Пути усовершенствования живой гриппозной вакцины и тактики ее применения при подготовке к пандемии

Дешева, Юлия Андреевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Пути усовершенствования живой гриппозной вакцины и тактики ее применения при подготовке к пандемии
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Пути усовершенствования живой гриппозной вакцины и тактики ее применения при подготовке к пандемии"

На правах рукописи

0034В404и

ДЕШЕВА Юлия Андреевна

ПУТИ УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ ЖИВОЙ ГРИППОЗНОЙ ВАКЦИНЫ И ТАКТИКИ ЕЕ ПРИМЕНЕНИЯ ПРИ ПОДГОТОВКЕ К ПАНДЕМИИ

03.00.06 - Вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Санкт-Петербург - 2009

1 2 Е/.ДР

003464040

Работа выполнена в отделе вирусологии им. А.А. Смородинцева Государственное учреждение научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ

Руденко Лариса Георгиевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, академик РАМН, профессор

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук

Зверев Виталий Васильевич Кузнецов Олег Константинович Зазимко Любовь Александровна

Ведущая организация: Государственное учреждение научно-исследовательский институт вирусологии им Д.И. Ивановского РАМН

Защита состоится 31 марта 2009 г. в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 001.043.01 при Государственном учреждении научно-исследовательский институт гриппа РАМН (197376, Санкт-Петербург, ул. профессора Попова, 15/17)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ гриппа РАМН

л /

Автореферат разослан « » февраля 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат медицинских наук

В.Ф. Суховецкая

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Грипп является глобальной инфекцией, которая в период сезонных эпидемий поражает от 10 до 20% населения планеты, а также единственной, способной вызвать в современном мире пандемии. До настоящего времени было известно 3 подтипа вируса гриппа, вызвавшие пандемии: A(H1N1) -в 1918 г., A(H2N2) - в 1957 г., A(H3N2) - в 1968 г. Начиная с 1997 г., высокопатогенные (ВП) вирусы гриппа подтипа A(H5N1), циркулирующие среди дикой и домашней птицы в Юго-восточной Азии и других регионах мира, вызвали заболевание 390 человек с необычайно высокой смертностью, которая составила более 60%. Анализ вирусов гриппа A(H5N1), выделенных как от людей, так и от птиц, показал, что за последние 7-8 лет вирусы этого подтипа разделились на несколько линий, существенно отличающихся между собой, как антигенно, так и генетически. Клиническая картина при инфекции людей вирусами A(H5N1) характеризуется тяжестью клинических симптомов, связанных с проявлениями острой дыхательной и сердечно-сосудистой недостаточности, признаками гепатита и тяжелой лимфопении. Дикие перелетные, особенно водоплавающие птицы являются одновременно природным резервуаром и переносчиком инфекции из стран Юго-Восточной Азии в другие регионы. Начиная с 2006 г., помимо Азии возбудитель распространился и внедрился в экологическую природную систему всей Европы, а также северной и центральной частей Африки. Не осталась незатронутой и территория России. Несмотря на то, что до сих пор не было получено убедительных данных об устойчивой передаче вируса A(H5N1) от человека к человеку (Katz et al., 1999, Uyeki et al., 2008), что ознаменовало бы начало новой пандемии, продолжающееся заражение людей создает угрозу возникновения пандемической ситуации (Webster, 2005). В настоящее время ситуация по гриппу в мире оценивается согласно классификации Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ, 2005) как «Период угрозы пандемии, фаза 3», для которого характерно выявление случаев заражения людей новыми подтипами вируса, но при этом отсутствует устойчивая передача вируса от человека к человеку.

В качестве потенциального источника нового пандемического штамма рассматриваются также вирусы птичьего гриппа других подтипов, способные передаваться людям: A(H9N2), A(H7N7). Опыт возникновения пандемий гриппа не исключает также возврата в циркуляцию вируса человека A(H2N2), который вызвал пандемию в 1957 году. В практике уже имеется пример возвращения ранее циркулирующих штаммов, как это было в 1977 г. с вирусом гриппа A(H1N1). Около 70% населения нашей страны никогда не встречались с вирусом A(H2N2) и не имеют иммунитета к нему. Однако вирусы этого подтипа продолжают циркулировать в популяциях животных (птиц, свиней), что увеличивает риск заболевания людей. В США в 2006 году от свиней с бронхопневмонией были выделены вирусы подтипа A(H2N3) (Ma et al., 2007). Молекулярный анализ поверхностных антигенов вирусов A(H2N3) показал, что они имеют птичье происхождение, но оба вируса уже приобрели признаки, характерные для вирусов млекопитающих. Это наблюдение подтверждает роль свиней как промежуточных хозяев при адаптации вирусов гриппа птиц перед передачей человеку.

В настоящий момент неизвестно, какой подтип вируса гриппа может

вызвать следующую пандемию, но необходимость срочной разработки эффективных мер и средств защиты человека от пандемии признается специалистами всего мира, что отражено в рекомендациях Всемирной организации Здравоохранения и Комитета США по практике иммунизации, а также приказах Министерства здравоохранения и социального развития РФ. Активная иммунизация общепризнанно считается наиболее эффективным медицинским средством профилактики вирусных инфекций. Опыт ликвидации наиболее опасных вирусных инфекций, таких как оспа, корь и полиомиелит позволяет заключить, что. использование живых вакцин обеспечивает необходимую эффективность и результативность противоэпидемических мероприятий. На заседаниях ВОЗ 04.11.05 и 2.05-5.05.2006 живая гриппозная вакцина включена в план предпандемической подготовки наряду с инактивированными вакцинами как средство профилактики пандемического гриппа.

Современные живые гриппозные вакцины (ЖГВ) включают аттенуированные штаммы вирусов гриппа, полученные методом генетической реассортации. Гены, кодирующие гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA), наследуются от антигенно актуального штамма, а шесть генов, кодирующих негликозилированные белки - от холодоадаптированного (ХА) «донора атгенуации». В России в течение многих лет вакцинные штаммы вируса гриппа А, включаемые в состав ЖГВ для взрослых, подготавливают на основе ХА донорского штамма подтипа H2N2 - А/Ленинград/134/17/57, полученного путем последовательных пассажей в куриных эмбрионах при пониженной до 25-26"С температуре. Для создания рекомбинантных штаммов ЖГВ для детей 3-14 лет был подготовлен дополнительно аттенуированный 30-кратным пассированием при низкой температуре донор атгенуации А/Ленинград/134/47/57(H2N2). Изучение полной нуклеотидной последовательности генов, кодирующих негликозилированные белки доноров атгенуации А/Ленинград/134/17/57 и А/Ленинград/134/47/57, выявило ряд мутаций, ответственных за проявление этими штаммами признаков температурочувствительности, холодовой адаптации и атгенуации (Klimov, Сох, 1995). В отличие от ЖГВ для взрослых, которая вводилась однократно, детский вариант ЖГВ применялся при двукратном введении с интервалом в 4 недели. Для подготовки реассортантных вакцинных штаммов вирусов гриппа В, включаемых в состав тривакцины, используется донор атгенуации В/СССР/60/69.

Многолетнее изучение реассортантной ЖГВ подтвердило ее безвредность и эффективность (Rudenko et al., 1993, Khan et al., 1996). В ряде широкомасштабных клинических испытаний было показано, что применение ЖГВ вызывает выраженную стимуляцию всех систем иммунного ответа (гуморального, локального, клеточного), включая сывороточные антитела, секреторные IgA, цитотоксические CD8+ Т-лимфоциты (Johnson et al. 1986), обеспечивая формирование широкого спектра иммунитета против дрейфовых вариантов вирусов гриппа. Стимуляция неспецифических факторов иммунитета (интерферон, NK-клетки) обусловливает эффективность ЖГВ с первых дней применения (Rudenko et al., 2001). Создаваемый при применении ЖГВ уровень коллективного иммунитета, как показали исследования среди детей школьного

возраста, играет значительную роль в ограничении распространения инфекции в обществе (Rudenko et al., 1993, Kendal et al., 1997, Monto et al., 1999).

Результаты целого ряда исследований свидетельствуют о генетической стабильности применяемых в настоящее время ХА донорских штаммов и реассортаитов на их основе (Klimov, Rudenko, 1996, Klimov et al., 2001). Клинические испытания американской реассортантной ЖГВ на основе донора аттенуации H2N2 А/Энн Арбор/6/60 показали, что при применении ЖГВ в условиях эпидемического подъема, вызванного вирусами A(H3N2), не происходило реассортации между вакцинными штаммами и дикими вирусами (Keitel et al., 1998). Более того, именно вакцинные штаммы выступали как доминирующие вирусы при опытах на хорьках и клиническом изучении у волонтеров, снижая уровень репродукции коинфицирующих диких вирусов (Whitaker-Dowling et al., 1991, Younger et al., 1994). Изучение полученных методами обратной генетики реассортантов американского донора аттенуации А/Энн Ap6op/6/60(H2N2) с циркулирующим эпидемическим вирусом А/Сидней/5/97(НЗМ2) показало, что реассортанты с любым составом генома неизменно оказывались более аттенуированными по сравнению с эпидемическим вирусом, независимо от того, вводились ли гены ХА штамма в состав эпидемического вируса или наоборот, гены эпидемического вируса переходили к донору аттенуации (Parks et al., 2007).

Существенным практическим преимуществом использования ЖГВ является интраназальный (физиологический) путь введения в виде назального спрея. При этом стоимость живой вакцины, обусловленная особенностями технологического процесса, не требующего концентрации вирусного материала, в несколько раз меньше инактивированной. В случае возникновения пандемической ситуации повышение потребности в количестве доз инактивированной вакцины с учетом необходимости двукратной иммунизации, обусловленной отсутствием у людей предшествующего иммунитета к новому вирусу, может привести к недостатку производственных мощностей предприятий, производящих вакцину. В этом случае применение ЖГВ может значительно увеличить охват прививками.

К настоящему времени в России накоплен значительный опыт применения ХА реассортантной ЖГВ в практике здравоохранения, тем не менее, ряд теоретических и практических вопросов все еще оставался нерешенным.

Несмотря на то, что существующие в настоящее время доноры аттенуации, применяемые для подготовки реассортантов вирусов гриппа А, входящих в состав поливалентной ЖГВ - А/Ленинград/134/47/57(H2N2) (Россия) и А/Энн Арбор/6/60(США) - подробно охарактеризованы (определены основные мутации в их геноме, ответственные за проявление is-фенотипа, изучена роль отдельных генов в аттенуации), не были определены мутации, ответственные за холодовую адаптацию вирусов гриппа, полученных в процессе пассирования при пониженной температуре. Не были проведены полное секвенирование и молекулярно-генетический анализ донора аттенуации вирусов гриппа В - В/СССР/60/69. Анализ реассортантов на основе В/СССР/60/69 проводился методами, требовавшими использования больших количеств концентрированного вирусного материала, что затрудняло проведение множественных исследований.

Не была разработана методика получения и оценки кандидатов в вакцинные штаммы ЖГВ для применения в случае пандемии, вызванной вирусом нового, не циркулирующего в настоящий момент подтипа.

До начала выполнения данной работы ЖГВ применялась для вакцинации лиц не старше 65 лет, а специфическая профилактика гриппа среди лиц пожилого возраста в России не проводилась вообще.

До проведения настоящих исследований в России применялись два варианта ЖГВ - детский и взрослый, при этом использование для детского варианта ЖГВ специального донора аттенуации приводило к удорожанию производства вакцины. Необходимость двукратного введения детского варианта вакцины при вакцинации детей от 3-х лет затрудняло проведение вакцинопрофилактики в предэпидемический период, а также усложняло выполнение календаря плановых прививок против других инфекций.

Целью настоящей работы являлась разработка теоретических и научно-практических основ для создания, оценки и применения живой гриппозной вакцины против пандемически опасных вирусов гриппа. Задачи исследования:

1. Молекулярно-генетический анализ и сравнительная оценка на чувствительных моделях гриппозной инфекции (куриные эмбрионы, культура клеток МОСК, мыши, хорыш) безвредных для человека ХА штаммов вирусов гриппа А и В, полученных последовательным пассированием при пониженной температуре.

2. Характеристика фенотипических и генотипических свойств ХА штамма А/Москва/21 /17/65(Н2Ы2) для применения в качестве нового донора аттенуации или вакцинного штамма в случае возвращения в циркуляцию вирусов этого подтипа.

3. Секвенирование донора аттенуации В/СССР/60/69 и модификация метода рестрикционного анализа применительно к реассортантам на его основе для производства поливалентной ЖГВ.

4. Подготовка, характеристика и доклиническое исследование высокопродуктивных реассортантных штаммов на основе ХА донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(Н2КГ2) с потенциально пандемическими вирусами гриппа различных подтипов вирусов гриппа: Н5, Н7, Н9.

5. Оценка в ограниченных клинических испытаниях безвредности, генетической стабильности и иммуногенности ЖГВ, разработанной с использованием модельного апатогенного птичьего вируса подтипа А(Н5Ы2).

6. Разработка оптимальной стратегии и тактики вакцинации с использованием ЖГВ в интерпандемический период и при подготовке к пандемии.

Научная новизна. Автором впервые применен реассортантный метод к созданию вакцинных штаммов «шифтовых» вариантов вирусов гриппа на основе отечественного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(Н2Ш) с использованием апатогенных вирусов гриппа птиц, что отражено в заявке на изобретение 118284 А1 (\УО, 2007). Впервые определены условия и закономерности получения и апробации холодоадаптированных штаммов вирусов гриппа потенциально пандемических подтипов - Н5, Н7 и Н9.

Автором впервые разработана экспериментальная модель для доклинического изучения прививочных свойств холодоадаптированных реассортантных штаммов потенциально пандемических подтипов. В доклиническом и клиническом изучении впервые исследована роль различных серологических тестов (РТГА, реакция микронейтрализации, иммуноферментный анализ) в оценке иммунологической эффективности ЖГВ подтипа Н5. На экспериментальной модели впервые теоретически обоснованы схемы иммунизации живой гриппозной вакциной из реассортантного штамма А(Н5Ш).

Впервые проведенное определение нуклеотидной последовательности и молекулярно-генетический анализ штаммов АУМосква/21 /17/65(Н2Ш) и В/СССР/60/69 позволили обосновать их применение в качестве доноров атгенуации для получения реассортантных вакцинных штаммов. Результаты секвенирования и рестриктазного картирования, выявившие целый ряд уникальных нуклеотидных замен в генах негликозилированных белков донора атгенуации В/СССР/60/69, указывают на единый генетический характер обеспечения холодовой адаптации вирусов гриппа А и В.

Теоретическая значимость проведенных исследований. Впервые разработана концепция создания реассортантной ЖГВ против вирусов гриппа, обладающих пандемическим потенциалом. Эта концепция основана на экспериментальных доказательствах безвредности, иммуногенности и протективной эффективности холодоадаптированных реассортантных штаммов, содержащих поверхностные антигены апатогенных птичьих вирусов, а также подтверждена данными о репродукции реассортантного штамма А(Н5И2) в носоглотке человека с формированием гуморальных и секреторных антител не только к вакцинному штамму, но и к высокопатогенным вирусам птичьего гриппа А(Н5Ш).

Получены новые фундаментальные данные о механизмах холодовой адаптации вирусов гриппа. Установлена связь изменений полимеразной субъединицы РВ2 с реализацией функции холодовой адаптации штамма А/Москва/21/17/65 (Н2Ы2).

Практическая значимость. Работа имеет большое народно-хозяйственное значение. В результате ее выполнения автором создана уникальная коллекция холодоадаптированных реассортантов потенциально пандемических подтипов вирусов гриппа А(Н5Ш), А(Н7Ю) и А(Н9Ы2), которые депонированы в Государственной коллекции вирусов института вирусологии имени Д.И. Ивановского. Эти штаммы могут быть использованы для быстрой наработки вирусного материала при производстве пандемической ЖГВ, что является одним из направлений международной стратегии подготовки к пандемии.

Данные доклинических испытаний реассортантного штамма АЛ7/утка/Потсдам/86/92(Н5Ш) позволили разработать и утвердить программы 1 и 2 фазы клинических испытаний экспериментальной серии ЖГВ подтипа А(Н5К2) «Орвакс», производства Федерального государственного унитарного предприятия «Микроген» с целью создания модели для клинического изучения ЖГВ подтипа Н5. Суммарные данные доклинического и клинического изучения безвредности, иммуногенности и эффективности реассортантного штамма на основе апатогенного птичьего вируса гриппа А(Н5Ш) позволили разработать основы доя апробации ЖГВ потенциально пандемического подтипа Н5.

На основании результатов клинических испытаний тривалентная ЖГВ, включающая реассортантные штаммы на основе донора атгенуации А/Ленинград/134/17/57(Н2№), рекомендована для профилактики гриппа среди детей с трех лет и пожилых людей, страдающих хроническими заболеваниями. Таким образом, были расширены контингенты для применения ЖГВ как единого препарата с включением наиболее уязвимых групп (детей дошкольного возраста и пожилых, хронически больных людей), что в случае пандемии позволяет обеспечить наибольший охват прививками всех групп и категорий населения.

Разработанные автором реассортантные вакцинные штаммы современных эпидемических вирусов В/60/Йоханнесбург/99/50, Л/17/Калифорния/04/71 (НЗК2), А/17/Висконсин/05/84(НЗМ2) использовались для производства ЖГВ, на их основе подготовлено 5 млн. доз вакцины.

Анализ нуклеотидной последовательности донора аттенуации В/СССР/60/69 и модификация ОТ-ПЦР рестрикционного анализа впервые позволили выполнять этим методом идентификацию внутренних и неструктурных белков реассортантных вакцинных штаммов вирусов гриппа В. Положения, выносимые на защиту.

1. Холодовая адаптация штамма А/Москва/21 /17/65(Н2№) связана с появлением в процессе пассирования при пониженной температуре множественных нуклеотидных замен в гене РВ2, приводящих к изменениям в структуре соответствующей полимеразной субъединицы. Свойства холодовой адаптации, аттенуации и генетической стабильности, присущие штамму А/Москва/21 /17/б5(Н2М2), позволяют использовать его не только в качестве самостоятельного вакцинного штамма для иммунизации населения в случае возвращения в циркуляцию вируса гриппа А(Н2№), но и как потенциально новый донор аттенуации.

2. Методы классической генетической реассортации в куриных эмбрионах позволяют регулярно получать высокоурожайные реассортантные штаммы на основе ХА донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(Н2Ы2) с использованием в качестве источника поверхностных антигенов апатогенных вирусов гриппа птиц потенциально пандемических подтипов.

3. Реассортантные штаммы апатогенных птичьих вирусов на основе донора А/Ленингр ад/134/17/57(Н2№) проявляют свойства температурочувстнительности, холодовой адаптации и аттенуации в различных чувствительных моделях. Высокая степень аттенуации ХА реассортантов птичьих вирусов для кур, вплоть до полной неспособности к репродукции, свидетельствует о безопасности для птичьих хозяйств производства и использования подобных штаммов.

4. Использование ЖГВ может быть эффективным против высокопатогенных вирусов гриппа даже в случае неполного антигенного соответствия между вакцинным вирусом и инфекционным штаммом (экспериментальная модель). Тем не менее, вакцинация штаммом нового подтипа до наступления пандемии является нецелесообразной, так как в настоящее время неизвестен вирус, который вызовет пандемию.

5. Прототип ЖГВ «Орвакс» подтипа А(Н5Ш) является безвредным, генетически стабильным препаратом и способен к репродукции в носоглотке человека. При оценке иммуногенности ЖГВ подтипа Н5 показано, что сочетанное

применение реакции торможения гемагглютинации и теста микронейтрализации в наибольшей степени удовлетворяет критериям чувствительности и специфичности (клиническое изучение).

6. Реассортантная ЖГВ на основе доноров аггенуации A/JI енинград/134/17/57(H2N2) и В/СССР/60/69 является безвредной и эффективной для всех групп населения, включая детей от 3-х лет и пожилых людей старше 65 лет, страдающих хроническими заболеваниями (клиническое изучение).

7. В случае появления нового пандемического штамма рекомендуется проведение двукратной прививки соответствующей моновакциной. Включение штамма нового антигенного подтипа в состав поливалентной живой гриппозной вакцины является нецелесообразным, так как его иммуногенность при этом снижается (экспериментальные данные).

Внедрение результатов работы. По теме работы получено 4 патента на изобретения. Подана 1 заявка на патент. Подготовлены методические рекомендации «Вакцинопрофилактика гриппа с помощью живой гриппозной вакцины среди лиц пожилого возраста». Внесены изменения в Фармакопейную Статью на «Вакцину гриппозную аллантоисную интраназальную живую сухую» ФСП 42-0504-4097-04.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на 4-й Международной конференции по проблемам гриппа (Крит, Греция, 2000), 1-й и 2-й Европейских конференциях по проблемам гриппа (Мальта, 2002, 2005), 2-м Международном симпозиуме по проблемам респираторных инфекций (Ла Романа, Доминиканская Республика, 2002), 2-й Международной конференции по ортомиксовирусам (Нью-Джерси, США, 2003), 5-й Международной конференции по проблемам гриппа (Окинава, Япония, 2003), 1-й Международной конференции по вирусным вакцинам (Лиссабон, Португалия, 2004), Первой всероссийской конференции «Вакцинология 04» (Москва, 2004), VIII и IX Всероссийских научных Форумах с международным участием имени академика В. И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2004, 2005), Международной научной конференции «Актуальные вирусные инфекции -теоретические и практические аспекты» (Санкт-Петербург, 2004), 4-й Международной конференции по проблемам птичьего гриппа (Лондон, Великобритания, 2006), 2-й Международной конференции по вирусным вакцинам (Вена, Австрия, 2006). 6-й Международной конференции по проблемам гриппа (Торонто, Канада, 2007), Заседании ВОЗ по вопросам подготовки к пандемии (Женева, Швейцария, 2007), 3-й Европейской конференции по проблемам гриппа (Виламоура, Португалия, 2008). Материалы работы также представлялись и обсуждались на заседаниях Отдела вирусологии НИИЭМ РАМН (2004 г., 2005 г.) и Центра по контролю заболеваемости США (Атланта, 2001 г., 2004 г.). Публикации. По теме диссертации опубликовано 77 печатных работ, в том числе 29 статей (20 - в журналах, рекомендованных ВАК), 4 патента РФ, 1 научный обзор и 43 тезиса докладов общим объемом более 200 страниц. Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 328 страницах текста, включая 61 таблицу и 20 рисунков; состоит из введения, трех глав обзора литературы, семи глав собственных исследований, обсуждения, выводов и списка

литературы, который содержит 485 источников, из них 98 отечественных и 387 -иностранных.

Личный вклад автора. Тема и план диссертации, ее основные идеи и содержание разработаны автором на основании многолетних (1998-2007 г.г.) исследований. Реассортантные штаммы апатогенных вирусов гриппа птиц А(Н5Ы2), А(Н7ЫЗ) и А (ГОШ), а также реассортанты эпидемических вирусов гриппа А и В, подготовленные на основе ХА штаммов А/Москва/21 /17/65(Н2№) и В/СССР/60/69, получены, проанализированы и апробированы в доклинических исследованиях на животных (мыши, хорьки) лично автором. Автор принимала личное участие в клинических исследованиях в домах престарелых и детских садах Санкт-Петербурга и Ленинградской области, а также на базе Военного госпиталя № 1137. Во всех совместных исследованиях по теме диссертации, наряду с личным участием в их проведении, автору принадлежит участие в разработке программы исследований, а также анализ полученных данных. Все материалы, использованные в диссертационной работе, проанализированы и обобщены лично автором.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Вирусы. В работе были использованы штаммы вирусов гриппа из коллекции отдела вирусологии: ХА доноры аттенуации А/Ленинград/134/17/57(Н2№) и В/СССР/60/69; вакцинный штамм А/Москва/21/65(Н2К2) и его ХА вариант А/Москва/21/17/65(Н2№), реассортантные штаммы современных эпидемических вирусов гриппа А и В. При разработке ЖГВ против пандемически опасных вирусов гриппа автором были подготовлены реассортантные штаммы на основе донора аттенуации А/Ленииград/134/17/57(Н2Ы2) с использованием в качестве источника поверхностных антигенов апатогенных вирусов гриппа птиц подтипов Н5, Н7, Н9, полученных из Центра по контролю и предупреждению заболеваний США. Для заражения иммунизированных животных применяли высокопатогенные (ВП) вирусы гриппа птиц подтипа А(Н5Ш), выделенные в во время вспышек в различных регионах. Все эксперименты с ВП вирусами гриппа птиц проводились в лабораториях с условиями повышенного уровня биологической защиты (В8Ь-3+).

Все вирусы культивировали в 10-дневных развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ). ХА донорские и реассортантные штаммы инкубировали при 34°С 48-76 часов. Апатогенные и высокопатогенные штаммы вирусов гриппа птиц инкубировали при 37°С в течение 18-24 часов. Инфекционную активность вирусов определяли в РКЭ при оптимальной, повышенной до 40° и пониженной до 25°С температуре, 50% эмбриональную инфекционную дозу (ЭИД50) рассчитывали по методу Яеес1-Миепс11 (1938). К числу температурочувствительных (имеющих фенотип относили вирусы, которые репродуцировались при повышенной до 40°С температуре на 5,0-6,0 ^ ЭИД50 ниже по сравнению с оптимальной (К.СТ40). Если разница титров при оптимальной и пониженной до 25-26°С температуре (ЯСТ25) не превышала 3,0-4,0 ^ ЭИД50, вирусы относили к ХА группе (са- фенотип). Культура клеток. Использовали линию клеток МОСК (ЫВЬ-2), полученную из Центра по контролю и предупреждению заболеваний США (Атланта, Джорджия).

Получение реассортантов между вирусами «дикого» типа и ХА донорами аттенуации проводили в РКЭ по описанным Г.И. Александровой методикам (1977).

Молекулярно-генетический анализ. Определение состава генома реассортантных вирусов выполняли с помощью ОТ-ПЦР-рестрикционного анализа (Klimov, Сох, 1993) или частичным секвенированием отдельных генов. Для идентификации генов НА и NA применяли полное секвенирование. Специфические праймеры были разработаны с помощью компьютерной программы SeqLab. Обработку электрофореграмм нуклеотидных последовательностей проводили с помощью пакета программ DNAstar (Madison, WI). Множественное выравнивание нуклеотидных и аминокислотных последовательностей генов различных вирусов гриппа человека и птиц, а также определение идентичности проводили с помощью программы GeneDoc, версия 2.6.002 (Nicholas, 1997). Для филогенетического анализа использовали компьютерную программу Mega, версия 2.1 (Kumar, 2001) с применением алгоритма минимальной эволюции.

Лабораторные животные. Самки мышей линии BALB/c в возрасте 10 недель (Jackson Laboratories, Bar Harbor, MA, USA), самцы мышей линии СВА в возрасте 12-14 недель (питомник Рапполово, Ленинградская область), куры породы белый Леггорн в возрасте 4-х недель, хорьки обоего пола в возрасте 4-х месяцев. Репродукция вирусов в дыхательных путях мышей. Мышам под легкой анестезией вводили интраназально (и/н) 50 мкл аллантоисной жидкости с содержанием вируса Ю'-Ю7 ЭИД50. Эвтаназию проводили согласно «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ № 266 МЗ РФ от 19.06.2003).Титры вирусов определяли в легких и носовых ходах на 3-й сутки по показателям титрования суспензии органов в развивающихся куриных эмбрионах, начиная с разведения 1:10 для легких и 1:2 для носовых ходов. 50% мышиную инфекционную дозу (МИДда) и 50% летальную дозу (ЛД50) определяли по методу Reed-Muench (1938).

Реинфекция. Иммунизированных мышей инфицировали ВП вирусами птичьего гриппа A(H5N1) в летальных дозах. Летальность и снижение веса регистрировали в течение 14 дней. Концентрацию вируса в дыхательных путях и лимфоидной ткани (тимус) определяли на 3-й дет. после заражения по результатам титрования суспензии органов на РКЭ. Концентрацию вируса в головном мозге мышей определяли на 6-е сутки после инфекции.

Клиническое изучение безвредности и эффективности реассортантной ЖГВ.

В исследовании использовали ЖГВ, выпускаемую Иркутским предприятием по производству иммунобиологических препаратов. Вакцина и плацебо в виде шифрованных препаратов вводились однократно интраназально с помощью распылителя РДЖ-М4 или индивидуального распылителя по 0,25 мл в каждый носовой ход прививаемого с последующей оценкой реактогенности, безвредности, иммуногенности и эффективности. Интенсивность вакцинальных лихорадочных реакций оценивали в соответствии с классификацией, принятой Комитетом вакцин и сывороток Минздрава РФ: реакция отсутствует - при температуре <37,0°С; слабая реакция - с повышением температуры тела до 37,5°С; средняя реакция - с температурой 37,6-38,5°С; сильная реакция - с повышением температуры выше 38,6°С. Согласно Фармакопейной статье на ЖГВ допускается наличие реакций с

повышением температуры тела выше 37,5°С не более чем у 2% привитых. Продолжительность температурной реакции не должна превышать 3 суток.

Получение и обработка клинических материалов (сыворотки крови, носовые смывы) производились согласно «Методическим указаниям по проведению контроля противогриппозных препаратов» от 16.11.84 или МУК 4.2.2136-06. Поствакцинальный иммунный ответ оценивали в РТГА, реакции микронейтрализации (РН) и непрямом варианте иммуноферментного анализа (ИФА) по описанным методикам (Rowe et al., 1999).

Статистическая обработка данных. При анализе полученных результатов определяли средние величины и стандартное отклонение (М±а). Оценку статистической значимости различий проводили при помощи компьютерной программы Statistica (версия 6,0) с использованием теста t-распределения Стьюдента для выборок с нормальным распределением, или непараметрических критериев Уилкоксона-Манна-Уитни. Влияние демографических факторов на иммунологическую эффективность вакцинации изучали с помощью дисперсионного анализа ANOVA. Сравнение долей (пропорций) в двух соотносящихся группах оценивали при помощи непараметрического критерия х2 Мак-Немара в модификации Лидделла, в других случаях использовали точный критерий Фишера. Различия считались значимыми при р<0,05.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

МОЛЕКУЛЯРНО-ТЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ХОЛОДО АДАПТИРОВАННЫХ ШТАММОВ ВИРУСОВ ГРИППА А И В

Все применяющиеся в настоящее время для получения реассортантных вакцинных штаммов ХА доноры атгенуации были получены эмпирическим путем после длительных пассажей при пониженной температуре. Поскольку в каждом конкретном случае в основе аттенуации могут лежать различные механизмы, при создании живых вакцин необходимо подробно изучить эти механизмы, для того чтобы понять, какой из них способен привести к получению наиболее эффективного препарата.

Молекулярно-генетический анализ и изучение биологических свойств ХА штамма А/Москеа/21/17/65(H2N2). Опыт появления пандемий не исключает возврата в циркуляцию вирусов человека A(H2N2), который является единственным подтипом, вызвавшим пандемию в 1957 году и исчезнувшим из циркуляции более 40 лет назад. Мы провели изучение штамма A/MocKBa/21/17/65(H2N2) [Москва/21/17], который принадлежит к вирусам, завершающим эру циркуляции вирусов гриппа подтипа A(H2N2). ХА донор атгенуации А/Ленинград/134/17/57 (HZN2), применяющийся в настоящее время для получения реассортантов, является документировано безвредным для людей и может использоваться как вакцинный штамм в случае возвращения в циркуляцию вирусов этого подтипа. Однако вирусы A(H2N2), выделенные в период с 1957 по 1968 год, значительно отличаются между собой как антигенно, так и генетически. Наиболее существенные отклонения антигенных признаков от свойств пандемического возбудителя 1957 года произошло у штаммов 1965-1967 гг. выделения. Предсказать антигенную структуру возможного возбудителя пандемии невозможно, так же как и его близость или отдаленность от имеющихся вакцинных штаммов соответствующего подтипа, поэтому является весьма важным

наличие в коллекции вакцинных штаммов нескольких тщательно охарактеризованных вакцинных кандидатов.

По молекулярной структуре НА штамм Москва/21/17 является наиболее близким к эталонному штамму А/Англия/64. Вакцинный штамм Москва/21/17, разработанный входивший в состав ЖГ'В для детей в 1967 году был получен Г.И. Александровой после дополнительного 17-кратного пассирования при пониженной до 25-26°С температуре вакцинного штамма А/Москва/21/65(Н2№) [Москва/21/65], применявшегося для вакцинации взрослых. Штамм Москва/21/17 характеризуется документированной безвредностью и высокой иммуногенностью для детей, что было неоднократно подтверждено за время его использования, как в виде моновакцины, так и в составе дивакцины в 1966 -1967 годах по данным Е.А. Сиротенко с соавт. (1967) и Г.И. Александровой с соавт. (1968).

С целью изучения молекулярных изменений, приводящих к холодовой адаптации штамма Москва/21/17, было проведено секвенирование всех его генов, которое выполнялось в Центре по контролю и предупреждению заболеваний США (Атланта, Джорджия). Анализ отличий в генах и генных продуктах, появление которых могло бы повлиять на проявление таких фенотипических признаков, как холодовая адаптация и ограничение репродукции при повышенной до 38-39°С температуре штамма Москва/21/17, проводили в сравнении с вариантом Москва/21/65, полученным пассированием при оптимальной температуре. Было показано, что пассажный вариант Москва/21/65 отличался от ХА варианта сниженной репродукцией в РКЭ при 25°С и, наоборот, отсутствием существенного снижения инфекционной активности при 38-39°С (рис. 1 А). В культуре клеток МБСК было показано, что при заражении монослоя ХА вирусом Москва/21/17 при повышенной до 39°С температуре инкубации имела место значительная задержка репродукции по сравнению с оптимальными условиями. Такое угнетение репродукции было наиболее выраженным на ранних сроках инфекции (первые сутки после инокуляции) (рис.1 В).

А. В.

■ М>снва:?1-17 аМосквл2165

11 5 »

5 7

= 5

2 3 1

- «- Москва 2117 —»—Москва 21 $5

Рис. 1. А - репродуктивная активность ХА штамма А/Москва/21/17 и пассажного варианта А/Москва/21/65 в РКЭ; В - динамика репродукции (24, 48 и 72 часа) в культуре клеток МБСК при заражающей дозе 0,02 М01.

Таким образом, в различных системах было показано, что вариант Москва/21/65, утративший способность размножаться при 40°С и аттенуированный для человека, достаточно сильно отличался от ХА варианта по уровню репродукции при пониженной или повышенной до 38-39,5°С температуре.

Анализ нуклеотидных последовательностей генов негликозилированных белков штаммов Москва/21/17 и Москва/21/65 показал, что в процессе дополнительного пассирования при пониженной температуре штамм Москва/21/17 приобрел 8 нуклеотидных замен в генах внутренних и неструктурных белков по сравнению с промежуточным вариантом Москва/21/65. При этом 6 нуклеотидных замен являются значащими и приводят к аминокислотным замещениям в РВ2 белке (три) и РВ1, М1 и NS1 белках (по одному) (табл. 1). Было показано, что большинство мутаций, отличающих ХА вариант от исходного пассажного, локализовано в гене РВ2. Все значащие замены в гене РВ2 являются уникальными, одна незначащая замена в 1740 положении нуклеотидной цепи не является уникальной, поскольку встречается у более поздних вирусов подтипа H3N2 (А/Англия/41, А/Токио/38). Замена метионина на изолейцин в 202 положении белка РВ2 располагается в участке 51-259 аминокислотной последовательности, который участвует во взаимодействии субъединиц РВ1 и РВ2 вирусной полимеразы в процессе транскрипции и репликации вируса (Toyoda et al., 1996, Ohtsu et al., 2002). Несмотря на то, что уникальные аминокислотные замены валина на изолейцин в 414 положении и глицина на серин в 416 положении белка РВ2 не ведут к изменению полярности или заряда, анализ с помощью методики Chou-Fasman (1974) показал возможность изменения в результате этих близко расположенных замен вторичной структуры белка в положении 415-416 в области а-спирали.

Таблица 1

Нуклеотидные замещения в генах ХА штамма А/Москва/21/17/65(Н2Ш) по

сравнению с пассажным вариантом А/Москва/21/65(Н2Ш)

Ген № № А/Москва/21/17 (ХА) А/Москва/21/65

нуклеотида аминокислот-

ного остатка нуклеотид аминокислота нуклеотид аминокислота

РВ2 633 202 А I G M

1267 414 А I G V

1273 416 А S G G

1740 - G - А -

РВ1 2191 723 С R Т W

РА - - - - - -

НА 41 - С - А -

477 147 А D G G

NP 396 - А* - G* -

NA - - - - - -

М1 569 182 А Т G A

NS1 219 65 А I G V

*А>в

Замена триптофана на аргинин в 723 положении белка РВ1 Москва/21/17 встречается у большинства проанализированных эпидемических вирусов и, таким образом, не может привносить изменений в сторону холодовой адаптации. Отсутствие отличий в РА белке Москва/21/17 от пассажного варианта подтверждает данные о роли отдельных генов, полученные на модели одногенных реассортантов на основе ХА донора аттенуации А/Ленинград/134/57(Н2Ы2) И. В. Киселевой (2001), когда было показано, что наследование только РА гена от ХА

варианта не приводило к аттенуации, если остальные гены происходили от исходного штамма «дикого типа».

Нуклеотидная замена в гене NP является незначащей и прослеживается на электрофореграмме в виде двойного пика с преобладанием А над G у ХА варианта и G над А у его предшественника. Эта мутация не является уникальной, так как встречается также у эпидемического штамма А/Энн Арбор/67. Уникальная мутация в М-гене штамма Москва/21/17 (Т-182-А), приводящая к замене в мембранном белке Ml, сопровождается изменениями свойств гидрофобности. Ранее при изучении роли отдельных генов в аттенуации штамма А/Ленинград/134/57(112N2) было показано, что присутствие в геноме вирулентного штамма М-гена от ХА варианта не приводило к проявлению is- и са-фенотипа.

Мутация в гене NS приводит к аминокислотной замене в белке NS1 (1-65-V), которая расположена в N-концевом участке а-спирали, состоящем из 73 аминокислот, который является эффекторным доменом взаимодействия с РНК (Qian et al., 1994), а также играет ключевую роль в модулировании таких факторов врожденного иммунитета, как интерферон а/(3 (Wang et al., 2000). Эта мутация является уникальной, однако, как будет продемонстрировано ниже, оказалось, что замещение NS-гена Москва/21/17 на NS-ген эпидемического вируса не приводило к изменению ts- и са- фенотипа. Ранее в исследованиях in vitro было показано, что уровни индукции ранних цитокинов ХА реассортантными штаммами A(H1N1) и A(H3N2) на основе донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(H2N2) в основном совпадали с аналогичными показателями для эпидемических вирусов соответствующего серотипа. Индукция интерферона I типа ХА реассортантами оказалась сниженной по сравнению с эпидемическими родителями. Изучение одногенных реассортантов, включающих мутантные гены донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(H2N2), показало, что включение генов РВ2 или РВ1 в состав реассортантов значительно снижало продукцию ранних цитокинов, включая и интерферон I типа, при инфицировании эпителиальных макрофагов человека. В то же время, в отношении реассортантов, включающих мутантный M или NS гены, такого снижения не наблюдалось (Rekstin et al., 2006).

Локализация мутации в гене НА, приводящей к аминокислотной замене в одном из петлеобразных участков глобулярной части тяжелой цепи НА1, свидетельствует, что она могла появиться в процессе адаптации при длительном пассировании в РКЭ. В гене нейраминидазы различий не выявлено.

Был проведен сравнительный анализ известных последовательностей генов внутренних и неструктурных белков таких доноров аттенуации подтипа H2N2, как А/Ленинград/134/17/57 (Klimov, Сох, 1988), А/Энн Арбор/6/60 (Maassab, 1969) и ХА штамма, полученного пассированием на культуре клеток Vero: А/Сингапур/1/57са (Romanova et al., 2004). Результаты представлены в таблице 2. Общим признаком для всех ХА штаммов является полигенный характер изменений, приводящих к проявлению са- и ait- фенотипа при традиционном способе получения ХА штаммов, то есть методом последовательного пассирования при пониженной температуре, даже если это пассирование осуществляется в различных системах (куриные эмбрионы, первичные или перевиваемые культуры). Сопоставление данных о мутациях в различных генах и

генных продуктах внутренних и неструктурных белков различных ХА штаммов подтипа A(H2N2) указывает на отсутствие каких-либо универсальных позиций в их геномах, мутации в которых должны приводить к аттенуации. Исключение составляет замена аланина в позиции 86 белка М2 на серин у штамма А/Энн Арбор/6/60 или треонин у штамма А/Ленинград/134/17/57, однако по данным Jin et al. (2003) эта мутация не связана с температурочувствительностью. Еще одним исключением является незначащая нуклеотидная замена в 813 положении reraNS вирусов А/Энн Арбор/6/60 (A->G) и ХА А/Сингапур/1/57са.

Таблица 2

Мутации в генах негликозилироваиных белков ХА штаммов A(H2N2)

Ген Энн Арбор/6/60 Ленинг рад/17 Москва/21/17/65 Сингапур/1/57 -ха

нуклеотид аминокислота нуклеотид аминокислота нуклеотид аминокислота нуклеотид аминокислота

РВ2 A-141-G A-821-G T-1933-c A-265-S G-1459-T V-478-L G-633-A G-1267-A G-1273-A A-1740-G М-202-1 V-414-I G-416-S A-252-G A-498-G Т-581-С G-1046-T I-185-T R-340-I

РВ1 A-123-G A-1195-G G-1395-T A-1766-G G-2005-A С-2019-Т К391-Е E-457-D E-581-G А-661-Т G-360-A G-819-T A-1795-G K-265-N V-591-1 Т-2191-С W-723-R Т-1279-А А-1965-С L-419-1

РА Т-20-С Т-2167-С Т-2168-С L-715-P L-715-P Т-222-С Т-107-С G-1045-T L-28-P V-341-L А-707-Т Т-1425-А A-1537-G G-1819-C N-228-I I-505-V E-599-Q

NP A-146-G G-34-D - - 396 G/A - G-210-A -

Ml G-68-A V-15-I A-567-G Т-182-А С-55-Т Т-97-С G-32A-7 G-499-C R-101-K Q-158-H

М2 G-969-T A-86-S G-969-A А-86-Т - - - -

NS1 G-483-A A-153-W G-193-A V-65-I -

NS2 A-813-G G-798-A M-100-I A-813-G -

Данные сравнительного анализа подтвердили, что наибольшим изменениям подвергаются гены полимеразного комплекса холодоадаптированных штаммов. Большинство нуклеотидных замен в этом случае сопровождается аминокислотными замещениями в соответствующих полимеразных субъединицах. Во всех случаях наиболее консервативным является белок №. Аминокислотные замещения в ЫР-белке ХА вариантов по сравнению с «дикими» штаммами или отсутствуют (А/Леникград/134/17/57, А/Сингапур/1/57ха), или существенно не влияют на структурную организацию белка. Во всех случаях множественный характер изменений в геноме ХА штаммов указывает на последовательную сопряженную эволюцию различных белковых субъединиц в процессе серийных пассажей при пониженной температуре. Эти сочетанные изменения в различных генах доноров аттенуации могут обеспечивать генетическую стабильность реассортантов на основе подобных штаммов.

Далее была поставлена задача оценить генетическую стабильность штамма А/Москва/21/17 и потенциальную возможность его применения как нового донора

аттенуации, для решения которой были получены полигенные реассортанты с современным эпидемическим вирусом А/Новая Каледония/20/99(НШ1). Один из реассортантов унаследовал от эпидемического вируса гены НА и ЫА (структура генома 6:2), а другой помимо этого еще Ш-ген (структура генома 5:3) (табл. 3). Секвенирование показало сохранность всех мутаций в генах внутренних и неструктурных белков, приобретенных реассортантами от ХА родителя А/Москва/21/17.

Таблица 3

Структура реассортантов на основе штамма А/Москва/21/17/65(Н2№)

Вирус Структура генома

А/Москва/21 /17/65(Н2Ю) РВ2 РВ1 РА НА NP NA М NS

А/Новая Каледония/20/99(Н 1N1) РВ2 РВ1 РА HA- NP NA М NS

Реассортант 6:2 (11-6:2) РВ2 РВ1 РА HA NP NA м NS

Реассортант 5:3 (11-5:3) РВ2 РВ1 РА НА NP NA м NS

Были изучены ростовые характеристики реассортантов и родительских штаммов при различных температурах инкубации в РКЭ, а также их репродуктивная активность в легких мышей линии СВА (рис. 2). Было показано, что наследование от ХА штамма шести или пяти генов внутренних и неструктурных белков (независимо от источника происхождения ИЗ-гена) приводило к проявлению реассортантами /л и са- фенотипа (рис. 2, А)

А. В.

аЗЭ.5 В34 025 яЛегкие ПНосовыеходы

1Й1 А/Мос/17 А/Мос/65 Р-6:2 |!-5:3 Н1Ш-ДТ ФСБ

Рис. 2. А - репродуктивная активность в куриных эмбрионах при различных температурах инкубации, В - репродукция в дыхательных путях мышей.

Репродукция 6:2 реассортанта в РКЭ при оптимальной температуре оказалась сниженной по сравнению с реассортантом 5:3 и родительским штаммом Москва/17, однако в дыхательных путях мышей такого снижения не наблюдалось (рис. 2, В).

Таким образом, было показано, что мутации, ответственные за холодовую адаптацию штамма А/Москва/21/17/65, локализованы в гене РВ2. Указанные замены расположены в активных доменах субъединицы РВ2 вирусной полимеразы: замена М-202-1 локализуется в участке 51-259 аминокислотной последовательности, активном при взаимодействии субъединиц РВ1 и РВ2 вирусной полимеразы, а уникальные близкорасположенные замены У-414-1 и О-416-8 могут вызывать изменение вторичной структуры белка. Мутация У-65-1 в белке N81 не оказывает влияния на са- и а/г-фенотип.

Генетическая стабильность штамма А/Москва/21/17(Н2№), а также сохранение свойств холодовой адаптации и аттенуации реассортантами,

полученными на его основе, позволяют его использование в качестве нового донора аттенуации для получения реассортантов, а также в качестве ХА вакцинного штамма в случае возвращения в циркуляцию вирусов A(H2N2). Молекулярно-гепетический анализ и рестриктазное картирование ХА штамма вируса гриппа В/СССР/60/69. Современная реассортантная ЖГВ применяется в виде поливалентного препарата, включающего штаммы всех трех циркулирующих в настоящее время разновидностей вирусов гриппа - A(H1N1), A(H3N2) и В. Для подготовки реассортантных вакцинных штаммов вирусов гриппа В используется ХА донор аттенуации В/СССР/60/69. Впервые была изучена нуклеотидная последовательность донора аттенуации В/СССР/60/69, что позволило модифицировать схему ОТ-ПЦР-рестрикционного анализа для изучения состава генома реассортантов на его основе. Ранее метод, базирующийся на идентификации уникальных нуклеотидных различий между генами ХА доноров аттенуации и эпидемических вирусов, был разработан для идентификации мутаций генов внутренних и неструктурных белков донора аттенуации А/Ленинград/143/17/57(Н2Ы2), который в течение многих лет используется для подготовки ХА реассортантных вакцинных штаммов с современными эпидемическими штаммами вирусов гриппа А подтипов HI и НЗ (Klimov, Сох, 1993).

Для получения ДНК-копий участков генов внутренних и неструктурных белков донора аттенуации В/СССР/60/69 применяли следующие праймеры, разработанные А.И. Климовым: РВ2-1550 (5' TGG GGA AGT CAT ААТ GG), РВ1-518 (5' ТТТ GCC AAG ATA ТСА TTG), РА-1061 (5' AAA TAC ААТ AAG ТАА TGA GG), NP-1123 (5' TGG GTA TGA AGC CAT GG), М-8 (5' GCA CGC ACT TTC TTA AAA TG), NS-6 (5' AAG CAG AGG ATT TAT TTA G). Комплементарными обратными праймерами были : PB2-r2389 (5' АСА CGA GCA ТТТ TTC ACT С), РВ1-Г1399 (5' CCA TAC ATG TCT CTT CAT С), PA-r2303 (5' GAA АСА CGT GCA ТТТ ТТ), NP - rl 838 (5' GAA АСА АСА GCA ТТТ ТТТ АС), M-rl 183 (5' АСА ACG САС ТТТ TTC CAG), NS-r 576 (5' ССС ТТТ TTA TTG ТСА AAC GG). Анализ полученных нуклеотидных последовательностей показал, что гены РВ2, РВ1, PA, NP и NS ХА донора В/СССР/60/69 имеют нуклеотидные позиции, отсутствующие в геномах современных эпидемических штаммов вируса гриппа В и приводящие к возникновению сайтов рестрикции для Hind III, BspH I, Bel II, Avr II, Мае I. Анализ нуклеотидной последовательности M гена выявил, что все современные изоляты имеют сайт рестрикции Bgl II, тогда как такой сайт отсутствует в M гене В/СССР/60/69 (табл. 4). Показано, что нуклеотидные замены, обнаруженные в РВ1, РА, NP, M и NS генах донора аттенуации В/СССР/60/69, с большой долей вероятности можно считать уникальными, поскольку они не встречались у подавляющего большинства штаммов вируса гриппа В, выделенных в различных регионах мира и принадлежащих к различным генетическим линиям. Хотя нуклеотидная замена в РВ2 гене не является уникальной, так как она встречалась у ряда вирусов линии В/Виктория, тем не менее, рестриктаза Hind III может применяться для определения происхождения гена РВ2 у реассортантов, полученных на основе ХА донора В/СССР/60/69, поскольку у вирусов гриппа В линии В/Виктория, выделенных после 2002 года, сайт рестрикции для Hind III, характерный для гена РВ2 донора В/СССР/60/69, отсутствует.

Таблица 4

Сайты рестрикции, уникальные для донора аттенуации В/СССР/60/69

Ген Сегмент № нуклео-тида Рестриктаза В/СССР/60/69 Современные штаммы

РВ2 1550-2389 1939 Hind III 5'...AiAGCTT...3' * 5'...AGGCTT...3'

РВ1 518-1399 1086 BspHI 5'...ïJ-CATGA...3' 5'...TTATGA...3'

РА 1061-2303 1796 Bell 5'...T4'GATCA...3' 5'...TGAACA...3'

NP 1123-1838 1291 Avril S'...ClCTAGG...3 5'...CCTAGA...3'

M 8-1183 524 BglII 5'...AAATCT...3 5'...A4GATCT...3'

NS 6-576 373 Mae I 5'...C4-TAG...3' 5'...ATAG...3'

Выявление целого ряда уникальных нуклеотидных замещений в генах внутренних и неструктурных белков донора аттенуации В/СССР/60/69 указывает на единый характер аттенуации вирусов гриппа А и В, полученных последовательным пассированием при пониженной температуре.

ПОДГОТОВКА И ХАРАКТЕРИСТИКА РЕАССОРТАНТНЫХ ХА ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ ПАНДЕМИЧЕСКИ ОПАСНЫХ ВИРУСОВ

ГРИППА

Характеристика вирусов птичьего гриппа, использованных в качестве источника поверхностных антигенов. В процессе отбора потенциальных кандидатов для подготовки вакцинных штаммов против возможных пандемий будущего были изучены характеристики репродукции в РКЭ при различных температурах следующих апатогенных вирусов гриппа птиц: А/утка/Потсдам/1406-86 (Н5И2), А/утка/Вьетнам/342/01 (Н5Ы1), А/дикая утка/Нидерланды/12/00 (Н7№), А/Гонконг/1073/99 (Н9К2),

А/перепел/Гонконг/6/97 (Н9Ы2), А/курица/Гонконг/09/97 (Н9Ы2). Показана высокая степень температуроустойчивости всех вышеперечисленных вирусов: показатели роста при 40°С не отличались или были выше, чем при 34 и 37°С, только при повышении температуры до 41°С наблюдалось снижение репродукции на 3-4 ^ ЭИД50/мл. Для реассортации классическими методами в куриных эмбрионах были выбраны вирусы А/утка/Потсдам/1406-86(Н5Ы2) [Н5М2-дт], А/дикая утка/Нидерланды/12/00 (Н7№) [Н7№-дт], А/перепел/Гонконг/6/97(Н9Ш) антигенной линии 01 [Н9Ш-дг]. Молекулярно-генетический анализ НА родительских штаммов «дикого» типа показал, что все они содержат в сайте протеолитического расщепления гемагглютинина один остаток аргинина -признак, характерный для низкопатогенных вирусов. Анализ тяжелой цепи гемагглютинина НА1 вирусов подтипа Н5 показал наличие аминокислотных различий между родительским вирусом, использованным для подготовки реассортантного вакцинного штамма подтипа А(Н5Ш) - А/утка/Потсдам/1402-6/86 - и вирусами, выделенными в Гонконге в 1997 году (95-96% гомологии), а также вирусом А/Гонконг/213/03(Н51чП) (94% гомологии). Количество аминокислотных различий между А/утка/Потсдам/1402-6/86(Н5К2) и другими более поздними изолятами А(Н5К1) находится в пределах 9-11%. Родительские «дикие» штаммы подтипа А(Н9К2) и А(Н7№) были на 98% идентичными изолятам, выделенным от больных в Гонконге в 1999 г. и в Нидерландах в 2003 г.

Ростовые характеристики реассортаптов птичьих вирусов при различных температурах инкубации в РКЭ. Для детального исследования были отобраны реассортанты, содержащие все значащие мутации в генах внутренних и неструктурных белков, описанные ранее для ХА донора аттенуации А/Ленинград/134/57(Н2№) [Лен/17]. С помощью ОТ-ПЦР-рестрикционного анализа и секвенирования генов НА и ЫА было показано, что реассортант А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5Ы2) [Лен 17/Н5] унаследовал от «дикого» вируса только ген НА, а остальные 7 генов - от донора аттенуации Лен/17 (формула генома 7:1). Реассортанты подтипов НТЫЗ и Н9№ - А/17/дикая утка/Нидерлавды/00/84 (Н7№) [Лен 17/Н7] и А/17/перепел/Гонконг/97/86 (Н9№) [Лен 17/Н9] - имели формулу генома 6:2, так как унаследовали гены НА и ЫА от «диких» родительских штаммов. Показано, что все реассортанты вирусов гриппа птиц на основе холодоадаптированного донора аттенуации Лен/17 обладают высокой продуктивностью в РКЭ (8,5-9,6 ^ ЭИД 50/мл) и устойчиво проявляют и са- фенотип, то есть свойства, характерные для ХА донора аттенуации (табл.5).

Таблица 5

Репродукция в куриных эмбрионах реассортантов апатогенных вирусов

гриппа птиц

Вирусы Инфекционная активность 18 ЭИД »/мл аст25 0ё эид50) КСТ,М (18 ЭИД50) Фенотип

Холодоадаптированный донор аттенуации

А/Ленинград/134/17/57(Н21Ч2) 9,5±0,3 2,2 8,0 И, са

Апатогенные вирусы птичьего гриппа

А/утка/Потсдам 1406-86(Н5№) 8,5±0,2 8,0 0 поп-1$, поп-са

А/дикая утка/Нидерланды/12/00(Н7№) 8,7±0,2 7,5 0 поп-15, поп-са

А/перепел/ Гонконг/6/97(Н9И2) 8,6±0,8 8,2 0 поп-15, поп-са

Реассортанты апатогенных птичьих вирусов

А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5Н2) 7:1 9,3±0,3 3,1 7,7 ¡5, са

А/17/дикая утка/Нидерланды/00/84(Н7№) 6:2 9,6±0,5 4,0 8,5 са

А/17/перепел/Гонконг/97/81 (Н9№) 6:2 9,8±0,5 2,8 9,8 й, са

Оценка безвредности для кур ХА реассортантов, содержащих гены вирусов птичьего гриппа. Данный раздел работы был выполнен совместно с ветеринарной лабораторией, г. Афины, США под руководством Д. Свэйна. Для оценки аттенуации при введении курам использовали реассортанты вирусов птичьего гриппа подтипов А(Н5№) и А(Н7№) на основе Лен/17, а также родительские птичьи вирусы и донор аттенуации Лен/17. Патогенность определяли при внутривенном (в/в) введении стандартного разведения (10"1) вирусного материала (табл.6). «Дикий» вирус подтипа А(Н5Ы2), а также ХА реассортанты подтипов А(Н5Ш) и А(Н7№) были безвредными и не вызывали развития инфекции. Из всех исследованных вирусов только «дикий» вирус НЖЗ-дт проявлял токсичность при в/в введении, когда развитие инфекции и смертность на 7-8 сутки наступали в 5 случаях из 8. После интраназального введения птичий вирус Н7ЫЗ-дт был выделен из ротоглоточных и клоакальных смывов на 3-й день после инфекции в средних титрах 1,1-0,9 1ц ЭИД50/мл. ХА реассортант данного подтипа не выделялся и не вызывал сероконверсий по данным радиальной иммунодиффузии в агарозном геле. Реассортант А(Н5Ш) и родительский вирус этого подтипа Н5№-

дт, а также донор аттенуации Лен/17 также не были выделены после интраназального введения и не вызывали сероконверсий.

Таблица б

Оценка безвредности и инфекционной активности реассортантов при _внутривенном (в/в) и ннтраназальном введении курам_

Вирус В/в введение(п=8) Интраназалыюе введение (п=5)

заболевае- леталь- выделение вируса на 3-й серокон- заболевае- леталь-

мость ность день ЭИД,„) версий мость ность

оральное клоакальное 21-й день

Холодоадаптированный донор аттенуации

Лен/17 0/8 0/8 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5

Анатогенные вирусы птичьего гриппа

Н5Ы2-дт 0/8 0/8 0/5 0/5 3/5 0/5 0/5

Н7Ю-дт 5/8 5/8 2/5(10") 1/5 (10 0!") 5/5 0/5 0/5

Реассортанты апатогенных птичьих вирусов

Лен17/Н5(Н5Ы2) 0/8 0/8 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5

Лен17/Н7(Н7№) 0/8 0/8 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5

Таким образом, было установлено, что приобретение реассортантами «внутренних» генов донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(И2№) приводило к полной их аттенуации для кур. ХА реассортанты, являясь адаптированными к пониженной температуре репродукции и гиператтенуированными для кур, оказались неспособными ни инфицировать птиц, температура тела у которых значительно выше, чем у человека, ни выделяться от них в окружающую среду. Безвредность кандидатов в вакцинные штаммы при интраназальном введении мышам. Изучение репродуктивной активности в дыхательных путях мышей показало, что все ХА реассортанты апатогенных птичьих вирусов были аттенуированными для мышей, репродуцируясь более эффективно в носовых ходах, чем в легочной ткани (табл.7).

Таблица 7

Репродуктивная активность реассортантов апатогенных птичьих вирусов и родительских штаммов в дыхательных путях мышей при заражающей дозе

61йЭИД50

Препарат Характеристика Выделение вируса на 3-й день п.и. (1В ЭИД50/мл), п=3

легкие носовые ходы

Лен 17/Н5 7:1 ХА реассортант 2,1±1,0 3,5±0,0

Н5Ш-дт «дикий» температуроустойчивый 6,3±0,3 1,6±0,2

Лен 17/Н7 6:2 ХА реассортант <1,5 3,7±0,3

Н7Ш-дт дикий» температуроустойчивый 6,4±0,2 1,7±0,0

Лен 17/Н9 6:2 ХА реассортант <1,5 3,7±0,2

Н9Ю-дт «дикий» температуроустойчивый 4,9±0,5 1,8±0,5

Лен/17 ХА донор аттенуации 2,3±0,5 2,5±0,3

Раствор ФСБ Контроль <1,5 <0,8

Полученные результаты свидетельствуют, что классическими методами в куриных эмбрионах подготовлены высокорепродуктивные реассортанты вирусов гриппа потенциально пандемических подтипов, проявляющие свойства температурочувствительности, холодовой адаптации и аттенуации, необходимые для вакцинных штаммов ЖГВ.

РЕЗУЛЬ ТА ТЫ ДОКЛИНИЧЕСКОГО ИЗУЧЕНИЯ РЕАССОРТАНТНОГО ШТАММА А/17/УТКА/ПОТСДАМ/86/92(Н5Ю). Основные этапы данного раздела работы были выполнены в Центре по контролю и предупреждению заболеваний США (Атланта, Джорджия). Антигенная специфичность. Проведенное сравнение полных нуклеотидных последовательностей вируса Н5№-дт «дикого» типа и 7:1 реассортанта соответствующего подтипа выявило отсутствие изменений в процессе реассортации и селективных пассажей. Тем не менее, известно, что вирусы гриппа могут антигенно отличаться даже в случае полной идентичности аминокислотного состава НА, в частности, вследствие различных путей гликозилирования при культивировании в различных системах (Katz et al., 1999, Romanova et al., 2003). В таблице 8 представлены данные изучения антигенных свойств реассортантного штамма Лен 17/Н5 в РТГА с набором иммунных сывороток хорьков.

Таблица 8

Данные РТГА с антисыворотками хорьков_

Вирусы Подти п Антисыворотки хорьков

Гк/156 Гс/Гк/437 Вн/113 Вн/342 Гк/213 Лен 17/Н5

А/Гонконг/156/97 (Гк/156) H5N1 320 160 640 640 <20 160

А/Гусь/Гонконг/437-4/99 (Гс/Гк/437) H5N1 640 640 5120 2560 640 1280

А/Гусь/В ьетнам/113/01 (Вн/113) H5N1 160 40 2560 320 160 80

А/У тка/Вьетнам/342/01 (Вн/342) H5N1 320 160 320 2560 <20 640

А/Гонконг/213/03 (Гк/213) H5N1 640 160 10240 2560 2560 640

ЛенП/Н5 H5N2 160 40 1280 640 <20 640

Н5Ш-дт H5N2 160 80 1280 640 <20 640

А/курица/Гонконг/409.1 /02 H5N1 160 80 5120 320 640 320

А/курица/Гонконг/31.4/02 H5NI 320 80 320 640 <20 320

А/Гусь/Гонконг/668.1/01 H5N1 160 80 640 640 160 160

Показано, что вакцинный кандидат Лен 17/Н5 являлся идентичным родительскому штамму A(H5N2), а также проявлял более выраженную степень антигенного родства с ВП вирусами A(H5N1), выделенными в Гонконге в 1997 году, по сравнению с вирусами A(H5N1) 2001-2003 годов выделения. При этом сыворотка, полученная к самому реассортанту Лен 17/Н5, реагировала в пределах всего 1:2 - 1:4 гомологичного титра как с вирусами 1997 года выделения, так и с более поздними изолятами.

Изучение генетической стабильности реассортантного ХА штамма Лен 17/Н5 после пассажа в носовых ходах хорька. В процессе получения иммунной антисыворотки реассортантный вирус вводили в носовые ходы хорька в дозе 6 lg ЭИДзо/мл с последующим выделением реизолятов на 3-й и 6-й день после инокуляции. Носовые смывы пассировали трехкратно в РКЭ. Вакцинный вирус, выделенный на 3-й день после инокуляции, сохранил все значащие мутации в генах внутренних и неструктурных белков, характерные для донора аттенуации Лен/17. На 6-й день после инокуляции вирус не был выделен (Desheva et al, 2005). Иммуногенность реассортантного штамма Лен 17/Н5 при введении белым мышам. На мышах была изучена возможность использования штамма Лен 17/Н5 в качестве как ЖГВ, так и инактивированной вакцины (ИГВ). Было проведено сравнительное изучение иммуногенности ЖГВ в дозе 107 ЭИДзо/мл, вводимой интраназально (и/н), и цельновирионной ИГВ, инактивированной формалином, вводимой внутримышечно (в/м) в дозе 10 мкг/100 мл. Результаты представлены в

таблице 9. После однократной и/н иммунизации ЖГВ из штамма Лен 17/Н5 сероконверсии антигемагглютинирующих и нейтрализующих антител в сыворотках крови наблюдались только к гомологичному вирусу подтипа А(Н5№). В качестве ИГВ, парентеральное введение Лен 17/Н5 стимулировало образование сывороточных антител как к гомологичному вирусу А(Н5Ш), так и вирусам А(Н5Ш), выделенным в 1997 г. в Гонконге (А/Гонконг/156/97 и А/Гонконг/483/97).

Таблица 9

Иммуногенность ЖГВ и ИГВ из реассортантного штамма Лен 17/Н5 через 6 __недель после введения мышам_

Препарат РТГА (среднегеометрические титры), п=5 РН (средние титры нейтрализующих антител), п=5

II5N2-ÄT Гонконг/483 Гонконг/213 Н5Ш-дт Гонконг/156 Гонконг/21 3

ЖГВ (и/н) 8,9 <10 <10 80 <20 <20

ИГВ (в/м) 10,0 7,6 <10 160 80 <20

H5N2-ÄT (и/н) 10,0 <10 <10 160 80 40

ФСБ(и/н) <10 <10 <10 <20 <20 <20

Применение ИФА позволило выявить в ответ на введение ЖГВ или ИГВ развитие сероконверсий вирус-специфических и 1§А в сыворотках крови к вирусам Н5Ш: к цельному вирусу А/Гонконг/213/03 и очищенному НА А/Гонконг/156/97 (рис. 3). В группе мышей, иммунизированных ЖГВ, были выявлены специфические и ^А антитела к вирусам А(Н5№) в легких и верхних дыхательных путях (ВДП). Внутримышечное введение ИГВ не стимулировало выработку lgA в легких и ВДП, локальный иммунный ответ в этом случае был представлен в основном и был выражен значительно слабее, чем при интраназальном введении ЖГВ (р<0,001) (рис.3).

А/Гонконг/156/97

А/Гонконг/213/03

3 з

Ii II г

| IgG IgA IgG IgA

;Бронхолегочн ые Носоеыесмывы

смывы [

«ЖГВ

Контроль

IgG IgA IgG IgA IgG IgA

Сыворотки бронхолегочные Носовые смывы

смывы

Рис. 3. Системные и секреторные IgG и IgA антитела (ИФА) к вирусам гриппа A(H5N1) после введения мышам реассортантного штамма Лен 17/Н5.

Таким образом, была подтверждена способность штамма Лен 17/Н5 индуцировать антитела не только к гомологичному варианту подтипа H5N2, но также и перекрестнореагирующие антитела к вирусам A(H5N1) (Desheva et al., 2006).

Сравнительное изучение эффективности ЖГВ и ИГВ из штамма Лен 17/Н5 при реинфекции мышей вирусами A(H5N1). Для заражения животных через 1,5 месяца после однократной иммунизации ЖГВ и ИГВ на основе штамма Лен 17/Н5 использовали вирусы подтипа H5N1 А/Гонконг/483/97 в дозе 50 ЛДзо и

А/Гонконг/213 в дозе 100 МИД5о (ВехЬеуа ег а1, 2006). Поскольку вирус А/Гонконг/213/03 не является высокопатогенным для мышей, оценку защитного действия вакцин проводили по показателям выделения этого вируса из легких на 3-й день после контрольного заражения. Результаты представлены в таблице 10.

Показано, что введение мышам ВП штамма А/Гонконг/483 в дозе 50 ЛД50 приводило в контрольной группе к значительной потере веса, начиная с 3-го дня после инфекции и к 100% смертности к 8-му дню, при этом средние титры вируса в легких достигали 5,9 ^ ЭИД50/МЛ. Иммунизация ЖГВ на 100% защищала от летальности, при этом потеря в весе не превышала 5%, а средний титр инфекционного вируса в легких был в 10000 раз ниже, чем в контрольной группе (р<0,001). ИГВ защищала от летальности в 9 случаях из 10 (90%). Несмотря на то, что в группе ИГВ инфекционный вирус ни в одном случае не был выделен из легких, некоторое его количество было выделено из носовых ходов и из головного мозга.

Таблица 10

Эффективность против заражения вирусами А(Н5Ш), _выделенными в 1997 и 2003 гг.__

Препарат Заражение 50 ЬО50 А/Гонконг/483/97 Заражение 100 МИД50 А/Гонконг/213/2003

о о О я к. 4> 5 .о Я о"- средние титры ЭИДо/мл), п=5 выделение вируса из легких

С О § » <0 '•—^ * 2 легкие носовые головной тимус выделено/ средние

и н о 60 ходы мозг всего титры (1йЭИД5с/мл)

Лен17/Н5(ЖГВ) 0/8 6 1,9±0,5 <0,8 <0,8 <0,8 1/10 1,8±0,9

Лен17/Н5(ИГВ) 1/8 7 <1,5 1,1 ±0,3 1,0±0,5 <0,8 0/5 <1,5

Н5Ш-дт 0/8 0 <1,5 <0,8 <0,8 <0,8 0/10 <1,5

Контроль 8/8 22 5,9±1,3 4,0±0,7 4,3±0,8 3,б±1,3 10/10 5,3±1,4

Заражение вирусом А/Гонконг/213, значительно отличающимся по антигенным свойствам, показало, что ЖГВ была на 90% эффективной, когда инфекционный вирус выделялся из легких в 1 случае из 10 в среднем титре 1,8 ^ ЭИД5о/мл, то есть в 3000 раз меньшем, по сравнению с контролем (р<0,001).

В другом эксперименте была изучена эффективность против реинфекции антигенным вариантом вируса А(Н5№), выделенным во время вспышки во Вьетнаме в 2004 г (в сотрудничестве с Ьи е1 а1.). В исследование были добавлены еще две группы мышей, которых иммунизировали в/м цельновирионной неадьювантной ИГВ из штамма Лен 17/Н5 двукратно с интервалом в 4 недели, либо ИГВ с добавлением гидроокиси алюминия - двукратно (табл. 11). Через 3 месяца после первичной иммунизации животные во всех вакцинных группах были полностью защищены от летальной инфекции 200 ЛД50 вируса А/Вьетпам/1203/2004(Н5Ш). В контрольной группе наблюдалось развитие тяжелой системной инфекции, сопровождающееся снижением среднего веса до 19%, выделением инфекционного вируса из тканей головного мозга в высоких титрах и 100% гибелью животных на 6-9 день инфекции. В группе ЖГВ снижение среднего веса было незначительным (7%), наблюдалось снижение титра заражающего вируса в легких в 10000 раз по сравнению с контролем, при этом инфекционный вирус не был выделен из головного мозга и верхних дыхательных путей.

Таблица 11

Эффективность против заражения антигенным вариантом вируса А(Н5№1), _выделенным во время вспышки во Вьетнаме в 2004 г._

Препарат Кратность введения Средние титры вируса lg ЭИД^/мл (п=5) Снижение веса (%) Летальность /всего

легкие носовые ходы головной мозг

ЖГВ 1 1,6±),2 <0,8 <0,8 7,3 0/5

ИГВ I 2,8±1,8 1,0±0,4 1,1 ±0,7 11,2 0/5

ИГВ 2 <0,8 <0,8 <0,8 8,0 0/5

ИГВ+адьювант 2 <0,8 <0,8 <0,8 1,8 0/5

Контроль 1 6,1±0,7 4,7±0,9 4,5±0,1 19,4 5/5

Однократное введение ИГВ без адьюванта защищало мышей от летальности, однако заражающий вирус выделялся не только из легких, но также из носовых ходов и головного мозга. Для достижения полной защиты против системного распространения инфекционного вируса и его выделения из ВДП потребовалось две дозы ИГВ.

Таким образом, было показано, что однократная иммунизация ЖГВ из реассортантного штамма Лен 17/Н5 полностью защищала мышей против летальной инфекции высокопатогенными вирусами A(H5N1). При минимальном выделении вируса из легочной ткани зараженных животных, вирус не был выделен из носовых ходов или головного мозга, что коррелировало с наличием вирус-специфических IgA в секретах ВДП. Наблюдаемый защитный эффект реассортантного штамма Лен 17/Н5 в отношении вирусов A(H5N1), принадлежащих к различным антигенным линиям в отсутствие достоверного уровня сероконверсий антигемагглютинирующих антител может объясняться как формированием специфических системных и локальных IgA и IgG, выявленных иммуноферментным методом, так и стимуляцией клеточного компонента иммунного ответа, что подтверждается выраженной индукцией интерферона-у спленоцитами мышей, иммунизированных ЖГВ, в ответ на стимуляцию цельным вирусом А/Гонконг/213/03 или рекомбинантным НА вируса А/Гонконг/156/97(H5Nl).

Перекрестная защита против ВП вируса A(H5N1), выделенного в 2005 г. на территории Российской Федерации. Данный раздел работы был выполнен на базе Вирусологического Центра НИИ микробиологии Мин. обороны РФ (Москва) под руководством д.м.н., проф. P.A. Хамитова и к.б.н. С.А. Мельникова, за что автор выражает им искреннюю благодарность. С целью изучения перекрестно-реактивной защиты, создаваемой ЖГВ из штамма Лен 17/Н5, было проведено заражение иммунизированных мышей вирусом H5N1 А/курица/Курган/2/05, выделенным специалистами Вирусологического центра в сентябре 2005 г. из легкого павшей курицы птицефабрики «Утятская». Культура штамма прошла один пассаж в легких белых мышей массой 14-16 г. В условиях закрытых лабораторий с повышенным уровнем безопасности на белых мышах линии BALB/c была изучена иммуногенность и эффективность ЖГВ из штамма Лен 17/Н5 по сравнению с субъединичной адьювантной ИГВ, приготовленной ФГУП «Микроген» из реассортантного штамма A(H5N1) N1BRG-14, полученного из Национального Института Биологических Исследований, Великобритания (ВОЗ, 2006). Реассортант NIBRG-14 был подготовлен на основе штамма A/PR/8/34 и содержал

модифицированные методами обратной генетики НА и ЫА от вируса А/Вьетнам/1203/2004(Н5Ы 1). В качестве адьюванта использовали иммуномодулятор полиоксидоний (полимер-субъединичная вакцина) или гидроокись алюминия (адсорбированная вакцина). ЖГВ в дозе 10м/0,05 мл вводили интраназально однократно или двукратно с интервалом в 10 дней, ИГВ в дозе 15 мкг НА- парентерально однократно. Для оценки иммунного ответа у вакцинированных животных были взяты сыворотки крови на 21 день после последней иммунизации. Результаты представлены в таблице 12.

Интраназальное введение ЖГВ как двукратное, так и однократное вызывало образование перекрестно-реагирующих антигемагглютинирующих антител в титрах на уровне протективных (1:80 и 1:40 соответственно). Наиболее высокие титры антител к вирусу А(Н5№) были выявлены при помощи ИФА. В случае применения полимер-субъединичной вакцины, содержащей полиоксидоний, по всем трем тестам были получены наиболее низкие показатели.

Таблица 12

Результаты оценки иммуногенных и протективных свойств вакцинных

кандидатов против птичьего гриппа подтипа Н5

Кратность введения Название препарата, доза Средние титры антител после иммунизации Доля выживших животных после инфекции

ИФА РН РТГА заражающая доза (ЛЛо) абс./ ВСЕГО %

1 Полимер-субъединичная вакцина H5NI, 15 мкг <1:40 <1:10 <1:10 25 3/15 20

Субьединичная адсорбированная H5N1, 15 мкг 1:80 1 10 <1:10 25 6/15 40

Интраназальная живая Лен 17/Н5,6,4 lg ЭИД50 1:320 1 14 1:40 27 8/14 57

2 Полимер-субъединичная вакцина H5N1, 15 мкг 1:80 1 20 1:20 25 7/14 50

Субъединичная адсорбированная H5N1, 15 мкг 1:320 1 20 1:10 25 12/15 80

Интраназальная живая Лен 17/Н5,6,4 lg ЭИД50 1:1280 1 40 1:80 27 13/15 87

Контроль Раствор ФСБ <1:40 <1:10 <1:10 27 0/10 0

Реинфекцию высокопатогенным вирусом А(Н5Ш) проводили на 21 день после первичной иммунизации в случае однократной вакцинации или на 21 день после последней иммунизации - в случае двукратного введения вакцины. После введения заражающего вируса в контрольной группе гибель животных наблюдалась, начиная с 6-го дня инфекции, и достигала 100% к 9-му дню. Иммунизация ЖГВ из штамма Лен 17/Н5 оказалась наиболее эффективной: двукратное введение защищало 87% иммунизированных животных против 27 ЛД50 заражающего вируса (р<0,001), а однократная иммунизация ЖГВ была эффективной на 57% (р=0,006). У животных, выживших после введения летальной дозы вируса А(Н5М1), были также собраны сыворотки крови на 21 день после заражения. Показано, что титры антигемагглютинирующих антител после инфекции ВП вирусом подтипа А(Н5М1) были всего в 2 раза выше (1:160), чем после двукратной иммунизации ЖГВ подтипа А(Н5Ы2) (1:80). Таким образом, была продемонстрирована корреляция более высокого уровня создаваемой защиты против ВП вируса А(Н5№) при двукратном применении ЖГВ Лен 17/Н5 с более высоким уровнем сывороточных перекрестно-реагирующих антител.

БЕЗВРЕДНОСТЬ И ИММУНОГЕННОСТЬ ЖГВ «ОРВАКС» ПОДТИПА А(Н5Ю) В ОГРАНИЧЕННОМ КЛИНИЧЕСКОМ ИЗУЧЕНИИ

С целью разработки модели для клинической оценки вакцинных препаратов потенциально пандемического подтипа Н5 ФГУП «Микроген» были подготовлены

экспериментальные серии ЖГВ «Орвакс» из реассортантного штамма Лен 17/Н5. Клинические исследования проводили в сотрудничестве с зам. начальника Вирусологического Центра НИИ микробиологии Мин. обороны РФ к.м.н., ст. науч. сотр. В.И. Марковьм и нач. отдела к.б.н., ст. науч. сотр. С.А. Мельниковым в соответствии с Протоколом исследования № ВГЖ-00/004/2006 «Оценка иммуногенных и протективных свойств вакцины гриппозной аллантоисной интраназальной живой, лиофилизат для приготовления раствора для интраназального введения (Орвакс)», согласованным с директором ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Изучение препарата, проводимое на клинической базе Военного госпиталя № 1137, включало 2 этапа. Первый этап проводился на 20 добровольцах и согласно рекомендации «Комитета по этике при федеральном органе контроля качества лекарственных средств» в исследование не была включена группа плацебо. Во время второго этапа изучения в исследование была включена группа плацебо.

Безвредность. В ходе первого этапа испытаний показана безвредность и ареактогенность ЖГВ из реассортантного штамма Лен 17/Н5 для 20 вакцинируемых. ЖГВ вводили в дозе 6,9 ЭИД50/0,5 мл. Регулярная термометрия в течение 42 суток после вакцинации не выявила повышения температуры тела ни у одного добровольца (табл. 13).

Таблица 13

Клинические реакции у волонтеров, привитых живой гриппозной вакциной _ «Орвакс» после первой и второй вакцинации__

Вакцинация Температурная реакция Интоксикация Катаральные явления в носоглотке

37,0 °С 37,1 - 37,5 "С 37,6- 38,5 "С > 38,6 °С

абс. % абс. % абс. % абс. % абс. % абс. %

Первая(п=20) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 8 40

Вторая (п=20) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Катаральные явления, наблюдаемые только после первичной иммунизации, были очень слабо выражены, возникали на 3-4 день после вакцинации и проходили самопроизвольно к 6-му дню, их развитие не коррелировало с выделением вакцинного вируса из ВДП привитых (г=-0,29, р>0,05) и последующим приростом специфических антител в сыворотке крови добровольца.

Результаты клинического обследования добровольцев врачами-специалистами разного профиля и проведенные лабораторно-инструментальные исследования свидетельствовали об отсутствии отклонений в самочувствии и в результатах анализов после иммунизации вакциной «Орвакс» в сравнении с фоновыми значениями.

Генетическая стабильность. У вакцинированных волонтеров были получены мазки из носа на различные сроки после первичной иммунизации и ревакцинации. Всего было получено 33 реизолята, 16 - от 11 добровольцев после первичной вакцинации, и 17 - от 14 добровольцев после ревакцинации. Все реизоляты были выделены либо после 3-х пассажей в РКЭ, либо после 1-2 пассажей в культуре клеток МЕ)СК в присутствии 2 мкг/мл трипсина ТРСК с последующим пассажем в РКЭ. В отличие от выделения реизолятов реассортантов современных эпидемических вирусов на основе донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(Н2Н2), которые ранее не удавалось получить в сроки более 3 суток после иммунизации ^огоу ег а1., 1993, КПгпоу а а1., 2000), средняя

продолжительность выделения вакцинного вируса Лен I7/H5 после 1-й вакцинации и ревакцинации составила 5,5 суток, что согласуется с ранее полученными данными о замедленной репродукции ХА реассортантов птичьих вирусов в клетках млекопитающих (Suguitan et al., 2006). Ввиду того, что у нескольких волонтеров положительный результат выделения вакцинного вируса был получен несколько раз на разные сроки после прививки, интерес представляло изучение возможных изменений фенотипических и генотипических признаков этих реизолятов. Показано, что реизоляты, полученные от одних и тех же добровольцев на разные сроки после вакцинации, сохранили ts фенотип и все мутации в генах внутренних и неструктурных белков, охарактеризованные для донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(Н2№).

Иммуногенность. РТГА проводили с использованием в качестве антигенов гомологичного вируса Лен 17/Н5 и реассортантного штамма подтипа A(H5N1) А/Индонезия/05/2005 с модифицированным методом обратной генетики НА, полученного на основе штамма A/PR/8/34. После первичной иммунизации выявлено 5,9% 4-х кратных приростов специфических антител (рис.4) к вирусу A(H5N2). Повторная иммунизация с интервалом в 21 день значительно усиливала иммунный ответ, приросты гомологичных антител после ревакцинации были выявлены в 47,1% случаев (р=0,02). Показатели приростов среднегеометрических титров антител (СГТ) возрастали с большей интенсивностью у повторно привитых по сравнению с первично привитыми и составили 1,3-2,8 (р=0,005).

4-х кратные и более поствакцинальные сероконверсии нейтрализующих антител к вирусу A(H5N2) были выявлены у 4-х волонтеров после первой прививки (20%) и у 10 (50%) - после повторной вакцинации (рис. 4).

-•фЛ .

Процент 4-х кратных Кратность при ростов Число лиц с титрами >1:20

сероконверсий

60 ,-3 г-60 -

501-I 4ii

40--И" 19 I 4°-11- =ргг

s II 2t J II »ffj-4f "рн

У^ЙГ Г I I 01 i I i\

1-вакцинация Ревакцинация 1-вакцинация Ревакцинация 1-вакцинация Ревакцинация

Рис. 4. Иммунный ответ на введение вакцины «Орвакс», п=20.

Прирост СГТ нейтрализующих антител после первичной иммунизации составил в среднем 1,9, после ревакцинации этот показатель увеличился до 2,9 (р=0,01). Число лиц с титрами >1:20 антигемагглютинирующих и нейтрализующих антител к гомологичному вирусу A(H5N2) составило после первичной вакцинации 17,7 и 25% соответственно. После ревакцинации эти показатели составили 47,1% и 55% (рис. 4).

У волонтеров было выявлено образование перекрестно-реагирующих антител к реассортантному штамму подтипа A(H5N1), принадлежащему к антигенно и генетически удаленной линии вирусов подтипа Н5.

Число лицститрами

_55

47,1 I

25 17,7

Ott

Поствакцинальные титры антигемагглютинирующих антител >1:20 к вирусу A(H5N1) были выявлены среди 11,8% обследованных после первой прививки и у 29,4% - после ревакцинации (р<0,05), приросты СГТ к вирусу A(H5N1) составили 1,2 после первичной вакцинации и 1,6 - после ревакцинации.

Для непрямого варианта ИФА 96-луночные панели покрывали 0,5 мкг/мл очищенного НА штамма Лен 17/Н5. Применение ИФА позволило выявить в сыворотках крови 4-кратные сероконверсии вирус-специфических IgG у 35% волонтеров после первой прививки и у 55% - после повторной вакцинации. При этом 4-кратные сероконверсии вирус-специфических IgA наблюдались у 45% волонтеров после первой прививки и у 60% - после повторной вакцинации. Средняя кратность приростов IgG составила 1,6 после первой прививки (р=0,03) и 2,5 - после ревакцинации (р<0,001). В отношении сывороточных IgA этот показатель составил соответственно 1,9 (р=0,02) и 3,2 (р=0,002). Необходимо отметить, что специфичность данного метода при оценке иммунного ответа к гриппу у взрослых людей может быть недостаточной, поскольку в этом случае часто наблюдается неспецифическое реагирование, в частности с ревматоидным фактором или аутоантителами (Salonen et al., 1992, Huang et al, 1992). При этом могут выявляться также антитела к антигенным детерминантам внутренних белков вирусов гриппа (в случае, если в качестве антигена используется цельный вирус). Если же в качестве антигена использовать очищенный или рекомбинантный НА, то неспецифическое реагирование может объясняться наличием общих антигенных эпитопов в НА вирусов подтипов HI, Н2 и Н5 (Rowe et al., 1999) или конформационными изменениями в молекуле НА в процессе адсорбции на твердой фазе, делающими консервативные эпитопы более доступными для распознавания. В обоих случаях при исследовании сывороток взрослых людей наблюдается высокий иммунологический фон до прививки. Так, средний уровень сывороточных IgG до прививки в нашем исследовании составил 1:5000. В этом отношении более показательным оказалось изучение сывороточных IgA, средний титр которых до прививки составил 1:100. После вакцинации и ревакцинации эти показатели возросли соответственно до 1:256 и 1:400, при этом наблюдалась корреляция с уровнем локальных IgA в носовых секретах. Показано значительное (р=0,03) увеличение числа 4-х кратных сероконверсий секреторных IgA (SIgA) после ревакцинации (65%) по сравнению с первичной вакцинацией (30%). СГТ секреторных антител после ревакцинации составили 1:16.

Были проанализированы суммарные данные вирусологического подтверждения выделения вакцинного вируса от привитых и развития сероконверсий антител к гомологичному вирусу A(H5N2) по данным различных серологических тестов. Частота 4-х кратных сероконверсий по данным РТГА, РН и ИФА (IgG) не зависела от положительного или отрицательного результата выделения вакцинного вируса из носовых ходов привитых ни после первичной иммунизации, ни после ревакцинации (р>0,05).

Таким образом, результаты 1 фазы клинических испытаний показали, что количество реакций после введения вакцины «Орвакс» не превышало регламентированных норм, установленных Фармакопейной статьей на ЖГВ. Для получения реизолятов вакцинного вируса от привитых потребовалось не менее 2-3 пассажей на чувствительных культурах, что говорит о крайне незначительном

содержании вируса в мазках из полости носа и свидетельствует о безопасности вакцины для окружающих. Показатели иммунного ответа после однократной иммунизации гриппозной вакциной подтипа Н5 были несколько ниже, чем при иммунизации сезонными гриппозными вакцинами, что является вполне закономерным в серонегативной популяции. Двукратная иммунизация значительно усиливала показатели иммуногенности вакцины «Орвакс». Европейским комитетом по контролю медицинских препаратов были установлены следующие критерии иммуногенности вакцинных препаратов на основе как эпидемических, так и потенциально пандемических вирусов гриппа: кратность приростов антител не менее 2,5 для лиц 18-60 лет и развитие достоверных сероконверсий у 40% привитых. Как видно из вышеприведенных данных, вакцина «Орвакс» подтипа A(H5N2) при двукратном введении соответствовала Европейским критериям иммуногенности по числу сероконверсий (47,1%) и по кратности приростов антигемагглютинирующих антител (2,8). В отношении числа лиц с защитным титром антител после прививки, до сих пор остается не выясненным вопрос, какой титр антигемагглютинирующих антител можно считать достаточным для защиты против потенциально пандемических вирусов -1:20 или 1:40.

Тест микронейтрализации, который ранее был рекомендован для изучения антительного ответа в сыворотках лиц, перенесших инфекцию вирусами A(H5N1) (ВОЗ, 2005), оказался достаточно чувствительным и специфичным в выявлении поствакцинальных штаммоспецифических вирус-нейтрализующих антител после иммунизации ЖГВ. Необходимо отметить, что при оптимизации теста микронейтрализации желательно использовать клеточные линии MDCK, поддерживающие оптимальную репродукцию используемого в тесте вируса (Rowe et al., 1999), прошедшие не более 20-25 пассажей до замораживания в жидком азоте.

Изучение поствакцинального секреторного иммунитета показало, что вакцина способна вызывать значительный уровень иммунного ответа вирус-специфическях IgA в ВДП, то есть непосредственно во входных воротах инфекции.

Необходимо отметить, что обычно рекомендуемая инфекционная активность ЖГВ из реассортантных штаммов вирусов гриппа А подтипов A(H1N1) и A(H3N2) составляет не менее 7,5 lg ЭИД50/0,2 мл. Однако, учитывая, что это был первый опыт применения среди людей ЖГВ подтипа Н5, была использована сниженная доза вакцинного вируса (6,9 lg ЭЙД5о/0,5 мл). При этом после двукратной вакцинации с интервалом в 21 день удалось вызвать выраженный иммунный ответ. При проведении 2-го этапа клинических испытаний на 42 добровольцах, дважды получивших вакцину с интервалом в 21 день, доза вакцинного вируса была увеличена до 8,3 lg ЭИД5о/0,5 мл. Данные по безвредности и реактогенности препарата полностью подтвердили ранее полученные показатели: отсутствовали температурные реакции и не было выявлено какого-либо неблагоприятного действия на организм привитых по данным инструментального и лабораторного обследования. По результатам иммуногенности за два года исследования был проведен суммарный анализ поствакцинального иммунного статуса привитых по данным двух серологических

тестов (РТГА и РН) с учетом кратности вакцинации и дозы вакцинного вируса. Было показано, что после первичной иммунизации ЖГВ в дозе 6,9 ^ ЭИД5о/0,5 или 8,3 ЭИД50/0,5 мл общее число 4-х кратных сероконверсий сывороточных антител составило 23-50% соответственно, а после ревакцинации - 71-74% (рис. 5). При этом число сочетанных конверсии у одних и тех же лиц было относительно невысоким: 0-2,4% после первой вакцинации и 14-24% после ревакцинации (г=-0,64-0,12, р>0,05).

□ Только РТГА ШРТГА+РН ■ Только РН

1 вакцинация Ревакцинация 1 вакцинация Ревакцинация 6.91д ЭИД50/0.5 мл (п=20) 8.3 lg ЭИД5010.5 мл (11=425

Рис. 5. Суммарный уровень сероконверсий в сыворотках крови привитых вакциной «Орвакс» по данным РТГА и РН.

Таким образом, по результатам 2-х исследований было установлено, что при оценке ЖГВ подтипа Н5 сочетанное применение тестов РТГА и МН для изучения гуморального иммунного ответа позволяет получить наиболее полную информацию о развитии сероконверсий в ответ на прививку.

РАЗРАБОТКА СТРАТЕГИИ И ТАКТИКИ ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКИ ГРИППА С ПОМОЩЬЮ ЖГВ В ИНТЕРПАНДЕМИЧЕСКИЙ ПЕРИОД И ПРИ ПОДГОТОВКЕ К ОЧЕРЕДНОЙ ПАНДЕМИИ

Вакцинация против гриппа во всем мире в первую очередь рекомендована лицам с высоким риском возникновения осложнений, в том числе пожилым людям старше 60 лет и лицам, страдающим хроническими соматическими заболеваниями, а также тем, кто в наибольшей степени подвержен риску заболевания гриппом и заражения других лиц. Из 3-х пандемий 20-го столетия две (1957 и 1968 гг.) вызвали наибольшую заболеваемость и смертность среди маленьких детей, пожилых и хронически больных людей (Potter, 2001).

Применение ЖГВ в группах высокого риска последствий заболевания гриппом.

В настоящее время доля лиц в возрасте старше трудоспособного в общей численности населения России составляет 20,5% (26,8 млн. человек), а к 2025 г по прогнозам она возрастет до 26,7%. По программе ВОЗ совместно со специалистами из Центра по контролю и предупреждению заболеваний США на базе домов престарелых Санкт-Петербурга и Ленинградской области были разработаны схемы иммунизации лиц преклонного возраста и больных, страдающих хроническими заболеваниями сердечно-сосудистой системы и нарушениями обмена веществ, с использованием ХА реассортантной ЖГВ. Всего

под наблюдением находилось 1177 человек в возрасте от 65 до 90 лет с различными диагнозами и уровнями функциональной активности. Полученные данные клинического и лабораторного обследования престарелых и хронически больных, привитых ЖГВ, показали, что ХА тривакцина не вызывала каких-либо неблагоприятных реакций у этой группы лиц. Наиболее эффективным методом иммунизации в пожилом возрасте признано сочетанное введение ЖГВ+ИГВ с последующей ревакцинацией ЖГВ. Изучение особенностей поствакцинального ответа на введение ЖГВ у лиц пожилого возраста показало, что в этой возрастной группе живой антиген не уступает инактивированному в стимуляции циркулирующих сывороточных антител. У пожилых людей ЖГВ стимулировала образование секреторных IgA в титрах не ниже, чем у лиц молодого возраста, при этом их концентрация в секретах ВДП не снижалась на протяжении 3-х месяцев. В соавторстве с А.Н. Найхиным и др. (2002) было изучено влияние возрастных изменений на функцию клеточного иммунного ответа при иммунизации гриппозными вакцинами. Показано, что ЖГВ активно индуцировала продукцию Thl-маркерных цитокинов (ИЛ-2 и ИФН-у) лимфоцитами периферической крови, стимулированными in vitro вирусом A(H1N1), как у молодых людей, так и у пожилых, тогда как ИГВ - только у молодых. Результаты продукции Thl-маркерных цитокинов хорошо согласуются с данными об индукции клеточного иммунного ответа в ответ на введение ЖГВ. Пролиферативная активность лейкоцитов у пожилых оказались в 2 выше после введения ЖГВ по сравнению с ИГВ, при введении которой увеличение этого показателя составило не более 1,3.

Оценка эффективности вакцинации против гриппа в домах престарелых показала, что в эпидемический по гриппу период среди лиц, привитых ЖГВ, имело место снижение заболеваемости в 1,6-2,0 раза по сравнению с непривитыми.

Таким образом, было показано, что иммунизация ЖГВ лиц пожилого возраста является не только безвредной, но и имеет преимущество в отношении стимуляции локального и клеточного компонентов иммунного ответа. По данным проведенных исследований были разработаны методические рекомендации «Вакцинопрофилактика гриппа с помощью живой гриппозной вакцины среди лиц пожилого возраста».

Применение тривалентной ЖГВ, включающей реассортантные вакцинные штаммы на основе донора аттенуации A/JIenunzpad/134/l 7/5 7(H2N2), среди детей дошкольного возраста. По данным ВОЗ, начиная с 1997 г. 50% всех заболевших гриппом A(H5N1) составили лица до 18 лет, а 90% - лица до 37 лет (ВОЗ, 2007). По прогнозам ВОЗ, в случае возникновения пандемии, вызванной вирусами A(H5N1), наибольшему риску заболевания могут подвергнуться дети, подростки и люди молодого возраста. Дети дошкольного и школьного возраста являются основными распространителями гриппозной инфекции в обществе. В то же время имеются данные о том, что при массовой вакцинации детей резко снижается заболеваемость невакцинированных лиц более старшего возраста (Monto et al., 1999).

Для вакцинации детей в детских садах Ленинградской области применялась коммерческая тривалентная ЖГВ для взрослых, включающая реассортантные штаммы, подготовленные в отделе вирусологии НИИЭМ РАМН на основе

штаммов, рекомендованных ВОЗ на 1999-2001 эпидемические сезоны: А/17/Пекин/95/25 (Н11Ч1), А/17/Новая Каледония/99/50 (НШ1), А/17/Сидней/97/76 (НЗШ) и В/60/Петербург/95/20. Данный раздел работы был выполнен в рамках совместной с ГИСК им. Л.А. Тарасевича «Программы исследований по оценке безвредности и иммуногенности живой гриппозной вакцины для детей в возрасте 3-6 лет как единого препарата для взрослых и детей». Исследования проводили в сотрудничестве с руководителем клиники НИИ гриппа РАМН проф., д.м.н. В.П. Дриневским и руководителем лаборатории испытаний новых средств защиты против вирусных инфекций д.м.н. М.К. Ерофеевой.

В течение 2-х эпидемических сезонов было обследовано и привито 369 детей. По суммарным данным 2-х лет исследования показано, что ЖГВ, включающая реассортантные вакцинные штаммы на основе донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (Н2№), была ареактогенной при применении у детей 3-6 лет. ЖГВ не оказывала какого-либо побочного влияния на организм детей по данным частоты соматической и аллергологической патологии в течение 6 месяцев после прививки. Во время прививочного сезона 1999-2000 г. титры антигемагглютинирующих антител к вирусам гриппа А >1:40 после вакцинации наблюдались у 45-53% вакцинированных (к вирусу В - у 30 %), кратность приростов СГТ антител к вирусам гриппа А и В у привитых детей составила 3,23,6. Анализ не выявил статистически значимых различий между количественными параметрами иммунного ответа в группах привитых однократно и двукратно.

В 2000 г. в состав вакцины был включен штамм А(НШ1) новой антигенной разновидности - А/17/Новая Каледония/99/50. Перед началом вакцинации подавляющее большинство детей (98%) были серонегативными к этому штамму. Сероконверсии сывороточных антител к вирусу А(НШ1) наблюдались в 26,4% случаев, при этом 4-х кратные приросты секреторных 1§А к этому антигену наблюдались у 44% обследованных. Таким образом, даже при условии, что подавляющее большинство детей перед прививкой были серонегативными, при однократном применении взрослого варианта ЖГВ удалось стимулировать выраженный иммунный ответ. По данным 2-х эпидемических сезонов вакцинация привела к значительному снижению заболеваемости ОРЗ и гриппом в период эпидемического подъема среди привитых, коэффициент эффективности вакцинации ЖГВ в отношении гриппа и ОРЗ составил 64 %.

На основании полученных результатов тривалентная ЖГВ для взрослых, включающая реассортантные штаммы современных эпидемических вирусов на основе доноров аттенуации А/Ленинград/134/17/57(Н2Ш) и В/СССР/60/69, рекомендована для применения среди детей от 3-х лет и взрослых без ограничения возраста, в связи с чем внесены изменения в фармакопейную статью на ЖГВ ФСП 42-0504-4097-04.

Изучение на экспериментальной модели оптимальной схемы иммунизации реассортантным штаммом подтипа Н5. В случае формирования пандемического штамма одним из важнейших условий эффективности вакцины нового подтипа будет являться разработка стратегии и тактики ее применения как во время пандемического подъема, так и после него, в период стабилизации эпидемиологической ситуации, а именно: кратность применения, целесообразность включения в состав существующей поливалентной вакцины и

возможности сочетания с другими профилактическими средствами. В связи с этим необходимо проводить исследования в направлении изучения взаимодействия вакцинных штаммов подтипа Н5 с реассортантными штаммами современных эпидемических вирусов, а также оценки иммуногенности и эффективности при различных схемах введения, включающих в себя комбинированное введение с ИГВ. На экспериментальной модели были изучены прививочные свойства вакцинного штамма Лен 17/Н5 при введении в составе поливалентной вакцины. Для оценки на мышах линии СВА инфекционной активности и иммуногенности реассортантного штамма Лен 17/Н5 при смешанном введении с реассортантами современных эпидемических вирусов было проведено интраназальное заражение ХА реассортантными штаммами Лен 17/Н5, A/17/Новая Каледония/99/145(НШ1), A/17/Bhckohchh/05/84(H3N2) и В/60/Малайзия/04/898 раздельно и в сочетании при заражающей дозе 6 lg ЭИД50 каждого вируса. Репродуктивную активность в легких определяли на 3-й сутки после инфекции по результатам титрования суспензии органов в РКЭ. Сыворотки крови для оценки иммуногенности были собраны через 28 дней после иммунизации. Результаты представлены в таблице 14.

Таблица 14

Прививочные свойства реассортантного штамма Лен 17/Н5 при введении

мышам раздельно и в составе дивалентной или поливалентной ЖГВ

Вакцинный препарат Максимальное снижение веса (%) на 5-е сутки п.и. Средние титры по данным титрования суспензии органов на 3-й сутки п.и. ЭИДо/мл) п=3 Нейтрализующие антитела к вирусу H5N2 (СГТ) п=5 Вирус-специфические IgG к НА Н5 (login) п=5

легкие носовые ходы

A(H1N1) 3 3,8±1,6 1,3±0,5 14,1 2,8±0,5

А(НЗТС2) 0 <1,5 1,0±0,3 5,0 2,1 ±0,2

В 0 3,9±1,8 2,4±1,0 5,0 <2,0

H5N2 0 1,6±0,2 1,9±1,5 30,3 3,4±0,3

A(H1NI)+A(H5N2) 1 1,8±0,6 3,4±0,5 31,8 3,2±0,2

A(H1N1)+A(H3N2)+B 5 3,б±0,7 4,1±0,6 20,0 2,2±0,3

A(H1N1)+A(H3N2)+B+A(H5N2) 3,5 3,8±2,0 4,7±1,0 14,1 2,3±0,2

Контроль (раствор ФСБ) 0 <1,5 <0,8 5,0 <1,0

Было показано, что введение каждого из реассортантных вирусов, а также их сочетания - A(H1N1)+A(H5N2), A(H1N1)+A(H3N2)+B,

A(H1N1)+A(H3N2)+B+A(H5N2) - не приводило к снижению массы тела животных более чем на 5%. При раздельном введении наибольший уровень репродуктивной активности в легких мышей наблюдался для реассортантов A(H1N1) и В (4,6 и 3,9 lg ЭИД50/МЛ соответственно). Использование штамма Лен 17/Н5 как в виде дивакцины в сочетании с реассортантом A(H1N1), так и в составе тетравакцины, не приводило к дополнительному снижению массы тела животных по сравнению с раздельным заражением.

При смешанном заражении реассортантами A(H1N1)+A(H5N2) наблюдалось значительное снижение выделения смеси вирусов из легких по сравнению с показателями репродукции обоих штаммов, введенных по отдельности. При одновременном введении трех реассортантных вирусов A(H1N1)+A(H3N2)+B уровень репродукции в легких не превышал таковых для отдельно взятых

реассортантов A(H1N1) или В. Добавление к трем реассортантам эпидемических вирусов штамма Лен 17/Н5 приводило к снижению тигров выделения вирусной смеси из легких, хотя различия не были статистически значимыми.

Через 28 дней после иммунизации штаммом Лен 17/Н5 отдельно или в сочетании с реассортантом подтипа A(H1N1) в сыворотках крови определялись сходные по значению титры нейтрализующих антител к вирусу A(H5N2), в то время как при введении в составе тетравакцины наблюдалось достоверное снижение титров нейтрализующих антител (р=0,03). Результаты ИФА с использованием в качестве подложки очищенного НА гомологичного вируса Лен 17/Н5 подтвердили это наблюдение. После иммунизации моновакциной Лен 17/Н5 или дивакциной A(H5N2)+A(H1N1) средние титры специфических IgG к вирусу Н5 составили 3,4 и 3,2 lg соответственно. При введении реассортантного штамма Лен 17/Н5 в составе тетравакцины уровень вирус-специфических IgG не превышал 2,5 lg, то есть был значительно ниже (р<0,001). Таким образом, было показано, что сочетанное введение реассортантов A(H5N2) и A(H1N1) не приводило к снижению иммуногенности в отношении компонента Н5, в то время как в составе тетравакцины реассортант Лен 17/Н5 оказался менее иммуногенным, чем при отдельном введении. Это явление согласуется с ранее полученными Т.В. Амвросьевой и соавт. (1983) данными , когда в опытах in vitro было показано, что при равных заражающих дозах штаммы вируса гриппа В в гетерогенных смесях оказывались более сильными конкурентами по сравнению со штаммами типа А.

Ранее в клинических испытаниях сезонных гриппозных вакцин было показано, что иммунизация моновалентной или дивалентной ЖГВ в сочетании с ИГВ приводит к появлению хорошо выраженного добавочного эффекта в отношении сероконверсий как сывороточных, так и секреторных антител (Powers et al., 1989). Сочетанное применение ИГВ и ЖГВ может позволить прийти к компромиссу по затрате материальных и временных ресурсов при применении пандемической вакцины. В связи с этим в эксперименте было проведено изучение иммуногенности при различных схемах последовательного введения ЖГВ и ИГВ из штамма Лен17/Н5. В качестве положительного контроля использовали сыворотки мышей, иммунизированных в/м субъединичной инактивированной вакциной из вируса A(H5N2) с гидроокисью алюминия производства ФГУП «Микроген». Результаты представлены в таблице 15.

Таблица 15

Иммуногенность ЖГВ и ИГВ подтипа A(H5N2) при введении мышам

раздельно и в сочетании

Вакцинная группа РТГА РН ИФА (lg)

(СГТ), (СГТ), сыворотки (11=5) носовые смывы (п=5)

п=5 п=5 IgG IgA IgG IgA

ЖГВ 8,4 20,0 3,4±0,5 2,9±0,3 1,9±0,4 1,8±0,4

ИГВ 26,4 16,8 3,2±0,5 2,4±0,3 1,9±0,4 <1,5

игв+жгв 253,9 80,0 4,5±0,3 3,4±0,4 2,3±0,7 2,0±0,5

жгв+игв 320 40 4,4±0,4 3,1±0,3 1,7±0,3 1,6±0,2

ИГВ+А1 67,3 31,8 3,8±0,2 2,6±0,2 <1,5 <1,5

Контроль <10 <10 <2,0 <2,0 <1,5 <1,5

Наиболее высокий уровень СГТ антигемагглютинирующих антител к вирусу А(Н5Ы2) наблюдался после сочетанной иммунизации ЖГВ с ревакцинацией ИГВ. СГТ нейтрализующих антител, напротив, были наиболее выраженными (1:80) при

вакцинации по сочетанной схеме ИГВ с последующей ревакцинацией ЖГВ. В этом случае также наблюдались существенные приросты локальных IgG (р=0,03) и IgA(p=0,05).

Таким образом, в эксперименте было показано, что двукратная сочетанная иммунизация с использованием ЖГВ и ИГВ позволила повысить СГТ антигемагглютинирующих антител в 10 раз, в то время как применение ИГВ с адьювантом - в 2,5 раза. Использование ИГВ для первичной вакцинации и ЖГВ для ревакцинации позволило добиться не только повышения интенсивности гуморального иммунного ответа, но и сочетанности продукции секреторных IgA и антител в сыворотке крови.

ВЫВОДЫ

1. Сравнительный анализ нуклеотидных замещений в генах холодоадаптированного штамма А/Москва/21/17/65(H2N2) и его предшественника - варианта A/MocKBa/21/65(H2N2) показал, что основные изменения, ответственные за проявления холодовой адаптации, локализуются в гене РВ2. Свойства холодовой адаптации и аттенуации, наследуемые реассортантами на основе штамма А/Москва/21/17/65(Н2Ы2), позволяют обосновать его использование не только в качестве холодоадаптированного вакцинного штамма в случае пандемии, вызванной вирусом гриппа подтипа A(H2N2), но и как потенциальный новый донор аттенуации для получения реассортантных вакцинных штаммов.

2. Результаты секвенирования донора аттенуации В/СССР/60/69 для сезонной тривалентной ЖГВ подтвердили полученные ранее данные об аттенуации этого донорского штамма и дали возможность модифицировать ОТ-ПЦР рестрикционный метод применительно к генам внутренних и неструктурных белков реассортантных вакцинных штаммов вирусов гриппа В.

3. Впервые получена уникальная коллекция высокорепродуктивных реассортантов вирусов гриппа A(H5N2), A(H7N3) и A(H9N2), устойчиво проявляющих ts-, са- и att- фенотип, с использованием стандартного метода генетической реассортации на основе холодоадаптированного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(H2N2).

4. Экспериментально установлено, что ЖГВ подтипа A(H5N2) из реассортантного штамма А/17/утка/Потсдам/86/92 защищает мышей против реинфекции высокопатогенными вирусами A(H5N1), значительно различающимися как антигенно, так и генетически. Защита от летальности и системного распространения инфекции коррелирует с образованием перекрестно-реагирующих сывороточных и секреторных антител.

5. В доклинических испытаниях на курах установлена неспособность к репродукции в организме птиц холодоадаптированных вакцинных штаммов A(H5N2) и A(H7N3), что подтверждает безопасность их производства и применения в районах с высокоразвитым сельским хозяйством.

6. В клиническом изучении показана безвредность и ареактогенность прототипа ЖГВ из реассортантного штамма А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5№) для волонтеров. Генетическая стабильность реизолятов вакцинного вируса подтипа является дополнительной гарантией безвредности применения подобных штаммов на людях. Вакцина вызывает образование системных и секреторных антител. Для

достижения наибольшего уровня иммунологической эффективности требуется двукратное введение вакцины с интервалом в 21 день.

7. В клинических испытаниях обосновано применение тривалентной ЖГВ, включающей реассортантные вакцинные штаммы на основе доноров аттенуации А/Ленинград/134/17/5 7(I12N2) и В/СССР/60/69, в качестве единого препарата для всех групп населения, включая детей от трех лет, взрослое население и лиц пожилого возраста, на основании чего внесены изменения в Фармакопейную Статью на «Вакцину гриппозную аллантоисную интраназальную живую сухую» ФСП 42-0504-4097-04.

8. Предложена тактика применения ЖГВ в случае пандемии, которая заключается в подготовке и апробации вакцинных кандидатов всех потенциально пандемических подтипов вирусов гриппа. В случае формирования нового пандемического штамма наиболее целесообразной является двукратная иммунизация соответствующей моновалентной ЖГВ, начиная с 1-й волны пандемии с охватом всех возрастных групп населения.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Авторские свидетельства.

1. Дешева Ю.А., Ларионова Н.В. Александрова Г.И., Руденко Л.Г., Климов А.И. Штамм вируса гриппа В/60/Иоханнесбург/99/50 для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей // Патент № 2215786.-Б.И.-№ 31, 10.11.2003.

2. Дешева Ю.А., Руденко Л.Г., Александрова Г.И. Штамм вируса гриппа А/17/Калифорния/04/71 (H3N2) для производства живой гриппозной вакцины для взрослых и детей // Патент № 2307162.-Б.И. № 27, 27.09.2007.

3. Rudenko L.G., Desheva J.A., Alexandrova G.I. Influenza virus vaccine // WO 2007/118284 Al, 25.10.2007.

4. Дешева Ю.А., Руденко Л.Г., Александрова Г.И. Штамм вируса гриппа А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5№) для производства живой и инактивированной гриппозной вакцины // Патент № 2318871,- Б.И. №7, 10.03.2008.

5. Дешева Ю.А., Руденко Л.Г., Александрова Г.И. Штамм вируса гриппа A/17/Bhckohchh/05/84(H3N2) для производства живой гриппозной вакцины для взрослых и детей // Патент № 2340671.- Б.И. № 34; 10.12.2008.

Научные обзоры.

1. Дешева Ю.А., Руденко Л.Г. Состояние и перспективы разработки вакцин против пандемически опасных вирусов гриппа птиц // Медицинский академический журнал, 2005.-Т.4.-№ 4.-С.26-35. Статьи в реферируемых журналах и сборниках научных статей.

1. Найхин А.Н., Руденко Л.Г., Арден Н., Кац Д., Григорьева Е.П., Дешева Ю.А., Донина С.А., Рекстин А.Р., Кокс Н. Формирование гуморального и секреторного иммунитета у лиц пожилого возраста при различных схемах иммунизации гриппозными вакцинами // Вопросы вирусологии,- 1998.- №1.- Т. -43.-С. 20-24.

2. Найхин А.Н., Руденко Л.Г., Арден Н., Кац Д., Григорьева Е.П., Дешева Ю.А., Донина С.А., Рекстин А.Р., Кокс Н. Иммунный ответ лиц пожилого возраста в

зависимости от числа ежегодных сезонных иммунизаций живой и инактивированной гриппозными вакцинами // Вопросы вирусологии.- 1998,- Т. 43.-№3. С.130-134.

3. Найхин А.Н., Рекстин А.Р., Кац Д., Донина С.А., Дешева Ю.А., Арден Н., Руденко Л.Г., Кокс Н. Продукция интерлейкина-2 in vitro и in vivo у пожилых людей, привитых раздельно и сочетанно живой и инактивированной гриппозными вакцинами // Вопросы вирусологии.- 2000.-Т. 45.- №1.- С. 25-29.

4. Найхин А.Н., Рекстин А.Р., Кац Д., Донина С.А., Григорьева Е.П., Дешева Ю.А., Арден Н., Руденко Л.Г., Кокс Н. Пролиферативная активность лимфоцитов пожилых людей in vitro при раздельной и сочетанной иммунизации живой и инактивированной гриппозными вакцинами // Вопросы вирусологии.-2000.-Т.45- №2.-С.41-45.

5. Klimov A.I., Kiseleva I.V., Desheva J.A., Alexandrova G.I., Cox N., Rudenko L.G. Live attenuated reassortant influenza vaccine prepared using A/Leningrad/134/17/57(H2N2) donor strain is genetically stable after replication in children 3-6 years of age // Options for the Control of Influenza IV.-A. Osterhaus et al. eds., Exerpta Medica.- 2001.-p. 951-954.

6. Rudenko L.G., Arden N.H., Grigorieva E., Naychin A., Rekstin A., Klimov A.I., Donina S., Desheva J., Holman R.C., DeGuzmzn A., Cox N., Katz J.M. Immunogenicity and efficacy of Russian live attenuated and US inactivated influenza vaccines used alone and in combination in nursing home residents // Vaccine.-2001.-Vol. 19.-P. 308-318.

7. Григорьева Е.П., Дешева Ю.А., Донина C.A., Найхин А.Н., Рекстин А.Р., Баранцева И.Б. Завиткова Е.А., Москвичева Т.М., Жаворонков В.Г., Руденко Л.Г. Сравнительная оценка безвредности, иммуногенной активности и профилактической эффективности взрослого и детского вариантов живой гриппозной вакцины у школьников 7-14 лет // Вопросы вирусологии.-2002.-№ 4.-С.24-27.

8. Дешева Ю.А., Данини Г.В., Григорьева Е.П., Донина С.А., Киселева И.В., Рекстин А.Р., Ермакова Л.А., Нацина В.К., Николаева В.М. Лонская Н.И., Епипшна Г.А., Жаворонков В.Г, Дриневский В.П., Ерофеева М.К., Найхин А. Н., Руденко Л.Г. Изучение безвредности, генетической стабильности и иммуногенности живой гриппозной вакцины для взрослых при вакцинации детей до Зх лет // Вопросы вирусологии,- 2002.-№4.-С.21-24

9. Найхин А.Н., Рекстин А.Р., Баранцева И.Б., Донина С.А., Дешева Ю.А., Григорьева Е.П., Киселева И.В., Руденко Л.Г. Иммунный ответ на живую гриппозную вакцину // Вестник РАМН,- 2002,- № 12,- С. 24-28.

10. Найхин А.Н., Рекстин А.Р., Донина С.А., Дешева Ю.А., Григорьева Е.П., Борланд Р., Руденко Л.Г. Иммуномодулирующий эффект липринола у людей, вакцинированных живой гриппозной вакциной // Медицинский Академический журнал,-2003,-Т.З.-№ 4,-С. 60-65.

11. Баранцева И.Б., Найхин А.Н., Донина С.А., Степанова Л.А., Рекстин А.Р., Григорьева Е.П., Дешева Ю.А., Руденко Л.Г. Гуморальный и местный иммунный ответ на гриппозные вакцины у лиц пожилого и молодого вазраста // Вопросы вирусологии.- 2003 .-№2 .-С .32-36.

12. Донина С.А., Найхин А.Н., Григорьева Е.П., Дешева Ю.А., Баранцева И.Б., Рекстин А.Р., Руденко Л.Г. Локальный иммунный ответ на живую холодоадаптированную реассортантную гриппозную вакцину у детей, взрослых и престарелых лиц // Вопросы вирусологии.- 2003.-№ 2.-С. 29-31.

13. Desheva J., Rudenko L., Alexandrova G., Cox N., Klimov A. Reassortment between avian apathogenic and human attenuated cold-adapted viruses as an approach for preparing influenza pandemic vaccines. Options for the control of Influenza V - Ed. Y. Kawaoka, Elsevier.- 2004,- P. 724-727.

14. Дриневский В.П., Дорошенко E.M., Гаврилов A.A., Данини Г.В., Григорьева Е.П., Дешева Ю.А. Профилактика гриппа живой гриппозной вакциной у детей // Эпидемиология и вакцинопрофилактика.-2005.-№5 (24).-С.35-37.

15. Дешева Ю.А., Рекстин А.Р., Лу X., Кац Д., Климов А.И., Руденко Л.Г. Системный и местный ответ на введение мьпнам живого холодоадаптированного (ХА) или инактивированного реассортантного штамма подтипа Н5 // Медицинская иммунология. -2005.-Т. 7.-№ 2-3 .-С.258-259.

16. Рекстин А.Р., Дешева Ю.А., Лу X., Александрова Г.И., Климов А.И., Катц Дж., Руденко Л.Г. Гетеросубтипический иммунный ответ и защита от высокопатогенныого вируса гриппа A(H5N1) у мышей, иммунизированных холодоадаптированным вирусом гриппа А/Ленинград/134/17/57(H2N2) // Медицинская иммунология,- 2005.- № 5-6.- С. 506-510.

17. Чиркова Т.В., Найхин А.Н., Донина С.А., Григорьева Е.П., Петухова Г.Д., Рекстин А.Р., Дешева Ю.А., Руденко Л.Г. Продукция общих и вирус-специфических IgE у детей и пожилых людей, иммунизированных живой гриппозной вакциной // Аллергология.-2006.-№3.-С. 17-21.

18. Lu X., Edwards L.E., Desheva J.A., Nguen D., Rekstin A, Stephenson J., Szretter K., Cox N., Rudenko L.G., Klimov A., Katz J. Cross-protective immunity in mice induced by live-attenuated or inactivated vaccines against highly pathogenic influenza A (H5N1) viruses // Vaccine.- 2006.- Vol. 24,- № 44-46.-P.6588-6593.

19. Desheva J. A., Lu X. H., Rekstin A.R., Rudenko L.G., Swayne D.E., Cox N.J., Katz J.M., Klimov A.I. Characterization of an influenza A H5N2 reassortant as a candidate for live-attenuated and inactivated vaccines against highly pathogenic H5N1 viruses with pandemic potential // Vaccine.- 2006,-Vol. 24.-№ 47-48.-P. 6859-6866.

20. Рекстин A.P., Киселева И.В., Дешева Ю.А., Кац Д., Александрова Г.И., Климов А.И., Руденко Л.Г. Анализ ростовых характеристик одногенных реассортантов эпидемического вируса А/Ленинград/134/57(H2N2) и его холодоадаптированного мутанта А/Ленинград/134/17/57(H2N2) // Вопросы вирусологии.-2007.-Т.52.-№ 2.-С. 13-15.

21. Дешева Ю.А., Руденко Л.Г., Климов А.И. Определение состава генома реассортантных холодоадаптированных штаммов вируса гриппа В методом рестриктазного анализа // Вопросы вирусологии.-2007.-Т.52.-№3.-с.16-19.

22. Дешева Ю.А., Лу X., Рекстин А.Р., Кац Д.М., Руденко Л.Г., Климов А.И. Прививочные свойства реассортантного холодоадаптированного штамма вируса гриппа A(H5N2) при интраназальном введении мышам // Вопросы вирусологии.-2007,- Т.52.-№4.-с.27-30.

23. Gambaryan A.S., Tuzikov А.В., Pazynina G.V., Desheva J.A., Bovin N.V., Matrosovich M.N., Klimov A.I. 6-sulfo sialyl Lewis X is the common receptor

determinant recognized by H5, H6, H7 and H9 influenza viruses of terrestrial poultry // Virol. J.- 2008.- 5:85.-10 p. (http://www.virologyj.eom/content/5/l/85).

24. Desheva J.A., Rudenko L.G., Rekstin A.R., Swayne D.E., Cox N.J., Klimov A.I. Development of candidate H7N3 live attenuated influenza vaccine // Options for the control of influenza VI.- Ed. J.M. Katz., Int. Med. Press.-London, Atlanta.-2008.-P. 591-592.

25. Rekstin A.R., Desheva J.A., Rudenko L.G. Interference-dominance properties of cold-adaped influenza viruses // Ibid.- P. 522-524.

26. Rudenko L. Desheva J., Korovkin S., Mironov A.,Rekstin A.R., Grigorieva E., Donina S., Gambaryan A., Katlinsky A. Safety and immunogenicity of live attenuated influenza reassortant vaccine (phase I-II clinical trials) // Influenza and other respiratory viruses.-2008.-№2.-P. 193-199.

в/в - внутривенно

в/м - внутримышечно

ВДП - верхние дыхательные пути

ВОЗ - всемирная организация здравоохранения

ВП - высокопатогенные (вирусы)

ЖГВ - живая гриппозная вакцина

и/н - интраназально

ИГВ - инактивированная гриппозная вакцина

ИЛ - интерлейкин

ИФА - иммуноферментный анализ

ИФН - интерферон

ЛД50 - 50% летальная доза

МИД50 - 50% мышиная инфекционная доза

ОТ-ПЦР - обратно-транскриптазная полимеразно-цепная реакция

п.и. - после инфекции

РТГА - реакция торможения гемагглютинации

РН - реакция микронейтрализации

РКЭ - развивающиеся куриные эмбрионы

СГТ - среднегеометрический титр

ТИД50 - 50% тканевая инфекционная доза

ФСБ - раствор фосфатно-солевого буфера

ХА (са) - холодоадаптированный

ЭИД50 - 50% эмбриональная инфекционная доза

НА - гемагглютинин

аП - аттенуированный

IgA, ^О - иммуноглобулины класса А, в

М01 - множественность заражения

^ - нейраминидаза

КСТ25Я1СТ40 - разница в репродуктивной активности при оптимальной и пониженной до 25°С/повышенной до 40°С температурах. ТЬ - Т-хелперы

ТРСК - Ь-1-тосиламид-2-фенилэтилхлорометилкетон - температурочувствительный

Содержание диссертации, доктора медицинских наук, Дешева, Юлия Андреевна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. ЖИВАЯ ГРИППОЗНАЯ ВАКЦИНА (ЖГВ).

1.1. Основные этапы разработки живой аттенуированной вакцины против гриппа.

1.2. Реассортантные ЖГВ и доноры аттенуации для их подготовки.

1.3. Изучение молекулярных основ аттенуации вирусов гриппа.

1.4. Вакцинопрофилактика гриппа с помощью реассортантной ЖГВ на основе холодоадаптированных донорских штаммов.

ГЛАВА 2. ХАРАКТЕРИСТИКА ПРЕДПАНДЕМИЧЕСКОЙ СИТУАЦИИ.

2.1. Кандидаты в пандемические штаммы.

2.2. Особенности клинической картины при заражении людей высокопатогенными вирусами гриппа.

2.3. Антигенная изменчивость вирусов А(Н5№) и способность к трансмиссии от человека к человеку.

2.4. Роль отдельных генов в проявлении патогенности и расширении круга чувствительных хозяев вирусов гриппа А.

2.5. Маркеры высокой патогенности вирусов птичьего гриппа на различных животных моделях.

2.6. Оценка развития современной предпандемической ситуации и возможные меры и средства профилактики.

ГЛАВА 3. РАЗРАБОТКА ВАКЦИН ПРОТИВ ПАНДЕМИЧЕСКИ ОПАСНЫХ ВИРУСОВ ГРИППА.

3.1. Разработка инактивированных вакцин против вирусов гриппа, обладающих пандемическим потенциалом.

3.2. Разработка ЖГВ при подготовке к пандемии.

3.3. Основные требования, предъявляемые к гриппозным вакцинам при подготовке к пандемии и пути усовершенствования вакцинных препаратов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Пути усовершенствования живой гриппозной вакцины и тактики ее применения при подготовке к пандемии"

Актуальность проблемы. Грипп является глобальной инфекцией, которая в период сезонных эпидемий поражает от 10 до 20% населения планеты, а также единственной, способной вызвать в современном мире пандемии. До настоящего времени было известно 3 подтипа вируса гриппа, вызвавшие пандемии: A(H1N1) - в 1918 г., A(H2N2) - в 1957 г., A(H3N2) - в 1968 г. Начиная с 1997 г. высокопатогенные (ВП) вирусы гриппа подтипа A(H5N1), циркулирующие среди дикой и домашней птицы в Юго-восточной Азии и других регионах мира, вызвали заболевание более 380 человек с более, чем 60% смертностью. Анализ вирусов гриппа A(H5N1), выделенных как от людей, так и от птиц показал, что за последние 7-8 лет вирусы данного подтипа разделились на несколько линий, существенно отличающихся между собой как антигенно, так и генетически [140, 208, 209, 459]. Клиническая картина при инфекции людей вирусами A(H5N1) характеризуется тяжестью клинических симптомов, связанных с проявлениями острой дыхательной и сердечнососудистой недостаточности, признаками гепатита и тяжелой лимфопении [449]. Дикие перелетные, особенно водоплавающие птицы являются одновременно природным резервуаром и переносчиком инфекции из стран Юго-восточной Азии в другие регионы [303, 458]. Начиная с 2006 г., помимо Азии возбудитель распространился на территорию Европы, Северной и Центральной частей Африки. Не осталась незатронутой и территория России [13, 53, 54, 64]. Несмотря на то, что до сих пор не было получено убедительных данных об устойчивой передаче вируса A(H5N1) от человека к человеку [130, 247, 448], что ознаменовало бы начало новой пандемии, продолжающееся заражение людей создает угрозу возникновения пандемической ситуации [209, 459, 468]. В настоящее время ситуация по гриппу в мире оценивается Всемирной Организацией Здравоохранения (ВОЗ) как «Период угрозы пандемии, фаза 3» [468], для которого характерно выявление случаев заражения людей новыми подтипами вируса, но при этом отсутствует устойчивая трансмиссия вируса от человека к человеку.

В качестве потенциального источника нового пандемического штамма рассматриваются также вирусы птичьего гриппа других подтипов, способные передаваться людям: А(Н9Ы2), А(Н7Н7). Опыт появления пандемий не исключает также возврата в циркуляцию вирусов человека А(Н2Ы2), который вызвал пандемию в 1957 году. В практике уже имеется пример возвращения ранее циркулирующих штаммов, как это было в 1977 г. с вирусом гриппа А(НШ1) [277]. Значительная часть населения нашей страны не встречалась с вирусом А(Н2№) и не имеет иммунитета к нему, однако вирусы этого подтипа продолжают циркулировать в популяциях животных (птиц, свиней), что увеличивает риск заболевания людей. В США в 2006 году от свиней с бронхопневмонией были выделены вирусы А(Н2ЫЗ) [296]. Молекулярный анализ гемагглютинина и нейраминидазы вирусов А(Н2ЫЗ) показал, что они имеют птичье происхождение, но оба вируса уже приобрели признаки, характерные для вирусов млекопитающих.

В настоящий момент неизвестно, какой подтип вируса гриппа может вызвать следующую пандемию, но необходимость срочной разработки эффективных мер и средств защиты человека от пандемии признается специалистами всего мира. Активная иммунизация общепризнанно считается наиболее эффективным медицинским средством профилактики вирусных инфекций. Опыт ликвидации наиболее опасных вирусных инфекций позволяет заключить, что только использование живых вакцин обеспечивает необходимую эпидемическую эффективность и результативность противоэпидемических мероприятий. На заседаниях ВОЗ 04.11.05 и 2.055.05.2006, посвященных разработке плана активных действий на пандемический период, живая гриппозная вакцина включена в план предпандемической подготовки наряду с инактивированными вакцинами как средство профилактики пандемического гриппа [471].

Современные живые гриппозные вакцины (ЖГВ) включают аттенуированные реассортантные штаммы вирусов гриппа, имеющие смешанный геном: гены, кодирующие гемагглютинин (НА) и нейраминидазу

ТчГА), наследуются от антигенно актуального штамма, а шесть генов, кодирующих негликозилированные белки - от холодоадаптированного (ХА) «донора аттенуации». В России в течение многих лет вакцинные штаммы вируса гриппа А, включаемые в состав ЖГВ для взрослых, подготавливают на основе ХА донорского штамма подтипа Н2И2 - А/Ленинград/134/17/57 [2, 4], полученного путем последовательных пассажей в куриных эмбрионах при пониженной до 25-26°С температуре. Для создания рекомбинантных штаммов ЖГВ для детей 3-14 лет был подготовлен дополнительно аттенуированный 30-кратным пассированием при низкой температуре донор аттенуации А/Ленинград/134/47/57(Н2Ы2) [22, 29]. Изучение полной последовательности нуклеотидов, кодирующих негликозилированные белки доноров аттенуации А/Ленинград/134/17/57 и А/Ленинград/134/47/57, выявило ряд мутаций, ответственных за проявление ими признаков температурочувствительности, холодовой адаптации и аттенуации [271, 272]. В отличие от ЖГВ для взрослых, вводимой однократно, детский вариаит ЖГВ применялся при двукратном введении с интервалом в 4 недели. Для подготовки реассортантных вакцинных штаммов вирусов гриппа В, включаемых в состав тривакцины, используется донор аттенуации В/СССР/60/69 [1, 100].

Многолетнее изучение реассортантной ЖГВ подтвердили ее безвредность и эффективность [3, 8-11, 36, 76, 102, 103, 262, 382, 383]. В ряде клинических испытаний, проведенных как в России, так и за рубежом, было показано, что применение ЖГВ вызывает выраженную стимуляцию всех систем иммунного ответа (гуморального, локального, клеточного), включая сывороточные антитела, секреторные ^А, цитотоксические СБ8+ Т-лимфоциты [30-32, 60-63, 154, 225, 244, 380], обеспечивая формирование широкого спектра иммунитета против дрейфовых вариантов вирусов гриппа. Стимуляция неспецифических факторов иммунитета (интерферон, МС-клетки) обусловливает эффективность ЖГВ с первых дней применения [28]. Создаваемый при применении ЖГВ уровень коллективного иммунитета, как показали исследования среди детей школьного возраста, играет значительную роль в ограничении распространения инфекции в обществе [258, 318, 383]. Результаты целого ряда исследований свидетельствуют о генетической стабильности применяемых в настоящее время ХА донорских штаммов и реассортантов на их основе [25, 45, 57, 138, 273, 274].

Существенным практическим преимуществом использования ЖГВ является интраназальиый (физиологический) путь введения в виде назального спрея. При этом стоимость живой вакцины, обусловленная особенностями технологического процесса, не требующего концентрации вирусного материала, в несколько раз меньше инактивированной. В случае возникновения пандемической ситуации повышение потребности в количестве доз инактивированной вакцины с учетом необходимости двукратной иммунизации, обусловленной отсутствием у людей предшествующего иммунитета к новому вирусу, может привести к недостатку производственных мощностей предприятий, производящих вакцину. В этом случае применение ЖГВ может значительно увеличить охват прививками.

Несмотря на то, что доноры аттенуации, применяемые для подготовки реассортантов вирусов гриппа А, входящих в состав поливалентной ЖГВ -А/Ленинград/134/47/57(Н2№) (Россия) и А/Энн Арбор/6/60(США) - подробно охарактеризованы (определены основные мутации в их геноме, изучена роль отдельных генов, ответственных за проявление свойств аттенуации) [153, 272], не были определены мутации, ответственные за холодовую адаптацию вирусов гриппа, полученных в процессе пассирования при пониженной температуре. Не были проведены полное секвенирование и молекулярно-генетический анализ донора аттенуации вирусов гриппа В В/СССР/60/69. Анализ реассортантов на основе В/СССР/60/69 проводился методами, требовавшими использования больших количеств концентрированного вирусного материала, что затрудняло проведение множественных исследований.

Задачи исследования:

1. Молекулярно-генетический анализ и сравнительная оценка на чувствительных системах и моделях гриппозной инфекции (куриные эмбрионы, культура клеток МБСК, мыши, хорьки) безвредных для человека ХА штаммов вирусов гриппа А и В, полученных последовательным пассированием при пониженной температуре.

2. Характеристика фенотипических и генотипических свойств ХА штамма А/Москва/21/17/65(Н2Ы2) для применения в качестве нового донора аттенуации или вакцинного штамма в случае возвращения в циркуляцию вирусов этого подтипа.

4. Подготовка, характеристика и доклиническое исследование высокопродуктивных реассортантных штаммов на основе ХА донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(Н2Н2) с потенциально пандемическими вирусами гриппа различных подтипов вирусов гриппа: Н5, Н7, Н9.

5. Оценка в ограниченных клинических испытаниях безвредности, генетической стабильности и иммуногенпости ЖГВ, разработанной с использованием модельного апатогенного птичьего вируса подтипа А(Н5И2).

Научная новизна. Автором впервые применен реассортантный метод к созданию вакцинных штаммов «шифтовых» вариантов вирусов гриппа на основе отечественного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(Н2И2) с использованием апатогенных вирусов гриппа птиц, что отражено в заявке на изобретение 118284 А1 2007). Впервые определены условия и закономерности получения и апробации холодоадаптированных штаммов вирусов гриппа потенциально пандемических подтипов - Н5, Н7 и Н9.

Впервые проведенное определение нуклеотидной последовательности и молекулярно-генетический анализ штаммов А/Москва/21/17/65(Н2К2) и В/СССР/60/69 и позволили обосновать их применение в качестве доноров аттенуации для получения реассортантных вакцинных штаммов. Результаты секвенирования и рестриктазного картирования, выявившие целый ряд уникальных нуклеотидных замен в генах негликозилированных белков донора аттенуации В/СССР/60/69, указывают на единый генетический характер обеспечения холодовой адаптации вирусов гриппа А и В.

Теоретическая значимость проведенных исследований. Впервые разработана концепция создания реассортантной ЖГВ против вирусов гриппа, обладающих пандемическим потенциалом. Эта концепция основана на экспериментальных доказательствах безвредности, иммуногенности и протективной эффективности холодоадаптированных реассортантных штаммов, содержащих поверхностные антигены апатогенных птичьих вирусов, а также подтверждена даниыми о репродукции реассортантного штамма А(Н5Ы2) в носоглотке человека с формированием гуморальных и секреторных антител не только к вакцинному штамму, но и к высокопатогенным вирусам птичьего гриппа А(Н5№).

Практическая значимость. Работа имеет большое народнохозяйственное значение. В результате ее выполнения автором создана уникальная коллекция холодоадаптированных реассортантов потенциально пандемических подтипов вирусов гриппа А(Н5Ы2), А(Н7№) и А(Н9И2), которые депонированы в Государственной коллекции вирусов института вирусологии имени Д.И. Ивановского. Эти штаммы могут быть использованы для быстрой наработки вирусного материала при производстве пандемической ЖГВ, что является одним из направлений международной стратегии подготовки к пандемии.

Данные доклинических испытаний реассортантного штамма А/17/утка/Г1отсдам/86/92(Н5Ы2) позволили разработать и утвердить программы 1 и 2 фазы клинических испытаний экспериментальной серии ЖГВ подтипа А(Н5Ы2) «Орвакс», производства ФГУП НПО «Микроген» с целыо создания модели для клинического изучения ЖГВ подтипа Н5. Суммарные данные доклинического и клинического изучения безвредности, иммуногенности и эффективности реассортантного штамма на основе апатогенного птичьего вируса гриппа А(Н5Ы2) позволили разработать основы для апробации ЖГВ потенциально пандемического подтипа Н5.

На основании результатов клинических испытаний тривалентная ЖГВ, включающая реассортантные штаммы на основе донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(Н2Ы2), рекомендована для профилактики гриппа среди детей с трех лет и пожилых людей, страдающих хроническими заболеваниями. Таким образом, были расширены контингента для применения ЖГВ как единого препарата с включением наиболее уязвимых групп (детей дошкольного возраста и пожилых, хронически больных людей) что в случае пандемии позволяет обеспечить наибольший охват прививками всех групп и категорий населения.

Разработанные автором реассортантные вакцинные штаммы современных эпидемических вирусов В/60/Йоханнесбург/99/50, А/17/Калифорния/04/71 (ШИ2), А/17/Висконсин/05/84(НЗЫ2) использовались для производства ЖГВ, на их основе подготовлено 5 млн. доз вакцины.

Положения, выноснмые на защиту.

1. Холодовая адаптация штамма А/Москва/21/17/65(Н2Ы2) связана с появлением в процессе пассирования при пониженной температуре множественных нуклеотидных замен в гене РВ2, приводящих к изменениям в структуре соответствующей полимеразной субъединицы. Свойства холодовой адаптации, аттенуации и генетической стабильности, присущие штамму А/Москва/21/17/65(Н2Н2), позволяют использовать его не только в качестве самостоятельного вакцинного штамма для иммунизации населения в случае возвращения в циркуляцию вируса гриппа А(Н2№), но и как потенциально новый донор аттенуации.

3. Реассортантные штаммы апатогенных птичьих вирусов на основе донора А/Ленинград/134/17/57(Н2Н2) проявляют свойства температурочувствительности, холодовой адаптации и аттенуации в различных чувствительных моделях. Высокая степень аттенуации ХА реассортантов птичьих вирусов для кур, вплоть до полной неспособности к репродукции, свидетельствует о безопасности для птичьих хозяйств производства и использования подобных штаммов.

5. Прототип ЖГВ «Орвакс» подтипа А(Н5Ы2) является безвредным, генетически стабильным препаратом и способен к репродукции в носоглотке человека. При оценке иммуногенности ЖГВ подтипа Н5 показано, что сочетанное применение реакции торможения гемагглютинации и теста микронейтрализации в наибольшей степени удовлетворяет критериям чувствительности и специфичности (клиническое изучение).

6. Реассортантная ЖГВ на основе доноров аттенуации А/Ленинград/134/17/5 7(Н2И2) и В/СССР/60/69 является безвредной и эффективной для всех групп населения, включая детей от 3-х лет и пожилых людей старше 65 лет, страдающих хроническими заболеваниями (клиническое изучение).

Канада, 2007), Заседании ВОЗ по вопросам подготовки к пандемии (Женева, Швейцария, 2007), 3-й Европейской конференции по проблемам гриппа (Виламоура, Португалия, 2008). Материалы работы также представлялись и обсуждались на заседаниях Отдела вирусологии НИИЭМ РАМН (2004 г., 2005 г.) и Центра по контролю заболеваемости США, Атланта, США (2001 г., 2004 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 77 печатных работ, в том числе 29 статей (20 - в журналах, рекомендованных ВАК), 4 патента РФ, 1 научный обзор и 43 тезиса докладов общим объемом более 200 страниц.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 328 страницах текста, включая 61 таблицу и 20 рисунков; состоит из введения, трех глав обзора литературы, семи глав собственных исследований, обсуждения, выводов и списка литературы, который содержит 485 источников, из них 98 отечественных и 387 - иностранных.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Дешева, Юлия Андреевна

ВЫВОДЫ.

1. Сравнительный анализ нуклеотидных замещений в генах холодоадаптированного штамма А/МоскваУ21/17/65(Ы2М2) и его предшественника - варианта А/Москва/21/65(Н2Ы2) показал, что основные изменения, ответственные за проявления холодовой адаптации, локализуются в гене РВ2. Свойства холодовой адаптации и аттенуации, наследуемые реассортантами на основе штамма А/МоскваУ21/17/65(Ы2Ы2), позволяют обосновать его использование не только в качестве холодоадаптированного вакцинного штамма в случае пандемии, вызванной вирусом гриппа подтипа А(Н2К2), но и как потенциальный новый донор аттенуации для получения реассортантных вакцинных штаммов.

3. Впервые получена уникальная коллекция высокорепродуктивных реассортантов вирусов гриппа А(Н5К2), А(Н7ЫЗ) и А(Н9Ы2), устойчиво проявляющих ts-, са- и аи- фенотип, с использованием стандартного метода генетической реассортации на основе холодоадаптированного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/5 7(Н2Ы2).

4. Экспериментально установлено, что ЖГВ подтипа А(Н5Ы2) из реассортантного штамма А/17/утка/Потсдам/86/92 защищает мышей против реинфекции высокопатогенными вирусами А(Н5Ш), значительно различающимися как антигенно, так и генетически. Защита от летальности и системного распространения инфекции коррелирует с образованием перекрестно-реагирующих сывороточных и секреторных антител.

5. В доклинических испытаниях на курах установлена неспособность к репродукции в организме птиц холодоадаптированных вакцинных штаммов

А(Н5М2) и А(Н7Ш), что подтверждает безопасность их производства и применения в районах с высокоразвитым сельским хозяйством.

6. В клиническом изучении показана безвредность и ареактогенность прототипа ЖГВ из реассортантного штамма А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5Н2) для волонтеров. Генетическая стабильность реизолятов вакцинного вируса является дополнительной гарантией безвредности применения подобных штаммов на людях. Вакцина вызывает образование системных и секреторных антител. Для достижения наибольшего уровня иммунологической эффективности требуется двукратное введение вакцины с интервалом в 21 день.

7. В клинических испытаниях обосновано применение тривалентной ЖГВ, включающей реассортантные вакцинные штаммы на основе доноров аттенуации А/Ленинград/134/17/57(Н2М2) и В/СССР/60/69, в качестве единого препарата для всех групп населения, включая детей от трех лет, взрослое население и лиц пожилого возраста, на основании чего внесены изменения в Фармакопейную Статью на «Вакцину гриппозную аллантоисную интраназальную живую сухую» ФСП 42-0504-4097-04.

Заключение.

Таким образом, в клиническом изучении тривалентной ЖГВ показано, что вакцина, включающая реассортантные штаммы современных эпидемических вирусов А(НШ1), А(НЗЫ2) и В, является ареактогенной и безвредной при применении среди людей пожилого возраста, страдающих хроническими заболеваниями сердечно-сосудистой системы и нарушениями обмена веществ. Полученные данные об иммуногенности и эффективности ЖГВ у престарелых, страдающих хроническими заболеваниями, позволили расширить рекомендации по применению взрослого варианта ЖГВ для профилактики гриппа у лиц «высокого риска». На основе анализа иммунологической и клинической эффективности ЖГВ и ИГВ, применяемых отдельно, и сопоставления этих данных с результатами эффективности их сочетанного применения выдвинуто положение о целесообразности внедрения сочетанной схемы иммунизации против гриппа лиц высокого риска последствий заболевания гриппом.

Было продемонстрировано, что взрослый вариант тривалентной ЖГВ, содержащий реассортантные вакцинные штаммы подтипов А(НШ1) и А(НЗИ2) на основе донора аттенуации А/Ленинград/13 4/17/57(Н2Ы2), является безвредным при применении среди детей 3-6 лет и не оказывает побочного действия на организм привитых детей. Назначение взрослого варианта ЖГВ детям дошкольного возраста при однократном введении удовлетворяет критериям иммуногенности, принятым для гриппозных вакцин. ЖГВ является эффективной в снижении заболеваемости гриппом и ОРЗ в эпидемический период. ЖГВ, активно репродуцировавшаяся в верхних дыхательных путях привитых, была генетически стабильна и вызывала формирование локальных и сывороточных антител.

На основании полученных результатов были разработаны рекомендации по применению взрослого варианта ЖГВ как единого препарата для взрослых и детей начиная с 3-х лет, что позволило обеспечить защиту самых уязвимых в отношении тяжести последствий гриппозной инфекции контингентов. Внесены изменения в Фармакопейную Статью на «Вакцину гриппозную аллантоисную интраназальную живую сухую» ФСП 42-0504-4097-04 [92].

По данным экспериментального изучения на мышах объединение реассортантного штамма нового подтипа А(Н5Ы2) на основе донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(Н2Ы2) с реассортантами современных эпидемических вирусов является потенциально безопасным для подопытных животных. При этом иммуногенность штамма А(Н5К2) снижалась при его включении в состав тетравакцины. Полученные данные являются необходимыми для дальнейшей разработки стратегии и тактики вакцинопрофилактики и путей повышения иммуногенности гриппозных вакцин нового подтипа Н5, ранее не встречавшегося в человеческой популяции.

При использовании сочетанной схемы вакцинации моновакциной подтипа Н5 наиболее эффективной является первичная вакцинация ИГВ с ревакцинацией ЖГВ. Дальнейшее направление исследований будет включать использование различных комбинаций препаратов и комплексное изучение в клинических испытаниях механизмов формирования иммунного ответа у людей на инактивированные и живые антигены вирусов нового подтипа с включением гуморальных и клеточных факторов.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Главной особенностью вирусов гриппа, осложняющей разработку средств борьбы с этой инфекцией, является свойственная им высокая изменчивость биологических и антигенных свойств, регулярно подтверждающаяся на опыте пандемий и следующих за ними эпидемий. По данным ВОЗ вакцинация предотвращает заболевание гриппом у 80-90% вакцинированных, а экономический эффект от противогриппозных прививок в 10-20 раз превышает затраты на вакцинацию. Как показывает опыт борьбы с наиболее опасными вирусными инфекциями, такими как оспа, полиомиелит и корь, самыми надежными средствами защиты являются в первую очередь живые вакцины, формирующие при иммунизации напряженный иммунитет. В резолюции ВОЗ от 6-7 декабря 2005 г. подчеркнуто, что «основным принципиальным преимуществом ЖГВ является формирование широкого спектра иммунитета против дрейфовых вариантов вирусов гриппа, длительная защита, простота применения и обеспечение ограничения распространения вируса в обществе». Стоимость живой вакцины в пять раз меньше инактивированной, а производительность биотехнологического процесса производства первой существенно выше.

Если в разработке живых гриппозных вакцин приоритет принадлежит России и США, где они разрешены к применению, то многолетнее применение ЖГВ - достижение только Российского здравоохранения. Более 25 лет живая аттенуированная реассортантная гриппозная вакцина в форме интраназального спрея широко применяется в Российской Федерации. Взрослый вариант отечественной тривалентной ЖГВ, включающей реассортантные штаммы А(НШ1), А(НЗШ) и В применялся для вакцинации лиц 14-65 лет, а для детей от 3-х лет использовали специально разработанный детский вариант ЖГВ. В США подобная живая гриппозная вакцина, основанная на классической генетической реассортации, была зарегистрирована только в 2003 году, при этом она рекомендована для лиц 2-49 лет.

В прошлом при возникновении пандемий вакцины никогда не поступали в распоряжение медиков вовремя и в достаточном количестве, чтобы действенным образом повлиять на уровни заболеваемости и смертности. Общепризнано, что оптимальная стратегия профилактики в условиях пандемической угрозы - это как можно более ранняя иммунизация актуальным пандемическим штаммом, или по возможности вирусом, близким по антигенным свойствам, поэтому индустриально развитые страны начали заблаговременную разработку подходов к созданию пандемической вакцины. В качестве источников возникновения нового пандемического штамма рассматриваются в первую очередь высокопатогенные вирусы гриппа А(Н5Ш), однако специалистами не исключается возможность возвращения в циркуляцию вирусов человека А(Н2Ы2).

В нашей работе проведено изучение аттенуированного последовательным пассированием при пониженной температуре штамма А/Москва/21/17/65(Н2К2), в качестве как потенциального нового донора аттенуации, так и вакцинного штамма для иммунизации населения в случае возвращения в циркуляцию вируса гриппа А(Н2К2). Применяющийся в настоящее время для получения реассортантов ХА донор аттенуации АУЛенинград/134/17/57(Н2№) является документированно безвредным для людей и также может применяться в качестве самостоятельного вакцинного штамма, однако вирусы Н2Ы2, выделенные в период с 1957 по 1968 год, значительно отличаются между собой как антигенно, так и генетически [2, 286]. Наиболее существенные отклонения антигенных признаков от свойств пандемического возбудителя 1957 года произошло у штаммов, выделенных в 1965-1967 гг. [2]. Предсказать антигенную структуру вероятного возбудителя пандемии невозможно, как и его близость или отдаленность от имеющихся вакцинных штаммов соответствующего подтипа, поэтому наличие в коллекции вакцинных штаммов нескольких тщательно охарактеризованных вакцинных кандидатов является весьма важным.

Изучение молекулярной структуры генов ХА вируса А/Москва/21/17/65(Н2Ы2) и его пассажного предшественника, штамма А/Москва/21/65(Н2Ы2), показало, что нуклеотидные замены, отвечающие за адаптацию к репродукции при пониженной температуре, приводят к изменениям в структурных и функционально активных доменах соответствующих белковых единиц. В гене РВ2 ХА варианта обнаружены уникальные нуклеотидные замены в 633, 1267, 1273 и 1740 позициях. Кодирующие нуклеотидные замены 633, 1267 и 1273 приводят к аминокислотным замещениям в 202 положении участка соответствующей полимеразной субъединицы, функционально активном при взаимодействии субъединиц РВ1 и РВ2 вирусной полимеразы, а также близкорасположенным заменам в 414 и 416 позициях, что может приводить к изменениям вторичной структуры белка. Также представляют интерес уникальные мутации в гене РВ1, обнаруженные как у ХА вируса А/Москва/21/17/65(Н2№), так и его пассажного предшественника, штамма А/Москва/21/65, и отличающие эти штаммы, документировано безвредные для человека от всех других проанализированных вирусов А(Н2И2). Все обнаруженные значащие мутации, ведущие в белке РВ1 обоих вариантов А/Москва/65 к аминокислотным замещениям, связанным с изменениями полярности, заряда или направления полипептидной цепи, обнаружены среди 264 аминокислот в С-концевом участке, функционально активном в процессе взаимодействии субъединицы с вирусной РНК. Кроме этого, в гене РВ1 обоих штаммов А/Москва/65 обнаружены уникальные нуклеотидные замены, приводящие к аминокислотным замещениям в недавно открытом белке РВ1-Б2 (8-32-К и С>-60-11). Таким образом, были подтверждены данные о роли полимеразных генов в проявлении температурочувствительности и аттенуации вирусов гриппа, полученные ранее И.В. Киселевой на модели одногенных реассортантов между ХА донором аттенуации А/Ленинград/134/17/57(Н2Н2) и родственным штаммом «дикого» типа А/Ленинград/ 134/57(Н2Ш), когда изучение значимости отдельных мутантных генов в аттенуации показало, что решающую роль для проявления fe-фенотипа и аттенуации реассортантами для экспериментальных животных играют мутации в генах РВ2 и РВ1 [44].

Помимо изменений в генах РВ2 и РВ1, в белке NSI ХА варианта обнаружена замена V-65-I, однако изменения в гене NS не влияли на проявления са- и att- фенотипа, как было показано на модели полигенных реассортантов на основе штамма А/Москва/21/17/65, содержащих поверхностные антигены эпидемического вируса A(H1N1). Было показано, что наследование 5:3 реассортантом NS гена от ХА родительского штамма приводило к существенному снижению репродукции в РКЭ и культуре клеток MDCK по сравнению с реассортантом, унаследовавшим этот ген от эпидемического вируса.

Свойства холодовой адаптации штамма А/Москва/21/17/65 и его реассортантов с формулой генома 6:2 и 5:3 были подтверждены на модели мышей, когда была продемонстрирована более высокая способность к репродукции этих штаммов в носовых ходах по сравнению с репродукцией в легких, где температура существенно выше. Таким образом, помимо использования в качестве самостоятельного вакцинного штамма А/Москва/21/17/65(Н2Ы2) может применяться как новый донор аттенуации. Возможно, что в случае необходимости его можно будет использовать в качестве донора внутренних генов для потенциально пандемической вакцины, предназначенной для детей в возрасте 1-3- лет.

Впервые было проведено секвенирование донора аттенуации В/СССР/60/69, применяющегося для подготовки реассортантных штаммов вирусов гриппа В для включения в состав тривалентной вакцины. Донор В/СССР/60/69 был ранее достаточно полно охарактеризован с вирусологической точки зрения, была продемонстрирована его клиническая безвредность. Однако современное состояние проблемы и появление новых молекулярных методов потребовали проведения дополнительных исследований на молекулярном уровне. Проведенное секвенирование с последующим сравнительным изучением биологических свойств донора аттенуации

В/СССР/60/69 и эпидемического штамма В/СССР/69-дт показало, что наличие множественных нуклеотидных замен, приводящих к аминокислотным замещениям в генах внутренних и неструктурных белков, коррелировало с холодовой адаптацией и «//-фенотипом для хорьков.

До проведения полного секвенирования донора аттенуации В/СССР/60/69 определение происхождения в геноме вакцинных реассортантов генов, кодирующих внутренние и неструктурные белки, наиболее часто проводили методом, основанным на различной электрофоретической подвижности в полиакриламидном геле сегментов РНК донора В/СССР/60/69 и эпидемических штаммов [47]. Этот метод требовал больших количеств РНК и, следовательно, накопления больших объемов вирусного материала и его концентрации. Кроме того, в ряде случаев при применении данного метода бывает сложно идентифицировать миграцию наиболее крупных сегментов, таких например, как гены полимеразного комплекса. Анализ мутаций, присутствующих в геноме холодоадаптированных штаммов, проводился также при помощи гибридизации изотопно меченных комплементарных РНК с избытком немеченых гомологичных или гетерологичных вирионных РНК с соответствующей детекцией гибридных молекул [46]. Данный метод обладает большей специфичностью, однако также требует использования большого объема РНК и является достаточно трудоемким. Другие методы или являются еще более сложными, или недостаточно чувствительны. Разработанная в данном исследовании схема рестриктазного картирования для идентификации генов внутренних и неструктурных белков реассортантов, полученных на основе ХА донора аттенуации В/СССР/60/69, обеспечила проведение анализа реассортантов при подготовке компонента В поливалентной ЖГВ.

Конструирование гриппозных вакцин включает в себя несколько последовательных стадий: отбор эпидемических или потенциально пандемических штаммов-кандидатов в вакцинные штаммы; реассортация с высокоурожайными лабораторными штаммами; выделение культуры штамма путем селективных пассажей; паспортизация и оценка безвредности полученного штамма; доклинические испытания; клинические испытания (авторские, государственные). Работы по разработке вакцин против потенциально пандемического гриппа А(Н5Ы1) ведутся во всем мире, начиная с 1997 года, когда вирус этого подтипа впервые был выделен от человека [146]. Первые аттенуированные реассортанты А(Н5Ш) были получены на основе американского донора аттенуации А/Энн/Арбор/6/60(Н2Ы2) с использованием модифицированных методами обратной генетики НА и ЫА высокопатогенных вирусов А(Н5Ы1), выделенных в Гонконге в 1997 году [422]. В 2004 и 2005 гг. были сконструированы вакцинные штаммы для ИГВ на основе генетически модифицированных ВП вирусов А(Н5Ш), выделенных во Вьетнаме и Индонезии [440]. Работа с ВП вирусами требует повышенных мер защиты биологической безопасности в специально оборудованных лабораториях, множественных тестов на безопасность полученных штаммов, сертифицированных клеточных линий и дорогостоящих генно-инженерных методик. Более того, даже при самом благоприятном течении событий, в случае начала циркуляции пандемического штамма актуальные антигенные варианты могут быть доступны не ранее 6 месяцев после их выделения. Альтернативный подход заключается в использовании низкопатогеиных суррогатных вирусов, проявляющих антигенное сходство с высокопатогенными вирусами. В связи с этим выявление антигенно - и генетически близких к потенциально пандемическим штаммам апатогенных вариантов представляется, по мнению ряда исследователей, весьма важным [159, 427].

Использование апатогенных птичьих вирусов в качестве источника поверхностных антигенов в сочетании с применением классических методов реассортации в куриных эмбрионах с ХА, безвредными для человека и чувствительных животных донорами аттенуации может быть существенным преимуществом при разработке и производстве вакцинных штаммов для ЖГВ, учитывая, что на настоящий момент во всем мире лицензированы вакцинные штаммы для ЖГВ, полученные классическими методами с использованием вирусов, выделенных только на куриных эмбрионах.

Для разработки вакцины против потенциально пандемических вирусов гриппа была использована методика генетической реассортации в куриных эмбрионах отечественного донора аттенуации АУЛенинград/134/17/57(Н2Ы2) с апатогенными вирусами гриппа птиц. Была показана высокая степень аттенуации реассортантов подтипа A(H5N2) и A(H7N3) на курах вплоть до полной неспособности к репродукции, что подтверждает безопасность для птичьих хозяйств при производстве и использовании подобных штаммов. Высокая урожайность полученных реассортантов в PIO дает возможность наработки большого количества вирусного материала, что позволяет их использование для производства как ЖГВ, так и ИГВ, а сокращение сроков инкубации до 26-28 часов позволяет ускорить технологический процесс.

В настоящий момент неизвестно, какая антигенная разновидность вируса способна вызвать пандемию, поэтому необходима разработка вакцин с возможно широким спектром перекрестного защитного действия. Результаты экспериментальных исследований и клинического изучения свидетельствуют, что интраназальное введение ЖГВ отвечает требованиям широты спектра перекрестного реагирования за счет эффективной стимуляции сывороточных и локальных антител, а также клеточного компонента иммунного ответа [98, 120, 147, 324, 382]. В эпидемиологических испытаниях, проведенных в России и США, было показано, что применение ЖГВ защищало не только от вируса, входившего в состав вакцины, но и от дрейфовых вариантов циркулирующих штаммов [28, 118]. Клиническая эффективность отечественной ЖГВ, включающей штамм АЛ 7/Панама/99/242(НЗN2) в период циркуляции вируса гриппа А/Вайоминг/3/03(НЗЫ2) (декабрь 2003- январь 2004 г.) среди взрослых контингентов составила 59% [28].

В эксперименте на чувствительной модели белых мышей была изучена иммуногенность и эффективность вакцинного кандидата АЛ 7/утка/Потсдам/86/92(Н5Ш), вводимого в качестве ЖГВ или ИГВ против заражения ВП вирусами A(H5N1), принадлежащими к различным антигенным группам. Несмотря на более или менее выраженные генетические различия (10

12 % аминокислотных различий) с заражающими вирусами A(H5N1), выделенными в 1997, 2003 и 2005 гг., введение реассортанта А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5Ш), содержащего НА апатогенного птичьего вируса A(H5N2) 1986 года выделения, вызывало значительный уровень защиты при экспериментальной инфекции мышей. Было показано, что несмотря на сниженный более, чем в 10000 раз уровень репродукции в легких мышей реассортанта А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5Ы2) по сравнению с «диким» родительким штаммом A(H5N2), однократное интраназальное введение мышам аттенуированного реассортанта создавало у мышей эффективную защиту против летальной системной инфекции вирусом А/Гонконг/483/97(Н5]чГ1) и приводило к снижению выделения заражающего вируса из легких на 5 lg ЭИД50, в то время как в контрольной группе наблюдалась 100% гибель мышей.

Следует отметить, что интраназальное введение родительского птичьего вируса A(H5N2) вызывало образование перекрестнореагирующих нейтрализующих антител в сыворотке крови к вирусам A(H5N1) не только генетически и антигенно близкой 3-й линии (А/Гонконг/156/97), но и более поздних 1-й (А/Гонконг/213/03) и 2-й (А/курица/Курган/2/2005). Высокая степень перекрестного реагирования после иммунизации штаммам A(H5N2) делают его наиболее подходящим кандидатом для получения вакцинных штаммов и могут в дальнейшем служить критерием для отбора других потенциальных кандидатов для получения реассортантных вакцинных штаммов.

При изучении на мышах перекрестной защиты после иммунизации ЖГВ из штамма А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5Ш) против вируса А/курица/Кургаи/2/05(Н5Ы1) в сравнительное исследование была включена субъединичная адьювантная ИГВ из штамма А/Вьетнам/1203/2004(Н5]М1). Показано преимущество защитного эффекта ЖГВ по сравнению с ИГВ. При этом однократная иммунизация ЖГВ из генетически отдаленного от заражающего вируса штамма оказалась достоверно эффективнее, чем однократная иммунизация субъединичнной адыовантной ИГВ, приготовленной из штамма, выделенного всего за несколько месяцев до появления новой антигенной разновидности вируса А(Н5Ы1).

Обращает на себя внимание, что при реинфекции мышей, предварительно иммунизированных ЖГВ из штамма

А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5Ы2), ВП вирусами А(Н51Ч1) различных антигенных линий, заражающие вирусы ни в одном случае не были выделены из носовых ходов или головного мозга. Подавление репродукции заражающего вируса в ВДП может иметь значение для предотвращения дальнейшего генерализованного распространения инфекции и выделения вируса в окружающую среду. Следует отметить, что ограничение репродукции высокопатогенных вирусов в ВДП и как следствие этого, предотвращение системной инфекции, в том числе и нейроинфекции, представляется важным преимуществом защитного действия ЖГВ в свете недавно полученных данных о нейрогенном пути генерализации инфекции, вызванной высокопатогенными вирусами А(ТМ5М1) [311].

Как уже упоминалось выше, реассортантный штамм А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5Ы2), использовавшийся в наших исследованиях, унаследовал ген ЫА подтипа N2 от ХА донорского штамма. Было продемонстрировано, что для защиты мышей от летальной инфекции вирусами А(Н5Ы1) присутствие в вакцинном штамме нейраминидазы N1 было необязательным. Более того, наличие ИА высокопатогенных вирусов в составе вакцинных штаммов может оказаться потенциально небезопасным, поскольку даже в случае низкорасщепляемого НА роль ЫА может оказаться критической в повышении патогенности, как это было показано для вируса, вызвавшего пандемию 1918 г [445].

Примечательно, что интраназальное введение мышам донора аттенуации А/Ленинград/134/17(Н2М2) также вызывало от 20 до 80% защиты (в зависимости от заражающей дозы) против летальной инфекции при заражении ВП А/Гонконг/483/97(Н51Ч1). При этом также наблюдалось отсутствие выделения заражающего вируса из носовых ходов, что может служить иллюстрацией влияния праймирования вирусами других подтипов на течение инфекции, вызванной вирусами А(Н5Ш). Однако очевидно, что для достижения полной защиты необходимо введение вакцинного вируса, содержащего гемагглютинин подтипа Н5.

Среди показателей эффективности, в первую очередь, следует оценивать протективные свойства вакцины, то есть ее способность защищать иммунизированных особей от прямого заражения вирулентным возбудителем. В отношении ХА гриппозной вакцины до сих пор не было установлено серологической связи с ее защитной эффективностью. При изучении защитного действия ЖГВ из штамма А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5К2) против ВП вирусов А(Н51М1) было показано, что отсутствие выделения заражающего вируса из носовых ходов коррелировало с высокими титрам секреторных 1§А к вирусам Н5 в носовых ходах. Локальный иммунный ответ слизистых оболочек организма служит первым и наиболее значимым барьером для развития многих вирусных инфекций, в том числе и гриппа [97, 152]. В опытах на мышах показано, что секреторные 1§А, которые превалируют в верхних дыхательных путях, обладают широким перекрестно-реактивным спектром действия против дрейфовых вариантов вирусов гриппа А и В [284]. Благодаря своей полимерной структуре, они обладают в несколько раз более высокой антигемагглютинирующей и нейтрализующей активностью по сравнению с [372], а также являются более устойчивыми и более перекрестно-реагирующими. Кроме того, 1§А могут взаимодействовать с поверхностными белками вируса гриппа внутриклеточно, в процессе трансцитоза [313]. У людей природная инфекция или иммунизация живыми вакцинами вызывает более широкую перекрестную защиту от последующего заражения. В нашем экспериментальном исследовании показано, что ЖГВ подтипа А(Н5Ш) в отличие от ИГВ вызывала интенсивное образование локальных 1§А. Обнаружение локальных (но не ^А) в легких мышей после иммунизации ИГВ может объясняться различными механизмами появления этих антител во внешних секретах - пассивное проникновение из сыворотки в первом случае [454] или активная секреция во втором [143, 415].

Механизмы перекрестного иммунитета при гриппе опосредованы несколькими факторами, среди которых важное место занимает клеточный иммунный ответ. Клеточный иммунитет участвует в элиминации вируса из организма и в активации гуморального иммунного ответа. Ранее в опытах на мышах было показано, что аттепуация вируса гриппа путем генетической реассортации дифференцированно влияет на индукцию различных звеньев клеточного иммунитета. Показатели пролиферативной активности спленоцитов после введения аттенуированного 6:2 реассортанта на основе донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(H2N2), содержащего 2 гена поверхностных белков от патогенного для мышей штамма A/PR/8/34, практически не снижались по отношению к родительскому патогенному штамму [31]. Сниженными по сравнению с патогенным родительским штаммом оказались стимуляция сывороточных антител и ЦТЛ, а по активности пролиферации общего пула лимфоцитов, стимуляции IL-2, Th и В-клеток реассортантный аттенуированный вирус даже превосходил патогенный.

Регуляция иммунного ответа, в том числе и на введение гриппозных вакцин, опосредована продукцией цитокинов CD4+ клетками, которые подвергаются дифференцировке на Thl и Th2, при этом Thl регулируют клеточный, a Th2 - гуморальный иммунный ответ. В связи с этим в процессе выполнения работы было проведено определение продукции Thl и Th2-маркерных цитокинов in vitro спленоцитами мышей, иммунизированных ЖГВ и цельновирионной ИГВ из штамма А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5№). Оказалось, что введение ЖГВ и ИГВ вызывало продукцию цитокинов спленоцитами иммунизированных мышей в ответ на стимуляцию как цельным вирусом A(H5N1), так и рекомбинантным гемагглютинином Н5. Иммунизация ЖГВ вызывала более высокие уровни продукции IFN-y спленоцитами мышей, стимулированных вирусами A(H5N1), иммунизация ИГВ индуцировала продукцию IL-4 и IL-10. Интересно, что после иммунизации родительским вирусом А(Н2И2) продукция спленоцитами мышей ШИ-у происходила только в ответ на стимуляцию цельным вирусом А(Н5Ш), что свидетельствует о направленности гетеросубтипического иммунитета на консервативные эпитопы вирусных белков [292].

До проведения клинических испытаний безвредность, иммуногенность и протективные свойства живой вакцины «Орвакс», произведенной предприятием «Микроген» на основе штамма А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5Ы2) была изучена при интраназальной иммунизации яванских макаков [381]. Ни у одной из 4 обезьян, иммунизированных вакциной «Орвакс» в дозе 6,9 ЭИД50/мл, не было выявлено нежелательных реакций на введение вакцины: температурная реакция отсутствовала, поведенческие реакции не изменились, масса животных не уменьшалась. Вакцинный вирус размножался в ВДП и был выделен у 2 из 4 обезьян, начиная на 3-5 сутки после первой вакцинации в максимальном титре 4,2 ^ ЭИД50/мл. Отсутствие вирусемии и температурной реакции в этот же период свидетельствует, что инфекционный процесс носил локальный характер. У 3-х из 4-х обезьян двукратная иммунизация вызывала образование антигемагглютинирующих антител к вирусам Н5 в титрах 1:40 — 1:160. Через 21 сутки после завершения цикла иммунизации животных инфицировали комбинированным методом путем интратрахеального и интраназального введения 7,5 ^ ЭИД50/МЛ адаптированного к приматам штамма вируса гриппа А/Курица/Курган/2/05(Н5Ш) У трех животных из контрольной группы после инфицирования возбудителем наблюдалось развитие клинических симптомов с повышением температуры тела на 0,6±0,3 в течение 2-4 суток после инфекции, сопровождающееся вирусемией. По суммарным данным развития клинических реакций и выделения вируса из дыхательных путей вакцина защищала против ВП вируса А(Н5М1) на уровне не менее 50%. Заражение вакцинированных животных сопровождалось в 75% случаев кратковременным повышением температуры (менее 8 часов), однократным выделением вируса из крови у одной из 4 обезьян и носовых смывов у двух из 4 обезьян без развития астенического синдрома.

Результаты доклинического изучения вакцинного штамма А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5Ш) на различных видах животных (мыши, куры, приматы) позволили разработать протокол 1 и 2-й фазы клинических испытаний ЖГВ «Орвакс». В клиническом изучении было показано, что вакцина «Орвакс» подтипа А(Н5Ы2) является безопасным и иммунологически эффективным препаратом. Результаты клинического обследования добровольцев врачами-специалистами разного профиля и проведенные лабораторно-инструментальные исследования свидетельствовали об отсутствии отклонений в самочувствии и в результатах анализов после иммунизации Вакциной «Орвакс» в сравнении с фоновыми значениями. Регулярная термометрия в течение 42 суток после вакцинации не выявила повышения температуры тела ни у одного добровольца. Данные о безвредности препарата при применении среди людей подтверждают концепцию аттенуации вирусов гриппа реассортацией с ХА донорами аттенуации и связи ХА фенотипа с аттенуацией. Не было отмечено какого-либо влияния вакцинации на показатели клинического и биохимического исследования крови. При оценке иммунологической безопасности не выявлено существенного отклонения от фоновых значений количества Т и В лимфоцитов, а также содержания в сыворотке крови С-реактивного белка и 1§Е.

Положительные данные о выделяемости вируса из носовых ходов привитых свидетельствует о хорошей приживаемости вакцины, что может служить дополнительным обоснованием подхода к разработке реассортантных вакцинных штаммов против пандемического гриппа с использованием апатогенных птичьих вирусов. Для выделения вакцинного вируса потребовалось 2-3 пассажа па чувствительных культурах, что говорит о крайне незначительном содержании вируса в мазках из полости носа привитых и может свидетельствовать о безопасности вакцины для окружающих. Изучение реизолятов, полученных от привитых на различные сроки после вакцинации, показало, что выделенный вакцинный вирус сохранял все мутации, характерные для ХА донора аттенуации. Выделение вакцинного вируса на 7-11 день после вакцинации подтверждает данные других авторов о замедленной репродукции вирусов подтипа Н5 в клетках млекопитающих.

Сравнение трех методов оценки поствакцинального иммунного ответа показало, что РТГА, которая до сих пор признается «золотым стандартом» оценки протективного иммунитета при введении гриппозных вакцин, в ряде случаев являлась недостаточно чувствительной в выявлении специфических антител к вакцинным антигенам птичьего происхождения. Реакция микронейтрализации оказалась более чувствительной по сравнению с РТГА в выявлении сывороточных антител к гомологичному вирусу после иммунизации ЖГВ. Низкие значения антител затрудняют получение более полной антигенной характеристики изучаемых штаммов вируса гриппа, но результаты изучения сывороток крови с различными антигенами в РТГА позволяют сделать заключение об антигенной полноценности штаммов, используемых в качестве источника поверхностных антигенов.

Ранее при изучении иммуногенности инактивированных вакцин на основе вирусов гриппа птиц, обладающих пандемическим потенциалом, как в эксперименте, так и в клинических испытаниях была показана низкая иммуногенность подобных препаратов, согласно общепринятым критериям, оцениваемым по сероконверсиям антигемагглютинирующих антител. С целью повышения чувствительности РТГА, проводимой с использованием вирусов птичьего происхождения, экспертами ВОЗ рекомендовано использовать эритроциты лошади [414]. По результатам нескольких экспериментов при постановке РТГА с сыворотками привитых вакциной «Орвакс» с использованием в качестве антигенов вирусов А(Н5Ы2) и А(Н5Ш) было показано, что эритроциты человека при оценке иммунного ответа на вакцину подтипа Н5 в сыворотках крови привитых являлись не менее чувствительными по сравнению с эритроцитами лошади.

Сочетанное применение двух (тестов РТГА и РН) для изучения гуморального иммунного ответа на введение ЖГВ подтипа Н5 позволяет получить наиболее полную информацию о развитии сероконверсий в ответ на прививку.

Европейским комитетом по контролю медицинских препаратов были установлены следующие критерии иммуногенности вакцинных препаратов на основе как эпидемических, так и потенциально пандемических вирусов гриппа: кратность приростов антител не менее 2,5 для лиц 18-60 лет и развитие достоверных сероконверсий у 40% привитых [467]. При этом уровень коллективного иммунитета, оцениваемый по числу лиц с защитными титрами антител, определяемых методом радиальной иммунодиффузии в агарозном геле, должен составлять не менее 70%. Клиническое изучение показало, что вакцина «Орвакс» подтипа А(Н5М2) при двукратном введении полностью соответствовала Европейским критериям иммуногенности по числу сероконверсий (41%) и по кратности приростов антигемагглютинирующих антител (2,8). В отношении числа лиц с защитным титром антител после прививки до сих пор остается невыясненным, какой титр антител можно считать защитным в отношении потенциально пандемических вирусов - 1:20 или 1:40.

Применение ИФА позволило обнаружить наличие в сыворотках крови у привитых ЖГВ антител к вирусам А(Н5М1), в том числе и антигенно удаленным. При этом наибольшая специфичность достигалась при использовании в качестве антигена очищенного НА вместо цельного вируса, поскольку таким образом достигалось выявление антител только к гемагглютинину, а не к антигенным эпитопам внутренних белков цельного вируса, которые являются более консервативными, чем у поверхностных белков. Тем не менее, прежде отмечалось, что специфичность данного метода при оценке поствакцинального иммунного ответа к гриппу у взрослых людей может быть недостаточной [379], поскольку в этом случае часто наблюдается неспецифическое реагирование. При этом могут выявляться также антитела к антигенным детерминантам внутренних белков вирусов гриппа (в случае, если в качестве антигена используется цельный вирус). Если же в качестве антигена использовать очищенный или рекомбинантный НА, то неспецифическое реагирование может объясняться наличием общих антигенных эпитопов в НА вирусов подтипов Hl, Н2 и Н5 [379] или конформационными изменениями в молекуле НА в процессе абсорбции на твердой фазе (полистирол), делающими подобные эпитопы более доступными для распознавания. В обоих случаях при исследовании сывороток взрослых людей наблюдается высокий иммунологический фон до прививки.

В ряде исследований было показано, что на сниженную иммуногенность инактивированных вакцин A(H5N1), выявленную как на экспериментальных моделях, так и в клинических испытаниях, может влиять изменение молекулярной структуры НА. Так, замена в 223 положении НА рекомбинантного вируса серина, характерного для вирусов, выделенных в 2004 г. во Вьетнаме на аспарагин (как у вируса А/Гонконг/213/2003) приводила к развитию более высоких титров антигеммаглютинирующих антител. Наряду с этим было показано, что присутствие аспарагина-223 усиливает чувствительность РТГА путем изменения рецепторной специфичности и аффинности антител к соответствующему антигену. На основании этого было рекомендовано использовать вирус, содержащий аспарагин-223 в качестве диагностического референс-антигеиа для изучения иммунологической эффективности вакцин A(H5N1) в клинических испытаниях [231].

Основной социальный и экономический ущерб от гриппа определяется уровнем заболеваемости, госпитализации и смертности. Проведенные в США исследования показали, что во время эпидемий гриппа показатели заболеваемости, госпитализации и смертности среди лиц старше 64 лет превышают аналогичные показатели среди людей 10-54 лет соответственно в 1,7-2,2, 5,6-29,0 и 10,2-115,0 раз [191]. Очень высокую смертность пожилых людей во время гриппозных эпидемий связывают со значительно более частым развитием у них постгриппозных осложнений, обусловленных сниженной иммунной защитой и наличием хронических заболеваний [174]. Грипп представляет особую опасность в пожилом возрасте, так как нередко протекает на фоне атеросклеротичеекнх изменений сердечно-сосудистой системы, хронических заболеваний органов дыхания и других осложнений. Заболевание гриппом характеризуется сочетанием воспалительных изменений в верхних дыхательных путях с явлениями общей интоксикации и поражением нервной и сердечно-сосудистой систем. В поражении различных органов и систем при гриппе ведущую роль, наряду с непосредственным действием вируса на эпителий дыхательных путей и нервную систему, играют циркуляторные расстройства. При этом наиболее выраженная патология, связанная с нарушением сосудистой проницаемости и изменений со стороны свертывающей системы крови, обнаруживается в сосудах микроциркуляции легкого и мозга. Страдает при этом также и сократительная функция миокарда. Активизация условно-патогенной флоры дыхательных путей вследствие действия возбудителя на барьерную функцию эпителия респираторного тракта ведет к возникновению бактериальных осложнений, наиболее частыми из которых являются бронхит и пневмония, а также к обострению сопутствующих хронических заболеваний. В большинстве развитых стран мира пожилые люди отнесены к группе "высокого риска" в отношении тяжести последствий гриппозной инфекции, поэтому там рекомендуется прививать от гриппа лиц 65 лет и старше, особенно, если они страдают хроническими сердечнососудистыми и бронхо-легочными заболеваниями [205]. В отличие от других стран в России люди пожилого возраста долгое время не прививались вообще, и в настоящее время также не являются обязательным контингентом для вакцинопрофилактики гриппа. Необходимо отметить, что число людей старше 60 лет в общем составе населения в развитых странах стремительно увеличивается. В России в настоящее время доля лиц в возрасте старше трудоспособного в общей численности населения составляет 20,5 % (26,8 млн. человек) а к 2025 г она по прогнозам возрастет до 26,7 %. В связи с этим разработка средств и методов профилактики гриппа среди этой возрастной группы приобретает все большую актуальность.

Один из разделов настоящего исследования посвящен проблемам разработки методов иммунизации пожилых лиц и больных, страдающих хроническими заболеваниями сердечно-сосудистой системы и нарушениями обмена веществ с использованием холодоадаптированной реассортантной ЖГВ. Полученные данные клинического и лабораторного обследования престарелых и хронически больных, привитых ЖГВ, показали, что холодоадаптированная тривакцина не вызывала каких-либо неблагоприятных реакций у этой группы лиц. Изучение особенностей поствакцинального ответа на введение ЖГВ у лиц пожилого возраста показало, что в этой возрастной группе живой антиген не уступает инактивированному в стимуляции циркулирующих сывороточных антител, помимо этого ЖГВ имеет преимущество перед ИГВ в индукции локального иммунного ответа, опосредованного секреторными IgA и в индукции Т-клеточного иммунного ответа. В сотрудничестве с А.Н. Найхиным и др. (2002) было проведено определение продукции ИФН-у, ИЛ-2, и ИЛ4 in vitro лимфоцитами людей разного возраста, иммунизированных ЖГВ однократно. Также после иммунизации определяли пролиферативную активность лимфоцитов (ПАЛ), которая отражает общую функциональную активность клеточного иммунитета. В исследование в качестве положительного контроля была включена группа людей, вакцинированных ИГВ, также однократно. Показано, что в отличие от ИГВ, ЖГВ активно стимулировала продукцию Thl-маркерных цитокинов (ИФН-у и ИЛ-2) как у молодых людей, так и у пожилых, тогда как ИГВ - только у молодых. Результаты продукции Thl-маркерных цитокинов хорошо согласуются с данными об индукции клеточного иммунитета в ответ на введение ЖГВ, поскольку пролиферативная активность лимфоцитов у пожилых и у молодых людей оказалась выше после введения ЖГВ [60, 61].

Изучение профилактической эффективности ЖГВ в домах престарелых показало, что в эпидемический по гриппу период среди привитых ЖГВ имело место снижение заболеваемости в 1,6-2,0 раза. Показано, что схема иммунизации, включающая сочетанное применение ИГВ и ЖГВ с последующей ревакцинацией ЖГВ является наиболее эффективной с позиций формирования напряженного иммунного ответа.

По данным проведенных исследований были разработаны рекомендации по применению ЖГВ для профилактики гриппа среди престарелых и лиц, страдающих хроническими заболеваниями, на основании чего в 1999 г. внесены изменения в Фармакопейную статью на ЖГВ [92].

Гриппом ежегодно переболевают от 10 до 50% населения всего мира, при этом около половины составляют дети. При всей актуальности защиты от гриппа детей младшего возраста, в России использовались только два варианта отечественных вакцин: ЖГВ для детей [29] и инактивированная вакцина "Гриппол" [85]. К недостатакам инактивированных вакцин при иммунизации детей относятся: инвазивный (парентеральный) путь введения; ограниченые возможности в стимуляции вируснейтрализующих секреторных антител при таком способе введения; возможность неоправданной антигенной нагрузки на организм ребенка при ежегодных вакцинациях инактивированными вакцинами, особенно, содержащими иммуномодуляторы. В отличие от инактивированных вакцин, ЖГВ, вводимая интраназальпо, и обладающая избирательным действием в зависимости от иммунного статуса ребенка, способна обеспечить образование более естественного и антигенно более широкого противогриппозного иммунитета. Необходимость подготовки двух вариантов ЖГВ - для взрослых и для детей - приводила к увеличению сроков и удорожанию производственного процесса, а двукратное введение детской ЖГВ создавало трудности при проведении вакцинации в предэпидемический период из-за высокого уровня заболеваемости ОРЗ.

До проведения исследований по применению взрослого варианта ЖГВ у детей 3-6 лет в 1991 году в гг. Вологде и Нижнем Новгороде было привито реассортантной тривалентной ЖГВ для взрослых на базе донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(Н2№) более 2000 школьников и показана ареактогенность и высокая иммупогенность и эффективность данного препарата при применении у детей 7-14 лет [383]. Согласно общепринятым критериям иммуногенности сезонные живые гриппозные вакцины оказались сравнимыми с трехвалентными инактивированными вакцинами. У привитых ЖГВ в течение эпидемического сезона наблюдалось снижение числа связанных с гриппом случаев осложнений со стороны нижних отделов дыхательных путей. Кроме того, вакцинация школьников уменьшала число обращений за медицинской помощью в связи с гриппом взрослых [318].

Проведенное в 1999-2001 гг. исследование показало, что использование взрослого варианта ЖГВ на базе донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(Н2Ы2) среди детей дошкольного возраста не вызывало увеличения показателей реактогенности. Число общих и местных реакций после прививки оказалось сопоставимым с показателями реактогенности инактивированных вакцин, используемых для профилактики гриппа у детей за рубежом [474]. Были получены данные о высокой иммуногенности однократного введения препарата детям этого возраста. При этом двукратное его введение не давало преимуществ в стимулировании поствакцинального иммунитета. Полученные результаты позволили рекомендовать взрослый вариант ЖГВ на основе донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(Н2Ы2) для профилактики гриппа среди детей 3-х лет и старше путем интраназального однократного введения.

Таким образом, включение пожилых лиц и детей дошкольного возраста в контингенты, подлежащие вакинации ЖГВ, позволило увеличить охват прививками, уменьшить заболеваемость и смертность от гриппа и его осложнений. Исследования, продемонстрировавшие возможность использования взрослого варианта вакцины для детей, существенно упростили работу практического здравоохранения по выполнению календаря прививок и значительно удешевили как стоимость вакцины (один препарат для всех групп населения), так и стоимость прививки.

При определении безвредности вакцинных препаратов, особенно для групп высокого риска, одним из актуальных направлений является исследование влияния вакцинации на возникновение и течение 1§Е опосредованных аллергических заболеваний. В последнее десятилетие отмечен рост аллергической сенсибилизированности населения. Так, среди детей дошкольного возраста, не имеющих в анамнезе клинически выраженной аллергической патологии, доля лиц со значительным превышением нормального уровня общих составила 52%, а среди взрослых, включая и пожилых людей - 1,2 -4,7% [94, 95]. В исследованиях Отдела вирусологии ГУ НИИЭМ РАМН было показано, что у детей, как с низкими, так и высокими исходными уровнями общих 1§Е иммунизация тривалентной ЖГВ не приводила к повышению концентраций ни общих, ни вирусспецифических 1§Е. Аналогичные данные получены также для группы взрослых людей, включая лиц старше 65 лет. Было показано отсутствие связи между развитием специфического иммунного ответа на ЖГВ и изменением уровня общих и вирус-специфических ^Е, обнаруживаемых как в сыворотке крови, так и в секретах ВДП. Полученные результаты могут объясняться отсутствием как у здоровых, так и сенсибилизированных людей выраженной продукции 1Ь-4 на фоне активной выработки Ш]Ч-у после иммунизации ЖГВ, поскольку 1Ь-4 является основным цитокином, переключающим В-клетки на синтез 1§Е, в то время как ШЬТ-у в данной ситуации выступает в роли антагониста 1Ь-4.

Согласно мнению экспертов ВОЗ, создание и применение поливалентной вакцины, включающей антигены как интердемических, так и пандемических (Н5) серотипов вирусов гриппа является одним из самых перспективных подходов для контроля возможной пандемии гриппа [65]. По прошествии пандемической волны, в случае формирования вирусом гриппа А(Н5Ш) постоянной линии в человеческой популяции и начала циркуляции наравне с распространенными в настоящий момент подтипами, приобретет актуальность вопрос о возможности включения вакцинного штамма нового подтипа в поливалентный препарат, уже объединяющий в себе аттенуированные вирусы гриппа А(НШ1), А(НЗЫ2) и В, в связи с чем представляется необходимым изучение на экспериментальных моделях путей применения вакцинного штамма нового подтипа как в период пандемического подъема, так и после стабилизации эпидемиологической обстановки. Созданию существующей тривалентной ЖГВ предшествовала огромная подготовительная работа, направленная на предотвращение таких последствий взаимодействия между вирусами в условиях смешанной инфекции, как подавление репродукции одного или обоих штаммов (интерференция), взаимное/одностороннее усиление репродукции вирусов за счет генетических взаимодействий, приводящих к образованию потомства с новыми биологическими свойствами, или негенетических взаимодействий комплементации. На основе полученных в этот период экспериментальных данных был сделан вывод, что использование ареактогененных для человека вакцинных штаммов, полученных на базе одного ХА донора аттенуации и объединенных в эквивалентных дозах, является основным условием обеспечения безопасного и эффективного применения дивакцины из реассортантов вируса гриппа А [74, 75, 102]. На модели РКЭ и мышей было показано, что объединение в бивалентный препарат аттенуированных вакцинных штаммов подтипов А(Н5Ы2) и А(НШ1) является безопасным судя по отсутствию взаимного усиления патогенности вирусов для подопытных животных, находящему подтверждение в невозможности выделения потенциально более вирулентных реассортантов подтипа А(Н5М1) при совместном культивировании упомянутых штаммов в развивающихся куриных эмбрионах. Негативным следствием взаимодействия вирусов А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5Ы2) и А/17/Новая Каледония/99/145(НШ1), взятых в эквивалентных дозах, при коинфекции различных чувствительных систем было одностороннее подавление репродукции и угнетение иммуногенности последнего. Включение реассортанта подтипа А(Н5И2) в состав поливалентной вакцины оказалось недостаточно эффективным по причине снижения его иммуногенности, тогда как изменения уровня сывороточных антител к остальным компонентам препарата или увеличения патогенности смеси вирусов на мышиной модели не наблюдалось.

В ряде лабораторий развитых стран проводятся работы по созданию и апробации ИГВ подтипа Н5. По результатам работ исследовательских лабораторий и немногочисленных пока клинических испытаний показана безвредность и низкая реактогенность разрабатываемых вакцин, однако в целом ряде исследований вакцинные штаммы, содержащие гемагглютинин вирусов Н5, демонстрировали низкую иммуногенность для подопытных животных и людей. Помимо увеличения антигенной • нагрузки при использовании ИГВ до 90 мкг гемагглютинина и применения адьювантов, одним из предложенных решений данной проблемы было двукратное введение препарата, значительно повышающее количественные параметры поствакцинального иммунного ответа. В нашем исследовании была рассмотрена возможность комбинированного применения двух типов гриппозных вакцин на основе штамма А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5Н2). Ранее в исследовании по сочетанному применению тривалентной ЖГВ и ИГВ, включающих реассортантные штаммы современных эпидемических вирусов, у престарелых было показано, что вакцинация ИГВ с последующей ревакцинацией ЖГВ позволяла добиться интенсивного и сбалансированного иммунного ответа сывороточных и локальных антител. В эксперименте на I мышах было установлено, что данная схема иммунизации штаммом А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5Н2) позволила добиться повышения интенсивности гуморального иммунного ответа и сочетанности продукции в смывах верхних дыхательных путей и антител в сыворотке крови. Применение подобной схемы иммунизации в случае начала пандемии позволит также прийти к компромиссу по затрате материальных и временных ресурсов, если ситуация потребует быстрого наращивания производственных мощностей, учитывая необходимость двукратного введения вакцины нового подтипа.

Библиография Диссертация по биологии, доктора медицинских наук, Дешева, Юлия Андреевна, Санкт-Петербург

1. Г.И. Александрова. Аттенуированный холодоадаптированный штамм вируса гриппа, используемый для производства живой интраназальной гриппозной вакцины // Патент СССР № 2078817 от 10.15.97

2. Александрова Г.И. Этиология, иммунология и специфическая профилактика гриппа (разработка живой вакцины против гриппа для детей) // Дисс.доктора мед. наук.- Л.- 1969.- 419 с.

3. Александрова Г. И. Живая гриппозная вакцина в СССР, разработка, изучение и практическое использование // Новое в эпидемиологии и профилактике вирусных инфекций, Ленинград.-1986.- С. 66-83.

4. Александрова Г. И. Применение метода генетической рекомбинации для получения вакцинных штаммов вируса гриппа // Вопр. Вирусол.-1977.-№4.- С. 387-395.

5. Александрова Г.И., Дехтярева Н.И., Голубев Д.Б. и др. Опыт селекции безвредных термочувствительных рекомбинантов вируса гриппа А // Вопр. Вирусологии,-1979.-№ 12.- С. 342-346.

6. Александрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа. СПб.: Наука.- 1994.- 151 с.

7. Александрова Г.И., Шапошникова Р.П., Смородинцев A.A. Живая гриппозная вакцина для детей (Итоги лабораторных и эпидемиологических испытаний в 1961-1970 гг.) В кн.: Иммунология и специфическая профилактика гриппа у детей // Ленинград. 1971. - С. 21-45.

8. Александрова Г.И., Микуцкая Б.А., Сиротенко Е.А. и др. Итоги изучения специализированного варианта живой гриппозной вакцины для иммунизации детей дошкольного и младшего школьного возраста// Вестник АМН СССР. — 1968.-№9.-С.41-45.

9. Амвросьева Т.В., Иткин З.Б., Склянская Е.И. Синтез вирусспецифических белков при смешанной инфекции, вызванной различными штаммами вируса гриппа А и В // Вопросы вирусологии.-1983.-№ 4.-е. 90-96.

10. Бакулин В. А. Эпизоотолого-эпидемиологические аспекты гриппа птиц // Зооиндустрия.- 2005.- №12.-С. 4-8.

11. Беляева Н.М., Сиротенко Е.А., Гефт P.A. и др. Сравнительная характеристика реактогенных и иммуногенных свойств дополнительно ослабленной живой гриппозной вакцины при интраназальном и пероральном введении детям // Педиатрия. 1969. - № 12. - С. 17-23.

12. Бичурина М.А., Ползик Т.П., Михайлова Г. Н. и др. Корреляция между сывороточными и секреторными антителами у привитых хроматографической гриппозной вакциной // Этиология и специфическая профилактика гриппа.-Л.Д979.-С. 75-82.

13. Бурцева Е.И. Слепушкин А.Н., Белякова А.Л. и др. Выбор оптимальных схем в тактике вакцинации против гриппа пожилых людей // ЖМЭИ.- 1998.-4. р. 40-44.

14. Бурцева, Е. И., Шевченко Е.С., Ленева И.А. Чувствительность к ремантадину и арбидолу вирусов гриппа, вызвавших эпидемические подъемы заболеваемости в России в сезоне 2004—2005 гг. // Вопросы вирусологи.-2006.-№ 5.-С. 24-29.

15. Гамбарян A.C., Маринина В.П., Солодарь Т.А. и др. Различная рецепторная специфичность вирусов гриппа уток и кур и ее отражение в составе сиалозидов на хозяйских клетках и муцинах // Там же.- №4,- С. 24-31.

16. Гамбарян A.C., Ямникова С.С., Львов Д.К. и др. Сравнение рецепторной специфичности вирусов гриппа А, выделенных от уток, кур и человека // Молекулярная биология.-2002.-Т. 36.-№ 3.- С. 542-549.

17. Гармашова Л.М., Гущина М.И., Егоров А.Ю., Александрова Г.И. Различия в температурном диапазоне репродукции вирулентных и аттенуированных холодоадаптированных вирусов гриппа А // Вопр. вирусологии.-1989.-№4.-С 411-415.

18. Гармашова Л.М., Полежаев Ф.И., Александрова Г.И. Холодоадаптированный штамм А/Ленинград/134/47/57(H2N2) специальный донор аттенуации живой гриппозной вакцины для детей и полученные на его основе рекомбинанты // Там же.-1984.-№1.- С. 28-31.

19. Гендон Ю. 3. Проблемы профилактики гриппа у маленьких детей // Там же.-2006,-№2,-С. 4-10.

20. Гендон Ю.З, Маркушин Ю.З., Акопова И.И. и др. Разработка культуральной живой холодоадаптированной реассортантной гриппозной вакцины // Там же.-2003.-№2,- С. 12-17.

21. Гендон Ю.З., Климов А.И., Лисовская К.В. Молекулярно-генетический анализ холодоадаптированного штамма донора аттенуации для живой гриппознй вакцины для детей: его рекомбинантов и изолятов от вакцинированных детей // Там же.-1984.-Т. 29.-С. 22-23.

22. Гольдфарб В.Э. Опыт подготовки аттенуированных вакцинных штаммов вируса гриппа для активной иммунизации детей младшего школьного и дошкольного возраста. Автореф. дисс. . канд. мед. наук.- Л., 1972.-19 с.

23. Григорьева Е.П., Дорошенко Е.М., Руденко Л.Г. Вакцинопрофилактика гриппа с помощью живой гриппозной вакцины // Эпидемиология и вакцинопрофилактика.- 2005.- Т. 23.- № 4.- С. 1-4.

24. Гущина М.И. получение холодоадаптированных рекомбинантных штаммов для живой гриппозной вакцины типа А для детей, автореф. дисс. канд. биол. наук.- Л. 1989,- 20 с.

25. Донина С.А. Локальный иммунный ответ и функциональная активность антител при гриппозной инфекции и иммунизации гриппозными вакцинами: Автореф. дисс. канд. мед. наук.-СПб., 1997.-20 с.

26. Донина С.А., Найхин А.Н., Петухова Г.Д. и др. Системный гуморальный и клеточный иммунный ответ при экспериментальной гриппозной инфекции и вакцинации //Медицинская иммунология.-2006.-Т, 8.-№ 1.- С. 3-4.

27. Егоров А.Ю., Гармашова Л.М., Лукашок И.В. и др. Ген N8 вероятная детерминанта апатогенности холодоадаптированного донора аттенуации А/Ленинград/134/47/57(Н2№) и его реассортантов // Вопр. Вирусологии.-1994.- Т. 39.-№5.-С. 201-205.

28. Егоров А.Ю., Гармашова Л.М., Неведомская Г.Н. и др. Иммуногенность для мышей аттенуированных реассортантов вируса гриппа А/Ленинград/134/47/57(Н2Ы2) в зависимости от состава их генома // Там же.-С. 198-201.

29. Егоров АЛО., Лисовская К.В. Высокорепродуктивные температурочувствительные рекомбинанты вируса гриппа А // Новое в эпидемиологии и профилактике вирусных инфекций, Ленинград.-1986.-С. 117-124.

30. Жданов В.М., Александрова Г.И., Гендон 10.3 Живая гриппозная рекомбинантная вакцина в СССР: разработка, изучение и практическое использование//ЖМЭИ.-1986.-№ 7.-С. 3-13.

31. Жилинская И.Н., Козлов Ю.В., Курманова А.Г. и др. Изменения в структуре М- и 1М8-генов в процессе аттенуации вируса гриппа // Доклады АН СССР.-1982.-Т. 267.-№ 5.-С. 1240-1243.

32. Жихарева И.В., Медведева Т.Е., Александрова Г.И., Климов А.И. 1з-мутации в геноме холодоадаптированных вариантов вирусов гриппа А/Гонконг/1 /68(НЗК2) и А/Виктория/35/72(ШШ) // Генетика.-1993.-Т.29.-№ 5.-С. 853-861.

33. Зазимко JI.A. Вирулентность вируса гриппа А для человека: генетические аспекты ее наследования при реассортации эпидемических и аттенуированных вариантов: Автореф.дисс. . д-ра мед. наук.-М. 1987.-41с.

34. Зверев В.В., Катлинский A.B., Костинов М.П. и др. Результаты сравнительного клинического исследования вакцин против вируса гриппа птиц // ЖМЭИ.-2007.-№ З.-Р. 10-16.

35. Зыков М.П., Васильева Р.И. Вакцинопрофилактика гриппа у детей // Проблемы медицинской вирусологии. 1982. - Т. 58. - С. 30-38.

36. Каверин Н.В., Смирнов Ю.А. Межвидовая трансмиссия вирусов гриппа А и проблема пандемий // Вопр. вирусологии.-2003.-№ 3.- С.4-10.

37. Киселев О.И., Блинов В.М., Писарева М.М. и др. Изоляты вируса гриппа подтипа A H5N1, выделенные от домашней птицы в Курганской области в 2005 году: молекулярно-генетическая характеристика // Молекулярная биология.-2008,- Т. 42.-№. 1.- С. 78-87.

38. Киселева И.В. Основы аттенуации вируса гриппа: Дисс. . докт. биол. наук -Санкт-Петербург., 2001.-224 с.

39. Киселева, И. В., Ларионова Н.В., Исакова И.Н., Руденко Л.Г. Генетическая стабильность холодоадаптированных вирусов гриппа // Там же.- 2006.- Т. 51.-№ 4.-С. 13-16.

40. Климов А. И., Йотов В. В. Особенности мутационных изменений геномной РНК холодоадаптированных и hr-вариантов вируса гриппа А. выявляемые методом РНЗС.РНК гибридизации // Мол. генетика, микробиология и вирусология.-1990.-№ 111.-С. 18-21.

41. Кузнецов O.K., Степанова Л.А., Коротков A.B. Особенности вакцинопрофилактики гриппа // Эпидемиология и профилактика.-2006.-Т.26.-№ 1.-С. 3-8.

42. Кузнецов* O.K. Применение гриппозных вакин в периоды угрозы и развития пандемии // Там же.-2007. Т.32.-№ 1.-С. 31-36.

43. Ленева И.А., Шустер A.M. Противовирусные этиотропные химиопрепараты: эффективность против вирусов гриппа А подтипа H5N1 // Вопросы вирусологи.-2006.-№5.- С. 4-8.

44. Липатов A.C., Смирнов Ю.А., Каверин Н.В., Вебстер Р. Г. Эволюция вирусов птичьего гриппа H5N1 (1997-2004) в Южной и Юго-восточной Азии // Там же.-2005.-Т.50.-№ 4.- С. 11-17.

45. Лисовская К.В., Гармашова Л.М., Медведева Т.Е. Анализ мутаций холодоадаптированных вариантов вируса гриппа А/Ленинград/134/57 // Acta virol.-1981.-Vol. 25.-№ 6.-Р. 415-417.

46. Львов Д.К., Федякина И.Т., Щелканов М.Ю., и др. Действие in vitro противовирусных препаратов на репродукцию высокопатогенных штаммов вируса гриппа A/H5N1, вызвавших эпизоотию среди домашних птиц летом 2005 г. // Там же.- С. 20-22.

47. Медведева Т.Е., Кудрявцева В.К., Неведомская Г.Н. и др. Роль отдельных генов в проявлении фенотипических свойств холодоадаптированного штамма А/Ленинград/47/57(Н2К2) донора аттенуации живых гриппозных вакцин // Генетика.-1993.-Т.29.-№ 4,- С. 681-691.

48. Медведева Т.Е., Романова Ю.Р., Гущина М.И. и др. ts-феиотип реизолятов от детей, привитых живой гриппозной вакциной типа А // Вопр. Вирусологии.-1990.-№2.-С. 101(13)-105(17).

49. Методические указания к работе опорных баз Всесоюзного Центра по гриппу и ОРЗ.-Л., 1987.-С.146-150.

50. Найхин А.Н., Артемьева С.А., Ермачепко Т.А. и др. Функциональная активность антител при иммунизации гриппозными вакцинами // Вопр. Вирусологии.- 1993.-№5.-С. 204-207.

51. Найхин А.Н., Рекстин А.Р., Кац Д. и др. Продукция интерлейкина-2 in vitro и in vivo у пожилых людей, привитых раздельно и сочетанно живой и инактивированной гриппозными вакцинами // Вопр.вирусологии.- 2000.-Т. 45.-№1.-С. 25-29.

52. Найхин А.Н., Рекстин А.Р., Кац Д. и др. Пролиферативная активность лимфоцитов пожилых людей in vitro при раздельной и сочетанной иммунизации живой и инактивированной гриппозными вакцинами // Вопр. Вирусологии.- 2000.-Т.45- №2.-С.41-45

53. Найхин А.Н., Руденко Л.Г., Арден Н. и др. Иммунный ответ лиц пожилого возраста в зависимости от числа ежегодных сезонных иммунизаций живой и инактивированной гриппозными вакцинами // Вопр.вирусологии.-1998.- Т. 43. №3. С. 130-134.

54. Найхин А.Н., Петухова Г.Д., Баранцева И.Б. и др. Апоптоз и пролиферация лимфоцитов назоассоциированной лимфоидной ткани и селезенки при экспериментальной гриппозной инфекции и вакцинации // Цитокины и воспаление.-2006.-№ 3.- С. 34-39.

55. Онищенко Г.Г. Ситуация по гриппу птиц, вызванному высокопатогенным вирусом гриппа A/H5N1, в странах Азии, Африки и европы в 2007 году // ЖМЭИ.-2008.-№ 4.-С.37-42.

56. Онищенко Г.Г., Зверев В.В., Катлинский A.B. и др. Тетравакцина — новый принципиальный подход к предотвращению пандемии гриппа // ЖМЭИ.-2007.-№ 4.-С. 15-19.

57. Плешанова P.A., Микуцкая Б.А., Иванова Т.П. и др. Реактогенные свойства вируса гриппа в зависимости от температурных условий культивирования // В кн. Ежегодник ИЭМ АМН СССР.- 1967. XI. - В.5. - С. 48-53.

58. Полежаев Ф.И. Живая рекомбинантная вакцина против гриппа: Дисс. . доктора мед. наук. Ленинград, 1983.- 387 с.

59. Приймяги Л.С., Шадрин A.C., Васильева Р.И. Защита детей от гриппа и других острых респираторных заболеваний. Таллинн.:Валгус,1987.- 232 с.

60. Приказ № 156/29 Министерства Здравоохранения российской Федерации от 07.05.1998 «О подготовке новых вакцинных производственных и диагностических штаммов вируса гриппа и их внедрении в производство вакцинных и диагностических препаратов».-1998.

61. Приказ № 266 Министерства Здравоохранения Российской Федерации от 19.06.2003 «Правила клинической практики в Российской Федерации».-2003.

62. Радаева И.Ф., Колокольцова Т.Д., Нечаева Е.А. и др. Создание и аттестация баков перевиваемой культур клеток MDCK для поизводства гриппозной вакцины // Вопр. вирусологии.-2005.- Т. 50.-№ 2.- С. 43-46.

63. Романова Ю.Р. Принципы конструирования дивакцин из холодоадаптированных рекомбинантов вируса гриппа А: Дисс. . канд. мед. наук.- Л„ 1988.-134 с.

64. Романова Ю.Р., Александрова. Г.И. Интерференция и ее преодоление при репродукции двух штаммов вируса гриппа А в эксперименте // Вопр. вирусологии.- 1993.-Т. 38.-№4,- С. 149-152.

65. Романова Ю.Р., Егоров А.Ю., Лисовская К.В. и др. Эффект усиления репродукции вируса гриппа в легких мышей при одновременном инфицировании двумя холодоадаптирванными штаммами // Вопр. вирусологи.- 1989.-Т. 34.-№ 5.- С. 547-553.

66. Руденко Л.Г., Григорьева Е.П., Дриневский В.П. и др. Итоги изучения живой гриппозной интраназальной вакцины при иммунизации детей 3-15 лет // ЖМЭИ.-1988.-№ 5.-С. 41-46.

67. Руденко Л. Г., Селиванов A.A., Икрамов Н.В. и др. Влияние повторной иммунизации инактивированными гриппозными вакцинами на формирование специфического и неспецифических факторов иммунитета // ЖМЭИ.-1984.-№ 12.-С. 98-101.

68. Руденко Л.Г. Пути повышения эффективности вакцинопрофилактики гриппа в СССР: Дисс. . д-ра.мед.наук.- Л., 1984.- 410 с.

69. Руденко Л.Г., Зыков М.П. Вакцинопрофилактика гриппа у лиц с хронической патологией//ЖМЭИ.- 1982.-N« 10.- С. 10-14.

70. Руденко Л.Г., Зыков М.П. Защита от гриппа людей с хронической патологией // Вр. дело.-1981.-№ 12.- С. 8-11.

71. Руденко Л.Г., Рамирес А, Барро М. Прививочные свойства живой гриппозной рекомбинантной вакцины типов А и В при раздельном и совместномприменении детям 3-14 лет // Вопр. вирусологии.- 1991.- Т. 36.- № 6.- С. 472474.

72. Руденко Л.Г., Шварцман Я.С., Исполатова A.B. и др. Основные характеристики живой гриппозной вакцины для детей из штаммов вирусов гриппа A(H1N1) и A(H3N2) при раздельном и совместном их применении // Вопр. вирусологии. 1989. - № 1. - С. 29-34.

73. Руднева И. А., Каверин Н. В., Тимофеева Т. А. и др. Оптимизация генного состава реассортантов, содержащих геммаглютинин вируса гриппа подтипа Н5, и их эффективность в опытах перекрестной иммунной защиты // Вопр. вирусологии 2008. - № 1. - С. 24-27.

74. Сиротенко Е.А., Галкина М.В., Малина М.В. и др. Итоги изучения клинических реакций у детей, привитых дополнительно ослабленной живой гриппозной вакциной // В кн.: Иммунология и специфическая профилактика гриппа у детей.- Ленинград, 1971.-С. 45-58.

75. Слепушкин А.Н., Бурцева Е.И., Шамшева О.В. и др. Реактогенность и иммуногенность вакцины гриппол у детей младшего школьного возраста (611 лет) // Новости науки и техники.-1999.-№ 5.- С. 3-7.

76. Смородинцев A.A. Грипп и его профилактика.- Москва:Медицина,1984.- 382 с.

77. Смородинцев A.A. Пути усовершенствования вакцинопрофилактики гриппа // Новое в эпидемиологии и профилактике вирусных инфекций.- Л., 1986.-С.84-89.

78. Смородинцев A.A., Чалкина О.М. Активная иммунизация против гриппа вакциной из живого ослабленного вируса // Советский врач.-1949.-№15.- С.16-29.

79. Смородинцев A.A., Чалкина О.М. Основные принципы конструирования живой вакцины против гриппа // В кн.: Вопросы патогенеза и иммунологии вирусных инфекций,- Л.Д955.-С.329-344.

80. Соминина A.A., Сорокин Е.В., Царева Т.Р. Вирус гриппа A(H5N1) как один из вероятных возбудителей предстоящей пандемии // Цитокины и воспаление. 2006. - Т. 5. - № 1.-С. 3-10.

81. Фармакопейная Статья на «Вакцину гриппозную аллантоисную интраназальную живую сухую» // ФСП 42-0504-4097-04.-2004.-12 с.

82. Хаитов P.M., Некрасов P.M., Пушкова Н.Г. и др. Эпидемиологическая и экономическая эффективность иммунизации вакциной Гриппол при гриппе и ОРВИ у взрослых и детей // ЖМЭИ.- 2003.-№3.-С. 83-86.

83. Чиркова Т.В., Найхин А.Н., Донина С.А. и др. Продукция общих и вирусспецифических IgE у детей и пожилых людей, иммунизированных живой гриппозной вакциной // Аллергология.- 2006.- №3.-С. 17-21.

84. Чиркова Т.В., Найхин А.Н., Донина С.А. и др. Продукция сывороточных и локальных IgE у молодых людей при гриппозной инфекции и иммунизации живой гриппозной вакциной // Аллергология.-2006.-№1.-С. 33-37.

85. Шадрин А.С., Карпухин Г.И., Дударев А .Я. и др. Сравнительная оценка эффективности массового применения живых и инактивированных гриппозных вакцин // М-лы 3-го Сов.-Фр. Симпозиума «Вакцинопрофилактика и иммунология гриппа».- Л., 1980.- С. 48-56.

86. Шварцман Я.С., Аграновская Е.Н., Григорьева С.К. и др. Участие секреторных антител в защите от гриппа// ЖМЭИ.- 1997.- №9.-С. 53-56.

87. Шварцман Я.С., Шуратов И.Х., Найхин А.Н. и др. Иммунология гриппа.-Алма-Ата: Наука, 1985.-144 с.

88. Alexander D. J. An overview of the epidemiology of avian influenza // Vaccine. 2007.- Vol.25.- 1. 30.- P. 5637-5644.

89. Alexandrova G.I., Smorodintzev A.A. Obtaining of an additionally attenuated vaccinating cryophil influenza strains // Rev. Roum. D4nframicrobiol.-1965.-Vol. 2.-№3.- P. 179-186.

90. Alexandrova, Budilovsky, G. N., Coval T.A., et al. Study of live recombinant cold-adapted influenza bivalent vaccine of type A for use in children: an epidemiological control trial // Vaccine. 1986. - Vol. 4. - № 2. - P. 114-118.

91. Almond, J. W. A single gene determines the host range of influenza virus // Nature.-1977.- Vol. 270.- P. 617-618.

92. Banks J, Speidel E.S., Moore E. et al. Changes in the gaemagglutinin and the neuraminidase genes prior to the emergence of highly pathogenic H7N1 avian influenza vims in Italy // Arch. Virology.- 2001.- Vol. 146.- № 5.-P. 963-973.

93. Bao Y., Bolotov P., Dernovoy D., et al. The Influenza Virus Resource at the National Center for Biotechnology Information // J. of Virology.- 2008.- Vol. 82.-№ 2.-P. 596-601.

94. Baum, L. G., Paulson J. C. The N2 neuraminidase of human influenza virus has acquired a substrate specificity complementary to the hemagglutinin receptor specificity // Virology.- 1991.- Vol. 180.-P. 10-15.

95. Bean W.J., Cox N.J., Kendal A. P. Recombination of human influenza A viruses in nature // Nature.- 1980. Vol. 284.- P. 638-640.

96. Beard C.W., Brugh M., Webster R.G. Emergence of amantadine-resistant H5N2 avian influenza virus during a simulated layer flock treatment program // Avian Dis.- 1987.- Vol. 31.- P. 533-537.

97. Beare A.S., Kendal A.P., Schild G.C. Trials of live influenza A recombinants in man during natural antigenic change in 1971-1976 // Med. Microbiol. Immunol. -1978.- Vol. 166.- i.1-4.- P. 91-98.

98. Beare A.S., Webster R.G. Replication of avian influenza viruses in humans // Arch. Virol. 1991.- Vol. 119.- P. 37-42.

99. Becker W. B. The isolation and classification of tern virus: influenza virus A/Tern/South Africa/61 // J. Hyg.- 1966. Vol. 64.- P. 309-320.

100. Beigel J.H., Farrar J., Han A.M. et al. Avian influenza A(H5N1) infection in humans//N. Eng. J. of Med.- 2005.- Vol. 353.-№ 13.-P.1374-1385.

101. Belshe R.B., Anderson, E.L., Newman, F., et. al. Immunization of infants and young children with live attenuated trivalent cold recombinant influenza A H1N1 and H3N2 and B vaccine // J. Infect. Dis. -1992.- Vol. 165.-P. 727-732.

102. Belshe R.B., Gruber W.C., Mendelman P.M., et al. Correlates of immune protection induced by live, attenuated, cold-adapted, trivalent, intranasal influenza virus vaccine // J. Infect. Dis.-2000.-Vol. 181.-P. 1133-1137.

103. Bender C., Hall Ii., Huang J., et al. Characterization of the surface proteins of influenza A (H5N1) viruses isolated from human in 1997-1998 // Virology.- 1999.-Vol. 254,-P. 115-123.

104. Bernstein D.I., Edwards K.M., Dekker C.L., et al. Effects of adjuvants on the safety and immunogenicity of an avian influenza H5N1 vaccine in adults // J. Infect Dis.- 2008.- Vol. 197.-№5.-P. 667-675.

105. Boyce T.G., Gruber W.C., Coleman-Dockery S.D. et al. Mucosal immune response to trivalent live attenuated intranasal influenza vaccine in children // Vaccine.-2000.-Vol. 18.-P. 82-88.

106. Braam J., Ulmanen I., Krug R.M. Molecular model of a eucaryotic transcription complex: functions and movements of influenza P proteins during capped RNA-primed transcription // Cell. 1983.- Vol. 34.- № 2.- P. 609-618.

107. Bradford M.M. A rapid and sensitive methods for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem.-1976.-Vol. 72.-№ 1-2.-P. 248-254.

108. Bright R.A., Carter D.M., Crevar C.J. // Cross-clade protective immune responses to influenza viruses with H5N1 HA and NA elicited by an influenza virus-like particle // PLoS ONE. 2008.- Vol. 30.- 3.- № 1.- P. el501.

109. Brown E.G. Liu H., Chang Kit L. et al. Patterns of mutation in the genome of influenza A virus on adaptation to increased virulence in the mouse lung: identification of functional themes // Proc. Natl. Acad. Sei. USA.- 2001 Vol. 98-P. 6883-6888

110. Brühl P., Kerschbaum A., Kistner O., et al. Humoral and cell-mediated immunity to vero cell-derived influenza vaccine // Vaccine. -2000.- Vol. 19.- I. 9-10.- P. 1149-58.

111. Buxton Bridges C, Katz J.M., Seto W.H., et al. Risk of influenza A (H5N1) infection among health care workers exposed to patients with influenza A (H5N1), Hong Kong // J. Infect. Dis.- 2000.- Vol. 181.- P. 344-348.

112. Calfee D.P., Hayden F.G. New approaches to influenza chemotherapy— neuraminidase inhibitors // Drugs.- 1998. -Vol. 56.- P. 537-553.

113. Cameron K.R, Gregory V., Banks I. et al. H9N2 subtype influenza A viruses in poultry in Pakistam are closely related to the H9N2 viruses responsible for human infection in Hong Kong // Virology. 2000. - Vol. 278. - P.36-41

114. Campitelli L., Donatelli I., Foni E., et al. Continued evolution of FI1N1 and H3N2 influenza viruses in pigs in Italy // Ibid.- 1993,- Vol. 193,- P. 453-457.

115. Castrucci M. R., Campitelli L., Ruggieri A., et al. Antigenic and sequence analysis of H3 influenza virus haemagglutinins from pigs in Italy // J. Gen. Virol. 1994.-Vol. 75.-P. 371-379.

116. Centers for Disease Control and Prevention. Prevention and control of influenza: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices (ACIP) // MMWR.- 1998.-Vol. 47.-P. 1-26.

117. Centers for diseases control and prevention. Cases of Influenza A (H5N1), Thailand, 2004 // MMWR- 2004.- Vol. 5,- P. 100-103.

118. Cha T., Kao K., Zhao J. et al. Genotypic stability of cold-adapted influenza virus vaccine in an efficacy clinical trial //J. of Clinical Microbiology.-2000.-Vol. 38.-№ 2.-P. 839-845.

119. Channock R.M., Murphy B.R. Use of temperature-sensitive and cold-adapted mutant viruses in immunoprophylaxis of acute respiratory tract disease // Rev. Infect. Dis.-1980.-Vol. 2,- № 3.-P. 421-432.

120. Chen H, Smith G.J., Li K.S. Establishment of multiple sublineages of H5N1 influenza virus in Asia: Implications for pandemic control // PNAS USA. 2006.2845-2850.

121. Chen H., Matsuoka Y., Chen Q. et. al. Generation and characterization of an H9N2 cold-adapted reassortant as a vaccine candidate // Avian Dis — 2003- Vol. 47.- Suppl. 3.-P. 1127-1130.

122. Chen H., Subbarao K., Swayne D. et al. Generation and evaluation of a high-growth reassortant H9N2 influenza A virus as a pandemic vaccine candidate // Vaccine.- 2003.- Vol. 21.- P. 1974-1979.

123. Chen K.S., Burlington D.B., Quinnan Jr G.V. Active synthesis of hemaglutinin-specific immunoglobulin A by lung cells of mice that were immunized intragastrically with inactivated influenza virus vaccine // J Virol.- 1987.- Vol. 61.-№>7.-P. 2150-2154.

124. Chou P.Y., Fasman G.D. Prediction of protein conformation // Biochemistry. -1974,-Vol. 13,-№2.-P. 222-245. ■ ■

125. Claas E. C. J., Y. Kawaoka J. C., De Jong N., et al. Infection of children with avian-human reassortant influenza virus from pigs in Europe // Virology.-1994.-Vol. 204.- P. 453^457.

126. Claas E., Osterhaus A., van Beek R. et al. Human influenza A H5N1 virus related to a highly pathogenic avian influenza virus // Lancet. 1998. - Vol. 351. - P. 472477.

127. Clements M.L., Betts R.F., Tierney E.L., Murphy B.R. Serum and nasal wash antibodies associated with resistance to experimental challenge with influenza A wild-type virus//J. Clin. Microbiol.- 1986.-Vol. 24.-P. 157-160.

128. Clements M.L., Murphy B.R. Development and persistence of local and systemic antibody responses in adults given inactivated influenza virus vaccines-1978 // Rev. Infect. Dis.-1983.-Vol. 5.-№4.- P.737-747.

129. Cockburn W.C., Delon P.J., Ferreira W. Origin and progress of the 1968-1969 Hong Kong influenza epidemic // Bull. WHO.-1969. Vol. 41.- P. 345-353.

130. Coleman J.R. The PB1-F2 protein of Influenza A virus: increasing pathogenicity by disrupting alveolar macrophages // Virol. J.- 2007.- 4:9.

131. Conenello G.M., Zamarin D., Perrone L.A., et. al. A single mutation in the PB1-F2 of H5N1 (HK/97) and 1918 influenza A viruses contributes to increased virulence//PLoS Pathogens.-2007.-Vol. 3.-№ 10.-P. 1414-1421.

132. Couch R.B., Kasel J.A. Immunity to influenza in man // Annu. Rev. Microbiol.-1983.- Vol. 37.- P. 529-549.

133. Cox N.J., Kitame F., Kendal A.P., et al. Identification of sequence changes in the cold-adapted, live attenuated influenza vaccine strain, A/Ann Arbor/6/60 (H2N2) //Virology.- 1988.-Vol. 167.-P. 554-567.

134. Cox R.J., Brokstad K.A., Ogra P. Influenza virus: immunity and vaccination strategies: comparison of the immune response to inactivated and live, attenuated influenza vaccines//Scand. J. Immunol.- 2004.-Vol. 59.-p.l-15.

135. De la Luna S, Martinez C, Ortin J. Molecular cloning and sequencing of influenza virus A/Victoria/3/75 polymerase genes: sequence evolution and prediction of possible functional domains // Virus Res.- 1989 -Vol. 13.- № 2.- P. 143-155.

136. De Borde D.C., Naeve C.W., Herlocher M.L., Maassab H.F. Resolution of a common RNA sequencing ambiguity by terminal deoxynucleotidyl transferase // Anal Biochem.- 1986 .- Vol. 157.- № 2.- P. 275-282.

137. Demicheli V., Jefferson T., Rivetti D., Deeks J. Prevention and early treatment of influenza in healthy adults//Vaccine. -2000. Vol. 18.-P. 957-1030.

138. Edwards L.E., Nguen D.C., Lu X. et al. Antigenic characteristics of recent avian influenza A (H5N1) viruses isolated from humans // Options for the control of Influenza V.-Ed. Y. Kawaoka, Elsevier, 2004,- P. 109-113.

139. Egorov A., Brandt S., Sereinig S., et al. Transfectant influenza A viruses with long deletions in the NS1 protein grow efficiently in Vero cells // J. Virol.- 1998.- Vol. 72.-P. 6437-6441.

140. Egorov A.Y., Medvedeva T.E., Polezhaev F.I. et al. Pecularities of obtaining and characterization of a cold-adapted A/PR/8/34 innfluenza virus variant //Acta virol.-1984.-Vol. 28.-№ l.-P. 19-25.

141. Ehrlich H.J., Miiller M., Oh H.M., et al. A clinical trial of a whole-virus H5N1 vaccine derived from cell culture // N. Engl. J. Med. -2008.-Vol. 358.- № 24.- P. 2573-1584.

142. Ellis T.M., Leung C.Y., Chow M.K. et al. Vaccination of chickens against H5N1 avian influenza in the face of outbreak interrupts virus transmission //Avian Pathol.-2004.-Vol. 33.-№ 4.- P.405-412.

143. Els M.C., Air G.M., Murti K. G. et al. An 18 amino acid deletion in an influenza neuraminidase.- Virology.- 1985. -Vol. 142,- P. 241-248.

144. Engering A.J., Cella M., Fluitsma D., et al. The mannose receptor functions as a high capacity and broad specificity antigen receptor in human dendritic cells // Eur. J. Immunol. 1997.- Vol. 9.- P. 2417-2425.

145. Englund J.A., Champlin R.E., Wyde P.R., et al. Common emergence of amantadine- and rimantadine-resistant influenza A viruses in symptomatic immunocompromised adults // Clin. Infect. Dis.- 1998.-Vol. 26.-P. 1418-1424.

146. Epstein, S.L., Kong W.P., Misplon J.A., et al. Protection against multiple influenza A subtypes by vaccination with highly conserved nucleoprotein // Vaccine.- 2005.- Vol. 23,- P. 5404-5410.

147. Ernst W.A., Kim H.J., Tumpey T.M., et al. Protection against HI, H5, H6 and H9 influenza A infection with liposomal matrix 2 epitope vaccines // Ibid.-2006.-Vol. 24.-i 24.- P. 5158-5168.

148. Falcon A.M., Fernandez-Sesma A., Nakaya Y., et al. Attenuation and immunogenicity in mice of temperature-sensitive influenza viruses expressing truncated NS1 proteins //J. Gen.Virol.- 2005.- Vol. 86.-P. 2817-2821

149. Fan J., Liang X., Horton M.S., et al. Preclinical study of influenza A M2 peptide conjugate vaccines in mice, ferrets and rhesus monkeys // Vaccine.-2004.-Vol. 22.-P. 2993-3003.

150. Fedson D.S. Clinical practice and public policy for influenza and pneumococcal vaccination of the elderly // Clin. Geriatr. Med. 1992.- Vol. 8. № 1.- P. 183-199.

151. Fernandez-Sesm A., Marukian S., Ebersole B.J., et al. Influenza virus evades innate and adaptive immunity via the NS1 protein // Journal of virology.- 2006.-Vol. 80.- Vol. 80, № 13.- P. 6295-6304.

152. Fodor E., Devenish L., Engelhardt O.G., et al. Rescue of inluenza A virus from recombinant DNA // Ibid. 1999.-Vol. 73. - №11- P. 9679-9682.

153. Fodor E., Mingay L.J., Crow M. et al. A single amino acid autation in the PA subunit of the influenza virus RNA polymerase inhibits endonucleolytic cleavage of capped RNAs //J. Virol.- 2002.- 76(18): 8989-9001.

154. Fortes P, Beloso A, Ortin J. Influenza virus NS1 protein inhibits pre-mRNA splicing and blocks mRNA nucleocytoplasmic transport // EMBO J.- 1994.- Vol. 13.-№3.- P. 704-712.

155. Foucher R.A., Munster V., Wallenstain A., et al. Characterization of a novel influenza A virus hemagglutinin subtype (HI6) obtained iron black-headed gulls // J. Virology.-2005.-Vol. 79.-№ 5.-P. 2814-2822.

156. Fouchier R.A., Schneeberger P.M., Rozendaal F.W. et al. Avian influenza A virus (H7N7) associated with human conjunctivitis and a fatal case of acute respiratory distress syndrome//PNAS USA. 2004. - Vol. 101.-P. 1356-1361.

157. Gaidet N., Cattoli G., Hammoumi S. et al Evidence of Infection by H5N2 Highly pathogenic avian influenza viruses in healthy wild waterfowl // Plos pathogens.-2008.-Vol.4.-1. 8.- P. el000127

158. Gambaryan A., Webster R, Matrosovich M. Differences between influenza virus receptors on target cells of duck and chicken // Arch. Virol.- 2002.- Vol. 147.- P. 1107-1208.

159. Gao P., Watanabe S., Ito T., et al. Biological heterogeneity, including systemic replication in mice, of H5N1 influenza A virus isolates from humans in Hong Kong //Journal of Virology -1999. Vol. 73.-P. 3184-3189.

160. Gao W., Soloff A.C., Lu X., et al. Protection of mice and poultry from lethal H5N1 avian influenza virus through adenovirus-based immunization // Ibid.- 2006.-Vol. 80.- № 4.-P. 1959-1964.

161. Garcia M, Crawford J.M., Latimer J.W., et.al. Heterogeneity in the haemagglutinin gene and emergence of the highly pathogenic phenotype amongrecent H5N2 avian inluenza viruses from Mexico // J. Gen. Virol.- 1996.-Vol. 77.-P. 1493-1504.

162. Garcia-Sastre, A., Egorov A., Matassov D., S. et al. Influenza A virus lacking the NS1 gene replicates in interferon-deficient systems // Virology.- 1998.- Vol. 252.-P. 324-330.

163. Ghendon Y.Z., Markushin S.G. Akopova I.I., et al. Development of cell culture (MDCK) live cold-adapted (CA) attenuated influenza vaccine // Vaccine.-2005.-4678-4684.

164. Ghendon, Y., S. Markushin, K. Lisovskaya, et al. Extragenic suppression of a ts phenotype during recombination between ts mutants of two fowl plague virus strains with ts mutations in gene 1 // J. Gen. Virol.- 1982. Vol. 62.- P. 239-248.

165. Glezen W.P. Serious morbidity and mortality associated with influenza epidemics //Epidemiol. Rev.- 1982.-Vol. 4.- P. 25-44.

166. Glezen W.P., Couch R.B., Taber L.H., et al. Epidemiologic observations of influenza B virus infections in Houston, Texas, 1976-1977 // Am. J. Epidemiol.-1980.-Vol.111.-P. 13-22

167. González S., Oitín J. Distinct regions of influenza virus PB1 polymerase subunit recognize vRNA and cRNA templates // EMBO J.- 1999.- Vol. 18.- № 13.- P. 3767-3775.

168. Goodwin K., Viboud C., Simonsen L. Antibody response to influenza vaccination in the elderly: a quantitative review // Vaccine.- 2006.- Vol. 24.- P. 1159-1169.

169. Gorman O.T., Bean W.J., Kawaoka Y., Webster R.G. Evolution of the nucleoprotein gene of influenza A virus // J. Virol. -1990.- Vol. 64.- № 4.-P. 14871497.

170. Gorse G.J., Belshe R.B. Enhanced lymphoproliferation to influenza A virus following vaccination of older, chronically ill adults with live attenuated viruses // Scand. J. Infect. Dis.- 1991.- Vol. 23.- P. 7-17.

171. Gorse G.J., Bleshe R.B. Munn N.J. Superiority of live attenuated compared to inactivated influenza A virus vaccines in older, chronically ill adults // Chest.-1991.- Vol. 100.-P. 977-984.

172. Gorse G.J., O'Connor T.Z., Newman F.K., et al. Immunity to influenza in older adults with chronic obstructive pulmonary disease // J. Infect. Dis.-. 2004.-Vol. 190.-p. 11-19.

173. Gorse G.J., Otto E.E., Powers D.C. et al. Induction of mucosal antibodies by live attenuated and inactivated influenza virus vaccines in the chronically ill elderly // J. Infect.Dis. 1996.- Vol. 173,- № 2.- P.-285-290.

174. Goto H., Kawaoka Y. A novel mechanism for the acquisition of virulence by a human influenza A virus // PNAS USA.- 1998.- Vol. 95.- P. 10224-10228.

175. Gotoh B., Ogasawara T., Toyoda T., et al. An endoprotease homologous to the blood clotting factor X as a determinant of viral tropism in chick embryo // EMBO J. 1990. - Vol. 9.- P. 4189-4195.

176. Govorkova E.A., Rehg J.E., Krauss S., et al. Lethality to ferrets of H5N1 influenza viruses isolated from humans and poultry in 2004 // J. Virol.- 2005.- Vol. 79.-P. 2191-2198.

177. Govorkova E.A., Smirnov Y.A. Cross-protection of mice immunized with different influenza A(H2) strains and challenged with viruses of the same HA subtype//Acta virol. 1997.-Vol. 41.-P. 251-257.

178. Govorkova E.A., Webby R.J., Humberd J., et al. Immunization with reverse-genetic-produced H5N1 influenza vaccine protects ferrets against homologous and heterologous challenge // J. Infect. Dis.- 2006.- Vol. 194.- P. 159-167.

179. Gross P.A., Hermogenes A.W., Sacks H.S., et al. The efficacy of influenza vaccine in elderly persons: a meta-analysis and review of the literature // Ann. Intern. Med. 1995.- Vol. 123.- P. 518-527.

180. Gu J., Xie Z., Gao Z., et al. H5N1 infection of the respiratory tract and beyond: a molecular pathology study // Lancet.- 2007.- Vol. 370.- P. 1137-1145.

181. Guan Y, Shortridge K.F., Krauss S. et al. H9N2 influenza viruses possessing H5Nl-like internal genomes continue to circulate in poultry in southeastern China // J. Virology.- 2000.- Vol. 74.- P. 9372-9380.

182. Guan Y., Peiris J.S., Lipatov A.S., et al. Emergence of multiple genotypes of H5N1 avian influenza viruses in Hong Kong SAR // PNAS 2002.- Vol. 99.- № 13.- P. 8950-8955.

183. Guan Y., Poon L.L., Cheung C.Y. et al. H5N1 influenza: a protean pandemic threat//PNAS USA.-2004.-Vol. 101.-№. 21-P. 8156-8161.

184. Guan Y., Shortridge K.F., Krauss S., et al. Emergence of avian H1N1 influenza viruses in pigs in China // J. Virology. 1996. - Vol. 70.- P. 8041-8046.

185. Guan Y., Shortridge K.F., Krauss S., Webster R.G. Molecular characterization of H9N2 inluenza viruses: were they the donors of the "internal" genes of H5N1 viruses in Hong Kong? // PNAS USA.- 1999.- Vol. 96.- P. 9363-9367.

186. Guo Y., Xu X., Cox N. J. Human influenza A (H1N2) viruses isolated from China //J. Gen. Virol. -1992. Vol. 73.- P. 383-388.

187. Ha Y., Stevens D.J., Skehel J.J., Wiley. D.C. X-ray structures of H5 avian and H9 swine influenza virus hemagglutinins bound to avian and human receptor analogs // PNAS USA.- 2001. Vol. 98.- P. 11181-11186.

188. Hak E., Meijboom M.J., Buskens E. Modelling the health-economic impact of the next influenza pandemic in The Netherlands // Vaccine.- 2006.- Vol. 24.- ii 44-46.-P. 6756-60.

189. Halloran M.E., Ferguson N.M., Eubank S., et al. Modeling targeted layered containment of an influenza pandemic in the United States // PNAS USA.- 2008.-Vol. 105.- № 12.- P. 4639-4644.

190. Halperin S.A., Smith B. Mabrouk T., et al. Safety and immunogenicity of a trivalent, inactivated, mammalian cell culture-derived influenza vaccine in healthy adults, seniors, and children // Ibid.- 2002.-Vol. 20.-P. 1240-1247.

191. Harper S.A., Fukuda K., Uyeki T.M., et al. Prevention and control of influenza. Recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices (ACIP) // MMWR.- 2005.- Vol. 54(RR-8).- P. 1-40.

192. Hatada E.,Takizawa T., Fukuda R. Specific binding of influenza A virus NS1 protein to the virus minus-sense RNA in vitro // J. Gen. Virol. — 1992.- Vol. 73 (Pt 1).-P. 17-25.

193. Hatta M., Gao P., ITalfmann P., Kawaoka Y. Molecular basis for high virulence of Hong Kong H5N1 Influenza A viruses // Science.- 2001.- Vol. 293.- P. 1840-1842.

194. Hatta M., Kawaoka Y. The continued pandemic threat posed by avian influenza viruses in Hong Kong // Trends in Microbiology. 2002. - Vol.10. - № 7. - P. 340344.

195. Hay A. The action of adamantanamines against influenza A viruses: inhibition of the M2 ion channel protein // Semin. Virol. -1992. Vol. 3.- P. 21-30.

196. Hayden F, Klimov A, Tashiro M. Neuraminidase inhibitor susceptibility network position statement: antiviral resistance in influenza A/H5N1 viruses // Antivir Ther. -2005.-Vol. 10.-№ 8.-P. 873-877.

197. Hayden F.G., Belshe R.B., Clover R.D., et al. Emergence and apparent transmission of rimantadine-resistant influenza A virus in families // N. Engl. J. Med. 1989.-Vol. 321.- P. 1696-1702.

198. Hayden F.G., Hay A.J. 1992. Emergence and transmission of influenza A viruses resistant to amantadine and rimantadine // Curr. Top. Microbiol. Immunol.- Vol. 176,-P. 119-130.

199. He X.S., Holmes H.T., Mahmood K. et al. Cellular immune responses in children and adults receiving Inactivated or live attenuated influenza vaccines // J. of virology.-2006.-Vol. 80.-№ 23 .-p. 11756-11766.

200. Hehme N., Engelmann H., Kiinzel W. et al. Pandemic preparedness: lessons learnt from H2N2 and H9N2 candidate vaccines // Med. Microbiol. Immunol.- 2002.- Vol. 191.- P. 203-8.

201. Herlocher M.L., Clavo A.C., Maassab H.F. Sequence comparisons of A/AA/6/60 influenza viruses: mutations which may contribute to attenuation // Virus Res.-1996.-Vol. 42.-№ 11-25.

202. Hiromoto Y., Saito T, Lindstrom S.E., et al. Phylogenetic analysis of the three polymerase genes (PB1, PB2 and PA) of influenza virus // J. of General virology.-2000.-Vol. 81.-P. 929-937.

203. Hoelscher M.A., Garg S., Bangari D.S., et al. Development of adenoviral-vector-based pandemic influenza vaccine against antigenically distinct human H5N1 strains in mice //Lancet.- 2006.- Vol. 367,- P. 475-481.

204. Hoffmann E., Krauss S., Perez D. et al. Eight-plasmid system for rapid generation of influenza virus vaccines // Vaccine.-2002.-Vol. 20.-P. 3165-3170.

205. Hoffmann E., Lipatov A. S., Webby R. J., et al. Role of specific hemagglutinin amino acids in the immunogenicity and protection of H5N1 influenza virus vaccines // PNAS USA.- 2005.-Vol. 102 .- № 36.- P. 12915-12920

206. Hoffmann E., Mahmood K., Chen Z. et al. Multiple gene segments control the temperature sensitivity and attenuation phenotypes of ca B/Ann arbor/1/66 // J. of Virology.-2005.-Vol.79.-№ 17.-P. 11014-11021.

207. Hoffmann E., Stech J., Leneva I., et al. Characterization of the influenza A virus gene pool in avian species in southern China: was H6N1 a derivative or a precursor ofH5Nl?//J. of Virology.-2000 .-Vol. 74.-№ 14.-P. 6309-6315.

208. Honda A., Mizumoto K., Ishihama A. Minimum molecular architectures for transcription and replication of the influenza virus // PNAS USA. 2002.- Vol. 99.-№20.-P. 13166-13171.

209. Horimoto T., Fukuda N., Iwatsuki-Horimoto K., et al. Antigenic differences between H5N1 human influenza viruses isolated in 1997 and 2003 // J. Vet. Med. Sci.- 2004,- Vol. 66.- P. 303-305.

210. Horimoto T., Takada A., Fujii K. et al. The development and characterization of H5 influenza virus vaccines derived from a 2003 human isolate // Vaccine.-2006.-Vol. 24.-i. 17.-P. 3669-3673.

211. Houck P., Hemphill M, LaCroix S, et al. Amantadine-resistant influenza A in nursing homes. Identification of a resistant virus prior to drug use // Arch. Intern. Med.-1995.-Vol. 155.-P. 533-537.

212. Hovden A., Cox R.J., Haaheim L.H. The immune response to H7N1 whole virus vaccine in mice // Options for the control of Influenza V/ Ed. Y. Kawaoka. Amsterdam.: Elsevier, 2004.-P. 636-639.

213. Hulse D.J., Webster R.G., Russell R.J., Perez D.R. Molecular determinants within the surface proteins involved in the pathogenicity of H5N1 influenza viruses in chickens //J. of Virology.- 2004.-Vol. 78.- № 18.- P. 9954-9964.

214. Jadhao S.J., Achenbach J., Swayne D.E., et al. Development of Eurasian H7N7/PR8 high growth reassortant virus for clinical evaluation as an inactivated pandemic influenza vaccine // Vaccine. -2008.-. Vol. 26.-. № 14.- P. 1742-1750.

215. Jin H., Lu B., Zhou H., et al. Multiple amino acid residues confer temperature sensitivity to human influenza virus vaccine strains (FluMist) derived from cold-adapted A/Ann Arbor/6/60 // Virology.- 2003.-Vol. 306.-P. 18-24.

216. Johnson P., Feldman S., Thompson J.M., et al. Immunity to influenza A virus infection in young children: A comparison of natural infection, live cold-adapted vaccine, and inactivated vaccine// J. Infect. Dis.- 1986.- Vol. 154.-P. 121-127.

217. Joseph T., McAuliffe J., Lu B., et al. A live attenuated cold-adapted influenza A H7N3 virus vaccine provides protection against homologous and heterologous H7 viruses in mice and ferrets // Virology.- 2008.- Vol. 378.- № 1.- P. 123-132.

218. Katz J. M., Lu X., Tumpey T.M. et al. Molecular correlates of influenza A(H5N1) virus pathogenesis in mice // J. of Virology.- 2000.-Vol. 74 .- P. 10807-10810.

219. Katz J.M., Lim W., Bridges C.B. et al. Antibody response in individuals infected with avian inflenza A (H5N1) viruses and detection of anti-H5 antibody among household and social contacts //J. Infect. Dis. 1999. - Vol. 180. - P. 1763-1770.

220. Katz J.M., Naeve C.W., Webster R.G. Host cell-mediated variation in H3N2 influenza viruses // Virology.- 1987.- Vol. 156.- P.386-395.

221. Katz J.M., Webster R.G. Efficacy of inactivated influenza A virus (H3N2) vaccines grown in mammalian cells or embryonated eggs // J. Infect. Dis.-1989.-Vol. 160.-P. 1808-1811.

222. Kaverin N.V., Rudneva I.A., Govorkova E.A., et al. Epitope mapping of the hemagglutinin molecule of a highly pathogenic H5N1 influenza virus by using monoclonal antibodies // J. of. Virology.- 2007.- Vol. 81.- № 23.- P. 12911 -12917

223. Kaverin N.V., Smirnov Y.A., Govorkova E.A. et al. Cross-protection and reassortment studies with avian H2 influenza viruses // Arch. Virol.-2000. Vol. 145.-P. 1059-1066.

224. Kawaoka Y., Krauss S., Webster R.G. Avian-to-human transmission of the PB1 gene of influenza A viruses in the 1957 and 1968 pandemics // Ibid. 1989.-Vol. 63.-P.4603-4608.

225. Kawaoka Y., Webster R.G. Evolution of the A/Chicken/Pennsylvania/83 (H5N2) influenza virus//Virology.- 1985.-Vol. 146.-P. 130-137.

226. Kawaoka Y., Webster R.G. Interplay between carbohydrate in the stalk and the length of the connecting peptide determines the cleavability of influenza virus hemagglutinin // J. of Virology.- 1989. Vol. 63.- P. 3296-3300.

227. Kawaoka Y., Webster R.G. Sequence requirements for cleavage activation of influenza virus hemagglutinin expressed in mammalian cells // PNAS USA.- 1988.-Vol. 85.- P. 324-328.

228. Kawaoka, Y. Structural features influencing hemagglutinin cleavability in a human influenza A virus//J. ofVirology. -1991.-Vol. 65.-P. 1195-1201.

229. Keitel W.A., Piedra P.A. Live cold-adapted, reassortant influenza vaccines // In: Textbook of influienza / Nicholson, Webster R.G., Hay A. Eds.- Oxford, UK:Blackwell Science, 1998.- P. 373-390

230. Kendal A. P. Cold-adapted live attenuated influenza vaccines developed in Russia: can they contribute to meeting the needs for influenza control in other countries? //Eur. J. Epid. 1997. -Vol. 13 - P. 591-609.

231. Kendal A.P., Maassab H.F., Alexandrova G.I. et al. Development of cold-adapted recombinant live, attenuated influenza vaccines in USA and USSR // Antiviral Res.- 1981.-Vol. l.-P. 339-365.

232. Kendal A.P., Pereira, M.S., Skehel J. Concepts and procedures for laboratory-based Influenza surveillance // Centers for Disease Control, Atlanta.-1982.-P.B17-B22.

233. Khan A.S., Polezhaev F.I., Vasilijeva R.I. et al. Comparison of US inactivated split-virus and Russian live attenuated, cold-adapted trivalent influenza vaccine in

234. Russian shoolchildren // J. Inf. Dis.-1996.-V. 173.-P. 453-456.

235. Khatchikian, D., Orlich M., Rott R. Increased viral pathogenicity after insertion of a 28S ribosomal RNA sequence into the haemagglutinin gene of an influenza virus //Nature.- 1989. Vol. 340.-P. 156-157.

236. Kilbourne E D. Asian Influenza (H2N2) // Emerg. Infect. Dis.- 1957,- Vol. 12.-№. 1.- P. 9-14

237. Kilbourne E.D., Smith C., Brett I., et al. The total influenza vaccine failure of 1947 revisited:Major intrasubtypic antigenic change can explain failure of vaccine in a post-World War II epidemic // PNAS USA.- 2002.- Vol. 99 .- № 16.- P. 1074810752.

238. Kim H.W., Brandt C.D., Arrobio J.O., et al. Influenza A and B virus infection in infants and young children during the years 1957-1976 // Am. J. Epidemiology.-1979.- Vol. 109.-P. 464-479.

239. King, J. C., Gross, P. A., Denning, C. R. et al. Comparison of live and inactivated influenza vaccine in high risk children // Vaccine.-1987.-Vol. 5,- P. 234—238.

240. Kingsbury D.W., Jones I.M., Murti K.G. Assembly of influenza ribonucleoprotein in vitro using recombinant nucleoprotein // Virology.- 1987.- Vol. 156.- № 2.- P. 396-403.

241. Kistner O., Barrett P.N., Mundt W., et al. Development of a novel mammalian cell (Vero)-derived influenza vaccine.- Vaccine.- 1998.- Vol. 16.- P. 960-968.

242. Klenk H.D., Garten W. Host cell proteases controlling virus pathogenicity // Trends Microbiol.- 1994.- Vol. 2.- P. 39-43.

243. Klimov A.I., Cox N.J. PCR restriction analysis of genome composition and stability of cold-adapted reassortant live influenza vaccines // J. of Virol. Methods.-1995,-Vol. 52.- P. 41-49.

244. Klimov A.I., Cox N.J., Yotov W.V. et al. Sequence changes in the live attenuated, cold-adapted variants of influenza A/Leningrad/134/57 (H2N2) virus // Virology.— 1992.-Vol. 186.-P. 795-797.

245. Klimov A.I., Rudenko L.G., Egorov A.Y., et al. Genetic stability of Russian cold-adapted live attenuated reassortant influenza vaccines // Options for the Control of Influenza III / Eds. L.E. Brown et al.- Elsevier Science, 1996. P. 129-136

246. Koopmans M., Wilbrink B., Conyn M. et al. Transmission of H7N7 avian influenza A virus to humanbeings during a large outbreak in commercial poultry farms in the Netherlands // Ibid.- 2004.- Vol. 363.- P. 587-593.

247. Kuiken T., Rimmelzwaan G., Riel D., et al. Avian H5N1 influenza in cats // Science.- 2004.-Vol. 306.-№ 5694.-P.241.

248. Kung, H.C., Jen K.F., Yuan W.C. Influenza in 1977: recurrence of influenza virus A subtype H1N1 // Bull. WHO.- 1978. Vol. 56.- P. 913-918.

249. Kumar S., Tamura K., Jakobsen I.B., Nei M. MEGA2: molecular evolutionary genetics analysis software // Bioinformatics.- 2001.- Vol. 17.- № 12.- P. 1244-1245.

250. Kurtz J., Manwell R.J., Banks J. Avian influenza virus isolated from a woman with conjunctivitis // Lancet. 1996. - Vol. 348. - P. 901 -902.

251. Li C., Yu K., Tian G., et. al. Evolution of H9N2 influenza viruses from domestic poultry in Mainland China // Virology.- 2005,- Vol. 340.- № 1.- P. 70-83.

252. Li K.S., Guan Y., Wang J. et al. Genesis of a highly pathogenic and potentially pandemic H5N1 influenza virus in Eastern Asia // Nature. -2004. -Vol. 430.-P. 209-213.

253. Li S., Liu C., Klimov A. et al. Recombinant influenza A vims vaccine for the pathogenic human A/Hong Kong/97(H5Nl) viruses // J. Infect. Dis.-1998.- Vol. 179.-№5.-P. 1132-1138.

254. Liang Y., Hong Y., Parslow T.G. cis-acting packaging signals in the influenza virus PB1, PB2, and PA genomic RNA segments // J. of Virology. -2005.-Vol. 79.-№16.-P. 10348-10355.

255. Lin Y.P., Shaw M., Gregory V., et al. Avian-to-human transmission of H9N2 subtype influenza A viruses: Relationship between H9N2 and H5N1 human isolates // PNAS USA.- 2000.- Vol. 97.- P. 9654-9658.

256. Lindstrom S.E., Cox N.J., Klimov A. Genetic analysis of human H2N2 and early H3N2 influenza viruses, 1957-1972: evidence for genetic divergence and multiple reassortment events // Virology.-2004.- Vol. 328.-№1.-P. 101-19.

257. Lipatov A., Webster R. Factors determining the high pathogenicity of Hong Kong H5N1/97 influenza viruses in mammals // Options for the control of Influenza V/ Ed. Y. Kawaoka. Amsterdam. Elsevier, 2004.- P. 59-62

258. Lipatov A.S, Webby R.J., Govorkova E.A., et al. Efficacy of H5 influenza vaccines produced by reverse genetics in a lethal mouse model // J. Infect. Dis.-2005.-Vol.191.-P. 1216-1220.

259. Liu T., Ye Z. Restriction of viral replication by mutation of influenza virus matrix protein//J. ofVirology.-2002.-Vol.76.-P. 13055-13061.

260. Liu W., Zou P., Lu Y. et al. Sequence comparison of the extracellular domain of M2 protein between human and avian influenza A virus provides new information for bivalent influenza vaccine design // Microbes Infect.- 2005.-Vol. 7.-P.171-177.

261. Lu X., Edwards L.E., Desheva J.A., et al. Cross-protective immunity in mice induced by live-attenuated or inactivated vaccines against highly pathogenic influenza A (H5N1) viruses // Vaccine.- 2006.- Vol. 24.- № 44-46.-P.6588-6593.

262. Lu X., Renshaw M., Tumpey T.M., et al. Immunity to influenza A H9N2 viruses induced by infection and vaccination // J. Virology.- 2001.- Vol. 75.-P. 4896-4901.

263. Lu X., Tumpey T.M., Morken T. et al. A mouse model for the evaluation of pathogenesis and immunity to influenza A(H5N1) viruses isolated from humans // J. of Virology.-1999.- Vol. 73,- P. 5903-5911

264. Lund J.M., Alexopoulou L., Sato A., et al. Recognition of single-stranded RNA viruses by Toll-like receptor 7 // PNAS USA.- 2004.- Vol. 101.- № 15.-p. 55985603.

265. Ma W., Vincent A.L., Gramer M.R., et al. Identification of H2N3 influenza A viruses from swine in the United States // PNAS USA. 2007.- Vol. 104.-№ 52.- P. 2049-2054.

266. Maassab H.F. Adaptation and growth characteristic of influenza virus at 25 degrees C//Nature.- 1967.-Vol. 213,- P. 612-614.

267. Maassab H.F. DeBorde, D.C. Development and characterization of cold-adapted viruses for use as live virus vaccine // Vaccine.- 1985.-Vol. 3.- P. 355-369.

268. Maassab H.F., DeBorde D.C., Donabedian A.M., Smotka C.W. Development of cold-adapted "Master" strains for type- B Influenza virus vaccine //In:Vaccines 85.-Cold Springs Harbor Laboratory, 1985.-P. 327-332.

269. Macken C., Lu H., Goodman J., Boyki, L. The value of a database in surveillance and vaccine selection // Options for the Control of Influenza IV/ Eds. A.Osterhaus, N.J Cox , A.W. Hampson.- Amsterdam: Elsevier Science, 2001.-P. 103-106.

270. Maines T.R., Lu X.H., Erb S.M., et al. Avian Influenza (H5N1) viruses isolated from humans in Asia in 2004 exhibit increased virulence in mammals / J. of Virology.-2005.- Vol. 79.- № 18.-P. 11788-11800.

271. Major D.L., Newman R.W., Dunleavy U., et al. Evaluation of H9N2 influenza vaccines in Balb/c mice // Options for the Control of Influenza IV/ Eds. A.Osterhaus, N.J Cox , A.W. Hampson.- Amsterdam: Elsevier Science, 2001 P. 784-794.

272. Makarova N.V., Kaverin N.V., Krauss S., et al. Transmission of Eurasian avian H2 influenza virus to shorebirds in North America // J. Gen. Virol. 1999.- Vol. 80.-( Pt 12.-P. 3167-71.

273. Mann A., Marriott A.C., Balasingam S. et al. Interfering vaccine (defective interfering influenza A virus) protects ferrets from influenza, and allows them to develop solid immunity to reinfection // Vaccine. 2006. - Vol. 24. - № 20.- P. 4290-4296.

274. Martin, K., Helenius A. Nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins: the viral matrix protein (Ml) promotes export and inhibits import // Cell.- 1991. — Vol. 67.-P. 117-130.

275. Mast E.E., Harmon M.W., Gravenstein S., et al. Emergence and possible transmission of amantadine-resistant viruses during nursing home outbreaks of influenza A (H3N2) // Am. J. Epidemiol. -1991.- Vol. 134.- № 9.- P. 988-997.

276. Masuda H., Suzuki I-I., Oshitani I-I., et al. Incidence of amantadine-resistant influenza A viruses in sentinel surveillance sites and nursing homes in Niigata, Japan // Microbiol. Immunol.- 2000.-Vol. 44.-P.833-839.

277. Matrosovich M., Zhou N., Kavaoka Y., Webster R. The surface glycoproteins of H5 influenza viruses isolated from humans, chickens and wild aquatic birds have distinguishable properties // Ibid.-1999,- Vol. 73.- P. 1146-1155.

278. Matrosovich M.N., Krauss S., Webster R.G. H9N2 influenza A viruses from poultry in Asia have human virus-like receptor specificity // Virology. -2001. -Vol. 281. —№ 2. P. 156-162.

279. Matrosovich, M., A. Tuzikov, N. Bovin, et al. Early alterations of the receptor-binding properties of HI, H2, and H3 avian influenza virus hemagglutinins after their introduction into mammals // J. of Virology. 2000. - Vol. 74.- P. 8502-8512.

280. Matsuda K., Shibata T., Sakoda Y. et al. In vitro demonstration of neural transmission of avian influenza A virus // J. of General Virology.- 2005.-V. 86.- P. 1131-1139.

281. Matsuoka Y., Chen H., Cox N. et al. Safety evaluation in chickens of candidate human vaccines as potential pandemic strains of influenza // Avian Dis 2003 .-Vol. 47.-Suppl. 3.-P. 926-930

282. Mazanec M.V., Kaetzel C.S., Lamm M.E., et al. Intracellular neutralization of virus by immunoglobulin A antibodies // PNAS USA.- 1992.-Vol.89.-p. 6901-6905.

283. Mbawuike I.N.,Pacheco S.,Acuna C.L. Mucosal immunity to influenza without IgA: an IgA knockout mouse model // J. Immunol. 1999 .- Vol. 162.- № 5.-P. 2530-2537

284. Meltzer M., Cox N.J., Fukida K. The economic impact of pandemic influenza in the United States: priorities for intervention // Emerging Infect. Dis 1999.-Vol. 5.-P.659-671.

285. Monto A. Interrupting the transmission of respiratory tract infections: theory and practice // Clinical Infect. Dis. 1999. - Vol. 28. - P. 200-204.

286. Monto A.S., Maassab H.F., Bryan E.R. Relative efficacy of embryonated eggs and cell culture for isolation of contemporary influenza viruses // J. Clin. Microbiol. -1981.-Vol. 13.-№1.-p. 233-235.

287. Murphy B.R. Use of live, attenuated cold-adapted influenza A reassortant virus vaccines in infants, children, young adults, and elderly adults // Infect. Dis. Clin. Pract. 1993. - Vol. 2.- P. 176-181.

288. Murphy B.R., Channock R.M. Genetic variations among influenza viruses / Ed. D.P.Nayak:New York, 1981.-P. 601-615.

289. Murphy B.R., Coelingh K. Principles underlying the development and use of live attenuated cold-adapted influenza A and B virus vaccines // Viral. Immunol.- Vol. 2002.-Vol. 15.-№ 2.- P. 295-323

290. Murphy B.R., Clements M.L. The systemic and mucosal immune response of humans to influenza A virus // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1989.- Vol. 146.-P. 107-116.

291. Murphy B.R., Markoff L.J., Hosier N.T., et al. Production and level of genetic stability of an influenza A virus temperature-sensitive mutant containing two genes with ts mutations // Infect. Immun. 1982. - Vol. 37.- P. 235-242.

292. Murrey C.J.L., Lopez A., Chin B. Estimation of potential global pandemic influenza mortality on the basis of vital registry data from the 1918-20 pandemicA a quantitative analysis //Lancet.- 2006.- Vil. 368.-P. 2211-2216.

293. Musiychuk K., Stephenson N., Bi Hong et al. A launch vector for the production of vaccine antigens in plants // Influenza and other respiratory viruses.- 2006.-Vol. l.-I. l.-P. 19-25.

294. Mutsch M., Zhou W., Rhodes P., et al. Use of inactivated intranasal influenza vaccine and risk of Bell's palsy in Switzerland // N. Engl. J. Med.- 2004.- Vol. 350.-P. 896-903

295. Naeve C.W., Hinshaw V.S., Webster R.G. Mutations in the hemagglutinin receptor-binding site can change the biological properties of an influenza virus // J. of Virology. 1984.- Vol. 51.- P. 567-569.

296. Neirynck S., Deroo T., Saelens X., et al. A universal influenza A vaccine based on the extracellular domain of the M2 protein // Nat. Med.- 1999,- Vol. 5.- № 10.- P: 1157-1163.

297. Neumann G., Watanabe T., Ito H., et al. Generation of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs // PNAS USA.- 1999.- Vol. 96.-P. 9345-9350.

298. Neuzil K.M., Hohlbein C., Zhu Y. Illness among schoolchildren during influenza season // Arch. Pediatr. Adolesc. Med.- 2002.-Vol. 156.- P. 986-991.

299. Nicholas K.B., Nicholas H.B. Jr, Deerfield D.W. GeneDoc: analysis and visualization of genetic variation // EMBNEW News. 1997,-Vol. 4. - P. 14.

300. Nicolson C., Major D., Wood J., Robertson J.S. Generation of influenza vaccine viruses on Vero cells by reverse genetics: an H5N1 candidate vaccine strain produced under a quality system // Vaccine.-2005.-Vol. 23.- P. 2943-2952.

301. Noble S., McLain L., Dimmock N.J., et al. Interfering vaccine: a novel antiviral that converts a potentially virulent infection into one that is subclinical and immunizing // Vaccine.-2004.-Vol. 22.-1. 23-24, P. 2993-3003.

302. Nolan T., Richmond P.C., Formica N.T. et al Safety and immunogenicity of aprototype adjuvanted inactivated split-virus influenza A (H5N1) vaccine in infants andchildren // Vaccine. -2008.-Vol. 26-№ 50.- P. 6383-6391.

303. O'Brien K.L., Walters M.I., Sellman J., et al. Severe pneumococcal pneumonia in previously healthy children: the role of preceding influenza infection // Clin. Infect. Dis.- 2000.- Vol. 30.- P. 784-789.

304. Palker T., Kiseleva I., Johnston K., et al. // Protective efficacy of intranasal cold-adapted influenza A/New Caledonia/20/99 (H1N1) vaccines comprised of egg- or cell culture-derived reassortants // Virus research.- 2004.- Vol. 105.-1. 2 P. 183194.

305. Pappas C., Aguliar P.V., Basler C.F. Single gene reassortants identify a critical role for PB1, HA, and NA in the high virulence of the 1918 pandemic influenza virus // PNAS USA.-2008.-Vol. 105.-№ 8.-3.3064-3069.

306. Pappas C., Matsuoka Y., Swayne D.E., Donis R.O. Development and evaluation of an influenza virus subtype H7N2 vaccine candidate for pandemic preparedness // Clinical and vaccine immunology.- 2007. -Vol. 14.- № 11,- P. 1425-1432.

307. Park C.H., Ishinaka M., Takada A., et al. The invasion routes of neurovirulent A/Hong Kong/483/97 (H5N1) influenza virus into the central nervous system after respiratory infection in mice // Arch. Virol.- 2002.-Vol. 147,- P. 1425-1436.

308. Parkin, N.T., Chiu, P., Coelingh, K.L., et al. Temperature sensitive mutants of influenza A virus generated by reverse genetics and clustered charged to alanine mutagenesis // Virus Res.- 1996.- Vol. 46.- P. 31-44.

309. Parks C.L., Latham T., Cahill A., et al. Phenotypic properties resulting from directed gene segment reassortment between wild-type A/Sydney/5/97 influenza virus and the live attenuated vaccine strain // Virology.-2007.- Vol. 367.- P. 275287.

310. Peiris J.S., Yu W.S., Leung C.W. et al. Reemergence of fatal human influenza A subtype H5N1 disease//Ibid.-2004.-Vol. 363.-P. 617-619.

311. Peiris M., Yuen K.Y., Leung C.W., et al. Human infection with inluenza H9N2 // Lancet.- 1999. Vol. 354. - P. 916-917.

312. Perales B., de la Luna S., Palacios I., Ortin J. Mutational analysis identifies functional domains in the influenza A virus PB2 polymerase subunit.// J. of Virology. 1996,- Vol. 70.- № 3.- p. 1678-1686.

313. Perdue M.L., Garcia M., Senne D. Virulence-associated sequence duplication at the hemagglutinin cleavage site of avian influenza viruses // Virus Res.- 1997. -Vol. 49.-P. 173-186.

314. Plante M., Jones T., Allard F., et al. Nasal immunization with subunit proteosome influenza vaccines induces serum HAI, mucosal IgA and protection against influenza challenge // Vaccine.- 2001.-Vol. 20.- I. 1-2.- P. 218-225.

315. Polezhaev F.I., Garmashova L.M., Polyakov Y.M., et al. Conditions for production of thermosensitive attenuated influenza virus recombinants // Acta Virol.-1978.- № 22.- P. 263-269.

316. Potter C.W. A history of influenza // J. Appl. Microbiol. 2001. - Vol. 91. - P. 572-579.

317. Potter C.W., Jennings R. Effect of priming on subsequent response to inactivated influenza vaccine // Vaccine.- 2003. Vol. 21.- I. 9-10.-P. 940-945.

318. Powers D.C., Sears S.D., Murphy B.R., et.al Systemic and local antibody responses in elderly subjects given live or inactivated influenza A virus vaccines // J. Clin. Microbiol. 1989.- Vol. 27.- № 12.- P. 2666-2671.

319. Production of pilot lots of inactivated influenza vaccine in response to a pandemic threat: an interim biosafety risk assessment // WHO Weekly epidemiological rec. -2003.-Vol. 78.-P. 405-408.

320. Qian X.Y., Alonso-Caplen F., Krug R.M. Two functional domains of the influenza virus NS1 protein are required for regulation of nuclear export of mRNA //J. Virol. -1994.- Vol. 68.- № 4.-P. 2433-2441.

321. Qiu Y, Krug R M. The influenza virus NS1 protein is a poly(A)-binding protein that inhibits nuclear export of mRNAs containing poly(A) // Ibid.- P. 2425-2432.

322. Reading P.C., Miller J.L., Anders E.M. Involvement of the mannose receptor in infection of macrophages by influenza virus // J. Virol. 2000.- Vol. 74.- № 11.- P. 5190-5197.

323. Reed L.J., Muench H. A simple method of estimation fifty per cent endpoints // Am. J. Hygiene.-1938.-Vol. 27.-P. 493-497.

324. Reid A.H., Fanning T.G., Hultin J.V., Taubenberger J.K. Origin and evolution of the 1918 "Spanish" influenza virus hemagglutinin gene // PNAS USA.- 1999. -Vol. 96.-P. 1651-1656.

325. Rekstin A.R., Kiseleva I.V., Klimov A.I., et al. Interferon and other proinflamatory cytokine responses in vitro following infection with wild-type and cold-adapted reassortant influenza viruses // Vaccine.- 2006.- Vol. 24.- I. 44-46.- P. 6581-6584.

326. Renegar K.B., Small P.A. Jr, Boykins L.G., Wright P.F. Role of IgA versus IgG in the control of influenza viral infection in the murine respiratory tract // J. Immunol.-2004.-Vol. 173.-№3.-P. 1978-1986.

327. Rimmelzwaan G.F., Kuiken T., van Amerongen G., et al. Pathogenesis of influenza A (H5N1) virus infection in a primate model // J. of Virology.- 2001.-Vol. 75.- № 14,- P. 6687-6691.

328. Rimmelzwaan G.F., Kuiken T., van Amerongen G. et al. A primate model to study the pathogenesis of influenza A (H5N1) virus infection // Avian Dis.-2003-Vol. 47,-№3.- P. 931-933.

329. Rogers G.N., D'Souza B.L. Receptor binding properties of human and animal HI influenza virus isolates // Virology. -1989.- Vol. 173.- № 1.- P. 317-322.

330. Romanova J.,R., Ermachenko T.A., Alexandrova G.I. Tannock G.A. Interference between cold-adapted (ca) influenza A and B vaccine reassortants or between ca reassortants and wild-type strains in eggs and mice // Vaccine.-1994.-Vol.12.-I 1.-P.23-27.

331. Romanova Y., Katinger D., Ferko B., et al. Live cold-adapted influenza A vaccine produced in Vero cell line //Virus Research.-2004.-Vol. 103.-P. 187-193.

332. Rowe T., Abernathy R.A., Hu-Primmer J., Thompson W.W., et al. Detection of antibody to avian influenza A(H5N1) virus in human serum by using a combination of serologic assays // J. of Clinical microbiology.- 1999.- Vol. 37.- P. 937-943.

333. Rudenko L.G. Live attenuated cold-adapted influenza vaccine in Russia: advantages, further research and development // In: Options for the Control of Influenza VI / Katz J.M. (ed).- London, Atlanta: International Medical Press, 2008.-P. 122-124.

334. Rudenko L.G., Slepushkin A.N., Monto A.S., et al. Efficacy of live attenuated and inactivated influenza vaccines in schoolchildren and their inactivated contacts in Novgorod, Russia // J. Infect. Dis. -1993.- Vol. 168.- P. 881-887.

335. Rudneva I.A., Timofeeva T.A., Shilov A.A., et al. Effect of gene constellation and postreassortment amino acid change on the phenotypic features of H5 influenza virus reassortants //Arch. Virol.- 2007.- Vol. 152.- № 6.- P. 1139-1145.

336. Saito T., Lim W., Suzuki T. et al. Characterization of a human H9N2 influenza virus isolated in Hong Kong // Vaccine.- 2002. Vol. 20. - P. 125-33.

337. Salomon R., Franks J., Govorkova E.A.The polymerase complex genes contribute to the high virulence of the human I-I5N1 influenza virus isolate A/Vietnam/1203/04 // J. Exp. Med.- 2006.- Vol. 203.- № 3.-P. 689-697.

338. Schäfer J.R., Kawaoka Y., Bean W.J., et al. Origin of the pandemic 1957 H2 influenza A virus and the persistence of its possible progenitors in the avian reservoir//Virology.- 1993.-Vol. 194.-P. 781-788.

339. Scheiblauer H., Reinacher M., Tashiro M., Rott R. Interactions between bacteria and influenza A virus in the development of influenza pneumonia // J. Infect. Dis.-1992.- Vol. 166.-P. 783-791.

340. Scholtissek C., Burger H., Kistner O., Shortridge K. F., et al. The nucleoprotein as a possible major factor in determining host specificity of influenza H3N2 viruses // Virology.- 1985. Vol. 147,- P. 287-294.

341. Scholtissek C., Quack G., Klenk H.D., Webster R.G. How to overcome resistance of influenza A viruses against adamantane derivatives // Antiviral Res.- 1998.- Vol. 37(2):83-95.

342. Scholtissek C., Rohde W., Von Hoyningen V., Rott R. On the origin of the human influenza virus subtype H2N2 and H3N2 // Virology.- 1978.- Vol. 87.- P. 13-20.

343. Scholtissek C., Stech J., Krauss S., Webster R. G. Cooperation between the hemagglutinin of avian viruses and the matrix protein of human influenza A viruses //J. of Virology.- 2002.- Vol. 76.- P. 1781-1786.

344. Schultz C., Dong V.C., Chau N.V.V., et al. Avian influenza H5N1 and healthcare workers //Emerg. Infect. Dis.-2005.-Vol. 1 l.-P. 1158-1159.

345. Schultz-Cherry S., Dybdahl-Sissoko N., Neumann, G., et al. Influenza virus NS1 protein induces apoptosis in cultured cells // J. of Virology.-2001.- Vol. 75.- P. 7875-7881.

346. Sellek P.W., Arzey G., Kirkland P.D. et al. An outbreak of highly pathogenic avian influenza in Australia in 1997 caused by an H7N4 virus // Avian Dis. -2003.-Vol. 47.- Suppl. 3.-P. 806-911.

347. Seo S.H., Hoffmann E., Webster G.R. Lethal H5N1 influenza viruses escape host antiviral cyokine responses // Nature Medicine. 2002. - Vol.8. - № 9. - P.950-954.

348. Seo S.H., Webster G.R. Cross-reactive, cell-mediated immunity and protection of chickens from lethal H5N1 influenza virus infection in Hong Kong poultry markets //J. of Virology.- 2001.- Vol. 75,- № 6.- P. 2516-25125.

349. Shaw M., Cooper L., Xu X., et al. Molecular changes associated with the transmission of avian influenza A H5N1 and H9N2 viruses to humans // J. Med. Virol.- 2002. Vol. 66.- P. 107-114.

350. Shaw M., Xu X., Li Y. et al. Reappearance and global spread of variants of influenza B/Victoria/2/87 lineage viruses in the 2000-2001 and 2001-2002 seasons //Virology.- 2002.- Vol. 303.-P. 1-8.

351. Shinya K., Hatta M., Yamada S., et. al. Characterization of a human H5N1 influenza A virus isolated in 2003 //J. of Virology.- 2005. Vol. 79.- № 15.- P. 9926-9932.

352. Shiraishi K., Mitamura K., Sakai-Tagawa Y., et al. High frequency of resistant viruses harboring different mutations in amantadine-treated children with influenza // J. Infect. Dis.- 2003.-Vol.-188.- P. 57-61.

353. Shortridge K.F., Zhou N.N., Guan Y., et al. Characterization of avian H5N1 influenza viruses from poultry in Hong Kong // Virology.- 1998. Vol. 252.- P. 331-342.

354. Smith H., Sweet C. Lessons for human influenza from pathogrnicity studies with ferrets //Rev. Infect. Dis.- 1988.-Vol.10.- № l.-P. 56-75.

355. Smorodintseff A.A., Tushinsky M.D., Drobyshevskaya A.I. et al. Investigation of volunteers infected with influrnza virus // Amer. J. med. Sei.- 1937.- Vol. 194.- № 2,- P. 159-170.

356. Simonsen L., Fukuda K., Schönberger L.B., Cox N.J. The impact of influenza epidemics on hospitalizations // J. Infect. Dis.- 2000.- Vol. 181.- № 3.- P. 831-837.

357. Snyder M.H., Betts R.F., DeBorde D., et al. Four viral genes independently contribute to attenuation of live influenza A/Ann Arbor/6/60 (H2N2) cold-adapted reassortant virus vaccines // J. of Virology. 1988.- Vol. 62.- P. 488-495.

358. Stepanova L., Naykhin A., Kolmskog C., et al. The humoral response to live and inactivated influenza vaccines administered alone and in combination to young adults and elderly // J. Clin. Virol.- 2002.- Vol. 24.- № 3.- P. 193-201

359. Stephenson I., Bugarini R., Nicholson K.G., et al. Cross-reactivity to highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses after vaccination with nonadjuvanted and

360. MF59-adjuvanted influenza A/Duck/Singapore/97 (H5N3) vaccine: a potential priming strategy // J. Infect. Dis.- 2005.- Vol. 191.- № 8,- P. 1210-1215.

361. Stephenson I., Nicholson K.G., Colegate A. et al. Boosting immunity to influenza H5N1 with MF59-adjuvanted H5N3 A/Duck/Singapore/97 vaccine in a primed human population // Vaccine. 2003. - Vol. 21. - P. 1687-1693.

362. Stephenson I., Nicholson K.G., Gluck R. et al. Safety and antigenicity of whole virus and subunit influenza A/Hong Kong/1073/99(H9N2) vaccine in healthy adults: phase I randomized trial // Lancet 2003 - Vol. 362,- P. 1959-1966

363. Stephenson I., Wood J.M., Nicholson K.G. et al. Sialic acid receptor specificity on erythrocytes affects detection of antibody to avian influenza haemagglutinin // J. Med. Virology.- 2003.- Vol. 70,- № 3,- P. 391-398.

364. Stevens J., Blixt O., Chen L.M., et al. Recent avian H5N1 viruses exhibit increased propensity for acquiring human receptor specificity // J. Mol. Biol. 2008.-Vol. 381.-№5,-P. 1382-94.

365. Stohr K., Esveld M. Will vaccines be available for the next influenza pandemic? // Science.-2004.- Vol. 306.- P. 2195-2196.

366. Suarez D.L., Perdue M.L., Cox N., et al. Comparisons of highly virulent H5N1 influenza A viruses isolated from humans and chickens from Hong Kong // J. of Virology. -1998.- Vol. 72.- Vol. 6678-6688.

367. Subbarao E.K., London W., Murphy B.R. A single amino acid in the PB2 gene of inluenza A virus is a determinant of host range // Ibid.- 1993.- Vol. 67.- P. 17611764.

368. Subbarao K., Chen H., Swayne D., et al. Evaluation of a genetically modified reassortant H5N1 influenza A virus vaccine candidate generated by plasmid-based reverse genetics // Virology. 2003. -Vol. 305. -P. 192-200.

369. Subbarao K., Klimov A., Katz J., Regnery H., et al. Characterization of an avian influenza A (H5N1) vims isolated from a child with a fatal respiratory illness // Science. 1998. - Vol. 279. - P. 393-396.

370. Subbarao K., Murphy B.R., Fauci A.S. Development of effective vaccines against pandemic influenza // Immunity.- 2006.- Vol. l.-P. 5-9.

371. Suguitan A.L., McAuliffe J., Mills K.L., et al. Live, attenuated Influenza A H5N1 candidate vaccines provide broad cross-protection in mice and ferrets 11 PLoS Medicine.- 2006.- Vol. 3.- 9.- e360.

372. Suzuki H., Saito R., Masuda H., et al. Emergence of amantadine-resistant influenza A viruses: epidemiological study // J. Infect. Chemother. 2003.- Vol. 9.-P. 195-200.

373. Swayne D.E., Lee C.W., Spackman E. Inactivated North American and European H5N2 avian influenza virus vaccines protect chickens from Asian H5N1 high pathogenicity avian influenza virus // Avian Pathol. -2006 .-Vol. 35.- № 2.- P. 141146.

374. Takada A., Kuboki N., Okazaki K. et al. Avirulent avian influenza virus as a vaccine strain against a potential human pandemic // J.of Virology. 1999. — Vol.73. -№ 10.-P. 8303-8307.

375. Takeuchi K. Lamb R.A. Influenza virus M2 protein ion channel activity stabilizes the native form of fowl plague virus hemagglutinin during intracellular transport // J. of Virology.- 1994. -Vol. 68.- P. 911-919.

376. Talon J., Horvath C.M., Polley R., et al. Activation of interferon regulatory factor 3 is inhibited by the influenza A virus NS1 protein // J. of Virology.- 2000.- Vol.74.- P. 7989-7996.

377. Tamura S., Tanimoto T., Kurata T. Mechanisms of broad cross-protection provided by Influenza virus infection and their application to vaccines // Jpn. J. Infect Dis.- 2005.-Vol. 58.-P. 195-207

378. Tashiro M., Ciborowski P., Klenk H.-D., et al. Role of staphylococcus protease in the development of influenza pneumonia // Nature.-1987.- Vol. 325.- P. 536-537.

379. Taubenberger J.K., Reid A.H., Janczewsky T.A. et al. Integrating historical, clinical and molecular genetic data in order to explain the origin and virulence of the 1918 Spanish influenza virus // Phil. Trans. R. Soc. 2001. - Vol. 356. - P. 1829-1839.

380. Thompson C.I., Barclay W.S., Zambon M.C., et al. Infection of human airway epithelium by human and avian strains of influenza A virus // J. of Virology.-2006.-Vol. 80,-№. 16.-P. 8060-8068.

381. To K.F., Chan P.K., Chan K.F., et al. Pathology of fatal human infection associated with avian influenza A(H5N1) virus.// J. Med. Virol.- 2001.- Vol. 63.- № 3.- P.242-246.

382. Tolpin M.D., Massicot J.G., Mullinix M.G., et al. Genetic factors associated with loss of the temperature-sensitive phenotype of the influenza A/Alaska/77-ts-lA2 recombinant during growth in vivo // Virology.- 1981.- Vol. 112.- P. 505-517.

383. Toyoda T., Adyshev D.M., Kobayashi M., et al. Molecular assembly of the influenza virus RNA polymerase: determination of the subunit-subunit contact sites //J. Gen. Virol.-1996.-Vol. 77.-P. 2149-2157.

384. Tran T.H., Nguen T.L., Nguen T.D. et al. Avian influenza A(H5N1) in 10 patients in Vietnam // N. New Engl. J. of Med. 2004. - Vol. 350. - P. 1179-1188.

385. Treanor J.J., Campbell J.D., Zangwill K.M., et al. Safety and immunogenicity of an inactivated subvirion influenza A (H5N1) vaccine // Ibid.- 2006.-Vol. 354.- P. 1343-1351.

386. Treanor J .J., Mattison, R., Domyati, G., et al. Protective efficacy of combined live intranasal and inactivated influenza A virus vaccines in the elderly // Ann. Intern. Med.- 1992.-Vol. 117.-P. 625-633.

387. Treanor J.J., Snyder M.H., London W.T., Murphy B.R. The B allele of the NS gene of avian influenza viruses, but not the A allele, attenuates a human influenza A virus for squirrel monkeys //Virology.- 1989.- Vol. 171.- №1.- P. 1-9.

388. Treanor J.J., Wilkinon B.E., Masseoud F. et al. Safety and immunogenicity of a recombinant haemagglutinin vaccine for H5 influenza in humans // Ibid. — 2001. — Vol. 19.-P. 1792-1737.

389. Tumpey T.M., Basler C.F., Aguilar P.V., et al. Characterization of the reconstructed 1918 Spanish influenza pandemic virus // Science.-2005.-Vol. 310.-№ 5745.- P. 77-80.

390. Ulmer J.B. Influenza DNA vaccines // Vaccine.- 2002.-Vol. 20.-Suppl. 2,- P. S74-S76.

391. Ungchusak K., Auewarakul P., Doweli S. et al. Probable person-to person Transmission of avian influenza A(H5N1) // N. Eng. J. of Med.-2005.-Vol. 352.-№4.-P. 333-340.

392. Uprasertkul M., Puthavathana P., Sangsiriwit K., et al. Influenza H5N1 replication sites in humans//Emerg. Infect. Dis.-2005.-Vol. 11.-P. 1036-1041.

393. Van Kampen K. R., Shi Z. , Gao P, et al Safety and immunogenicity of adenovirus-vectored nasal and epicutaneous influenza vaccines in humans // Vaccine.-2005.-Vol. 23.- P.1029-1036.

394. Van Kolfschooten F. Avian influenza in the Netherlands, WHO Disease Outbreak Reported, 24 April 2003. Dutch veterinarian becomes first victim of avian influenza //Lancet.- 2003.- Vol. 361.- P. 1444.

395. Vines A., Wells K., Matrosovich M. et al. The role of influenza A virus hemagglutinin residues 226 and 228 in receptor specificity and host range restriction // J. of Virology.-1998.-Vol. 72.-№ 9.- P. 7626-7631.

396. Viseshakul N., Thanawongnuwech R., Amonsin A. et al. The genome sequence analysis of H5N1 avian influenza A virus isolated from the outbreak among poultry populations in Thailand // Virology. 2004. -Vol. 328. -P. 169-176.

397. Wang X., Li M., Zheng H. et al. Influenza A virus NS protein prevents the activation of NF-kB and induction of type I IFN // J. Virology.-2000.-Vol. 74,-P.l 1566-11573.

398. Ward P., Small I.,Smith J. et al. Oseltamivir (Tamiflu) and its potential for use in the event of an influenza pandemic // J. antimicrob. Chemother.-2005.-Vol. 55.-Suppl.l.-P. i5-i21.

399. Webby R.J., Perez D.R., Coleman J.S., et al. Responsiveness to a pandemic alert: use of reverse genetics for rapid development of influenza vaccines // Lancet.-2004.-Vol. 363.-P. 1099-1103.

400. Webster R.G., Bean W.J., Gorman T.M. et al. Evolution and ecology of influenza A viruses//Microbiol. Rev. 1992. - Vol. 56.-P. 152-179.

401. Webster R.G., Guan Y., Poon L. The spread of the H5N1 bird flu epidemic in Asia in 2004 // Arch. Virol. Suppl. -2005,- Vol. 19.- P. 117-129.

402. Webster R.G., Kawaoka, Y. Bean W.J., Jr. Molecular changes in A/Chicken/Pennsylvania/83 (H5N2) influenza virus associated with acquisition of virulence//Virology.- 1986.-Vol. 149.-P. 165-173.

403. Webster R.G., Yakhno M.A., Hinshaw V.S., et al. Intestinal influenza: replication and characterization of influenza viruses in ducks // Virology.-1978. Vol. 84.- P. 268-278.

404. Wei C.J., Xu L., Kong W.P. Comparative efficacy of neutralizing antibodies elicited by recombinant hemagglutinin proteins from avian H5N1 influenza virus // J. of Virology. 2008.- Vol. 82.- № 13.- P. 6200-6208.

405. Wolff T, O'Neill RE, Palese P. NSl-Binding protein (NS1-BP): a novel human protein that interacts with the influenza A virus nonstructural NS1 protein is relocalized in the nuclei of infected cells // J. Virol.- 1998.-Vol. 72.- P. 7170-7180.

406. Wood J.M., Major D, Newman R.W. et al. Preparation of vaccines against H5N1 influenza // Vaccine. 2002.- Vol. 20.-Suppl.2. - P. S84-S87.

407. Wood J.M., Nicholson K.G., Stephenson I., et al. Experience with the clinical development of influenza vaccines for potential epidemics // Med. Microbiol. Immunol.-2002.-Vol. 191.-P. 197-201

408. World Plealth Organization Electronic resource. / Avian influenza: assessing the pandemic threat // Geneva: World Health Organization.- 2005, Accessmode:www.who.int/csr/disease/influenza //WHOCDS 200529 /en/ (accessed 2006 Oct 11).

409. World Health Organization Electronic resource. / Global pandemic influenza action plan to increase vaccine supply. WHO/CDS/EPR/GIP/2006.1. September 2006 (www.who.int/vaccines-documents/DocsPDF06/863.pdf).

410. World Health Organization. Cell culture as a substrate for the production of influenza vaccine: memorandum from a WHO meeting / World Health Organization // Bull. WHO. -1995. -Vol. 73. P. 431-435.

411. World Health Organization Electronic resource. / Cumulative Number of Confirmed Human Cases of Avian Influenza A/(H5N1) Reported to WHO 19 June 2008 (http://www.who.int/csr/disease/avian influenza/country/casestable 2008 06 19/en/index.htmH

412. Wright P.F., Dupont W., Edwards K. Comparative study of cold-adapted and inactivated influenza vaccines//Proc. Opt. For the Control of Influenza II.-Amsterdam-London-New York-Tokyo.: Excerpta medica,1993.-P.71-77.

413. Xu X., Smith C.B., Mungall B.A., et al. Intercontinental circulation of human influenza A(H1N2) reassortant viruses during the 2001-2002 influenza season // J. Infect. Dis. 2002 .- Vol.186.- № 10.- P.1490-1493.

414. Ye Z.P., Baylor N.W., Wagner R.R. Transcription-inhibition and RNA-binding domains of influenza A virus matrix protein mapped with anti-idiotypic antibodies and synthetic peptides// J. of Virology. -1989.-Vol. 63.-№ 9.-P. 3586-3594.

415. Yen H.L., Monto A.S., Webster R.G. et al. Virulence may determine the necessary duration and dosage of oseltamivir treatment for highly pathogenic A/Vietnam/1203/04 influenza virus in mice //J. Infect. Dis.- 2005.-Vol. 192.-P. 1216-1224.

416. Youil R., Su Q., Toner T.J., et al. Comparative study of influenza virus replication in Vero and MDCK cell lines // J. Virol. Methods.- 2004.-Vol. 120.- №.1.- P. 2331.

417. Younger J.S., Treanor J.J., Whitaker-Dowling P. et al. Effect of simultaneous administration of cold-adapted and wild-type influenza a viruses on experimental wild type influenza in humans // J. of clinical microbiology.- 1994. -Vol. 32.- P. 750-754.

418. Zamarin D., Ortigoza M.B., Palese P. Influenza A virus PB1-F2 protein contributes to viral pathogenesis in mice // J. of Virology.- 2006.-Vol. 80.- № 16,-P.7976-7983.

419. Zheng H., Palese P., Garcia-sastre A. Nonconserved nucleotides at the 3' and 5' ends of an influenza A virus RNA play an important role in viral RNA replication // Virology.- 1996.-Vol. 217,-P. 242-251.

420. Zhirnov O.P., Konakova T.E., Wolff T., Klenk H.D. NS1 protein of influenza A virus down-regulates apoptosis // Ibid. 2002.- Vol. 76.- № 4.- P. 1617-25.

421. Zitzow L.A., Rowe T., Morken T., et al. Pathogenesis of avian influenza A (H5N1) viruses in ferrets // Ibid.- 2002.- Vol. 76.- № 9,- P. 4420-4429.

Информация о работе

Дешева, Юлия Андреевна
доктора медицинских наук
Санкт-Петербург, 2009
ВАК 03.00.06

Диссертация

Пути усовершенствования живой гриппозной вакцины и тактики ее применения при подготовке к пандемии - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы