Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярные механизмы холодоадаптации и реверсий к TS+фенотипу вирусов гриппа A и B

ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярные механизмы холодоадаптации и реверсий к TS+фенотипу вирусов гриппа A и B"

На правах рукописи

ЦФАСМАН 884687351

Татьяна Михайловна

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ХОЛОДОАДАПТАЦИИ И РЕВЕРСИЙ К ТБ+ ФЕНОТИПУ ВИРУСОВ ГРИППА А И В

03.02.02 - вирусология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2010

-2 СЕ И 2010

004607851

Работа выполнена в НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук

Маркушин Станислав Георгиевич

Официальные оппоненты:

Академик РАМН, доктор медицинских Каверин Николай Вениаминович наук, профессор

Ведущая организация: НИИ гриппа СЗО РАМН

Защита диссертации состоится «23» сентября 2010 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 001.035.01 в НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН по адресу: 105064, г. Москва, Малый Казенный пер., д. 5а

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН

Доктор биологических наук

Гамбарян Александра Сергеевна

Автореферат разослан «_» 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Ирина Владимировна Яковлева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы.

Живые гриппозные вакцины создают на основе холодоадаптированных (ХА) штаммов вируса гриппа. Основными фенотипическими маркёрами, которые характеризуют атгенуацию ХА штаммов (в конечном итоге, их апатогенность для людей), являются са и ts фенотип, т.е. способность к эффективной репродукции при пониженной и неспособность к

репродукции при повышенной (39-40°С) температуре. Считается, что са, ts и аттенуированный (att) фенотип ХА штаммов стабилен благодаря совокупности мутаций, приобретённых этими штаммами в процессе адаптации к пониженной температуре, в генах РВ2, РВ1, PA, NP, М1/М2 и NS1/NS2 [Александрова Г.И. и Климов А.И., 1994; Ambrose C.S. et al., 2008].

Несмотря на то, что живые гриппозные вакцины на основе ХА штаммов в течение многих лет используются в России и в США, механизмы адаптации вирусов гриппа к пониженной температуре до сих пор изучены недостаточно. Исследования показали, что популяция ХА штамма А/Ленинград/134/17/57, используемого для производства живой гриппозной вакцины в России, гетерогенна и состоит из вариантов с различным набором мутаций. Этот факт может затруднять изучение механизмов аттенуации данного штамма.

Роль отдельных генов в аттенуации ХА штаммов исследована лишь для четырёх штаммов, которые используются для производства вакцины: А/ЭннАрбор/6/60, В/ЭннАрбор/1/66, А/Ленинград/134/17/57 и В/СССР/60/69 [Hoffmann Е. et al., 2005; Jin Н. et al., 2003; Jin H. et al., 2004; Kiseleva I. et al., 2004; Kiseleva I. et al., 2010]. Только для двух штаммов -А/Ленинград/134/17/57 и А/Ленинград/134/47/57, полученных на основе одного и того же родительского штамма - известно, какие именно мутации произошли в процессе адаптации этих штаммов к пониженной температуре (для остальных штаммов достоверно неизвестны соответствующие

предковые дикие штаммы, с которыми можно было бы провести сравнение) [Медведева Т.Е. и др., 1991; Ghendon Y. et al., 1984; Herlocher M.L. et al, 1993; Klimov A. et al, 1992].

До сих пор остаётся неясным, есть ли какие-либо закономерности, касающиеся появления мутаций в определённых участках генома ХА штаммов вируса гриппа. Неизвестно, существуют ли определённые локусы, в которых возникают мутации при адаптации вирусов гриппа к пониженной температуре или сходный фенотип ХА штаммов может быть обусловлен различным сочетанием мутаций в разных генах.

Проблема различия темпов накопления мутаций вирусами гриппа А и В в процессе адаптации к пониженной температуре и обратной адаптации ХА штаммов к повышенной температуре требует дальнейшего изучения.

Несмотря на подтверждённую стабильность фенотипа ХА штаммов вируса гриппа in vivo, неясно, при каких условиях возможна реверсия фенотипа подобных штаммов и достижимы ли эти условия во время репликации вируса в организме человека.

Получить ответ на эти вопросы чрезвычайно важно прежде всего с точки зрения безопасности применения живой гриппозной вакцины.

Цели и задачи исследования.

Целью работы было изучение молекулярных механизмов холодоадаптации ХА штаммов вируса гриппа А и В и изучение проблемы стабильности фенотипа ХА штаммов на модели ts+ ревертантов ХА штаммов вируса гриппа А и В.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: \

1. Получить ХА варианты штаммов вируса гриппа на основе эпидемических штаммов А/Краснодар/101/59 и В/Виктория/2/87 путём пассажей при пониженной температуре и изучить их ts, са и

аттенуированный фенотип, а также мутации, приобретённые за время пассажей при пониженной температуре. 1

2. Получить /5+ ревертанты ХА штаммов А/Ленинград/134/47/57, А/Краснодар/101/35/59 и В/Виктория/2/41/87 путём пассажей данных штаммов при постепенно повышающихся температурах и изучить их ¿5, са и аттенуированный фенотип.

3. Оценить эффективность методов комплементационно-рекомбинационного и ПЦР-рестрикционного анализа для контроля стабильности £у мутаций в геноме ХА штаммов и для обнаружения истинных реверсий и супрессорных мутаций на модели ревертанта ХА штамма А/Ленинград/134/47/57.

4. Методом секвенирования выявить истинные реверсии и са мутаций и супрессорные мутации, возникшие в геноме ревертанта штамма АУЛенинград/134/47/57 и одного из ревертантов ХА штамма А/Краснодар/101/35/59 в процессе пассажей при повышенной температуре.

Научная новизна работы.

Изучение фенотипа новых ХА штаммов и мутаций в их геноме вносит существенный вклад в понимание механизмов аттенуации вируса гриппа.

Впервые показана возможность получения ревертантов ХА штаммов вируса гриппа в лабораторных условиях и показана роль как истинных реверсий, так и супрессорных мутаций в реверсии к £?+ фенотипу ХА штаммов вируса гриппа.

Практическая значимость.

Полученные и охарактеризованные в работе ХА штаммы А/Краснодар/101/35/59 и В/Виктория/2/63/87 могут быть использованы в дальнейшем для получения живой гриппозной вакцины.

Показано, что для эффективного контроля генетической стабильности и безопасности ХА штаммов-доноров аттенуации вируса гриппа целесообразно комбинированное применение нескольких методов

исследования, например, ПЦР-рестрикционного метода и комплементационно-рекомбинационного метода.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Ca, ts и атгенуированный фенотип ХА штаммов может быть обусловлен различным сочетанием са и ts мутаций в разных генах, кодирующих внутренние белки вируса гриппа. Мутации, обуславливающие адаптацию ХА штаммов вирусов гриппа к пониженной температуре, находятся в консервативных участках вирусных белков.

2. Для реверсии фенотипа ХА штаммов важны как истинные реверсии, так и супрессорные мутации. В соответствии с этим для анализа стабильности генома ХА штаммов и изолятов вакцинных штаммов от вакцинированных людей следует применять методы, позволяющие оценить наличие как истинных реверсий, так и супрессорных мутаций (например, полное секвенирование генома или комбинацию ПЦР-рестрикционного и комплементационно-рекомбинационного анализа).

3. ХА штаммы вируса гриппа обладают большой степенью фенотипической стабильности. Полная реверсия ts фенотипа этих штаммов возможна при условиях, которые не достижимы во время репликации вируса в организме человека (большое количество пассажей при постепенно повышающихся температурах).

Апробация материалов диссертации и публикации

Материалы диссертации доложены на 13th International Conference on Negative Strand Viruses (Salamanca, Spain, 2006), Х1П международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных "Ломоносов-2006" (Москва, 2006), Third European Congress of Virology (Nuernberg, Germany, 2007), 18th Annual Meeting of the Society for Virology (Heidelberg, Germany, 2008), 14th International Congress of Virology (Istanbul, Turkey, 2008), конференции молодых ученых, посвященной 100-летию получения И.И. Мечниковым Нобелевской премии (Москва, 2008), 19th

Annual Meeting of the Society for Virology (Leipzig, Germany, 2009), конференции молодых учёных НИИ ВС им. И.И. Мечникова РАМН (Москва, 2009), международной научной конференции "Противогриппозные вакцины нового поколения" (Санкт-Петербург, 2009).

Апробация диссертации состоялась 22 апреля 2010 г. на научной конференции отдела вирусологии НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН.

По теме диссертации опубликовано 10 научных работ. Получен один патент РФ.

Объем и структура диссертации

Материалы диссертации изложены на 147 страницах машинописного текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований с обсуждением полученных данных, заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 27 таблицами и 7 рисунками. Библиография включает 147 отечественных и зарубежных источников.

Личный вклад автора заключается в непосредственном участии в выполнении всех разделов данного исследования, а также в проведении анализа полученных данных. Автор признателен к.б.н. И.И. Акоповой за помощь в получении и анализе ts и са фенотипа ХА штаммов А/Краснодар/101/35/59 и В/Виктория/2/63/87, а также за предоставление данных комплементационно-рекомбинационного анализа ts+ ревертанта А/Ленинград/134/47/57/Rev и Е.Б. Файзулоеву за помощь в секвенировании штаммов АУКраснодар/101/59, А/Краснодар/101/35/59 и В/Виктория/2/41/87.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Вирусы, культуры клеток, куриные эмбрионы. В работе использовали ХА штамм-донор атгенуации для живых гриппозных реассортантных вакцин А/Ленинград/134/47/57 (H2N2); эпидемические штаммы А/Ленинград/134/57 (H2N2), А/Гонконг/68 (H3N2), А/Краснодар/101/59 (H2N2), В/Виктория/2/87;

ts мутанты штамма Вейбридж ВЧП (вируса чумы птиц (H7N7)) и ts мутанты штамма Росток ВЧП. ts мутанты штамма Росток были получены из Национального Института Медицинских Исследований (Лондон, Великобритания). В работе использовали 9-11 дневные куриные эмбрионы (птицекомбинат "Птичное"), а также линию клеток MDCK, полученную из Института Пастера, Франция. Клетки MDCK культивировали по стандартной методике на среде Игла MEM ("ФГУП ПИПВЭ им. М.П.Чумакова РАМН", Москва) с 5% фетальной сывороткой телят фирмы "HyClone" (США). Для комплементационно-рекомбинационного анализа использовали первичную культуру куриных фибробластов, приготовленную из 9-10-дневных куриных эмбрионов по стандартной методике [Белов Г.А., 2002].

Для определения инфекционного титра вирусов в ЭИД50 и накопления вирусов для последующих опытов куриные эмбрионы заражали по стандартной методике 10-кратными разведениями вируса в аллантоисную полость [Шубладзе А.К. и Гайдамович С.Я., 1954]. Наличие вируса в аллантоисной жидкости определяли по реакции гемагглютинации с 0,5% суспензией эритроцитов кур. Инфекционный титр вируса в ЭИД50/0,2 мл рассчитывали по методу Кербера. Для определения ts и са фенотипа исследуемых штаммов проводили титрование одновременно при оптимальной, пониженной и повышенной температуре. Разницу в уровне репродукции вируса гриппа при разных температурах выражали величиной RCT (reproductive capacity at different temperatures), которая определяется как разница между инфекционным титром вируса при оптимальной температуре 34°С и титром при исследуемой температуре, измеряемым в ^ЭИД50/0,2 мл.

Для получения ХЛ вариантов штаммов вируса гриппа А/Краснодар/101/59 и В/Виктория/2/87, пассажи при пониженной температуре инкубации велись параллельно в куриных эмбрионах и в культуре клеток MDCK. На куриных эмбрионах пассажи проводили в течение 3 суток для вируса гриппа Айв течение 4-6 суток для вируса гриппа

В (по 4 суток при температурах 26-30°С и 5-6 суток при температуре 25°С). На культуре клеток МБСК пассажи проводили в течение 3-7 суток, в зависимости от инфекционной активности вируса. Штамм считали обладающим й фенотипом в случае, если он был неспособен к репродукции при повышенной температуре (40°С для вирусов гриппа А, 38°С для вирусов гриппа В), и са фенотипом в случае, если ЯСТ^б 13 1дЭИД50/0,2 мл.

Получение ревертантов ХА штаммов вируса гриппа А (А/Красподар/101/35/59 и А/Ленинград/134/47/57) и штамма вируса гриппа В В/Виктория/2/41/87 проводилось путем пассажей ХА штаммов в куриных эмбрионах при повышенной температуре. Для следующего пассажа куриные эмбрионы заражали 10-кратными разведениями аллантоисной жидкости из предыдущего пассажа. Инкубация при соответствующей температуре проводилась в течение 48 ч для вируса гриппа А и 72 ч для вируса гриппа В. Схема получения ревертантов представлена в таблице 1.

Таблица 1.

Схема высокотемпературных пассажей для получения ревертантов

штаммов вируса гриппа А и В.

Для штаммов АЖраснодар/101/35/59 и А/Ленинград/134/47/57 Для штамма В/Виктория/2/41/87

Номера пассажей Количество пассажей Температура Номера пассажей Количество пассажей Температура

1-3 3 35 1-3 3 35

4-6 3 36 4-6 3 36

7-10 4 37 7-10 4 37

11-13 3 38 11-16 6 37

14-18 5 40 17-18 2 38

Клонирование ХА штаммов и ts+ ревертантов ХА штамма А/Краснодар/101/35/59 методом бляшек проводили в 6-луночных плашках фирмы "Costar" на 3-дневном монослое клеток MDCK по стандартной методике, используя покрытие из 0,5% агарозы, приготовленное на основе

среды Игла MEM, содержащей 2мкг/мл трипсина. Через 3 суток клетки заливали 0,5% покрытием из агарозы, содержащим нейтральрот (1,2 мл 0,1% раствора красителя на 25 мл 0,5% агарозного покрытия). Через сутки проводили учёт бляшек в лунках, заражённых разными разведениями вируса. Материал из бляшек накапливали в куриных эмбрионах и, параллельно, в культуре клеток MDCK.

Для определения репродукции вируса в лёгких и носовых ходах мышей [Неведомская Г.Н. и др., 1992], группы самок беспородных мышей или самок мышей линии Balb/c (по 5-10 штук на группу) заражали интраназально под лёгким эфирным наркозом анализируемыми вирусами в инфекционном титре 107'5 ЭИД5<>/0,2мл (по 50 мкл на мышь). Инфекционный титр вируса в 10%-ной суспензии лёгких или носовых ходов мышей определяли на куриных эмбрионах и выражали в ЭИД50/0,2мл. Статистическую обработку результатов проводили в программе Excel-2007.

Комплементационно-рекомбинационный анализ с использованием одноударных ts мутантов ВЧП проводился по стандартной методике [Ghenkina D.B. and Ghendon Y.Z., 1979]. Монослойную культуру фибробластов куриного эмбриона (ФКЭ) инфицировали параллельно изучаемыми штаммами вируса гриппа человека и десятикратными разведениями ts мутантов ВЧП, относящихся к различным группам рекомбинации. После 30 мин адсорбции монослой инфицированных клеток заливали агаровым покрытием стандартного состава [Белов Г.А., 2002], и инкубировали при 42°С в опытах с ts мутантами штамма Вейбридж и при 40°С в опытах с ts мутантами штамма Росток, а в контрольных опытах при 36°С в течение 72 часов, после чего учитывали количество образующихся бляшек. В контрольных опытах клетки инфицировали только штаммами вируса гриппа человека или только ts мутантами ВЧП.

Выделение вирусной РНК из аллантоисной жидкости или из вируса, концентрированного центрифугированием, проводили при помощи "Набора

для очистки РНК из сыворотки крови" фирмы "Изоген" (Москва) в соответствии с рекомендацией производителя.

Обратную транскрипцию и ПЦР для получения ПЦР-продуктов для последующего секвенирования или рестрикции проводили при помощи системы AccessRT-PCR фирмы "Promega" (в соответствии с рекомендациями производителя). ПЦР-продукты анализировали методом электрофореза в 1,5% агарозном геле, содержащем 1 мкг/мл бромистого этидия, под напряжением 5 В/см.

Анализ стабильности мутаций в геноме ts+ ревертанта ХА штамма А/Ленинград/134/47/57 проводился с использованием ПЦР-рестрикционного метода, разработанного Климовым с соавт. [Klimov A.I. and Сох N.J, 1995; Киселёва и Климов, 2002].

Для секвенирования использовались ПЦР-продукты, очищенные на колонках Wizard ("Promega", США). Секвенирование проводилось фирмой Евроген на автоматическом секвенаторе MegaBACE-500. Для анализа нуклеотидных последовательностей, а также для подбора праймеров для ПЦР и секвенирования использовали пакеты программ VectorNTI 9.0 и Omiga 2.0. Синтез праймеров осуществлялся фирмой "Литех" (Москва).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение молекулярных механизмов адаптации к пониженной температуре вирусов гриппа А и В на модели ХА мутантов штаммов А/Краснодар/101/59 и В/Виктория/2/87.

ХА штамм A/KpacHodap/101/35/59(H2N2).

ХА штамм А/Краснодар/101/35/59(H2N2) (А/Кр/35) прошёл 5 пассажей при 30°С и 25 пассажей при 26°С на куриных эмбрионах, а затем 5 пассажей при 26°С на культуре клеток MDCK (общее число пассажей - 35), после чего, с целью получения генетически однородного штамма, вирус был трижды клонирован методом бляшек в культуре клеток MDCK.

ХА штамм А/Кр/35, в отличие от соответствующего дикого штамма-предка А/Краснодар/101/59 (А/Кр/дт), обладал выраженным 1ч и са фенотипом (Табл. 2), т.е. не был способен к репродукции при температуре 40°С и эффективно репродуцировался при температуре 26°С.

Таблица 2.

Сравнение способности ¿у+ ревертантов ХА штаммов, ХА штаммов и диких

штаммов-предков к репродукции при повышенной и пониженной температуре.

Штамм Титр, в 5о/0,2 мл при температурах, °С, и эемени пассирования RCT

26°С (3 суток) 26°С (6 суток) 34°С (48 ч) 40°С (48 ч) RCT26<3 суток) RCT>6(6 суток) RCT40

А/Кр/дт 2,0 4,2 9,0 Sfl 7,0 4,8 1,0

А/Кр/35 4,0 6,8 10,0 Ô 6,0 3,2 10,0

A/Kp/Revl, неклонированный 3,5 4,2 9,5 8,5 6,0 5,3 1,0

A/Kp/Revl 2,2 4,0 9,0 8,0 6,8 5,0 1,0

A/Kp/Rev2, неклонированный 3,5 5,0 9,0 8,0 5,5 4,0 1,0

A/Kp/Rev2 3,5 5,5 9,0 8,0 5,5 3,5 1,0

А/Лен/дт 2,5 3,5 8,0 6,8 5,5 4,5 1,2

А/Лен/47 4,0 7,0 _9,5 1,0 5,5 2,5 8,5

А/Лен/Rev 2,5 3,0 8,5 8,0 6,0 5,5 0,5

Кроме того, штамм А/Кр/35, в отличие от штамма-предка А/Кр/дт, практически не был способен к репродукции в лёгких мышей (Табл.3), что свидетельствует о снижении патогенности этого штамма.

Секвенирование кодирующих участков всех внутренних генов ХА штамма и его дикого штамма-предка показало, что за время адаптации к пониженной температуре штамм А/Кр/35 приобрёл 13 нуклеотидных замен во всех внутренних генах, кроме гена, кодирующего белки NS1 и NS2, из которых 8 привели к изменению аминокислот в белках РВ2, РВ1, РА, NP, М1 и М2 (Рис. 1). 1

Таблица 3.

Сравнение способности ХА штаммов, их £у+ ревертантов и диких

штаммов-предков к репродукции в органах мышей.

Штамм Средний титр вируса в органах мышей на 3 день после инфицирования, ^ЭИД50/О,2 мл (доверительный интервал, а=0,05)

В носовых ходах В лёгких

А/Кр/дт 1,3±0,4 3,65±0,4

А/Кр/35 0±0 0,4±0,4

А/Кр/11еу1, некпонированный 2,8±0,3 1,6±1

А/Кр/Яеу1 1,5±0,5 2,5±1,2

А/Кр/11еу2, неклонированный 1,2±0,3 0,4±0,6

А/Кр/Леу2 0,8±0,5 0,3±0,5

А/Лен/дт* - 2,0

А/Лен/47* - <1,0

А/ЛенЖеу* - 3,0

В/Вик/дт* 3,9±0,4 3,9±0,3

В/Вик/41* 2,5±0,4 1,8±0,7

В/Вик/63* 2±0,6 0,4±0,4

*Для опытов по репродукции штаммов А/Лен/47, А/Лен/дт, А/Лен/Яег, В/Вик/дт, В/Вик/41, В/Вик/63 в органах мышей использовали самок мышей линии Ва\Ыс. Остальные опыты проводились на самках беспородных мышей. Для одних и тех же штаммов различия в репродукции в органах беспородных мышей и мышей линии Ва1Ь/с были незначительными.

При этом все предсказанные по нуклеотидной последовательности штамма А/Кр/35 аминокислотные замены уникальны для данного штамма среди всех последовательностей нуклеотидов всех штаммов вируса гриппа А человека (Н2№, ЬГШ2 и НШ1), представленных в базе данных вепВапк. Все мутации на уровне аминокислот произошли в консервативных участках соответствующих белков: штаммы вируса гриппа Н2И2, а также штаммы Н3№ и НШ1, с которыми проводилось сравнение, имеют в соответствующих позициях одну и ту же аминокислоту. При этом расположение нуклеотидных замен в геноме штамма А/Кр/35 отличается от

такового для других отсеквенированных к настоящему времени ХА штаммов (А/Ленинград/134/17/57, А/Ленинград/47/57 и А/ЭннАрбор/6/60).

Следует отметить, что мутация в гене Ml штамма АЛСр/35, обуславливающая замену аминокислоты Leul03Ile, лежит в области 101-RKLKR-105, которая в том числе отвечает за связывание белка Ml с РНК. Интересно, что одновременная замена ArglOlSer и Argl05Ser в этой области обуславливает приобретение ts фенотипа штаммом A/WSN/33 [Liu Т. and Ye Z., 2004; Liu Т. and Ye Z., 2005]. Можно предположить важную роль мутации Leul03Ile в М1-белке аця поддержания ts фенотипа штамма А/Кр/35.

размер -ген .(нт)

Val290Le|^/j<\ UCC1494UCUb.,GCG1500GCA

NP 1565

Glu369Vai/R\ /j<VAla433Val

Leu103lleK(M,

M 1027 NS 890

100 500

1000 1500

2000 ht

Рисунок 1. Мутации в геноме ХА штамма А/Кр/35.

Буквой "к" отмечены кодирующие мутации. Уникальные замены по сравнению со штаммами вируса гриппа А человека из базы данных GenBank обведены красным.

По итогам экспериментов нами был получен ХА штамм вируса гриппа А/Краснодар/101/35/59, по своему ts, са и ait фенотипу не уступающий ранее полученным ХА штаммам вируса гриппа - донорам для производства живой

I

гриппозной вакцины и обладающий рядом уникальных мутаций во внутренних генах. Фенотипические характеристики данного штамма говорят о перспективности дальнейших исследований, касающихся его применения для производства живой вакцины против гриппа.

ХА варианты штамма В/Виктория/2/87.

На основе эпидемического штамма В/Виктория/2/87 (В/Вик/дт) методом пассирования при пониженной температуре нами было получено два штамма. Первый из них (В/Виктория/2/41/87 (В/Вик/41)) прошёл 6 пассажей при температуре 30°С и 5 пассажей при 26°С на куриных эмбрионах, а затем 30 пассажей в культуре клеток МБСК при 24-26°С, после чего был трижды клонирован методом бляшек в культуре клеток МБСК. Второй штамм (В/Виктория/2/63/87 (В/Вик/63)), прошёл дополнительно 4 пассажа при 24-26°С на клетках МБСК и 18 пассажей при 24-26°С на куриных эмбрионах и был клонирован трижды методом бляшек для получения генетически однородного штамма.

Таблица 4.

Изменение й и са фенотипа штамма В/Виктория/2/87 (В/Вик/дт) в

процессе пассажей при пониженной температуре.

Штамм Титр, 1£ЭИД5о/0,2мл при температурах, °С, и времени пассирования, сутки ЯСТ

26°С (6 суток) 34°С (3 суток) 38°С (3 суток) 39°С (3 суток) ЯСТ26 (6 суток) ИСТ38 ЯСТз9

родительский штамм В/Вик/дт 2,8 8,0 5,0 1,5 5,2 3,0 6,5

В/Вик/41 4,5 8,5 1,5 <1 4,0 7,0 >7,5

ХА штамм В/Вик/63 6,0 8,0 <1 - 2,0 >7 -

За время пассажей при пониженной температуре ХА штамм В/Вик/63 приобрёл выраженный ¿у и са фенотип (Табл. 4) и был аттенуирован для лабораторных животных (не был способен к репродукции в лёгких мышей и обладал сниженными показателями репродукции в носовых ходах мышей, по сравнению со штаммом-предком В/Вик/дт (Табл.3)). Штамм В/Вик/41, прошедший меньшее количество пассажей при пониженной температуре, по своему фенотипу занимал промежуточное положение между ХА штаммом В/Вик/63 и штаммом-предком В/Вик/дт (Табл.3, Табл.4). Этот штамм

обладал фенотипом, но са фенотип штамма В/Вик/41 был менее выражен, чем для штамма В/Вик/63 (ИСТ26(6 суток)= 5,2; 4,0 и 2,0 ^ЭИД50/0,2 мл для исходного эпидемического штамма В/Вик/дт, штамма В/Вик/41 и ХА штамма В/Вик/63, соответственно). Кроме того, штамм В/Вик/41 обладал ограниченной способностью к репродукции в лёгких мышей (Табл. 3).

размер

ген .

(иг)

РВ2 2396 РВ1 2386 РА 2304

NP 18-11 ]

M 1191 NS 1096

2000 HT

Рисунок 2. Мутации в геноме штаммов В/Вик/41 и В/Вик/63.

Буквой "к" отмечены кодирующие мутации. Синим обведены мутации, отличающие штамм В/Вик/63 от штамма В/Вик/41. Уникальные замены по сравнению со всеми штаммами вируса гриппа В из баш данных GenBank обведены красным. Мутация Val625Ile в гене РА не является полностью уникальной и присутствует у 3% (9 из 317) проанализированных штаммов.

Секвенирование показало (Рис. 2), что за время пассажей при пониженной температуре штамм В/Вик/41 приобрёл 7 мутаций во всех генах, кодирующих внутренние белки (сравнение проводилось с последовательностью нуклеотидов дикого штамма В/Виктория/2/1987 (В/Вик/дт) из базы данных GenBank), причём 5 из них кодировали замену аминокислоты в белках РВ2, РВ1, NP, М1 и NS1. В гене РА присутствовали только некодирующие мутации. Все 5 аминокислотных замен были уникальными по сравнению со всеми штаммами вируса гриппа В из базы данных GenBank (Рис. 2). Секвенирование кодирующей области всех внутренних генов ХА штамма В/Вик/63 выявило две новых мутации (кодирующая мутация в гене РА и некодирующая мутация в М-гене) по

сравнению со штаммом В/Вик/41 (Рис. 2). Расположение обнаруженных в штаммах В/Вик/63 и В/Вик/41 мутаций не коррелировало с расположением уникальных замен в ХА штамме В/ЭннАрбор/1/66 [Hoffmann Е. et al, 2005].

Можно сделать вывод о том, что мутация в гене РА - единственная кодирующая мутация, по которой штамм В/Вик/63 отличается от штамма В/Вик/41 - играет большую роль веаи att фенотипе этого штамма. Замена, которая произошла в РА гене штамма В/Вик/63 (Val625Ile) произошла в консервативном участке этого белка: у 97% всех штаммов вируса гриппа В из базы данных GenBank (308 из 317 штаммов) в позиции 625 стоит валин.

Исследование фенотипа штамма В/Вик/63 показывает, что этот штамм (в отличие от штамма В/Вик/41) по своему ts, са и аттенуированному фенотипу не уступает ранее полученным ХА штаммам вируса гриппа и может быть использован в дальнейшем для производства живой гриппозной вакцины.

Изучение молекулярных механизмов реверсий ХА штаммов к ts+ фенотипу.

ts+ ревертант ХА штамма А/Ленинград/134/47/57.

ts+ ревертант A/JIeH/Rev был получен после 18 пассажей ХА штамма А/Ленинград/134/47/57 (А/Лен/47) при постепенно повышающихся температурах (Табл. 1). За время пассажей штамм А/Лен/Rev приобрёл выраженный ts+ фенотип (т.е. репродуцировался при повышенной температуре так же эффективно, как и при оптимальной температуре), утеряв при этом са фенотип (Табл. 2). При этом штамм А/Лен/Rev, в отличие от исходного ХА штамма-предка А/Лен/47, был способен к репродукции в лёгких мышей (Табл. 3).

ПЦР-рестрикционный анализ мутаций, приобретённых ранее штаммом А/Лен/47 в процессе адаптации к пониженной температуре, выявил наличие единственной истинной реверсии мутации в гене РВ2. Как видно из рисунка ЗА, РВ2 ген аллантоисного ревертанта утерял сайт рестрикции Tru91,

присутствовавший в штамме А/Леи/47. Все остальные исследованные гены по наличию соответствующих сайтов рестрикции были аналогичны таковым для штамма А/Лен/47 (примеры фотографий агарозного геля см. Рис. ЗБ, В).

Рисунок 3. Исследование сохранности уникальных мутаций в геноме ts+ ревертанта А/Лен/Rev методом ПЦР-рестрикционного анализа.

L - ХА штамм А/Лен/47; R - ревертант А/Лен/Rev; НК - эпидемический штамм А/Гонконг/68 (H3N2). Сбоку отмечен размер соответствующих продуктов рестрикции (для гена РВ2 исходный ПЦР-продукт имел размер 240, а продукты рестрикции - размеры 155 и 85 нуклеотидов, для гена PB1 - 304=227+77, для гена NP - 314=287+27). Красным обведена истинная реверсия мутации в гене РВ2 (исчезновение сайта рестрикции, присутствовавшего в геноме ХА штамма). Для остальных генов результаты рестрикционного анализа ревертанта соответствовали таковым для ХА штамма.

Тем не менее, опыты по рекомбинации исследуемого вируса с одноударными ts мутантами ВЧП, содержащими ts мутацию в известном гене (комплементационно-рекомбинационный анализ) показали реверсию фенотипического проявления мутации в трёх генах (РВ2, NP и NS). Как видно из Табл. 5, штамм А/Лен/Rev, в отличие от исходного ХА штамма, «спасал» ts фенотип мутантов ВЧП, имеющих ts мутации в генах, кодирующих белки РВ2, NP и NS, что говорит о наличии фенотипической реверсии проявления ts мутаций, локализованных в соответствующих РНК-сегментах генома ts+ ревертанта. Реверсия ts фенотипа гена РВ2 могла быть связана с прямой реверсией мутации, обнаруженной ПЦР-рестрикционным методом, однако в случае генов, кодирующих белки NP и NS, прямой

а.

тасггоИ)

l r ек.

б.

рв1(нялш) l r нк.

В.

NTffcoP.n l r нк

-!

!е7—éssljl.js^*-314

реверсии не наблюдалось. Было выдвинуто предположение, что в этом случае комплементация с соответствующими мутантами ВЧП обусловлена экстра- или интрагенными супрессорными мутациями.

Таблица 5.

Рекомбинация ревертанта А/Лен/Яеу, исходного ХА штамма А/Ленинград/134/47/57 (А/Лен/47) и дикого штамма А/Краснодар/101/59

(А/Кр/дт) с ts мутантами ВЧП.

Ts мутант Мутант-ный белок Образование бляшек в культуре ФКЭ инфицированной совместно исследуемым вирусом и а мутантами ВЧП при указанных температурах (в БОЕ/мл) Образование бляшек й мутантами ВЧП при указанных температурах (контроль)

А/Лен/47 A/JleH/Rev А/Кр/лг

36°С 40/42°С 36°С 40/42°С 36°С 40/42°С 36°С 40/42°С

о 29 PI32 3-107 <102 1.10s 2.104 1.107 з.ю6 2.107 <102

15/1 РВ1 2.105 <102 2.106 <102 4*105 1.10" 1.105 <102

Й166 РА 5»106 1»105 2«107 1.105 з.ю6 1.105 з.ю® <102

US1 NP ыол < 1 о2 1«10'' 2.104 2.106 з.ю5 1.106 <Ю2

йЗОЗ/1 М1/М2 6.10s ю2 3.105 <102 6.105 6«103 5.105 <102

MN3 NS1/NS2 МО'' <10: 2.10'' 5.104 8.105 З.Ю4 2.Ю6 <ю2

Обозначения: Красным отмечены гены, в которых произошла реверсия и мутации.

Секвенирование кодирующей части "внутренних" генов ts+ ревертанта А/Лен/Rev (A/Leningrad/134/47/fe+18/1957(H2N2), GenBank, EF633437 -EF633442) выявило возникновение в процессе адаптации к повышенной температуре 27 новых мутаций во всех "внутренних" генах, из которых 13 кодируют замену аминокислот во всех внутренних белках, кроме М2 и NS2 (сравнение проводилось с последовательностью штамма А/Лен/47 из базы данных GenBank (А/Ленинград/134/47/57, М81582 - М81587)) (Рис. 4).

Секвенирование подтвердило сохранность всех мутаций, приобретённых ранее штаммом А/Лен/47 в процессе холодовой адаптации, кроме двух мутаций - в гене РВ2 (478Val->Leu->Val) и в гене РВ1 (265Lys->Asn—>Lys) (Рис. 4), причём реверсия ts мутации в гене РВ1, в отличие от реверсии в гене РВ2, не была обнаружена методом ПЦР-рестрикционного анализа. Последнее связано с тем, что на нуклеотидном

уровне истинной реверсии не произошло (8190—>Т—>А), в результате чего не произошло восстановление сайта рестрикции рестриктазы НтсИН.

Реверсии мутаций в генах РВ1 и РВ2, или некоторые из дополнительных мутаций в геноме штамма А/Лен/Яеу, в соответствии с результатами комплементационно-рекомбинационного теста,

супрессировали фенотипическое проявление /.у мутаций в генах МР и N8 £$+ ревертанта. Полученные данные не позволяют судить о том, какие именно мутации обусловили супрессию.

ген

размер

(нт) РВ2 2341

РВ1 2341

I

Leu478Val К К

оо I i j Mb

37ain I

Gln686Glu ьУ

PA 2 23J ¡ША

Asp327Glu Val463Ala

NP 1565

M102'' M.

n -5-5 Д, Pro164Leu' Pro23Ala

100 500 1000

Рисунок 4. Мутации во внутренних генах ts+ ревертанта А/Лен/Rev. Буквой "к" отмечены кодирующие мутации. Зелёным отмечены мутации, приобретённые ХА штаммом в процессе пассажей при пониженной температуре и сохранившиеся в геноме ts+ ревертанта. Жёлтым отмечены новые мутации, приобретённые ts+ ревертантом. Красным отмечены истинные реверсии мутаций. На рисунке текстом обозначены только кодирующие мутации в геноме ts+ревертанта.

Полученные данные об истинных реверсиях в геноме штамма А/Лен/Rev свидетельствуют в пользу того, что реверсия в большой мере произошла благодаря мутациям в генах, кодирующих белки РВ2 и РВ1, что соответствует данным литературы о роли этих генов в проявлении ts фенотипа различными штаммами вируса гриппа [Hoffmann Е. et al, 2005; Jin

H. et al, 2003; Jin H. et al., 2004; Kiseleva I. et al., 2010; Klimov A.I. et al., 2001]. Тем не менее, нельзя исключить роль дополнительных мутаций в реверсии фенотипа штамма А/Лен/47 в процессе пассажей при высокой температуре, за счёт явлений экстра- и интрагенной супрессии ts мутаций в генах NP и NS. По имеющимся данным нельзя судить об экстра- или интрагенной природе мутаций, супрессирующих фенотип гена NP. Мутация в гене NS2 достоверно была супрессирована экстрагенно, поскольку новых мутаций в участке гена, кодирующем белок NS2, обнаружено не было, однако невозможно сказать о том, какой ген является супрессором в данном случае.

Г.9+ реевртанты ХА штамма А/Краснодар/101/35/59.

ts+ ревертанты штамма А/Кр/35 (A/Kp/Revl и A/Kp/Rev2) были получены по той же схеме, что и ts+ ревертант штамма А/Лен/47 (Табл. 1). За время пассажей при повышенной температуре ревертанты штамма А/Кр/35, так же, как и ревертант штамма А/Лен/47, приобрели ts+ фенотип (RCT40=1 lg3Hfl50/0,2 мл), но при этом были способны к ограниченной репродукции при пониженной температуре (RCT26<6 суток)=3,2-5 ^ЭИД5о/0,2 мл) (Табл. 2).

Штамм A/Kp/Revl, подобно штамму А/Лен/Rev, в процессе пассажей при повышенной температуре утерял аттенуированный фенотип, в то время как ревертант A/Kp/Rev2 по своей способности к репродукции в лёгких и носовых ходах мышей был близок к исходному ХА штамму А/Кр/35 (Табл. 3). Надо отметить, что трёхкратное клонирование методом бляшек практически не повлияло на фенотип ревертантов штамма А/Кр/35 (Табл. 2, Табл. 3).

В целом изучение ts+ ревертантов ХА штаммов А/Лен/47 и А/Кр/35 показало, что реверсия к ts+ фенотипу может сопровождаться разной степенью выраженности са фенотипа и не всегда приводит к потере аттенуированного фенотипа на модели мышей. Из этого следует, что за са, ts и аттенуированный фенотип ХА штамма А/Кр/35 отвечают разные мутации в

его геноме. Судя по данным литературы, это общая закономерность для ХА штаммов вируса гриппа [Киселёва И.В. и др., 2003; Ларионова Н.В. и др., 2006; Panzig В. et al., 1984; Zhang Y.M. et al., 1982].

Секвенирование всех внутренних генов ts+ ревертанта A/Kp/Rev2 показало, что реверсия штамма A/Kp/Rev2 произошла за счёт 2-х истинных реверсий (в генах, кодирующих белки М2 (42Ile—>Val—>11е) и NP (369Glu->Val—>Glu)) и 15 дополнительных мутаций во всех внутренних генах, кроме гена РА (из них 9 - кодирующих замену аминокислоты) (Рис. 5). размер

ген

(нт) ~thr178met u

Lys627Glu.

РВ2 2341

РВ1 2341 ¿ЦйЭД

РА 2233

Lys103Arg к Рго28'

NP1565 ЛМи клт К£Ш)..

мЛГЧШ

Gfy47CysK(NSl)

NS 890

100 500

K(NS2) Phe107Leu

А» I .....^ I

1000

1500 2000 HT

Рисунок 5. Мутации во внутренних генах (5+ ревертанта А/Кр/Яеу2. Буквой "к" отмечены кодирующие мутации. Зелёным отмечены мутации, приобретённые ХА штаммом в процессе пассажей при пониженной температуре и сохранившиеся в геноме £?+ ревертанта. Жёлтым отмечены новые мутации, приобретённые И+ ревертантом. Красным отмечены истинные реверсии мутаций. На рисунке текстом обозначены только кодирующие мутации в геноме /5+ревертанта.

Можно заключить, что истинных реверсии мутаций в М2 и № генах, даже при наличие ряда дополнительных мутаций, недостаточно для потери ХА штаммом аттенуированного фенотипа для мышей.

Новая мутация в гене, кодирующем белок М1 (А^ЖЬув), лежит в участке 101-105 этого белка. В этом же участке возникла мутация в ХА штамме А/Кр/35 (ЬеиЮЗНе), сохранившаяся в процессе пассажей при

повышенной температуре в геноме штамма A/Kp/Rev2. Не исключено, что мутация ArglOlLys супрессировала действие мутации Leul03Ile.

Наши результаты говорят о большой стабильности ряда маркёров аттенуированного фенотипа ХА штаммов вируса гриппа А: во-первых, для реверсии ts+ фенотипа данных штаммов потребовалось большое количество пассажей (около 18-ти) при постепенно повышающихся температурах; во-вторых, даже реверсия ts фенотипа не всегда сопровождалась полной реверсией са и ait фенотипа.

ts+ ревертант штамма В/Виктория/2/41/87.

Полученный после 18 пассажей при повышенной температуре ts+ ревертант В/Вик/Rev (Табл.1) не только утерял ts фенотип, присущий штамму В/Вик/41, но обладал более выраженным ts+ фенотипом по сравнению со своим диким штаммом-предком (RCT38=7,0; 3,0 и <1 ^ЭИД50/0,2 мл, для штаммов В/Вик/41, В/Вик/дт и В/Вик/Rev, соответственно) (Табл. 6). При этом, изменения способности к репродукции при пониженной температуре не произошло (RCT26(6)=3,5-4,5 ^ЭИД50/0,2 мл для ревертантов и 4 ^ЭИД50/0,2 мл для ХА штамма).

Таблица 6.

Изменение ts и са фенотипа ХА штамма В/Виктория/2/41/87 (В/Вик/41)

в процессе пассажей при повышенной температуре.

Штамм Титр, ^ЭИД5о/0,2мл при температурах, °С, и времени пассирования, сутки RCT

26°С (6 суток) 34°С (3 суток) 38°С (3 суток) 39°С (3 суток) RCT26(6 суток) RCT38 RCT39

В/Вик/дт 2,8 8,0 5,0 1,5 5,2 3,0 6,5

В/Вик/41 4,5 8,5 1,5 0 4,0 7,0 8,5

В/Вик/Rev 4,5 7,5 7,5 1,5 3,0 0 6,0

Итак, результаты исследования реверсии к Лу+ фенотипу штамма В/Вик/41 так же, как и в случае ревертантов вирусов гриппа А, говорят о

большой степени стабильности фенотипа ХА штаммов вируса гриппа и о том, что ts+ фенотип не всегда сочетается с неспособностью к репродукции при пониженной температуре. Изучение полученных в работе ревертантов показывает, что за са и за ts фенотип ХА штаммов отвечают разные мутации, что совпадает с данными по исследованию других ХА штаммов вируса гриппа [Chen Z. et al., 2006; Hoffmann E. et al., 2005]. Выводы:

1. ХА штаммы вируса гриппа А/Краснодар/101/35/59 и В/Виктория/2/63/87 обладают са, ts и att фенотипом и могут быть предложены в качестве кандидатов штаммов-доноров для производства живых гриппозных вакцин.

2. Большая часть мутаций, ответственных за ts и са фенотип, в ХА штаммах вируса гриппа А/Краснодар/101/35/59 и В/Виктория/2/63/87 расположены в консервативных участках белков.

3. Не наблюдается корреляции в расположении уникальных замен в геноме ХА штаммов вируса гриппа А/Краснодар/101/35/59 и В/Виктория/2/63/87 и в геноме ХА штаммов, полученных другими исследователями.

4. Для адаптации штамма вируса гриппа В/Виктория/2/87 к пониженной температуре потребовалось в два раза больше пассажей по сравнению со штаммом А/Краснодар/101/59, однако темпы реверсии вирусов гриппа А и В к ts+ фенотипу оказались сравнимыми.

5. ХА штаммы вируса гриппа А и В обладают высокой стабильностью са и ts фенотипа.

6. Реверсия ts фенотипа ХА штаммов вируса гриппа А и В не всегда сопровождается реверсией са фенотипа и утерей аттенуированного фенотипа.

7. Реверсии ts фенотипа XA штаммов вируса гриппа обусловлены появлением как истинных реверсий, так и интра- или экстрагенных супрессорных мутаций в отдельных генах.

8. Реверсия ts мутации в NS гене ts+ ревертанта штамма А/Ленинград/134/47/57 обусловлена явлением экстрагенной супрессии, а реверсия ts мутации в NP гене - экстра- или интрагенной супрессией.

9. Реверсия ts фенотипа ХА штаммов обусловлена как истинными реверсиями, так и супрессорными мутациями. В соответствии с этим для анализа стабильности генома ХА штаммов и изолятов вакцинных штаммов от вакцинированных людей следует применять методы, позволяющие оценить наличие как истинных реверсий, так и супрессорных мутаций (например, полное секвенирование генома или комбинацию ПЦР-рестрикционного и комплементационно-рекомбинационного анализа).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Маркушин С.Г. Молекулярные механизмы реверсий к ts+ фенотипу холодоадаптированных штаммов вируса гриппа А - доноров для живых гриппозных вакцин. / Акопова И.И., Коптяева И.Б., Цфасман Т.М. и Гендон Ю.З. // Вопросы вирусологии. -2006. - Т. 51. №5. - С. 17-22.

2. Цфасман Т.М. Молекулярные механизмы реверсий к 1з+-фенотипу и их зависимость от способов пассирования холодоадаптированного штамма вируса гриппа А - донора аттенуации для производства живых гриппозных вакцин. / Маркушин С.Г., Акопова И.И. и Коптяева И.Б. // Актуальные вопросы эпидемиологии инфекционных болезней (сборник научных трудов). Российская академия последипломного образования, каф. эпидемиологии. - 2006. - Вып.8 - С. 513-515.

3. Tsfasman Т. Molecular mechanisms of reversion to the ts+ (non-temperature-sensitive) phenotype of influenza A cold-adapted (ca) virus strains. / Markushin S., Akopova I. and Ghendon Y. // Journal of General Virology. - 2007 - Vol. 88 - P. 2724-2729.

4. Гендон Ю.З. Холодоадаптированный штамм вируса гриппа A/H2N2 Краснодар/101/59/35, предназначенный в качестве штамма-донора аттенуации для получения реассортантных холодоадаптированных вакцинных штаммов для живой

гриппозной вакцины / Маркушин С. Г., Акопова И. И., Коптяева И. Б. и Цфасман Т.М. // Патент РФ № 2354695.

5. Markushin S. Molecular mechanisms of reversion to the ts+ phenotype of cold-adapted influenza A strains - attenuation donors for the influenza reassortant live attenuated vaccines. / Akopova I., Koptiaeva I., Tsfasman T. and Ghendon Y. // Salamanca, Spain, June 17-22, 2006 Abstracts of 13-th international conference on negative strand viruses - 2006. - P. 214.

6. Цфасман Т.М. Молекулярные механизмы реверсий к ts+ фенотипу холодоадаптированных штаммов вируса гриппа А - доноров для живых гриппозных вакцин. / Маркушин С.Г., Акопова И.И., Коптяева И.Б. и Гендон Ю.З. // Москва. 12-15 апреля 2006г. Тезисы XIII международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных "Ломоносов-2006" - 2006. - С. 242-243.

7. Tsfasman Т. Molecular mechanisms of reversion to the ts+ phenotype of influenza A cold-adapted virus strains. / Markushin S., Akopova I. and Ghendon Y. // Nuernberg, Germany, September 1-5, 2007. Third European Congress of Virology Programme and Abstracts - 2007 -P.83.

8. Tsfasman T. Reversion to the ts+ phenotype of influenza A cold-adapted strains associated with the loss of attenuated phenotype in mice. / Markushin S., Akopova I., Kopriaeva I. and Ghendon Y. // Heidelberg, Germany, March 5-8, 2008. 18th Annual Meeting of the Society for Virology,, Programme and Abstracts - 2008. - P. 276.

9. Akopova I. Novel cold-adapted influenza virus strain A/Krasnodar/101/35/59(H2N2) for live influenza vaccine production. / Tsfasman T., Markushin S., Ghendon Y. and Faizuloev E. // Istanbul, Turkey, August 10-15, 2008. IUMS Congress: 14th International Congress of Virology -2008.-P. 159.

10. Tsfasman T. Reversion to the ts+ phenotype of influenza A cold-adapted strains is not always associated with the loss of attenuated phenotype in mouse lung. / Markushin S. and Ghendon Y. // Leipzig, Germany, March 18-21, 2009. 19th Annual Meeting of the Society for Virology-2009.-P. 176.

Н.Цфасман Т.М. Механизмы реверсий холодоадаптированных вакцинных штаммов вируса гриппа А к ts+ фенотипу на примере ts+ ревертантов штаммов А/Ленинград/134/47/57 и А/Краснодар/101/59/35. / Маркушин С.Г., Акопова И.И., Коптяева И.Б. и Гендон Ю.З. // Санкт-Петербург. 28-29 октября 2009. Сборник статей и тезисов международной научной конференции "Противогриппозные вакцины нового поколения" - 2009. - С. 82-83.

Подписано в печать:

05.07.2010

Заказ № 3931 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Цфасман, Татьяна Михайловна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Живые противовирусные вакцины — проблемы и преимущества.

1.1.1. Общая характеристика живых противовирусных вакцин.

1.1.2. Проблемы, связанные с применением живых противовирусных вакцин.

1.1.3. Способы улучшения живых противовирусных вакцин.

1.2. Вирус гриппа: строение вириона и геном.

1.3. Генетика вируса гриппа.

1.3.1. Мутационная изменчивость.

1.3.2. Рекомбинационная изменчивость.

1.3.3. Экстрагенные и интрагенные супрессии.

1.4. Живые холодоадаптированные гриппозные вакцины.

1.4.1. Получение живых гриппозных вакцин.

1.4.2. Механизмы аттенуации ХА штаммов-доноров для производства ЖГВ.

1.4.3. Генетическая стабильность аттенуированных штаммов и вакцин, полученных на их основе.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.1.1. Реактивы.

2.1.2. Лабораторные штаммы вирусов.

2.1.3. Клеточные линии и куриные эмбрионы.

2.2. Методы.

2.2.1. Работа с культурами клеток.

2.2.2. Определение инфекционного титра вирусов в ЭИД50 и накопление вирусов для последующих опытов.

2.2.3. Получение ХА вариантов штаммов вируса гриппа А/Краснодар/101/59 и В/Виктория/2/87.

2.2.4. Получение ts+ ревертантов ХА штаммов вируса гриппа А (А/Краснодар/101/35/59 и А/Ленинград/134/47/57) и ХА штамма вируса гриппа В (В/Виктория/2/41/87).

2.2.5. Клонирование ХА штаммов и ts+ ревертантов ХА штамма А/Краснодар/101/35/59 методом бляшек.!.

2.2.6. Оценка патогенности вирусов для мышей.

2.2.7. Комплементационно-рекомбинационный тест.

2.2.8. Очистка вируса и выделение вирионной РНК.

2.2.9. Получение ПЦР-продуктов для последующего секвенирования или ПЦР-рестрикционного анализа.

2.2.10. ПЦР-рестрикционный метод.

2.2.11. Очистка ПЦР-продуктов.

2.2.12. Секвестрование.

2.2.13. Статистическая обработка результатов опытов по оценке патогенности вирусов для мышей.

2.2.14. Компьютерное обеспечение.

Глава 3. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ АДАПТАЦИИ К ПОНИЖЕННОЙ ТЕМПЕРАТУРЕ ВИРУСОВ ГРИППА А И В НА МОДЕЛИ ХА МУТАНТОВ ШТАММОВ А/КРАСНОДАР/101/59 И В/ВИКТОРИЯ/2/87.

3.1. Биологические свойства и мутации в геноме ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2Ы2) - потомка эпидемического штамма А/Краснодар/101/59.

3.2. Биологические свойства и мутации в геноме ХА вариантов штамма В/Виктория/2/87.

Глава 4. ИЗУЧЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МЕХАНИЗМОВ РЕВЕРСИЙ ХА ШТАММОВ К ts+ ФЕНОТИПУ.

4.1. Получение и биологические свойства ts+ ревертанта ХА штамма А/Ленинград/134/47/57.

4.2. Получение и биологические свойства ревертантов ХА штамма А/Краснодар/101/35/59.

4.3. Получение и биологические свойства ¿5+ ревертанта ХА штамма В/Виктория/2/41/87.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярные механизмы холодоадаптации и реверсий к TS+фенотипу вирусов гриппа A и B"

Актуальность проблемы.

Вакцинопрофилактика является важнейшим способом борьбы с эпидемиями гриппа. Наряду с инактивированными вакцинами, широко используются живые вакцины против гриппа (ЖГВ) [Гендон, 2004].

Применение живых противовирусных вакцин связано с риском возникновения вакциноассоциированного заболевания в результате реверсии фенотипа или селекции более патогенных вариантов из гетерогенной популяции вакцинного штамма [Murphy B.R. and Chanock, 2001]. Таким образом, чрезвычайно важными являются исследования стабильности фенотипа вакцинных штаммов в разных условиях и контроль генетической однородности популяции вакцинного штамма, а также изучение механизмов, приводящих к аттенуации вакцинных штаммов.

Для получения живых гриппозных вакцин используют холодоадаптированные (ХА) штаммы. Основными фенотипическими маркёрами, которые определяют аттенуацию ХА штаммов, являются са и ts фенотип, т.е. способность к эффективной репродукции при пониженной (26°С) и неспособность к репродукции при повышенной (39-40 С) температуре [Александрова и Климов, 1994; Ambrose et al., 2008]. Считается, что са, ts и аттенуированный фенотип ХА штаммов стабилен благодаря мутациям в генах, кодирующих внутренние белки вириона (РВ2, РВ1, РА, NP, М1/М2 и NS1/NS2), приобретённым этими штаммами в процессе адаптации к пониженной температуре [Jin et al., 2003; Jin et al., 2004a; Hoffmann et al., 2005; Kiseleva et al., 2004a; Kiseleva et al., 2010; Klimov et al., 1992].

Несмотря на то, что живые гриппозные вакцины на основе ХА штаммов в течение многих лет используются в России и в США, механизмы адаптации вирусов гриппа к пониженной температуре до сих пор изучены недостаточно. Роль различных генов в аттенуации ХА штаммов исследована лишь для четырёх штаммов, которые используются для производства вакцины: А/Энн Арбор/6/60, В/Энн Арбор/1/66, А/Ленинград/134/17/57, В/СССР/60/69 [Jin et al., 2003; Jin et al., 2004a; Hoffmann et al., 2005; Kiseleva et al., 2004a; Kiseleva et al., 2010]. Среди этих четырёх штаммов наиболее подробно изучены штаммы А/Энн Арбор/6/60 и В/Энн Арбор/1/66: известно, какой минимальный набор мутаций требуется для проявления са, ts и аттенуированного фенотипа этих штаммов и какие этапы жизненного цикла вируса нарушены в связи с этими мутациями [Jin et al., 2003; Jin et al., 2004a; Hoffmann et al., 2005; Chan et al., 2008; Chen et al., 2006; Chen et al., 2008]. Для двух других штаммов — А/Ленинград/134/17/57 и А/Ленинград/134/47/57, полученных на основе одного и того же предкового штамма — известно, какие именно мутации произошли в процессе адаптации этих штаммов к пониженной температуре (для остальных штаммов неизвестны соответствующие предковые дикие штаммы, с которыми можно было бы провести сравнение) [Медведева и др., 1991; Ghendon et al., 1984; Herlocher et al., 1993; KlimovetaL, 1992].

Неясно, есть ли определённые локусы, в которых возникают мутации при адаптации вирусов гриппа к пониженной температуре или подобная адаптация и, соответственно, сходный фенотип ХА штаммов, может быть обусловлен различным сочетанием мутаций в разных генах? Всегда ли важные для поддержания ts, са и аттенуированного фенотипа мутации возникают в консервативных участках белков? В таком случае, большая часть подобных мутаций должны быть уникальными для ХА штаммов по сравнению с эпидемическими штаммами вируса гриппа.

Известно, что темпы накопления мутаций для вирусов гриппа В ниже, чем для вирусов гриппа А. Проблема различия темпов накопления мутаций вирусами гриппа А и В в процессе адаптации к пониженной температуре и обратной адаптации ХА штаммов к повышенной температуре требует дальнейшего изучения.

Как было сказано выше, аттенуированный фенотип ХА штаммов стабилен благодаря мутациям во всех внутренних генах этих штаммов. Существует ряд методов, контролирующих сохранность этих мутаций, однако все эти методы имеют свои ограничения. Так, ПЦР-рестрикционный метод, применявшийся в том числе для контроля стабильности генома изолятов вакцинных штаммов от вакцинированных людей, не позволяет судить о возможном накоплении в геноме ХА штамма дополнительных супрессорных мутаций.

В связи с этим возникает вопрос, действительно ли са и аттенуированный фенотип ХА штаммов связан только с сохранностью вышеупомянутых мутаций и возможна ли реверсия фенотипа ХА штаммов без реверсии этих мутаций, за счёт экстра- или интрагенной суппрессии?

Несмотря на подтверждённую стабильность фенотипа ХА штаммов вируса гриппа т у1уо, неясно, при каких условиях возможна реверсия фенотипа подобных штаммов и достижимы ли эти условия во время репликации вируса в организме человека. Неизвестно, какие мутации могут обусловить подобную реверсию и какую роль в реверсии фенотипа ХА штаммов будут играть истинные реверсии мутаций, присутствовавших в геноме ХА штаммов.

Получить ответ на эти вопросы чрезвычайно важно прежде всего с точки зрения безопасности применения живой гриппозной вакцины.

Цели и задачи исследования.

Основной целью работы было изучение молекулярных механизмов холодоадаптации и реверсий вирусов гриппа А и В.

В первой части работы планировалось получить и охарактеризовать новые ХА штаммы вируса гриппа А и В — кандидаты в штаммы-доноры аттенуации для получения ЖГВ.

Вторая часть работы заключалась в изучении молекулярных механизмов реверсий к ts+ фенотипу ХА штаммов-доноров аттенуации для живых гриппозных реассортантных вакцин на модели полученных в лаборатории ts+ ревертантов ХА штаммов А/Ленинград/134/47/57, А/Краснодар/101/35/59 и В/Виктория/2/41/87.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Получить ХА варианты штаммов вируса гриппа на основе эпидемических штаммов А/Краснодар/101/59 и В/Виктория/2/87 путём пассажей при пониженной температуре и изучить их ts, са и аттенуированный фенотип, а также мутации, приобретённые за время пассажей при пониженной температуре.

2. Получить ts+ ревертанты ХА штаммов А/Ленинград/134/47/57, А/Краснодар/101/3 5/59 и В/Виктория/2/41/87 путём пассажей данных штаммов при постепенно повышающихся температурах и изучить их са и аттенуированный фенотип.

3. Оценить эффективность методов комплементационно-рекомбинационного и ПЦР-рестрикционного анализа для контроля стабильности ts мутаций в геноме ХА штаммов и для обнаружения истинных реверсий и супрессорных мутаций на модели ревертанта ХА штамма А/Ленинград/134/47/57.

4. Методом секвенирования выявить истинные реверсии ts и са мутаций и супрессорные мутации, возникшие в геноме £у+ ревертанта штамма А/Ленинград/134/47/57 и одного из ts+ ревертантов ХА штамма А/Краснодар/101/35/59 в процессе пассажей при повышенной температуре.

Научная новизна работы.

Изучение фенотипа новых ХА штаммов и мутаций в их геноме вносит существенный вклад в понимание механизмов аттенуации вируса гриппа.

Впервые показана возможность получения ts+ ревертантов ХА штаммов вируса гриппа в лабораторных условиях и показана роль как истинных реверсий, так и супрессорных мутаций в реверсии к фенотипу ХА штаммов вируса гриппа.

Практическая значимость.

1. Полученные и охарактеризованные в работе ХА штаммы А/Краснодар/101/35/59 и В/Виктория/2/63/87 могут быть предложены как штаммы-кандидаты для получения живой гриппозной вакцины.

2. Показано, что для эффективного контроля генетической стабильности и безопасности ХА штаммов-доноров аттенуации вируса гриппа целесообразно комбинированное применение нескольких методов исследования, например, ПЦР-рестрикционного метода и комплементационно-рекомбинационного метода.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. ХА штаммы А/Краснодар/101/59 и В/Виктория/2/87 могут быть исследованы в качестве новых доноров для получения живой вакцины против гриппа, производимой на куриных эмбрионах или в культуре клеток МОСК.

2. Са, ¿у и аттенуированный фенотип ХА штаммов может быть обусловлен различным сочетанием мутаций в разных генах. Мутации в ХА штаммах А/Краснодар/101/35/59 и В/Виктория/2/63/87 были уникальными для этих штаммов по сравнению с другими известными ХА штаммами. Большая часть накопленных за время адаптации к пониженной температуре мутаций специфична для данного ХА штамма и не встречается у эпидемических штаммов вируса гриппа.

3. ХА штаммы вируса гриппа обладают большой степенью фенотипической стабильности. Реверсия ts фенотипа этих штаммов происходит только при условиях, которые не достижимы во время репликации в организме человека (большое количество пассажей при постепенно повышающихся температурах). Данные условия позволяют получить ts+ ревертант ХА штамма, который, тем не менее, может при этом обладать частичным са и аттенуированным фенотипом, что дополнительно подтверждает стабильность фенотипа ХА штаммов.

4. Для реверсии фенотипа ХА штаммов важны как истинные реверсии, так и суппрессорные мутации. В соответствии с этим для анализа стабильности генома ХА штаммов и изолятов вакцинных штаммов от вакцинированных людей следует применять методы, позволяющие оценить наличие как истинных реверсий, так и суппрессорных мутаций (например, полное секвенирование генома или комбинацию ПЦР-рестрикционного и комплементационно-рекомбинационного анализа).

5. Для адаптации вирусов гриппа В к пониженной температуре требуется большее количество пассажей, по сравнению с вирусами гриппа А, что подтверждается результатами этой работы и исследованиями других учёных. Тем не менее, наши данные по получению ревертантов ХА штаммов А/Краснодар/101/35/59 и В/Виктория/2/41/87 позволяют предположить, что вирусы гриппа А и В имеют сравнимые темпы обратной адаптации к повышенной температуре.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Цфасман, Татьяна Михайловна

ВЫВОДЫ:

1. ХА штаммы вируса гриппа А/Краснодар/101/3 5/59 и В/Виктория/2/63/87 обладают са, ts и att фенотипом и могут быть предложены в качестве кандидатов штаммов-доноров для производства живых гриппозных вакцин.

2. Большая часть мутаций, ответственных за ts и са фенотип, в ХА штаммах вируса гриппа А/Краснодар/101/35/59 и В/Виктория/2/63/87 расположены в консервативных участках белков.

3. Не наблюдается корреляции в расположении уникальных замен в геноме ХА штаммов вируса гриппа А/Краснодар/101/35/59 и В/Виктория/2/63/87 и в геноме ХА штаммов, полученных другими исследователями.

4. Для адаптации штамма вируса гриппа В/Виктория/2/87 к пониженной температуре потребовалось в два раза больше пассажей по сравнению со штаммом А/Краснодар/101/59, однако темпы реверсии вирусов гриппа А и В к ts+ фенотипу оказались сравнимыми.

5. ХА штаммы вируса гриппа А и В обладают высокой стабильностью са и ts фенотипа.

6. Реверсия ts фенотипа ХА штаммов вируса гриппа А и В не всегда сопровождается реверсией са фенотипа и утерей аттенуированного фенотипа.

7. Реверсии ts фенотипа ХА штаммов вируса гриппа обусловлены появлением как истинных реверсий, так и интра- или экстрагенных супрессорных мутаций в отдельных генах.

8. Реверсия ts мутации в N8 гене ts+ ревертанта штамма А/Ленинград/134/47/57 обусловлена явлением экстрагенной супрессии, а реверсия ts мутации в гене — экстра- или интрагенной супрессией.

9. Реверсия ts фенотипа ХА штаммов обусловлена как истинными реверсиями, так и супрессорными мутациями. В соответствии с этим для анализа стабильности генома ХА штаммов и изолятов вакцинных штаммов от вакцинированных людей следует применять методы, позволяющие оценить наличие как истинных реверсий, так и супрессорных мутаций (например, полное секвенирование генома или комбинацию ПЦР-рестрикционного и комплементационно-рекомбинационного анализа).

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает глубокую благодарность научному руководителю, д.м.н. Маркушину Станиславу Георгиевичу за постановку темы, обучение в процессе работы, ценные советы на всём протяжении работы и моральную поддержку.

Автор выражает благодарность д.м.н. Гендону Юрию Захаровичу за помощь в интерпретации результатов работы и ценные замечания по поводу полученных результатов на всём протяжении работы.

Автор выражает благодарность к.б.н. Акоповой Ирине Ивановне за помощь в получении ХА штаммов вируса гриппа А и В и в изучении их фенотипа.

Автор выражает благодарность к.б.н. Файзулоеву Евгению Борисовичу за помощь в подборе праймеров, подготовке ПЦР-продуктов и анализе результатов секвенирования ХА штаммов, а также за ценные советы.

Автор выражает благодарность к.б.н. Коптяевой Ирине Борисовне за помощь в культивировании клеток МЕ)СК.

Автор выражает благодарность всем остальным сотрудникам лаборатории РНК-содержащих вирусов за поддержку.

Автор выражает отдельную благодарность Илье Иткину за помощь в литературной правке текста работы.

Автор выражает благодарность рецензентам работы к.б.н. Файзулоеву Евгению Борисовичу и к.м.н. Ганковской Оксане Анатольевне за внимательное чтение работы и за ценные замечания по сути работы и по поводу её текста.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе путём пассажей при пониженной температуре были получены ХА штаммы А/Краснодар/101/35/59 и В/Виктория/2/63/87. Было показано, что эти штаммы обладают са и ¿у фенотипом и не уступают по своему фенотипу ХА штаммам, используемым в настоящее время для поизводства живой гриппозной вакцины. Как показали опыты на мышах, вирулентность полученных штаммов была снижена по сравнению с исходными дикими штаммами. Таким образом, можно утверждать, что целесообразно дальнейшее изучение возможности применения ХА штаммов А/Краснодар/101/35/59 и В/Виктория/2/63/87 в качестве штаммов-доноров аттенуации для производства живой гриппозной вакцины.

Изучение мутационных изменений в геноме ХА штаммов вируса гриппа А/Краснодар/101/35/59 и В/Виктория/2/63/87 показало, что адаптация к пониженной температуре может быть обусловлена различными мутациями. Не было замечено никакой корреляции между набором мутаций в ХА штаммах А/Краснодар/101/35/59 и В/Виктория/2/63/87 по сравнению с ранее изученными ХА штаммами. При этом подавляющее число мутаций в геноме ХА штаммов уникальны для ХА штамма (то есть не встречаются у эпидемических штаммов вируса гриппа), что говорит о том, что мутации, отвечающие за са, Лу и аП фенотип возникают в консервативных (и, соответственно, функционально важных) участках белков.

Изучение молекулярных механизмов реверсий ХА штаммов к £у+ фенотипу указывает на высокую стабильность фенотипа ХА штаммов, в том числе аттенуированного фенотипа. Реверсия фенотипа ХА штаммов возможна в условиях, которые не достижимы во время репликации вируса в организме человека (более 10 пассажей при повышении температуры на 1-2°С через каждые 2-3 пассажа). При этом реверсия ¿у фенотипа не всегда приводит к реверсии са и аМ фенотипа, что подтверждает данные литературы о том, что за са, и аи фенотип отвечают мутации в различных участках генома ХА штаммов вирусов гриппа А и В.

Наши данные говорят о том, что реверсии ¿у фенотипа ХА штаммов обусловлены появлением как истинных реверсий, так и интра- или экстрагенных супрессорных мутаций. Было показано, что ¿у мутации в генах n8 и 1чпр ревертанта АУЛенинград/134/47/57/Яеу были супрессированы другими мутациями, возникшими в геноме ревертанта, причём в случае N8 гена произошла экстрагенная супрессия мутации, а в случае гена полученные данные не позволяют сделать вывод о природе супрессии.

Поскольку в реверсии ts фенотипа вакцинных штаммов могут играть роль как истинные реверсии, так и супрессорные мутации, для контроля стабильности фенотипа ХА вакцинных реассортантных штаммов вируса гриппа более целесообразно секвенирование всех внутренних генов изолятов ХА штаммов или комплексное применение ПЦР-рестрикционного метода и комплементационно-рекомбинационного метода. Сочетание этих методов позволит делать выводы как о прямых реверсиях мутации, так и о возможных супрессорных мутациях, не давая при этом информации о экстра- или интрагенной природе супрессий.

Интересно отметить, что для адаптации вирусов гриппа В к пониженной температуре требуется приблизительно в два раза больше пассажей по сравнению с вирусами гриппа А, что подтверждается данными литературы и результатами данной работы. Однако, наши данные по изучению ревертантов ХА штаммов А/Краснодар/101/35/59 и В/Виктория/2/63/87 говорят в пользу того, что вируса гриппа А и В имеют сравнимые темпы реверсии к фенотипу, то есть сравнимые темпы обратной адаптации к повышенной температуре.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Цфасман, Татьяна Михайловна, Москва

1. Александрова Г.И., Климов А.И. (1994) Живая вакцина против гриппа. //СПб.: Наука, 151с.

2. Белов Г.А. (2002) Практикум по общей вирусологии: Учеб. пособие п/ред. И.Г. Атабекова, 2-е изд.//М.: Издательство МГУ, 184 с.

3. Гендон Ю.З. (2004) Преимущества и недостатки инактивированной и живой вакцины против гриппа. //Вопросы вирусологии, 49(4): 4-12.

4. Дешева Ю.А., Руденко Л.Г., Климов А.И. (2007) Определение состава генома реассортантных холодоадаптированных штаммов вируса гриппа В методом рестриктазного анализа //Вопросы вирусологии, 52(3): 16-19.

5. Киселёва И.В, Григорьева Е.П., Найхин А.Н., Иванова В.В., Ларионова Н.В. и др. (2003) Температурочувствительность эпидемических вирусов гриппа А как возможный маркёр иммуногенности реассортантных вакцинных штаммов. //Вопросы вирусологии, 48(4): 2629.

6. Киселёва И.В., Климов А.И. (2002) Анализ мутаций в геноме холодадаптированных штаммов вируса гриппа А с использованием расширенной модификации ПЦР-рестриктного метода. //Вопросы вирусологии, 47(6): 24-27.

7. Медведева Т.Е., Романова Ю.Р., Гущина М.И., Руденко Л.Г., Гендон Ю.З. и др. (1990) Ts фенотип реизолятов от детей, привитых живой холодоадаптированной гриппозной вакциной типа А. //Вопросы вирусологии, 35(2): 105-108.

8. Неведомская Г.Н., Медведева Т.Е., Жихарёва И.В., Климов А.И., Александрова Г.И. (1992) Оценка степени аттенуации холодоадаптированных штаммов вируса гриппа А на моделях мышей линии СВА и сирийских хомячков. //Вопросы вирусологии, 37(1): 37-40.

9. Сейбиль В.Б., Малышкина Л.П. (2005) Всемирная организация здравоохранения и проблема ликвидации инфекционных заболеваний в мире. //Вопросы вирусологии, 50(3): 60-63.

10. Шубладзе А.К. и Гайдамович С.Я. (1954) Краткий курс практической вирусологии. Изд 2-е, переработанное и дополненное. // М.: Гос. изд-во мед. лит-ры. Медгиз, 380 с.

11. Яковенко М. Л., Короткова Е. А. (2008) Эволюция вакцинных штаммов полиовируса. //Вопросы вирусологии, 53(3): 45-48.

12. Afzal М.А., Pickford A.R., Forsey Т., Heath А.В., Minor P.D. (1993)The Jeryl Lynn vaccine strain of mumps virus is a mixture of two distinct isolates. Journal of General Virology, 74( Pt 5): 917-920.

13. Albo C., Valencia A., Portela A. (1995) Identification of an RNA binding region within the N-terminal third of the influenza A virus nucleoprotein. //Virology, 69(6): 3799-3806.

14. Ambrose C.S., Luke C., Coelingh K. (2008) Current status of live attenuated influenza vaccine in the United States for seasonal and pandemic influenza. //Influenza and other respiratory viruses, 2(6): 193-202.

15. Biswas S.K., Boutz P.L., Nayak D.P. (1998) Influenza virus nucleoprotein interacts with influenza virus polymerase proteins. //Virology, 72(7): 5493-5501.

16. Blinov V.M., Kiselev O.G. (2006) Molecular mechanism of recombination and evolution of H5N1 influenza viruses. //The 10th ISTC/Korea workshop, March 14-15, Jeonam Provincial Office, Mokpo Shinan Beach Hotel.

17. Buonagurio D.A., O'neill R.E., Shutyak L., D'Arco G.A., Bechert T.M. et al. (2006b) Genetic and phenotypic stability of cold-adapted influenza viruses in a trivalent vaccine administered to children in a day care setting. //Virology, 347(2): 296-306.

18. Chen Z., Aspelund A., Kemble G., Jin H. (2006) Genetic mapping of the cold-adapted phenotype of B/Ann Arbor/1/66, the master donor virus for live attenuated influenza vaccines (FluMist). //Virology, 345(2): 416423.

19. Chen Z., Aspelund A., Kemble G., Jin H. (2008) Molecular studies of temperature-sensitive replication of the cold-adapted B/Ann Arbor/1/66, the master donor virus for live attenuated influenza FluMist vaccines. //Virology, 380(2): 354-362.

20. Elton D., Medcalf L., Bishop K., Harrison D., Digard P. (1999) Identification of amino acid residues of influenza virus nucleoprotein essential for RNA binding. //Virology, 73(9): 7357-7367.

21. Falcon A.M., Fortes P., Marion R.M., Beloso A., Ortin J. (1999) Interaction of influenza virus NS1 protein and the human homologue of Staufen in vivo and in vitro. //Nucleic Acids Research, 27(11): 2241-2247.

22. Fouchier R.A., Munster V., Wallensten A., Bestebroer T.M., Herfst S. et al. (2005) Characterization of a novel influenza A virus hemagglutinin subtype (HI 6) obtained from black-headed gulls. //Virology, 79(5): 2814-2822.

23. Galler R., Pugachev K.V., Santos C.L., Ocran S.W., Jabor A.V. et al. (2001) Phenotypic and molecular analyses of yellow fever 17 DD vaccine viruses associated with serious adverse events in Brazil. //Virology, 290(2): 309-319.

24. Ghedin E., Sengamalay N.A., Shumway M., Zaborsky J., Feldblyum T. et al. (2005) Large-scale sequencing of human influenza reveals the dynamic nature of viral genome evolution. //Nature, 437(7062): 1162-1166.

25. Ghendon Y.Z. (1998) Cold-adapted, live influenza vaccines developed in Russia. //Textbook of influenza. Ed. Nicholson K., Webster R., Hay A.; Blackwell science, 391-399.

26. Ghendon Y.Z., Markushin S.G. (1980) Studies on mutation lesions and physiology of fowl plague virus ts mutants. //Philosophic Transactions of the Royal Society of London, B, 288(1029): 383-392.

27. Haaheim L.R., Pattison J.R., Whitley R.J. (2002) A practical guide to clinical virology. //John Wiley and Sons Ltd.

28. Hale B.G., Randall R.E., Ortin J., Jackson D. (2008) The multifunctional NS1 protein of influenza A viruses. //Journal of General Virology, 89, 2359-2376.

29. Hambleton S., Gershon A.A. (2005) Preventing varicella-zoster disease. //Clinical Microbiology Reviews, 18(1): 70-80.

30. Hay A.J., Lomniczi B., Bellamy A.R., Skehel J.J. (1977) Transcription of the influenza virus genome. //Virology, 83(2): 337-355.

31. Herlocher M.L., Clavo A.C., Maassab H.F. (1996) Sequence comparisons of A/AA/6/60 influenza viruses: mutations which may contribute to attenuation. //Virus Research, 42: 11-25.

32. Herlocher M.L., Maassab H.F., Webster R.G. (1993) Molecular and biological changes in the cold-adapted "master strain" A/AA/6/60 (H2N2) influenza virus. //Proceedings of National Academy of Sciences USA, 90: 6032-6036.

33. Hoffmann E., Mahmood K., Chen Z., Yang C-F., Spaete J. et al. (2005) Multiple gene segments control the temperature sensitivity and attenuation phenotypes of ca B/Ann Arbor/1/66 //Virology, 79(17): 1101411021.

34. Holmes E.C., Ghedin E., Miller N., Taylor J., Bao Y. et al. (2005) Whole-genome analysis of human influenza A virus reveals multiple persistent lineages and reassortment among recent H3N2 viruses. //PLoS Biology, 3(9): e300.

35. Honda A., Mizumoto K., Ishihama A. (1999) Two separate sequences of PB2 subunit constitute the RNA cap-binding site of influenza virus RNA polymerase. //Genes to cells, 4(8): 471-478.

36. Imai M., Kawasaki K., Odagiri T. (2008) Cytoplasmic domain of influenza B virus BM2 protein plays critical roles in production of infectious virus. //Journal of Virology, 82(2): 728-739.

37. Jennings A.D., Gibson C.A., Miller B.R., Mathews J.H., Mitchell C.J. et al. (1994) Analysis of a yellow fever virus isolated from a fatal case of vaccine-associated human encephalitis. //Journal of Infectious Diseases, 169: 512-518.

38. Jin H., Lu B., Zhou H., Kemble G. (2004a) Genetic studies of FluMist influenza vaccines derived from cold-adapted A/Ann Arbor/6/60. //International congress series 1263: 153-156.

39. Jin H., Lu B., Zhou H., Ma Ch., Zhao J. et al. (2003) Multiple amino acid residues confer temperature sensitivity to human influenza virus vaccine strains (FluMist) derived from cold-adapted A/Ann Arbor/6/60. //Virology, 306(1): 18-24.

40. Keawcharoen J., Oraveerakul K., Kuiken T., Fouchier R.A., Amonsin A. et al. (2004) Avian influenza H5N1 in tigers and leopards. //Emerging Infectious Diseases, 10(12): 2189-2191.

41. Kendal A.P., Maassab H.F., Alexandrova G.I., Ghendon Y.Z. (1981) Development of cold-adapted recombinant live, attenuated influenza A vaccines in the U.S.A. and U.S.S.R. //Antiviral Research, 1: 339-365.

42. Kiseleva I., Su Q., Toner T.J., Szymkowiak C., Kwan W.S. et al. (2004b) Cell-based assay for the determination of temperature sensitive andcold adapted phenotypes of influenza viruses. //Journal of Virological Methods, 116(1): 71-78.

43. Klimov A.I., Cox N.J. (1995) PCR restriction analysis of genome composition and stability of cold-adapted reassortant live influenza vaccines //Virological Methods, 52: 41-49.

44. Klimov A.I., Cox N.J., Yotov W., Rocha E., Alexandrova G.I. et al. (1992) Sequence changes in the live attenuated, cold-adapted variants of influenza A /Leningrad/134/57 (H2N2) virus. //Virology, 186(2): 795-797.

45. Kosutic-Gulija T., Forcic D., Santak M., Ramljak A., Mateljak-Lukacevic S. et al. (2008) Genetic heterogeneity of L-Zagreb mumps virus vaccine strain //Virology Journal, 5: 79.

46. Lamb R.A., Krug R.M. (2001) Orthomyxoviridae. In: Knippe D.M., Howley P.M., Griffin D.E. et al.; Fields Virology, 4-th edition. //Lippincott Williams & Wilkins.

47. Lee K.-H., Seo S.-U., Song J.-M., Lee C.-M., Kim H.-A. et al. (2006) Characterization of live influenza vaccine donor strain derived from cold-adaptation of X-31 virus. //Vaccine, 24(11): 1966-1974.

48. Li C., Hatta M., Watanabe S., Neumann G., Kawaoka Y. (2008) Compatibility among polymerase subunit proteins is a restricting factor in reassortment between equine H7N7 and human H3N2 influenza viruses. //Journal of Virology, 82(23): 11880-11888.

49. Lin Y.P., Gregory V., Bennett M., Hay A. (2004) Recent changes among human influenza viruses. //Virus Research, 103(1-2): 47-52.

50. Lindsey N.P., Schroeder B.A., Miller E.R., Braun M.M., Hinckley A.F. et al. (2008) Adverse event reports following yellow fever vaccination. //Vaccine, 26(48): 6077-6082.

51. Liu T., Ye Z. (2004) Introduction of a temperature-sensitive phenotype into influenza A/WSN/33 virus by altering the basic amino acid domain of influenza virus matrix protein. //Journal of Virology, 78(18): 95859591.

52. Liu T., Ye Z. (2005) Attenuating mutations of the matrix gene of influenza A/WSN/33 virus. //Journal of Virology, 79(3): 1918-1923.

53. Maier H.J., Kashiwagi Т., Нага К., Brownlee G.G. (2008) Differential role of the influenza A virus polymerase PA subunit for vRNA and cRNA promoter binding //Virology, 370: 194-204.

54. Maniatis Т., Fritsch E.F., Sambrook J. (1982) Molecular cloning. (A laboratory manual). //Cold spring harbor laboratory, 545 pp.

55. Marion R.M., Aragon Т., Beloso A., Nieto A., Ortin J. (1997) The N-terminal half of the influenza virus NS1 protein is sufficient for nuclear retention of mRNA and enhancement of viral mRNA translation. //Nucleic Acids Research, 25(21): 4271-4277.

56. Mazur I., Anhlan D., Mitzner D., Wixler L., Schubert U. et al. (2008) The proapoptotic influenza A virus protein PB1-F2 regulates viral polymerase activity by interaction with the PB1 protein //Cell Microbiology, 10(5): 1140-52.

57. Mostow S.R., Hopkins J.A., Wright P.F. (1979) Behavior of vaccine revertants of temperature-sensitive mutants of influenza virus in ferret tracheal organ culture //infection and Immunity, 26(1): 193-196.

58. Mould J. A., Paterson R.G., Takeda M., Ohigashi Y., Venkataraman P. et al. (2003) Influenza В virus BM2 protein has ion channel activity that conducts protons across membranes //Developmental Cell, 5(1): 175-184.

59. Murphy B.R., Chanock R.M. (2001) Immunization against viral diseases. In: Knippe D.M., Howley P.M., Griffin D.E. et al.; Fields Virology, 4th edition. //Lippincott Williams & Wilkins.

60. Murphy T.V., Gargiullo P.M., Massoudi M.S., Nelson D.B., Jumaan A.O. et al. (2001) Intussusception among Infants Given an Oral Rotavirus Vaccine //The New England Journal of Medicine, 344: 564-572.

61. Murphy T.V., Smith P.J., Gargiullo P.M., Schwarz B. (2003) The first rotavirus vaccine and intussusception: epidemiological studies and policy decisions //The Journal of Infectious Diseases, 187: 1309-1313.

62. NayakD.P., Baloguna R.A., Yamada H., Zhou Z.H., Barman S. (2009) Influenza virus morphogenesis and budding //Virus Research, 143(2): 147-161.

63. Nayak D.P., Hui E.K., Barman S. (2004) Assembly and budding of influenza virus.//Virus Research, 106(2): 147-165.

64. Nobusawa E., Sato K. (2006) Comparison of mutation rates of human influenza A and B viruses. //Journal of Virology, 80(7): 3675-3678.

65. Obayashi E., Yoshida H., Kawai F., Shibayama N., Kawaguchi A. et al. (2008) The structural basis for an essential subunit interaction in influenza virus RNA polymerase. //Nature, 454(7208): 1127-1131.

66. Odoom J.K., Yunus Z., Dunn G., Minor P.D., Martin J. (2008) Changes in population dynamics during long-term evolution of sabin type 1 poliovirus in an immunodeficient patient //Journal of Virology, 82(18): 91799190.

67. Paterson R.G., Takeda M., Ohigashi Y., Pinto L.H., Lamb R.A. (2003) Influenza B virus BM2 protein is an oligomeric integral membrane protein expressed at the cell surface. //Virology, 306(1): 7-17.

68. Poole E., Elton D., Medcalf L., Digard P. (2004) Functional domains of the influenza A virus PB2 protein: identification of NP- and PB1-binding sites //Virology, 321(1): 120-133.

69. Portela A., Digard P. (2002) The influenza virus nucleoprotein: a multifunctional RNA-binding protein pivotal to virus replication. //General Virology, 83(4): 723-734.

70. Qian X.Y., Alonso-Caplen F., Krug R.M. (1994) Two functional domains of the influenza virus NS1 protein are required for regulation of nuclear export of mRNA. //Virology, 68(4): 2433-2441.

71. Quinlivan M., Zamarin D., Garcia-Sastre A., Cullinane A., Chambers T. et al. (2005) Attenuation of equine influenza viruses through truncations of the NS1 protein. //Virology, 79(13): 8431-8439.

72. Racaniello V.R. (2006) One hundred years of poliovirus pathogenesis. //Virology, 344(1): 9-16.

73. Rodriguez A., Pérez-González A., Nieto A. (2007) Influenza virus infection causes specific degradation of the largest subunit of cellular RNA polymerase II. //Journal of Virology, 81(10): 5315-5324.

74. Rudenko L.G., Kiseleva I.V., Larionova N.V., Grigorieva E.P., Naikhin A.N. et al. (2004) Analysis of some factors influencing immunogenicity of live cold-adapted reassortant influenza vaccines. //International congress series 1263: 542-546.

75. Sauder C.J., Vandenburgh K.M., Iskow R.C., Malik T., Carbone K.M. et al. (2006) Changes in mumps virus neurovirulence phenotype associated with quasispecies heterogeneity. //Virology, 350(1): 48-57.

76. Scholtissek Chr., Spring S.B. (1981) Extragenic suppression of temperature-sensitive mutations in RNA segment 8 by replacement of different RNA segments with those of other influenza A virus prototype strains. //Virology, 118(1): 28-34.

77. Seo S.U., Byun Y.H., Lee E.Y., Jung E.J., Jang Y.H. et al. (2008) Development and characterization of a live attenuated influenza B virus vaccine candidate. //Vaccine, 26(7): 874-881.

78. Smith D.B., Inglis S.C. (1987) The mutation rate and variability of eukaryotic viruses: an analytical review. //Journal of General Virology, 68(Pt 11): 2729-40.

79. Snyder M.H., Betts R.F., DeBorde D., Tierney E.L., Clements M.L. et al. (1988) Four viral genes independantly contribute to attenuation of live influenza A/AA/6/60 cold-adapted reassortant virus vaccines. //Virology, 62(2): 488-495.

80. Sweet T.M., Maassab H.F., Herlocher M.L. (2004) Reverse genetics studies of attenuation of the ca A/AA/6/60 influenza virus: the role of the matrix gene. //Biomedicine and pharmacotherapy, 58(9): 509-515.

81. Treanor J.J., Buja R., Murphy B.R. (1991) Intragenic suppression of a deletion mutation of the nonstructural gene of an influenza A virus. //Virology, 65(8): 4204-4210.

82. Treanor J.J., Perkins M., Battaglia R., Murphy B.R. (1994) Evaluation of the genetic stability of the temperature-sensitive PB2 gene mutation of the influenza A/Ann Arbor/6/60 cold-adapted vaccine virus. //Virology, 68(12): 7684-7688.

83. Watson J.M. (1998) Surveillance of influenza. In Karl G. Nicholson et al.; Textbook of influenza. //Blackwell science: 207-216.

84. Wilschut J., McElhaney J.E. (2005) Rapid reference: Influenza. //Printed by Grafos, Spain: Mosby, 216 pp.

85. Wong S.S., Yuen K.Y. (2006) Avian influenza virus infections in humans.//Chest, 129(1): 156-168.

86. Wright K.E., Dimock K., Brown E.G. (2000) Biological characteristics of genetic variants of Urabe AM9 mumps vaccine virus. //Virus research, 67(1): 49-57

87. Wright P.F., Webster R.G. (2001) Orthomyxoviruses. In: Knippe D.M., Howley P.M., Griffin D.E. et al. Fields Virology, 4-th edition. //Lippincott Williams & Wilkins.

88. Yin-Murphy M., Almond J.W. (1996) Picornaviruses In: Peake R.C., James D. A., Susman M. et al.; Medical microbiology, 4-th edition, ed. by Baron S.

89. Youil R., Kiseleva I., Kwan W.S., Szymkowiak C., Toner T.J. et al. (2004) Phenotypic and genetic analyses of the heterogeneous population present in the cold-adapted master donor strain: A/Leningrad/134/17/57 (H2N2).//Virus Research, 102(2): 165-176.

90. Yuan P., Bartlam M., Lou Z., Chen S., Zhou J. et al. (2009) Crystal structure of an avian influenza polymerase PA(N) reveals an endonuclease active site. //Nature, 458(7240): 909-913.

91. Zamarin D., Ortigoza M.B., Palese P. (2006) Influenza A virus PB1-F2 protein contributes to viral pathogenesis in mice. //Journal of Virology, 80(16): 7976-7983.

92. Zhang Y.M., Tian S.F., Zhu J.M. (1982) Identification of naturally occurring temperature-sensitive strains of influenza A virus and location of their genetic lesions. //Scientia Sinica, B., 25(4): 411-419.