минимальной способностью неспецифически связывать компоненты анализируемой системы и быть удобной при разделении фаз (Дмитриев Г.А. с соавт., 1997). Процесс механической сорбции обратим и, следовательно, сенсибилизированные планшеты, полученные сорбционным путем, не подлежат длительному хранению (Калинина О.А. с соавт., 1997). В связи с этим, ведется поиск новых, стабильных

при хранении твердофазных носителей для постановки ИФА. Одна из таких задач решалась в рамках данной диссертационной работы.

В результате проведенных исследований были получены 3 серии иммуно-пероксидазных конъюгатов с рабочим титром 1:200. Чувствительность ИФА (традиционного в планшетах) в отношении антигенов ВГП A/H5N1 составила 100 нг/мл инактивированного антигенного материала, при отсутствии перекрестных реакций с гетерологичными препаратами.

С целью проверки возможности использования метода селективного концентрирования антигенов ВГП A/H5N1, содержащегося в пробах воды объемом 5000 мл с концентрацией патогена 1 пг/мл, 2 пг/мл и 10 пг/мл, с помощью МИС были проведены лабораторные испытания разработанного нами сочетанного метода МИС + ИФА (56 испытаний). Техническое устройство и порядок его использования для концентрирования антигенов ВГП из воды описаны ранее. МИС после контакта с пробой тщательно промывали пять-шесть раз забуференным физиологическим раствором рН 7,2 и применяли при проведении ИФА. При этом в качестве положительного контроля использовали нативный антиген ВГП, который наносили непосредственно на МИС во флаконе. Отрицательным контролем служил МИС, не контактировавший с антигеном. Пробы с МИС переносили в пенициллиновые флаконы, куда вносили 200 мкл иммунопероксидазного конъ-югата для выявления антигенов ВГП A/H5N1 в рабочем разведении, инкубировали, промывали не менее шести раз, удерживая сорбент на дне флакона с помощью постоянного магнита. После внесения во флаконы по 200 мкл хромогенного субстрата (о-фенилендиамина) через 1-2 мин, когда надосадочная жидкость начинала слегка желтеть в отрицательном контроле, жидкую фазу переносили в микропланшеты и останавливали реакцию, внося 50 мкл стоп-реагента. Учет результатов осуществляли с помощью регистрирующего устройства Мультискан при длине волны 492 нм. Положительными считали пробы, если их оптическая плотность в два и более раз превышала таковую в отрицательном контроле. При этом чувствительность ИФА с использованием МИС, осуществляющих концентрирование антигенов ВГП из воды объмом 5000 мл, по сравнению с использованием данного метода при применении полистироловых планшет увеличилась в тысячи раз. (табл. 2).

Таблица 2.

Результаты изучения специфической активности МИС

при выявлении антигенов ВГП A/H5N1 в ИФА_

Исследуемый антигенный материал Концентрация антигенов ВГП в пробе воды объемом 5000 мл Отношение оптической плотности опытных гранул МИС к оптической плотности контрольных гранул (без антигена)

1 серия МИС 2 серия МИС 3 серия МИС

Инактивированный ВГП A/H5N1 1 пг/мл 2,1 1,9 2,0

2 пг/мл 2,6 2,4 2,3

10 пг/мл 4,2 4,1 4,3

20 пг/мл 5,5 5,2 5,4

Использование селективного концентрирования антигенов ВГП на МИС дало возможность обнаружить ВГГ1 в 54 пробах воды, а то время как в традиционном ИФА без применения МИС получены отрицательные результаты, связанные с низкой концентрацией патогена. При сочетанием использовании МИС + ИФА отпадала необходимость постановки реакции в полистироловых планшетах, сокращалось время проведения анализа до 40-60 мин, а объем исследуемой пробы увеличивался в тысячи раз.

Дисперсия случайной выборки из результатов эксперимента по определению чувствительности МИС + ИФА (восемь результатов с чувствительностью 2 пг/мл, два - L пг/мл в 5000 мл воды) составила 4,4444; среднее отклонение — 1,6; стандартное отклонение -2,1082.

На основе полученных данных были созданы тест-системы для индикации ВГП A/H5N1 (рис. 4). В состав набора входят следующие компоненты: 10 %-ная взвесь МИС против ВГП - один флакон (4,0 мл); конъюгат пероксидазный имму-ноглобулиновый против вируса гриппа птиц- одна ампула (0,5 мл); инакгивиро-ванный ВГП A/H5N1, сухой - одна ампула (0,5 мл) и все необходимые ишреди-енты для постановке ИФА.

Рис. 4. Тест-система ИФА+МИС для индикации ВГП A/H5N1

Эффективность разработанной тест-системы подтверждена в совместных лабораторных испытаниях, проведенных на базах СтавНИПЧИ (акт испытаний от 12.05.2006 г.) и ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН (акт испытаний от 03.07.2006 г.).

Использование магноиммуиосорбентов для селективного концентрирования вируса гриппа нгиц с последующим выявлением его методом полимеразной ценной реакции

Для обнаружения ВГП в объектах окружающей среды и в биологическом материале в настоящее время широко применяется метод ОТ-ПЦР. При постановке полимеразной цепной реакции (ПЦР), учитывая, что генетический материал ВГП представлен молекулами РНК, после ее выделения проводят реакцию обратной транскрипции с применением фермента ревертазы, в результате чего формируется кДНК, используемая в дальнейших этапах анализа. Наличие эффективных способов подготовки исследуемых проб является одним из важнейших условий успешного проведения ПЦР-анализа. При исследовании проб из объектов окружающей среды возникает необходимость в использовании особых методических приемов, позволяющих специфично концентрировать возбудителей

определенной инфекции и уменьшить неблагоприятное влияние на компоненты реакции всевозможных примесей, значительно снижающих чувствительность ПЦР. С целью проверки возможности использования метода селективного концентрирования ВГП, содержащегося в пробах воды, с помощью МИС в лабораторных условиях были проведены исследования, когда ВГГ1 присутствовал в 5000 мл воды в концентрациях 1 пг/мл, 2 пг/мл и 10 пг/мл. После концентрирования вируса на МИС с помощью описанного устройства их извлекали, промывали и определяли наличие патогена методом ОТ-ПЦР.

В пробирки вносили 450 мкл лизирующего раствора добавляли 50 мкл пробы (МИС с фиксированным ВГП), инкубировали 5 мин, перемешивали на вортексе. После этого пробирки с МИС подносили к постоянному магниту и переносили супернатант в другие чистые пробирки. Далее полученную суспензию, а также пробы воды, не контактировавшие с МИС, исследовали методом ОТ-ПЦР, используя тест-систему «АмплиСенс Influenza virus А-Н5/Н7» с электрофо-ретической детекцией, а также набор реагентов для учета результатов в режиме «реального времени» «АмплиСенс Influenza virus A H5N1-FL». Все манипуляции проводили, следуя инструкциям по применению тест-систем. Предварительно было установлено, что используемый в работе инактивированный р-нропиолактоном ВГП, полностью уграчивая инфекционную активность, обнаруживался как в серологических реакциях, так и методом ОТ-ПЦР. В качестве положительного контроля использовали 10 нг ВГП, наносимого непосредственно на МИС во флаконе. Контроль специфичности проводили с указанными ранее гете-рологичными препаратами. Отрицательными контролями служили пробы МИС, не контактировавшие с ВГП.

Исследование проб с применением тест-системы «АмплиСенс Influenza virus А-Н5/Н7» проводили в два этапа. На первом этане выявляли РНК вируса ipunna А. Образцы после проведения реакции обратной транскрипции, в которых на электрофореграмме имелись специфические полосы 365 п.н., отбирались для проведения второго этапа - идентификации субтипа Н5. При проведении анализа с применением набора реагентов «АмплиСенс Influenza virus A H5N1-FL» на первом этапе также выявляли РНК вируса гриппа А. На втором этапе для идентификации субтипа H5N1 были использованы образцы кДНК положительных проб с предыдущего этапа. Схема проведения анализов ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР-РВ с соче-танным применением МИС представлена на рисунке 5. В реакциях ОТ-ПЦР, так и ОТ-ПЦР-РВ обнаруживался ВГП с концентрацией патогена в пробе от 2 пг/мл и выше в тех пробах, в которых вирус концентрировался на МИС и в пробах положительного контроля. Пробы воды, не контактировавшие с МИС, пробы, содержащие гетерологичные препараты, а также пробы с отрицательным контролем дали отрицательный результат. Дисперсия случайной выборки из результатов эксперимента но определению чувствительности МИС + ОТ-ПЦР (восемь результатов с чувствительностью 2 пг/мл, два - 1 пг/мл на 5000 мл воды) составила 4,4444; среднее отклонение - 1,6; стандартное отклонение - 2,1082. Дисперсия случайной выборки из результатов эксперимента по определению чувствительности МИС + ОТ-ПЦР-РВ (девять результатов с чувствительностью 2 пг/мл и один - 1 пг/мл в 5000 мл воды) составила 2,5; среднее отклонение - 0,9; стандартное отклонение -1,5811.

Подготовка материала (инактивирование)

Контакт с МИС

Отмывка от загрязнений (ингибиторов ПЦР)

Выделение РНК

Постановка реакции обратной транскрипции (получение кДНК)

Амплификация кДНК (выявление РНК вируса гриппа А)

Электрофорез, учет результатов (выявление РНК) и отбор образцов, содержащих РНК вируса гриппа А

Амплификация кДНК (идентификация субтипа Н5 вируса гриппа А)

Электрофорез (идентификация субтипа Н5 вируса гриппа А) и учет результатов

Рис. 5. Схема проведения МИС+ОТ-ПЦР для выявления вируса гриппа А и идентификации субтипов Н5 (А) и МИС+ОТ-ПЦР-РВ для выявления РНК вируса гриппа А и идентификации субтипа H5N1 (В)

В результате, наличие вируса гриппа A/H5N1 выявлено как при применении тест-системы с электрофоретической детекцией результатов, так и набора

С момента выявления в России эпизоотий гриппа птиц A/H5N1 в Ставропольском крае такая патология не регистрировалась. В связи с этим, оценена возможность использования разработанной установки «Аквадиамаг» для обнаружения патогена в стоячем водоеме только в модельных опытах. С этой целью «Аквадиамаг» помещали в емкость с 200 л озерной воды, предварительно конта-минированной инактивированным ВГП с конечной концентрацией патогена 0,25 пг/мл. На установку «Аквадиамаг» помещали две магнитные ловушки с МИС против ВГП. Через 18 ч после прокачивания через МИС нескольких сотен литров воды сорбенты извлекали из ловушек, промывали и исследовали в КИФА, ИФА и ОТ-ПЦР. Отрицательным контролем служили МИС не контактировавшие с патогеном. Также исследовали пробу воды без селективного концентрирования на

Учет результатов (выявление РНК)

Амплификация кДНК (идентификация субтипа H5N1)

Учет результатов (идентификация субтипа H5N1)

МИС. В результате наличие ВГП A/H5N1 выявлено только в двух пробах, в которых возбудитель концентрировался на МИС всеми тремя методами при отрицательных контролях. Таким образом, была установлена возможность специфического выявления ВГП A/H5N1 в иммунохимических (КИФА, ИФА) и геннодиа-гностических (ОТ-ПЦР) методах с использованием МИС в пробах воды большого объема даже в том случае, если концентрация патогена в воде не позволяет его обнаруживать известными методами.

Сравнительная характеристика традиционных и сочетанных методов с использованием МИС, применяемых при индикации ВГП в модельных опытах в воде объемом 200 литров, контаминированной патогеном с концентрацией 0,25 пг/мл, представлена в таблице 3.

Таблица 3

Сравнительная характеристика методов индикации ВГП в модельных опытах

Анализы Традиционные анализы Анализы с МИС (сочетанные)

Время постановки, ч Срок годности сенсибил. твердой фазы Результаты исследования Время постановки, ч Срок годности сенсибил. твердой фазы Результаты исследования

ИФА* 21 1-6 мес. отрицат. 0,5-1 2 года (срок наблюдения) положит.

иммунофлу-оресцентный анализ и КИФА 2 отрицат. 0,5 -1 2 года (срок наблюдения) положит.

ОТ-ПЦР (с электрофоре- тической детекцией) 6 отрицат. 6 2 года (срок наблюдения) положит.

Примечание: * - постановка ИФА с учетом сенсибилизации планшет

Выводы

1. Для осуществления скрининговых исследований при выявлении вируса гриппа птиц разработан специфический диагностикум латексный с чувствительностью 25-50 нг/мл. В качестве разводящей жидкости при постановке реакции агглютинации латекса и среды высушивания диагностикума предложен универсальный раствор, стабилизирующий диагностикум и увеличивающий срок его годности до двух лет.

2. Для селективного концентрирования вируса гриппа птиц, присутствующего в объектах окружающей среды (вода) в низких концентрациях, созданы и апробированы в индикационных реакциях аффинные гранулированные магнитные сорбенты на основе алюмосиликата, окиси железа и полиглюкина, активированные перхлоратом натрия, обладающие способностью ковалентно фиксировать на своей поверхности иммуноглобулины против вируса гриппа птиц.

3.Усовершенствована специфическая индикация вируса гриппа птиц в водных объектах с низкой концентрацией патогена (2 пг/мл) и выше путем его селективной концентрации на магнитных иммуносорбентах из 5 литров жидкости с последующим их использованием в ИФА, КИФА и ПЦР.

4.Динамическое, селективное концентрирование на магнитных иммуносорбентах вируса гриппа птиц с использованием разработанной установки «Аквадиамаг» из воды открытых водоемов объемом несколько сот литров, где присутствует патоген в низких концентрациях (0,25 пг/мл), не позволяющих его обнаружение известными индикационными методам, дает возможность стабильно выявлять патоген в иммунохимических и геннодиагностических реакциях.

5.Для индикации вируса гриппа птиц впервые разработаны методические приемы по сочетанному применению магнитных иммуносорбентов с адсорбированным патогеном при постановке количественного иммунофлуоресцентного, иммуноферментного анализов и полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией, обеспечивающие высокую чувствительность и специфичность указанных методов.

Практические рекомендации

1. При проведении скрининговых исследований при выявлении ВГП в объектах окружающей среды при концентрации патогена свыше 50 нг/мл проводить РАЛ, характеризующуюся простотой постановки, хорошей воспроизводимостью и позволяющей осуществлять предварительный учет реакции через 1,5-2 ч.

2. Для селективного концентрирования ВГП из объектов окружающей среды (воды) использовать МИС, получаемый из алюмосиликата, магнитного порошка, полиглюкина, акгивируемый натрием перхлората с последующей кова-лентной иммобилизацией на нем иммуноглобулинов против данного вируса.

3. Динамическое концентрирование ВГП осуществлять на МИС, фиксированных магнитными «ловушками», при пропускании через них воды объемом, достигающим несколько сот литров, где предполагается наличие патогена в концентрациях, не позволяющих его выявление всеми известными методами индикации.

4. Для исследования стоячей воды открытых водоемов, являющейся основным фактором передачи ВГП здоровым особям водоплавающих, использовать установку «Аквадиамаг», обеспечивающую концентрирование вируса на МИС из большого объема жидкости.

5. Индикацию ВГП осуществлять иммунохимическими (КИФА, ИФА), геннодиагностическими (ОТ-ПЦР) методами, используя МИС в качестве твердой фазы для концентрирования патогена.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Ефременко, В.И. О значении птиц в заносе и циркуляции патогенных для человека вирусов в природных и антропогенных биоценозах Юга России / В.И. Ефременко, Г.М. Грижебовскнй, А.П. Бейер, И.В. Чумакова, О.В. Малецкая, М.П. Григорьев, Н.Ф. Василенко, И.В.Жарникова, АД. Антоненко, Т.Н. Орлова, Е.И. Исаева, А.Г. Ботиков, Н.В. Ефременко, М.Ф. Мамедли, Е.Е. Афанасьева, Л.Н. Марчукова, И.Э. Ляпин, Э.Ш. Мамедли, А.А. Картоев, П.Г. Дерябин, Д.К. Львов // Деп. В ВИНИТИ 26.07.06, № 1008. - В 2006. -15 с.

2. Ефременко, В.И. Применение магнитных сорбентов для экспресс-

диагностики гриппа птиц / В.И. Ефременко, Д.К. Львов, П.Г. Дерябин, Н.Ф. Василенко, И.В.Жарникова, Н.В. Ефременко, А.Д. Антоненко, Т.Н. Орлова, Е.И. Исаева, А.Г. Ботиков // Материалы VII Межгосуд. научно-практической конференции государств-участников СНГ (3-5 октября 2006, Оболенск, Московская область, Россия) «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского Саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников содружества независимых государств». Оболенск, 2006. - С. 201- 202.

3. Левченко, Н.В. Разработка магноиммуносорбентных тест-систем и установок селективного концентрирования для выявления вируса гриппа птиц / Н.В. Левченко, В.И. Ефременко, Д.К. Львов, И.В. Жарникова, П.Г. Дерябин, Н.Ф. Василенко, Е.И. Исаева, А.В. Ботиков // Материалы IX съезда Всероссийской науч.-практич. общества Эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. (26-27 апреля 2007 г., г. Москва, Санэпидмедиа). - Т. 1. - С. 248- 249.

4. Ефременко, В.И. Установка для микробиологического мониторинга объектов водной среды / В.И. Ефременко, А.Л. Столяров, Э.М. Игуменов, A.M. Игуменов, Е.Н. Афанасьев, А.В. Таран, И.В. Жарникова, Н.В. Левченко, С.А. Курчева // Патент РФ на полезную модель № 64784. Заявка № 2006144331. Зарегистрирован в Гос. реестре изобретений РФ 10.07.2007 г. Бюл. № 19.

5. Ефременко, В.И. Диагностическая тест-система для выявления вируса гриппа птиц A/H5N1 / В.И. Ефременко, Д.К. Львов, И.В.Жарникова, Н.Ф. Василенко, П.Г. Дерябин, Н.В. Левченко, А.Д. Антоненко, Т.Н. Орлова, Е.Д. Исаева, А.Г. Ботиков, А.В. Таран, Т.В. Жарникова // Патент РФ № 2339694. Заявка № 2006140334 от 15.11.2006. Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений РФ 27 ноября 2008 г. Бюл. № 33.

6. Ефременко, В.И. Экспериментальные данные по выявлению вируса гриппа птиц с помощью магнитных иммуносорбентов / В.И. Ефременко, Д.К. Львов, П.Г. Дерябин, Н.В. Левченко, И.В. Жарникова, Н.Ф. Василенко, Е.И. Исаева, Т.В. Жарникова, Т.Н. Орлова, А.Г. Ботиков // Вопросы вирусологии. - № 3. - 2008. - C.4J- 45.

7. Ефременко, В.И. Повышение эффективности выявления возбудителя гриппа птиц в методах экспресс-анализа за счет его селективного концентрирования на специфических иммуносорбентах / В.И. Ефременко, Д.К. Львов, П.Г. Дерябин, Н.В. Левченко, Н.Ф. Василенко, И.В. Жарникова, Е.И. Исаева, А.Г. Ботиков // Междунар. науч.-практич. конф. «Проблемы совершенствования межгосударственного взаимодействия в подготовке к пандемии гриппа». - Новосибирск, 9-10 октября 2008. - С. 118-120.

8. Жарникова, И.В. Разработка и применение иммобилизованных систем для экспресс - диагностики различных заболеваний / И.В. Жарникова, И.С. Тю-менцева, Е.Н. Афанасьев, В.И. Ефременко, Е.В. Жданова, Т.В. Жарникова, Е.Е. Афанасьева, Т.Н. Орлова, Д.В. Ефременко, Н.Е. Афанасьев, М.Л. Лаврешин, Н.В. Левченко, А.А. Семирчева, С.А. Курчева, A.M. Бабий // Вестник Российской военно-медицинской академии. - № 2 (22). - Приложение. - Часть 1. - 2008. - С. 180-181.

9. Ефременко, В.И. Магнитоуправляемые диагностические тест-системы в мониторинге возбудителей опасных бактериальных и вирусных инфекций /

В.И. Ефременко, Н.Ф. Василенко, И.В. Жарникова, Н.В. Левченко, Т.В. Жарни-кова, Т.Н. Орлова, А.С. Кочарян // Междунар. научн.-практич. конф. «Перспективы сотрудничества государств-членов ШОС в противодействии угрозе инфекционных болезней». - Новосибирск, 14-15 мая 2009. - С. 92-95.

10. Левченко, Н.В. Разработка специфических магнитоуправляемых сорбентов и технических средств для селективного концентрирования вируса гриппа птиц с последующей постановкой иммуноферментного анализа и полимеразной цепной реакции / Н.В. Левченко // Научно - практическая конференция молодых ученых и специалистов «Биологическая безопасность в современном мире». -Оболенск, 2009. - С. 132-133.

11. Горобец, Е.А. Изучение диагностической ценности тест-системы магноиммуносорбентной для выявления вируса гриппа птиц / Е.А. Горобец, Н.Ф. Василенко, Л.И. Заревина, И.В. Жарникова, Н.В. Левченко, О.И. Коготкова, П.Б. Новаков // X межгосударственная научно-практическая конференция «Актуальные проблемы предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения государств-участников СНГ». - Ставрополь, 5-6 октября 2010. - С.176.

12. Левченко, Н.В. Выявление вируса гриппа птиц с помощью диагно-стикума полиакролеинового (латексного) иммуноглобулинового / Н.В. Левченко // X межгосударственная научно-практическая конференция «Актуальные проблемы предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения государств-участников СНГ». - Ставрополь, 5-6 октября 2010. - С. 204.

13. Левченко, Н.В. Использование магнитных иммуносорбентов для обнаружения вируса гриппа методом флуоресцирующих антител / Н.В. Левченко, И.В. Жарникова, Н.Ф. Василенко // X межгосударственная научно-практическая конференция «Актуальные проблемы предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения государств-участников СНГ». - Ставрополь, 5-6 октября 2010. - С. 205.

14. Жарникова, И.В. Способ получения раствора, используемого в качестве разводящей жидкости и среды высушивания эритроцитарных и латексных диагностикумов / И.В. Жарникова, И.С. Тюменцева, Е.Н. Афанасьев, А.А. Зайцев, Т.В. Жарникова, Н.В. Левченко, А.С. Кочарян // Патент на изобретение № 2395094 G 01 N 33/531. Заявка № 2009118320; Заявлено 14.05.09 г.; Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений РФ 20.07.10 г. Бюл. № 20.

15. Левченко, Н.В. Экспресс-диагностика вируса гриппа птиц в объектах окружающей среды, содержащих патоген в низких концентрациях / Н.В. Левченко, В.И. Ефременко // Медицинский вестник Северного Кавказа. -№1 (21).-2011.-С. 46-49.

16. Левченко, Н.В. Биотехнология получения и характеристика диа-гностикума полиакролеинового (латексного) для выявления вируса гриппа птиц в реакции суспензионной агглютинации / Н.В. Левченко // Медицинский вестник Северного Кавказа. - № 1 (21). - 2011. - С. 64-65.

ЛЕВЧЕНКО Наталия Витальевна

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Сдано в набор 05.05.11. Подписано в печать 04.05.11. Формат 60x84 ]/,6 Бумага типогр. № 2. Печать офсетная. Гарнитура офсетная. Усл. печ. 1,0. Уч.-изд. л. 1,2. Заказ 2004. Тираж 100 экз.

ГНУ СНИЖК цех оперативной полиграфии 355017, г. Ставрополь, пер. Зоотехнический, 15.

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Левченко, Наталия Витальевна

Перечень сокращений, условных обозначений, символов, единиц и терминов

Введение

Глава 1. Анализ эпидемиологической обстановки по гриппу птиц и современного состояния индикации его возбудителя (обзор литературы)

1.1. Эпидемиологическая обстановка по гриппу птиц

1.2. Иммунохимические и геннодиагностические системы для индикации вируса гриппа птиц в объектах окружающей среды и биологическом материале

1.3. Использование иммобилизованных носителей с целью совершенствования диагностических систем для выявления возбудителей инфекционных болезней ^ Собственные исследования

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Получение антигена вируса гриппа птиц и антивирусных сывороток

2.2. Иммунофлуоресцентные и иммуноферментные конъюгаты, применяемые при выявлении вируса гриппа птиц

2.3. Постановка полимеразной цепной реакции

2.4. Физико-химические методы анализа

2.5. Матрица и модификаторы магноиммуносорбентов

2.6. Постановка реакции агглютинации латекса

2.7. Используемые препараты для контроля специфичности

2.8. Лиофилизация биологического материала

2.9. Статистическая обработка материалов

Глава 3. Совершенствование индикации вируса гриппа птиц путем разработки иммунодиагностических препаратов

3.1. Получение латексного диагностикума

3.2. Приготовление иммунофлуоресцентных конъюгатов, используемых в количественном иммунофлуоресцентном анализе при выявлении вируса гриппа птиц А/Н5№ ^

3.3. Получение иммунопероксидазных конъюгатов, применяемых для иммуноферментного метода обнаружения вируса гриппа птиц А/Н5Ш, сконцентрированного на магнитных им-муносорбентах

Глава 4. Разработка метода селективного концентрирования вируса гриппа птиц из объектов окружающей среды с помощью магнитных иммуносорбентов и устройств для работы с ними

4.1. Создание и характеристика магнитных иммуносорбентов

4.2. Разработка и использование установок для селективного концентрирования вируса гриппа птиц на магноиммуносорбен

Глава 5. Твердофазные системы для индикации вируса гриппа птиц А/Н5№

5.1. Количественный иммунофлуоресцентный анализ с использованием магнитных иммуносорбентов для обнаружения вируса гриппа птиц в объектах окружающей среды ^

5.2. Постановка иммуноферментного метода индикации вируса гриппа птиц с использованием в качестве твердой фазы магнитных иммуносорбентов

5.3. Использование магнитных иммуносорбентов для селективного концентрирования вируса гриппа птиц с последующим выявлением его методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией

Введение Диссертация по биологии, на тему "Совершенствование методов выявления вируса гриппа птиц А/Н5N1 путем создания высокочувствительных диагностических систем"

Приобретение способности вируса гриппа птиц (ВГП) вызывать заболевание человека, заканчивающиеся в ряде случаев летальным исходом, привлекло внимание вирусологов и эпидемиологов к всестороннему изучению возбудителя инфекции, путей его распространения, разработки эффективных мер диагностики, профилактики и лечения данного заболевания (Бектемиров Т.А., 2005; Липатов с соавт., 2005; Гендон Ю.З., 2006; Львов Д.К., 2006; Онищенко Г.Г., 2006; 2007; Ре1г18 1.8. & а1., 2007 и др.). В 2009 г. в 15 странах выявлено свыше 400 случаев тяжелых заболеваний человека с высокой летальностью, вызванных гриппом птиц Н5№, однако в нашей стране заболевание людей этой инфекцией не зарегистрировано (Крылов П.С. с соавт., 2009). По данным ВОЗ, на 21 апреля 2011 г. всего в мире зарегистрировано 552 лабораторно подтвержденных случаев заболевания людей гриппом птиц Н5Ш, из которых 322 закончились летально. С 2005 г. на территории России в различных регионах на путях миграции перелетных птиц отмечались быстро распространяющиеся эпизоотии среди дикой и домашней птицы, вызванные вирусом высокопатогенного гриппа птиц се-ротипа Н5Ш, что потребовало принятия эффективных противоэпидемических мер по защите от данного заболевания не только домашней птицы, но и людей (Онищенко Г.Г. с соавт., 2006).

В первую очередь, это относилось к разработке эффективных способов индикации данного вируса в объектах биотической и абиотической природы. Если во внутренних органах больной или погибшей от вируса гриппа птицы концентрация патогена позволяла не только изолировать отдельные штаммы вируса, но и осуществлять его индикацию с использованием иммунохимиче-ских и геннодиагностических методов, то выявлять вирус гриппа птиц в объектах окружающей среды, включая воду открытых водоемов, являющуюся фактором передачи инфекции, до настоящего времени не представлялось возможным из-за его низкой концентрации в данных объектах. В связи с этим, разработка новых высокочувствительных и специфичных методов индикации возбудителя, сочетающих возможность осуществлять динамическое, селективное концентрирование ВГП из сильно загрязненных проб воды неограниченного объема, является весьма актуальной задачей, решение которой позволит совершенствовать вирусологический и эпидемиологический мониторинг за данной инфекцией.

Цель исследования — повышение эффективности методов индикации ВГП путем совершенствования суспензионного диагностикума и разработки магноимму но сорбентов (МИС) для концентрирования патогена и последующего использования в иммунохимических и геннодиагностических реакциях.

Основные задачи исследования:

2. Создать МИС для избирательного концентрирования ВГП;

5. Экспериментально обосновать возможность повышения выявляемо-сти ВГП в иммуноферментном анализе (ИФА) после предварительного селективного концентрирования патогена из исследуемого материала на МИС;

Для обеспечения динамического, селективного концентрирования ВГП на МИС из воды открытых водоемов впервые разработана установка «Аква-диамаг».

Приоритетность выполненных исследований подтверждена патентом РФ на полезную модель № 64784 от 10.07.2007 г. «Установка для микробиологического мониторинга объектов водной среды», патентом РФ № 2339694 от 27.11.2008 г. «Диагностическая тест-система для выявления вируса гриппа птиц А/Н5Ш» и патентом РФ № 2395094 от 20.07.2009 г. «Способ получения раствора, используемого в качестве разводящей жидкости и среды высушивания эритроцитарных и латексных диагностикумов».

Теоретическая и практическая значимость работы. Основная теоретическая значимость работы заключается в определении научных аспектов и подходов к созданию индикационных систем для выявления ВГП, присутствующего в водных объектах окружающей среды в низких концентрациях, не позволяющих его обнаруживать традиционными индикационными методами.

Для осуществления скрининговых исследований, направленных на выявление ВГП создан специфический латексный диагностикум. При индикации вируса в методах КИФА, ИФА и ОТ-ГТЦР использованы МИС, позволяющие избирательно концентрировать патоген из объектов окружающей среды с низкой концентрацией вируса.

Полученные результаты исследований подтверждены межлабораторными испытаниями в Федеральном государственном учреждении здравоохранения «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора (СтавНИПЧИ) «макетов приборов «Аквадиамаг-1» и «Аквадиамаг-2», акт испытаний утвержден директором СтавНИПЧИ 12.05.2006 г.; «Тест-системы диагностической магноиммуно-сорбентной для выявления вируса гриппа птиц иммуноферментным анализом (ИФА) и количественным иммунофлуоресцентным анализом (КИФА)», акт испытаний утвержден директором СтавНИПЧИ 12.05.2006 г.; а также «Тест-системы диагностической магноиммуносорбентной для выявления вируса гриппа птиц иммуноферментным методом», акт испытаний утвержден директором ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН 03.07.2006 г.

По материалам проведенных исследований составлены Методические рекомендации «Применение магнитных иммуносорбентов для селективного концентрирования вируса гриппа птиц А/Н5Ш с последующей постановкой иммуноферментного анализа и полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией», утвержденные директором СтавНИПЧИ и директором ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН в ноябре 2008 г.

На «Тест-систему иммуноферментную для выявления вируса гриппа птиц А/Н5Ы1 (МИС - ИФА - Грипп птиц - СтавНШТЧИ)» оформлены: пусковой регламент № 01897080-13-09 на производство, технические условия

ТУ 9388-020-01897080-2009, инструкция по применению, утвержденные директором СтавНИПЧИ на основании решения ученого совета института от 21 мая 2010 г., протокол № 5.

Материалы диссертации используются'на курсах первичной специализации и усовершенствования врачей по особо опасным инфекциям, в лекциях и практических занятиях по индикации и применению МИС в. мониторинге за ВГП в СтавНИПЧИ.

Основные положения, выносимые на защиту:

3. Разработанные методы селективного концентрирования ВГП на МИС с последующей индикацией в иммунохимических (КИФА, ИФА) и геннодиагностических (ОТ-ПЦР) реакциях позволяют увеличить чувствительность анализов и использовать их при вирусологическом мониторинге объектов окружающей среды.

Международной научно-практической конференции «Проблемы совершенствования межгосударственного взаимодействия в подготовке к пандемии гриппа» (Новосибирск, 9—10 октября 2008 г.); научно-практической конференции молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора «Биологическая безопасность в современном мире» (Оболенск, 21-22 апреля 2009 г.); Международной научно-практической конференции «Перспективы сотрудничества государств-членов ШОС в противодействии угрозе инфекционных болезней» (Новосибирск, 14 - 15 мая 2009 г.); X межгосударственной научно-практической конференции «Актуальные проблемы предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области* санитарно-эпидемиологического благополучия населения государств-участников СНГ» (Ставрополь, 5-6 октября 2010 г.).

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Левченко, Наталия Витальевна

106 Выводы

1. Для осуществления скрининговых исследований при выявлении вируса гриппа птиц разработан специфический диагностикум латексный с чувствительностью 25-50 нг/мл. В>качестве разводящей жидкости при постановке реакции агглютинации латекса и среды высушивания диагностикума предложен универсальный раствор, стабилизирующий диагностикум и увеличивающий срок его годности до двух лет.

3. Усовершенствована специфическая индикация вируса гриппа птиц в водных объектах с низкой концентрацией патогена (2 пг/мл) и выше путем его селективной концентрации на магнитных иммуносорбентах из 5 литров жидкости с последующим их использованием в ИФА, КИФА и ПЦР.

4. Динамическое, селективное концентрирование на магнитных иммуносорбентах вируса гриппа птиц с использованием разработанной установки «Аквадиамаг» из воды открытых водоемов объемом несколько сот литров, где присутствует патоген в низких концентрациях (0,25 пг/мл), не позволяющих его обнаружение известными индикационными методам, дает возможность стабильно выявлять патоген в иммунохимических и геннодиагностиче-ских реакциях.

5. Для индикации вируса гриппа птиц впервые разработаны методические приемы по сочетанному применению магнитных иммуносорбентов с адсорбированным патогеном при постановке количественного иммунофлуоресцентного, иммуноферментного анализов и полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией, обеспечивающие высокую чувствительность и специфичность указанных методов.

Практические рекомендации

1. При проведении скрининговых исследований при выявлении ВГП в объектах окружающей среды при концентрации патогена свыше 50 нг/мл проводить PAJI, характеризующуюся простотой постановки, хорошей воспроизводимостью и позволяющей осуществлять предварительный учет реакции через 1,5-2 ч.

2. Для селективного концентрирования ВГП из объектов окружающей среды (воды) использовать МИС, получаемый из алюмосиликата, магнитного порошка, полиглюкина, активируемый натрием перхлората с последующей ко-валентной иммобилизацией на нем иммуноглобулинов против данного вируса.

5. Индикацию ВГП осуществлять иммунохимическими (КИФА, ИФА), ген-нодиагностическими (ОТ-ПЦР) методами, используя МИС в качестве твердой фазы для концентрирования патогена.

Благодарности

Автор приносит благодарность Д.К. Львову, В.И. Ефременко, Г.М. Гри-жибовскому, П.Г. Дерябину, А.П. Бейер, О.В. Малецкой, И.В. Жарниковой, Н.Ф. Василенко, Е.И. Исаевой, А.Г. Ботикову за совместное участие в оценке роли птиц в заносе и циркуляции ВГП в природных и антропогенных биоценозах Юга России.

Автор благодарит также сотрудников ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН Д.К. Львова, П.Г. Дерябина, Е.И. Исаеву, A.B. Ботикова за предоставление инактивированного ВГП и ИАЖ к нему, на основе которых в рамках диссертации создавались новые диагностические системы.

В создании прибора «Аквадиамаг» и оценке его способности концентрировать ВГП на МИС из воды большого объема помимо автора принимали участие Ефременко В.И.,Жарникова И.В., Столяров A.A., Игуменов A.M., Игуменов E.H.

Диссертант благодарит сотрудников СтавНИПЧИ и ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН Львова Д.К., Ефременко В.И., Дерябина П.Г., Жарникову И.В., Василенко Н.Ф., Исаеву Е.И., Ботикова A.B., Антоненко А.Д., Орлову Т.Н., Таран A.B., Жарникову Т.В., Горобец Е.А., Заревину Л.И., Коготкову О.И., Новакова П.Б., Тюменцеву И.С., Афанасьева E.H., Зайцева A.A., Кочарян A.A., принимающих участие в испытаниях на различных уровнях разработанных диагностических систем для выявления ВГП в объектах окружающей среды.

Другие соавторы совместных публикаций, отраженных в автореферате и диссертации, занимались разработкой эпидемиологического мониторинга и диагностических систем, предназначенных не для выявления и изучения ареола распространения ВГП.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Левченко, Наталия Витальевна, Кольцово

1. Алиева, Е.В. Совершенствование методов лабораторной диагностики дизентерии: автореф. дис. . канд. мед. наук. / Е.В. Алиева. Ростов-на-Дону, 1996. - 27 с.

2. Аминокислотные замены в гемагглютинине вируса гриппа подтипа Н5, влияющие на антигенную специфичность и вирулентность вируса / П.С. Крылов и др. // Вопросы вирусологии. 2009. - № 5. - С. 14-19.

3. Афанасьев, E.H. Научно-методические аспекты экспресс-диагностики возбудителей особо опасных зоонозных инфекций (чума, бруцеллез, сибирская язва): автореф. дис. . докт. мед. наук / E.H. Афанасьев. -Ростов-на-Дону, 2000. 46 с.

4. Аффинные сорбенты с магнитными свойствами в клинике и диагностике инфекционных и неинфекционных заболеваний / В.И. Покровский и др. // Вестник Российской Академии медицинских наук. — 2002. № 2. -С. 3 - 6.

5. Бектемиров, Т.А. Птичий грипп и возможная пандемия / Т.А. Бек-темиров // Биопрепараты. 2005. - № 17. - С. 14-16.

6. Беличенко, A.B. Получение атипичных форм Treponema pallidum и детекция антител к ним в эксперименте: автореф. дис. . канд. мед. наук / A.B. Беличенко. Ставрополь, 2006. - 20 с.

7. Бинатова, В.В. Совершенствование методов лабораторной диагностики лептоспироза: автореф. дис. . канд. биол. наук / В.В. Бинатова. — Ставрополь, 1999. 29 с.

8. Васильев, Ю.М. Вакцины против вируса гриппа птиц / Ю.М. Васильев // Вопросы вирусологии. 2008. - № 6. - С. 4-15.

9. Васильев, Ю.М. Сравнительное изучение размножения вирусов гриппа в культуре клеток и куриных эмбрионах / Ю.М. Васильев, И.А. Руднева, И.Б. Коптяева// Вопросы вирусологии. 2009. - № 4. - С. 18-23.

10. Вирус гриппа A /H5N1: атлас репродукции и патологических изменений внутренних органов мышей / Г.Г. Онищенко и др.. Новосибирск: изд-во «Арта», 2008. - С. 207.

11. Вирусный гепатит А, Крымская геморрагическая лихорадка: современные аспекты эпидемиологии и лабораторной диагностики / Василенко и др.. Ставрополь, 2004. - 160 с.

12. Владимцева, И.В. Научно-методические аспекты приготовления и использования магнитоуправляемых иммобилизованных микробиологических систем: автореф. дис. . докт. биол. наук / И.В. Владимцева. Ставрополь, 2002.-39 с.

13. Высокопатогенный вирус гриппа птиц, вызывающий гриппозную пневмонию у человека / В.В. Макаров и др. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2005. - № 3. - С. 105-109.

14. Выявление в Западной Сибири высокопатогенных H5N1 вирусов гриппа, генетически родственным вирусом, циркулирующим в Юго-Восточной Азии в 2003-2005 гг. / Г.Г. Онищенко и др. // Доклады РАН. -2006. В. 406, № 2. - С. 278-280.

15. Гондон, Ю.З. Эпизоотии гриппа птиц;и борьба с ними / Ю.З. Гендон // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2006. - № 5. -С. 17-28.

16. Грядских, Д.А., Синтез композиционных аффинных сорбентов с магнитными свойствами и их технологическое использование при изготовлении чумных иммунобиологических препаратов: автореф. дис. канд. биол. наук / Д.А. Грядских. Ставрополь, 2004. - С. 22.

17. Дерябин, П.Г. Реакция биологической нейтрализации / П.Г. Дерябин, A.M. Бутенко // Медицинская вирусология / под ред. Д.К. Львова. — М.: МИА, 2008. С. 307-310.

18. Дерябин, П.Г. Реакция гемагглютинации и реакция торможения ге-магглютинации / П.Г. Дерябин, A.M. Бутенко, Е.И. Бурцева // Медицинская вирусология / под. ред. Д.К. Львова. М.: МИА, 2008. - С. 312-318.

19. Динамика вирулентности штаммов высоковирулентного вируса гриппа A/H5N1 генотипа 2.2, изолированных на территории России в 20052007 гг. / М.Ю. Щелканов др. // Вопросы вирусологии. 2009. - № 2. -С. 8-17.

20. Дмитриев, Г.А. Применение ИФА для серодиагностики сифилиса / Г.А. Дмитриев, Т.А. Киселева // Актуальные вопросы дерматологии и венерологии: юбил. сб. тр. конф., посвящ. 5-летию созд. кож. и вен. болезней педиатр. фак. РГМУ. М., 1997. - С. 36-37.

21. Дубинина, O.A. Некоторые аспекты птичьего гриппа в Тюменской области / O.A. Дубинина, Г.В. Шарухо, A.B. Валицкая // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2006. - № 5: - С. 106-107.

22. Ерофеев, Ю.В. Эпизоотия гриппа среди дикой водоплавающей птицы в Саргатеке Омской области в 2005 году / Ю.В. Ерофеев, И.В. Мубарак-шина, P.P. Мубаракшин // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2006. - № 5,- С. 90-93.

23. Ефременко, В.И. Магносорбенты в микробиологических исследованиях / В.И. Ефременко. Ставрополь: Ставрополь, 1996i - 131с.

24. Ефременко, В.И. Новые методы исследования холерного вириона // Актуальные вопросы лабораторной диагностики и профилактики холеры: тез. Всесоюз. научн. конф. Ростов-на- Дону, 1988. - С. 145 - 151.

25. Ефременко, Д.В. Совершенствование экспрессных методов индикации микобактерий туберкулеза: автореф. дис. . канд. мед. наук / Д.В. Ефременко. Ставрополь, 2005. - 20 с.

26. Жарникова, Т.В. Усовершенствование методов индикации Franeisella tularensis и Leptospira interrogans с применением иммобилизованных систем: дис. канд. биол. наук / Т.В. Жарникова. — Ставрополь, 2009. -С.163.

27. Зависимость ядерного импорта полимеров нуклеопротеина вируса гриппа от их конформационного статуса / Н.П. Семёнова и др. // Вопросы вирусологии. 2008. - № 6. - С. 21-24.

28. Избирательное концентрирование бактерий и риккетсий при помощи поликонденсационных иммуносорбентов / K.JI. Шаханина и др. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1969. ■ № 9. ■ С. 140 - 144.

29. Изучение высокопатогенного H5N1 вируса гриппа, выделенного от больных и погибших птиц в Западной Сибири / Г.Г. Онищенко и др.. -Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2006. - № 5. -С. 47-54.

30. Иммуномагнитные сорбенты для экспресс-диагностики особо опасных инфекционных заболеваний: аспекты биотехнологии и опыт применения / И.С. Тюменцева и др. // Проблемы особо опасных инфекций. 2009. - № 3. -С. 59-61.

31. Иммуноферментный метод обнаружения бруцеллезных антител и антигена в сыворотках крови животноводов из неблагополучных по бруцеллезу хозяйств / М.П. Подоляко М.П. и др.. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1995. - № 6. - С. 53-54.

32. Инфицирование свиней вирусами гриппа А/Н4 и А/Н5, изолированными от диких птиц на территории России / С.С. Ямникова и др. // Вопросы вирусологии. 2008. - № 6. - С. 30-34.

33. Информация о заболеваемости гриппом в мире и в России, в том числе гриппом птиц (пресс-релиз Роспотребнадзора от 06.04.2006г.) // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2006. - №5. -С. 124-126

34. Калинина, O.A. ИФА в серодиагностике сифилиса / O.A. Калинина, И.В. Емельянова, М.А.' Локтионова // Современные вопросы дерматовенерологии: юбил. сб. научн. тр., посвященных 70 —лет. обл. кож.-вен. дисп. г. Курска. Курск, 1997. - С. 65-67.

35. Каримова, Т.В. Итоги работы по выявлению РНК, специфичных антител против вируса гриппа A(H5N1) в материале от людей / Т.В. Каримова, Т.А. Малявина, О.Ю. Якунина // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2006. - № 5. - С. 82-83.

36. Кельцев, H.B. Основы адсорбционной техники / Н.В. Кельцев. -М.- 1984.-С. 280.

37. Килевой, Л.Я. Эпизоотическая ситуация по гриппу птиц в Курганской области / Л.Я. Килевой, А.Я. Косарева, O.A. Панкратова // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2006. - № 5. - С. 101-103.

38. Киселев, О.И. Состояние разработки вакцин против вируса гриппа H5N1 в мире и России / О.И. Киселёв, Л.М. Цибалова, В.И. Покровский // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2006. - № 5. -С. 28-38.

39. Климова, В.А. Основные микрометоды анализа органических соединений / В.А. Климова. М., 1975. - 223 с.

40. Клячко-Гурвич, A.A. Методы определения удельной поверхности / A.A. Клячко-Гурвич // Изв. АН СССР. 1964. - № 10. - С. 1885.

41. Ленева, И.А. Противовирусные этиотропные химиопрепараты: эффективность против вирусов гриппа A H5N1 / И.А. Ленева, A.M. Шустер // Вопросы вирусологии. 2006. - № 5. - С. 4-7.

42. Львов, Д.К. Сбор, хранение и транспортировка полевых материалов / Д.К. Львов, М.Ю. Щелканов, Л.В. Колобухина // Медицинская вирусология: руководство / под ред. Д.К. Львова. М., 2008. - С. 293-300.

43. Магнитоуправляемые сорбенты в клинике и диагностике инфекционных и ревматических заболеваний / В.И. Покровский и др. // Объединенный медицинский журнал. — 2002. № 2 (3). - С. 51-53.

44. Межпопуляционные взаимодействия в системе вируса гриппа А -животные человек / Д.К. Львов и др. // Вопросы вирусологии. - 2005. -№4.-с. 4-11.

45. Метод получения магноиммуносорбентов для диагностических тест-систем / A.B. Брыкалов и др. // Совершенствование учебного процесса и применение технических средств обучения: сб. трудов 58 — й научн. метод. конф. - Ставрополь, 1995. - С. 19-20.

46. Молекулярно-биологический анализ изолятов вируса гриппа птиц, вызвавших эпизоотии на юге Западной Сибири и в Крыму / Г.Г. Онищенко и др. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2007. -№ 5. - С. 28-32.

47. Мониторинг антител к вирусу гриппа А у населения различных регионов Западной Сибири / О.Г. Курская и др. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2009. - № 3. - С. 92-95.

48. Направленная модификация участков каспазного расщепления в белках вируса гриппа птиц / О.П. Жирнов и др. // Вопросы вирусологии. -2008.-№6. -С. 16-21.

49. Новая технология ковалентной иммобилизации биомолекул на носителях. I. Разработка способа получения сорбентов на основе трис (гидро-ксиметил) фосфина / Л.И. Греков и др. // Биотехнология. - 2007. - № 4. -С. 34-40.

50. Новая технология ковалентной иммобилизации биомолекул на носителях. И. Применение фосфиновых сорбентов для иммунодиагностики и индикации возбудителей инфекционных заболеваний / Л.И. Греков и др. // Биотехнология. 2007. - № 5. - С. 88-94.

51. Новый метод выделения возбудителя холеры из воды / В.И. Ефре-менко и др. // Особо опасные инфекционные заболевания: диагностика, профилактика и биологические свойства возбудителей: сб. науч. работ. — Волгоград, 1990. В. 4. - С. 213-219.

52. Носков, Ф.С. Очистка конъюгатов от непрореагировавшего флюо-рохрома / Ф.С. Носков // Иммунологическая диагностика вирусных инфекций. М., 1985.-С. 254.

53. О мерах по защите населения, проживающего в эпизоотически неблагоприятных по гриппу птиц районах (от 01.09.2005 №0100,/7103-05-23) // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2006. - № 5. -С. 109-110.

54. Обнаружение чумного микроба в блохах методом полимеразной ценной реакции с использованием магноимуносорбентов / E.H. Афанасьев идр. // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. 2004. - № 1. -С. 33-36.

55. Оптимизация генного состава реассортантов, содержащих гемагг-лютинин вируса гриппа подтипа Н5, и их эффективность в опытах перекрестной иммунной защиты / И.А. Руднева и др. // Вопросы вирусологии. -2008. -№ 1.-С. 24-27.

56. Опыт применения магнитоуправляемых диагностикумов в эпиднад-зоре за холерой в Дагестане и Чеченской Республике / В.И. Ефременко и др. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1996. - № 3. -Приложение. - С. 73-75.

57. Организационное обеспечение санитарно-эпидемиологического благополучия территорий Омской области, вовлеченных в эпизоотию птичьего гриппа / Ю.В. Ерофеев и и др. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2006. - № 5. - С. 94-96.

58. Организация надзора над ЗАО »«Птицефабрика Любинская» на период осложнения эпизоотической обстановки по заболеваемости гриппом птиц в Омской области / П.А. Усков и др. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2006. - № 5. - С. 96-99.

59. Организация эколого-эпидемиологического мониторинга территории Российской Федерации: метод, рекомендации / под ред. Д.К. Львова. -М. 1995.-34 с.

60. Патент № 2165081 Россия G01N 33/53. Способ индикации микроорганизмов / В.И. Ефременко, И.С. Тюменцева, Е.Б. Жилченко и др.. -№ 99100445/13; заявл. 05.01.99 ; опубл. 10.04.01. Бюл. № 10.

61. Патент РФ № 2012888 G01N33/531 Способ получения латексного диагностикума / Смелянский В.П., Зыкин Л.Ф., Манолов А.Д. и др.. — № 4941436/14; заявл. 03.06.1991 ; опубл. 15.05.94 г. Бюл. № 9.

62. Патент РФ № 2065164 G 01 N33/53 от 10.08.1996. Диагностические тест-система для выявления вируса гепатита А / Н.Ф. Василенко, В.И. Ефременко, И.Н. Гнутов. № 5036693/14; заявл. 09.04.1992 ; опубл. 10.08.1996. Бюл. № 22.

63. Патент РФ № 2200327 от 10.03.2003. Способ диагностики сифилиса (варианты) / И.А. Базиков, И.С. Тюменцева, В.И. Ефременко и др.. -№ 99124840/14; заявл. 25.11.99; опубл. 10.03.2003, Бюл. № 7

64. Патент РФ № 2218411 С12(2001/04 О0Ш033/53 О0Ш033/543 в0Ш033/569 от 10.12.2003. Способ обнаружения патогенных микроорганизмов в объектах внешней среды / В.И. Ефременко, И.С. Тюменцева, М.Н. Кас-торная и др. № 2001135978/13; опубл. 10.02.04, Бюл. № 34

65. Патент РФ № 2223499 МПК в 01 N 33/543, С 12 О 1/04 Способ индикации возбудителя сибирской язвы в объектах внешней среды / Абгарян А.Г., Ерёменко Е.И, Ефременко В.И. и др. № 2000109193/13; опубл. 10.02.2004, Бюл. № 4.

66. Патент РФ на полезную модель №64784 МПК 001 N 33/553, С12 М 1/00. Установка для микробиологического мониторинга объектов водной среды / Ефременко В.И., Столяров А.Л., Игуменов Э.А. и др.. заявлено 12.12.2006 ; опубл. 10.07.2007, Бюл. № 19.

67. Первый прорыв нового для России генотипа 2.3.2 высоковирулентного вируса гриппа A/H5N1 на Дальнем Востоке / Д.К. Львов и др. // Вопросы вирусологии. 2008. - № 5. - С. 4-8.

68. Получение и применение магнитных сорбентов в методах имму-ноанализа микроорганизмов / В.И. Ефременко и др. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1989. - № 12. - С. 100 - 105.

69. Получение и свойства моноклональных антител к высокопатогенному штамму вируса гриппа птиц А (H5N1), выделенного на территории Российской Федерации / A.A. Кущ и др. // Вопросы вирусологии. 2008. -№ 5.- С. 9-14.

70. Понотов, Л.В. Опыт работы по ликвидации очагов птичьего гриппа в Здвинском районе Новосибирской области / Л.В. Понотов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2006. - № 5. - С. 79-81.

71. Практическая химия белка. М.: Мир, 1989. - С. 300-301.

72. Применение иммуноферментной индикации вирусспецифических антигенов в изучении нового противогриппозного препарата арбидола / И.А. Ленева и др. // Химико-фармацевтический журнал. 1994. - № 9. -С. 4-8.

73. Применение количественной иммунофлуоресценции для определения адсосорбционной способности магнитных иммуносорбентов / Г.Г. Под-золкова и др. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1988.-№5.- С. 56-58.

74. Применение сочетанных методов экспресс-диагностики для выявления вируса гепатита А / В.И. Ефременко и др. // Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, 2006. - В. 1 (91) - С. 72-75.

75. Противовирусная активность сульфатированного полисахарида из бурой инфекции культур клеток, вызванной вирусом гриппа А птиц (H5N1) / И.Д. Макаренкова и др. // Вопросы вирусологии. 2010. - №1. - С. 41-45.

76. Птичий грипп / Т.П. Лобанова и др. // Грипп птиц: происхождение инфекционных биокатастроф / Под ред. В.И. Покровского.- СПб: Росток, 2005. С. 63-105.

77. Птичий грипп в Алтайском крае / И.П. Салдан и др. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2006. - № 5. - С. 104105.

78. Различная рецепторная специфичность вирусов гриппа уток и кур и ее отражение в составе сиалозидов на хозяйских клетках и муцинах / A.C. Гамбарян и др. // Вопросы вирусологии. 2006. - № 4. - С. 24-32.

79. Разработка диагностической тест-системы на основе «сэндвич»-ИФА для выявления вируса гриппа А птиц / Л.В. Жемаева и др. // Вопросы вирусологии. 2009. - № 4. - С. 45-49.

80. Разработка и применение иммобилизованных систем для экспресс-диагностики различных заболеваний / И.В. Жарникова и др. // Вестник Российской военно-медицинской академии. 2008. - № 2 (22). - Приложение. -С. 180-181.

81. Разработка тест-систем для выявления и типирования вируса гриппа А на основе полимеразной цепной реакции / Д.Е. Киреев и др. // Вопросы вирусологии. 2007. - № 4. - С. 17-22.

82. Расшифровка эпизоотической вспышки среди диких и домашних птиц на юге европейской части России в декабре 2007 г. / Д.К. Львов и др. // Вопросы вирусологии. 2008. - № 4. - С. 18-23.

83. Реассортация и взаимодействие генов при скрещивании вируса гриппа птиц подтипа Н5 с вирусом гриппа человека // К.С. Кочергин-Никитский и др. // Вопросы вирусологии. 2007. - № 1. - С. 23-28.

84. Результаты двухлетнего обследования диких птиц на территории Западной Монголии на присутствие вируса гриппа / A.M. Шестопалов и др. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2006. - № 5. -С. 55-59.

85. Рекомендации по клинике, дифференциальной диагностике и лечению людей, инфицированных высокопатогенным вирусом гриппа A (H5N1) // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2006. - № 5. -С. 112-117.

86. Совершенствование метода индикации возбудителя сибирской язвы / А.Г. Абгарян и др. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2003. - № 6. - Приложение. - С. 47-51.

87. Создание тест-системы на основе метода полимеразной цепной реакции для детекции вируса гриппа А / Д.Е. Киреев и др. // Материалы XII Российского национального конгресса «Человек pi лекарство» (Москва 18-22 апреля 2005г.). -М, 2005. С. 138.

88. Спектр клеточных линий позвоночных, чувствительных к высокопатогенным вирусам гриппа А/крачка / Южная Африка / 61 (H5N1) и А/крачка / Новосибирск/56/05 (H5N1) / П.Г. Дерябин и др. // Вопросы вирусологии. 2007. - № 1. - С. 45-47.

89. Сравнение методов оценки эффективности ингибиторов гемагглю-тинина вируса гриппа в тестах in vitro и in vivo. / Е.П. Гончарова и др. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2006. - № 5. -С. 39-46.

90. Тамбовцев, Е.П. Методы статистической обработки результатов серологических реакций / Е.П. Тамбовцев, С.Г. Ахметкалиев, Н.П. Пятницкий // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1969. - № 10. -С. 26-31.

91. Таран, A.B. Совершенствование методов лабораторной диагностики лептоспироза и детекции его возбудителя: автореф. дис. . канд. мед. наук / A.B. Таран. Ставрополь, 2008. - С. 24.

92. Фрайфелдер, Д. Физическая биохимия / Д. Фрайфелдер. М.: Мир, 1980.-С. 73.

93. Хитозан как адъювант для инактивированных вакцин против вирусов гриппа птиц / Ю.З. Гендон и др. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2009. - № 2. - С. 40-47.

94. Циркуляция гриппа типа А среди домашней птицы в предэпизоти-ческий период 2005 года в Новосибирской области / Ю.Г. Юшков и др. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2006. - № 5. -С. 59-65.

95. Шторц, X. Иммунофлуоресценция / X. Штоц // Иммунологические методы. М.: Медицина, 1987. - С. 128-148.

96. Щедрин, В.И. Сравнительная оценка двух иммуноферментных систем для серодиагностики сифилиса / В.И. Щедрин, В.Б. Сбойчинов,

97. B.И. Волков // Актуальные вопросы дерматологии: сб. тез. докл. научн,-практ. конф., посвященной 125-летию созд. каф. кож. и вен. болезней. СПб, 1994. - С. 81-82.

98. Эволюция вирусов гриппа птиц H5N1 с 1997 по 2004 г. в Южной и Юго-Восточной Азии / A.C. Липатов и др. // Вопросы вирусологии. 2005. -№4.-С. 11-17.

99. Эволюция вируса гриппа H5N1 в природных биоценозах Северной Евразии: глобальные последствия / Д.К. Львов и др. // Материалы IV Международного ветеринарного конгресса по птицеводству (Москва, 8-11 апреля 2008). М., 2008. - С. 87-92.

100. Эпидемические штаммы вирусов гриппа А и В в сезоне 20052006 г.г. в России / В.Т. Иванова и др. // Вопросы вирусологии. 2008. -№4.-С. 13-18.

101. Эпизоотия среди лебедей-шипунов (Cygnus olor) в нижней дельте Волги (ноябрь 2005г.), вызванная высокопатогенным вирусом гриппа A/H5N1 / Д.К. Львов и др. // Вопросы вирусологии. 2006. - № 3. - С. 10-16.

102. Эпизоотологические и эпидемиологические особенности очага гриппа птиц в Челябинской области в сезон 2005 года / А.И. Семёнов и др. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2006. - № 5. -С. 99-101.

103. Alexander, D. Ecology of avian influenza in domestic birds / D. Alexander // Proc. Int. Symp. on Emergence and Control of Zoonotic Ortho- and Paramyxovirus Diseases: Merieux Foundation 2001. - P. 25-34

104. Antigen sparing and cross-reactive immunity with an adjuvanted H5N1 prototype pandemic influenza vaccine: a randomised controlled trial / I. Leroux-Roles et al. // Lancet. 2007. Vol. 370. - P. 580-589.

105. Austin, F.J. Antigenic mapping of an avian HI influenza vims haemag-glutinin and interrelationship of HI viruses from humans, pigs and birds / F.J. Austin, R.G. Webster// J. Gen. Virol. 1986. - Vol. 67, № 6. - P. 983-992.

106. Brownlee, G.G. The predicted antigenicity of the haemagglutinin, of the 1918 Spanish influenza pandemic suggests an avian origin. Philos. Trans. R. Soc. bond. B. / G.G. Brownlee, E. Fodor // Biol. Sci. 2001. - Vol. 356, № 1416. -P. 1871-1876.

107. Caspase-dependent N-terminal cleavage of influenza virus nucleocapsid protein in infected cells / O.P. Zhir et al. // J. Virol. 1999. Vol. 73. - P. 11581163.

108. Characteriration of novel influenza A virus hemagglutinin subtype (HI 6) obtained from blac-headed gulls / Ron A.M. Foucher et al. // Y. Virol. 2005. -Vol. 79, № 5. - P. 2814-2822.

109. Characterization of a new avian-like influenza. A vims from horses in China / Y. Guo et al. // Virology. 1992. - Vol. 188, № 1. - P. 245-255.

110. Clark, M.F. Characteristics of the microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant virus / M.F. Clark, A.N. Adams // J. Gen. Virol. 1977. - Vol. 36, № 3. - P. 475-483.

111. Coons, A.H. Localisation of antigen in tissue cells / A.H. Coons, M.N. Kapran// J. Exp. med. 1950. - Vol. 91, № 1. - P. 81-89.

112. Defection of human serum antibody to avian influenza A (H5N1) virusiusing a combination of serologic assays / T. Rowe et al. // J. Clin. Microbiol. -1999.-Vol. 37.-P. 937-943.

113. Detection uf the causative agent of tularemia in environmenal objects by an express method using magnetoimmunosorbents / I.V. Zharnikova et al. // Natural infectios diseases: abstracts of scientific conference. Ulaanbaator, 2001. -P. 81-83.

114. Development and evaluation of a DAS-Elisa for rapid defection of avian influenza viruses / A. Zhang et al. // Avian Dis. 2006. - Vol. 50. - P. 325-330.

115. Development of magnetoimmunosorbent diagnosticums for the detection of Yersinia pestis using rapid methods / Zharnikova et al. // Chinese journal of Control of Endemic Disease. 1999. - Vol. 14. - P. 73.

116. Effects of adjuvants on the safety and immunogenicity of an avian influenza H5N1 vaccine in adults / J. Bernstein et al. // J. Infect. Dis. 2008. -Vol. 197. - P. 667-675.

117. Epitope mapping of the hemagglutinin molecule of a highly pathogenic H5N1 influenza virus by using monoclonal antibodies I N.V. Kaverin et al. // J. Virol. 2007. - Vol. 87. - P. 129111-12917.

118. H5N1 chiken influenza viruses display a high binding affinity for Neu5 Aca2-3Galß 1 -4(6HS03)GlcNAc-containing receptors / A.S. Gambaryan et al. // Virology. 2004. - Vol. 326. - P. 310-316.

119. H5N1 influenza: a protein pandemic threat / J. Guan et al. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2004. - Vol. 25, № 101(21). - P. 8156-8161.

120. Hay, A. Amantadine and rimantadine-mechanisms / A. Hay // Antiviral Drug Resistance / Ed. D. Richman- Chichester, 1996. P. 44-58.

121. Highly Pathogenetic Avian Influenza. Terrestrial Animal Health Code (office International des Epizzoties) // World Organization for Animal Health. -2003.

122. Hirst, G.K. The agglutination of red cells by allantoic fluid of chick embryos infected with influenza virus / G.K. Hizst // Science. 1941. - Vol. 94. -P: 22-23.

123. Horimoto, T. Influenza: Lessons from past pandemics, warnings from current incidents / T. Horimoto, Y. Kawaoka // Nature Reviews Microbiology. -2005. Vol. 3, № 8. - p. 59-60.

124. Horimoto, T. Influenza: lessons from past pandemics, warnings from current incidents / T. Horimoto, J. Kawaoka / Natl. Rev. Microbiol. 2005. -Vol. 3.-P. 591-600.

125. Hyushina, N.A. Defection of amantadine-resistant variants among avian influenza viruses isolated in North America and Asia / N.A. Hyushina, E.A. Go-vorkova, R.G. Webster // Virology. 2005. - Vol. 10, № 341(1) - P. 102-106.

126. Identification and subtyping of avian influenza viruses by reverse tran-scription-PCR / M.S. Lee et al. // J. Virol. Methods. 2001. - Vol. 97(1-2). -P. 13-22.

127. Influenza in birds, pigs and human: old theories versus current viewpoint / K. Van Reeth et al. // Proceedings of 19-th IPVS Congress. — Copenhagen: Denmark, 2002. Vol. 1. - P. 26-35.

128. Influenza: emergence and control / A. Lipatov et al. // J. Virol. 2004. -№78.-P. 8951-8959.

129. Isolation from turkey breeder hens of a reassortant H1N1 influenza virus with swine, human and avian lineage genes / D.L. et al. // Avian Dis. 2002. -Vol. 46, № l.-P. 111-121.

130. Ito, Т. Avian influenza / Т. Ito, Y. Kawaoka I I Textbook of influenza / K. Nicholson, R.Webster, A.Hay. Blackwell: Science, 1988. - P. 126-136.

131. Ito, T. Avian Influenza / T. Ito, Y. Kawaoka // Textbook of Influenza / K.G. Nicholson. Oxford: Oxford Univ. Press., 1988. - P. 126-129.

132. Joint Committee on vaccination and immunization. Influenza subgroun. -Режим доступа: http//www.advisorybodies. dov.uk/jcvi/mins-flu-130405.htm

133. Lamb, R. Genes and Proteins of the Influenza Viruses / R. Lamb // The Influenza Viruses / Krug R.M. N.Y.: Plenum Press, 1989. - P. 1-67.

134. Molecular basis for high virulence of Hong Kong H5N1 influenza A viruses / M. Hatta et al. // Science. 2001. - Vol. 293. - P. 1840-1842.

135. Molecular basis for the generation in pigs of influenza A virus with pandemic potential / T. Ito et al. 1998. - Vol. 72, № 9. - P. 7367-7373.

136. Molecular correlates of influenza A H5N1 virus pathogenesis in mice / J.M. Katz et al. // J. Virol. 2000. - Vol. 74. - P. 10807-10810.

137. Molecular determinants within the surface proteins involved in the pathogenicity of H5N1 influenza viruses in chickens / D.J. Hulse et al. // J. Virol. 2004. - Vol. 18, № 1. - P. 9954-9964.

138. Molecular mechanisms of variation in influenza viruses / R.G Webster et al. //Nature. 1982. - Vol. 296, № 5853. - P. 115121.

139. Murphy, B.R. Orthomyxoviruses / B.R. Murphy, R.G. Webster // Field Virology. Philadelphia, 2001. - P. 1397-1445.

140. Nakane, P.K. Peroxidase labelled antibody - a new method of conjugation / P.K. Nakane, A. Kawaoi // J. Histochem. Cytochem. - 1974. - Vol. 22. -P. 506-508.

141. Neuraminidase is important for the initiation of influenza virus infection in human airway epithelium / M.N. Matrosovich et al. // J. Virol. 2004. -Vol. 78. - Supple 22. - P. 12665-12667.

142. NS1 protein of influenza A virus down-regulates apoptosis / O.P. Zhirnov et al. // J. Virol. 2002. - Vol. 76. - P. 1617-1625.

143. Ouchterlony, O. Antigen antibody reactions in gel / O. Ouchterlony // Arkiv for Kemi. Mineral. O Ged. - 1949. - Vol. 261, № 14. - P. 1-9.

144. Pathogenicity and diagnosis of H5N2 Mexican avian influenza viruses in chicken / D.M. Swayne et al. // Avian Dis. 1997. - Vol. 41, №2. - P. 335-346.

145. Pathogenicity of H5 influenza virus for ducks / N. Koshoda et al. // Arch. Virol. 2005. - № 150. - P. 1383-1393.

146. Peiris, J.S. Avian influenza virus (H5N1): a threat to human health / J.S. Peiris, M.D. de Jong, Y. Guan // Clin. Microbiol. Rev. 2007. - Vol. 20. -P. 243-267.

147. Perroncito, E. Epizoozia tifoide neigalliancei / E. Perroncito // Annali della Academia d. agricoltora di Torino. 1978. - № 21. - P. 87-126.

148. Peruski, A.N. Immunological methods for detection and identification of infectious diseases and biological warfare agents / A.N. Peruski, L.F Peruski // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2003. - Vol. 10, № 4. - P. 506-513.

149. Phenotypic expression of HA-NA combinations in human-avian influenza A virus reassortants / I.A. Rudneva et al. // Arch. Virol. 1996. - Vol. 141. -P. 1091-1099.

150. Pinto, L.N. The M2 protor channels of influenza A and B viruses / L.N Pinto, R.A. Lamb //J. Biol. Chem. 2006. - Vol. 281, № 14. p. 8997-9000.

151. Portela, A. The influenza virus nucleoprotein: a multifunctional RNA-binding protein pivotal to virus replication / A. Portela, P. Digard // J. Gen. Virol. -2002. Vol. 83. - P. 723-734.

152. Potential for transmission of avian influenza viruses to pigs / H. Kida et al. // J. Gen. Virol. 1994. - Vol. 75. - P. 2183-2188.

153. Rapid diagnosis of influenza infection of NP antigen using an immuno-capture Elisa test / J.J. Chomel et al. // J. Virol. Meth. 1989. - Vol. 25. - P. 8192.

154. Reemerying H5N1 influenza virus in Hong Kong in 2000 are high pathogenic to ducks / K. Dyrtinng et al. // Y. Virol. 2004. - № 76. - P. 48924901.

155. Restoration of virulence of escape mutants of H5 and H9 influenza viruses by their readaptation to mice / I.A. Rudneva et al. // J. Gen. Virol. 2005. -Vol. 86. - P. 2831-2838.

156. Safety and immunogenicity of an inactivated adjuvanted whole-vizion influenza A (H5N1) vaccine: a phase I randomised controlled trial / J. Lin et al. // Lancet. 2006. - Vol. 368. - P. 991-997.

157. Schafer, W. Vergleichende sero-immunologische Untersuchungen über die vims der influenza unf klassichen geflugelpest / W. Schäfer // Z. Naturforsch. -1955.-№ 10 B.-P. 81-91.

158. Seo, S.H. The NS1 gene of H5N1 influenza viruses circumvents the host anti-viral cytokyne responses / S.H. Seo, E. Hoffman, R.G. Webster // Virus Res. -2005.-Vol. 103.-P. 107-113.

159. Steibuch, G. The isolation of IgG from imanalion serra with the acid of caprilic / G. Steibuch, R. Andran // Arch. Biochem. 1969. - Vol. 139. - P. 279284.

160. Sting, R. Erfahrungen mit einfachen ELISA-Testsystems fur die Brucellose Serologie bei Rind, Schaf und Ziege / R. Sting, G. Ortmann // Berlin. Und munch. Wochenschr. - 2000. - Vol. 113, № 1. - P. 22-28.

161. Structure of a knokout mutant of influenza virus Ml protein that has altered activities in membrane binding, oligomerisaton and binding to NEP (NS2) / S. Arzt et ai. // Virus Res. 2004. - Vol. 99, № 2. - P. 115-119.

162. Structure of the antigenic sites on the hemagglutinin molecule of H5 influenza virus and phenotypic variation of escape mutants / N.V. Kaverin et al. // J. Gen. Virol. 2002. - Vol. 83. - P. 2497-2505.

163. Sturm-Ramirez, K.M. Are ducks contributing to the endemicity of pathogenic H5N1 influenza virus in Asia? / K.M. Sturm-Ramirez, D.G. Hulse-Post, E.A. Govorkova // Y. Virol. 2005. - Vol. 79, №17. - P. 1169-1179.

164. Subbarao, K. Influenza vaccines: presents and future / K. Subbarao // Adv. Virus. Res. 1999. - Vol. 54. - P. 349-373.

165. Swayne, D.E. Efficacy of recombinant fowl poxvirus vaccine in protecting chickens against a highly pathogenic Mexican origin H5N2 avian influenza virus / D.E. Swayne, J.R. Beck, T.R. Mickle // Avian Dis. - 1997. - Vol. 41, №4. -P. 910-922.

166. The National Trainig Course on Animal Influenza Diagnosis and Surveillance. Harbin, China (May 20-26, 2001). Harbin, 2001.

167. The surface glycoprotein of H5 influenza viruses isolated from humans, chickens and wild aquatic birds have distinguishable properties / M.N. Matroso-vich et al. // J. Virol. 1999. - Vol. 73. - P. 1146-1155.

168. Three Indonesian clusters of H5N1 virus infection in 2005 / J.N. KanduM et al. //N. Engl. J. Med. 2006. - Vol. 355. - P. 2186 - 2194.

169. Ungchusak, K. Fetal. Probable person-to-person transmission of avian influenza A (FI5N1) / K. Ungchusak, P. Auewaracul, S. Dowell // N. Engl. J. Med. 2005. - Vol. 352. - P. 333-340.

170. Universal primer set for the full-length amplification of all influenza A viruses / E. Holfman et al. // Arch. Virol. 2001. - Vol. 146. - P. 2275-2289.

171. Update of human infections with highly pathogenic avian influenza virus A/H7N7 during an outbreak in poultry in the Netherlands / M. Koopmans et al. // Eurosurveillance Weekly. 2003. - P. 1-5.

172. Use of immune magnetic separation and PCR for Bacillus antracis detection in soil samples program and abstracts book / E. Eremenko et al. //4-th international conference on Anthrax. — Maryland USA, 2001. P. 22.

173. Van Reeth, K. Avian and swine viruses: our understanding of zoonotick risk / K. Van Reeth // Vet. Res. 2007. - Vol. 38. - P. 243-260.

174. Wiley, D.C. Structural identification of the antibody-binding sites of Hong Kong influenza hemagglutinin and their involvement in antigenic variation / D.S. Wiley, I.A. Wilson, J.J. Skenel //Neture. 1981. - Vol. 289. - P. 373-378.

175. Wood, J.M. Developing vaccines against pandemic influenza / J.M. Wood // Phil. Trans. R. Soc. Lond. 2001. - Vol. 356. - P. 1953-1960.

176. Wright, R.G. Orthomyxoviruses / R.G. Wright, R.G. Webster // Fields Virology / Eds D.M. Knipe, P.M. Howley. Philadelphia, 2001. - P. 1533-1579.

177. Yegani, M. Avian influenza causing a poultry industry crisis / M. Yegani // World Poultry. 2004. - № 20. - P. 20-22.

178. Yu, H. Comparative studies of magnetic particlebased solid phase fluorogenic and electrochemiluminescent immunoassay / H. Yu // J. Immunol. Methods. 1998. - Vol. 218, № 1-2. - P. 1-8.

Информация о работе

Левченко, Наталия Витальевна
кандидата медицинских наук
Кольцово, 2011
ВАК 03.02.02

Диссертация

Совершенствование методов выявления вируса гриппа птиц А/Н5N1 путем создания высокочувствительных диагностических систем - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Совершенствование методов выявления вируса гриппа птиц А/Н5N1 путем создания высокочувствительных диагностических систем - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы