Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности реассортации современных штаммов вируса гриппа с донорами аттенуации живой гриппозной вакцины

ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Особенности реассортации современных штаммов вируса гриппа с донорами аттенуации живой гриппозной вакцины"

На правах рукописи &

БАЖЕНОВА Екатерина Андреевна

Особенности реассортации современных штаммов вируса гриппа с донорами аттенуации живой гриппозной вакцины

03.02.02 - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2015

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Институт экспериментальной медицины»

Научный руководитель доктор биологических наук, доцент

Киселева Ирина Васильевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, ФГБУ Жилинская Ирина Николаевна «Научно-исследовательский институт гриппа» Минздрава России, ведущий научный сотрудник

доктор биологических наук, Красильников Игорь Викторович

профессор, ФГУП «Санкт-Петербургский Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток и Предприятие по производству бактерийных препаратов» ФМБА России, заместитель директора

Ведущая организация ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»

Защита состоится 24 апреля 2015 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 001.026.01 на базе Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П. Чумакова» по адресу: 142782, г. Москва, поселение Московский, поселок Института полиомиелита, 27 км Киевского шоссе.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П. Чумакова» и на сайте http://poliomyelit.ru.

Автореферат разослан: « Г » ./-¿а-^Ч 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Романова Лидия Юрьевна

н;УС-\РСТВЕ.ННАЯ БИБЛИОТЕКА

~~—"ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одним из важных признаков вируса гриппа, как вируса, обладающего сегментированным геномом, является его способность к реассортации. Реассортация в природе может привести к шифтовым изменениям антигенной структуры вируса с появлением нового антигенного варианта. В лабораторных условиях принцип реассортации используется при подготовке штаммов живой гриппозной вакцины (ЖГВ) (Александрова, 1977; МаавваЬ е1 а1., 1990; \Vareing е1 а1., 2002). В основе лежит скрещивание «дикого» (\УТ) вируса с холодоадаптированным (ХА) донором аттенуации с последующим отбором реассортантов, унаследовавших от «дикого» родителя гены, кодирующие гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (ЫА), а внутренние гены - от донора (формула генома 6:2). Допускается также формула генома 5:3. Этот принцип используется и для подготовки штаммов инактивированной (ИГВ). В этом случае в качестве источника внутренних генов используется донор высокой урожайности А/РЯ/8/34 (Н1N1).

Существенной трудностью работы с противогриппозными вакцинами, отличающей их от других профилактических препаратов, таких, как вакцина против клещевого энцефалита, кори, полиомиелита и пр., является необходимость постоянной смены состава вакцинных штаммов, обусловленная непрерывным процессом эволюции вируса гриппа.

Отдел вирусологии Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Институт экспериментальной медицины» (ФГБНУ «ИЭМ») является единственным в России структурным подразделением, на которое Министерством здравоохранения России возложена обязанность ежегодной подготовки вакцинных штаммов сезонной ЖГВ. В соответствии с рекомендациями Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) в отделе вирусологии дважды в год готовят новые вакцинные штаммы - для южного и северного полушария, и затем передают их в ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава России для производства ЖГВ в России и в ВОЗ - для развивающихся стран (Индия, Китай, Таиланд).

В последние годы ЖГВ заняла лидирующее место в мире среди профилактических противогриппозных препаратов. По мнению экспертов ВОЗ, ЖГВ является наиболее эффективным средством защиты восприимчивой

популяции от вирусов гриппа, вызывающих не только сезонные эпидемии, но и глобальные пандемии.

Все вышесказанное определяет важность изучения биологических характеристик вируса гриппа для понимания механизмов, лежащих в основе реассортации вирусов гриппа, с последующей разработкой методических подходов, которые облегчили бы процедуру скрещивания «диких» вирусов с донорами аттенуации.

Степень разработанности темы. Несмотря на то, что вирус гриппа изучают на протяжении более, чем восьмидесяти лет, большая группа вопросов пока не нашла своего ответа. В частности, причины, по которым одни вирусы легко вступают в реассортацию, а другие - нет, до настоящего момента не известны. Опубликована всего одна работа (Subarrao et al., 1995), в которой описаны сложности получения реассортантов вакцинной формулы генома. Зависимость результатов скрещивания от конкретных биологических свойств родительских вирусов практически не изучалась. Не ясна роль других вирусных белков, кроме гемагглютинина, в формировании устойчивости к неспецифическим ингибиторам сыворотки крови.

ВОЗ, рекомендуя новые кандидаты для подготовки гриппозных вакцин, учитывает только антигенную актуальность и новизну гриппозных штаммов, в то время как такие характеристики рекомендованного «дикого» вируса, как его чувствительность к неспецифическим ингибиторам сыворотки крови, может поставить под угрозу возможность подготовки в срок вакцинных штаммов (Ларионова и др., 2006).

Вопрос об оптимальном соотношении фенотипических свойств «дикого» родительского вируса, используемого для подготовки ЖГВ, был очень кратко описан в работе (Maassab et al., 1990), в которой предлагалось предварительно клонировать «дикий» родительский вирус при повышенной температуре для придания ему большей вирулентности.

На фоне достаточно большого числа работ, посвященных биологии вируса гриппа (Lamb et al., 1981; Palese, Shaw, 2007; Neumann et al., 2009 и др.) и вакцинопрофилактике вызываемого им заболевания (Alexandrova et al., 1984, 1996; Каггоп et al, 2009; Rudenko el al., 2001, 2008, 2014; Talaat et al., 2011, 2013

и др.) пока еще трудно сделать однозначный вывод о том, какое влияние определенные биологические свойства современных штаммов вируса гриппа могут оказывать на их способность к реассортации с ХА вирусами; какие сложности возникают при подготовке вакцинных штаммов на основе современных сезонных и потенциально пандемических вирусов гриппа, каковы причины этого явления и существуют ли реальные пути их преодоления.

К моменту начала нашей работы систематические исследования в этом направлении в мире не проводились. Монографий на данную тему, а также защищенных диссертаций в открытом доступе не имеется. Все вышесказанное определяет важность изучения биологических характеристик вируса гриппа, а оценка особенностей реассортации современных штаммов вируса гриппа с донорами атгенуации ЖГВ представляется весьма актуальной.

Таким образом, основной целью работы явилось изучение влияния биологических свойств современных вирусов гриппа на их способность к реассортации с донорами атгенуации живой гриппозной вакцины.

Для решения поставленной цели в задачи исследования входило:

1. Разработка экспресс-метода оценки состава генома реассортантов, подготовленных на основе современных штаммов вируса гриппа.

2. Изучение основных биологических свойств современных эпидемических и пандемических штаммов вируса гриппа (устойчивости репродукции за верхними и нижними пределами температурного оптимума, чувствительности к неспецифическим ингибиторам сыворотки крови) и оценка их влияния на эффективность подготовки вакцинных штаммов живой гриппозной вакцины.

3. Оценка возможности использования реассортантов для инактивированной вакцины на основе вируса А/РКУ8/34 в качестве источника гемагглютинина и нейраминидазы для подготовки вакцинных штаммов живой гриппозной вакцины.

Научная новизна работы. Доказано, что NA вируса гриппа вносит определенный вклад в формирование его чувствительности к неспецифическим ингибиторам сыворотки крови млекопитающих и играет важную роль в реассортации «диких» вирусов гриппа с донорами аттенуации.

Впервые продемонстрировано наличие констелляции НА и РВ2 генов у некоторых вирусов гриппа. Эту жесткую связь не удается разорвать методами классической реассортации.

Показано, что в последние 20 лет при подготовке ЖГВ частота получения реассортантов с вакцинной формулой генома снизилась практически в два раза. Установлено наличие прямой связи между частотой получения вакцинных штаммов и фенотипическими свойствами «диких» родительских вирусов.

Теоретическая и практическая значимость работы. Показано, что получение вакцинных штаммов при реассортации «диких» вирусов гриппа человека и птиц и ХА доноров аттенуации во многом определяется уникальными фенотипическими свойствами «дикого» родительского штамма. Наиболее высокий выход вакцинных реассортантов достигается при использовании холодочувствительных, температуро- и ингибитороустойчивых «диких» родительских вирусов. Предварительная инактивация «дикого» родительского вируса ультрафиолетовым облучением позволяет существенно повысить эффективность подготовки вакцинных штаммов ЖГВ на основе современных вирусов гриппа человека и птиц.

Установлено, что не только гемагглютинин, но и нейраминидаза вируса гриппа вовлечена в формирование его ингибиторочувствительного фенотипа.

Разработан экспресс-метод оценки состава генома реассортантных штаммов вируса гриппа, подготовленных на основе современных «диких» штаммов вируса гриппа человека и птиц и доноров аттенуации.

Методология и методы исследования. Методологической основой исследования послужила совокупность вирусологических и молекулярно-биологических методов. В ходе работы использовались как классические методы исследований, так и авторская методика экспресс-анализа состава генома реассортантных вирусов гриппа.

Основные положения, выносимые на защиту. Современные штаммы вируса гриппа обладают широким набором фенотипических свойств от высокой устойчивости к репродукции при повышенных температурах инкубации до холодоустойчивости и чувствительности к неспецифическим

ингибиторам, содержащимся в нормальной сыворотке крови млекопитающих, что влияет на эффективность их скрещивания с донорами аттенуации ЖГВ.

В последние годы при подготовке вакцинных штаммов ЖГВ значительно снизилась частота получения реассортантов, наследующих от «дикого» родительского вируса гены, кодирующие НА и ЫА, а остальные гены - от ХА донора аттенуации. Если до 2000 года количество реассортантов с вакцинной формулой генома составляло 50,8%, то после 2000 года не превышало 26,4%. Наиболее высокая частота получения вакцинных штаммов достигается при скрещивании доноров аттенуации с «дикими» вирусами, устойчивыми к неспецифическим ингибиторам.

Показано наличие жесткой констелляции генов, кодирующих нейраминидазу и РВ2 субъединицу полимеразного комплекса, в составе вирусов гриппа А/Н5. Данную связь не удается разорвать методами классической реассортации с донором аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (Н2Ш).

Личный вклад автора заключается в непосредственном планировании и выполнении всех экспериментальных разделов работы и обработке полученных данных. Автором лично проведен анализ литературных и собственных данных, обобщены результаты исследований и подготовлены материалы к публикациям.

Внедрение результатов работы в практику. Подготовлены и переданы в производственные институты четыре вакцинных штамма сезонной ЖГВ на эпидемические сезоны 2012-2013 гг. (А/17/Виктория/2011/89 (НЗЫ2), В/60/Висконсин/2010/125) и 2013-2014, 2014-1015 гг. (А/17/Техас/2012/30 (НЗШ), В/60/Массачусетс/2012/10) и один штамм потенциально пандемической ЖГВ А/17/Индиана/11/72 (НЗШу) на основе выделенного от человека вируса гриппа свиней. Штаммы депонированы в Государственную коллекцию вирусов (Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского. ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Д.Ф. Гамалеи» Минздрава России) под номерами 2723, 2724, 2737, 2740 и 2739. Документация на подготовленные штаммы направлена в Федеральную службу по интеллектуальной собственности. На один штамм получен патент РФ, а на три штамма имеются положительные решения.

Все исследования входили в плановую научную тематику отдела вирусологии им. А.А.Смородинцева ФГБНУ «ИЭМ».

Степень достоверности и апробация результатов диссертации. Достоверность и обоснованность результатов работы обеспечена использованием современных средств и методик проведения исследований, значительным объемом работы, большим массивом статистически обработанных данных и комплексным анализом полученных результатов.

Апробация работы осуществлялась на протяжении всего периода проведения исследований. Основные положения диссертации были доложены и обсуждены на 24 отечественных и международных научных конференциях и симпозиумах, в том числе, на 17-м Международном конгрессе медицинских наук (ISCOMS) (Гронинген, Нидерланды, 2010); на VII Международном конгрессе по контролю за гриппом (Гонконг, Китай, 2010); на Четвертой конференции Европейской научной рабочей группы по гриппу (ESWI) (Мальта, 2011); на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы эпидемиологии на современном этапе», посвященной 80-летию кафедры эпидемиологии и доказательной медицины ГОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М.Сеченова Минздравсоцразвития России (Москва, 2011); на Международном конгрессе «Человеческий фактор риска» Союза управления рисками в профилактической медицине (URMPM) (Лондон, Великобритания, 2012); на Научной конференции «Грипп: вирусология, эпидемиология, профилактика, лечение», посвященной 45-летию ФГБУ «НИИ гриппа» Минсоцздравразвития России (Санкт-Петербург, 2012); на VIII-m Международном конгрессе по контролю за гриппом (Кейптаун, ЮАР, 2013); на V-м международном симпозиуме по гриппу, проводимому Европейской научной рабочей группой (Рига, Латвия, 2014), а также на заседаниях отдела вирусологии им. А.А.Смородинцева ФГБНУ «ИЭМ» (2010-2014) и Межлабораторной конференции ФГБНУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П. Чумакова» (2015).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 научных работ, в том числе 6 в российских журналах, входящих в Перечень рецензируемых изданий, рекомендованных ВАК, 3 - в зарубежных журналах, индексируемых в

международных системах цитирования (библиографических базах - Web of Science, Scopus, PubMed).

Объем и структура диссертации. Объем работы составляет 122 страницы машинописного текста, включая 28 таблиц и 6 рисунков. Список литературы включает 216 наименований, из них 47 отечественных и 169 англоязычных.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ (1). МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Вирусы. (1) Полученные из CDC и ВОЗ «дикие» вирусы гриппа А и В и вакцинные штаммы ИГВ на основе донора высокой урожайности A/PR/8/34 (PR8); (2) ХА доноры аттенуации отечественной ЖГВ, А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) (Л/17) и В/СССР/60/69 (В/60), являющиеся собственностью ФГБНУ «ИЭМ», Санкт-Петербург, РФ; (3) ХА вакцинные штаммы ЖГВ, подготовленные лично автором или сотрудниками отдела вирусологии им. А.А.Смородинцева ФГБНУ «ИЭМ».

Культивирование вирусов в развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ). Вирусы инкубировали в 10-11-дневных РКЭ, полученных с птицефабрики ООО «Племрепродуктор Назия» (Ленинградская область) при 32°С. Титр вирусов рассчитывали по Reed и Munch (1938) и выражали в lg ЭИДзо/0,2 мл.

Оценка температуре- и холодочувствительности вирусов гриппа. Активность репродукции вирусов гриппа А и В при разных температурах оценивали по результатам титрования в РКЭ, инкубированных при пермиссивной (32°С), повышенной и пониженной температуре инкубации. Вирус считали температурочувствительным, т.е. имеющим Is фенотип, если разница в титрах при повышенной и оптимальной температуре составляла не менее 5,0 lg ЭИД5о/0,2 мл, и температурорезистентным, т.е. обладающим non-ts фенотипом, если этот показатель не превышал 3,0 lg ЭИД5о/0,2 мл. ХА считали штамм, для которого разница в титрах вируса при пониженной и оптимальной температуре не превышала 3,0 lg ЭИД50/0,2мл (са-фенотип).

Титр сыворотки определяли в реакции торможения гемагглютинаиии (РТГА). регламентированной методическими указаниями МУ 3.3.2.1758-03, с

использованием 4 АЕ антигена и 1,0% взвеси эритроцитов кур или человека 0(1) Rh+ группы.

Чувствительность вирусов гриппа к неспеииЛическим ингибиторам сыворотки крови проводили в РТГА, используя в качестве источника ингибиторов (ИГ) сыворотку, полученную из крови морских свинок (ФГУП «Питомник лабораторных животных «Рапполово»), и сыворотку лошади («БиолоТ», Санкт-Петербург). Вирусы считали ингибитороустойчивыми (ИУ) при титре сывороток в РТГА < 1:40 и ингибиторочувствительными (ИЧ) при титре > 1:80.

Животные. Белые беспородные крысы, половозрелые самцы с массой тела 200-300 гр., и морские свинки, самки-альбиносы с массой тела 300-350 гр., полученные из ФГУП «Питомник лабораторных животных «Рапполово». Работа проводилась в соответствии с «Правилами лабораторной практики» (2010) и была одобрена Локальным этическим комитетом при ФГБНУ «ИЭМ».

Получение реассортантов осуществляли в РКЭ по стандартной методике (Александрова, 1977), включающей скрещивание двух нативных вирусов («дикого» вируса и донора аттенуации), селективные пассажи в присутствии антисыворотки к донору аттенуации при пониженной до 25°С температуре инкубации и клонирование. Определение состава генома реассортантов проводили по разработанному нами методу микс-ПЦР, описанному ниже.

Статистическая обработка. Достоверность полученных результатов оценивали стандартными методами с помощью /-критерия Стьюдента и критерия х2- Обработку данных проводили с использованием программ «MS Office Excel», «Statistica 6.0» и «SPSS». За величину уровня статистической значимости было принято значение р<0,005.

(2). РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Разработка метода микс-ПЦР для анализа состава генома реассортантных штаммов вируса гриппа. Изучение феномена реассортации вирусов гриппа во многом определяется наличием адекватного метода анализа состава генома. Для определения принадлежности генов реассортантых вирусов гриппа описаны разные методы, такие, как электрофорез вирусных РНК в полиакриламидном геле (Odagiri et al., 1982; Palese, Schulman, 1976;

Snyder et al., 1988), мультиплексный ПЦР-анализ (Ha et al., 2006; He et al., 2009; Lee et al., 2010), рестрикционный анализ (Brett et al., 2002; Klimov, Cox, 1995; Offringa et al., 2000) и некоторые другие. Однако, эти методы не всегда позволяют гарантированно судить о чистоте исследуемого препарата.

H1 Н2 Н1+Н2 нз НЗ+Н2

М1 231 231231 23123М

Рисунок 1. Микс-ПЦР анализ принадлежности гена, кодирующего нейраминидазу, вирусу гриппа A(H1N1) или A(H2N2) Сверху - анализируемые вирусы: Hl - WT вирус A/Brisbane/59/07 (H1N1); Н2 - донор атгенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2); НЗ - WT вирус А/Вrisbane/10/07 (H3N2); Н1+Н2 - смесь WT вируса H1N1 и донора атгенуации H2N2; НЗ+Н2 - смесь WT вируса H3N2 и донора аттенуации H2N2. Снизу - вирусспецифические праймеры: 1 - праймеры к NA донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2); 2 - праймеры к NA WT вирусов гриппа А(Н 1N1); 3 - смесь праймеров к обоим вирусам; М - маркер молекулярного веса.

Нами был разработан экспресс-метод микс-ПЦР, позволяющий не только оценить состав генома реассортантов доноров аттенуации с вирусами гриппа сероподтипа Н1, НЗ, Н5 и вируса гриппа В, но и выявить в одной реакции возможную контаминацию одного вируса другим. Метод также может быть использован при типировании изолятов от больных или лиц, привитых ЖГВ.

На рис. 1 приведен анализ принадлежности гена, кодирующего NA. В качестве WT вируса использован штамм A/Brisbane/59/2007 (H1N1). Как видно из рисунка, праймеры, специфические для NA «дикого» вируса H1N1, одни или в смеси с праймерами к H2N2, позволяли получить ПЦР-продукт, чего не происходило при использовании одних только праймеров к вирусу H2N2. При использовании смеси двух вирусов (H1N1 и H2N2) и смеси вирусспецифических праймеров (H1N1 и H2N2) в гель-электрофорезе наблюдается четкое разделение фрагментов ДНК разной длины.

Используя разработанный метод, был определен состав генома 924 реассортантов.

Основные биологические свойства современных вирусов гриппа и их влияние на подготовку вакцинных штаммов живой гриппозной вакцины.

Вирусы гриппа различаются между собой целому ряду фенотипических характеристик. Спектр таких признаков очень широк. Так, вирусы гриппа могут отличаться по их устойчивости к химиопрепаратам, скорости элюции с эритроцитов, степени трансмиссивное™ и вирулентности, урожайности в различных субстратах, способности к репродукции за верхними и нижними пределами температурного оптимума, чувствительности к неспецифическим ИГ нормальной сыворотки крови и т. д. Данные свойства вирусов представляют собой теоретический интерес при изучении эволюционной изменчивости вируса гриппа, а также важны в прикладном аспекте при подготовке вакцинных штаммов ЖГВ. В последнем случае на первый план выступают такие свойства вирусов гриппа, как их способность к репродукции в широком диапазоне температур и ингибитороустойчивость.

В ранних работах при определении /.v-фенотипа исследователи, как правило, ограничивались одной повышенной температурой инкубации, - для вирусов гриппа А она составляла 40°С, для вирусов гриппа В - 37°С или 38°С (Медведева и др., 1971; Alexandrova et al., 1990). В нашем исследовании изучены особенности репликации 35 современных вирусов гриппа H1N1, H3N2 и В в более широком диапазоне температур: для вирусов гриппа А - 38—40°С, а для вирусов гриппа В - 36-38°С. Было показано, что современные вирусы обладают широким спектром чувствительности/устойчивости к повышенной температуре инкубации, от высокой температуроустойчивости пандемического вируса A/Califomia/07/09 (HlNl)pdm до темпсратурочувствительности вируса A/Nanchang/933/95 (H3N2).

Анализ способности современных вирусов к репродукции при пониженной до 25°С температуре показал, что основная масса (80%) всех вирусов гриппа А и В была ограничена по этому признаку. Этот показатель особенно важен при подготовке ХА вакцинных штаммов, поскольку при скрещивании двух ХА вирусов WT вируса и донора аттенуации) теряется важный селектирующий фактор. Однако, было обнаружено некоторое число штаммов, обладающих определенной устойчивостью к репликации при 25°С.

Анализ чувствительности современных вирусов гриппа к неспецифическим ИГ проводили с использованием сывороток крови морской свинки и лошади. Показано, что все вирусы гриппа А(НШ1) обладали четко выраженной устойчивостью к неспецифическим ИГ нормальной сыворотки крови, в то время как вирусы гриппа А(Н31^2) обладали как ИЧ, так и ИУ фенотипом. Вирусы гриппа В линии Ямагата характеризовались выраженной чувствительностью к термостабильным ингибиторам сыворотки крови морской свинки и лошади. Вирусы гриппа В Викторианской линии в основной своей массе были ИУ, за исключением штамма В/№уа<1а/03/11. Это согласуется с данными Ивановой и др. (2011) о том, что в последние годы среди штаммов, принадлежащих к Викторианской эволюционной ветви, стали появляться вирусы, проявляющие высокую ингибиторочувствительность.

Таблица 1. Примеры различных комбинаций фенотипических свойств

_вирусов гриппа А и В_

Фенотип при температуре инкубации

38° 39° 40° 25° ИГ-устойчивость

AyCalifomia/07/09 (HlNl)pdm non-ls non-ts non-ts non-ca Устойчив

A/Indiana/10/1 l(H3N2)v non-ls non-ts non-ts non-ca Чувствителен

A/Panama/2007/99 (H3N2) non-ls non-ts non-ts ca Чувствителен

A/Perth/13/95 (H1NI) non-ls non-ts non-ts ca Устойчив

A/Texas/50/12 (H3N2) non-ls non-ts ts non—ca Чувствителен

A/Nanchanß/933/95 (H3N2) IS ts ts non-ca Чувствителен

Вирусы гриппа В Фенотип при температуре инкубации

36° 37° 38° 25° ИГ-устойчивость

B/Malaysia/2506/04 non-ls non-ts non-ts ca Устойчив

B/Brisbane/60/08 non-ts non-ts ts ca Устойчив

B/Texas/06/11 non-ls non-ts ts ca Чувствителен

B/Massachusetts /2/12 non-ls non-ts ts non-ca Чувствителен

B/Nevada/03/11 non-ts ts IS non-ca Чувствителен

B/Wisconsin/1/10 Is ts ts non-ca Чувствителен

Некоторые вирусы, в частности 1М1В1Ш-23 (Н51Ч1) и АЯехаз/50/12 (НЗШ), обладали разной степенью ингибиторочувствительности к сывороткам морской свинки и лошади. Оба вируса были чувствительны к ингибиторам сыворотки морской свинки и устойчивы к лошадиной сыворотке. В связи с этим в последующих разделах нашей работы использовалась сыворотка морской свинки как дающая более широкий спектр положительных результатов.

Т.о., было показано, что циркулирующие вирусы значительно различаются по таким биологическим свойствам, как температуро-, холодо- и

ингибиторочувствительность. Продемонстрировано, что современным вирусам гриппа А и В присущи разные комбинации этих фенотипических признаков. Примеры возможных комбинаций приведены в табл. 1.

К сожалению, рекомендуемые в последнее время ВОЗ вирусы все чаще имеют ^-фенотип, а также чувствительны к неспецифическим ИГ нормальной сыворотки крови. Как будет показано ниже, эти свойства «дикого» родительского вируса могут негативно влиять на процесс подготовки ЖГВ.

В соответствии с Российской нормативной документацией (Приказ Минздрава РФ №156/29 от 07.05.1998), подготовка штаммов ЖГВ допускается исключительно методом классической реассортации в РКЭ. Это достаточно долгий и трудоемкий процесс, занимающий как минимум 2,5-3 месяца. Успешное и быстрое получение вакцинных реассортантов зависит от целого комплекса факторов. Поэтому задачей следующего раздела исследований явилась оценка сложностей и особенностей подготовки вакцинных штаммов на основе современных сезонных вирусов гриппа, обладающих различными биологическими свойствами. Прежде всего, был проведен ретроспективный анализ данных, полученных в отделе вирусологии им. А.А.Смородинцева ФГБНУ «ИЭМ» за последние за 20 лет, включая наши собственные результаты за 2008-2014 гг.

Было замечено, что в последние годы эффективность подготовки реасортантных вакцинных штаммов живой гриппозной вакцины снизилась практически в два раза по сравнению с 1990-2000 годами. Если до 2000 года количество реассортантов с вакцинной формулой генома составляло не менее 50,8%, то в настоящее время оно не превышает 26,4% (табл. 2).

При анализе состава генома реассортантов, полученных на основе вирусов гриппа А и В, циркулировавших до 2000-го года, было установлено, что ^ в 91,8% случаев переходила в геном реассортантного вируса от «дикого» родителя, а полимеразные гены в подавляющем большинстве наследовались от ХА донора. Процент «холодных» М и N5 генов был также достаточно высок и составлял 56,9 и 50,5%, что позволяло регулярно получать штаммы с желаемой формулой генома 6:2. С конца 1990-х - начала 2000-х годов отмечалось все больше случаев разобщения генов, кодирующих НА и ЫА: «дикая» NA

переходила в геном только в 11,6% реассортантов. Также снизилось число реассортантов, наследующих внутренние гены от доноров аттенуации. Процент «холодных» М и N8 генов опустился до 14,3 и 21,5%, соответственно (рис. 2).

Таблица 2. Частота получения штаммов с вакцинной формулой генома (6:2 и 5:3) путем реассортации «диких» вирусов гриппа А и В различных лет

__выделения с донорами аттенуации_

Реассортанты_

Период циркуляции «дикого» вируса цсЕГО {^°Рму,па г(-нома

_Вакцинная Другая

до 2000 (11 вирусов гриппа А и В) 189 50,8% 49,2%

после 2000 (24 вирусов гриппа А и В) 561 26,4%_73,6%

Критерий Пирсона 13,2; р=0,0003

Формула генома 6:2 и 5:3.

Реассортанты на основе ИГГ вирусов гриппа А и В, циркулировавших:

До 2000 года

После 2000 года

100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

РВ2РВ1 РА НА ЫР ЫА М ЫБ □ Ген от УУТ вируса

ч

РВ2РВ1 РА НА № ИА М N5 Ген от донора аттенуации

Рисунок 2. Наследование реассортантными штаммами генов от донора аттенуации или от вируса гриппа «дикого» типа (суммарные данные по вирусам гриппа А и В)

Чтобы понять, с каким именно свойством «дикого» родителя может быть связано преимущественное наследование реассортантом того или иного гена, был проанализирован состав генома 402 реассортантов, подготовленных на основе температуро-, холодо- или ингибитороустойчивых (чувствительных) родительских вирусов и ХА доноров аттенуации. Все использованные для анализа реассортанты унаследовали гемагглютинин от вируса «дикого» типа.

Основное внимание было уделено переходу в состав генома реассортантов самого проблемного гена - гена, кодирующего ЫА (см. рис. 2).

При скрещивании с ХА донором природно холодоустойчивых вирусов гриппа в 51,1% случаев реассортанты наследовали ЫА от WT родителя. Такая же картина наблюдалась при скрещивании холодочувствительных вирусов гриппа, у которых ЫА от \УТ родителя переходила в 48,4% всех реассортантов. Т.о., статистически значимого влияния данного фенотипического свойства на наследование реассортантами ЫА обнаружено не было (табл. 3).

Таблица 3. Оценка наследования реассортантами нейраминидазы от

«диких» родительских вирусов в зависимости от их са- и М-фенотипа

. Реассортанты

Фенотип «диких» родительских -—г;-

г „„г.™ Из них унаследовали_

вирусов гриппа ВСЕГО -ХА-1ЧА-

Холодоустойчивость (са фенотип)_

са (7 вирусов гриппа А и В) 141 51,1% 48,9%

поп-са (28 вирусов гриппа А и В) 609 48,4% 51,6%

_Критерий х2 Пирсона 0,18; р=0,7777_

Температурочувствительность (^-фенотип)_

й (19 вирусов) 431 35,0% 65,0%

по/г-й (16 вирусов)_319 67,7% 32,3%

_Критерий х2 Пирсона 21,80; р Г 0,0001_

Все реассортанты унаследовали НА от вируса «дикого» типа.

Что же касается /¿-фенотипа, была обнаружена определенная связь между способностью «диких» вирусов к репродукции при температурах выше оптимальной и частотой наследования реассортантным штаммом \УТ или ХА нейраминидазы. Нейраминидаза /5 вирусов переходила в геном реассортантов в 35,0%. ЫА же иои-й вирусов наследовалась в два раза чаще - в 67,7% случаев (табл. 3). Статистическая обработка полученных данных подтвердила, что данный фенотипический признак безусловно влияет на включение в состав генома реассортантных вирусов нейраминидазы «дикого» типа.

Еще одним важным свойством вируса гриппа является его чувствительность к неспецифическим сывороточным ИГ. Анализ 849 реассортантов с донорами аггенуации, полученных на основе 40 «диких» вирусов гриппа А и В, показал, что вне зависимости от принадлежности \УТ родителя к определенному типу/подтипу, ЫА ИУ вирусов встраивалась в геном

реассортантов чаще, чем ЫА ИЧ вирусов. Только 26,4% (130 из 493) от общего числа клонов, подготовленных на основе ИЧ вирусов, унаследовала нейраминидазу «дикого» типа. И наоборот, среди 356 ИУ реассортантов всего 59 (16,6%) приобрели NA от донора аттенуации (рис. 3).

Реассортанты на основе ^ вирусов гриппа А и В: 356 ИУ реассортантов 493 ИЧ реассортанта

■ ИА от 1Л/Т вируса □ МА от донора аттенуации

Рисунок 3. Наследование реассортантами ЫА от донора аттенуации или от WT вируса гриппа, обладающего различной чувствительностью к неспецифическим ингибиторам сыворотки крови (суммарные данные по вирусам гриппа А и В)

Реассортанты на основе \№Т вирусов гриппа А и В: Ингибитороустойчивых Ингибиторочувствительных

Формула генома: ■ 6:2 □ 5:3 □ другая

Рисунок 4. Состав генома реассортантных штаммов, полученных при скрещивании доноров аттенуации и сезонных вирусов гриппа А и В, обладающих различной чувствительностью к неспецифическим ингибиторам сыворотки крови (суммарные данные по вирусам гриппа А и В) Кроме того, ИУ «дикие» вирусы легко вступали в рсассортацию с ХА

донорами с формированием значительного числа клонов с вакцинной

формулой генома 6:2 и 5:3 (55,1%). При скрещивании доноров с ИЧ вирусами только 10,7% реассортантов обладали формулой генома 5:3 и 6:2 (рис. 4).

Роль НА в формировании ингибитороустойчивости вируса гриппа доказана (Matrosovich et al., 1998). Однако, роль другого поверхностного антигена - NA - до настоящего момента оставалась практически неизвестной. Понимание этого представляет несомненный интерес в свете установленного нами факта преимущественного наследования реассортантными вирусами нейраминидазы от вирусов, обладающих ИУ фенотипом.

Мы изучили степень чувствительности к неспецифическим ИГ сыворотки крови морской свинки доноров аттенуации J1/17 и В/60, 9 WT вирусов гриппа А и В, а также 19 полученных на их основе реассортантов, унаследовавших от WT родителя один (НА) или два гена (НА и NA), кодирующих поверхностные белки. Было показано, что 6 из 9 WT вирусов были высоко ИЧ - их титр в РТГА с нормальной сывороткой крови морской свинки колебался в пределах от 2560 до 10240 (табл. 4). Оба донора и вирусы VN1203, INDO/05 и B/Texas/26/08 оказались высоко ИУ (тиф в РТГА <10). Степень чувствительности к ИГ реассортантов с формулой генома 6:2 и 7:1, полученных на основе ИЧ WT вирусов, отличалась. У 7:1 реассортантов, унаследовавших от ИЧ WT родителя только НА, наблюдалось 3-4 кратное снижение титра в РТГА с нормальной сывороткой крови морской свинки по сравнению с реассортантами, обладающими обоими «дикими» НА и NA или родительскими вирусами. Так, титр в РТГА «дикого» вируса B/Wisconsin/1/10 и его 6:2 реассортантов R15 и R16, составлял 5120, в то время как титр 7:1 реассортанта R14 был только 320.

Т.о., было показано выраженное снижение ингибиторочувствительности 7:1 реассортантов, унаследовавших НА от высоко ИЧ «дикого» вируса, a NA -от высоко ИУ донора аттенуации, по сравнению с их «дикими» ИЧ родителями или 6:2 реассортантами. Замена NA «дикого» ИЧ вируса на NA ИУ донора аттенуации (Rl, R3-R5, R11-R12, R14, R17-R18) привела к четырехкратному и более снижению чувствительности реассортантов к сывороточным ИГ.

Таблица 4. Чувствительность вирусов гриппа к ингибиторам

Вирусы / реассортанты Происхождение гена ИТ-устойчивость вируса

Код Название Подтип (тип) НА NA РТГА

Вирусы гриппа А

Л/17 А/Ленинград/135/17/57 H2N2 Л/17 Л/17 < 10 Устойчивый^

WT1 A/Califomia/07/04 H3N2 WT WT 2560 Чувствительн.'1

R12 R2 A/Califomia/07/04 x Л/17 A/Califomia/07/04 x Л/17 H3N2 H3N2 WT WT Л/17 WT 320 2560 I Чувствительн. (<)' | Чувствительн. (=)7

WT NIBRG-23* H5N1 WT WT 5120 Чувствительн.

R3,4,5 NIBRG-23 x Л/17 H5N2 WT Л/17 640 I Чувствительн. (<) |

WT INDO/057 H5N1 WT WT 10 Устойчивый

R6,7 INDO/Û5 x Л/17 H5N2 WT Л/17 10 Устойчивый (=)

WT VN1203" H5N1 WT WT < 10 Устойчивый

R8,9 VNI203 x JI/17 H5N2 WT Л/17 < 10 Устойчивый (=)

RIO A/Vietnam/1203/04 x Д/17 H5N2 WT WT < 10 Устойчивый (=)

Вирусы гриппа В

В/60 B/CCCP/60/69 В В/60 В/60 < 10 Устойчивый

WT B/Harbin/07/94 В WT WT 10240 Чувствительный

RI 1 B/Harbin/07/94 x B/60 В WT В/60 2560 | Чувствительн. (<) |

WT B/Texas/26/08 в WT WT < 10 Устойчивый

R12,13 B/Texas/26/08 x B/60 В WT WT < 10 Устойчивый (=)

WT B/Wisconsin/1/10 В WT WT 5120 Чувствительн.

R14 R15.16 B/Wisconsin/1/10 x B/60 B/Wisconsin/1/10 x B/60 в в WT WT В/60 WT 320 5120 I Чувствительн. (<) | Чувствительн. (=)

WT B/Bangladesh/1994/10 в WT WT 5120 Чувствительн.

R17 B/Bangladesh/1994/10 x B/60 в WT В/60 640 | Чувствительн. (<) I

WT B/Texas/06/11 в WT WT 640 Чувствительн.

R18 B/Texas/06/11 x B/60 в WT В/60 80 | Чувствительн. (<) |

R19 B/Texas/06/11 x B/60 в WT WT 640 Чувствительн. (=)

вируса с донором аттенуации; реассортанты, унаследовавшие НА от WT вируса, a NA - от WT вируса (формула генома 6:2) или от донора аттенуации (формула генома 7:1). Родительский вирус 3устойчив или ''чувствителен к термостабильным неспецифическим ИГ сыворотки. 'Чувствительность реассортанта к термостабильным неспецифическим ИГ сыворотки в сравнении с WT родительским вирусом; р < 0.0001). Штаммы ИГВ: 6A/turkey/Turkey/1 /05 х PR8; 7A/Indonesia/5/05 х PR8;sA/Vietnam/1203/04 х PR8.

Представленные результаты свидетельствуют об определенном участии NA в формировании ингибитороустойчивого фенотипа вируса гриппа.

Использование RG-PR8-peaccopmaHmHbix штаммов ИГВ в качестве источника поверхностных антигенов при подготовке вакиинных штаммов ЖГВ. Сегодня, наряду с циркулирующим калифорнийским штаммом вируса гриппа A(HlNl)pdm, потенциальную угрозу представляют вирусы гриппа птиц A(H5N1), имеющие пандемический потенциал. Поскольку данные вирусы в

большинстве своем высоко патогенны, то проведение вирусологической работы осложняется необходимостью соблюдения особых условий безопасности. Поэтому при подготовке потенциально пандемических вакцинных штаммов ЖГВ сероподтипа H5N1 в качестве источника поверхностных антигенов нами были использованы H5N1-PR8-RG реассортантные штаммы для ИГВ, подготовленные с помощью методов обратной генетики (организации-производители - NIBSC, Великобритания и CDC, США). Полиосновный сайт протеолиза гена, кодирующего НА, был модифицирован производителями для снижения патогенности этих вирусов, что делает их безопасными для естественных хозяев и персонала лабораторий.

Таблица 5. Наследование генов, кодирующих нейраминидазу и РВ2 субъединицу полимеразного комплекса, реассортантами, полученными при скрещивании PR-RG-штаммов ИГВ или природного низко патогенного изолята A/duck/Potsdam/1402-6/86 (H5N2) с донором аггенуации Л/17

_или вакцинным штаммом, подготовленным на его основе_

Всего 1 WT-NA; ХА-РВ2 | WT (NA+PB2) ХА (NA+PB2) «Дикий» вирус _Источник генов донора аттенуации_

А/Ленинград/134/17/57 (H2N2)

NIBRG-23 (H5N1)' 17 0 0 17

VN1203 (H5N1)2 42 0 14 28

INDO/05 (H5N1)3 11 0 0 11

IRV-148 (HIN1)4 28 28 0 0

NIB-64 (H3N2)5 9 5 4 0

A/d/P/1402-6/86 (H5N2)6 207 15 0 0 20 0 0 15

«Дикий» вирус А/17/Калифорния/09/38 (HlNl)pdm"

A/d/P/1402-6/86 (H5N2) 15' 7 8 0

16 16 0 0

В таблице суммированы результаты, полученные при скрещивании инактивированного УФО «дикого» вируса. Штаммы ИГВ (1-5): 1 А/Шгкеу/Тцгкеу/1/05 х РЯ8; 2А/У 1С(пат/1203/04 х РЯ8; 3А/1т1опе81а/5/05 х РЯ8; 4Л/ВтЬапе/59/09 (Н1Ж) х РЯ8; 5А/РеПЬ/16/09 (НЗЫ2) х РЯ8; 6А/с1иск/Ро15(1ат/1402-6/86 (Н5Ы2); 'данные получены при классическом скрещивании двух нативных вирусов; "вакцинный штамм пандемической ЖГВ.

Первая попытка получения методом классической реассоргации двух нативных родительских вирусов штамма ЖГВ против высоко патогенного вируса гриппа АЛигкеуЛГигкеу/1/05 (Н5Ы1) с использованием в качестве источника поверхностных антигенов RG-PR8-peaccopтaнтa N1BRG-23 (Н5Ш) не удалась, поскольку вирусы в реассортацию не вступали. Известно, что эффективность процесса реассортации можно повысить путем инактивации

«дикого» родителя (Rudneva et al., 2007). Поэтому на следующем этапе нашей работы мы использовали предварительную инактивацию трех H5N1-RG-PR8-вирусов (NIBRG-23, INDO/05 и VN1203) ультрафиолетовым облучением (УФО). Такая постановка опыта также не привела к формированию 6:2 или 5:3 реассортантов. Тем не менее, реассортация наступала, из 70 полученных реассортантов 56 (80%) унаследовали от донора аттенуации гены, кодирующие РВ2 и NA, а 14 (20%) приобрели оба этих гена от H5N1-родителя (табл. 5).

При этом 48 (68,6%) реассортантов приобрели от донора все внутренние гены, что является необходимым условием для вакцинного штамма ЖГВ. К сожалению, их NA также принадлежала донору аттенуации, то есть полученные реассортанты имели формулу генома 7:1. Т.о., мы столкнулись с наличием очень прочной связки генов NA+PB2 родительских вирусов.

В последующих экспериментах в протокол скрещивания был добавлен этап предварительной инактивации «дикого» вируса УФО.

Неудача при скрещивании донора аттенуации Л/17 с H5N1-RG-PR8 вирусами постигла и другую группу авторов (Gambaryan et al., 2012).

Чтобы понять, является ли установленная констелляция PB2+NA генов особенностью любых PR8-peaccopTaHTOB или она обусловлена какими-то иными причинами, мы попытались подготовить штаммы сезонной ЖГВ на основе ее произведенных в Великобритании (NIBSC) PRS-аналогов для ИГВ: IRV-148 (H1N1) (A/Brisbane/59/07-PR8) и NIB-64 (H3N2 (A/Perth/ 16/09-PR8). Из 37 полученных штаммов 33 унаследовали NA от «дикого» родителя, а РВ2 ген - от донора аттенуации (табл. 5); при этом три реассортанта (два H1N1 и один H3N2) имели формулу генома 6:2. Т.о., была установлена реальная возможность разобщения связи генов PB2+NA у PR8-peaccopTaHToe, несущих НА и NA сезонных штаммов вируса гриппа, что свидетельствует о том, что причина неудач кроется не в RG-PRS-реассортантах как таковых, а в чем-то другом, возможно, каких-то уникальных особенностях вирусов гриппа Н5.

При скрещивании донора аттенуации с низкопатогенным вирусом гриппа птиц A/duck/Potsdam/1402-6/86 (H5N2) методом классической реассортации и с использованием предварительной инактивации УФО «дикого» родителя было получено 35 реассортантов. Все 20 реассортантов, полученных методом

классической реассортации, одновременно унаследовали гены 1ЧА и РВ2 от птичьего вируса А(Н5Ш), а 15 реассортантов, полученных с использованием инактивированного УФО «дикого» вируса гриппа птиц, унаследовали гены ЫА и РВ2 - донора аттенуации (табл. 5).

Т.о., было показано, что не только Н5М1-Р118 реассортанты, но и природные изоляты вирусов гриппа птиц, несущие гемагглютинин Н5, при скрещивании с донором аттенуации Л/17 демонстрируют уникально прочную связь между генами PB2+NA.

Окончательный ответ был получен при реассортации нативного либо инактивированного УФО вируса гриппа птиц АЛ1иск/Ро15(1ат/1402-6/86 (Н5Ш) и вакцинного штамма А/17/Калифорния/09/38 (Н1Ы1)рс1ш пандемической ЖГВ, который был использован нами в качестве источника внутренних «донорских» генов. Всего был получен 31 реассортант с ЫА «дикого» типа - 15 без этапа инактивации и 16 после обработки «дикого» вируса УФО. Все 16 реассортантов из группы «УФО» унаследовали ген РВ2 от донора аттенуации, а ЫА - от «дикого» вируса, в то время, как только у 7 из 15 (47%) реассортантов, полученных без инактивации, оказалась разорванной связка РВ2+1^А.

(3). ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Анализ состава генома реассортантов, полученных при скрещивании доноров аттенуации с «дикими» вирусами гриппа разных лет выделения показал, что в последние 20 лет эффективность подготовки штаммов с вакцинной формулой генома снизилась, что в первую очередь связано с сочетанием определенных биологических характеристик современных вирусов.

Определены свойства вируса гриппа, влияющие на частоту наследования реассортантами тех или иных генов родительских вирусов.

Полученные в исследовании результаты позволяют сделать некоторые рекомендации, облегчающие процедуру скрещивания «диких» вирусов с донорами аттенуации и, следовательно, оптимизировать подготовку вакцинных штаммов. В частности, для минимизации проблем, связанных с определенными фенотипическими свойствами современных вирусов, при подготовке вакцинных штаммов ЖГВ необходимо осуществлять обязательную всестороннюю характеристику \¥Т вируса с последующим его клонированием

с целью отбора наиболее подходящего по фенотипическим признакам клона; для повышения частоты получения вакцинных штаммов следует осуществлять предварительную инактивацию «дикого» вируса. В случае выявленной несовместимости «дикого» вируса и донора аттенуации использовать в качестве источника внутренних генов подготавливаемого кандидата вакцинный штамм антигенной структуры, отличной от таковой донорского вируса.

ВЫВОДЫ

1. Разработан экспресс-метод оценки состава генома реассортантов, подготовленных на основе доноров аттенуации живой гриппозной вакцины и штаммов вируса гриппа А сероподтипов Н1, НЗ, Н5 и вируса гриппа В.

2. На основе изучения комплекса фенотипических свойств вирусов гриппа А и В, циркулировавших в различные годы и генетического анализа 924 полученных на их основе реассортантов с донорами аттенуации, впервые установлено, что частота получения вакцинных реассортантов имеет прямую связь с такими свойствами «диких» родительских вирусов, как их температуро- и ингибитороустойчивость.

3. Продемонстрирована возможность подготовки вакцинных штаммов живой гриппозной вакцины, с использованием в качестве источника гемагглютинина и нейраминидазы не «диких» вирусов, а НХЗ-РЯ8-реассортантов (вакцинных штаммов для производства инактивированных вакцин)

4. При скрещивании донора аттенуации и вирусов, несущих НА и ЫА вирусов гриппа птиц А (Н51М1), показано наличие жесткой констелляции генов родительских штаммов, кодирующих ЫА и РВ2 субъединицу полимеразного комплекса. Предварительная инактивация «дикого» родительского вируса ультрафиолетовым облучением, а также использование вакцинных штаммов устаревшей антигенной структуры в качестве источника внутренних генов донора аттенуации позволяет повысить эффективность подготовки вакцинных штаммов живой гриппозной вакцины.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК РФ, а также в

зарубежных журналах, входящих в международные системы цитирования

и библиографические базы данных

1. Киселева И.В. Трансмиссивность вируса гриппа (экспериментальные данные) / И.В. Киселева, И.В. Ларионова, Е.А. Баженова, И.А. Дубровина, И.Н. Исакова-Сивак, Е.П. Григорьева, С.А. Донина, Л.Г. Руденко // Медицинский академический журнал. - 2010. - №4. - С.240-248.

2. Киселева И.В. Анализ состава генома штаммов сезонной и пандемической живой гриппозной вакцины / И.В. Киселева, J.T.M. Voeten, L.C.P. Teley, H.B. Ларионова, И.А. Дубровина, Ж.А. Бердыгулова, Е.А. Баженова, Н. van den Bosch, J.G.M. Heldens, Л.Г. Руденко // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2011. - №4. - С.29-36.

3. Дубровина И.А. Живая грипозная вакцина для детей и взрослых: трансмисивность в экспериментах in vivo / И.А. Дубровина, Е.А. Баженова, И.В. Киселева, Ж.А. Бердыгулова, Н.В. Ларионова, Л.Г. Руденко // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2011. - №6. - С.14—18.

4. Kiscleva 1. Possible outcomes of reassortment in vivo between wild type and live attenuated influenza vaccine strains /1. Kiseleva, I. Dubrovina, E. Bazhenova, E. Fedorova, N. Larionova, L. Rudenko // Vaccine. - 2012. - V. 30. - № 51. -P.7395-7399.

5. Киселева И.В. Особенности реассортации современных штаммов вируса гриппа с донорами аттенуации живой гриппозной вакцины / И.В. Киселева, Е.А. Баженова, Н.В. Ларионова, Е.А. Федорова, И.А. Дубровина, И.Н. Исакова-Сивак, Л.Г. Руденко // Вопросы вирусологии. - 2013. - №5. - С.26-31.

6. Larionova N. Live attenuated influenza vaccines against highly pathogenic H5N1 avian influenza: development and preclinical characterization / N. Larionova, 1. Kiseleva, 1. Isakova-Sivak, A. Rekstin, I. Dubrovina, E. Bazhenova, T.M. Ross, D. Swayne, L. Gubareva, V. Tsvetnitsky, E. Fedorova, E. Doroshenko, L. Rudenko // Journal of Vaccines and Vaccination. - 2013. - V. 4. - №8. - doi: 10.4172/2157-7560.1000208.

7. Киселева И.В. Роль нейраминидазы в формировании чувствительности вирусов гриппа к сывороточным ингибиторам и эффективности реассортации / И.В. Киселева, Н.В. Ларионова, Е.А. Баженова, Е.А. Федорова, И.А. Дубровина, И.Н. Исакова-Сивак, Л.Г. Руденко //

Молекулярная генетика, микробиология, вирусология. - 2014. - №3. - С.34-40.

8. Киселева И.В. Оценка генетической и фенотипической стабильности живой гриппозной вакцины против потенциально пандемического вируса гриппа птиц / И.В. Киселева, И.А. Дубровина, Н.В. Ларионова, И.Н. Исакова-Сивак, Е.А. Федорова, Е.А. Баженова, М.А. Стукова, М.К. Ерофеева, Л.Г. Руденко // Фундаментальные исследования. - 2014. - №11, Вып.6. - С. 13011305.

9. Kiseleva I. Contribution of neuraminidase of influenza viruses to the sensitivity to normal sera inhibitors and reassortment efficiency /1. Kiseleva, N. Larionova, E. Fedorova, E. Bazhenova, I. Dubrovina, I. Isakova-Sivak, L. Rudenko // The Open Microbiology Journal. - 2014. -№ 8. - P.59-70.

Патенты Российской Федерации

1. Патент 2532844 Российская Федерация, МПК C12N / Вакцинный штамм вируса гриппа А/17/Виктория/2011/89 (H3N2) для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и детей / Н.В. Ларионова, И.А. Дубровина, И.В. Киселева, Е.А. Баженова, Г.И. Александрова, Л.Г. Руденко; заявитель и патентообладатель Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт эскпериментальной медицины" Северо-западного отделения Российской Академии медицинских наук (ФГБУ "НИИЭМ" СЗО РАМН). -№2012130551; заявл. от 17.07.2012; опубл. 10.11.2014. Бюл. №31

Статьи в прочих научных изданиях

1. Kiseleva I. Study of transmissibility of wild type and cold-adapted influenza viruses in guinea pigs / I. Kiseleva, N. Larionova, E. Bazhenova, I. Dubrovina, L. Rudenko // Influenza and other respiratory viruses. - 2011. - V. 5. - Suppl. 1. -P. 304-307.

2. Larionova N. Peculiarities of reassortment of a cold-adapted influenza A master donor virus with influenza A viruses containing hemagglutinin and neuraminidase of avian H5N1 origin / N. Larionova, I. Kiseleva, I. Dubrovina, E. Bazhenova, L. Rudenko // Influenza and other respiratory viruses. - 2011. - V. 5. - Suppl. 1.-P.346-349.

3. Баженова Е.А. Проблемы подготовки вакцинных штаммов живой гриппозной вакцины на основе потенциально пандемических вирусов гриппа / Е.А. Баженова, Н.В. Ларионова, Е.А. Федорова, И.А. Дубровина, И.В. Киселева, Л.Г. Руденко // Эпидемиология и инфекционные болезни. Актуальные вопросы. - 2012. - №6. - С. 16-20.

4. Федорова Е.А. Реассортация эпидемических и вакцинных штаммов вируса гриппа в эксперименте / Е.А. Федорова, И.А. Дубровина, Е.А. Баженова, Е.В. Иванова, Н.В. Ларионова, И.В. Киселева, Л.Г. Руденко // Материалы Научной конференции «Грипп: вирусология, эпидемиология, профилактика, лечение», посвященной 45-летию НИИ гриппа 24-25 октября 2012 года, Санкт-Петербург. Сборник статей. - СПб. - 2012. - С. 28-38.

5. Дубровина И.А. Изучение возможности реассортации эпидемических и вакцинных штаммов вируса гриппа в экспериментах in vivo / И.А. Дубровина, Е.А. Баженова, Е.А. Федорова, Е.В. Иванова, Н.В. Ларионова, И.В. Киселева // Медицинский академический журнал. - 2012. - Т. 12. - №4.

- С. 45-47.

6. Федорова Е.А. Иммуногенность in vivo вакцинных штаммов живой гриппозной вакцины, подготовленных на основе вируса А/Новая Каледония/20/99 (H1N1), выделенного в развивающихся куриных эмбрионах или культуре клеток MDCK / Е.А. Федорова, И.Н. Исакова-Сивак, С.А. Кузнецова, В.А. Кузнецова, И.А. Дубровина, Е.А. Баженова, И.В. Киселева // Медицинский академический журнал. - 2012. - Т.12. - №4.

- С. 57-59.

7. Kiseleva I. Live cold-adapted attenuated vaccine against H5N1 influenza viruses /1. Kiseleva, N. Larionova, E. Fedorova, 1. Dubrovina, E. Bazhenova,T.M. Ross, L. Rudenko // Journal of Medical Safety. - 2013. - P. 36-41.

Подписано в печать 20.02.2015 Формат 60x84'/)6 Цифровая Печ. л. 1.1 Тираж 100 Заказ № 35/02 печать

Типография «Фалкон Принт» (197101, г. Санкт-Петербург, ул. Большая Пушкарская, д. 54, офис 2, Сайт: falconprint.ru)

1 5 — 3 3 8 5

2012476283

2012476283