Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Реликтовые вирусы гриппа А (HINI). Биология и значение на современном этапе эволюции возбудителя

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Реликтовые вирусы гриппа А (HINI). Биология и значение на современном этапе эволюции возбудителя"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ

КАЗАХСТАН

Научно-нсследовательскии институт эпидемиологии, микробиологии и инфекционных болезнен

На правах рукописи

ЧУВАКОВА Зсйнен Кожахметовна

РЕЛИКТОВЫЕ ВИРУСЫ ГРИППА А (НШ1). БИОЛОГИЯ II ЗНАЧЕНИЕ НА СОВРЕМЕННОМ ЭТАПЕ ЭВОЛЮЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ

ОЗ.ОО.ОБ — вирусология

Д И С С Е Р Т А Ц И Я

на соискание ученой стененн доктора биологических наук п форме научного доклада

Алматы-19!)3

Работа выполнена в Институте микробиологии и вирусологии Национальной Академии Наук Республики Казахстан

Научные консультанты: доктор биологических наук

ИСАЕВА. Е.С.

доктор медицинских наук РОВНОМ З.й.

доктор медицинских наук,профессор МУРАТОВ Й.2.

Официальные оппоненты: член-корреспондент Российской

Академии естественных наук,доктор медицинских наук, профессор

SPiOB §Л.

доктор биологических наук,профессор САЯТОВ ИД.

доктор медицинских наук 1ШШ Т.Д.

Ведущее учрегдэние: Научно-исследовательский институт

гриппа li3 РФ

Защита состоится "3/ " 1993 г. в 14 часов

на заседании специализированного Совета д 079 05 01 при НИИ эпидемиологии,микробиологии и инфекционных болезней ЫЗ Республики Казахстан по адресу: 480002, г. Алматы, ул. Макатаева, 34.

Автореферат разослан сог^рЯ^Я^ 1993 г.

С диссертацией ыогно ознакомиться в библиотеке , института.

Ученый секретарь „ —

специализированного Совета

кандидат медицинских наук -а^У Н.И.НУРКША

Лктум -юсть проблемы.

вопросы возникновения и путей выживания пандомических вариантов вируса гриппа являотся основополагающими и взаимосвязанными в проблеме гриппа - самого .массового неконтролируемого заболевания человека. Существует несколько концепций по этим вопросам, группирующихся в антропонознуо и зооантро-понозную. Более ранней является антропонозная концепция, в основу которой легли работы Аискел-еэ {1942-1983) «Оа^ирог! е*.аС (1953,1969), Сыородинцева (1Э69).Согласно этой концепции "единственным источником и резервуаром инфекции является человеку Грипп хивотннх не является источником заболевания лодей, поскольну вирусы гриппа челов©ка после пассата через организм другого хозяина теряпт исходную пато-генность для человека (Жданов, Гайдаыович, 1966). В дальнейшей, когда били установлены тесные серологические взаимосвя^" зи иеаду вирусами гриппа человека и животных, высокая степень гомологии генов, способность к перераспределению фрагментов РНК, широкое распространение получила экологическая концепция ( ЮсРёоагие # 1973; Зданов, Львов, Закстельская, 1978; Еа^еЫсщ, \We6siet , ЭсксЕа. ,1978).Однако накопление фактов о распределении вирусов гриппа по "кругу хозяев" ( Веан 1Э84;2*и.гиоУ , Ва1гогз£ауа , 198 А;ВсЬо1и$*ек <£ а.1 1988; Уатте&и. ,1989; Уогтап й а1 1990), трудностях преодоления иехвидового барьера ( УУгВг , ¿ауе-г , А1г 1983; Яиникова 1990), слабой конкурентноспособности реассор-тантов по биологической активности, вирулентности и контаги-озности (5с1юН1«е1 еЬ аЕ ,1985; "Пап <£ а! , 1335; А а1 1987), свидетельствовало об дивергентном характере эволт;ии вирусов гриппа человека и гивотных, отразающек хозяинспоци-фическую адаптации нуклеопротеидного гена'С Ч)огтаи аЕ , 1990). Наряду с эгии, сведения об ограниченности пандемических вариантов, рециркуляции ранних штампов подтипов Н1М1 и НЗМ2, и.главное, о возврате на эпидемическую орбиту вируса 50-х гг. циркуляции,способствовало развитии альтернативной концепции ( Нсре-Зипрао!?, 1979; ЗЬйт^-Наги? ,1981;Сыородинцев, Лузянина, Иванова, 1Э81; Голубев,1985; Иуратов, 1987).Современные взгляды па гриппознуо инфекцию,как антропоноэ, иало-кены Норе - ^траок и ЧкЫ^гу (1387).Авторы предполагает

- г -

что иэхду эпидемиями вирус гриппа сохраняется в организме человека в латентной или персистентной форме. В популяции сохраняются все о ыифтовых вариантов вируса гриппа А, а отдельные вирусологические и серологические находки неактуальных пандемических вариантов являются результатом активации вируса у носителей-и его последующего ограниченного распространения. Выход вируса на эпидемическуп орбиту возможен только после "восстановления им высочайшей вирулентности под влиянием факторов внешней среды и при изменении состояния организма хозяина" (Смородинцев, 1981). Поскольку внешние .факторы действуот на всю популяцию "хозяев", эпидемия начинается из многих первоначальных очагов. Сходные закономерности наблюдаются при эпизоотиях у свиней ( кпгХхг^гь ,1983). Наиболее сложный в райках концепций остается вопрос о 'механизмах консервации генома (генов) пандемических вариантов в популяциях • людей и хивотних. Уеханизм интеграции генетического материала вируса гриппа в геном хозяина не имеет доказательств,хотя в исключительных обстоятествах инфекции у вирусов с обратной транскриптазой это мохет произойти. РБК-содергащие вирусы человека и зивотннх, неспособные к интеграции в клеточный геном в качестве стратегии вшивания, по-видимому, могут использовать такие механизмы, как антигенная вариабельность, вертикальная передача и персиотентная инфекция (Ткаекег , 1986;

Уа&йв,5а6о ,1988). Способность вируса гриппа к трансплацентарной передаче и персистентной инфэнции обоснована данными экспериментальных исследований и клинико-лабораторных наблюдений (Гаврилов,1966-1972, Ритова,1976; Зуев,1936,1908,1990; Медведева и др. ,1Э83;Фролов, 1981;Щербинская, 1984; Нсгоазоп. , 1986;Ровнова и др.,1990).Однако,ыолекулярно-биологические * основы становления и поддергания персистентной инфекции мало изучены.Возможно,генетический материал вируса гриппа сохраняется в клетке в эписомальной форме,как это описано для большинства ДНК-содерхащих вирусов ( 4Ь.(?ал9 , 5аёо ,1988). По данным ряда авторов вирус ио!ет персистировать в организме в составе иммунных комплексов (Зуев, 1973; Фролов и др., 1981), в виде дефектных интерферирующих частиц (¡Дербинская, 1984), температуроэависимнх мутантов (Медведева, Арон,1985). Возмохно, процесс персистенции связан с далецыямк в согьшнте

РНК, кодирующего неструктурный балок ( ^¿u.cafi vial t 1988), функция которого заключается в выключении синтеза хозяйских белков и переключения синтеза ранних балков вирусспецифических к поздним ( U-'ot^tenkotvn et al, 1980; ICoenneclce et a8 Д981; Губарева и др., 1988).

Таким образом, неясность происхождения и механизмов консервации пандемических вариантов вируса гриппа к человека указывает на необходимость и важность комплексных исследований по эпвднадзору за рециркуляцией атипичных вариантов неактуальных для настоящего времени вариантов и молекулярно-биологическому изучению их структурно-функциональной организации. Подобные исследования приблизили бн решение проблемы превращения гриппа в контролируемую и прогнозируемую инфекцию, что позволит разработать эффективные способы профилактики и лечения самого массового заболевания человечества, провоцирующего, как стало известно в последнее ремя, многие соматические и даже психические заболевания ( Haii/ii eta£, 1988} Knight , 19*1. С tow eta£ , шх, Голубев, 1989).

Цель и задачи исследований

Цель настоящей работы заключается в комплексных вирусологических, эпидемиологических исследованиях циркуляции реликтовых штаммов вируса гриппа А, иммунологическом и молекулярно-биологичес-ком изучении их структурно-функциональной организации и выяснении механизмов сохранения вирусов в мелгопидемический период.

Для достижения указанной цели были поставлены 'следующие задачи:

- разработать эффективный способ изоляции вируса гриппа, циркулирующего в межэпидемический периодj

- получить вирусологические и серологические доказательства циркуляции реликтовых штаммов вирусов гриппа А среди людей;

- изучить спектры антител к различным вариантам вируоа подтипа HINI в сыворотках здоровых и больных людей;

- провести иммунологический анализ антигенной отруктуры гем-агглютинин^, нейраминицазы и нуклеопротеидиого балка реликтовых отакмов вирусов гриппа А;

- изучить в сравнительном аспекте биологические свойотва изо-лятов с необычной антигенной структурой;

- и -

- изучить особенности полипептидного состава и генома изолятов;

- изучить особенности биологической активности и структурной организации межзпидемических изолятов;

- разработать диагностические приемы, направленные на индикацию вирусов и вирусных антигенов в межопвдемический период;

- провести моделирование трансплацентарной передачи и индукции медленной гриппозной инфекции реликтовыми вирусами и их компонентами в эксперименте на мышах;

- изучить возможность трансплацентарной передачи вируса гриппа А в.естественных условиях.-

Научная новизна

В результате комплексных вирусологических и серологических исследований в Алмаги впервые установлена циркуляция ранних се-ровариентов вируса гриппа А(НШ - НЗЧ'ХМ и Н0М1), близкородственных, но не идентичных возбудителям гриппа 1910, 1933 гг. по антигенным, биологическим и структурным характеристикам.

Впервые установлено, что вирусы гриппа А (НРД-серо вариант Н0М1), изолированные от умерших детей, представляют собой дрейф-вариант эталонного штамма А/^-^/ЗЗ по антигенной структуре НА иМа и отличаются от него по ряду биологических, структурных и физико-химических характеристик.

Впервые на территории Азии от больных и умерших людей выделены вирусы гриппа А(Н1М1-серовариант В отличие от вирусов 1МТ, ранее выделенных от людей в США и Европе, антигенная структура НА алматинских изолятов практически идентична НА вируса классического гриппа свиней 1930 г. Антигенная структура МА изолятов имеет взаимосвязи сМА вирусов Н1Я1 человека и вклс-• - чает штаммоспецифические детерминанты, что отличает их от эталонных вирусов гриппа Получены новые данные о том, что антигенная структура ЫР изолятов более сходна с таковой ИР эталона к)№ I ^ои^/15/30 и содержит участки комплементарные участкам антигена "хозяина". Установлено сходство "олигонукдеотидных спектров анализируемой части гена НА изолята А/ М/ /15/30 и их отличие от вируса к/М /6/76. При сравнении значительной части генов ИА алмаТинского и американского штаммов обнаружены менее выраженные отличия, чем при срав-

нении первого с вирусом гриппа свиней 30 г. Впервые установлена первичная структура гена гемагглитинина изолята Л&11417/84 и выведена аминокислотная последовательность тяжелой субъединицы. Установлено, что по степени гомологии последовательности HAI алматинский иэолят в большей степени сходен с вирусами гриппа человека (78,8-83,1%), чем американский штамм (75,2-79,10 и значительно отличается (94,2-96,6$) от вирусов гриппа свиней по сравнении с А /¡VJ7C/7& (86,9-69,0$). Однако последовательности .HAI штаммов Hji^lMl, также как и вирусы гриппа человека но содержат потенциального сайта гликозилирования 276-278, характерного только для вирусов гриппа свиней. Впервые выявлено наличие реверсии в антигенно- и функционально- значимом участке и высокая етеленьгомологии современного варианта подтипа HIN 1-/Тайвань/Х/ 86(Tcu/t/86) и изолята ¿¿/М17/М.

Впервые выявлены особенности биологических свойств вирусов Ней'INI, выделенных от человека. Показана корреляция мезду способностью к бляшкообразованш, низкой репродуктивности при повышенной температуре у вирусов, выделенных от больных с поражением ЦНС. Установлена высокая степень эпителиотропности и токсичности изолятов и изолированных глшсопротеиаов. Впервые на белых мышах воспроизведен феномен медленной гриппозной инфекции, индуцированной суммой гликопротвидов и, отдельно,.препаратом нейраминадазы, изолированных из вирусов гриппа Ш^ГМ.

Изучены структурно-функциональные особенности вирусов гриппа, циркулирующих в межэпидемический период,, Впервые показано, что в популяциях межэпндемических изолятов превалируют вирусные частицы со сниженной или отсутствуюцей нейраминидазной активностью, замаскированной гемагглвтинируюцей ективностыз и сохраненной фу-зионной активностьи. Особенностями структурной организации вирио-нов кежэпвдемических изолятов является наличие оиавовых кислот на молекуле гемагглвттшна, отсутствие белков Ш, IL Спектр вирусспе-цифичваких белков, синтезируомнх к 5 часа« посла инфицирования межэпидемическим изолятом вкявчает белки NP» N5IB а гакк® шзко-нолекулярный белок, соответствующий по Молекулярной моосэ дефектному белку ЫВ1.

Практическая ценнооть работы.

Впервые разработаны элективные способы изоляции вируоа грип-

па с низкой биологической активностью, основанный на прерывании инфекционного цикла на ранней стадии и сокультивнровании первично-инфицированных и незаряженных клеток куриного эмбриона, органного трансплантанта,культуры клеток ( Авторское свидетельство № 639941, Авторское свидетельство № '780538).

Впервые разработан способ индикации вируса гриппа с неопределяемой гемагглютинирушцей активностью с помощью гетерологичной нейраминидазы (Авторское свидетельство № I5I0533 ).

Впервые разработан простой и доступный способ индикации вируса гриппа непосредственно в клинических и секционных материалах с помощью отечественного неионного детергента МЭСК (Авторское свидетельство It 1630488).

В Государственной коллекции вирусов депонированы 6 оригинальных штаммов вирусов гриппа, изолированных от болышх и умерших людей (номера депонентов - 1651, 1907, 1999, 2253, 2255, 2266).

На основе авторского штамма А/Алматы/1417/6*1 в лаборатории генетики и вакцинных штаммов fflffl гриппа (г.Санкт-Петербург) получен реассортанткый штамм вируса гриппа, кандидат в вакцинные штаммы, который унаследовал гены, кодирующие внутренние белки от донора аттенуации А/Ленингрвд/и^/ПУВДСНЗНН) и гены, кодирующие поверхностные белки от вируса А/Алматы/1417/84. Реассортантному штамму присвоен депонент № 2285 в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им Л.И.Ивановского РАН г.Москва.

Министерством здравоохранения Республики Казахстан утверждены следующие методические пособия для вирусологов санитарно-эпидемиологической службы и научных учреждений:

- Методические рекомендации "Применение органных культур трахеи цыплят для выделения респираторных вирусов от больных" Алма-Ата, 1979, с. 14.

- Методические рекомендации "Способы повышения эффективности выделения вируса гриппа", Алма-Ата, 1987, с. 13.

- Методическое письмо "Модифицированный метод изоляции вируса гриппа на культуре клеток ЩСК", Алма-Ата, 1987, с. 5.

В научно-техническом информационном сборнике статей "Передовой производственный опыт в медицинской промышленности, рекомендуемый для внедрения", выпускаемом Минмедпромом СССР НПО "Медбио-зкономика" и ВНИИ СЗНГИ, опубликована реклама: "Быстрая индикация гемагглютинируицих вирусов в первичном материале, полученном от

больного", Москва, 1990.

КазНИИНТИ при Госплане Казахской ССР выпущены Информационные липтки: "Способ быстрой индикации вируса гриппа".

Приказом по Министерству здравоохранения Казахской ССР № 485 от 01.06.83 г. на базе Республиканской санэпидстанции проведен семинар по освоению методов лабораторной диагностики вирусных инфекций для врачей-вирусологов областных санэпидстанций.

.Разработанные способы - выделения вируса гриппа методом прерванной инфекции на куриных эмбрионах, органных культурах, модифицированный метод изоляции вируса гриппа на культуре клеток ВДСК, ранней диагностики гриппа о помощью детергента МЗСК, индикации вируса гриппа с помощь» гетерологичной нейраминвдазы - внедрены в работу следующих санэпидстанций и научных учреждений: Республиканской санэпидстанции, Актюбинской СЭС, Джамбулской СЭС, Чимкентской СЭС, Целиноградской СЗС, Семипалатинской СЭС, ВНИИ гриппа (г,Санкт-Петербург), лаборатории микробиологии латентных инфекций НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН, лаборатории диагностики вирусных инфекций, лаборатории иммунологии Института вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН, лаборатории 285 САБО, кафедры инфекционных болезней Актюбинского медицинского института, лаборатории респираторных вирусов НИИЭМИБ МЗ Республики Казахстан, лаборатории экологии вирусов ИМиВ HAH PK.

Основные положения, выносимые на защиту

- Изоляция вируса гриппа путем прерывания инфекционного цикла в куриных эмбрионах или органных культурах трахеи цыплят о последующим сокультивированиэн зараженных клеток с незараженными клетками хорионаллантонса, повышает эффективность выделения меж-эпздемических и межпандемических вирусов..

- Б I98I-I990 гг. в Алматы наряду с актуальными саровариан-тами вирусов гриппа А и В циркулировала и участвовали в этиологии спорадической и сезонной заболеваемости реликтовые штаммы вируса гриппа A/HINI.

- Атипичные возбудителя гриппа в основном поражали молодых лвдеЯ и детей в возрасте до года. Выявлены коррелятивные взаимосвязи обнаружения антигекемии и виремии у поворошенных и родильниц, перенесших грипп во время беременности, с патологией развития плода и новорожденного.

- Вирусы гриппа НОШ, изолированные в марте 1981 г. из секционного материала детей первого года жизни, подобны по антигенной структуре НА и^А эталону k/WStf /33, но отличаются односторонним родством с гликопрогевдами вирусов НТМТ 40-70 гг. и выраженной гетерогенностью популяции по сероподтипу кейраминидазы, так как включают клоны с птичьей нейраминидаэойМ3. Изоляты HQWI и клоны отличаются от эталонных штаммов А/K/'.SW/33 и А/крачка/Туркменистан/18/76 (H5N3) по ряду биологических свойств и структурно-функциональных характеристик, что свидетельствует об их оригинальности и аутентичности.

- Вирусы гриппа HtfuIM, изолированные в 1984-85 гг. из клинических и секционных материалов взрослых и детей, по антигенной структуре НА практически идентична эталону h/Sw/loMd. /15/30. По антигенной структуре нейрамиквдфзы часть изолятор сходна с эталоном вируса свиней, часть - с вирусом А/ //J /8/76. Антигенная • структура NP белка изолягов включает больше опитопов, характерных для вируса гриппа свиней, чем для вируса А/ //J /8/76, а также содержит участки, комплементарные последовательностям клеток "хозяев". Наблюдаются коррелятивные взаимосвязи между штаммоспе-цифическими особенностями антигенной структуры У к и N Р. и степенью тяжести заболевания.

- Сравнительный иммунологический анализ антигенных взаимоотношений медцу НА вирусов HiwENl, выделенных от людей в разных географических зонах, а также от разного вида хозяев свидетельствует об общем генетическом происхоядении и неодинаковых путях эволюции исследуемых возбудителей.

- Изолированные гликопротеиды вирусов HSwIMI повышают проницаемость эндотелия капилляров, обладают способностью вызывать плазмо- и геморрагии, дистрофические, некробиотические и некротические изменения в клетках различных органов, а также индуцировать феномен медленной гриппозной инфекции у мышей.

- Особенностями структурной организации генома и белков ви-рионов изолятов HSVINI являются наличие дополнительного 6 сегмента РНК кодирующего нейраминидазу и большая электрофоретичвская подвижность тяжелой и легкой субъединиц гемагглютинина некоторых изолятов. Олигонуклеотндные спектры гена НА изолятов Н $W INI и эталона A/SU /15/30 практически идентичны. Мезду генами изолятов и эталонов V f^/I5/30 и А/ /8/76 имеются значи-

тельные структурные различия. По степени гомологии аминокислотной последовательности тяжелой субъединицы гемагглютинмна» включая антигенно- функционально- значимые участки, изолят A/AiV 1417/84 более'близок к основным представителям вирусов человека подтипа Н IUI» в том числе к актуальному штамму А/Тайвань/86,.чем эталонный штамм А/ /VJ /8/76. Последовательности HAI алматинского и американского штаммов HWIMI не содержат потенциального сайта гликозилирования, характерного только для Еирусов свиней. Вместе с тем, степень гомологии НА! изолята А/А ^/1417/84 с вирусами гриппа свиней и штаммом А/ W3 /8/76 значительно нике, чем степень гомологии HAI последнего и вируса гриппа свиней.

- В популяциях вирусов, изолированных в мекэпидемический период превалирует частицы с неопределяемой гемагглютинирующей активностью. Причина этого феномена в сиалидизации рецепторного участка гемагглвтинина вследствие отсутствия нейраминидазной активности. Репродукция межэпидемических вирусов возможна из-за сохранения фузионной активности гемагглютинина и протекает по абортивному типу: в основном синтезируется нуоеопротевдный белок, гемаг-глютинин в свободной и связанной форме. Синтез М белка отсутствует, неструктурный белок синтезируется в обычной и дефектной форме.

- Разработанный способ экспреос-диагностики з первичном материале от больного по частоте диагносцирования, чувствительности и подтверждаемости сопоставим о методом иммуноферментного анализа

и позволяет диагносцировать грипп в различные фазы эпидпроцесса, в том числе скрытую гриппозную инфекцию.

- Разработанный способ индикации вируса гриппа о неопределяемой гемагглютинирувщей активностью о помощью коммерческого препарата гетерологичной иейраминвдазы повышает эффективность знделения мэжэпидемичэских и межпандемических (реликтовых) вирусов.

Апробация работы.

Материалы диссертации были доложены на ГУ Всесоюзном биохимическом съезде, г.Мэсхва, 1979 г| на Ш конференции биохимиков Средней Азии и Казахстана, г. Душанбе, 198t r«'j йэнференции вирусологов Казахстана» г.Алматы» 1982 г.5 на III съезде детских врачей Казахстана, Алмати, 1984 г.} на ГУ объединенном съезде гигиенистов, эпидемиологов, микробиологов, паразитологов и инфекционио-тов Казахстана, г.Чимкент, 1985; на итоговой конференции учреаде-

- 10 -

ний АН КааССР -Минздрава КааССР и других ведомств аа 1981 -1985 гг., Алматн, 1986 г„,; 1У конференции биохимиков республик Средней Азии и Казахстана, Ашхабад, 1986 г.,; 11 съезде гигиенистов, санитарных врачей, микробиологов и паразитологов Молдавской ССР, г. Кишенев, 1987 г.; на ХУ111 съезде Всесоюзного общества эпидемиологов, микробиологов и я паразитологов им» Я,И.Мечникова, г.Алматы, 1989 г.; на 1У съезде детских врачей Казахстана, г.Алматы, 1989 г.; на .У Объединенном съезде гигиенистов, эпидемиологов, микробиологов, паразитологов и инфекционистов Казахской ССР, г. Алматн, 1991 г..; на У конференции биохимиков республик Средней Азии и Казахстана, г, Ташкент , 1991 г.; на объединенном заседании вирусологов, эпидемиологов НИИ эпидемиологии, микробиологии и инфекционных болезней ЫЗ РК и Института микробиологии и вирусологии НАЛ РК, 1993 г.

Автор вырахает благодарность за плодотворное сотрудничество научным сотрудникам лаборатории Э.В.Ким1, Л.И.Фурсовой, И.В.Демьяненко, В.П.Толмачевой, 14.Г.Шаменовой, врачам-виру* сологам Республиканской СЭС Р.И.Бондаревой, И.А.Шавриной, ТоА.Перебоевой; сотрудникам Института вирусологии им.Д.И.Ивановского РАИН Е.И.Исаевой, В.А.Исаченко, Е.И.Склянской, С.С. Ямниковой, А.А.Шилову; Института биохимии и молекулярной биологии растений НАН РК А.Б.Беклемишеву и сотрудникам НИИ эпидемиологии,микробиологии ¡1 инфекционных болезней МЗ РК профессору С.Д„йрханову, профессору А.Т.Исиагулову, С.А. Нивткалиевой. Автор вырахает глубокую признательность за консультативную помощь в процессе выполнения работы академику ВЛДданову, академику П.Н.Косякову, академику В.А.Зуеву, доктору медицинских наук 3.И.Ровновой, доктору биологических наук Е.С.Исаевой, профессору Л.Я.Закстельской,профессору ' В.Н.Каверину, профессору М.Х.Муратову.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы.

Клинические и секционные материалы от больных и умерших людей доставлялись в вирусологическую лабораторию Республиканской СЭС иа поликлиник,больниц и прозектур г.Алматы,Изоляцию вирусов проводили на куриных эмбрионах, культуре клеток, органных культурах трахеи цыплят. Идентификацию гемагглюти-

- 11 -

пирующих агентов осуществляли методами, рекомендованными ЮЗ (1982). В работе использовали эталонные штаммы вирусои гриппа из Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН, коммерческие диагностические препараты производства Ленинградского института вакцин и сывороток.

В процессе работы в зависимости от целей были использованы следующие вирусологические, иммунологические, биохимические и молекулярно-биологическиэ методы исследования, рекомендованные ЮЗ (1982): реакция торможения гемагглстинации (РТГА), реакция подавления нейраминидазной активности (РПНА), реакция двойной юшунодиффузии в агаре (РДИД), встречный им-муноэлектрофорез (ВЛЭФ), иммуноферментннй анализ (ИМ), радиоиммунологический анализ (РИА), радиоиммунопреципитация на пленке в НАГ, определение гемагглюгинирующег:, гемолитической, нейраминидазной, инфекционной, бяяшкообразувщей, патогенной, токсической активностей, моделирование гриппозной медленной инфекции, очистка и концентрация вирусов, изоляция, очистка гликопротеидов, нейраминидазы, рибонуклеиновой кислоты (РНК), электрофорэгический анализ вирионных белков, меченных смесью аминокислот вирусспецифических белков, тотальной РНК вируса, цечениа вирусных белков ^ ин витро, олигопептид-ннй анализ вирионных белков, олигонуклеотйдннй анализ сегментов РНК, определение нуклеотидной последовательности гена гемагглитинина, компьотэрный анализ выведенной аминокислотной последовательности тяжелой субъединицн геыагглютинина пэолята и эталонных штаммов.

1. Изоляция и этиологическая значимость реликтовых штаммов вируса гриппа АЛШ1 на современном этапе эволюции возбудителя. 1.1. Разработка способа изоляции вируса гриппа в иахэпиде-

мичэский перидд.

Частота изоляции вируса гриппа в мэаэпидемичеоки© периоды ничтоано нала и несопоставима с такоэой о периоды эпвдо-ции (Лувянина и др.,1986). Трудности с ввдввоииои вируса, по-видимому, связаны с глубокш изменение« его биологических свойств ( 1952). На основании ранее получон-

нцх результатов о накоплении в зарахошшх клетках хорнонал-лантоисннй мембран к 6-8 часам максимального количества ви-

.12 -

русспецифичесхих РНК» гемагглютинина и нейраминидазы (Чувакова, 1971? Исаева, 1974 j Исаева и др., 1976) мы предположили, что использование пула неполностью реализуемых предшественников мало активного возбудителя для заражения новой партии КЗ может привести к усилению его репродуктивной активности. С этой целью свежую аллантоисную культуру (100 ЭВД) или лиофильно высушенный препарат лабораторных штаммов вируса гриппа А вводили в КЗ и в-органную культуру трахеи цыпленка и после инхубации в течение 3, 6, 12 и 24 часов прерывали инфекционный процесс. Гомогенаты оболочек и трахеи инокулировали в КЭ и через 24 часа инкубации определяли гемагглютинирувдую и инфекционную активность в аллантоисной жидкости. Наиболее высокий урожай вирусных частиц собирали в случае прерывания инфекции через б часов после инфекции, при этом инфекционный титр повышался в "[¿5-3 раза при заражении лиофильно-высушенным вирусом, а гемагглютинирующий титр повышался в 10 и более раз в обоих случаях. Принцип прерывания инфекции был применен для повышения выделяемости вируса от больных в 1968-69 и 1974-77 гг. в г.Алматы (табл. I).

Частота изоляции вируса гриппа путем прерывания инфекционного процесса в ХАОН КЭ и ОКТЦ оказалась выше при сравнении с традиционным способом выделения агента, причем в межэпидемический период превышение наблюдаливЗ и более раза. Новый способ позволяет изолировать вирус уже при исходном заражении и не требует дальнейшего "слепого пассирования%что экономит время и средства в 2-3 раза по сравнении со стандартным методом.

Способ прерванной инфекции на КЗ использовали для изоляции вирусов в межэпидемические периоды 1981-86 гг. (табл.2).

1.2. Изоляция реликтовых штаммов вируса гриппа подтипа

HINT в 1981—1986 гг. в Алматы.

• В марте 1981 г. после вспышки гриппа В при исследовании 13 секционных материалов из легких и трахеи детей грудного возраста, умерших от острой респираторной вирусной инфекции (ОРВИ), протекавшей с высокой температурой и судорогами были изолированы 4 штамма вируса гриппа A/HlNI-серовариант HONT. В декабре этого же года при исследовании 127 носоглоточных смывов от больных выделено 6 птаммов вируса гриппа A/HtNl, в том числе 3 штамма серова-рианта HOWt. Последние изолированы от детей в возрасте от 3 до 9 лет с симптомами интоксикации и катаральными явлениями. По анти-

Таблица 1

Эффективность метода прерванной инфекции для выделения вируса гриппа от бсльннх

Метода изоляции : Эпидфаэа

Количество ис следован -ноге материала

Выделено щ таимо в

: Всего :При ис—; После

:-------гхэднои :пассага

: абс, ; % гзаразсе-: :нии :

Серо-подтип

Референе - КЗ 1966-1969 140

Тэст КЗ - - КЗ эпидемия

Референе - кэ и02апидеиичеекий 111

Тест КЭ - КЗ период

Референе - кэ 1974-1975 " 104

Тэст КЗ • - кэ эпидемия

Референе - кэ 1975-1976 183

Тест ОК • - кэ Эпидемия

Референе ~ кэ 1977 81

Тест ОК ■ - кэ эпидемия

Референе КЭ ■ 1982-1983 42

Тест КЭ • - кэ мехэпидемический

периэд

31 40,3 10 21 А/НЗМ2 ^

37 54,2 37- -

9 8,6 0 9 А/НЗИ2 '

32 28,6* 32 -

19 18,2 8 11 А/НЗМ2

29 27,8 29 -

19 10,0 8 11 А/НЗИ2

36 19,0 36 -

5 8,1 3 2 тип В

12 14,9 12 - А/НЗМ2

2 4,7 _ 2 А/Н1М1

17 40, 4 17 - А/НЗЫ2

Таблица 2

Антигенные варианты вируса гриппа, выделенные в Алматн в 1981-1986 гг.

Год

Месяц,фаза эпидпроцесса

Источник выделения

Изоляты с антигенной структурой ГА Актуальных штаммов: Атипичных штаммов

Н1

НЗ

:Н 1

НО : XI-

п од об нах эталонам

А/Рй/З 4: А/^З/ЗЗ*: А7ГЙ/Ъ~ЛАч$/ 56

1981 январь-февраль эпидемия В март.постэпи-деыический декабрь, эпидемия Н1М1

1982 акт-ноябрь иежэпид. декабрь.подъем заб-ти

1983 январь.подъем заб-ти март-апрель ыехзпйд. период май.мехэпид. иень-иель, мехэпид. период

декабрь,подъем заб-ти

смыв

еекцион. материал

смыв 4/Iх

еекцион.

материал

еекцион.

материал

емнв

смыв,еекцион. мате- х риал 1/1

смыв

смыв,кровь

секцией.

материал

смыв.секц.

материал

29

2/2* 3/3*

1/1х 2/2* 3/3Х

2/2х

. 3/1*

2/2* 3/3Х

3х

-е-(

272х

Зхх

1

2 : 3 : 4 : 5 : 6 : 7 ; 6 : ' 9 : 10" : 11

1984 январь-иар? эпидемия Н1,В август-сент. мехэпид.период

онтябрь-дэк. подъем эаб-ти

1985 'янаарь-мапт эпидемия Н3м2

апрель,ые*эпид. декабрь, подъем ааб-ти

1986 янваоь-март

. эпидемия НЗМ2 • апрель мехэпид. октябрь, подъем заб-ти

ЙУЙЙ1эпвде"

смыв секц.мат. диквор

смыв смыв яиквор сэяц.матер, секц.матер.

секционный материал

смыв

кровь

смыв

смыв

б/г*1 з/1хх 6х

3/3

1/1хх о

4/4хх 21 4х

1/1ХХ 1/Г

2х

21

1/1*

хх

1/1хх 2/1хх

I

ся

Примечание: числитель-число иэолятов,

знамвматель-в том числе миксты,

х - метод прерванной инфекции,

хх - метода стандартной и прерванной инфекции.

генной структуре НА и МА штаммы ШМ, выделенные из секционных материалов были подобны эталонному вирусу А/ М^М /33, а штаммы, изолированные из смывов - эталонному вирусу А/РР/б/З'к Один из штаммов представлял смешанную популяцию вирусов, сходных с А/РЕ/ 8/34 и А/Англид/333/80(Н1Ы1), из которой был отклонирован вариант, подобный А/РР/8/34. В указанные периоды наряду с заражением КЭ, инфекционный материал вводили в культуру фибробластов цыпленка, при этом совпадение положительных и отрицательных результатов по гемадсорбции и выделению вируса было 100$, что свидетельствовало об отсутствии контаминации из возможно естественно инфицированных эмбрионов. Идентификация вирусов осуществлялась в Институте вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН.

В межэпидемический период с марта 1982 по июль 1983 гг. при вирусологич-еском-обследовании 42-секционных и 37,клинических материалов было выделено 23 гемагглоптирующих агента, из которых 17 изолированы методом прерванной инфекции, б - новым и традиционным способами. Штаммы, изолированные до декабря 1982 г.'хорошо размножались в КЭ, имели морфологию, характерную для свежевиделвилы х вирионов. У грех штаммов антигенная структура гемагглютинина была родственна эталону А/ГМ/Т/47 до 1/4 гомологичного титра. Из них два штамма с высокой инфекционной, гемагглютинирующей, нейра-минидазной активностью представляли собой рекомбинант, так как обладали нейраминидазой, сероподтипа N2, что было определено в РПНА и РДВД с сывороткой к рекомбинантному вирусу В - (Не^ 1М2).' Третий штамм с низкими показателями биологической активности содержал нейраминидазу сероподтипа N1. Штаммы, выделенные в зимний сезон 1982-1983 гг. плохо адаптировались к КЗ, имели низкую гемаг-глютикирующую и нейраминидазную активность, обладали резко выраженными токсическими свойствами. Поскольку на первых пассажах титры РГА не превышали 1:2, предварительную идентификацию выделенных «тентов осуществляли в РДИД и ВКЭФ (рис. I). Изоляты преципи-тировались сыворотками к вирусам ШМ и НЗН2, но не давали полос преципитации с сыворотками к подтипам Н2М2 и типом В. Электронное микроскопирование препаратов изолятов показало преимущественное наличие полиморфных частиц с разрушающимся поверхностным слоем шипов. Только после 10-20 пассажей изоляты приобретали генагглю-тинирующий титр и нейраминидазную активность, достаточные для идентификации в РТГА и РПНА. Было установлено, что изоляты от

Рис. I. ДВД и ВИЙ свежеизолированных гемагглютинирущих агентов со стандартными противогриппоэнши сыворотками к вирусам гриппа (а А/ШкляверДбСНШ), (б)_А/Хабаровск/77(Н1М1)" (в) А73иктория/75(Н31\2), (г) В/Япошш/77. -

tД^ад:в центральной лунке - цельная антисывсротка,в пещ-ерических лунках исследуемые агенты: I - М2/82, 2 - МО/62, - №13/92, 4 - ГЛ1/62 ,Б - М4/83, Ь - »15/83, >1 - норзальная аллактоисндя икдкость, 3 - физиологический раствор.

ВИЗ»: I - л-нсслодуеггш агенты, покера ю го Л - аиткскво-ротка цельная, II - антисыворотка в разводонки 1:1.

/

детой раннего возраста представляют собой смешанную популяция вирусов, подобных эталонны« А/Р5/8/34 и А/ Шанхай/1/80СШ2). При этом три микста изолированы из смывов из носа грудничков во время

вспшки гриппа в доме ребенка № 2, а два - из секционных материалов младенцев умерших от ОРВИ и внутриутробной пневмонии. Ранней весной 1983 г. из секционных материалов детей были выделены 2 штамма» подобные эталону А/СССР/90/77(НШ1), из смыва ребенка -микст вирусов, подобных эталонам А/СССР/90/77 и А/Шанхай/1 /80 (НЗЫ2). Период с конца апреля по июль 1983 г. характеризовался циркуляцией среди новорожденных и их матерей смешанной популяции вирусов, подобных эталону А/Нидерлавды/1/56(Н1М1) и А/Еанхай/1/80. Указанный микст вирусов был этиологическим фактором вспышки гриппа в роддоме № I и доме ребенка № 2, а также причиной летальных исходов трех новорожденных детей с диагнозом: "внутриутробная пневмония".

Сравнительный анализ результатов клинического, патанатомичес-кого и вирусологического обследования умерших детей показал, что вирус был выделен в значительном проценте случаев летальных исходов 0*0,2$). В некоторых материалах с отрицательным результатом вирусологической диагностики клиническая и патоморфологическая картина была типичной для токсической формы гриппозной инфекции. В этой связи было проведено вирусологическое исследование крови матерей с постнатальной гибелью новорожденных в результате внутриутробных инфекций. К-ва, 20 лет - через один и два месяца после родов выделена смешанная популяция вирусов, подобных А/РК/8/34, А/Нвдерлавды/Е/56, А/Шанхай/1/80, аналогичная изоляту из легких и трахеи ребенка, С-ер. 27 лет - через год после вторых родов с гибелью новорожденных дважды с месячным интервалом выделена смешанная популяция вирусов, подобных эталонам А/Нвдерланды/35/5б и А/Шанхай/31/80. Б-ва, 40 лет - в крови обнаружены гриппозные антигены А/Шанхай/31/80 и типа В, последний изолирован на КЭ, в анамнезе 2 родов с постнатальной гибелью детей. К-ва. 25 лет - через 5 месяцев после родов из крови выделен вирус, подобный /15/

' 30, В анамнезе постнатальная гибель плода, из легких и трахеи которого изолирован вирус с аналогичной антигенной структурой. Х-ва, 32 лет - спустя 3 месяца после родов в крови методами Шк и в детергент-тесте обнаружены гриппозные антигены вирусов А/Р8/8/34, А/Чили/1/83 и А/СССР/2/85 и изолирован вирус, подобный эталону А/Чили/1/83. Б сыворотке методом Ш>А и РТГА обнаружены антитела к вирусу А/СССР/2/85(НЗМ2). Исследованные женщины страдали частыми катарами верхних дыхательных путей без повышения температуры,

имели астеническое телосложение. Одна из матерей (С-ер) была направлена нами на обследование и лечение в Институт иммунологии МЗ СФ по поводу иммунодефицитного состояния и после соответствующей терапии родила здорового ребенка.

Дальнейшие исследования были направлены на получение доказательств орансплацентарной передачи антигенов/вирусов и выяснение этиопатогенетической роли антигенемиц/виремии в при-и постнаталь-ной патологии. В 1988-1990 гг.-проводилось вирусологическое исследование 122 проб плацентарной и пуповинной крови родильниц с неоднократной угрозой прерывания беременности, перенесших во время беременности грипп и ОРЗ, а также секционного материала мертворожденных и новорожденных (94 пробы) с диагнозом внутриутробная вирусная инфекция и пневмония. В детергент-тесте гемагглютинирующий антиген был обнаружен в 40,9$ случаев в пробах плацентарной крови и в 22,9$ - пуповинной кровц, взятых в третьем периоде родов. Совпадение положительных находок в крови родильниц и новорожденных наблюдалось в 13,9$. Из положительных на гриппозный агент образцов вирус удалось изолировать в 66$ из плацентарной, в 89,2$ - из пуповинной пробы крови. Наиболее высокий процент изоляции был при заражении КЗ пробами, положительными и у матери и у ребенка (94$). ИЗ 16 изолятов два штамма идентифицированы, как подобные А/Брази-лия/П/78(ШМ), 5 штаммов - А/§илшпиныОШ2), один штамм - А/РД/ 8/34, Остальные иэоляты представляли собой миксты актуальных и реликтовых штаммов вируса гриппа А и типа В. При исследовании 94 секционных материалов гемагглютинирующий антиген обнаружен в го-могенатах легочной и трахеальшй ткани в 38,вирус же был изолирован из 11,1% проб. Из II идентифицированных изолятов б штаммов были подобны эталону А/ЗК' /15/30» остальные представляли смешанные популяции вирусов, подобных этому же эталону и А/Н3№2. При сравнении групп родильниц о отсутствием и наличием гриппозного антигена в крови выявлено, что показатели патологии беременности, родов, плода и новорожденного ^в контрольной группе женщин существенно ниже, в особенности, по сравнении, о группой, где выявлена трансплацентарная передача вируса плоду (табл. 3).

Изучение катанамнеэа I года жизни детейг родившихся от мате-рей-вирусоносителей показало, что у 70-1005? таких детей наблюдается та или иная патология. В этой связи нами совместно с клинической лабораторией Института хирургии МЗ РК проведено вирусологи-

Таблица 3

Патологические последствия персистенции и трансплацентарной передачи В1фуса гриппа от матерей с неоднократной угрозой прерывания беременности

Виды патологии

: Наличие патологии в следующих группах исследования*£

: I-контрольная, от-: П-антигенемия : 111-антигенемия :сутстаио антиге- г только у родиль- :одновременно у ро-гнемии у родильниц:ниц,34 пары гдияьниц и новорож-549 пар ; гденныхДб пар

В анамнезе матерей:

ТоксйкбЗ-—

Пиэлонефрит Тяжелый гестоз

Угроза прерывания беременности Выкидыши,мертвороаде ние

У родильниц: Преждевременные роды с гестационным периодом 31-32 недели

33-35 недель

Многоводие

Преждевременное излитие вод Кесарево сечение У новорожденных; Сосотояние по нкаде Апгар-тяжелое

средней тяжести

Внутриутробная гипотрофия Енутриутробная пневмония

Катамнез Т года жизни ребенка: Диатез, аллергии

Гнойновоспалителыше заболевания Заболевания верхних дыхательных путей Пневмонии, бронхиты

Неврологические заболевания__

36.7 нет нет ' 24,4

20.4

48.8 6,1

28.5 нет 10,2

4.0

6Д 28,5 10,0

6.1

6Д нет 6Д нет 2,0

нет

27,7

нет

48.0

37,0

38,0 7,2 12,0 22.0 12,0 7,2

16,6 25,7 18,0 16, б

30.0 20'0 28,0

9^0 •

18.1

не*

12,5

31,5

37,5

35,3

68,7 25,5

43.2 12,5

35.3 12» 5

29.4

69.7

58.8 55,0

29,4 82,3 64,7

м

8

Число детей с патологией

Г0,0

70,0.

100,0/

Таблица 4

Никробно-вирусные ассоциации,выделеннне от детей с хроническими неспецифическиыи заболеваниями легких.

Виды микробов и вирусов

ВИ£усьг_($)_

Грипп А '.Грипп В ¡Парагрипп:Адено-:РС-вирус ___2____:_____1____

Стафилококк эпидермальннй

Стафилококк

Стрептококк

Нейссерии

Пневмококк

Гемолитические бактерии

Дрожжи

Грамм (-)

Грипп А

Грипп В

Парагрипп 3

Аденовирус 3

РС-вирус

32 9 11 23 13

8

8 2 5

4 2

2 2

ческое и микробиологическое исследование 52 детей" з возрасте от I до 16 лет с хроническими.неспецифическими заболеваниями легких (ХНЗБ). В 69$ проб крови обнаружены гемагглютинирующие агенты, в том числе: грипп А и Б - 52%, -парагрипп - 5%, аденовирус - 1%, РС - вирус - Вирусы гриппа идентифицированы как ЮМ2 - у 12 детей, НШ1 - 2, Н(М - I, миксты Н4» Ш+НЗМ1 - 2, НЗЩМЬ-Н(М - I,. Н0Ы1+НЗЬ»2 - I, НЗЫ2" Гш'г> тип Б - I, НОЩ+РС * I. Вирусы в больпинстве случаев обнаруживали в,ассоциации о микроорганизмами (тайл. 4).

Результаты диагносцирования микробно-вирусных ассоциаций свидетельствуют о наличии у большинства детей с ХНЗБ латентной гриппозной инфекции, обусловленной "¡актуальными и реликтовыми возбудителями.

Таким образом, при вирусологическом исследовании крови

матерей и детей получены прямые доказательства трансплацентарной передачи вирусов гриппа с различной антигенной структурой НА и N А и выявлен контингент риска, связанный с антигенемией и вире-мией.

В ноябре-декабре 1983 г. в период отсутствия эпидемического подъема заболеваемости гриппом, от людей с диагнозом "грипп" и "ОРЗ" были выделены 3 штамма вируса гриппа с гемагглютинином НЭЛТ. М-ов, 65 лет - заболел внезапно 12 ноября, умер 14 ноября. Основные симптомы заболевания: приступообразные резкие боли в животе, задержка стула, газов. Клинический диагноз: "Острый тромбоз мезентериальшх сосудов. Гангрена тонкой кишки. Разлитой серозно-геморрагический перитонит. Интоксикация", йммунофлуоресцентный анализ кусочка легкого выявил наличие вируса гриппа А. Паталого-анатомический диагноз: "Грипп. ДВС синдром. Острая сердечно-сосудистая недостаточность". М-ва, 10' лет - заболела внезапно 16 де- . кабря. Основные симптомы заболевания: высокая температура, кашель, интоксикация. Клинический диагноз: "ОРВИ". В сыворотке на 3 день болезни обнаруживали антитела к изоляту в титре 1:20, на 7 день и через 3 месяца антитела отсутствовали. Р-ин, 27 лет - заболел внезапно 16 декабря. Симптомы болезни и диагноз, как у М-вой. Выделенные штаммы имели гемагглютинин, антигенно идентичный вирусам /15/30 и А/Л«* ¿¡^/8/76. Поскольку изоляция от людей вируса, сходного с вирусами гриппа свиней носит казуистический характер, нами было проведено эпидемиологическое исследование выявленных случаев гриппозной инфекции. Установлено, что больные М-ва и Р-ин контакта со свиньями не имели. М-ов работал в мя-соконсершм комбинате и содержал свиней в домаинем хозяйстве. Серологическое исследование 50 рабочих мясокомбината выявило наличие антител в низких титрах к гемагглютинину Н5М в 34$ случаев от лиц, родившихся после 1931 г. В сыворотках двух рабочих обнаружены антитела к изоляту также в низких титрах. Радиоиммунологический анализ сгустков крови выявил в одном :,иэ образцов гриппозный антиген НйИ'Т и в 4 образцах - НЗ. Иммуноферментным методом был обнаружен только антиген НЗ. При сопоставлении результатов РТГА, РИА и ®А оказалось, что отсутствие антигенов НЗ, Н1 и В коррелировало с высоким уровнем антител к этим вирусам, и, напротив, в образцах сывороток с йизким содержанием антител к вирусам

- 23 -

HSWINI и H3N2 соответствующие антигены обнаруживались.

В период эпидемической вспышки гриппа (январь-март 1984 г.) при исследовании 407 смывов из носа выделено 12 штаммов вируса гриппа HINT, три штамма H3N2, один микот - H3N2+HINI, б штаммов типа В. Наряду с актуальными штаммами обнаружено 4 изолята, подобных по антигенным свойствам генагглютинина эталонному свиному варианту kjSW/Chvdi 15/30. Зти вирусы были выделены от молодых людей 19-23 лег, не контактировавших со с&иньями.

В межэпидемический период (август-сентябрь 1984 г.) изолировано два штамма вируса гриппа, подобных эталону-А/^йу/Й?«^ 15/30. Штамм А/Алматы/1367/84 (Л?/Х367/84) выделен из легких и трахеи женщины 47 лет с диагнозом: "Грипп, абдоминальная форма". Методами РИА и И#А в кусочках органов обнаружены антигены HSWINI и H3N2. Заболела внезално, основные симптомы: интоксикация, "острый живот", умерла на третьи сутки после начала заболевания. Контакта со свиньями не имела, среди окружающих заболеваний 0P3 не было. Штамм А/Алматы/1382/84 изолирован двавды в I месяц с интервалом из сгустка крови 30-летнвй женщины, страдавшей частыми заболеваниями верхних дыхательных путей. В момент взятия крови женщина была практически здорова, среди окружающих ОРЗ на наблюдалось. В сыворотка этой же крови обнаружены антитела к эталону HS^i и изоляту/4Е/'1367/84 в титрах 1:20-1:40.,В исследуемый период методами РИА и ШК в сгустках крови 25 здоровых лиц 20-50 лет в 8%

случаев выявлены микста антигенов HSW INI и H3N2 (табл. 5).

ТУ квартал 1984 г. характеризовался подъемом сезонной заболеваемости ОРЗ и изоляцией б штаммов вируса гриппа HSt'STM. Один штамм выделен из легких и *фахеи мужчины 46 лет о клиническим диагнозом: "Аппендицит с явлениями перитонита"» Пагалогоанатоми-ческий диагноз: "Грипп, ДВС-сивдром". В кусочках органов методами РИА и ШК обнаружены гриппозные антигены HSWIKII и H3N2. Три штамма 1414, 1415 и 1416 выделены из носовых смывов детей I-I3 лет, : один штамм А/Алматк/1417/84(АЕ/1417/84) - из нооового смыва пациента 26 лет о симптомами, характерными для ОРВЙ. Штамм А/Алматн/ 247/984(^/247/84) выделен из. сгустка крови 18-летней девушки о диагнозом: "Серозный менингит". В сыворотке ее арови» взятой э начале заболевания, выявлены антитела к оталону и изоляту Н&Л в титре 1:160 и 1:80 соответственно. В пробах сыворотки, взятой через I и Э месяца (срок пребывания в стационаре), антигемагглвти-

- ги -

Таблица 5

Радиоиммунологический и тшуноферментнцй исследования (РИА и ИМ) ыатериалвв от людей

Срок наблюдения

Исследованный материал

Антиснворет-ка к серова-риантам

Количество положительных находок

РИА :

"абсТ " % ~ абс."

1984 г. Сгустки HSW1N1

сентябрь крови адоро- H0N1 вого населе- HIN1 ния H2N2

НЗК12 В

Изалят 1367, HSW.N1 легкие,трахея Н0Ц1

H2N2 H3N2 В

Иаолят 139 5, HSW1N1 легкие,трахея H0N1 H1N1 H2N2 H3N2 В

1984 г. Сгустки HSW1N1

1У квартал крови больных H0N1 (сезонный гриппом Н1Ы1

подъем забо- H2N2

леваемости) H3N2-

2/25 8 2/25 8

0/25 О 0/25 О

0/25 0 0/25 О

0/25 0 0/25 О

0/25 0 0/25 О

0/25 0 0/25 О

+

+

НС

+ +

4/18 22.2

0/18 Ö

0/18 О

0/18 О

1/18 5.0

0/18 б

Примечание: числитель - число положительных находок,

знаменатель - числе исследованных образцов, + наличие гриппозноге антигена, - отсутствие гриппвзного антигена, НС - не ставили аналиэы.

нины не обнаружены. Исследование в этот период методом ИФА сгустков крови 18 больных гриппом и ОРЗ выявило наличие гриппозных антигенов НЗИ'ШГв 22,2{£, НЗЫ2 в 5% случаев. .

В период эпидемического подъема заболеваемости гриппом (январь-март 1985 г.) из 512 смывов из носа были выделены только вирусы сероподтипа НЗЫ 2 (33 атамма). При исследовании 5 секционных материалов детей, умерших от гриппа, изолированы 2 штамма

+

+

вируса, подобные А/СССР/90/77, с низкой биологической активностью. Один штамм, подобный эталону и изллятам HSWINI, выделен из спино-мозговой жидкости новорожденного с энцефалопатией, мать которого перенесла грипп в I половине беременности.

В межэпвдемический период (апрель 1985 г.) из секционного материала мужчины 64 лет о диагнозом: "Гриппозная пневмония" - изолирован микст вирусов» подобных A/SW /15/30, А/РЕ/8/76 и типа В, контактов умершего со свиньями не отмечено. В декабре этого же года (сезонный подъем заболеваемости) из секционного материала мужчины 78 лет, умершего от гриппозной пневмонии, изолирован вирус, подобный А/РД/8/76. Одновременно, из секционного материала девуи-ки 20 лет с диагнозом: "Грипп" выделена смешанная популяция вирусов, подобных А/РВ/8/34 и А/Филиппины/2/82(НЗМ2). В период эпидемической вспыики (январь-март 1986 г.), вызванной актуальным штаммом А/$илиппины/2/82, из смывов больных 20-25 лет выделены два штамма, подобные HSwINI и один штамм, подобный A/PR/8/34. В октябре 1986 г. в период перед эпидемией, вызванной штаммом А/Тайвань/ 1/86(HtNl), из смывов пациентов 19 и 26 лет с диагнозом "Грипп" изолированы два штамма, подобные А/ SW /15/30. В парных сыворотках больных зафиксирован диагностический прирост антител к указанному сероварианту и к изоляту HSWINI. Контакт со свиньями больные отрицают» Для тяжелых случаев гриппа о летальным исходом были характерны резкие патоморфологические изменения практически всех важных систем организма. •

Таким образом, проведенные вирусологические исследования показали, что в течение периода наблюдений среди людей, наряду с актуальными штаммами вирусов гриппа А, циркулировали и участвовали в этиологической структуре заболеваний и летальных исходов варианты сероподтипа HINT, подобные эталонным штаммам A/WS /33, А/РД/8/34, А/ SW /15/30, A/FH/3I/47, А/Нвдерлаады/56, А/СССР/90/ 77. Нередко реликтовые штаммы изолировали от одного индивидума в составе смешанных популяций с современными атаммами, что в отдельных случаях привело к изоляции вируса-рекомбинанта HIN2.

Для подтверждения аутентичности реликтовых изолятов вируса гриппа А и изучения их эпидемиологической значимости а период с 1984 по 1986 гг. проводились серологические исследования больных и здоровых лиц.

- 26 -

1.3. Значение циркуляции реликтовых штаммов в эпидемиологии

гриппа в г. Алматы.

В осенне-зимний сезон I984-T985 гг. -период подъема заболеваемости с последующим переходом в эпидемическую вспышку - проводилось серологическое обследование 288 больных гриппом, ОРЗ и ОРВИ (рис.2). В ноябре-декабре серопозитивные к вирусу HSWINI сыворотки больных не всегда характеризовались диагностическим приростом, хотя и содержали антигемагглютинйны в высоком. титре, что свидетельствует о свежеперенесенной инфекции. Так, иммунный ответ в PTFA к HSWINt в титре I : 320 был зарегистрирован у 4 пациентов 10, Г8, 19 и 39 лет в острый период болезни. При исследовании парных сывороток наблюдали наибольший процент £22,1$) положительных сероконверсий к гемагглютинину HS*T. Он включал: изолированный диагностический прирбст. антигемагглютйнинов к свежевы-деленному изоляту А/Алматы/84 в 10,4$ случаев, к эталонному штамму A/-SVC/15/30 в 5,5$, одновременно к обоим штаммам - 6,2% случаев. В 14,0$ случаев имела место сероконверсия к вирусам А/СССР/ 90/77 и A/SW /15/30. Б последней декаде декабря 1984 г. и первой декаде января 1985 г. число сывороток с диагностическим приростом антител ко всем исследуемым штаммам сероварианта HSWINI возросло до 35,0$. При подсчете на ЭВМ среднегеометрических титров антител в парных сыворотках больных этого периода установлено, что число больных с положительной сероконверсией статистически достоверно С >2,0). Зго свидетельствует о том, что серовариант HSWINI был ведущим этиологическим фактором заболеваемости в это время. В основном регистрировали синхронный прирост титра анти-гемагглютининов к эталонным и изолированным штаммам в различных комбинациях (рис. 3). В некоторых случаях изолированное нарастание антител наблюдали лишь к изолятам A6/I4I7/84 и AE/I382/84, что указывает на их превалирование в данный период. При изучении характера положительных сероконверсий в парных сыворотках с синхронным подъемом антител к эталонам и изолятам HSWINI, H3N2 установлено,что в большинстве случаев в 1-х сыворотках антитела отсутствовали, а во 2-х сыворотках появлялись в низких титрах.При использовании в качестве антигена эталона H3N2,титры антител в парных сыворотках превышал« таковые с изолятом H3N2 в несколько раз. В парных.

сыворотках с подъемом антител к. вирусам типа В, при использовании

Рис« 2. Частота диагностического прироста антигваагглвтининов против различных серовариантов вирусов гриппа А и В в .сыворотках крови больных в. осенне-зимний период 198^-1985 гг. 1 - к Ш»Лю /15/30, 2 - к изоляту 1417/84 СНБЛ'^ 1),

3 - одновременно к изоляту, 1417/64 и к^тм. СМ* а. /15/30. 4 - к А/СССР/ЭО/77, 5 - одновременно с А/СССР/90/77 и /15/30, 6 - к А/Филиппинн/2/82,

7 - к В/СССР/100/83. 8 - одновременно к А/СССР/90/77 и А/Филиппины/2/62, 9 - к изоляту 236/85{НЗМ2), 10 - одновременно к изоляту 236/85 и А/£илиппинн/2/82, а « квартал. 1984 г,-, б - 1-я декада января 1ЭВо г., в - февраль 1985 г., по оси ординат - процент сывороток с диагностическим приростом антител.

Рис. 3 Процентные соотношения положительных сероконвэр-сий к эталоннны и изолированный штаииаи ' Ц) 1 в сыворотках

в качестве антигена.изолят вируса В наблюдали более высокие титрн антител, чем при использовании эталона В, при этом в 1-х сыворотках всегда присутствовали антитела. Полученные наблюдения, по-видимому, указывают на го, что близкие по антигенной структуре гем-агглютинина .сероварианты типа В постоянно циркулируют среди людей. Антигенный дрейф гемагглвтинина НЗ более выражен, чем у гемагглю-тинина вируса типа В, поэтому иммунный ответ к изоляту НЗ слабее, чем анамнестический ответ к эталону НЗ. Что касается исследуемых серовариантов Н5К/1Ы1, то судя по слабой выраженности ответа к эталону, а также отсутствию антител в 1-ой сыворотке, данные Серова» рианты не имеют тахого широкого распространения, как актуальные штаммы вирусов А и В.

Изучение степени участия атипичных штаммов вируса гриппа в этиологической структуре заболеваемости и их эпидемиологической значимости продолжали в различные фазы эпидпроцесса в 1986-1987 гг. (табл. 6).

/ Таблица 6

Серологическая диагностика гриппа, вызванного атипичными вариантами вируса подтипа H1.N1 в 1986-1987 гг„ в Алматн.

Периед обследования

Фаза зпвдпрб-цесса

К-за иссдэ-: А/йШШ

дованных па:--------

рных сыво- :Среднегео- :Т-до~; роток .'метрические ;сто- ;

:ти?рн оаво-:вер- : : роток_:ность

А/Е0Н1

ТГ

% :Среднегео- ;Т-до-: % се-.'метрические:сто- -се-ро-:?итрн сыво-:вер- :ро дон:роток ^ :ность;кон-

:вер: :сии:

X

ТГ

:вер-:сии

го хо

1986 г. январь

февраль-

март

иай-

ионь

октябрь

ноябрь-декабрь

январь февраль

1987 г.

Предэпидомический период Эпидемия тип В

Мехэпидемич ас-кий период Предэпидеыичее-кий период Эпидемия А/Н1Ы1

Постэпидемический период

30 ■ 0 0 - - 0,99

.88 30 30 0,65 1*83 Ф 0^70 & 0,64 8 ;8 6,9 2,52 х!:? 1:8?

'58 2,26 2,31 0,10 10,3 2,15

203 1,32 1,58 0,68 15,7 1,75

32 27 0 0,50 0 0,31 0 0,55 0 1,30 0 1,75

1,83

8г

16,7 4,5

ад

12,1 21,0

15,6 29,6

В РТГА с коммерческими диагностиками исследовали 512 парных сывороток крови от больных детей. Статистическую обработку полученных данных осуществляли на ЭВМ (табл. 6). В предэпидеми-ческий период (январь 1986 г.) в сыворотках больных количество положительных сероконверсий к диагкосгикуму H0MI составляло 16,7$, к HSV4INI - не было выявлено. В период эпидемии гриппа В количество сывороток к диагностикуму H0NI упало до 4,5$» а к диагностику-му HSWENI выявлено в 6,9? случаев. В мае 1986 г. зарегистрировано равное количество случаев заболеваний с приростом антител в сыворотках к обоим серовариантам. С июня по декабрь 1986 г. количество больных с сероконверсией к HSWINI увеличилось до 12-17$ от общего числа обследованных больных. В предэпидемическом периоде (октябрь I98C г.) в три раза возросло число положительных сероконверсий к H0NI. В период эпидемии A/HINI число сывороток с диагностическим приростом антител к H0NI достигло 21,а в кон- . це постэпвдемического периода - 29,6прироста антител к H$W[NI не обнаруживали. При подсчете среднегеометрических титров антител к атипичным штаммам установлено» что число лиц с диагностическим нарастанием титров антител к этим вариантам недостоверно ( <2»0). Полученные данные свидетельствуют о том, что в 1986-1987 гг. возбудители заболеваний - вирусы H0NI и HSWINI не обладали эпидемической потенцией. В 1984 :- 1986 гг. проводили сероэпидемиологичес-кие исследования здоровых лиц, в возрасте 18-50 лет - доноров, студентов, работников мясокомбината, электротехнического завода, хлопчатобумакного и мехового комбинатов. В РТГА с широким набором вирусов гриппа А и В исследовано 678 образцов сывороток (табл. 7). Спектрантигемагглютининов к подтипу Н INI включал преимущественно высокие титры к штаммам A/FtVl/47, А/СССР/90/77, А/Дунедиц/б/83; средние - к А/$укушима/1031/78, низкие титры-к "тупиковому" вирусу А/Денвер/56 и реликтовым вариантам HSWINI и H0NI. Изолированный иммунный ответ к HSS/I обнаруживали в осенне-зимние месяцы, к A/X/SW/33 - преимущественно в марте. Антигемагглютинины к вирусу А/РЕ/8/34 выявляли на протяжении всего периода исследования, причем в значительном проценте случаев иммунный ответ был штаммо-специфическим, максимальная частота положительных случаев выявлена в феврале 1986 г. Чаще всего (до 100$) обнаруживали антитела к вирусу A/FM/IA7, максимальное число положительных находок

Таблица 7

Частота обнаружения изолированного шыунного ответа на геиаггл!этинин атипичных вариантов вируса гриппа H2.N1 в сыворотках здоровых лиц

Период исследования

Коли- ; Антигшагглюткнины к вирусам {%)__

400720 *""" """ """ ™™

ис с Л 0 -: а15/30^ к/Ш_Ы/33___А/Рй/8/34

снворо* изолированный ответ к числу

тоа :исследо-:поло- :исследо-:поло- ;исследо-:поло-гванных :хитель-:ванных :хитель-:ианных :аитель-:сыворо- :ных на-:снворо- :ных на-:сыворо- :ных на-;ток . :ходок :тон _:ходок _:ток _ :ходок_

А/РМ/1/ 47

:иеследо-:поло-:ванных :житсль-¡сыворо- :них на-:ток ;ходок

I

1984 г»

•ларт 50 13,0 52,9 6,0 10,7 2,0 5,0 26,0 27,6

иай 67 0 0 ' 4,4 '14,2 8,9 37,5 19, 4 30,2

август 57 5,2 33,3 3,9 16,6 7,0 22, 2 24,5 32,2

сентябрь 27 14,8 66,6 ' не НС 3,7 33,3 НС не

1385 г.

февраль - 120 ' 0 0 НС НС 2,5 20,0 6,7 7,3

март 30 3,3 33,3 НС НС 6,2 50,0 0 0

цай 45 ' 0 . 0 не НС 6,6 42,8 82,2 1 82,2

ивнь 44 0 • 0 НС . НС 13,о 50,0 24,3 30,0

декабрь 30 3,7 12,5 НС НС НС не 20,0 16,6

1986 г.

февраль 130 . 0 0 НС НС 33,3 60,0 но НС

март 78 2,5 16,6 НС не 6,6 20,0 32,6 45,7

изолированного иммунного ответа (82%) зарегистрировано в мае 1985 г. Наличие низких титров антигемагглютининов в HSttt' не всегда обозначало реагирование за счет общих антигенных детерминант подтипа HINT (табл.8). Так, при детальной анализе спектра анти-гемагглютининов 13 донорских сывороток с высокими тирами антител к H0NI, в б из них, взятых от лиц родившихся .ранее 1940 г.-, присутствовали антитела к HSWWI в низких тиарах, что вероятно является следствием анамнестического ответа. В пользу свеяеперенесен-ной инфекции H0NI свидетельствуют! высокие титры антител, наличие изолированного штаммаспецифического ответа, так как в одних сыворотках выявляли положительный ответ к K/WSN/33, а в других к А/РК/8/34. Использование в PÍTAb качестве антигенов двух эталонных и 9 изолятов HSW{HI позволило*обнаружить втаммоспецифичность ; иммунного Ответа к атому сероварианту вируса. Наиболее часто встречались антитела к штаммам А/N^ /8/76 и А/Алматы/1367/84 (свыше 50t от общего числа положительных находок HSv^INi), в 20*40$ случаев обнаруживали антиг ем агглютинины к штаммам к/ Ai /mV&t, А/ /1382/84, к/ Ai /1135/83 и болгароким штаммом HSV^TNI, до 20# находок свяааны о наличием антигемагглютининов к штаммам А/ SW /15/30, А/Алматы/3/85, А/Алматц/Ш44/83, А/Алматы/1196/83. '.;. г. ; '

Таким образом, результаты сероэпвдемиологических исследований подтверждают данные вирусологических исследований об одновременной циркуляции среди населения Алматы эпидемически актуальных вариантов вируса гриппа к подтипов HINI -k H3N2 и не имевших эпидемиологической значимости реликтовых вариантов подтипа HINT, циркулировавших в 1918, 1933-34, 1947, 1950 и 1977 гг. Серологически „и вирусологически установлена этиологическая роль вируса HS*' INI в сезонном подъеме'¡заболеваемости гриппом в конце 1984 г. Выявление в сыворотках больных и здоровых лиц индивидуальных иммунных реакций к различным эталонным и изолированным штаммам HSWIM1 и H0NT однозначно указывает i» минорные различия антигенных сайтов гемаггдптинина вблизи рецепторсвязнваадего участка.

2. Биология вирусов гриппа A/HINt - серовариант HÖNE, подобных этаяонноиу BTa»ty A/»'Síj/33 : Сероварианту H0NI вируса гриппа A/HINt активно циркулировали среди населения в период о 1929 no 1946 гг., нередко вызывая

''.••.'.■.'". .. • ■ : Таблица 8

Спектр- антигеиагглотикинов к различным штаммам вирусов гриппа А и В в сыворотках доноров, положительных на наличие антител к HSW1 и НО

Штамц вируса :Серо~:

• ./..' :вари~:~ - — -:ант : 5 : 10 :

н5*1 0 О

4 >. о 40

А/Алиаты/ИЗб/вЗ 20, О

А/Алматы/1196/83 О 0

h/WSN/Щ ; Ю 640 320 А/Р8/8/34 • О 640

kftWft^ H1 Ш .320

А/0мачи/83 160 320

А/СССР/90/77 160 320

^ЖГ6 А а8

А/Лекинград/2/63 Н2 О О

А/Шанхай/31/81 НЗ • О О А/Филиппивы/2/82 О О

ЗЛоиконг/72 В О 2D

В/Москва/6/83 . О 20

З/Москва/100/83 ■" 40 2560

н во р о Т 0 к

'21 Т 34" Г43 7 63~: ~7~ 7 8 ": Г11 : Г12 7 1и . 2Э~;~ '50 7 59"

. 0 0 .33 0 0 0 0 0 . 0 0 0

0 20 0 40 . 0 0 0 0 0 0 0

20 0 0 .0 0 0 о. 0 0 0 0

40 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

20 0 0 0 0 0 0 ' 0 0 0 0

640 0 20 0 0 0 43 80 40 640 40

160 0 160 0 640 2560 320 2560 640 0 160 t

80 80 320 80 320 320 320 20 80 1®) 80 и V0

160 40 160 0 40 80 640 1280 - 40 40 40

40 80 320 40 160. .160 320 20 40 80 40 1

40 0 0 • 0 0 320 160 0 0 0 40

640 0 160 0 20 160 320 2D 40 0 40

80 43 160 0 40 1260 320 160 160 160 0

20 0 20, 0 ■ 40 1280 • 40 320 . 0 40 0

■ 20 ' 0 ■ 160 0 320 1280 320 1280 0, 0 0

20 160 40 0 0 .0' 160 160 640 40 0

0 160 . 20 0 . 0 0 80 80 .160 40 0

20 320 320 0 40 0 1280 160 1280 160 40

Примечание; приведены обратные титры РТГА.

опвдемии. Б отличие от штамма KjW.SmJ/i /33 - первого изолята вируса гриппа от человека» штамма подобные kj Puerto Rico /8/34, неоднократно "не в свое время" изолировали от человека во время локальных вспышек гриппа в закрытых коллективах детей и взрослых (Жуматов и др., 1965; HilPwan , 1979) в виде спорадических случаев преимущественно от детей (Иванова и др., 1982; Фролов и др., 1985; Литвинова и др., 1986; Ямникова, 1989). Вирусологические и серологические исследования, проведенные нами в I98I-I990 гг. показали этиологическую роль вариантов HONT, в заболеваемости младенцев, нередко с летальным исходом, а также их способность к сохранению в организме беременных женцин и детей группы риска. Изоляция в марте 1981 г. в г.Адматы 4 штаммов вируса аитигенно близкородственного эталону /33, из секционных материалов

детей до I года явилось уникальным событием в вирусологической практике. В этой связи представлялось необходимым детально изучить биологию необычных изолятов H0NI.

2.1 о Антигенная структура гликопротеидов.

Изучение антигенной структуры гемагглютинина осуществляли путем сравнения состава популяции антигемаггдютишшов в гипериммунных сыворотках к изоляту и основным представителям подтипа HSWWI ( табл. 9). Результаты'иммунологического анализа в РТГА показал^ что гемагглютинин изолятов является дрейф-вариантом эталонного штамма A/WSN/33, а от сходного с ним штамма, выделенного от китов отличается выраженным односторонним родством с НА вируса A/VW 1А7Л1денггафккацкя другого гликопротеида изолятов H0NJ - нейраминидазы е РПНА выявила близкое родство этого белка с таковым эталона A/WSM/33 (до Т/3 гомологичного титра). Менее активно ' нейраминидазная активность изолятов ингибировалась антисывороткаг ми А/РЯ/8/34 и А/ПУ t/47 и рекомбинантов» содержащих гемагглютинин этих вирусов (до 1/9 - I/T8 гомологичного титра). Неожиданные результаты были получены в РПНА о сыворотками к птичьим вирусам с нейраминидазой сероподтипа ÄJI иМЗ. В отличие от Ферментов эталонных штаммов, фермент изолятов полностью ингибировался антисыворот-

' ками к А/цыпленок/Шотландия/59, А/курица/СССР/314/67, А/крачка/ Туркмения/18/73, Иммунологический анализ антигенной структуры нейраминидазы в РПНА с иммунными сыворотками к изоляту А/Алматы/ 13/81 и эталона A/WSN/33 показал, что спектры антител в этих

и „ Таблица 9

Иммунологичеекий анализ антигенной структуры гемагглютинина изолятов Н0Ы1

Тест-вируса

Результаты РТГА с крысиными сыворотками :Результатн РТГА с сыво-_______к вирусам_______£роткаии к_вир^сам__

4 : о : 6 ; 7 :~9 : 10~:~11~:~*12 ; 6 : 12 : 6 : 12~.

• : - ' : ; : :до адсор-:после адсорб-

: ;оции :ции вирусами

• •••¡I I ! 12 : -6 ; 4

1.А/СССР/Аяматн/10/81 2560

2.А/СССР/Алматы/11/81 1280

3.А/СССР/Алматн/12/81 1280

4.А/СССР/Алматн/13/81 2560

а.А/Змпе/^ЛДо/ЗО ' 20

б.А/УКЗпи^/ЗЗ 640 7. А /РиечЬ 8/34 160 6.А/6«^ат<з /1/42 О 9.А/Мй-23 /1/43 ■ 20

10. к/¥оь1 ЖоптсхД^/!// 47 . 80

11.А/СССР/090/77 20

12.А/Кит/Тихий Океан/76 640

13.А/Крачка/Ю.Африка/61 О

14. А/Крачка/Туркмен/1873 О

80 1280 160 80 640 640 6 40

80 640 320 80 640 40 1280 - - - - -

40 64) 320 80 640 40 640 - - - - -

160 1280 320 80 6« 40 1280 1280 1280 80 6« 20

5120 а 80 0 320 80 0- • - - - - -

160 2560 320 160 80 320 160 5130 160 0 0 0

320 1280 5120 2560 80 640. 20 640 20 0 0 0

0 0 160 0 80 - - - - - - -

_ _ 2560 ^ _ _ 160 0 0 0 5

160 20 20 640 2560 640 - 40 0 0 0 0

80 40 20 . 80 6 10 10240 40' 80 40 0 0 0

* 1280 160 160 80 - 1280 1280 1280 0 1280 320

0 0 - - - - - - — — —

из и!

О

О

сыворотках значительно отличаются (табл.10). Во первых, антитела к НА изолята в большей степени представлены в сыворотке к эталонному вирусу, чем таковые к ЫА эталона в сыворотке к изоляту. 'Во-вторых, спектр антител в сыворотке изолята, в отличие от сыворотки эталона, содержит антитела к нейраминвдазе птичьих сероподтипов и Н5Ю и сероподтипу НШ1.

Таким образом, иммунологический анализ гемагглютинина и нейраыинидаэы изолятов Н0М1 продемонстрировал, что они представляют собой дрейф-вариант эталонного штамма АЛУЗ№/ЭЭ. Обнаружены антигенные взаимосвязи меаду нейраминидазами изолятов о.т людей и птичьим вирусом.

2.2. Биологические свойства и функциональная активность ГП. Вируса ШМ, изолированные при исходном заражении КЗ, через

2-3 пассажа достигали высоких показателей гемагглвтинирующей и инфекционной активности и были ингибиторорезистетны.В отличив от эталонного втамма А/У/ЗИ/ЗЗ, изоляты на 2-3 ^ ЭВД в КЗ слабее размножались при пониженной температуре и образовывали бляшки на монослое МДСК только в присутствии трипсина. Сравнение биологических свойств изолятов ШМ1 и птичьего штамма Н5Ю выявило отсутствие у последнего патогенности для мышей. Изолированные штаммы имели менее выраженную рецепторразрушающую (нейраминидазную) и фузионную (гемолитическую) активности, чем сравниваемые эталонт ныв вирусы. У двух изолятов ойтимумы рН этих активностей располагались в более кислой среде. По признаку термоустойчивости,, функциональной активности Ш изоляты занимали промежуточное положение между ММЩ. 733 и А/крачкг^Туркмения/1$/73.

2.3. Структурные особенности вирионных и виру специфических белков.

Электрофорвтическая подвижность в ПАГ вирионных белков всех Ц изолятов была одинаковой в восстанавливающих и в не восстанавливающих условиях СрисЛ). Спектр белков изолятов отличался от такового эталонов НОМГ более подвижным гемагглютинином (мономера и обеих цепей), наличием нерасщепляющейся формы гемагглютинина, три-мерной формы гемагглютинина, тетрамерной формы нейраминидазного белка менее подвижного мономера нейраминидазы (мм 70 кД). Электро-форетический анализ вирусспецифических белков, синтезирующихся через 5 часов после инфицирования в клетках МДСК показал четкие

Таблица Ю

Иммунологический анализ антигенной структуры нейраминвдазы изолятов KONI в РПНА

Вирусн

Серопод-:Титрн РПНА с тип :сыворотками :к вирусам

:А/СССР? :I/w3*N ; 13/81 :/33

А/СССР/Алматы/10/81 H0N1-N3 1 2/3

А/СССР/Алматн/11/81 • H0N1-N3 1 2/3

А/СССР/Алыагн/12/81 H0N1-NS 1 2/3

А/СССР/Алцатн/13/81 H0N1-N3 1 2/3

A/W5N /33 H0N1 . 1/3 1

A/PR/8/34 H0N1 1/9 1/3

A/FH/1/47 H1N1 1/9 . 0

А/Врааилия/1/78 H1N1 1/9 0

А/Техас/1/77 H3N2 • 0 0

R-A/лош/Прага/1/56хА/РР/8/34 H7N1 1/6 1/3

Я-А/л ош/Пр аг а/1/56хА/ /1/47 H7N1 1/6 0

R-A/noa/ilpara/l/56xA/Texac/l/77 • . H7N2 0 0

Н-А/лош/Прага/1/56хА/СССР/92/77 H7N1 1/6 1/3

К-А/лош/Прага/1/06хА/СССР/б1/79 H7N1 1/3 1/3

И-А/лош/Прага/1/06хА/СССР/215/79 H7N2 '0 0

А/цнпленок Шотландия/59 • H5N1 1/6 0

А/курица/СССР/314/67 H5N1 1/6 0

А/крачка/Ю.Африка/61 H5N3 1/3 0

А/крачка/Туркиения/18/73 H5N3 1/3 0

А/индон/Англия/бЗ Н7^3 ., 0 0

А/утка/Иена/72 H2N3 1/6 1/6

А/ индюк/Онтарио/бв H8N4 0 о.

А/буревестник/Австралия/72 H6N5 1/6 1/6

А/утка/Англия/5б H11N6 1/6 1/6

А/лош/Прага/1/56 . H7N7 0 0

А/лоа/Найаьш/1/ 63 H3N8 0 0

- 38 в)

+ Ю

:——ММ у ,г ¡г)—ни

Ф.1

¡1-3—.. . ■ ■■■ - • , .'.г*

НАО— «V; — - -----

МР— . " ^ — №Р

НА!— ' '

12 3 4 5

12 3 4 5

б)

П-ЗГГ

НЙ1-

г-№4 : ¡-(ИМ

|1 -НАО >

© ©

+МЭ -мэ

НЛО" НА1"

И -НД2г

с)

ЕЗ

Рй'

НАО

Н.Н

-НАО -ИР

+МЭ -мэ

МОКР -11А1-

м — т-

д)

Р'

—м<ч

—№5

—т

-т

+МЭ -мэ

белков восстанавливаю-

11/81, Ч 7 А/(

_ -

отличия в позиции неструктурных белков изолята и эталонного штан-ма. Другое отличие заключалось в низком уровне синтеза гемагглати-нина и мембранного белка при заражении клеток изолятом.

П_ервичную структуру вирданннх белков изолята и эталонных вирусов сравнивали по ол иго пептидным картам триптических гидролиза-тов белков, меченых радиоактивным йодом. На уровне чувствительности избранного метода анализа олигопептвдные спектры 4 изолятоэ были неразличимы. #ингерприкты мембранного белка и легких цепей гемагглютинина изолятов и сравниваемых вирусов имели сходный рисунок и менее различались мегкду собой, чем таковые нейраминидаз-ного белка, тяжелой цепи гемагглютинина и нуклеопротеидного белка. Анализ олигопептидных карт НА1 изолятов и вирусов А/ШМ/ЗЗ, А/РД/ 8/34 и А/крачка/Туркмения/18/73 выявил наличие группы из б пептидов, характерных для всех изученных белков. Наблюдается вариабельность в расположении и интенсивности хроматографически малоподвижных пятен. НА1 эталонных штаммов различаются между собой и от НА! изолятов наличием 2-6 пептидов (рис.5). Пептидные карты №А изолятов отличались от таковых вируса А/Р^8/34 наличием орех индивидуальных пептидов (рис.6). Группировка из 5 пептидов в центре карт, характерная для изолятов и штамма А/Р5/8/34, отсутствует на фингерпринтах нейраминвдазы А/«'5Л1/33 и А/крачка/Туркмения/18/73. Пептидные карты ЫА последних отличались наличием бнстродвижущихоя пептидов, что,вероятно, объясняется высоким содержанием остатков тирозина в последовательности фермента.

Таким образом, установление структурно-функциональных особенностей вирусов Изолятов исключают контаминации лабораторными штаммами и свидетельствует об аутентичности изолятов, подобных эталону А/МЗ/М/ЗЗ.

2.4. Структурно-функциональные особенности клонированных вариантов изолята А/Алматы/13/81 (Н1М1-КЗ).

3 связи с предполагаемой гетерогенностьо вирусной популяции по антигенной структуре нейраиинидазного белка проводили клонирование изолята на культуре клеток МДСК с последующим серо тонированием клонов в РИЛА и ДИД.Ь'З тридцати Оляшек,отобранных для клонирования, вирус репродуцировался в 15 случаях. Один из репродуцированных вариантов представлял собой популяции со смешанным сероподтипои гемагглютинина (Н1 + Н5) и нейрамкнидазы (N1 + ИЗ).Два варианта имели смешанный тип нейрамини-

- 40 -

А Б в

Рис. 5 Олигопептидные спектры _ белков тяжелой цепи гемагглютинина вирусов гриппа А.

А - А/СССР/Алыатн/13/81, Б - А/РК/8/34, В - A/WSV/33, Г - А/кр/Турк/18/73.

Б В г

S3

»

о

Рис. 6. Олигопептидные спектры белков

нейраминидазы вирусов гриппа А.Обозначения те же.

дазы HINI-N3. Пять клонов содержали поверхностные антигены подтипа HINT, подобные эталону A/WSfJ/33 на 1/2 гомологичного титра по гемагглютинину и на 1/8 - Т/2 гомологичного титра по нейраминида-зе. Семь клонов представляли собой рекомбинанты HIN3, гемагглюти-нин одного из них был сходен с таковым эталона A/WSW /33, а у остальных - эталона А/Р&/§/34. Полученные данные подтвердили наши предположения об антигенной гетерогенности вирусной популяции

изолятов, предствляющую сабой фенотипическую смесь подтипов НИ tíl и HIN 3 со штаммаспецифическиш особенностями присущими гемагглю-тинину А/WS// /33, A/PPjB/3'i и таковыми характерными для нейра-минидазы птичьего подтипа H5N3.

Клоны HIN I,подобные A/WSN/33 имели более высокую инфекционную, бляшкообразующую активность, были патогенны, токсичны и кей-ровирулентны для мышей. Клоны HIN3 характеризовались отсутствием этих важных трех признаков. Клоны HIN I и HIN3 различались по оптимуму pH и термочувствительности функциональной активности гли-копротеидов (табл.11).

При сравнении электройоретической подвижности полилептидов клонированных вариантов обнаружено, что клоны HINI отличаются от клонов HIN3 отсутствием нерасщеплекного мономера НАО: менее мобильной подвижностью мономера и тяжелой цепи гемагглютинина и отсутствием нейраминндазного белка с молекулярной массой ^70

Таким образом, результаты клонирования и последующего изучения антигенных, биологических и структурных характеристик полученных клонов однозначно указывают на то, что пассажный вариант изо-лята представляет собой фенотипическую смесь собственно штамма А/Алматц/13/81, подобного A/WSN/33, субпопуляций вирусов HIN I (подобного А/РВ/8/34), H5N3 и продукта смешанной репродукции рекомбинанта HIN3. Возможность выделения смешанных популяций вирусов подтипов HINT (ранний и поздний вариант), H3Ñ2 и рекомби-нантов HIN2, H3NI от отдельного индивидуума не подлежит сомнению (Исаева и др., 1985; Чувакова и др., 1985; Уота^е е+ ai. , 1978; tienda? ti oí, 1979; Гъапк et aß , 1983 ; 1987). Напротив, вирусы с антигенной структурой Н4-Н13 и N3-N9 и их рекомбинанты с вирусами человеческого происхождения не играют, за единичным исключением, роли в заболеваемости людей (Львов и др., 1985; Ямникова, 1989). Вместе с тем известно, что в оплодотворенных яйцах клинически здоровых кур могут находиться вирусы гриппа, парагриппа, ньюкаслской болезни (Сюрин ид., 1986). Описана вертикальная передача вируса гриппа через яйца черноголовой чайки ( ß-ogfaya edaV, 1984), Вирусы гриппа H5N3, H5NI циркулируют среди кур и вызывают эпизоотию (Осидзе и др., 1973;Ца?£, i985;Hinsliau)et«?, 1985). Таким образом, очевидна возможность контаминации вирусами из эмбрионов кур (Жданов и др., 1983), что нэря-

Таблица 11

Биологические свойства вируса А/СССР/13/81 и его клонированных

вариантов

о Иру С

Антигенная форцула

ж ф

о, «

Е-

8 П « «

й « я

к аг л см

я - Е-

ж о О О

ж \ О \

§8 И О Ж ю

№=Г

К

Фаз О СО

1=2"

Е2

Токсичность

о

X я

К <й

® а га Я Б 3 а, н к

ж ж « ©

а,« с и

I

«

«

л К

и а

О Я5 1=5

О м Й

я \ © м и, сз я к ста: я к о* ко ■ о ьи в,®о кчй

«

о я с о а.

Е-

о «

о.®

к а ш и ж а

ч 3

вы во

го

л

та о о о о к м щ Ш Я

Ч Е-ч 5 со св

§

® л

я о о к

§ 9

^ ю

КС

йо

а е* к

СО

«Ч «! Й2 я г5 С02

3 ^ в; » к я

Я л аь к о <Е о И в

А/РК/8/34 НШ 3, 2 0, 0

А/коачка/Тудк-иенистан/18/73 Н51МЗ 3 0

А/ад/зз Н1М1 9, 5 6,0

А/СССР/ло/81, 0 вариант Н1Ы1-ЫЗ 4, о 3, 0

& 1-вариант ЯШ 8, 8 8, 6

К Ъ ¿-вариант Н1Ы1-ЫЗ 2 2,а

К 2 1¿-вариант нимз з, о 0

+ 9- 9,5 - 0 0,91 46, 4

3- 3,7 - 6,2 0,80 47,5

+ 10-11,0 + 7,2 0,81 42,0

+ 4, о +• 4,5 0,90 28

+ 10-14 + 8,8 0,91 22

- 4-4,5 - 6,2 0,89 24

- 3-4 5,2 1,0 23

ду с другими факторами свгдетольствуст о необходимости использования кул »тур клеток для вирусологических исследований полевых материалов (Рейзин, Чумаков, 1985; Seliiid. A ai ,1583; Cb^ctä, 1987 ),

3. Биология вирусов гриппа A/HINI - серовариант HSWINI»

выделенный от человека.

В эпидемиологии гриппа серовариант вируса HS К/ INI подтипа. HIN I как этиологический фактор пандемий, занимает особое место. С одной стороны, установлено, что возбудителем "испанки" в 19181919 гг. был общий предшественник вирусов к/Шт L /15/30 и A/P£/8/34 (JUaSumP HetjWk , 1983; JVat^üna. et a? , 1984), который переместился затем в популяцию свиней, где циркулирует до настоящего времени, сохраняясь между впизоотиями в организме переболевших свиноматок (UJe&sieteta?, 1983). В отличие от других вирусов животных, вирусы, изолированные от свиней, сравнительно легко инфицируют человека, вызывая заболевание с клиникой 0P3 (Beate et ai , 1973, 1976). Не исключено, что микроциркуляция серо варианта HSVCIMI происходит в популяции людей в виде латентных и персистентных инфекций, о чел свидетельствуют периодические изоляции вирусов, неполностью идентичных свиным протатипным штаммам, от людей, не имевших контакта со свиньями ( Pobdatea «ta€ , 1984; <D<> a£ , 1986). С другой стороны, не вызывает

сомнений возможность зоонозной заболеваемости людей (Львов и др., 1985; DocKölie Hattatdk , 1977; MiuskaiJ «i о£ , 1978; BuSte eta£ 1984). При этом большинство" исследователей считает, что трансмиссии агента от свиней людям представляют собой "тупик", так как

вирусы недостаточно контагиозны, чтобы вызвать эпидемическую заболеваемость, или даяе ограниченную передачу вируса от человека ;; человеку, однако пандемический вирус I9I8-I9I9 гг.» возбудители вспышки гриппа в Ньи Дкерси в 1976 г. и подъема заболеваемости в Алматы в 1984 г., обладали этим свойством, хотя и в различной степени ( et , 1977; eta£ , 1983;

Чувакова и др., 1985). Несмотря на высокую степень гомологии аминокислотных последовательностей г ем агглютинина вирусоз А/кЫ ^ В/76, А/Р5/8/34, h/WltJ /33, первый является типичным в!фусо:; " гриппа свиней с некоторыми изменениями, связанными с определенной адаптацией зозбудителя к организму человека (Ьс^-гг et а'с t 1980

ßoik etat t 1983). Вместе с тем нет сведений о прямом контакте погибшего новобранца со свиньями ( , 1977). Таким образом, вопрос о происхождении и потенциальной эпидемической значимости человеческих изолятов HSWIN I до сих пор не ясен. В этой связи ностоящий раздел работы посвящен изучению структурно- функциональных особенностей алматинских изолятов HSWIN I 1984-85 гг.

3.1. Антигенная структура гемагглютинина.

Первоначальный анализ вариантов HSWIN Г в РТГА с широким набором безингибиторных сывороток к вирусам подтипа HINI показал наличие общих антигенных детерминант НА алматинских изолятов и эталонов с НА вирусов А/РК/8/34, А/СССР/90/77, но не с НА вирусов A/W5M/33 и А/РК/Т/47, в отличив от болгарских изолятов, имевших перекрестные детерминанты с НА A/WSN/33 и A/FM/IA7, и НА вируса уток, который имел' общие детерминанты лишь с НА А/СССР/90/77. _

Иммунологический анализ НА в РТГА, РИЛ, РИА и ЙЗД осуществляли с использованием метода избирательной адсорбции антител в гипериммунных сыворотках к вирусам HS'WtNI, выделенным от человека в СШАе Болгарии, в г. Алматы, первому свиному изоляту А/Swine СiovJ& /15/30, изоляту от уток А/у тка/Алберта/35/76. В РТГА установлено, что НА алматинских изолятов имели одну подтилоспецифичес-к; детерминанту, одну детерминанту, общую с НА всех штаммов HSV^IMT, третью детерминанту•перекрестнореагирующую с НА А/Swine OoWа /15/30 и болгарских штаммов (табл.12). Таким образом, по данным РТГА, антигенная структура НА алматинских изолятов была полностью идентична НА A/Swwe Cfew?7i5/30, что подтверждено данными РИЛ с НА внутриклеточного вируса синтезированного в клетках ОДСК (рис. 7).

Поскольку в РТГА анализируются лишь участки белка, расположенные вблизи рецепторсвязывакщей области полипептида, дальнейшие исследования проводили с использованием методов ТФ РИА и И§А с адсорбированными гилериммунными сыворотками к очищенным аллантоис-ным культурам вкусов. Непрямой ТФ РИА гипериммунных сывороток к вирусам A/SwineCWl5/30 и A/flei*) ^«t^/8/76 осуществляли в системе иммобилизованного гомологичного вируса (рис.8), контрольные образцы - ХАОН (гомогенат хорионаллонтоисных оболочек), вирусы адсорбенты, используемые для предварительной адсорбции, не конкурировали с вирусами А/3*лие 15/30 и А/ N^J /8/76 за антитела

Таблица 12

Выделение'перекрестнореагирувдих и ттаммоспецийических популяций антител иэ сывороток к изолятам й 081, В* 1367 и № №17

Тест-вирусы

Антисыворотки к вирусам

А/Алматы/Ш2у84 : А/Алмат«/1367/84 : А/Алматы/1417/84 Яо~аЛ-~:ГГо'сл'5 адсоЗцйи" Тдо ад= Тпос1е-адсорСцйи~:До~аЛ--:Н'осл5 адсорбция " сорбции: ви2У£Еши_ _ : сорбции:_вир£сами___:сорбции:_ вирусами

:РИ/8 РК/8/~РК/8/: :РК/8 РД/8/_КР/в/: :РД/6 р£/8/~р£/8/~

:34 34+ , 34+, : :34 34+ 34+/ : :34 34+ 34+

- : лу/ г : : М / лм/

: 76 15/30: : 76^ 15/30: : 76^ 15/30

ЫвПб

А/1382/84 А/1367/84 А/1417/84 А/1414/84 А/1415/64 А/247/84 А/, 1135/83 А/1044/83 А/Болгария. р^ЯискШш^й А/РР/8/34 А/90/*

1280 640 Г60 0 2560 1280 Г60 0

1280 320 0 0 1280 640 160 0

1280 320 -160 0 2560 640 160 0

1280 320 160 0 2560 640 160 0

1280 320 160 0 2560 640 160 0

1280 320 160 0 2560 640 160 0

1280 320 160 0 •2560 640 160 0

1280 640 160 0 2560 64Д 80 0

640 320 80 0 1280 320 160 0

1280 320 80 0 1280 320 80 0

2560 320 80 0 2560 320 160 0

160 80 40-80 0 320 80 40 0

80 0 0 0 320 0 0 0

20 0 0 0 80 0 0 0

2560 1280 60 0

1280 640 0 0

1280 640 160 0

1280 640 80 0

1280 . 640 80 0

1280 640 80 0

1280 640 80 0

1280 640 80 0

1280 320 80 0

640 320 40 0

1280 320 80 0

160 80 80 0

160 0 0 0

40 0 0 0

.ь-

и1

- 46 -i 2 5 Ч 5 в

.'» f

■I t

i f " ; i.

a

7 8

■■ 1M

;

; / ¡—HAO

J

S

-MP

-1 2 5 k 5 6 7 8 9 to 11 12 15 14 15

4l }flo

HAO: NP

•Л г, О -

. у \

} s

Рис. 7. Электрофоретьческий анализ синтеза О-вирусспе-цифических балков методом РЛП в плетках ¿ДСК, вараженнах ви-пусами H9W1N1. а - нсзарапенкнх клеток (1,2), клетки ¡зараженные А/Алмати/1417/84 (3,4), клетки заразенные A/SW/Jowa/ 15/30 (5,6), клетки зарагенные A/New ^«¿а (,7,8). 1,2,3,0,7 -кммунопрзципитатн с сывороткой к A/SW /Jowa-/1 о/30.

1,2 3 - клетки, заразенные A/sw/io/ЗО, А/Адматы/84 А/Алма-ты/1382/84. 4,5,6 - иааунопрвципитаты после обработки ли-затов сывороткой к вирусу A/sw/15/ЗО. 7,8,9 - им^унапре-цппктаты после обработки ллзатов сывороткой к вирусу А/Алла-ты/1367/84. 10,11,12 - имиунопреципитаты после обработки лизатов сывороткой it вирусу А/Алмати/1382/84. 13 14,-иммунопозципитатн посла обработки лизатов сывороткой, су А /А л м ат ы /1367 /8 4, адсорбированной виру сои "

зывопотк&й к зиру-м A/SW /15/30.

урезами.

ваша

•fc--J

^раЛедения понкщир$аш£го hu,p<j<¡& Риг- ft В!онятпентный ТФ РИА антисыворотки к вкоусу анти-А/^/15/30 в системе идао-

523 ÍSS

гШш liwife^^

7-АЛНР/121/80, 8-1/1417/84, 9-A/Í3S2/84, 10-А/1417/84, Н-А/1414/84, 12-А/1415/84, 13-А/247/84, 14-А/1044/84, Í5-XA0H.

гомологичных сывороток во всех вариантах опытов. После поэтапной адсорбции сыворотки вирусами А/СССР/90/77» А/РД/8/34, A/N*3 / 8/76 степень конкуренции, угол наклона и ход кривых дозовой зависимости конкуренции НА вирусов, выделенных в Алматы были идентичны таковым вируса A/SW /15/30, Процент конкуренции болгарских штаммов бил несколько ниже (62-86%) по сравнении с алматиискими. НА вирусов A/N^/8/76 и А/утка/Альб/35/7б не конкурировали за связывание с антителами к НА A/SW/15/30, В опытах последовательной избирательной адсорбции антител к вирусам А/СССР/90/77, А/Р1У 8/34, A/SvC/15/ЗО все исследуемые варианты не конкурировали за антитела к A/M^j/8/76, что свидетельствовало о строгой штаммовой специфичности этого вируса (рис. 9). При исследовании популяции антител в гипериммунной сыворотке к А/БКР/120/82 в î® MA с тем же набором вирусов было обнаружено'наличие четырех ввдов антител: . Г - общий к вирусам подтипа HTNI, 2 - выявляемой всеми вирусами HSWIN I, 3 - к вирусу A/SW /15/30 и 4 - характерной только для изолятов, выделенных в Болгарии. Анализ в 1Ф MA гипериммунной сыворотки к А/утка/Альб/35/76 также показал наличие 4 антигенных детерминант в составе НА: подтиловой, общий для сероварианта HSWI, общий с вирусом A/N^/8/76 и собственной штам-моспецкфической. Таким образом, в результате анализа гемагглю-тинина 12 штаммов вирусов, проведенный 4 различными методами с использованием иммуноадсорбции гипериммунных сывороток к исследуемым вирусам установлено следующее. Антигенная структура НА

HSWINT различного происхождения характеризуется идентичностью двух антигенных детерминант, что указывает на существование у них в прошлом общего происхождения. По штаммовой специфичности указанные вирусы подразделялись на две группы: A/SW/I5/30 -. подобные (алматинские и болгарские штаммы) и A/N^ /8/76 - подобные (утиный штамм). Вместе с тем, НА вирусов человека из США, Болгарии и вирус, изолированный от уток в Канаде в отличие от алматинского изолята обладали собственной специфичностью. По-видимому алматинские штаммы, подобные по НА классическому вирусу гриппа свиней A/SW/I5/30, имеют более раннее происхождение, чем вышеперечисленные вирусы. Исходя из этого можно предположить, что эволюция вирусов HSWIN I, по крайней мере гена гемагглютини-на, могла идти по трем возможным путям: антигенный дрейф, межви-

Рис. 9„Конкурентный К РИА антисыворотки я вирусу А/^7/8/76 в системе иммобилизованного гомологичного вируса»

А, Б - конкуренция за перекрестно-расширяющие антитела сыворотки анти-А//У5>/8/76, полученные путем адсорбции (А) последовательно вирусом А/РЯ/8/3ч и (Б) вирусами А/Р^у8/34 и А/90/77. В - конкуренция за ттаммоспецифические антитела сывоцотаи, полученные путем последовательной адсорбции ее тремя вирусами А/Р5/8/34, А/90/77 и А/?«//15/30. Конкурирующие вирусы: сл. обозначения на рис. 8.

довая изменчивость и сохранение в популяции людей практически неизмененном виде.

Для изучения антигенной структуры нейраминидазы использовали два подхода. Анализ всей молекулы фермента проводили в КФА с моноспецигЬической сывороткой к нейраминидазе вируса A/SW /15/ 30, полученной путем истощения хозяйскими антигенами и гомологичным НА.По степени значений БОС фарменты исследуемых вирусов расположились в следующем убывающем порядке: гомологичный вирус, алма-тинские и болгарские штаммы, A/N^/8/76 и А/утка/Альб/3-5/76, A/PS/8/34 и А/СССР/90/77. Методом конкурентного Ti Ш была изучена сравнительная способность нейраминидазы разных вирусов HINI конкурировать с нейраминидазой эталонного штамма A/S^V 15/30 за связывание с гомологичными антителами моноспецифйческой сыворотки (рис.10). По степени конкуренции, углу наклона и ходу кривых дозовой зависимости исследуемые вирусы подразделялись на 4 группы (подгруппы), каждая из которых объединила варианты с идентичной антигенной структурой нейраминидазы. В 1-е вооли штаммы к/?2/ 8/34 и А/СССР/90/77, во 2-х, - А/уткд/Альб/35/76, в 3-ю - к/Ыу / 8/76 и в 4-ю - А/SW/15/30, А/Алматы/1417/84, А/БНР/120/82 и А/БНР/121/82.

С целью изучения антигенной специфичности фермента в районе центра каталитического использовали полмслональные сыворотки к целым вирконам и моноспецифические сыворотки к "головкам" нейраминидазы A/SW/I5/30, A/N^ /8/76, А/Алматц/1417/84 и А/Алматц/ 247/84 (табл. 13). В качестве антигенов кроме очищенных вирусных суспензий использовали препараты "головок" нейраминидазы изолятов А/Алматы/1417/84 и А/Алматы/247/84, солюбилизированных проназой и очищенных на сеФадексеG- 200. Выход препарата фермента по белку составил 40-50$, по активности - 50$, фактор очистки был равен 85, чистота и гомогенность препарата установлена электрофоре-тическкм и элэктронномккроскопическим методами. Кроличьи антиней-рамшидазные сыворотки к ним содержали моноспецифические антитела в титрах Е:320 в Ш и РПНА.

В опытах с антивирусными сыворотками установлено, что в Функционально значимой области фермента, в отличие от эталонных штаммов, изоляты HSWINI имевт антигенные взаимосвязи с вирусом А/Фукуиика/78(НШ1), но не с вирусами HtNl 70 и 86 гг. циркуля-

ЮЛ

vöruxj¡ñücMSd aso nñ ЗГ lo з

ра&Ьми! tu/mono плита

Рис, 10. Характеристика степени конкуренции в ТФ ЙФА антинейраиинидазной сыворотки к A/Swn-е/uowa. /15/30 с рав-личннми вариантами вирусов гриппа А подтипа H1N1 Н0Ы1 и HSW1N1, Конкурирующие вирусы:, A/Swrne / Jowájlo/ZQ, 2 -

i -Лщ^,"ЛШО -

k/Nw ftwey /8/76„ 6 - А/БНР/12С 8 - А/Алыатн/1417/84, 9 - ХАОН.

ции. Антинейраминидазные антитела к вирусу А/ /15/30 в сыворотках к изолятам представлены в значительно меньшей степени, чем к вирусу А/Л^ /8/76. Активность фермента I, полученных от •

больных с тяжелой симптоматикой болезни,, не подавлялась антисывороткой А//^/8/76, что подтвердилось при использовании в качестве антигена препарата "головок" нейраминидазы. Наиболее четкие результаты штаммоспецифической идентификации антигенной структуры нейра-минидаз в РПНА получены в случае использования моноспецифических антинейраминидазных сывороток. Нейраминидаза штаммов, изолированных от больных с обычной симптоматикой была близкородственна, но не идентична нейраминидазе эталона А/А^/8/76. Нейраминидаза изо-лятов и вирусов, изолированных от больных с тяжелыми поражениями» была сходна, на 1/2 - 1/4 титра с нейрамицидазой эталона А/ / 15/30. Вместе с тем антг.тгнная структурно беих групп алматинских изолятов характеризовалась собственной специфичностью. Суммируя данные, полученные в И$А и РПНА, можно придти к выводу о том.

Таблица 13

Анализ антигенной специфичности нейраминидазы вирусов в реакции подавления нейраминидазной активности

Антиген : Титры РПНА с сыворотками к

^ вирусы" ~ ^головка" нейрами-______________нидазы_вир£сов__

•

. . . . • со • ж • • » *

• Ю С- "Ч ю

О »Е— " -=Г 0 -3" • « о С- » О 'Г- »Й "-эг Й Й ►-> С- <Л -V. , СО со ^ »СО ° <> -V- • (Л <• -ч. ° "СО »1?! О Й 1Л с- со X ° к •»-• О О С- -м. о о-\ <? 1а 1 н • м • ч, • в • = со »Я, ">-' 1

• я а) к ли Э

о » й • »•3«о\<»!з«к«о «к »я «я

«й о г • «) > и >Р( » и •«: «I »а$ »из ^ ^ ^ ^

6ф«0вОО9 О 9 о

Vsw7шWl5/зQ~l6Q~m~ ¡¡0~тб0~0 о" о ~Э20~ ~ео " во" Гео "

А/Ныо-Джерси/

8/76 80 320 320 320 0 0 0 80 320 320 О

А/Алматц/1417/84 160 320 320 320 0 160 0 0 320 1280 ' 0

А/Алматы/1415/84 160 80 80 160 0 20 0 0 320 1200 0

А/Алматы/1414/84 160 320 320 320 0 160 0 0 320 1280 0

А/Алматц/1382/8^ 160 80 320 320 0 320 0 0 320 1280 0

Нб^УЫ*' 160 20 320 320 0 320 0 320 0 0 640

А^матц/ ш 20 ^ 52() 0 э20 о эго 2() ^ 0

А/Алматц/

3/85 160 20 320 320 0 320 0 320 20 40 0

МлгарВДЙ/82 160 20 но но 0 но 0 320 0 0 40

Бол гария/х^/ 82 80 320 но но 0 но 0 160 0 0 40

"Головка" нейраминидазы вирусов;

А/Алматы/ 247/ 84 80 0 160 80 0 80 0 160 20 40 но А/Ллматц/1417/84 0 80 160 160 0 160 0 0 320 640 но

Примечанием данные обратные величины титров антител» но - не определяли

что на молекуле нейрамшпиазного белка имеются общие подтиповыв, группоспецифические антигенные детерминанты. В функционально значимой области "головок" иейраминидазы изолятов определяются под-группоспецифические антигенные детерминанты, коррелирующие с тяжестью заболевания источника изоляции вируса, а также штаммоспе-циАические антигенные детерминанты.

Таким образом,, в отличие от антигенной структуры гемагглюти-нина, антигенная структура иейраминидазы изолятов HSWINI гетеро-генна по составу антигенных детерминант и имеет итаммоспецифические детерминанты, что позволяет представить вирусы HSW INI, как дрейф-варианты эталонов A/SVf/15/30 и A/M^J /8/76 по нейрамини-дазному компоненту. Наличие антигенной взаимосвязи между нейрами-нидазами изолятов и вирусом 78 г. можно объяснить внутрицистронной комплементацией б сегмента РНК, кодирующим нейраминвдазу между "дремлющим" вирусом HSWIMI и эпидемическим актуальным в 1978 году штаммом HIM I.

3.2. Антигенная структура нуклеопротеидного белка.

Антигенные свойства NP-белка изолятов HSW INI исследовали методом РКА на полиэтиленовой пленке с использованием моноклональ-

ных антител (МКА) к NP-белку вирусов A/W5N/33, А/чайка/Казахстан 470/79(HINI), подобный вирусу А/СССР/90/77 и с мономпецифически-ми сыворотками к NP вируса А/Шотландия/8'10/74СНЗМ2). Авторадио-грайическая и радиометрическая (табл.14) регистрация результатов показала, что все исследуемые вирусы содержат в составе NP эпитоп, комплементарный МКА Н12. NP сравниваемых стаммов, за исключением NP штамма А/СССР/90/77, не взаимодействовал с МКА F8I. Эпитопы,

комплементарные МКА. 3,1 и ^69/6 присутствовали в NP алматинских изолятов и А/ЕНР/121/82 и эталона A/SW/I5/30, при этом значении БОС MP изолятов от больных с менингеальными явлениями значительно превосходили таковые у остальных вирусов с МКА 5,1, также как и с МКА HI2, NP всех вирусов образовывали иммунные комплексы. В обоих случаях величины ВОС были значительно выше, у NP вирусов, изолированных от больных с тяжелой симптоматикой заболеваний. Анализ вирус-специфических белков, синтезированных в клетках МДСК, инфицированных изолятами HSWINI и сравниваемыми ытаммами, методом электрофореза и РШ с МКА HI2 и F8I дал результаты, аналогичные вышеуказан-ним. Таким образом, антигенная структура NP белка изолятов была

Таблица 14

Радиометрический анализ степени связывания вирусов Н5М1М1 с моноклональныик и ыоноспецифическими сыворотками к МР белку.

Штамп вируса

___Значения ВОС _ .__.__

¿ононлональные сыворотки к ЫР белг£ виоу£ов _

А/чайкаДаз/ 470/79 (НШ.)

Р81

Н12

А^Л/33( НШ-ва-риант .НОМ 1)

3/1

5/1:469/6

ионоспеци-:фическая ¡сыворотка :к №Р белку :вируса А/ :Шотландия/ : 8 40/7 4 ;{НЗН2)

ЗТ : 4Т

А/Й^ие рана/15/30 3,0 13,4 3,2 6,3 2,8 3,6 3,6

А/№*/ уггчщ /8/76 3,8 8, о 1,8 3,4 1,2 3,0 2,2

А/БНР/120/82 ' 3,4 8,5 2,3 4,8 1,9 3,2 2,7

А/БНР/121/82 2,8 11,4 3,1 6,8 2,2 3,1 3,3

А/Алматы/1417/8 4 3,3 12,1 3,2 5,2 2,6 2,9 2,8

А/Алматы/1367/84 3,1 13,7 3,4 7,1 3,1 3,5 3,7

А/Алыаты/1382/84 2,9 15,9 5,8 11,9 4,4 3,4 4,0

А/Алматы/3/85 3,5 19,1 12,1 21,5 10,9 3,9 7,5

А/Алматы/247/84 4,0 15,3 13,8 23,3 10,6 3,9 5,7

А/Алматы/1414/84 3,2 11,1 2,9 5,4 2,1 2,7 1,5

А/Алматн/1415/8 4 з.-з 11,3 2,5 5,1 2,2 2,3 1,5

А/СССР/90/77 11,4 9,0 1,5 3,6 1,2 1,8 1,3

А/»С5М /33 2,9 7,5 3,8 4,7 2,6 2,6 2,4

сходна с таковой ЫР эталона А/^/15/30, хотя и отличалась в ряде случаев ее высокими значениями ВОС. От МР штамма А/МЗ/8/76 Ыр изолятов отличался по 2 зпитспам, а от ^ А/СССР/90/77 - по 3» а а также взаимодействие ЫР эталона А/'-М'/ХЗ/ЗО и некоторых изолятов Н5№ТЫГ о «оноспецифическими антителами кМР белку вируса НЗМ 2 позволило предположить возможное присутствие хозяинспецифических последовательностей в полипептиде ЫР» В этой связи было предпринято исследование антигенных свойств МР, синтезированных в клетках МДСК и §ЗК методом электрофореза с последующей РКП с использованием антитканевых и антивирусных лоликлональкых сывороток (рис.П.)„ В цитоплазматических экстрактах клеток,инфицированных вирусами Н8\Х/ТЫ1, Н1М, Н2М2, НЗЫ2 в отличие от иеинфициро-

м м

9875 5.^321

) НЛ0

Л '

/ V

л

N

"О

Рис. Электро^оретический и радиоиммунно-преципитационный анализ ^С-М? белков,синтезированных в клетках, зараженных вирусом /15/30. I - лизат зараженных клеток.

Иммунопреципитаты после обработки лизата:гомологичной антивирусной сывороткой-2; той же сывороткой адсорбированной:антигенами Форсмана, ХАОН-3; антигенами Форсмана, ХАОН,вирусом А/ССХ;Р/90/77-4: антигенами §оосмана,ХАОН,вирусами У СССР/90/77, А/Алматы/1367/ 84 - 5: антигенами Форсмана, ХАОН, вирусами А/СССР/90/77. А/ Ал маты/ 1417/84 - б; антигенами Форсмана,ХАОН,вирусами А/СССР/90/77, А/Ме^ неггеи/8/76-7: антигенами Форсмана,ХАОН, вирусами А/СССР/90/ 77, А/ 5и// Тс^а /15/30 - 8. Иммунопреципитаты после обработки лкзата антиввдовыми сыворотками: к антигенам: ХАОН - 9; Форсмана 10, ЩСК-П, АСА-)-10

ванных, после обработки как антивирусными сыворотками Н5Л1Ы1, НЗЫ2, Н10М7, так и сыворотками к антигенам ВДСК и §орсмана в по-згщгт № белка бми обнаружены преципитаты различной степени интенсивности. Последовательное истощение сыворотки к вирусу гриппа АДм/15/30 антигенами ЩСК, Форсмана, ХАОН и - ММ' эритроцита человека, а также гетеро- и гомологичными вирусами, позволило выявить присутствие антител не только к № вируса, но и к антигенам исследованных хозяев. Ангиввдоэая сыворотка ЩСК преци-питировала ЫР-белки большинства представителей основных серовари-

антов вирусов гриппа А, за исключениемЫР вирусов А/СССР/90/77, А/Р5/8/34 и типа Е^ее. (табл. 15). Как известно, NР-белок вируса гриппа является главным антигеном,, узнаваемым типо.специфичными ЦТ! ( "То\*иееиЫ^ а£ , 1984; Уемк£еЫ & & , 1985; М^оека

Benni.nL , 1988)о Согласно гипотезе ТошпаспЫ е£а,I (1985) на плазматических мембранах зараженных клеток происходит ассоциация белка ИР, или его пептидов с антигенами класса I Главного комплекса гистосовместимости. Полученные нами данные свидетельствуют в пользу этой гипотезы. Результаты РИА с вирионным ЫР_и РИЛ с ви~ русспецифическими МР указывает на присутствие в структуре ЫР белков ряда вирусов, в частности изолятов последовательностей, комплементарных последовательностям хозяйских белков. Подобная антигенная "мимикрия" широко распространенная в природе, возможно способствует ограничению распознавания ЦТЛ инфицированных клеток с экспонированными на поверхности МР или его пептидов, что может поддерживать персистенцию вируса в клетках.

3.3. Биологические свойства изолятов НЗМ'Ш!.

Б отличие от эталонных штаммов изоляты обладали более высокой репродуктивной активяоетьв в КЗ, легких мышей,, часть из них обладала нейровирулентной и бляшкообразуюцей активностью. Все исследуемые штаммы-изоляты были патогенны и токсичны для мышей без предварительной адаптации.При внутривенном введении вируса в дозе 1000 ЗВД50/5ОМХЛ наблюдалась токсическая гибель мыпей в течение первых суток, которая сопровождалась геморрагическим отеком всех внутренних органов и регистрацией резкого повышения проницаемости капилляров легочной ткани для краски Эванс голубой. При интра-назальной инокуляции той же дозы вируса заболевание и гибель мышей наблюдали с I по 10 день, при этом о б пар у швали вирусяракти-чески во всех органах, включая кишечник. При гистологическом исследовании выявлены высокая проницаемость сосудов микроциркуляцки, тромбозы, плазмо- и геморрагии, дистрофические, некробиотические и некротические изменения в тканях„Патоморфологические изменения наступали в более ранние сроки и в случае выживания сохранялись более длительное время,в отличие от таковых,вызванных современным эпидемическим штаммом, описанным в литературе (Парусов, 1981).

Таким образом, изоляты Н!>М1М1 характеризовались резко вира-

Таблица. 15

Хозяинзависшше антшзенные свойства ИР белков, синтезированных в клетках, инфицированных основными серовариантами вирусов гриппа А и В.

Сыворотки: Радиоимыунопреципитат МР белков вирусов

; Н5Я/ 1М1 : НОШ ' : Н1Ы1 : НЗЫ2(8) :Н2Ы2 : 3 ;МДСК

£№/30 7^76:^/1417 ' :Рй/34:СССР : ; Деп? ; : ; /84 ; 33 : ; /77 ; /47; о7 ;х-31:Утка : :Укр. •Синг/' : 57 : : I -л

I

адси ++ - - ++ + + +++ + -

А ЛIV/30 +++ +++ +++ ++ - - ++ + + +++ + -

аш81 _ - +++ +++ НС НС НС НС НС +++

ЩАН12 +++ +++ +++ НС НС НС НС НС +++

хэнной сиктьлкотропностью и токсичностьа, что суаиодас? с результатами патоморфологического исследования органоЕ и тканей пациентов, умерших от токсической формы инфекции вируса гриппа HSU/ТЖ (Чувакова и др., I9S3). Указанные свойства изолятов HSWIN 1 продемонстрированы при коделированк'.: медленной гриппозной инфекции на белых беспородных мышах. Есе использованные штаммы HSWIN I индуцировал'.; рождение неполноценных особей с частотой 12-331, при этом первые признаки патологии проявлялись у мышат уже на 3-5 сутки после рождения и летальный исход наступал быстрее, чем описано в работе С'!лрнмик и др., 1984). Другим отличием было полное отсутствие волосяного покрова. Вирус, персисткровавший в организме самки и изолированный из крови, был дефектен по нейраминвдаз-ной активности, сохранял фузионную активность, а гемагглютинирую-щую активность проявлял только с помощью гетерологичной нейрами-нидазы (табл. 16). Вирус же, изолировашый из органов карликовых мышат, был полноценным, активно репродуцировался на КЗ. При пато-морфологическом исследовании тканей головного мозга, легких, миокарда и печени та фоне отсутствия воспалительных явлений были обнаружены дистрофические и дегенеративные изменения. Для белого вещества стволовых отделов мозга и мозжечка было характерно развитие признаков губчатой энцефалопатии.

Для выяснения природы вирусных структур, ответственных за развитие врожденной патологии, изучали роль изолированных глико-протевдов и отдельно нейрамшшдазы в этом процессе (рис. 12, 13,14). Ранее нашими и другими исследованиями роль суммы гликопротеидов в патогенезе гриппозной инфекции была теоретически И"экспериментально обоснована (Чувакова и др., 1985, 1987, 1988; Исмаилова и др., 1989; Rato,Okada, T96I). Препараты суммы гликопротеидов и иейраминидазы, обладающие функциональной активности, токсичностью для мышей при внутривенном введении, не содержащие инфекционного начала дозировали по белку и инокулировали интраназально или внутривенно беременным самкам в высокой концентрации, не превышавшей летальной дозы для беременных самок 40-60 мкг для ГП и 80-100 мкг дляМА. Феномен "карликовости" мышат бил воспроизведен в 20-50$ случаев прк ннтраназальном введении препаратов, и z 66-100$ - при внутривенном. При внутривенном введении ГП и Ni А индуцировали, как к целый вирус, рождение " голых карликов", а

Таблица 16

Распространение ин^.злцпонного вируса и вирусспецифичеснкх активностей з организмах лн.;.эиц;;онной сакяк п ее мшат

йнвотиы;

: ¿мру с с п зци.1> ич зс -¡пая активность

Легкое

1оэг

осадокл¡суперна- ¡осадок гсупорна-: ' тант : :тант

-НЯа+ННЗ: -ННЗ+ННЗ:-ЖУ+ННЗ: -ШВ+ННБ

_ Печень осадок

: суперна-:тант

-ННВ+НН5: -БНЗ+ШК

Самка, забп- Титр РГА обрат-та на 28 ннй 0 2 0 2

день послз Лейра:.шнпдазная оодов активность,

0П34ЭНц 0 0

Г вы. о л и т и ч э с к а я активность,

0По42 ни 0-100 °.0;Ю

Инфекционный титр «дЭ'^аО 1,0 О

аыыонок с Титр РГА 16 32 0 0

патологией Лейраиинидазная активность

Р Гемолитическая дения активность

0П542нц 0,150 О

Инфекционный

титр Сд ЭйДзз 3, о О

iшi0H0к-H0p- Титр РГА О О

на,забит на Инфекционный 28 день пос- титр, щ ЭИД^д О О

ле роздения

Обозначения: х - осадок после центрифугирования : „

хх - супернатант после центрифугирования

0 2 0 2 0 0 0

0 0 0 0

о, ¿го 0,070 0 0

1,0 0 0 0

128 128 64 128 0 0 2

0,100 0 0 0

0,300 0 0 0,110

3,0 0 0 0

0 0 0 0

0 0 0 0

29000 об/мин?

32

I

1Г>

-мэ

|ррр

\ 2 3 к 4 2 3 4

Рис. 12. Электрофореграмма спектра белков вируса А/НБ№1М1/ и субвирусных структур:

1 - коры,

2 - вирус,

3 - гликопротеидн,

4 - нойраминвдааа.

к-

Рис. 13, Электронная микроскопия препаратов вируса А/Н3^1Ы1/ и субвирусных структур.

а - очищенный вирус; б - коры; в - гликопротеидн; г - голов-

ки нейраминидазы: д - агрегаты фермента. Окраска ФВК. Инструм. увел, х 100000- 25

250000

Рис. 14. Индукция врохденной патологии у мышей вирусом А/Н5Й'^1) и ©го вирусными структурами, а - помет мытой через 1 неделю после рождения, б - мышонок "карлик" через 3,5 недоль поело рождения.

при интраназальном введении препарата N А "карлики" были покрыты пушком, Полученные результаты согласуются с данными об индукции врожденной патологии иейнфекционным вирусом (Морозова и др., 1989) if свидетельствуют о том, что поверхностные белки вируса, обладающие ^узионной и сиалидазной активностью могут оказывать повреждающее действие на эпителиальные клетки сосудов, микроциркуляцию органов и тканей мышат. Показано, что в этом процессе нейра-минидаза может играть самостоятельную роль, вероятно, вследствии десиалирования сиалогликопротеидов клеточной поверхности, приводящего к нарушению их структурирующей и маскирующей функций (Schou/ez, 1982). Последняя характерна для таких тканей организма как мозг, иммуноглобулины, гормоны, которые характеризуются высоким содержанием сиалогликоконыогатов. Размаскирование антигенных структур в результате действия нейраминидазы может привести к хроническим и аутоиммунным процессам.

Таким образом, роль нейраминидазы в развитии дистрофических и дегенеративных изменений в органах и тканях мышей может заключаться в прямом воздействии на проницаемость эндотелия сосудов михроциркуляцш и эпителия клеток, либо в опосредованном влиянии путем изменения антигенного статуса клеток организма.

Сравнительное изучение действия различных физико-химических факторов на функциональную активность гликопротвидов эталонных и изолированных штаммов HSW INI обнаружило их отличие по оптимуму рН, динамике нейраминидазной активности и степени гемолитической активности. По признаку термоустойчивости гликопротеиды штамма A/N^/8/76 отличались от изолятов и эталона A/SW /15/30.

З.Ц. Структурная организация белков и генома изолятов

Полипептидный спектр вирионных белков изолятов и эталонных вирусов HSWIWI характеризовался наличием расщепляемого и нерас-щепляемого С77 кс1 ) мономера гемагглютинина. Мономер гемагглюти-нина, тяжелые и легкие цепи гемагглютинина изолятов от больных с неврологическими симптомами имели большую электрофоретическу» подвижность, чем таковые остальных штаммов (рис. 15). Спектры вирусспецифических белков, синтезированных к 5 часам после инфицирования клеток, зараженных эталоном A/Sw/15/ЗО и изолятов, отличались от таковых, зараженных вирусом А/М'3/8/76 более подвижным неструктурным белком (рис. 7). Также как и спектры вирионных

ш-

НА2-" UVw

NA4

i Í.'.íf Я

l ^ 4--\ •

i"' " V-.

'ПГппепо^)-— 1

«г-Н i?»r ?{ rf— HAG»5

HAO-r.^.rnr, , ?C> Г/.Х 1—HA0

NP —( "", 1 -P,^-'; WwwU^ifcXJ-WP

^XI^^CCSÜ—M

i 2 Б M 5 6 7 В

i2Sh 5 6 7 8

Рис. 15. Электрофореграмма спектра структурных белков штамма .вируса гриппа AVSm/Hl/. 1-A/W;W./1о/30., 2-A/New OÍetsey /8/7Б, З-А/Алиатн/1417/84,, 4-А/ллиатн/1414/Й4„ З-АДлиаты/^47/84, 6-А/Ллиаты/378о, 7-А/Алиаты/1382/64, 3-А/Али аты/1367/84.

{=РВ1,РВЙ ¿Vi—РА

i-5 —

7—i

8-

* M ь r

1 nri Рис. 16. Злектрофореграм-í—NP ма распределения езгментов ■NAi РНК штаммов вируса гриппа НА2 A/HSWlNl/д,

1 - ft/SwAow/a/io/ЗО,

2 - A/New^ey /8/76;

3 - А/Алиаты/l417/84.

ií Ч) %

белков, спектры вирусспецийических белков вирусов HSWtNI включали мономеры гемагглгатинина с большей и меньшой подвижностью, что отличает их от таковых вирусов HINI и зависит от степени гликогилирс-вания предшественника к,во-тхтшу, мо-иг егйлть на гс-

лкпепткда мономера и вирулентность вкруса ICaiVaoícct, WeHistiz , 1988; Селкмова, 1992).

Спектры генов двух эталонных и изолированного ытачма HSWi.Ni отличались друг от друга количеством РНК сегментов (рге.15), гено-

мы вирусов, изолированных от человека в США и Алматы содержали дополнитольшй сегмент РНК в позиции меяду 5 и 7 сегментами» по скорости движения 5а сегмент больше соответствовал гену нейраминидазы. Бее 8 сегментов РНК изолятов имели сходную подвижность с таковыми эталона A/SW^ 15/30, тогда как 4 и б сегменты РНК штамма A/N^f/8/76 двигались в ПАГ с меньшей скоростью,, чем у зирусов A/SVP/15/30 и изолята. Если дополнительный сегмент действительно является геном нейраминидазы, то можно предполагать наличие делеции з структуре этого гена у вирусов HSWINI человека, со всеми вытекающими отсюда последствиями, а именно, снижение или отсутствие синтеза белка NA ведущее к нарушении посттрансляционных преобразований предшественника гемагглютинина (неполный кливедзк, сиалидизация рецепторного участка гемагглютинина), а,также к нарушению процесса отпочковывания зирионов с поверхности клеток и их агрегирования.

Для сравнения первичной структуры генов нейраминидазы эталонов и изолята олигонуклеотедному анализу подвергли значительную доля б сегментов РНК (43$) Стабл» 17» рис. 17), Значительные различия были выявлены в генах нейраминидазы вирусов АJ9>W /15/30 и А/Алматы/WI7/84. При сравнении фингерпринтов этой пары было обнаружено 16 несовпадающих олигонуклеотидов» а при сравнении, фингерпринтов пары изолята и A/N^/8/76 - 9. На карте гена А вируса А/Алматы/1417/84 было выявлено 7-8 олигонуклеотидов, отсутствующих на картах А эталонов. Вместе с тем, на карте гена NÄ A/SIV/I5/30 обнаружено 7 олигонуклеотидов, отсутствующих на карте штамма-изолята, а на карте гена вируса А/М^/8/7б - 2. Процентная доля замещенных оснований для пары генов изолята и A/SW/15/30 составляло 2%, С учетом размера гена нейраминидазы это означает, что на весь ген приходится 27 замен, что свидетельствует об отдаленном структурном сходстве генов NA указанных штаммов. Менее выраженные структурные различия наблюдались при сравнении генов NA штаммов А/Алматы/1417/84 и A/NQf/8/76, выделенных от человека. Результаты олигонуклеотидного анализа подтверждают данные, полученные при иммунологическом анализе и свидетельствуют о высокой изменчивости нейраминидазы изолята HSWINI по сравнению с более Консервативной структурой гемагглютинина.

Первичную структуру гена гемагглютинина изолята А/Алматы/ 1417/84 исследовали методами олигонуклеотидного картирования и

Ген

кце

Анализ олигонунлеотидннх карт генов геиагглютинина и нейраминидазн штаимов вируса гриппа А/Алиаты/1417/84, А/SW/Ct*Wl5/30 и A/New ^т«^8/76

Сравниваемые:Доля гена, :Распределение ана-.'Минимальное вирусы ¡представленглизируемнх олиго- ¡число замен ¡ного акали-:ну£леотидов ___¡оснований

•нуклеагвда :_А/1417/84^:чиЧм : %"

: в % : : + : ': _ \ _

НА

NA

33 46 0 0 0 0

40 6 13 16 3,2

43 . 3 4 8 7-8 12 2,0

А/1417/84 .

А/3^/1о/30 А/1417/64 А/N^8/76

А/1417/84

А/3^/1о/30 А/1417/84

, , , 35 7 2 'б 1,3

А/^/8/76

Обозначения: х-определяли исходя из размеров олигонук-леотидов и данных о мояокулярных массах генов НА и№ вируса гриппа хх-А/1417/84 (-О-число олигонуклеотидов,обнаруженных на олигонуклеотидной карте данного гена штампа А/1417/84,но отсутствующих на олигонуклеотидной карте данного гена другого сравниваемого штамма; А/1417/8 4 (-)-число олигонуклеотидов,об-наругенных на карте ванного гена штацца А/§1У/15/30 или /[/N'278/76,но отсутствую-щих^а^карте соответствующего гена штаи-

секвенирования. Олигонуклеотвдному анализу подвергалась значительная часть (1/3 доля) гена зрех штаммов варианта (табл. 17, рис. 18). На уровне точности метода анализируемая часть 4 сегмента РНК вирусов А/ Ал маты/1417/ 84 и А/5\У/15/30 была практически идентична. Напротив, при сравнении фингерпинтов генов изолята и */М^/8/7б были выявлены существенные различия (3,2$ замен). С учетом размеров гена в 1760-1780 нуклеотидов это означает, что на вео{> ген приходится 2,8$ замен.

\ -гз»-

• «

Аиэ-йяДзУ/й1»

6" О О ^

С> °0'°о о о ° О о

«Я

оо ** О

О о _ о <9 -О о

О О

Ц!

" "■-."Г'-1 ■"■V"*' -

>-- V —чА

-л • Л „ V *

I с ■ а

«* •

4» я»

.»И

- ■ о

Нм-йяроз/З/Гв

О

«г-

е-*"*»

!>А

Рис.

штаммов вируса ,гр. л У^иеЗсМз- /15/30. Дана схема справа те гена А штамма вноние

, вверху распределение олигонуклеотидов на кар-А/Адматы/ 1417/84, по которому в данном случае проводили сравнение с генами МА штаммов А/нем Пегщ/8/76 и к/ %тп<г /15/30. Кружками на картах обозначены олигонуклео-тиды, отсутствующие у исходного А/Алматы/1417/84, стрелками - оли-гонуклеотиды, присутствующие на карте N А данного штамма, но отсутствующие на карте N А штамма А/Алматы/1417/84. Крестиками отмечены положения красителей.

«

«

«

V <

г * /*

"« -.ИЗ?» - :Г

г

г

Рис» 18 Ояигонуклеотцдные.карты генов,гемагглвткнша итаммов вируса гриппа / Щте- /15/30, А/^гг^/е,

76 и А/Ал маты/ 14Т7/ 84 (сверху вниз). Стрелками отмечены ал иго-нуклеотиды» специфичные для гена НА данного птакма вируса^ крестиками - положение маркерных красителей:бромфенолового синего (сверху) и ксиленцианола (снизу).

Полноразмерная ДНКтКопия гена гемагглютинина изолята А/Алма-ты/14Т7/84 была получена путем синтеза на геномной РНК двухцепо-' чечных к ДНК с последующим клонированием в плазмиде рВ 327 в 8.сoil . При определении последовательности гена гемагглютинина длиной 1778 нуклеотидов обнаружена единственная протяженная рамка считывания (нуклеотиды с 34 по 1730) в пределах которой возможно кодирование полипептида, состоящего из 566 аминокислотных остатков. С помощью компьютерного анализа геномного банка данных 1989 г.

'de.n.e Bank. ( с/о 3ntet£i Genetics Una , используя программу) выведена аминокислотная последовательность тяжелой субъединицы гемагглютинина и проведено попарное сравнение последовательностей HAI основных представителей вирусов подтипа HINI разных годов циркуляции в человеческой популяции (рис. 19). Результаты сравнения N-терминальной последовательности свидетельствуют о более Еыраженном сходстве сигнального пептида у HAI изолята и эпидемических штаммов, чем у HAI A/M'J/8/76. Также очевидно, что последовательности сигнальных пептидов HAI ранних штаммов 1933,

1934 и 1951 гг. циркуляции и современного варианта 1986 г., в отличие от остальных представителей HINI более близки таковым вирусов HSWINI.npn попарном сравнении процентных соотношений гомологии последовательностей 326 аминокислотных остатков начиная cN-терминальной аспарагиновой кислоты HAI изолята с HAI остальных вирусов наименьшие (10,1$) различия выявлены со штаммом A/N^j/ 8/76, наибольшие (21,1? - со штаммами £лд/51 и FXW//52 (рис. 20). При сравнении изолята со штаммами HIMI 1950, 1970, 1980 гг. наименьшее число замен обнаружено с HAI QSi/54 и Tai/86. Степень гомологии последовательностей HAI изолята.и эпидемических штаммов гриппа человека заметно выше,чем таковая HAI AAl^/6/76.Примечательно, что последовательности HAI вирусов At/84, PIJ/34,QS^54, Феп, /57,^tn/80 имеют меньве различий с более "поздним" вирусом Tal/86, чем с ранее циркулировавшим Chi/83.

Сравнение последовательностей HAI эпидемических штаммов и A/NJ/8/ 76 показало значительно большее число замен. По степени гомологии последовательностей оба штамма HSWIMI укладываются в пределы сероподтипа HINI, что указывает на стабильность структурных подтипов в процессе эволюции ( Heggnesg etat, 1982). Вместе с тем вышеприведенные данные подтверждают мнение о том, что накопление мутаций е процессе естественной изменчивости формирует

Л/ГИ/Э4

л/тен/и

А/ап/ю

АДЕN/80

АДА1/86

А/ЮТ/Т?

Л/ЕМЗ/Л

А/гал»/я

АДиС/И

АД) £N/57

^/АЬ/М ст/ш/?« А/РМ/34

А/»ГСМ/33 А/СШ/83 А/ЬЕИ/ВО А/ТА1/86 А/1ЯК/77 А/ГМ0/51 А/КЛИ/И

А/ОМУМ

А/ОЕЫЛТ.

81Ж/АЬ/М 8»/Ю/76 А/РМ/34 АЛгеЛ/ЗЗ А/СШ/М А/Ш^/80 А/ТА1/В6 А/иЭ 14/77 А/ЕНО/51

А/ПЛМЗЗ

АД»!./«

л/от/п

8Ж/А1ум

А/РМ/И К/Ч/Ж/ЗЗ А/СН1ЛЭ А/ЬЕМ/ао А/ТА1/86 Л/1К1(/77 А/ЕМО/И А/ИЛУ/Л А/СЙ1/Л АД>Ы/57

А/ТМ/К А/ШН/77 А/ЕМО/31 А/РШ/П

А/ПШЧ/Я

вМ/М/И

А/РМ/М А/№№33 А/СН1/И А/ЬЕЫ/Ю АДА1/М АЛИИ/ТТ А/ЕГЮ/Л А/И.*/» А/ОШЯ А/Т>ВЙ/37

11М-»

МКАМ.иУ[.ЬСЛРЛАТИЛШ'1.С1 аУНАШ^ТВТУрТУЬВКМУТУТ»« УМИ-ВВЯШОаСК 60

• Т. ........ ,

..(... АО. .. I . У. . V. . О. . . I . . . . О. . . I , . . из. . О. . . I . ... т.. а .. I.

. . 1,5 . . В. . . 1 .

I.. .. 1.$.. а ..«.

. К. , I . . . . . . В. . . I . . К. . I . . . . 1.2. . О. . . I . . К. . 1 . . . . ЬЗ . . С. . . 1.

I..

. N. .

. к.. . к. . . к.. . к.. . к..

..к

. . . I Г. . . . А........

• р.

.. н.,

.. к .. к

юа! APLQ2.OKCNI.AOR' |.(.ОМГВСаЫ1.ТУЗ$Ф$У1 УВТБОЗОМОТСУРООР! ВУВВЬКВ иа

. к. . к. . к. . к. к. . к.

н..

. . . . . . . .. рр. . Р. в. . . .... РИ.

. . . . . .. . Т. V .... . . . ОЗ . . РАЯ. . . ГЫ. в. . А. . . . .

.... ...... 5. ..» 1... Р8КК. . . !; А. Ш. В. • * » • 1 V А. .

..... ..... 8. . . V/ 1 , . . . . . . 5. У8КК. . . . . А. т в. . V. А. .

РвКК. . . . . А. РМ. в. • 7- А. .

гзкк.:. . . А. РМ. в. .... . V А. .

. . . .5. . 8 НИ. . , . . А. РИ. в. .... А. .

к.. . . . «У V. . . . . . . 5. . 8МЯ. . . . . А. РЫ. в. . 1 . . ; . А. .

. . , - в. . 81ЧК. . . . . А. PN. в. .... А. .

IГI К»1 . . Ч/ У. . . . .' . . 8. . 8 МК. . . . . А. PN. в. .... А. .

. . К. . .

. N.

(эиде

. . 5. . . 8. . . 5.

.. к. .. к. .. е. .. е.

. . 5. . . 3. . . 8. . . 8.

М55

V,

V.

V.

V.

V.

V.

У.

V.

V.

V.

V.

, з. «ни. к...... • ■ • ■ тввка..

, . . 8Н. КК. . . . К.....ТВАНО. 1

... внвик.... к.. V.. твамо. . . . . «К. ЯК. . . . К. . У. . ТВАМО. .

____н. и.... к.. V. .: твлмо..

. N.

. N. , . N. .

. N. . . Н. , . А... . К. , . И. .

. КМ

ты

РЕКРВ1 PrKTS8VTNUOTTKaVTAACr.YAaASSrYKNLLWLVKKBNSYriU.SK Ш . . К. . . . . Я. . . I. К. . . .. к. . .

. . И. . .

.. к..

.. к.. .

. . К. .

. . к. . .

.. к.. .

... в.

... в.

. . Е. . . ЕК . . . В. . , . ВК ,.. вк ... вк ... вк. ... вк.

в. мя..

N.....

-. РИ. . ЯУ. . ..

НУ. к..

ТУ. . . . НУ. я., N1. К. .

м. ■ к. .

N. . Я. .

N. . К. ,

N. .

.. . «И. . К. . . У8, 8КК. К. . , ...» ПК. К. . . . 5. 8НК. К. . . . 8НК. К.

. . ТЕ. . О. .

.. т.. со..

. . ТВ, N0. . . . ТВ. N0. .

. тв. на..

5 YVNNKOKBVLVLWOVHHrrr^TDOQSLVOKAOAYVJVOSJKYYRRFTPBI ААКГКУКОО 3»

. .1. - ----

. . I

в! I!.....

в... в...

........ . р.... N. К. К. . » » * «

. . 8№ К. . ! м! .. вн. ..; ут. N. N...... ¡ . в.. ,; о.

. . 83. ОВ. .... 8. ОМ. . . . А. . N. N...... . . * . ко.

... »N1 В. . кт«. яквм. . . . V. . и. N...... . к.. . ., н.

. . 8М В. . КТ1. яквн. . .-. V. . N. N...... . в.. ....

. . 1М а.. КА1. ИТ ЕМ. . . . V. . н. N...... . к.. ....

;. («1 В.. КП. кквк . . . V. . N. N...... . в.. .....

. . 8М В. . «Т. . яквн. . . . V. . N. N...... . в..

. . змвв. кг.. окон. ... V.: N. N.... . к.. !! о.

. V 8 N1 ВВ. кг.. икон. . .; V. . N. N...... . к., .. 0.

. . 8 N1 ВВ. кл.. ккоя. . . . V. . N. N....... . к.. .. о.

В. .V.

. ов...

. ов.,. •ов- • •

асишотултивгост! трватош.улмпгара1М|103'08 о! I и наг уносотксотр и зоа

. 8. . . .. . . . . V. * • •. -м.. 1 »а ..... N.., . . К

... К. .... 1 .. N.. . 1.. * .• .я. . Р. . . . . .8М.В. N... . . к

н. .... ......... 1 . 1.. . . . 8. . РЕ. . . . ,, . ем. Б. N.. . .. О

в. 1. . . ......... 1 .. N. . . 1. . . 8. . Р. . . . . . . . 1М№ . А.. ..О

,, I____ .;•».. . 1.. «м.. . . ; . Р. . . . .... 8М0Е. . .-.. . .0 ,

в. !. . . . .....В. . . 1 .. N. . 1 . ■ ш... . 8. .Г... . .... 5 МОП. . А..

1... . ----------1 .. N. ; . 1 . . «и.. . . .Г... . .... 8МОВ. ....

р. .........1 . 1.. .. . 8. . Р. . . .

р. . .». ........... . ■. . • . 1. . . .. . 8. .Г. ... ..... МО& .... . .О

оа! м$«1.ггтнгмт1 истштимтамнм I (к т.

за

. 1. . ... 0. .. к. ...... , . А. . . . V. . . , ,

. I.. .. 0. . к. . *. д. . ; , , , ,

. 1. . . . 0. .. к. . .. . . . V

.... . . 0. .. к.

. 1. . .. а. .. к. , , . , , .......V

.... .. а. ..к. , к.. . .

. 1. . .. а. .. к. . я.. . .

. 1. . . 1 о. .. к. . .. * , , , , ,

к. « * . • • . . •

. 1. . .. а .. к. , , ... ........

- ■. , . . о. .'. к. ....; . *.....,

Рис'. 19 . Выравненные амниоккслмиые последовательности НА1 субъединкц различных штаммов вируса гриппа А подтип» Ним.'

гсм&гглктшкнов

т

■Яг

» • » » а » • w а r> a h ¡> ¡3 ä к в h i i i i i i / i i Различил в последовательности аминокислотных остатков,

Рис. 20 Аминокислотные различия HAI (326 остатков,- 100?) при попарном сравнении последовательностей вирусов гриппа А серо-подтипа ЯШ^различшх^г^дов ^иркщи.

5 - бj: 7 8 -W57, 9 -UW77, II -Chi

МЫ

я а в *7 »да w в и » t

Роялти» * посягдоаатсльности аминокислотных остатка, %

Рис.

21 Аминокислотные,различия при попарном сравнении HAI вирусов типиа A/HINI по 33 CtOOf) .позициям, отличающим HAI штаммов А7Алмата/1417/84 и А/New

Обозначения: те же.

обособленные структурные подклассы HSWI, НО и HI в рамках одного структурного подтипа Оьданов и др., 1983). При определении степени гомологии НАГ всех вирусов по 33 позициям, отличающим последовательности обоих птамков KSWI установлены аналогичные закономерности (рис. 21)о В частности, при сравнении HAI изолята и .Tal /86 отмечено всего 8 замен, тогда как при сравнении HAI N1^/8/76 и Tal /86 - 27 замен остатков, что, по-видимому, свидетельствует об эволюционной близости первой пары вирусов.

Качественный анализ последовательностей (табл. 18, рис. 19) показал,, что стабильность структурного подтипа HINI обеспечивается, в первую очередь, неизменностью позиций остатков цистеина. Присутствие или замена в положениях-83„ 183 - остатков пролина, 60, 252 г триптофана, 138 - тирозина, 45-202 - глицина,, по-видимому, обуславливают стабильность организации молекул HAT HSWX как структурного подкласса» Вместе с тем HAI штаммов HSW INI

. различались мевду собой до некоторым структурно-значимым остаткам: 127-гли и 207-т1ф были шгаммаоспецкфичкы для А/AI /84, а 127-лиз для A/N$ /8/76. По числу сайтов гликозилирования и отсутствию такового а ключевой позиции 155-157, определяющей рецептор-связывамдие и антигенные свойства вирусов Н INI 50-80 гг., группу вирусов HSWT можно отнести к ранним серовариантам HÍNI. Однако локализация сайта гликозилирования в положении 87-89, не затрагивающем функционально и антигеннозначимые участки, свидетельствует о частичном структурном сходстве HAI HSWI и HI 50-80 гг., хотя при этом нельзя исключить сгерический эффект. В рецепторсвязыващей области HAI наличие остатков 183-про и 195-ала являются специфическими для HAI HSWI, а замена между НА! к/kl /84 и А/МЗ /8/76 асп-97-асп для последнего штамма специфическая.

Для сравнения аминокислотных последовательностей в антигенно-значимых участках использовали эквивалентные сайты на молекулах HAI HI, приведенные в работах ita¿ <1985), Uwon etat.,

(T992). В сайте ¡U HSWI имеются замены орех остатков. В позиции 127 HAIHSWI отличаются мевду собой и от НАГ вирусов 30-80 гг. (гли-глу-асц) соответственно. HAI At/84 иN^76 различаются по остатку позиции 129, при этом 129-лиз характерен дляАЕ/84, PI^34S Chl/83, и ТаГ/8б, в Г.29-арг - для N^/76, ¿en/80,MSR/77 к вирусов 50 г. К этому следует добавить, что в сайте Sa HAI вирусов 30-80 гг.

Таблица 18

Особенности аминокислотной последовательности в антигенно-, структурно-и функционально-аначшшх областях тягелой субъединицы гемаггдютинина вирусов Н5И/1М1.

Особенности последовательностей НА1

Число замен и совпадений остатков

Антигенные сайтн:?эцвп- ;Сайты:Струнтурно-значиаые аминокислотные --------:тор .тлико: остатки

Йа : : Са:СЙ:связы" :зили"

гвающая :рова-: Цие : Про

Три

Гли

Тир

Замены цегду штампами Л£/84 и Щ/76

Группоспецифические замены НЗисШ

Штамноспепифичоские эаиены; Ас/84 Щ/76

Сходство вирусов 30-х '- 80-х годов с:

76

нет

нет

нЗ/7е

нет

1 2

14 11

2 2

нет нет 1 нет нет 3

9 9

17 5 16 5

нет 2

11 9

нет нет

нет нет

нет нет нет 2

нет нет нет нет

9 9

нет 2

нет нет

16 16

5 5

1 2

1

нет

16 16

15 15

I

-о

был сходен с АС/84 по 14 позициям, а Njf/76 - по II. В позиции,перекрывающейся для сайтов Sa,Si> и рецепторного участка, остаток 155-глу был характерен для HAI вирусов HSWI и РД/Э4, хорошо размножающихся в куриных эмбрионах, но не для HAt WS^S (155-гли) -адаптированного к мыиам. По-видимому, в популяциях исследуемых штаммов превалирует высокоуражайный Н-зари ант, -что отличает их от популяции вирусов, изолированных от свиней, для которых свойственен низкоурожайный -L вариант < HlnshawMc?, i978{Kitboiuneetat # 1988} &uoneia£. , 1992). Замена в сайте 5а лиз-125-асн у НА! актуального штамма Tai/86 и тупикового штамма Феи/57 представляет собой особый интерес, поскольку 125-асн характерен для MI ранних вариантов H$Wi.H НО. Однако, в отличие от НА1Фел/57 у HAI Tal/86 в этом районе появился сайт потенциального гликозидирования. Одновременно произошла потеря такового в позиции 127-129, свойственного HAI большинства сравниваемых штаммов. Таким образом, в сайте За HAI актуального итамма произошла реверсия в позиции 125, важной как в антигенном отношении, так и для тканевого тропизма вирусов, и расположенной вблизи рецепторсвязывающего "кармана" («Dojüeks ei at Д985; Уд**»- et cd , 1992). у HAIHV57 аналогичная замена лиз-125-асн сопровождалась делецией остатка гис-!2бе что, возможно, явилось причиной прекращения активной циркуляции подтипа HINI в 1956-1957 гг.

В сайта Sü> мевду HAI А£/84 иN^76 различий не обнаружено, выявлены группоспецифические отличия HAI HSWt:152-вал, 156-асн, 195-ала, 196-ачп, а такке наличие 153чяиз у HAI HSWI и A/WSN/33, в отличие от HAI остальных вирусов 153-тро).-

Б участке Ca мэаду НА! АС/84 и W^f/76 наблюдается замена сер-142-асн, штаммоспецифическая для последнего, а также имеются группоспецифические для HAI HSW/I остатки: 137-про, 138-тир, 141-ала, 205-диз. Сайг С характеризуется наличием группосяецифичэо-ких остатков 69-лей, 72-гре, 74-сер.

Таким образом, пс степени гомологии последовательностей остатков всего полилептвда HAt, антигенно- и функциональнозначимых участков НА! изолят А?/84 и Н$/76 относятся к обособленному антигенно и структурному подклассу HSWT. Вместе с тем, по указанным параметрам последоз-лтзлыюсть HAI At/84 б.олое, чем последовательность HAI NJ/76 близка к последовательности HAI антигенно и орук-

турных подклассов вирусов НО и HI эпидемических вирусов человека. Указанные выводы согласуются с результатами секвенирования генов HAI вирусов свиней, выполненных недавно О^иопetat,1992). Так, степень гомологии последовательностей HAI Afc/84 с Njf/76 и вирусов свиней 1976, 1982 и 1988 гг. изоляции (89,9; 88,1; 89,0; 86,9% соответственно) существенно ниже таковой HAI N^76 и вирусов свиней (96,0; 96,6; 94,2%) и соответствует изменчивости на уровне подклассов. Различие в степени гомологии HAI штамма NJ/76 и вирусов HIHI гриппа свиней соответствует изменчивости типа дрейфа. Аналогичная степень гомологии последовательностей (.94,5%) была установлена при сравнении последовательностей HAI вирусов H3N2 гонконгской разновидности изолированных от человека и свиней ( Kuda it a?t X988). Авторы считают, что вирусы свиней. H3N2, являются результатом межвидовой передачи человек-свинья к/или человек-утка-свинья. Возможно, вирус подобный k/Sw¡ne/3cw&./15/30 также был результатом выброса пандемического вируса в популяцию свиней в I9I8-I919 гг. и последующей адаптации к этому хозяину (Фридман, 1986). Об этом свидетельствуют наши данные о том, что последовательности человеческих изолятов HSWINI, также как и эпидемические варианты подтипа HINI, не содержат потенциального сайта гликозилирования в позиции 276^78, специфического для HAT вирусов свиней (&uoaeta£ , 1992). Установленная нами ранее гомология значительной части гена HAI нзолята Aß/84 и к/SW/15/30 -гипотетического возбудителя "испанки" и высокая степень адаптиро-ванности НА! изолята к человеческой популяции позволяет предположить потенциальную способность штаммов, подобных вирусу А/Алматы/ 1417/84 стать этиологическим фактором новой пандемии HSWINI в * будущем. В пользу такого предположения свидетельствуют также данные о наличии реверсии в антигенно- и функционально-значимом участке и более высокой степени гомологии последовательности HAI современного варианта подтипа HINI - вируса А/Тайвань/1/86 и исследуемого изолята А-Алматы/1417/84.

4. Особенности биологии мвжэпидемических изолятов вируса гриппа А.

Изоляция реликтовых и межэпидемических вирусов в 1981—1986 гг. была осуществлена в подавляющем большинстве случаев о помощью метода прерванной инфекции, впервые примененного Ma.CJ.ssaC. (1969)

для выявления инфекционности РНК-полиыеразного комплекса вируса гриппа. Принцип сокультизирования инфицированных и неинфицирован-ных клеток позднее был применен Медведевой и др. (1988), А £ еег , Мачкил (1982) для увеличения выхода вируса при репродукции на культурах клеток. Известно, что для вирусов гриппа в условиях естественной циркуляции среди иммунного населения (Тарос и др., 1981), в эксперименте под влиянием иммунпресса (Иванова и др., t979), а также для вкусов, персиотирующих в клеточных культурах (Гаврилов, 1966; Зуев, Г970; Голубев, 1976; Неп1е, ,1964, \Х/и£-¡сиизоИ « 1972), в организме мышей (Зуев, 1957; Фролов, 1978), свиней (Лакорт, 1966) и человека (Фролов, 1978, Ногт'сзои ,1985) характерно снижение или отсутствие гекагглютинирующей й иммуноген-ной активности на фоне сохраняющейся способности к репродукции. Такая особенность биологии неэпидемических штаммов вируса является одной из причин, определяющих трудности их выявления, поскольку критерием его наличия или отсутствия в биологических жидкостях или тканях является реакция гемагглютинации (Тарос и др., 1981; Лузянина, 1986). Молекулярные механизмы снижения биологической активности возбудителя гриппа в не эпидемии практически не освещены в литературе. Имеющаяся информация касается лиеь вирусов с определяемой гемагглютинируюцей активностью (Щербинская, 1984).

В связи с изложенным дальнейшие исследования были направлены на разработку и усовершенствование способов индикации малоактивного возбудителя в первичных и "слепых" пассажных материалах и изучению особенностей с^зуктурвой организации'и функциональной активности гликопротеидов вирионов.

4,1. Разработка способа индикации антигена вируса гриппа в

клинических и секционных материалах.

Принято считать, что в смывах содержится такое ничтожное количество инфекта, что его невозможно обнаружить по основному маркеру вируса - реакции гемагглютинации, и поэтому методы экспрес-диагноатики гриппозного антигена непосредственно в материалах от " больных основаны либо на иммунохшических реакциях выявления комплекса антиген-антитело, либо на обнаружении единичных копий ьи-лусных генов в клетках, к сожалению пока недоступных для массового применения. Однако при исходном заражении куриного эмбриона . ^ смцвом от больного вирус чаото выделяется в значительных титрах

(до 1:512), что предполагает наличная инфекте более 10 вирусных частиц, дающих одну гемагглютинирующул единицу. Учитывая это обстоятельство, а также то, что вирус в смыве адсорбирован на поверхности назофарингиального эпителия, была сделана попытка десорби-ровать агент с помощью поверхностно-активных веществ-ПАВ. В основе действия ПАВ лежит их амфифильная природа, позволяющая им взаимодействовать как с гидрофильными, так и с гидрофобными участками белков. Поскольку степень солюбилизации белков в биологически активном, состоянии зависит от величин концентрации мицеллообразоЕа-ния (ККМ) и показателя гидрофильно-липо^ильного баланса (ГЛБ) детергентов для исследований были отобраны коммерческие детергенты: тритон Х-100 (ККМ 0,24 мМ, ГЛБ 13,5), Х-305 (ККМ 0,62 мМ, ГЛБ 17,3), твин-30 (ККМ 0,07 мМ, ГЛБ 15,0) и отечественный детергент МХК (ККМ 32 мМ, ГЛБ 15,5),синтезированнный старшим научным сотрудником Института химических наук АН РК Артамоновым А.Ф. и изученным доктором биологических наук В.Э.Еерезиным (1986). Наиболее мягким действием на целостность мембраны эритроцитов петуха обладали детергенты Х-305 и МЭСК. В отличие от Х-305 МЗСК десорбировал вирус с эритроцитов в концентрации,близкой к значению ККМ (0,50,75$) (рис.23).Результаты настоящего исследования^ также данные полученные Березиным (1986) указывают на неоднозначначный эффект детергента в диапазоне заданных концентраций: 0,5-0,75$ десорбции антигена вируса с клеточной мембраны; 1-2^-повышение проницаемости мембраны клетки; и еышэ - солпбилйзация глихопротеидов с поверхности вирусной частицы.- В эксперименте с культурой клеток почек собак и органной культурой трахеи и легкого цыпленка,зараженных вирусом, 0,5? МЗСК ускорял и повышал десорбцию репродуцированного вируса в кул ь тур ал ь ну ю среду,что позволило приступить к разработ^ ке способа индикации вируса в клинических материалах.Во время эпидемии заведомо положительные на грипп сиывы из носа от больных гриппом обрабатывали МЭСК в концентрациях от 0,01 до 2,0$ в течение 5-60 минут в диапозоне температур 20-45°С. Максимальные титры гемагглютинации обнаруживали при обработке 1,5% раствором МЭСК (0,75? конечная концентрация) в течение 15 минут при 37°с (рис. 24,25). Для оценки чувствительности и специфичности детергент теста по методике Сац а»чА МштсЬ (1987) 125 образцов смывов от больных исследовали параллельно в ИФА с использованием

МО 90 80 70 60 SO Ю 30 го ■ 10

I I I

! / \в

Sfà—i-^iC-c——

0,005 nos OJ Ofi 1 2 V

Рис.22. Влияние различных концентраций де-" тергентов на выход гемоглобина из

эритроцитов. 1-тритон XI0Q, 2-твин 40, 3-МЭСК. 4-тритоя X30J. По оси ордкнат - выход гемоглобина {%), по оси абцке - конечная концентация детергента (%)

0 О,WÎ ЦП 0,1 45 1,0

РИС .£3 .Влияние различных концентраций МЭСК и тритона Х-30.5 на процесс десорбции вирусов с эритроцитов. По оси ордкнат - % десорбции, по ося абцис конечная концентрация детергентов (%). 1,2,3,4 - вирус в присутствии МЭСК; За, 4а - вирусы в присутствии тритона Х305.

РИС .21.1 Обнаружение гемагопотииируютях рце,25» Влияние времени контакта смыва с агентоа в носоглоточных смывах от ' 0,75% детергеша МЭСК на степень

больных с помощью МЭСК. По оси гемагглютиикрующей активности. По

ордииат слева - обратные титры РГА, оси ординат - обратные титры РГА, по

справа - гемолиз эритроцитов в оси абцисс - время инкубации в мяв.

ОЕ549нм. По оси аСцис-концентрация МЭСК С/о)- 1,1 - положительные по

РГА смывы от болышх, Э - смыв от '

здорового пациента, 4 - смыв от больного пациента без обработки МЭСК, 5 - МЭСК, 6 - гемолиз эритроцитов в присутствии МЭСК.

смеси поликлональных гипериммунных кроличьих сывороток к актуальным вариантам типа А и В, а также изоляцией вируса методом прерванной инфекции. Установлено, что показатели частоты диагносциро-вания, специфичности и чувствительности разработанного способа индикации с помощью детергента достаточно высоки и сопоставимы с ®А (табл. 19).

За период 1986-1987 гг. разработанным способом было исследовано 1102 образца клинических и секционных материалов от больных гриппом, ОРЗ и постгршпозньми осложнениями (рис.26). Частота обнаружения гемагглютинирующего агента была наиболее еысокой в период эпидемии VТайвань/бб. Во время сезонной заболеваемости этот - показатель колебался в пределах 20-40$, а в летние месяцы - от 4 .до 20$ случаев. Идентификация агентов, содержащих 4 АЕ и выие непосредственно в смывах позволила диагносцировать грипп в 91,0$, 57$, 30,7$ от положительных случаев. Изоляция вирусов методом прерванной инфекции подтвердила результаты экспресс-диагностики в 88„ 81 и 70$ случаев.

В 1987-1990 гг. при исследовании с помошьв ПАВ 2958 проб смывов из носа от больных 0РВИ, гриппом, ОРЗ и пневмониями, наряду с индикацией антигенов актуальных вирусов, в II образцах (0,3$) был обнаружен НА антиген сероварианта Н51У1М1, в 20 образцах (0,6$) - НА антигена сероварианта НОН!, что свидетельствовало о продолжающейся циркуляции реликтовых вирусов в Алматы. В эпидемический сезон 1986.г. разработанный метод применяли для скрининга положительных проб на грипп, что позволило повысить частоту выделения вируса в 2,3 раза. В январе 1988 г. скрининг положительных проб с помощью ПАВ способствовал выделению возбудителя на .культуре ИДСК с 19,4 до 51,7$, что позволило расшифровать этиологию эпидемии гриппа в Алматы как А/Миссисипи/ 1/85(НЗ^) одним из первых в странах СНГ.

4.2. Функционыльные особенности гликопротеидов и разработка способа индикации вируса с неопределяемой гемагглютини-рующей активностью

Частота изоляции вируса гриппа, в межэпвдемический период ничтожно мала и несопоставима с таковой в период эпидемий (Лузя-нина и др., 1985). В постэпидемич'еский и межэпидемический периоды 1987 г. исследовали 392 смыва из носа и 825 проб парных сывороток крови от больных с диагнозом 0РВИ, ОРЗ и пневмонии. На фоне

Л ■.."".- Таблица 19

Оценка эффективности способа ранней диагностики гриппа по сравнению с референс методами »

Тест-метод ; Референс-^втод

Показатели диагностики, %

: Чувствительность : Специфичность

а + б

'т. 100

+ в

100

Общий показатель совпадения результатов диагностики

а + г

а + б ч- в + г

х 100

Датергент-Х тест (4

1. Изоляция вируса методом прерванной инфекции (56$)

2. ИМ (52Й)Х

64 56

81 66

72 62

-а оз

И$А-тес* (52*)х

1. Изоляция

вируса методом прерванной инфекции (56%)

69

. 63

66

Примечание: х-в скобках частота фактического диагносцирования,% от 125 случаев;

а - истинно полоЕительнне совпадавшие результаты; г - истинно отрицательные совпадающие результаты; б - лохноотрицательные; в - лох-нополохитедьные результата по данным тест-метода.

Сезднный подъем Зпидвмия Сезонный подъем

заоолеваемсти заболеваемости

1 1 '_-ч^———

19863 Ш7г

Рис. 26. Динамика обнаружения гемагглгатинирующего антигена в смывах от больных по фазам эпидемического процесса в 1986 г. и I квартале 1987 г. По оси абсцис - порядковый номер месяцев в году, по оси ординат - % индикации гемагглютинирующего антигена

положительной диагностики гриппа серологически в 42,7?, в других тестах получены следующие результаты: в детергент-тесте в 34,0?, в ИФА - в 43,2$ случаев, изоляция вируса стандартным методом (СТ) на КЗ была осуществлена в 0,4$, а методом прерванной инфекции (ПИ) в 60,4? случаев.

Для изучения причин низкой эффективности стандартного способа выделения вируса, было предпринято сравнительное исследование Функций гемагглютинина, нейрамикидазы и способности к репродук- * ции изолятов СТ и ПИ (табл. 20). В отличие от изо.-ятов ПИ у изоля-тов СТ регистрировали лишь гемолитическую (фузионную) функцию НА, что согласуется с данными

(1988), ЫоЬилсш/а , МаЦчпа (Г988) о способности N-терминальных гидрофобных пептидов НА соэфанять фузионную активность в отсутствие рецепторносвязывающей активности гемаггю-тинина. Имея в виду, что в экспериментальных условиях отсутствие нейраминидазной активности вируса гриппа приводит к снижению Или отсутствию гемагглгатинируодей активности вследствие сиалидизации

Таблица 20

Содержание свободных и связанных сиаловых кислот в аллантоисных культурах межэпидемических изолятов вируса гриппа и функциональная активность гликопротевдов

изолятов

изолята

:Гемаг- гНейра-?Гемо- :инфек-:глвтини- :мини- £лити- ;ционная :рущая глазная! чес- ; актив-:актив-х 5актив-:кая ; ность-:ность гноеть^актив-^эод.-. :-ят7+шйгвд^м.:52ета.:п /„Г

-ННВ:+ННБ;суб_

1 страт :фетуин1

540 -9.-1Ч _ :~ННВ:+ННВ;

.Тоталь-:В том ;ное ко-:числе £личест-:свобо-:во сиа-:дных !ловых :сиа-;кислот,!л0вых '.мкг/ал {кислот.

:В том числе связанных, гнедиализуемых сиаловых кислот,^

без обработки ННВ

после обработки ННВ

А/РН/8/34 , , 512 512 1,65

А/Ленинград/385/80 К 2362 ПИ 128 128 1,15

32 128 0,23

К ГОЗЗ ПИ 64 256 0,40

№ 1059 ПИ 32 128 0628

№ 1033 СТ 0 32

К 1034 СТ 0 64 0

№ 1035 СТ 0 8 0

К 1042 СТ 0 Тб 0

К 1043 СТ 0 2 0

№ 1045 СТ 0 32 0

К 1046 СТ 0 2 0

* 1051 СТ 0 8 0

№ 1059 СТ 0 4 0

№ 2362 СТ 4 32 0.02 0

Контроль 0 0

0,560 0,280 1,250 0,950 0,890 0,900 0,850 0,580 0,400 0,220 0,800 0,110 0,600 0,660 0,950

8,1 7,7 7 9 3 9 3,7 3 5 3 1 3 9 3,2 30 4,0 2,5 3,5 3,0 6 5

8,0

7.8 7,6 4,3

3.9 4,2 4,5

7,5

133+15 108+20 136+17 210+30 Ю7Т21 160719 134+17 161*20 108722 15ОТ18 178+17 120+23 160+23 180+27 153?17 48+12

О О

1.5*0,5

3,3+0,7 1,2+0,8 7,2+0,7 6,770,3 6,8ТО,5 0,8П,0 7,3*0,9 4,470,5 2,9+0,6 15,6+0,9 20,0+0,8 10,5+0,7 О

7,5+1,5 6,4+1,6 40,6+8,9 50,9+9,3 43,9+7,1 43,7+8,0 32,3+11,5 28,5?9,3 51,8+9,7 69,3+8,5 56,4+9,2 33,3*9,9 43,7+6,3 53,6+8.7 70,67Гб,1 6,271,7

7,1+1,8 6,2+2,0 21.3+7,1 26,0+9,2 25,1+8,2

Г7Д+2,2 15,671,6 27,1+8.0 39,4+10,2 29,3+8,5 18,2+3,5 22,8+5,8 30,5+11,3 34,6+12,5 5,8+1,5

Оо О

Примечание: ПИ-изолят,полученный методом прерванной инфекции; СТ-изолят,полученный стандартным кета дом; -ННВ-без обработки нейраминвдазой нехолерного вибриона.+ННВ-после обработки нейраминвдазой нехолерного вибриона; Х-обратные титры РГА.

рецепторных участков макромолекул гемагглютинина и аггрегирова-нию вирионов ( íbiese ¿tat , 1974, Шульц, 197Э), было предпринято изучение содержания сиаловых кислот и сиалоконьюгатов в аллан-тоисшх культурах природных изолятов СТ и ПИ и влияние обработки гетерологичной нейраминидазой (нехолерного вибриона) на состояние функциональной активности гемагглютинина (табл.20}. Оказалось, что в отличие от контрольных проб аллантоискых жидкостей, в аллан- -тоисных изолятах СТ и Пй содержатся не только связанные, но и свободные сиаловые кислоты, количество которых в изолятах СТ в два раза и более превышает таковое в изолятах ПИ. Количество связанных сиаловых кислот в изолятах СТ и ПК в несколько раз превосходит, такоЕое в аллантоисных культурах лабораторных штаммов. Полученные данные указывают на то, что при дефиците нейраминидазной активности вирусов в естественных условиях, также как и в эксперименте, происходит усияеиная сиалидизация вирионов, точнее рецеп-торного участка гемагглютинина, вследствие чего рецепторсвязывающая Функция этого белка ингибируется. Уместно отметить, что свободные сиаловые кислоты и низкомолекулярные сиалоконыогаты не инги-бируют гемагглютинацию вирусами ( Haywood , 1974). Обработка изолятов СТ гетерологичной нейраминидгзсй приводила к снижению количества связанных сиаловых кислот и выявлению гемагглютиниру-ющей активности, вследствии десиалирования. Вирусспецифичность гемагглютинирующей и гемолитической активностей изолятов СТ была продемонстрирована подавлением противогриппозными сыворотками к актуальным штаммам А/Тайвань/86, Е^Зсидароге/б/бб и реликтовому, штамму A/PS/8/34. Б результате исследований по оптимизации температурных, временных факторов инкубации и концентрации гетерологич-ного фермента (рис. 27) нами разработан способ индикации вируса гриппа с неопределяемой гемагглютинирующей активностью.

Предложенный способ позволил обнаружить репродукцию малоактивного возбудителя в жидкостях КЗ и ИСК, зараженных материалами от больных и здоровых лиц в межэпвдемические по гриппу периоды (Иаменова и др., 1989). По-видимому проникновение и репродукция Функционально дефектных частиц происходит за счет сохранения фу-зионной активности, усилении которой, вероятно, способствует агрегация частиц и снижение рН в области слияния с поверхностью клетки вследствие большого количества сиаловых кислот и их коньюгатов.

Пассирование на КЗ изолятов СТ методом прерванной инфекции

ЮМ

S12

3

я а 256

а

* а 128

1-

64

g 32

«i

Cv 1S

&

S В

4

а

aoi аоз ед/пл

О 5 10 15 зо СО

оков инку-10-

Рис. 27, Влияние дозы ферментов НН8 (а) и cdi бации (б) на проявление гемаггдютишшущей способности иа л ятов СТ (1), ПИ С 2), вируса А/РК/8/34. 4 - нонтроль - нормальная аллаитоисная падкость

или путем заражения концентрированных осаждением , способствовало репродукции вируса с определяемой гемагглвтинирувщей активностью (Д-вариант) (табл. 21). Напротив, пассирование изолята СТ методом предельных разведений приводило к воспроизводству вириодав с дефицитом нейраминвдазной и гемагглютинирующей активности (О-вари-ант). Изучение функциональной активностей и степени сиалидизации фракций 0- и Д-вариангов иэолятов СТ, полученных центрифугированием при 30000 об/мин к 10000 об/йин показало, что обе функции гемагглвтинина связаны,в основном, о надосадочной фракцией, а инфекционная активность - с осадком. Опаловые кислоты также определялись преимущественно в оупернатанте.

4.3. Структурно-морфологическая организация вирионов межэпидемических иэолятов • Электрофоретичэский анализ в ПА.Г болков осоэдаэмой и неосаж-даемой фракций О-варианта изолята выявил присутствие в осадке белка нуклеопротеида с ММ 53 и 56 кД и белка гемагглвтинина в мономерной и гримерной формах (рис. 28). Тример гемагглвтинина состоял

Функциональная активность,и степень сиализадии гемагглвтинина немпидеиичесного вируса гриппа

Таблица 21

Исследуемый материал

Инфекционная активность ЭИДоО

¡Геиолитическая :активность

: 0П542 ни

А1/88 •ША:Хе^д'к:М/аО_-Л/а4:^/54 ~Д~:~0: :~Д~: 0:

:Рецаптор-евязцвав-¡Содержание сиа-:щая активность, :лоьых кислот :титры РГА без ННВ : 0П54Э нц

: _ с ННВ :

■Л /88 :А£/8~4:2ел/о4 ТлГ/88"^84>е»/54

: Д ГоТ ГД~:~0:

Исходный

вирус 4,0 2,5 6,5 6,0 0,10 1,0 0,10 0,23 _32 0 128 6 4 0,02 0,15 О О

■ 128 8 128 64

Посла осаяде-ния при: 30 тыс.об.мин.

Осадок 4,5 3,0 6,5 5,6 0,01 0,16 0,

10 тыс.об.айн. Осадок

0,12 4 0 64 64

16 2 64 64

0,03 16 0 32 4

32 4 32 4

0,01 0 32 0

16 2 32 0

0,18 16 0 128 64

32 4 128 64

+ МЭ

-МЭ

—НА0*3

-МЭ +МЭ

НАа_ , --•■ «а НА5- •

' -сэ

-НА5 -МР

1

—НАа «¿г —ИР, НА!

НА-

2 1

—И

1 2

4 2 2

—НА2

1

Рис. 28. Злектуофареграмма спектра вирионных белков межэпидемического изоляга СТ после центрифугирования при 29000 об/мин, а - осадок, б - супернатант, I - лабораторный штамм, 2 - изолят СТ.

—НА

I

■сг —МР

¿»«А

т^Рис. 29. Элктрофореграмма спек-фа С -вирусспецифических белков в клетках МДСК через 5 часов после инфицирования межэпвдемическим изолятом СТ. I - лабораторный вирус, 2 - изолят СТ.

^^ ПН,N51 —N511

1 2

из мономеров менее подвижных, чем полипептиды мономеров. В присутствии восстановителя не происходило разделения мономеров на легкую и тяжелую цепи. В супернатанте О-варианта изолята CT обнаруживали только тримерную форму гемагглютинина, состоящую из более повижных мономеров, не диссоциирующих на полипептиды НАГ и НА2 в восстанавливвюи1их_условиях.11оскольку в обеих фракциях О-варианта определяли гемолитическую активность, отсутствие диссоциации цепей нельзя объяснить нерасщеплэнностью мономера в периоде процес-синга. Возможно, субъединицы гемагглютинина удерживаются вместе за счет стабилизации конформации молекул олигосахаридными цепочками ( ^аЕЬо^кгг ttûi ,1988). Таким образом, О-варианты межопиде-мйческого изолята характеризовались низкой продукцией белка NP с разной молекулярной массой, отсутствием мембранного белка. Минорные белки либо отсутствовали, либо не окрашивались из-за крайне низкой продукции Снейраминидаза, полимеразные белки), Гемагглю-тинин был представлен двумя видами мономеров с разной электрофоре-тической подвижностью, при этом более подвижные мономеры были организованы в тримеры и находились в основном в солюбилизированной форме.

С целью изучения спектра вирусспецифических белков, синтезирующихся в клетках при заражении О-вариантом межэпидемического изолята, лизат клеток МДСК через 5 часов после инфицирования подвергали электрофоретическому анализу (рис. 29). В указанный период инфекции в клетках синтезировались только белки МР и NSI, а также низкомолекулярный вирусспецифический белок о ММ 10—II кД, который согласно данным ^ucas etat (1988) является дефектной формой неструктурного белка NSI-продукта деЛетированного NS-гена, синтезирующегося во время персистентной инфекции в культуре клеток ВНК после инфицирования вирусом A/WSN /зз. Полученные дачные свидетельствуют о том, что спектр мажорных вирусспецифических белков при инфицировании О-вариантом такта характеризуется отсутствием синтеза М-белка. Отсутствие белка НАО гемагглютинина, по-видимому, можно объяснить либо его секретируемостыо в культуральную среду, либо низкой скоростью синтеза в исследуемые сроки индукции.

Электронномикроскопические исследования негативно контрасти-рованных препаратов Д-варианта меязпидемического изолята показали резко выраженный полиморфизм, склонность' к аггрегированию, наличие поверхностных субъединиц в солюбютизированном и аггрегированном

состоянии (рис. 30). Наблюдали разброс частиц от 20 до 180нм в диаметре. Длина филаментозных частиц да-стигала до .2500 нм, причем нуклеокапсидные и поверхностные структуры обнаруживались не на всем протяжении частицы. 20-40$ частиц в поле зрения были лишены швдкков полностью или частично. В препаратах выявляли также мембраноподобные структуры диаметром Гб нм, ассоциированные с нуклеокапсидами и шипиками» Вирусное потомство, репродуцированное в алдантоисе КЗ инфицированных 0-вариантом межэпвдемического изо-лята характеризовалось отсутствием полноценных вирионов. Поверхностные белки выявлялись вне нуклеокапсидных структур, последние обнаруживались либо в компактном виде, либо в виде собранных бус. Некоторые частицы были покрыты укороченными шипиками. В поле зрения также попадали мембраноподобные структуры, ассоциированные о рибосамами. При заражении клеток.МДСК О-вариантом в культуральной жидкости чаще обнаруживали мембраноподобные соруктуры, ассоциированные с хаотическим скоплением нитевидных образований различной длины, нуклеокапсидных клубочков и шпиков на разной стадии сборки частиц с отсутствующим слоем мембранного белка. Изредка в поле зрения обнаруживали полноценный внркон.

Таким образом, как в КЭ, так и в культуре клеток, инфицированных материалом от больных в межэпвдемическом периоде, репродуцировалось неполноценно© вирусное потомство, состоящее преимущественно из частиц, лишенных мембранного белка поверхностных структур и последние, в основном, находились в солюбилизированном и аггрегированном состоянии. Полученные морфологические данные указывают на их сходство с продуктами экспериментальной абортивной гриппозной инфекции (Букринская и др., 1988) и модельных персис-тентных парамиксовирусных инфекций ( Анджапаридзе и др., 1982; R.oax , Wald. Vogel , 1982; 'Dafcot? ^ie^ eta£ , 1982; Магакд, 1982). В естественных условиях персистенцш вирусов в ввде нук-леокапендов описана только при подостром склерозирующем панзнце-фалите, вызванном вирусом кори ( Haa.»e t 1981). Важно отметить, что вирус кори обличается от остальных представителей семейства миксовирусов отсутствием неяракинидаэы и способность» легко устанавливать лерсистенгную инфекцию как ин виво, так и нн витро (Аедкппаридзо и др., 19Ш), что указывает на значительную роль н?йрамин«дазы в репродукции вирусов, содержащих этот фермент.

.»Л

а

Л

Рис. 30. Морфологические варианты вирионов и вирусспецифи-ческих структур межэпидемического изоляга. Окраска ФВК. Инстр» увел, х 80 ООО. а.<5 - изолят ПИ, выращенный в КЗ; в, г - изолят СТ, выращенный в КЗ, д, е - изолят СТ; выращенный на ЩСК.

По-видимому, сохранение вируса гриппа в ыежэпидемический период обусловлено перепетопцией в отдельной организме субвирусных структур, вюшчавщих РНД-полимэразный ноши ей с, а такхе геыагглотинин с блокированной рецепторсвязнвасщей и выраженной фузионной активностьо. Это предположение согласуется .с результатами экспериментов по моделированию персис-тентной инфекции вирусом А/РК/8/34 (Иванова и др., 1989), вирусом А/ 1Х/5л/ /33 ( СХсипроч е1 а1 , 1981) на культурах клеток. Авторам удавалось до 390 дня перепетенции.обнаруживать МР балок в составе свободных рибосоы в цитоплазме НА -в составе плазматических мембран; Весьма вероятно, что нув-леокапсиды могут высвобождаться из клеток путей вакуолизации и циркулировать в крови в виде нуклэосом, либо путей ци~ тодеструкции, обусловленной их аккумуляцией в значительных количествах ( К1йга.1гдк. <& а? г 1982), а такае путем слияния участков мембран порахенкнх клеток тесно контактирующих с соседними иеэаракенннии клеткаци ( Мес^Ыг аI 1987; Ри]1п.ат1 , ОЕДз^оле 1 1988). В генетических экспериментах с

-мутациями в генах М ( ^а^я-ш^о. , Нотта ( 1981), НА ( РьЛХлалк &о1 , 1986; ЗскоЙ1в«е4. , 1988), МА (ЬесИ <гка1 1971; В-геигимд р 1986, 1Э87) почкование и выход вирусных частиц, дефектных по одному из продуктов указанных генов, бнл возиоген. С.другой стороны, фенотипические особенности мегэпидемических изолятов ииевт иного общего с фенотипом персистирушаих вирусов - это снижение или отсутствие гемагглютинирушцэй активности, низкая инфекционная активность, сильная редукция синтеза структурных белков (Усши^ег 1980). Весьма вероятно, что мутации в некоторых сегментах РНК проявляются й фенотипе и мехэпидецических и персистируо-щих вирусов гриппа. По нашиы денным, пбпломер гемагглотинина находится преимущественно в растворимой форме, вероятно, вследствие дефекта в синтезе М белна или в результате отсутствия гидрофобного якорного доиена. Различная элвктрофоретк-ческая подвихность мономеров НАО связана, по-ввдицому, с нарушениями процессов гпикозилирования, дисульфидного созреванья или укорочения длины полипепгида (Зайдес и др., 1986; Свлииова, 1992). В наших условиях постановки электрофореза

НЛО не был разделен на цепи НА 1 и НА2. Однако наличие выра-Iэнной функции слияния заставляет сомневаться в нарушении кливедха предшественника НА, С другой стороны, есть данные о том, что хотя вирус с нерасщеплэнным НАО репродуцируется в оболочках КЗ только в месте инокуляции и не распространяется в соседние участки, он является патогенным для цыплят ( SchoÊ-Ussei et а? , 1988). Мн такхе нашли,что в белковом спектре ыехэпвдемического изолята GT белок NA отсутствует, но в изолято ПИ зарегистрирована ферментативно активная ней-раминидааа. Этот факт согласуется с результатами исследований Boss and Wavjak (1990) об обратимости точечных мутаций на ^-плоскости "головки" фермента, которнэ ведут к нарушению тетрамеризации полипептида и включения в оболочку вируса. С отсутствием нейраминидазной активности природного ¡¿вхэпиде-цического изолята, как и в экспериментах с -fcs -мутациями гена А ( Pafese étal , 197 4) связана наблюдаемая нами усиленная сиалидиэация и агрегация молекул НА. Другой путь нарушения синтеза и созревания "поздних" белков может быть связан с синтезом в клетках, инфицированных изоллтом СТ, белка идентифицированного, согласно данным Hiueaç et ad (1988), как делегированный продукт гена NS . Недавно Тгеалоь- et a£ ( 1991) установили воэмо1ность восстановления функции дефектного NS1 белка.за счет реверсии вал-23-ала на Jj-спирали вторичной структуры N -терминального конца полипептида, компенсирующей делецио аминокислотных остатков в участке 66-7?. Вероятно, обратимость мутаций в№иМАгенах tS-мутантов ■ является одним иа механизмов реактивации ыехэпидемических и реликтовых вирусов.

Таким образом, мн предполагаем,. что такие генетические механизмы, кап нарушение транскрипции ыРНК, изменения рамок считывания в 7, 8 генах,IS-мутации в 6 генах, ответственные, Но мнений Ttieîf ut ai ( 1984) за фенотип персистенции вируса гриппа ин витро, возможно действупт и при персистенции нехэпидемических и мехпандемических вариантов вирусов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Вопрос о возникновении новых подтипов вирусов гриппа А до сих пор остается открытии, поэтому обнаружение и изучение особенностей вирусов, подобных родоначальникам прошлых пандемий является одним из вахнейиих аспектов этой проблемы.

Результаты наших исследований значительно расширили и обновили список антигенных "анахронизмов", пополнив его штацца-ии вирусов гриппа А/Н1М1/,' подобными возбудителям "испанской" пандемии и первому вирусу гриппа, выделенному от человека - АА^И/ЗЗ. Преадо всего необходимо было учесть, что в настоящее время в лабораторных музеях сосредоточен основной генофонд вирусов гриппа человека за последние 50 лет, что но иснлючало случайный выброс вирулентных штаммов прошлых лет в человеческую популяцию или лабораторную контаминацию при выделении или пассировании штампов. Изоляция и идентификация вирусов в разных лабораториях, отсутствие в последних прототипных эталонных штаммов, наличие в енворотнах крови больных изолированных сероконверсий к изолятаи, антигенные, биохимические и молонулярно-биологические отличия их от ре-форенс-штагшов - все это свидетельствовало об ауг'ентичкости, реальной длительной сохранении и периодическом выделении от людей реликтовых штаммов вирусов гриппа Н1М1. Исследования последних лет показали, что штамм "русского гриппа" (Н1М1), который появился вновь в мае 1977 г, и впоследствии распространился по всему миру, не был полностью идентичен вирусу А/ Poгt Х1/й.х1еу1 /1/50, как это было установлено Иака^тае^аС (1978), SaK.ofti.eseL е1 а? (1978),на уровне точности олигонуклео-тидного анализа , Уоипд (1982). При изучении нуклео-

тидной последовательности Уоиад е£ о! (1983), АНтассеъ,

(1988) обнаружено 9 мутаций в гене НА. и И мутаций в гене ЫР. Авторы установили, что вирус А/СССР/90/77 в течение 27 лет сохранялся в человеческой популяции, а не в хивотном резервуаре. Выделенный'наш штамм А/Алматн/1417/ 84, этиологический агент подъема сезонной заболеваемости гриппом в 1984 г., по гену НА такге был практически идентичен вирусу классического гриппа свиней А/З^/С/о^а. /15/30, что не исключает наличия в последовательности гена НА точечных нутаций в функционально или антигенно значимых участках. Этот вопрос могет ёить решек в будуцем в результате секвенирования НА гена а/^/"Лм/д. /15/30. Б последнее времг; различными методами установлены тесные филогенетические связи ивхду генами ЫР, МА, НА, М5 , М вирусов аД^Ы/ЗЗ, А/РК/8 и вирусами /15/30 и А/&^/5ЬоРе /31,

но не "свиных" изолятов от людей 1977-1989 гг., которые близки к современным вируса« [UNI человека ( E>u(6 U/HO 1981; ujo-zman. U а? 1990). В опытах с МКА НА свиные изолятц такав разделяются на ранние i\/SW/Jowa. /15/30 и A/SW/Komö-ридх/1/ЗЭ) и поздние ('свиноподобные от людей 1967-1982 гг.) варианты ( Austin ,Wkfe&tet ( 1986). Приведенные данные поаво-ляют спекулировать, что A/WSN/33, A/PR/8/34 и A/SVf /15/30 произошли от агентов, вызвавших пандемию 1918 г. Сопоставляя даннно литературы и собсгээнные исследования т предполагаем, что вирус А/Алматн/1417/84 является дрейф вариантой возбудителя пандемии 1918 г. значительно более, чей лтамм А/ /8 76, адаптированная к человеческой популяции. Хотя иимуноло-гичаски и методом олигонуклеотидного анализа структура НА иэолята была практически идентична таковой НА A/SW/5owa/i¿/ 30, обнаружение в сыворотках больных штаммоспецифичесних со-рононверсий к изолятам А/Алмагы/1417/84 и А/Алматы/1382/84 позволяет предполагать минорные замены оснований в гене НА изолятов, связанные, на наш взгляд, с эволюцией в процессе переистенции в человеческой популяции.

Огромный фактический материал накопленный в вирусологии свидетельствует, что молекулярная эволюция вирусов идет по пути нейтрализма (Цилмнений, 1990). Биологический смысл теории нейтральности молекулярной эволюции Klmuta (1985) состоит в том, что в основе перестройки генетического материала легат не воздействие внешней среди, а независимые от них фиксации нейтральных (не затрагивавших хизкенно важных функций) и почти нейтральная мутаций, накопление которых не контролируется отбором и создает условия для осуществления резких эволюционных сдвигов в геноме, нал с положительным, так и отрицательным эффектом. Внезапное скачкообразное появ- • лениэ изменении* штаммов узе известных вирусов ялляю>тся, по мнегшю Цялинсного ( 1990), особенностью внутривидовой микро- . эволюции PHÍÍ-геномных вирусов. Помимо эволюционной роли ной-траль пне' мутации осуществляют также защиту от форсированной эволюции. Суть ее заключается в том, что вахные в функциональной отношении белки и иодирующие их участки гона изменяются медленнее, чем менее вахные. Так, скорость эволюции

ГИПОТЕТИЧЕСКАЯ МОДЕЛЬ СОХРАНЕНИЯ ВИРУСОВ ГРИППА А Б ЧЕЛОВЕЧЕСКОЙ ПОПУЛЯЦИИ

Возможные молекулярные механизмы персвсгскцкн вируса

Ковоермцв* вр-пури Я функции реп роду кпадого шиуяя • РНП №Я-меразного »*жпдгксд (сегшевты !,ДЗ к оолхпевтапм РВ2. РВ1. РА, КР>

Дмпвм в I ссгмеягте в

I №руимик рсг)гйтоувв4 фуввцкя СП* тем сегмсктаа 4,6,7 «аакруючп "шмя-юте" беля

К^Леяяс оиюм М-бма*

Нлрушсявс сборки ицмяи

Нзлфеш сппсм РДОедзз

Нлрутжаж аптеза сггаеяге» • поодяей сади. Свщоашд рецеп-тормого еяйта бела НА

Нлруюевяв свякзл N щююсша НА

Карушеаяе мяхсрнвяш я йсмбраяу, яятябкшп * "тнутччщт* фуп*

цвк еря отрмкя фумоюсй шя^

'♦•"О

"О

о

пвш<0е|

а

а вЕЗ<о 5

о

до

1

о % *Д °Д л л А да^ «V

< аУ/

о < о

Рецкркуликяя ^А? ° « оф о

Ч>\Ъ ^ пжп

У А, Лаальим

V юшшжл

рслнгтовкх вирусов Сезлоси

® 194Э-США

1955-Квза*ет»м ■щ 1976тС ША-о 1980-Роесмя

■ 1984-85

Кяихетам

Vе*0

Спорадическая

И 1949~Фр*мций. 1950-Камяда. 197б-У*р*мм*.1931-Роесия. Казахстан. 1982- РАКОН1 В 1974 -8&-СШ А. Боягаои». Кази-ствн, Швейцария, Нидер ленды

О 19б8-63-Г«рыания.Роееи«. Камхстм

= _. О п^а

§

* Л *-'

«ь "О 0 *•/> о '»»О

& ♦♦о

о «Й» п°СОоО-

о ♦

%

0 о О □ о О о

Обозначения: {3 Н1М1-Н5ШГЛ а

И НШ1-Н0Ж в

□ шш-шш а

О Н2М2 о

Д НЗМ2 &

Перснстирующне »грмнты

. Возможные молекулярные механизмы рециркуляция реликтовых штаммов

Реакткшацяя персистру-юпца •гейша путпе:

1) рекрелй в 8 ССГМСНТС кодирующем белк

2> жомплеиентэцяи с 7,3 ССГ ■

меетямг I] этиемячески птушюто отчмл

3) еиутрмилстронноЯ аома-леметаям с 4,6 шжетэмл ю эмиемпссо* «паяльного пгпчмд того же ссропол-птл

Аиягмые ореобдоом-яжртосттд бели» НА ■ КА згаипипееп XX-туалышх опзмм» иутек

1) постепенного мажоплепяя ре*срсшя «сегмент4 ябс ооиедуюоипе свамгом

2) ■иуг^шцктроивой ресом-бямадвеА с шъиьятжуя 4 я в вережтаруюшего мринш ■и и же серооодпше

Рхс.31»

генов вирусов гриппа РВ1, Р32, РА, МР, М намного ниже, чей таковая генов НА, МА, а скорость эволюции гена занимает срединное положение и более равномерна во времени, чем скорости эволюции остальных генов ( РаРе$е , Уоикчэ , 1983; &иоиси|и-йс Л а1 , 1Э86).

Исходя из теории нейтральности молекулярной эволюции К1тига ( 1985), основываясь на работах Аискеиг? (1942-1983),сЬйусггрог1 ее сх (1953-1969), Сиородинцова, Лузяниной ( 1969-198 4), Т-сас^ег (1986), Норе-^трзои , УоЕмбе* ( 1987),

, Ба&о ( 1983) и на результатах собственных исследований нами разработана гипотетическая модель сохранения вирусов гриппа в человеческой популяции (рис. 31). Основным ее содержанием являются: ограниченность пандемических вариантов; их персистенция в иммукологичесяи толерантных организмах в виде консервативного репродуктивного модуля (гены'1,2,3,о) с дефектными в функционально значимых областях генами 4,6,7,8; рецикличность появления в человеческой популяции, связанная с "молекулярными часами" эволюции вирусных геномов, отражающих цикличность природных.явлений. Эпизодическое появление в циркуляции атипичных по отношению к процессу естественной изменчивости вирусов случается в результате накопления спонтанный мутаций, реверсии, а танхе межгенных и внутригенннх реассортаций и комплементаций с актуальными вирулентными штаммами (Петров и др., 1986; Сандахчеев и др., 1988, 1989; Киселев, 1989; Голубев, 1990; Гринбаум и др., 1992). Вирусы "анахронизма" могут вызывать спорадическую, сезонную заболеваемость локальную вспышку в закрытом коллективе. Их пандемическое распространение возможно, по-видимому, после прекращения циркуляции актуальных штаммов, исчерпавших свои эпидемические потенции. Вои.касзи/ио е£<^ ( 1986) предполагают, что наиболее вероятным кандидатом на роль молекулярных часов в эволюции возбудителя гриппа является ген 8, кодирующий N51 белок. Может быть, перенасыщение нейтральными мутациями именно этого гена приводит к сдвигу и является пусковым механизмом появления вновь дремлющих пандемических вариантов.

ВЫВОДЫ

1. В результата многолетних комплексных исследований установлена циркуляция ранних серовариантов вирусов гриппа A/H1N1 среди населения г.Алматы, показано их участие в этиологии спорадической и сезонной заболеваемости гриппом.

2. Разработан способ изоляции вируса гриппа основанный на прерывании инфекции на раннем этапе с последующим совместным культивированием инфицированных и наинфицирован-нкх клеток хорионаллантоиеной оболочки в КЭ, позволяющий повысить частоту выделения возбудителя в неэпидемический период.

3. Впервые от людей изолированы вирусы гриппа A/H1N1-серовариант НОМ 1, подобные эталонному вирусу A/wsw/33. Установлены антигенные, структурные и функциональные отличия бачков изолированных и прототипных штаммов. Путем клонирования методом бляшек выявлена гетерогенность популяции изолята H0N1, включавшая субпопуляцию птичьего сороподтипа в качестве вируса-помощника.

4. Впервые от лидей изолированы вирусы гриппа A/H1N1-серовариант KSW1N1, подобные вирусу классического гриппа свиней A/SwineCbwa /15/30. Установлены их различия мехду собой и с эталонными штаммами по биологическим свойствам, антигенной структуре геыагглвтинина, нейраминидазы, нуклеопро-теидного белка, составу и электрофоретической подвихности сегментов генома, олигонуклеотидным спектрам 4 и 6 сегментов РНК.

5. Установлено, что первичная структура тяхелой субъединицы гемагглютинина вирусов HSW1N1, выделенных от человека и свиней отличается по наличие у последних потенциального сайта гликоэилирования в позиции 276-278,. По степени гомологии аминокислотной последовательности ЙА1 штамм А/Алматы/ 1417/84 более близок к вариантам НШ1 человека и менее сходен с вариантами HSW1M1 свиней, чек шташа A/N^/8/76. Вира-хенноо сходство НА! штамма А/Алиагн/1417/84 и H1N1 человека в антигвино- и функциональнозначимых участках предполагает потенциальную эпвдекическуп значимость изолята.

- 95 -

6. Разработан способ экспросс-диагносуики гриппа с помощью детергента \02li. По чувствительности и специфичности способ сопоставим с мотодои имыунофвриентного анализа, но

в отличие от него технически прост и не требует особых реактивов и оборудования. Метод эффективен для экспресс-диагностики гриппа в острой и латентной фазе заболевания и для скрининга полохительннх проб с цель» повышения выделения вируса.

7. Разработан способ индикации вируса гриппа с неопределяемой г емагглютинирующей активностью с помощью гэтероло-гичной нейраминидазн (нехолерного вибриона). Способ прост и доступен в выполнении, эффективен для обнарухения вирусов гриппа с пониюнной биологической активностью.

8. С помощью разработанных технических приемов впервые удалось выделить и изучить пир.усн гриппа с неопределяемой геиагглютинирупщей активностью, циркулирующих в ивхзпидеми-ческок периоде. Лехэпидоиическив изоляти характеризуются гетерогенностью вирусной популяции по антигенным свойствам, морфологическим формам вирусннх структур, отсутствием нейра-минидазноИ активности, блокированием рецепторовяэывающэго участка гемагглотинина, вырагенной фузионной активностью. Обнаружено нарушение структурной организации вирионов, заключающееся в отсутствии У и ЫА белков, вырахенной редукцией синтеза белков пол«неравного ионплекса ЫР и НА.

9. Применение разработанных гестов позволило обнару- -хить днтигенешш/виромио у родильниц, иоворохденных и детей с хроническими неспсцифичоскими заболеваниями легких и ретроспективно изучить коррелятивную взаимосвязь с патологией матерей и детой.

10. Показано, что при моделировании медленной гриппозной интенции на мышах, у вирусов, изолированных от пищат

с патологией, происходит реактивация функций НА1 и МА и усиление репродуктивной активности. Впервые установлена способность гликопрогевдов и, отдельно, нейраминидаан вируса гриппа А индуцировать врожденную патологию у цнией.

11. Предложена гипотетическая иодель сохранения вируса гриппа А в человеческой популяции, сущность которой заилю-

чается в цикличности персистенции и реактивации 5 пандемических вариантов вирусов гриппа в соответствии с теорией нейтральности молекулярной эволюции Кипита (1985), роли и механизмов миироциркуляции реликтовых вирусов на различных этапах эволюции возбудителя.

- 97 - •

Список оciiOHHux работ, опубликованных по матзриаяам диссертации

Г. Ким Э.Б Чувакова З.К., Исаева Е.С.» Михайлов Г.Г., Бирюкова Т.Е. Эффективный метод выделения вируса гриппа на куриных эмбрионах. Вопр. вирусол., 1975, i б, о, 732-734.

2. Иржанов С.Д., Исаева Е.С., Соколова Н.Н., Чувакова З.К, Способ обнаружения вируса гриппа. Авторское свидетельство

№ 639941. 1978 (ДСП).

3. Иржанов С.Д., Байжомартов М.С., Прозоровский С.В., Кара-гулова К.А., Соколова Н.Н., Стеценко О.Г., Ярема Г.В., Исаева Е.С., Чувакова З.К. Царевский Л.Л., Шаврина И.А. Применение органных культур трахеи цыплят для Еыделения респираторных вирусов и Mycoplasma Pncumon.0^ больних. Методические рекомендации. Алматы. 1979, [9 с.

4..Исаева Е.С., Чувакова З.К., Иржанов С.Д., Ким Э.В., Соколова Н.Н. Способ получения вируса гриппа. Авторское свидетельство № 780538. 1980 (ДСП).

5. Чувакова З.К., Исаева Е.С., Ким Э.В. Прерванная гриппозная инфекция клеток куриных зародышей в системах ин виво и ин витро. Тезисы докладов I конференции вирусологов Казахстана. Алма-Ата, 1982, с. 282-284.

6. Чувакова З.К., Ким Э.В., Ф.урсова J.M., Исаева Б.С., Склян-ская Е.И., Доценко Г.Н. Биологические и физико-химические характеристики вирусов гриппа A/CCCP/8l(H0NI), выделенных из секционного материала детей раннего возраста в Алма-Ате. В сб. Иммунология вирусных и михоплазменныЗс инфекций. Алма-Ата, 1983, с. 107—110.

7. Чувакова З.К., Фурсова Л.М., Ким З.В., Доценко Г.Н., Исаева Е.И., Исаечнко В.А., Исаева Е.С., РовноваЗ.И., Косяков П.Н., Закстельская Л.Я., Жданов В.М. Антигенный и биохимический анализ белков вируса гриппа А/СССР/Алма-Ата/13/81 с гемагглютинином HI. Вопр. вирусол., 1984, № б, с. 667-672.

8. Чувакова З.К., Фурсова Л.М., Ким З.В., Склянская Е.И., Исаева Е.С. Биохимическое доказательство аутентичности штаммов вирусов гриппа А серомртитWS/33), выделенных при вирусологическом обследовании секционных материалов детей. Известия АН КаЭССР,

сер. биол., 1984, * 3, с. 51-54.

9. Чувакова З.К., Фурсова Л.М., Исаева Е.С., Демьяненко И.В.

Впиякие гликопротеидов вируса гриппа на состояние проницаемости легочных кашЬГяров мышей. Вопр. вирусол., 1985, К I, с. 43-46.

10. Чувакова З.К., Ровнова З.И., Исаева Е.И., Шаврина И.А., Исаева Е.С., Ким З.В., Перебоева Т.А., Бондарева Р.И., Демьяненко И.В.,- Мукажанова Г.Н. Циркуляция среди людей вируса гриппа А, антигенно сходного с вирусом гриппа свиней. Известия АН КазССР, сер. биол., 1985, № 2, с. 65-71.

11. Чувакова З.К., Ровнова З.М., Царевский Л.П., Исаева Е.И., Исаченко В.А., Шаврина И.А., Ким Э.В., Бондарева Р.К., 'Исаева Е.С., Косяков П.Н. Вирусологическое и патоморфологическое изучение гриппозной инфекции у детей в период 1982-1983 гг. Вопр. вирусол, 1985, № 4, с. 402-409.

12. Чувакова З.К., Ровнова З.И., Исаева Е.И., Ким Э.В., Игнатьева Т.Е., Шаврина И.А., Царевский Л.П., Исаева Е.С. Три случая изоляции вируса гриппа А с гемагглютиккном HSW[ 0т людей в 1983 г. в Алма-Ате. Вопр. вирусол., 1985, * 5, с. 530-536.

13. Чувакова З.К., Исаева Е.С., Фурсова Л.М., Демьяненко И. В., Ким Э.В., Мукажанова Г.Н., Ровнова З.Й., Шаврина И.А. Изучение вирусов гриппа А,циркулировавших в межэпидемические периоды I98I-I984 гг. в г. Алма-Ате. В сб. Фундаментальные науки в медицине. Алма-Ата, 1986, с. 60-62.

14. Чувакова З.К., Ровнова З.И., Исаева Е.И., Демьяненко И.В., Исаева Е.С., Ким Э.В., Шаврина И.А., Перебоева Т.А., Бондарева Р.И. Вирусологический и серологический анализы циркуляции вируса грш -па A(HINI), подобного сероварианту A(HSWINI), в 1984-1985 гг. в Алма-Ате. Ыурн. микробиол., опидемиол. и иммунобиол., 1986, № 10

с. 30-36.

15. Фурсова Л.М., Чувакова З.К., Исаева Е.С. Изменение полипептидного состава и бляшкообразующей активности клонированного варианта вируса гриппа А. Тезисы докладов 1У конференции биохимиков республик Средней Азии и Казахстана. Ашхабад. 1986, с. 360-351.

16. Чувакова З.К., Фурсова Л.М., Ким Э.В., Демьяненко И.В. Патогенетические функции гликопротеидов вирусов гриппа, .связанные с их нейраминидазной и гемолитической активностью. Там же с. 364-365.

17. Фурсова Л.М., Чувакова З.К., Исаева Е.С. Иммуноструктура к серовариантам вирусов гриппа А и В при микроопидекиологическом иеследовании. В сб. Биология вирусов гриппа. Алма-Ата, 1987,

с. 120-127.

18. Чувакова З.К., Ким Э.Б., Демьяненко И.В. Исаева Е.С. Получение и анализ моноспеци^ической сыворотки к очищенной нейрами-нидазе вируса гриппа А/свинья/ Айова/15/30. Известия АН КазССР, сер.биол., 1987, № Ц, с. 57-60.

19. Демьяненко И.В., Чувакова З.К., Исаева Е.И., Склянская Е.Й., Комаров Ю.С., Ким З.В., Платонова А.Л., Исаева Е.С., Ров-нова З.И. Иммунологический анализ поверхностных компонентов вируса гриппа А, подобного сероварианту А/SWI/Nl/, изолированного в Алма-Ате в 1984-1985 гг. Вопр. вирусол. 1987, № 5, с. 533-538.

20. Чувакова З.К., Исаева Е.С., Толмачега В.Л., Ким Э.В., Шаманова М.Г., Фурсова Л.М., Ирханов С.Д., Бондарева Р.И., Шдври-ria И.А,, Перебоева Г.А. Способы повыиения эффективности выделения вируса гриппа. Методические рекомендации. Алма-Ата. 1987, 13 с. (ДСП).

21. Исаева Е.И., Чувакова 3»К., Березин В.Э. Гликопротеи-ды ортомиксовирусов. Монография. Алма-Ата. Наука. 1988. 168 с.

22. Демьяненко И.В., Шилов A.A., Чувакова З.К., Чайка О.В., Исаева Б.И., Григорьева Т.А., Ровнова З.И.,Исаева Е.С., Косяков П.Н. СроЕНительная характеристика гемагглютинина вирусов гриппа

А с антигенной структурой HSVfINt, выделенных от человека и животных. Вопр. вирусол. 1988, »2, с. 157-162.

23. Фурсова Л.М., Чувакова З.К., Еаврина И.А., Бондарева Р.И., Исаева Е.С., КимЭ.В., Бейсембаева Р.7. Использование модифицированного метода изоляции вируса гриппа на культуре клеток почек собак при расшифровке вспышки гриппа,в Алма-Ате. Известие АН КазССР, сер.биол., 1988, »3, с. 60-63.

24. Толмачева В.П., Исаева Е.С., Чувакова З.К., Ким Э.В., Шаврина И.А. Сравнительная оценка методов быстрой диагностики гриппа. Известие АН КазССР, сер. биол. Í988, № I, с. 65-69.

25. Чувакова З.К., Исаева Е.С., Шаменова М.Г., Толмачева В.П., Ким Э.В., Фурсова Л.М., Ниеткалиева С.А. Способ диагностики гриппа Авторское свидетельство № 1510533, 1989 (ДСП).

26. Чувакова З.К., Демьяненко И.В., Чайка О.В., Шилов A.A., Ким З.В., Ровнова З.И., Исаева Е.И., Исаева Е.С. Антигенная специфичность нейраминидазы и структура генов нейраминидазы вирусов гриппа A(HINt) - серовариант HSMNI, выделенных от человека и животных. Вопр. вирусол., 1989, № б, с. 656-660.

27. Демьяненко И.Е., Ровнова З.И., Исаева Е.И., Чувакова З.К.

Антигенная структура гемагглвтиника вирусов гриппа HINl(HSWlHI), выделенных от людей и уток. Вопр. вирусол., 1989, № 6, с. 661-665.

28. Фурсова Л.М., Чувакова З.К., Исаева Е.С. Получение и характеристика клонированных вариантов вируса гриппа А/СССР/13/81 (HINI-N3). Вопр. вирусол., 1989, № 6., с. 669-675.

29. Чувакова З.К..Биология ранних серовариантов вирусов гриппа А и их значение в патологии человека. Тезисы докладов ХУ1П съезда Всесоюзного общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов им. И.И.Мечникова. Москва. 1989. т. I, с. 2W-25I.

30. Исаева Е.С., Толмачева Б.П., Чувакова З.К., Артамонов

A.Ф., Петелина О.Г., Еаменова М.Г. Способ ранней диагностики гриппа. Авторское свидетельство К- 1630488. 1990 (ДСП).

31. Чувакова З.К., Исаева Е.С.» Ровнова З.И., ИЬменова М.Г., Ким Э.В., Фурсова Ji.И., Шаврина К.А. Изучение Функциональной активности гликопротеидов межэпидемических изолятов вируса гриппа. Вопр. вирусол., 1990, $ U, с. 286-289.

32. Шилов A.A., Чувакова З.К., Демьяненко Н.Б., Чайка О.В., Исаева Е.И., Ровнова З.И. Радиоиммунологический шелигонуклеотид-ный анализ вируса гриппа A/HSttlNI), изолированного от людей и животных. Acta vitofogixa , 1990, т. 34, вып. 3, с. 303.

33. Чувакова З.К., Склякская Е.И., ймникова G.G., Комаров Ю.Н., Семенова Н.П., Платонова A.C., Исаева Е.И.« Ровнова З.И. Радиоиммукологический анализ нуклеопротеидкых белков вирусов гриппа HS'AINI, выдаленкых от человека и свиней. Тезисы докладов Всесоюзной конференции ЕМ0, секция II. Вирусы'растений, животных и микроорганизмов. Алма-Ата. 1990, с» III.

34. Фурсова U.M., Ким Э.В., Чувакова З.К. Структурна-биоло-гические особенности Eipyca гриппа "свиней", персистирувцого в организме человека» Там же, с. 107.

35. БекпемишеЭ А.Б., Назарова Л.И., Филимонов Н.Г., Блинов

B.М., Гринев A.A., Чувакова З.К., Ким З.В., Кукажаноза Г.Н. Полная нуклеотидная последовательность гена гемагглптинина вируса гриппа А/ А л ма -А та/ ГЯ7/ 84 (HINI-серовариант KSVINI). Тезисы доклада П Всесоюзного симпозиума по молекулярной биологии. Ашхабад. 1991, с. 105.

■ 36. Чувакова З.К., Еаменова М.Г., Фурсова Л.М. Биохимическая природа вирусов гриппа, персистирувщих в природе. Тезисы док-

_ TOI -

ладов У конференции биохимиков Средней Азии и Казахстана. Ташкент, 199t, с. 392.

37. Чувакова З.К., Ким 3.В.,Исмаилова Ю.С. Роль гдикопротвидов вирусов гриппа HSW.NI в патогенезе экспериментальной инфекции. В сб. Биология вирусов гриппа человека и животных. Алма-Ата*. 1991, с. 126-129.

38. Фурсова Л.М., Чувакова З.К., Шаменова М.Г., Попова Е.И. Структурно-функциональные особенности межэпвдемического изолята вируса гриппа А. Там же, с. 112—118.

39. Чувакова З.К., Ким Э.В., Чувакова Т.К., Исмайлова B.C., Шаменова М.Г.Дубаныпева К.Б. Вертикальная передача вируса гриппа от матери плоду. В сб. Микрососудистов русло в условиях патологии и эксперименте. Алма-Ата. 1992, с. 114-116.

40. Исмаилова U.C., Чувакова З.К., Ким Э.В. Патология сосудов микроциркуляции легких под влиянием нейраминидазы вируса группа А. Там не, с. 50-52.

41. Zuev V.A, IChûtUonovû А.Н.,' Btjkovsic^ci S.1., CKuvabyaZ K.. P-topeiiy of different vizat proteins io indue« -Ute spongiform encephalopathy. Alçtzads " dfihinattonal Symposium " 400 i^ears oj

.vLzoHoqu Moscou. Щ 92 , p. 102.

42. Чувакова 3.K., Исмаилова Ю.С., Ким Э.В., Мукаханова Г.H., Зуев В.А. Индукция вирусом гриппа А(НШХ-серовариант HSWINI) и его гликопротеидами врожденной патологии у мышей. Вопр. вирусол. 1993, № !.. с. 2-6.

43. Беклемишев А.Б., Назарова Л.М., Филимонов Н.Г., Блинов В.М., Гринев A.A., Чувакова З.К., Ким Э.В., Мукажанова Г.Н. Синтез, клонирование и определение первичной структуры полноразмерной ДНК-копии гена гемагглвтинкна вируса гриппа А/Алма-Ата/ 1417/84(Н1М1-серовариант HSWIMI). Молекул, генетика, микробиол. и вирусол., 1993, № 2