Молекулярно-этиологический анализ современного разнообразия вирусов гриппа А человека

Петров, Николай Алексеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-этиологический анализ современного разнообразия вирусов гриппа А человека
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-этиологический анализ современного разнообразия вирусов гриппа А человека"

АКАДЕМИЯ ЩЩИНСКИХ НАУК СССР ИНСТИТУТ ВИРУСОЛОГИИ им. л. И. ИВАНОВСКОГО

На правах руиюписи УДК 578. 832,1: 578. 223-24, 547.963,616. 98

ПЕТРОВ КгколаЯ Алетееешм ШЛШГУЛЛРНа-ЭТИОЛОШЕСЗПВ! АЛАЛИЗ СОБРЕ? ЕЖСГО РДЗ/ЮСЕРЛОНЯ

в:ерусоз гргшпл л чзшеел 03. 00. 03 - Молекулярная биология

есхйлд,

обобщающий опубликованные работы на соискание ученой степени доктора биологических наук

Мэсква - 1991'

Работа выполнена во ВШШ молекулярной биологии НПО "Вектор" Мшмед прока СССР, пос. Кольцово Новосибирского района

Научные консультанты: профессор, доктор мед. наук Д. Б. ГОЛУБЕВ, доктор биол.наук С. К. ВАСИЛЕНКО

Официальные оппоненты:

профессор, д<?ктор Виол, тук Ж. Г. ХАРИТОНЕНКОВ профессор, доктор бшл. наук 0. И. КИСЕЛЕВ профессор, доктор мед. наук В. А. ЗУЕВ

Ведущее учреждение: НИИ эпидемиологии и ифекдионных болезней им. Л. Е Громашевского Ю УССР, г. Киев.

Защита состоится' ". " 1991 г. в " " часов

на заседании Специализированного Совета (Д 001.20.01) при Институте вирусологии им. Д. И. Ивановского АМН СССР (г.Мэскава, 123098,уд. Гамалеи 16) ,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института вирусологии им. Л- И. Ивановского АМН ССОР

Автореферат разослан " *' 1991 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета, кандидат медицинских наук

А. М. ЖУКОВСШ

ртгций | обвдя характеристика исследования

'Ш'УМЬШЮТЬ ПРОБЛЕМЫ. Грипп представляет собой самую массово инфекцию человечества,приносящую значительный экономический ущерб. Эффективных средстз борьбы с этим заболеванием до сих пор не найдено,что во многом обусловлено чрезвычайной изменчивостью и разнообразием природных популяций вируса гриппа, быстрой сменой господствующих в данном регионе вариантов. Осчовнн»

ПрЗНШКЫ ТаКОЙ нарчасельности НавеСТНЬ!: еТО Н'гКОПлеНУ.е V'1.' Г'^Л;:':;',

в гене геычи'слш'лятн (НА) и н«йраминидазч з рачках одного антигенного подтипа (антигенный дрейф),неожиданное появление ь эпидемической циркуляции вирусов е поверхностными антигенами иного антигенного подтипа (шифр) и обмен сегментами генома между вирусами (реассортация). Тем не менее,во многом остается неясными как молекулярные закономерности антигенного дрейфа, так и источники и механизмы появления з эпидемическом процессе вирусов новых антигенных подтипов. Аналогичные проблемы в той или иной мере актуальны и для вирусов ящура и СЩД. Особую проблему представляют случаи изоляции минорных компонентов эпидемического процесса - вирусов гриппа так называемых "неактуальных" антигенных подтипов или "антигенных анахронизмов", вызывающих среди специалистов острые концептуальные споры, неразрешимые классическими вирусологическими методами.

В этиологическом надзоре зз гриппом в '¿аней стране до последнего вре*:?ни -практически не использовался_такой моаньй метод анализа как прямее секвеяированае вирусных геномов. Применение новых скоростных методик определения первичной структуры РНК открывает перспективы детального анализа изменений, происходящих е генах вирусов гриппа как в ее ственнкх условиях, так и в процессе получения вакцинных с.таммсв. Актуарным представляется исследование законемерностел и распрсе-гг* ненность в природе феномена реаесортации.

ШЬЮ НАСТОЯЩЕЙ РАБОТЫ явилось использование сезр^якнх '-*ето-дов молекулярной гибридизации и прямого праймерного еега^шгл-вания:

для изучения структуры природных популяции вируос2 л

человека, включат и минорны? их компоненты

для выяснения внутренних молекулярных закономерностей антигенного дрейфа, шфта к реаееортацик

характеризации персистектных вирусов и вакцинных штаммов,а также возможной роли антропогенного фактора в биосфере. ЕШНЛЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ. В результате структурно-функционального анализа полученных данных о перЕИч-кой структуре геномов вирусов гриппа А подтверждала "нейтралистская" концепция эволюционного процесса б природных популяциях, позволяющая упорядочить разнообразие вирусов,объединяв данные классической вирусологии и структурного анализа и выявив определенные связи между изменениями первичной структуры геноЕ и фенотипом.

. Установлены структурные особенности локальных подгрупп современных вирусов сероподтипов ДНЗН2) и А(КШ1)..причем обнаружен реверсивный характер поздних фаз антигенного дрейфа вирусов подтипа А(БЗЫЕ).

Впервые изучены на уровне первичной структуры представители нескольких атипичных групп вирусов гриппа А различных антигенных подтипов. Показана 'их гетерогенность в отношении пер-еичной структуры генома м происхождения, а в ряде случаев выявлена пряьая свявь с антропогенным воздействием- на биосферу,в частности,с вакцинацией.

Подробно исследованы молекулярные изменения,происходящие в генах вирусов гриппа в процессах их лабораторного пассирования и приготовления вакцинных штаммов,выявлены внутренние молекулярные маркера в, геномах некоторых штаммов,широко применяющихся для получения вакцин против гриппа.

Создан банк клонированных ДНК-копи2 всех генов вируса гриппа А и на его основе разработан новый метод молекулярной конкурентной точечной гибридизации,позволяющий стандартно и бистро генотюировать вирусы гриппа А всех актуальных для человека антигенных подтипов с определением происхождения генов внутрених и неструктурных белков. С помощью этого метода проведен анализ ряда лабораторных вирусов и природных изолятоб и

выявлены естественные реассортантные геномы,которые далее были исследованы на уровне первичной структуры .

На основе структурного анализа генов внутренних белков вирусов гриппа А человека различных антигенных подтипов установлено преимущественное сохранение их при реассортации в процессах истинных антигенных шифтов и обнаружено неизвестное ранее явление шфта гена белка РВ1.

При исследовании модельных и природных персистентных вирусов. гриппа человека установлены определенные закономерности молекулярных изменений в гене НА и показана потенциальная возможность длительного сохранения практически неизменных вирусных геномов в человеческой популяции.

В совокупности результаты работы представляют собой составную часть научных основ нового перспективного научного направления - молекулярной эпидемиологии гриппа. Они широко используются в практике этиологического надзора за гриппом в СССР и при подготовке вакцинных штаммов.

По материалам работы получено ? авторских свидетельств на изобретения,во Всесоюзной коллекции микроорганизмов депонированы 8 штаммов E.coli с плазмидами,несущими ДНК-копии всех сегментов генома вируса гриппа А. Материалы диссертации изложены в 24 статьях. Результаты работы представлены на научном семинаре • Института вирусологии им. Д. И. Ивановского АМН СССР,г. Москва,1989 г. , на Всесоюзном симпозиуме "Вакцины,диагностические средства и новая биотехнология",г. Пушино,1988 г., на международном симпозиуме "Фундаментальные и прикладные вопросы СПИД,вирусных гепатитов и гриппа,г. Суздаль,1983 г., на ?-м Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов",г. Москва,1990 г. , на Республиканской конференции "современные методы лабораторной диагностики вирусных и бактериальных инфекций»включая СПИД",г. Алушта,1990 г.

©ВРШШШ РШШ

г. естой! шхвдоаашш.

~ Первичная структура геномов вирусов гршиа А изучалась ыетодэм прямого прайшрного секвенирования. Сугзость его закатается в том, что в 5'-конец о^тоиукхэотлдного прайшра,комплементарного строго определенному участку вирусного генома, вводится радиоактивная кетка. После откига каченного прай-шра с суммарной внрионной РНК осуществляется его достройка с помощью обратной транскриптазы я керадиоактивных предЕсствен-ииков на матрице ШЛ вируса гриппа,в результате чего образуется меченная по 5*-концу одноцепочечиая копия определенного участка вирусного геноха. ГЬслге соответствующей очистки радиоактивные продукты достройки секвенирухется химическим методом Максама-Гилберта Места: "посадки" прайшров выбраны на расстоянии 200-250 нуклеотндов друг от друга по всей длине гена»так что расшифрованная последовательность нуклеотидов,прочитанная с любого кь.них,перекрывается на 50-100 остатков с последовательностью, прочитанной с соседнего праймера.

13реику|десгво метода состоит в том, что исключается трудоемкая стадия клонирования и поиска кДНК в плазыидньос векторах, а конечный результат не зависит от незначительных вариаций первичной структуры отдельных молекул рнк (внутришпудяционной микрогетерогенности генома) и ошбок ревертазы. Он отражает доминантную структуру генома, присущую подавляющему большинству молекул,т. е. структуру всей вирусной популяции как таковой. Введение ж стадии клонирования позволяет определить лишь первичную структуру единственной случайно выбранной молекулы,которая обычно содеряит шторные вамеиы нуклеотидов, не характерные для популяции в целом.что вызывает необходимость дополнительного секвенирования нескольких независимых клонов.

Метод позволяет йсаользовать для секвенирования практически неочищенные препараты вирусной РНК, подученные фенол-детергентами методом из осветленной аллантоисной жидкости.

Более прямой вариант,когда достройка праймера осуществляется ревертазой в присутствии терминаторов транскрипции (метод

Сзнгера) „обладает теки недостатками, что мозязт происходить "паразит? юе" праймирование путем еамэзатразкм со случайных мест в гекоке и в примаслю: РНК. Кроме того,он чувствителен к первичной и вторичной структуре РНК, что приводит к неспецифической терминацш;.

Олкгонуклеотидные праймэры размером 12-23 нуклеотидных остатка,комплементарные единственному участку на всем протяжении вирусного генома и универсальные длп достаточно широкого круга гомологичных вирусов гриппа,синтезированы ГКФ "Импульс" НПО "Вектор" (п.Кольцово Новосибирского района). Ревертаза вируса миелобластоза птиц производства Омутнинского химзавода (п.Восточный Кировской области). Радиоактивные препараты производства кооператива "Биос" (ХОП "Радиопрепарат",г. Таксект). Вирусные препараты получены из лабораторий Института вирусологии им. Д. И. Ивановского ' АМН СССР (г. Москва), ВНИИ гриппа КЗ СССР (г. Ленинград) и Омутнинского химзавода (коммерческие вакцинные препараты).

2. змшшерксшз антигенного дршш пгггоярукшк ееруссз

гриппа А ЧВХСШ&.

г. 1. ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА ГЕНА НД ЛОКАЛЬНЫХ АНТИГЕННЫХ ПОДГРУПП

ВИРУСОВ ГРИППА ПОЛТИПА А[НЗН2).

.. Вирусы гриппа антигенного подтипа А( НЗШ),после продолжительного перерыва,вновь, появились в человеческой популяции в •1968 году,вызвав,пандемию,и с тех пор сохраняют эпидемическую активность,подвергаясь антигенному дрейфу. В первое десятилетие- смена доминирующих вариантов происходила'достаточно быстро, через ксидае 1 3 года,и приводила к неоСра-ымому вытеснению предшествовавшей антигенной разновидности иэ атипического процесса. : Лишь однавдн, в 1975-76'годах, зафиксировано параллельное сосуде тшвание двух антигенных подгрупп (этпоны А^Викгория/3/75 и А/Ан1'лин/Зи4/70). В последние годы гетерогенность природных популяций вирусов этого подтипа значительно

возросла,что связано с отсутствием явно доминирующего варианта и более длительным сосуществованием различных локально сформировавшихся антигенных подгрупп. Столь длительное,более двух десятилетий,развитие эпидемического процесса с участием вирусов гриппа А(ЙЗМ2) дает редкую возможность непосредственного изучения быстрых микроэволюционных процессов в природных популяциях в их динамике. ~

Общеизвестно, что определяющей' молекулярной основой антигенного дрейфа служит накопление мутаций в гене НА,сопровождаемое сменой доминирующего варианта Мутация при атом должна рассматриваться как явление не столько молекулярное,сколько популяционное,связанное с отбором из ухе существующей внутри-популяционной микрогетерогенности генофонда. Химическое по сути изменение становится биологическим только в результате его распространения на большую часть соответствующей популяции -"закрепления" мутации. Ведущей причиной такого закрепления новых мугаций оказывается непрерывное возрастание коллективного иммунитета популяции хозяина Механизм,обеспечивающий отбор и закрепление дрейфовых мутаций - это непрерывная циркуляция вируса от одной хозяйской особи к другой в частично иммунной популяции, связанная с периодическими резкими уменьшениями эффективной численности популяции вируса и отбором минорных субпопуляций.

С целью выяснения харкгёрных особенностей современных локальных антигенных подгрупп вирусов гриппа А(ВЗМ2) и закономерностей антигенного дрейфа за 20 лет нами определена первичная структура наиболее типичных представителей этих подгрупп, выделенных на территории СССР,а также ряда международных эталонов и вирусов прошлых лет: А/Гонконг/1/68, А/Викто-рия/35/72, А/Ленинград/538/74, А/Ленинград/337/76, А/Ленинград/385/80, А/Филиппины/2/82, А/СССР/31/85, А/СССР/3/85, А/СССР/281/86, А/Риг-а/9977/86, А/Виктория/7/87, А/Сычу-ань/2/87, А/СССР/21/88.

Структурно-функциональный анализ в сравнении с литератур-

води дашжми позволял выявить специфические особенности аминокислотной последовательности НА вирусов различных подгрупп, суммированные в слйл.1 (Везде а тексте и таблицах нумерация нут;готидов дается от 5'-конца позитивной цепи гена, а аминокислотных остатков - от И-конца соответствующего зрелого белка). Среди них ютско выделить две подгуппы,характерные для Л"'Л - "филиппинскую" и "миссисипекую" (эталоны Л/Филиппины/2/82 и А/)гжеисипи/1/Р5), европейскую и азиатскую разновидности подгуппы "кен" (.эталон А/Б*н/1/84), а-э истоке- г-'— хоокеанскуы подгруппу "сычуань" (эталоны А/'Сычуань/г/37 и А/Шанх8й/И/87). Представителя всех этих подгрупп практически одновременно коциркулировали на территории СССР,создавая значительное разнообразие в антигенных свойствах изолируемых штаммов. Специфические особенности структуры гена НА каждой из подгрупп дают возможность выяснения путей проникновения на территорию пашей страны возбудителей конкретных эпидемий. Следует отметить,что формировние локальных подгрупп на террирории СССР не обнаружено.

2. 2. РЕВЕРСИВНЫЙ ХАРАКТЕР ПОЗМЕП ФАЗЫ АНТИГЕННОГО ДРЕЙФА

ВИРУСОВ ГРИППА

Анализ конкретных мутаций аминокислот в НА современных вирусов гриппа А(НЗМ2) обнаружил,что более половины из них представляют собой повторные мутации в тех л© положениях молекулы, по которым уже происходили замены в ходе антигенного дрейфа с 1968 года. Более того,основная часть таких повторных мутаций оказывается реверсиями,восстанавливающими в данном участке структуру белка более раннего дрейф-варианта или прототипа - А/Гонконг/1/63.

Это приводит к своеобразному новому феномену "имитации" современными вирусами А(НЗДЗ) ряда антигенных характеристик предш(>ствоваших ' лрейф-вариантов. Так, вирусы подгруппы "к-''И" 1985 года (.отечественный вриант А/СССР/2/в5),в отличие от "фи-

липпинской" подгруппы,нейтрализуются сывороткой к старому эталону А/Техас/1/77 до 1/2-1 гомологичного тира и опознаются 5 ин 6 моноклональных антител к этому вирусу. В то ¡ж время,их пер7 вичная структура свидетельствует,что они произошли путем мутг-

-----цнй._иэ_вирусов типа А/Филкппины/2/82,у которых таких свойств

не было. Анализ показал Гчто "у "вгашзв подгруппы —1'кан"___в__

зультате двух мутаций в антигенной детерминанте А (Э-144-У г. е-146-3) восстановилась первичная структура и расположение сайтов глмкззилирования,свойственные вирусам 1977-79 годов. Во второй ключевой антигенной детерминанте В у них произошла мутация Е-156-К, являющаяся реверсией к структуре белка эталона А/Техас/1/77. В литературе высказывается мнение,что эта мутация в некоторых случаях молит возникать в процессе адаптации вируса к размножению в курином э;.:5риокв уже после его изоляции. Тем не менее , у всех вирусов А(НЗМ2) до 1979 года в этогл положении стоит остаток К,когда как у всех вирусов после 1979 года,за исключение« подгуппы "кен",имеет место остаток Е.

Вирусы другой антигенной подгруппы - "Миссисипи" (отечественный вариант А/СССР/281/85) обнаруживают заметное сходство с эталоном А/Ванггж/1/79. Для них характерно исчезновение двух сайтов гликозклпрования в положениях 126 и 246,что должно, вероятно,« силу пространственной близости,восстановить кон-формацию олигоеахаридной цепи в сайге гликозилирования 165 над ■ областью, антигенной детерминанты В,присуща вирусам типа А/Банг кок/1/79.

Очевидно,что в обычно проводимой реакции РТГА с гетероло-гичньш аятисыворотками основную роль долеты играть антите-••да, сйяэываквдеся с верхней частью тримера НА и стермчески ив--гибирующие «го взаимодействие с остатком сиаловой кислоты рецептора' эритроцита. пространственной структуры белка следу-ет.что это антитела к антигенной области В и аминокислотным остаткам Д37Д4'3-1Х5 Детерминанты А. Видимо, структура именно этих -участков чю^екулы з основном и б^дет определять степень антигенного ррдоть^~вирусоз по данным РТГА.

Вируса подгруппы "сычуань",потомки птакмов подгруппы "кен",потеряли присущее родителям сходство с эталоном А/Те-хас/1/77. При этой штаммы типа А/Виктория/7/87 (эталон А/Шан-хай/11/87) приобрели определенное сходство в РТГА с эталоном Л/Еангкок/1/79. Анализ гена НА штамма А/Вжтория/7/87 показал, что в нем имеются мутации в антигенной детерминанте А Г-137-Н (реверсия к штамыам 1668-75 г.) и И-145-К (реверсия к штамму А/Икнхай/31/80,сходному с А/Бангкок/1/79),а в антигенной детеминанте В - мутация К-156-Е (реверсия к штаммам 1968-79 г.).

Эталон А/Сычуань/2/87 слабо реагирует с сыворотками ко всем предшествовавшим эталонам, кроме подгруппы "кен". В его детерминанте В зафиксированы мутации У-155-И л Б-159-У, даюздте последовательность аминокислот 155-Я К 5 £ У К-160 в этой ключевой области молекулы. Она имеет не более трех совпадений с любым вирусов прошлых лет (кроме подгруппы "кен"),что может объяснять его поведение з реакции РТГА.

' 3. ОБЩИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ АНТИГЕННОГО ДРЕЙФА ВИРУСОВ ГРИППА

ХШ2) ЗА 20 ЛЕТ.

Вне зависимости от разнообразия первичных структур и антигенных свойств вирусов гриппа А(ШИ2) в различных подгруппах, все они подчиняются обвдм закономерностям антигенного дрейфа,которые представляют собой следствие саморазвития эпидемического процесса во взаимодействии популяций хозяина и вируса. Структурно-эволюционный подход позволяет выявить такие наиболее общие тенденции,которые обусловлены как спецификой строения генома самого возбудителя,так и обратным.влиянием на него индуцированных изменений в популяции хозяина.

Мутации в генах вируса естественно разделить на две прин-цшшально рапные грушш. Одна из них - это "молчащие" мутации чяуечэтпдсф. !?ж>рие из ?а внро:кденности генетического кола к* поменяют, структуру (>елка и,следовательно»не «/граяечьчол црлми

на фенотипе,не подвержены естественному отбору непосредственно. На ркс. 1 показана динамика накопления таких молчащих замен нуклеотидов в гене НА 'У вирусов гриппа А( H3N2) за 20 лет непрерывного дрейфа (кривая 1). Анализ сделан на материале более -50_структур генов в области,кодирующей самую изменчивую тяжелую субъединицу белка ¡максимальный разброс значений в какдой точке кривой не превышает t3 замены, т. е. величины их прироста за год. Для этой кривой характерно линейное отклонение от линейности, т. е. при изменении 10% нуклеотидов отклонение от линейности составляет также 10% от этих 10%,т. е. VI. Sïo связано с тем,что размеры гена ограничены и некоторые мутации происходят повторно в одних и тех положениях,не увеличивая общего числа отличий от прототипа. Такой вид экспериментальной кривой говорит о случайном характере ыолчавдх замен нуклеотидов,их практической нейтральности для функционирования вируса и о постоянстве скорости их накопления,как и следовало оккдать исходя из нейтралистской концепции эволюции M Кимура .06 этом жз говорит и равномерность их распределения по всей длине гена Экспериментально определенная по наклону кривой скорость накопления составляет 0,81 в год от обцего числа положений в гене,допускающих синонимичные замены,шш 3 молчащих замены в год в области HAÏ. D рассматриваемом участке гена НА имеется 356 таких положений. При условии сохранения смысла кодода для 179 из них -возможны только 2 варианта нуклеотидных остатков, для 23 - три варианта,а в 154 допустимо любое их 4-х оснований. Трансверсии при мутациях сравнительно редки и лишь уменьшают отклонение от линейности. Практически все обнаруженные повторные молчащее мутации являются транзитивными реверсиями. С учетом этого,зависимость накопления со временем числа молчаших нуклеотидных различий от исходного гена в предположении их случайного характера в интервале Нп<1 можно представить формулой x-A'nAYI-Кгн-Н*rf .. },гт X - число молчащих раз-

личий, к - скорость закрепления мутаций в вирусной популяции в данном хозяине.в долях от N в год, N ~ сбвзе число полодений в

гене,допускающих такие замены, л - число лет. При найденном ранее значении К = 0,008 интервал применимости формулы порядка 100 лет,т.е. за это время структура эффективно рандомизируется и теряет гомологию с исходным геном на уровне молчащих мутаций. Надо отметить,что постоянство скорости накопления нейтральных молчащих ogí-йн характеризует эволюции популяций вируса гриппа интегрально,независимо от формирования внутри ее различных локальных подгрупп,поскольку определяется самим фактом циркуляции вируса в частично иммунной среде.

Именно в силу постоянства скорости и случайности как прямых, тач и обратных колчаних мутаций нуклеотидов.весь "эволюционный путь" вирусной популяции за этот обозримый период времени запечатлен,запомнен в первичной структуре его генов. Его можно расшифровать,реконструировав филогенетические связи между отдельными изолятали. На р::о. 2 приведено такое реконструированное древо эволюции гена НА вирусов гриппа А(H3N2) человека. Даже из грубой схемы видно,что после 1982 года эволюционный процесс для этих вирусов теряет глобальную однородность -формируются и длительно сосуществуют различные локальные антигенные (и соответствующие иы структурные) подгруппы.

Замены на уровне аминокислот,в отличие от молчащих мутаций, непосредственно - отражается в фенотипе вируса и прямо подвергаются действию отбора. Притом их возможное разнообразие существенно выше. График числа отличий от прототипа А/Гон-конг/1/68,в области.НА1 ("рис. 1,кривая 2) построен тага© на материале более 50 структур различных штаммов и разброс точек для каждого года не превышает ±2 замены даже для 14 изолятов одного года выделения из разных антигенных подгрупп. В первое десятилетие дрейфа отличия аминокислот накапливались линейно, однако во втором десятилетии этот процесс резко замедлился и сейчас практически остановился. Это касается в целом всей современной популяции вирусов A(H3N2).независимо от их принадлежности к весьма различным антигенным подгруппам.

Линейность накопления аминокислотных замен в начальной

фазе дрейфа говорит об их й практической нейтраль-

ности для выполнения молекулой Ш. своих многочисленных функций в жизненном цикле вируса гриппа. В условиях растущего иммунного пресса со стороны хозяина,многие иэ них обеспечивают временное селективное преимущество. Однако сам характер замен к число положений в молекуле,допускающих такие квазисвободные изменения,очень ограничены. Мззкно предположить, что давление иммунного пресса хозяина постепенно искажает нативную структуру протогипного белка и в итоге накопление замен начинает мешать ему нормально функционировать. Поэтому отбор становится двунаправленным и стабилизирует число отличий на уровне 40-50. При этом замены продолжают закрепляться,но происходят в основном в одних и тех же ограниченных участках антигенных детерминант и часто приводят к реверсиям - восстановлению структуры белка более ранних вариантов.

Переход вирусов А( НЗН2) к фазе стабилизированного дрейфа о том, щ'о они практически исчерпали потенциал изменчивости, который позволял им существовать как эпидемическим более 20 лет,по крайней мере,во взрослой (иммунной) человеческой популяции. Из такой ограниченности дрейфа следует.что эпидемическая фаза в существовании вируса гриппа А человека таюке ограничена Неизбежный антигенный дрейф ведет в некотором смысля в эволюционный тупик. Через, определенные промежутки - времени вирусы гриппа человека должны обновлять свой генофонд либо за счет генов НА из животных резервуаров,где антигенный дрейф незначителен, либо путем сохранения интактных вирусных геномой в-человеческой популяции в условиях отсутствия циркуляции и не*» избежно связанного с ней дрейфа В силу тех же причин ант'Ш'ёй^ кый дрейф не способен преодолеть даже различий.мевду разновидностями (.антигенными подтипами) в пределах одного вида - вируса гриппа Л.

Р. 4. ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА ГЕНОВ КД СОЕРЕШНЫХ БГ&УСОВ ГРИППА

АНТИГЕННОГО ТЮтШ АХН1М1).

Как известно, вирусы гриппа подтипа А(Н1Ш). практически совпадающее по структуре всего генома со штаммами 1950 года,неожиданно вернулись в эпидемическую циркуляцию в 1977 году,и с этим до сия пор связана некая загадка Эти своеобразные "антигенные анахронизмы" прижились в человеческой популяции и с тех пор подвергается антигенному дрейфу,не повторяющему путь.прой-~ денньй их родителями после 1950 года до исчезновения в 1957 г. Это,кстати,подчеркивает принципиальную случайность замен и ^предсказуемость конкретных путей дрейфа. В настоящее время вирусы гриппа двух антигенных подтипов А(НШ) и А(НЗЫ2) сосу-.тествуют.не вытесняя друг друга из эпидемического процесса.в отличие ог классических антигенных вдфгов 1947,1957 и 1968 годов. Антигенный дрейф вирусов А(ШМ1) после 1977 года происходил не так интенсивно,как у вирусов А( КЗЬ'2). Возможно, это быта связало с ограниченностью их циркуляции «еиммунной прослойкой родивиихся'после 1950 г.

Нами была изучена структура гена НА этих вирусов сразу аоеле "возвращения" в 1977 г. и после появления практически первого' значительно . отличающегося от.прототипа А/СССР/90/77 дрейф-варианта А/Тайзань/1/86. Это штаммы А/СССР/90/77,А/Хаба-ровск/74/77, А/йиев/59/79, А/Ленинград/621/86,АЛЯенинград/б24/8Б (табл.2). Для антигенного дрейфа вирусов этого подтипа- характерна тенденция к маскировке антигенных детерминант 5а и СЬ олигосахаридными остатками. Так,у вирусов тайваньской разно-■ иидности 1986 г. появился дополнительный сайт гликозилирования в положениях 54 в СЬ и 125 в с одновременным исчезновением ах в положениях 127 и 158 в 5а. Возможно,какую-то роль в последнем случае играли чисто стерические причины,поскольку эти три остатка расположены в пределах 10-15 ангстрем друг от друга При этом продолжается-активное накопление мутаций в антигенных детерминантах (7а и 5Ь. Повторных мутаций аминокислот с реверсией к более ранним вариантам пока практически не наблюдается ,в отличие от вирусов А(НЗМ2),поскольку линейная фаза

еде ке пройдена. У вирусов A(H1N1) как число молчащих нуклео-тидных.так и число аминокислотных отличий от прототипа 1977 года продолжает увеличиваться с постоянной и примерно равной скоростью (линейно}. При этом скорость накопления молчащих замен несколько ниже,чем у вирусов A(H3N2) и составляет примерно 0,6% в год для области НА1 (рис. 1,кривые 3 и 4). Отсутствие реверсий и линейность накопления аминокислотных замен в первое десятилетие дрейфа вирусов А(НШ),на наш взгляд, говорит о сохранении у них значительного потенциала антигенной-изменчивости.

г. ксяледозания вакцинных штаммов.

3. 1. ИЗМЕНЕНИЯ В ГЕНАХ ВИРУСОВ ГРИППА к ПРИ ЛАБОРАТОРНОМ ПАССИРОВАНИИ И РЕАССОРТАЦИИ.

Проблема изменений вирусов гриппа при лабораторных манипу-лояциях имеет непосредственное отношение как к вопросу о соответствии определяемой первичной структуры генов их реальному состоянию в природе,так и к проблеме адаптации вируса гриппа к размножению в ином хозяине. Как правило,изучение вирусов начинается после предварительной адаптации от размножения в клетках легочного эпителия человека к размножению в тканях куриных эмбрионов или культур клегок животных. Обычно процесс переа-дэлтации,т. е. отбора способной к размножению на новом хозяине субпопуляции,проходит за 1-3 пассажа. При этом измевеия в гена* НА вирусов подтипов А{ КЗН2) и A(H1N1) при адаптации к ку--риному эмбриону достаточно хорошо известны и исчисляются единичными заменами аминокислот. Изучались также замены,сопровождающие адаптацию вируса гриппа человека к размножению в легких мышей. При этом, например,у вируса А/СССР/90/77СНШ) приобретение фенотипа летальности для мышей происходит в два этапа и часто связано с исчезновением двух сайтов гликозилирования в области "кармана" молекулы НА,распознающего остаток сиадовой кислоты клеточного рецептора. Отбор такой субпопуляции может

повлечь за собой некоторое изменение антигенных характеристик нативного вируса. Однако в целом смена хозяина лишь незначительно изменяет первичную структуру генов природной популяции вируса.

Вопрос о дальнейшей судьбе гена НА вируса гриппа при продуктивных лассажх на куриных эмбрионах или клеточных культурах • представляет немалый не только теоретический,но и прикладной интерес в связи с тем,что многократное пассирование остается одним из методов приготовления штаммов для живых гриппозных вакцин. Известно,что в результате определенного числа пассажей на гетерологичном хозяине вирус становится аттенуирован-ным для человека,а в дальнейшем может потерять иммуноген-ность. Мы исследовали первичную структуру гена НА вакцинного штамма вируса гриппа А/СССР/2/85( НЗН2) на. стадиях 9,15 и 20 последовательных пассажей на куриных эмбрионах,не включавших стадий клонирования в предельных разведениях. При этом биологические свойства вируса заметно менялись. Тем не менее,в гене НА на всех стадиях пассирования не обнаружено ни одной замены нуклеотида,что свидетельствует об эквивалентности в отношении данного гена живой вакцины и ее эпидемического прототипа. Полученные результаты противоречат представлениям об исключительной роли . НА в детерминации вирулентности вируса гриппа. Очевидно,изменения в других генах могут оказывать значительно более существенное влияние на степень вирулентности.

■ Те зге результаты были получении при изучении первичной структуры гена НА штамма А/Ленинград/337/76(НЗМг) на стадиях 10 и 23 пассажей на куриных эмбрионах. На 23 пассаже обнаружена единственная молчащая замена нуклеотида .6-383-4,никак не влияющая на свойства вируса.

Поскольку .праймерны'й метод секвенирования дает тотальную структуру популяций,была сделана попытка оценить степень ее внутренней ■' микрогетерогенности. Нами исследована первичная структура гена НА после его клонирования-из пассажной популяции вируса гриппа А/СССР/2/85( ИЗ^) путем реаессртации с Х'ччо-

доадаптированным ктаммоы А/Лениград/17/57(Н2Нг). Структура этой отдельной молекулы,случайно выбранной из популяции,также не отличалась от доминантной,что говорит о высокой внутренней гомогенности вирусной популяции после ее относительно недавней -изоляции и адаптации к лабораторной культуре.

Исследование структуры гена НА вакцинного вьсокоаттенуи-рованногс штамма А/Викторил/35/7г/50(H3N2) на стадии 51 пасса-лса на куриных эмбрионах показало, что за предыдущие 50 пассажей, проведенных в условиях отбора на скорость и эффективность размножения,наиболее изменчивая при дрейфе и отвечающая за антигенные характеристики вириоаа часть гена,кодирующая тяжелую с-уО^дашцу белка НА! не изменилась совершенно. При этом в легкой субт^динице НА2 элиминировалась мутация G-4-S в консервативном "пелгяде слшмт" аирусшй и клеточной мембран, имев-¡гзяся у исходною толнга А,'Виктория/35/72 и отсутствующая у остальных штаммов этого подтипа. Кроме того,закрепилась молчащая мутация нуклеотида Т-1652-С и три замены аминокислот: I-189-М в погруженной в мембрану области белка,D-1S8-N' а D-160-У в примембранной области.

При адаптации исходного вируса А/Викторкя/35/72(H3N2) к размножению в культуре клеток MDCK в его гене НА1также обнаружены мутации лишь в участке НА2 - молчащая замена нуклеотида G-1574-A и мутация аминокислоты D-184-N в примембранной области.

Таким образом выяснело,что обычные лабораторные манипуляции практически не отражаются на нативной первичной структуре генов НА природных вирусов гриппа А,а если изменяют ее,то весьма специфически и ограниченно.

3. 2. ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА ГЕНОМА РЕАССОРТАНТНЫХ ВАКЦИННЫХ

ШТАММОВ Х/ШИНГРАД/54/KHlNl) и А/КИЕВ/59/79(НЖ),

Значительный практический интерес представляет такде вопрос о стабильности структуры генома в процессе промышленного производства вакцинных препаратов. Нами изучена первичная

структура геномов двух таких реаосортантньк вакцинных штаммов для инактивированной вакцину,взятых в конце цикла их производства, поскольку стадия клонирования путем реассортации при их создании практически гарантирует исходную внутреннею гокогои-кость вирусной популяция. СеквенироБаиге ь данном случае осуществлялось поел? пр°^-рр::?;"'.т:;л'ого :;гонйро1 '.;п'Я ЛТТК-г'сггмП гонов ЭТИХ вирусов в П.^в!.г!1ДНЫЧ- Т.?!:'! о;«::. Э~0 ПОЗРОЛт но только выявить специфические для данных t.oviiSHr: ..rn^œs .мугг;-mt (внутренние *<олеку..:ярнье маркеры),но и ецгш-ть степень нарастания внутренней ¡^-т-огетерогенггостн популяции впрюноз а процессе промышленного производства,исследуя структуру нескольких независимых клонов одного гена

Схема получения реассортантного закцюшого птамш A/Kií-ea/59/79/F( H1N1) пр:э»де::а на рсс. 3. Его геном содержит гены белков РА, M и i'S от лабораторного варианта адзыма A/FR/8/34CШШ),а остальные гены - от эппдемггческого вируса А/Киев/59/79(H1 î.'l). (Вирусы антигенного сероподтипа А(ШМ1) 1933-47 г. здесь обозначается по старой клессифккацки как A(H0N1) для удобства различения). Вирус 7/Легогнград/54/1( НШ ) представляв собой реассортакг,несуглй гены БД и NA от эпидемического вируса А/Хабаровск/74/77( 1Ш,Ч ),а остальные сесть генов от A/PR/8/3-K HCN1). ото было установлено по подвюхности РНК при электрофорезе и прямым ееквенированием. В геноме штамма Х/Ленкнград/п4/1 установлена полная первичная структура ге-HOS НА и NA вируса А/Хабарове к/74/77(НШ.), генов NP.NS и около РА вируса А/PR/3/34(Н0М1) - того его лабораторного варианта,на основе которого з СССР получают вакцинные штаммы. В геноме вируса А/Киев/59/79/Р установлена полная структура генов HA,NA,NP,PB1,PB2 штамма А/Ккев/59/79(H1N1) и генов M.NS и около 50% структуры гена РА" штамма A/PR/8/34(H0Nl),а также полная первичная структура да;-кс-гаш гена N3 исходного штамма д/Ки-ев/59/79(НШ).

Секвеиировакие независи; :.vx клонов генов поверхностных белков BKpKOíia показало полное отсутствие накопления микроге-

терогенности первичной структуры в процессе производства вакцинных препаратов. В независимых клонах генов белков кора выявлена очень слабая микрогетерогенность, составляющая менее 1 различающегося нуклеотида на 4000 оснований,что может быть связано отчасти со случайными ошибками ревертазы в процессе получения ДНК-копий.

При сравнении первичной структуры генов одного и того же штамма A/PR/8/34.HO представленных - в независимых субпопуляциях, случайно отобранных при клонировании в процессе получения именно этих двух реасеортангных вакцинных штаммов,были обнаружены незначительные различия. Так, в гене MS штамма X/Ленинград/54/1 имеются замены нуклеоткдов в поло»зениях 191'и 867,которых нет в гене штамма А/Киев/59/79/P.

Вариант А/РР./8/34,используемый в нашей стране,достоверно отличается от других аналогичных лабораторных вариантов этого .же штамма - британского варианта "Cambridge" и американского "Mount Sinai". Он имеет,в частности,уникальные замены нуклео-тмдов С-170-1 и G-Í89-A в гене ПЗ,в-б7-С и Т-403-С в гене М и С-17&-Т, Т-226-А, A-366~G,G~546-A в гене РА,что позволяет дифференцировать происхождение генов даже очень близких по первичной структуре вариантов одного штамма. При этом применяемый у нас вариант существенно блиме к варианту "Mount Sinai". Очевидно, что различия мезду лабораторными вариантами одного и того ж? штамма накопились за многие десятилетия их раздельного' пассирования в лабораториях уже после изоляции в 1934 г.

3. 3.. ГЕЮТтИЮВШШ РЕАССОРТЛЕТНЫХ ВИРУСНЫХ ГЕНОМОВ.

Срар-нение,-первичных структур генов NP.PB1 и РВ2 штамма' А/Кие в/5.9/79 (ШМ1) с соответствующими генами вирусов гриппа других антигенных подтипов показало,что они наиболее гомологичны генам гирусоа ACB3N2J,а не А(ЩН1). Это подтвердило и прямое • праймер.ное секвенирование всех сегментов генома исходного эпидемического штамма А/1С;ев/5Э/79( ffiNl). Кроме того,ген

РА этого вируса тагае оказался гомологичен генам вирусов Л(?Ш2). Таким образом, штамм А/Киев/59/79(НШ) имеет природный реассортантный геном,гены полимеразного комплекса которого (РВ1,РБ2,РА и №) захвачены от вирусов А(НЗМ2) 1977-79 годов. Вирусы этого типа были широко распространены во время первых совместных эпидемий А(НШ) и А(.НЗМ2) и,вероятно, возникли естественным путем в результате совместного заражения одного.хозяина. Однако после 1980 г. они исчезли из циркуляции.

В результате этих исследований мы располагали набором ДНК-копий всех 8 генов вируса гриппа А в плазмидных векторах, притом происходящих из геномов вирусов различных антигенных подтипов - А(Н0М1) ,А(НШ) и А(НЗМ2). Кроме того, нами были получены и секвенированы также полноразмерные ДНК-копии генов РВ2 и НА вируса гриппа птиц А/ТРУ/Мз уЬг1¿ге(Н7М?).

На основе этого банка ДНК-копий генов был разработан новый метод полного генотипирования любых реассортантных геномов вирусов гриппа А человека, позволяющий установить происхождение генов внутренних неструктурных белков применительно к антигенным сероподтипам поверхностных гликопротеидов далее при отсутствии референсных родительских штаммов,как это обычно бывает в случае природных реассортантов - метод конкурентной точечной гибридизации. Результаты,полученные этим методом .полностью подтверждаются в модельных экспериментах данными электрофореза вирионных РНК,гибридизации кРНК/вРНК и прямого секвенировакия. Сущность е^о заключается в том,что помимо радиоактивно меченного зонда (плазмиды с ДНК-копией одного из генов) в гибридк-зационный раствор вносится РНК вируса с заведомо известным геном, гомологичным используемой в качестве зонда плчзмидной ДНК,но относящемуся к иному,чем проклонированный в виде кДНК,Оероподтипу вируса гриппа А. Эта конкурирующая РНК- вкосится в значительном избытке по отношению как к молекулярному зонду,так и к исследуемой РНК,иммобилизованной на фильтре. Поэтому в растворе быстро образун/гся гибриды меченной ДШ зонда и конкурирующей РНК,из которых последняя может быть витеенека

- EO -

только теми вирусными РНК на фильтре, у которых гомология к зонду выше. При этом на фильтре иммобилизуется вирусный лизат без предварительного выделения вирионной РНК и определения ее количества. Одновременно анализу могут быть подвергнуты несколько десятков штаммов. Бее это делает метод быстрым,серийным и доступным любой лаборатории.

Этим методом были полностью генотипированы многие лабораторные рвассортанты и выявлено несколько природных реасорт'ант-ных геномов, в частности, у вирусов А/Киев/59/79(НШ) - гены РЕ1, РВ2, РА. и МР ох вирусов А(НЖ), А/Ленинград/23/81(ЮШ) и А/Л^нинград/»5/81(Н0М1) - гены PA.NP и NS от вирусов A(H1N1), Д/Лен инград/141/83(K3NS) и А/ЛенинградЛбЗ/ЗЗСНЗМг) - ген И от Екрусо» А(НОШ). Одновременное наличие в эпидемической циркуляции ра8КооС>р*вных генов кора и достаточная распространенность процессов реассортации вызывают необходимость включения ь обирярнннтое обозначение некоторых- вирусов гриппа и их полной генетической формулы. Естественно,вопрос о происхождении таких реассортактов 'разреши лкиь путем сравнительного секвени-роинния. - ' -

Задача эта имеет реальный смысл только по отношению к генам кора,поскольку идентификация сероподтипа НА и NA в любом вирусе легко осуществляется общепринятыми иммунологическими пробами. Однако само понятие принадлежности генов кора вирусам определенного сероподтипа требует уточнения.. Само наличие феномена реассортвции предполагает отсутствие жесткого,однозначно функционально обусловленного соответствия между определен-Hi;.M. набором йести генов н'двумч текамм поверхностных глк-

»¿-•дкглулмраи-'биолох-ичеекие исследования показали, что структурны* группы генов НА,соответствуй« определенным ееро-чодтииам, в настояние время эводоционно стабильны. Быстрое накопление мутаций в процессе антигенного дрейфа или.в силу иных причин не лриводит к выходу'за-пределы подтипа,о чем косвенно свидетельствует ограниченность их числа и отсутствие переход-

ных форм. Один из возможных механизмов такой консервации продемонстрирован нами на примере дрейфа гена НА вирусов гриппа А(НЗИ2). В процессе дрейфа в рамках подтипа формируются филогенетически связанные группы,ряды генов - ветви дрейфа. Вероятно, формирование независмых ветвей дрейфа от одного общего предка могло в прошлом привести к возникновению довольно обособленных структурных подклассов Нз\у,НО и Ш в намках серопод-типа Н1.

Литературные данные заставляют предположить существование нескольких аналогичных обособленных структурных'классов и для каждого из генов кора. Они отражают эволюционно обусловленную функциональную адаптацию отдельных генов и их комплексов к определенному хозяину или экологически близкой группе хозяев,как например,в случае генов КР вирусов человека и птиц. Само наличие таких специфичных к хозяину структурных групп свидетельствует об относительной редкости "переходов" генов от одного хозяина к другому путем реассортации. '

Полученные в ходе работы данные о первичных структурах генов кора вирусов гриппа А человека разных лет выделения и относящихся к различным серолодтипам.а. таете данные литературы, логично укладываются в предположение о существовании специфичного для человека комплекса генов кора. Для каждого конкретного гена (¡за исключением РВ1 и,возможно,РА) существует лишь один структурный класс,в пределах которого выявляется филогенетически связанный,непрерывный за последние 50 лет,ряд генов отдельных.штаммов (ветвь дрейфа),обусловленный линейным накоплением мутаций. При смене доминирующего антигенного подтипа (шифте) "новые" вирусы наследуют комплекс генов кора своих предшественников,!. е_. шифты обязательно сопровождаются р<з-ассоргацией. Неразветвленность дрейфа кора определяется тем обстоятельством,что отбору .подвергаются не отдельные гены,а вирусы как целое,причем в человеческой популяции определяющим является отбор по гену НА. В этом смысле дрейф генов кора "индуцирован" антигенным дрейфом НА путем случайного "захвата"

субпопуляций этих генов при смене доминирующих антигенных разновидностей. Каждому временному интервалу,маркированному сменой господствующего сероподтипа (шифтом),соответствует определенный ''отрезок" такой ветви дрейфа генов кора Именно в этом, смысле и следует понимать выражение о "принадлежности" генов кора вирусам определенного сероподтипа.

Обнаруженные разветвления путей дрейфа этих генов связаны с возвращением в циркуляцию геномов "анахронизмов". Так,в 1977 году вновь вернулись,почти не претерпев изменений,гены,существовавшие у вирусов гриппа А человека в 1950 г. ,и с тех пор накапливают мутации,не повторяя схему дрейфа,проходившего с 1950 г. до нашх дней при смене господствующих сероподтипов H1NÍ-H2N2-H3N2. Именно в Э"!ом смысле сейчас можно говорить о существовании одновременно двух разновидностей генов кора вирусов современных сероподтипов HI HI и H3N2. Нарисованная схема весьма ориентировочна из-за недостатка данных о первичных структурах генов полимераз,но даже в таким несовершенном виде она полезна для адекватной интерпретации информации„получечной методом конкурентной точечной гибридизации и секвенирования при генотипировании природных реассортантов.

3. 4. ШШГ ГЕНА РВ1.

В соответсвии с вышеприведенной схемой,по крайней мере, начиная с 30-х годов,в генах NS.M,NP,PB2 вирусов гриппа А, человека происходило плавное и довольно медленное накопление мутапий,в результате чего уровень различия нуклеотидов между отдельными штаммами . разных лет постепенно поднимается с 2-3% до 7-3%. Однако в случае генов РВ1 обнаружен резкий скачок. У вирусов AC HON 1) 30-х годов и А(НШ},как 50-х годов, так и современных, гены PEL различаются весьма незначительно,на 2-3% нуклеои'идов. Гак ж? мало различаются и. гены РВ1 вирусов AC H2N2) и ACH3N2) 60-х и 80-X. годов. Ко на рубеже HI N3 - Н2М2 уровни различий между генами РВ1 подскакивают до 16%! Это пре-

вышает даже величину различий остальных генов кора у вирусов человека и птиц,которая для всех генов находится в пределах 12-14% и соответствует периоду постепенного накопления в сотни лет. Модно предположить, что появление в 195? г. вирусов А(К?'!£) сопровождалось такте и шифтом гена белка РВ1,что привело к вытеснению из доминирующей вирусной популяции гена РВ1 вирусов человека эпохи НО-HI. Вероятно, новый ген РВ1 происходит из экологически отдаленного животного резервуара, как и гены НА и NA вирусов А(ШЫ2) (табл.2).

4. ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА ГЕНОШЕ "ЖГИГЕШШХ АНАХРОНИЗМОВ".

В предыдущих разделах проанализированы общие тенденции -антигенного дрейфа доминирующих ныне популяций вирусов гриппа А и те изменения,которые происходят с ними в процессе лабораторных манипуляций. Однако реальное разнообразие вирусов в природе не ограничиватся только доминантными формами. Всегда существует.относительно чаще выделяясь в пределах СССР,очень пестрая и генетически гетерогенная группа минорных вирусных изолятов.так называемых "антигенных анахронизмов".которая вызывает серьезные теоретические споры относительно их происхождения. Привлекает внимание их сходство с возбудителями прошлых эпидемий,казалось бы,давно вытесненными из эпидемического процесса в ходе антигенного дрейфа и ряда шифтов. Однако лишь в результате кропотливого сравнительного структурного анализа иногда можно с определенной степенью достоверности понять их происхождение: как результат реального _ сохранения реликтовых форм,проникновения сходных вирусных генов из животных популяций, антропогенного загрязнения биооферы или описанной ранее имитации антигенных характеристик за счет реверсивных мутаций. Нами, изучена первичная структура геномов нескольких различных групп т:-'ких атипичных по отношению к процессу естественной изменчивости вирусов гриппа А.

4.1. ГОШЮНГО-ПОЛОВВЫЕ ВИРУСЫ МШП2).

В 3985-86 годах в ССОР и на Кубе было ввдегено шокество штаммов, сходных с родоначальником пандемии 1568 г. Л/Гон-конг/1/68(1Ш2), причем на Кубе они вызвали обширную эпидемию среди молодели. В отличие от проготипного шта^а, они до 1/161/32 гомологичного титра шгибаровались акт ис ьшо ротнами к эталонам 1976-79 годов,а антисыворотки к этим гонконг-подобным итаммам выявлял!! родственные антигенные детерминанты даже в ЕА вирусов А( НЗМ2) 1977-85 г.

Сравнение первичной структруы НА четырех ¡таких ита\2лов с прототипом приведено в тай&З. Результаты однозначно доказывают как филогенетическую близость их к вирусу А/Гонконг/1/68, так и то,что они не является, продуктом антигенного дрейфа современных вирусов А(ЕЗЖ). Сбнару>зио всего 4-6 нуклеотндньк отличий от прототипа, тогда как в процессе дрейфа до 1985 г. накопилось почти 100 мутаций в гене НА. Ери это« выделенные в СССР варианты скорее всего занесены с Дуба С другой стороны, выявленные различия не позволяют отодзеетвкть сен НА этих вирусов ни с одним из описанных до сих пор штатов т каекких-ся в лабораториях мира.

Замена аминокислоты 6-158-Е в антигенной детерминанте В, вероятно,служит причиной отличий антигенных характеристик этих вирусов от прототипа А/Гоиконг/1/68,поскольку такая мутация закрепилась в коде антигенного дрейфа у всех вирусов АСВЗМ2) после 1975 г. .хотя она мои шеть и другое функциональное значение, связанное с изиенениеы тканевого тропизма. Мутация 1-226-0 у штамма А/Ку6а/1915/86 приводит к резистентности к сывороточным ингибиторам. Замена Еь31-14 встречается у всех вирусов А( НЗМ2) после 1669 г., а 1-140-Ы в пришмйранвой области НА2 консервативна,хотя нельзя исключить ее влияния на процесс транспорта белка на клеточную мембрану.

Характер отмеченных различий говорит об аутентичности изучаемых штаммов и позволяет исключить возможность контамина-

ции общепринятыми международными зтаюнаш, однако происхогс-"-ниэ их неясно. Соотнесение молчащих и аминокислотных гн-жя от1/3 у ранних штаммов,до 1/1 у более поздних. Изучение пр— вичной структуры генов кора показало,что в данном случае молно отвергнуть и гипотезу о проникновении в человеческую популяцию, генов вирусов животных,поскольку,по крайней мере у вирусов и? Калуги,все гены принадлежат вирусам человека А(НЗЬ'2),ха;актирным для 1968 года. Возможно, это истинно реликтовые штаммы. сохранявшиеся в латентной йюрмэ.или результат загрязнения оиссфе-ры вследствие утечки из лабораторий не общепринятого эталонного,а измененного чзолята 1908-59 г. Следует помнить,что осн:з-ной генофонд вирусов гриппа за последние 50 лет сейчас сосредоточен в лабораторных музеях. Иногда исследователи г.р?дгочл-•¿■ают работать пе с общепринятыми эталонами, а с собственными аналогичными • изолягамл с неизвестной структурой генома. Пси этом з ряде случаев в литературе достоверно показаны ка-: случайный выкос вирулентных етзшов прошлых эпидемий в человеческие» популяцию, так к лабораторная контаминация при выделении.

4.2. А/ВЖТО?ИЯ/72-ПОД>БЕБЗ ШТАММЫ А(НЗМ2).

В сентябре-ноябре 1982 г. в ряде регионов СССР от балск^л в возрасте от 1 часа до 50 лот было выделено по 3-6 изодятоз вирусов гриппа, антигенно тождественных старому дрейф-вари^яху А/Вик'гория/35/72( НЗМ2). Перед этим в СССР была проведена массовая вакцинация населения живой аттенуированной вакциной нз основе штамма А/1533/17. Последний представлял собой реассср-танг,содерхат& поверхностные антигены от вирулентного вируса А/Бангкок/1/79(КЗН2),а гены кора - от аттенуированного лабораторного штамма А/Виктория/35/72/50(1Ш2),однако имел и значительную примесь антигенов последнего, ранее уже отмечалось,что в ходе 50 пассачей нз куриных эмбрионах штамм А/8иктория/35/7£ /50 приобрел 4 аминокислотных и одно молчащзе отличие от исходного вируса А/Викгория/35/' 2. Точно такие же замены обкару-

ждись и в генах НА атипичных вирусов А/Одесса/2380/82(НЗМ2) и А/СВ1-;рдловск/7862/82( НЗК2) - табл. 4. Все атипичные штаммы были лиофилизованн сразу же после получения из соответствующих .Обл-СЭС и в лабораториях,где проводилось их изучение,не пассировались.' Очевидно,в данном случае мы имеем дело с заболеванием, спровоцированным вакцинацией,возможно,с участием иммуноде-фициткой прослойки населения. Вероятно,активация вирулентности примесного пассажного пташа произошла в результате реассорта-ции с вирусом А/Бангкок/1/79,однако филогенетическая близость этих двух родительских вирусов пока не позволила разобраться в происхождении всех генов этих "анахронизмов" путем секвениро-вания. Ясно лишь,что ген N3 происходит от пассажного штамма. В то время,применение самого аттенуированкого штамма А/Еикто-ркн/ЗС>/72/Е0 как компонента вакцины в 1974-77 годах такими последствиями не сопровождалось.

Единственный штамм А/Лешнград/38/86( НЗН2) .также антиген-но тождественный эталону А/Викторяя/35/72(ШН2),был выделен из спинномозговой жидкости больного рассеянным склерозом. Его ген НА отличается от эталона единственной молчащей заменой нуклео-твда А-бб8-в. В данном случае наиболее вероятной представляется лабораторная контаминация при выделении или идентификации.

4.3. А/РО/73- ¡ШОРНЫЕ ШТАММЫ А(НЗМ2).

В перЕой половине января 1983 г. в Ленинграде (27 штам-моь) к з июне-августе 1983 г. в Свердловске (11 штаммов) от детей я -10 лет были выделены вирусы,антигенно тождественные эталону А/Порт Чалмерс/1/73(НЗМ2). Сравнение первичной структуры гена НА некоторых из них с этим эталоном,а также с лабораторным штаммом А/Лениград/538/74(НЗН2),приведено в табл. 5. Бое эти вирусы чрезвычайно близки лруг к другу и отличаются 1-2 молчащими заменами. Мутация нуклеотида Т-754-А у штамм* А/Ленивград/153/83( НЗМ2),кроме того,придает ему устойчивость к ингибиторам сывороток.. Сказать что либо более опре-

ДеЛеННО? Об ИХ ПРОИОХОТКД^НУ" Ч*. п^ЧОВйЧЙЧ ЭТИХ «м«чнх hjV>^c—

тавдн.ется коэнолн.-м. Ci/íf»«-*-'**» »-«юя'.-ипч f.v-^;.».,, „ »jjpyc-<t

Л/Ленинград/;оЗ/оЗ ¡i ронаганных ему изо.ытон с лабораторными штаммами нрослехничется в том обстоятельстве, что их ген И rif<•:.-исходит из геномч вируса A/PR/8/34(H0Nl). В то „е вр^мл,у штамма • А/Свердюиск/8373/вВ г*н М ириннм'^т »~«г.у<\"»м A(JPí;:y 1972-1977 годов.

4.4. ВИРУСЫ, СЮ/ТШ С A/'PR/S/34( НОМ1).

Штаммы, сходнее с вирусам! гриппа 30-х годов, выделяются достаточно регулярно в с ?■ ш разных регионах. На им иеследована первичная структура генока трех из них. Сравнение г«ноь и белков НА вирусов А/Ленинград/Р2/Б2( HDN1) и А-'Л.-ниг-рад/23/31( H0N1) с эталонами 30-х годов приведено в табл. О и 7. Йзолят А/Ленинград/23/81 выделен из спинномозговой редкости больного 1,5 лет с диагнозом "гнойный шинингит". У обо;:;-; трусов гены НА отличается друг от друга,наиболее близки к гену птамма A/PR/3/34(НОМ1),но не совпадают ни с одним «в до пи-пор описанным эталоном топ эпохи. Внимательный анализ покрывает, что отличия от двух лабораторных вариантов «ггаш A/PR/8/34 в основном связаны с тем,что последние накопили значительное число мутаций за десятилетия раздельного лассиропп-ния в лабораторных условиях,тогда как гены Hh вирусов А/Лоты-град/32/5'2,и особенно А/Лениград/23/81,пги.Оолее близки к кро-ятной нативной первичной структуре вирусов 30-х годов.

Еще более неожиданно, что гены NP, N3 и РА я i «»номе j>Hpyi;?i А/Ленинграл/ЗЗ/З'К H0N1) происходят т геном.-» см°нны>. нщ>у-сов A(Hlw'l) 1377-80 г. - что ¡jиер->:.'¡fi^ч1 см п ¡^тыт кче^у^щ--вой гибриливации (табл. 8,9,10;>. В ц^.пом, )>^:--ульт«-пы ¡<тмы* первичной СТрутурМ ГЕНОМОВ -Vi'ИХ двух К"рУ'--Г|« nWíVWW пь

те же выводы, чч-о и и случдр оиксн.ньы/ »•, .аконг о-тюд> ••<-и1-ч

вирусов 198Г)-80

Природа иролита ПО!!]) совершенно иная.

- 2S -

и аналогичные eiviy три вируса 1987 года были выделены в ШР or детей с тяжелой клинической картиной заболевания. У переболевши детей наблюдался прирост антител'к эталону A/PR/8/34CH0N1).

Анализ последовательности нуклеотвдов гена Ш вируса А/ШР/198/83 показал, что в области тяжелой субъединкцы он полностью совпадает с геном НА одного из • лабортаорных вариантов штамма A/PR/8/34 "Mount Sinai" и отличается по 10 нуклеотидш* от другого (британского) лабортаорного варианта "Carnbridjje" этого же штамма. .Эти отличия включают характерную делецию триплета и 8 из них приводят к заменам аминокислот. В области легкой цепи структура гена варианта "Mount Sinai" не опубликована, а с вариантом. "Cambridge" имеется 3 молчащих различия, нуклеотидов Т-1391-А, С-1493-А и А-1749-С. Частично установленная первичная структура 6 генов кора во всех случаях наиболее близка к генам штамма A/PR/8/34,причем к тому его лабораторному варианту,который применяется в СССР для получения вакцинных штаммов для инактлвированных вакцин и происходит кз американского варианта "Mount Sinai,:. Очевидно,что все различия между тремя вариантами штамма A/PR/8/34 накопились в ходе их раздельного пассирования посла изоляции. Совокупность приведенных данных позволяет отождествить изолят А/ШР/198/83 с однаы из таких лабораторных вариантов и подтверждает реальность антропогенного загрязнения биосферы измененным:: вирусными геномами.

4. 5.' АТИПИЧНЫЕ ВИРУСЫ А(НЖ),

В 1982-86 годах в МНР и в 1988 году в Шскве от детей с тяжелой клинической картиной выделены штаммы,антигенно родственные эталону А/СССР/90/77( RLN1), Изучение первичной структуры генома одного из них - A/MHP/128/36(H1N1) - показало, что он происходит кз вакцинного штамма X/Ленинград/54/1, применявезгосй в СССР и КНР для массовой вакцинации в составе инактивирокзикой вакцины в 1979-81 г. Как уже упо-

- 29 - •

¡.зналось; этот вакцинный птамм содержал 6 генов кора от лабораторного варианта A/PR/8/34(H0N1),а гены НА и NA - от вируса А/Хабаровск/74/77( H1N1) (табл. 11). 'Ген НА вируса ЛЛШР/128/8б сохранил уникальную аминокислотную замену F-71-V в НА1 втгмма Л/Хзбаровск/74/77, отличающую его от всех остальных вирусов этого подтипа,и приобрел дополнительную молчадую нуклеотидную замену В-536-А. Частичная структура зсэх шести генов кора ■показала,что у вируса А/ШР/123/86 они,как и у лротогипного вакцинного штампа, происходят из генома лабораторного заринта вируса A/PR/834. При этом обнару-гены дополнительные замены нуклеотидов Т-58-А з гене .!; T-S.77-G в геке HS, приводящая к замене аминокислоты V-84-в з fiSl;. 6-103-А з гене РА, приводящая к иутащог D-Z7-U а его белке.

П;рус А/Г£>сква/771/88( НШ) оказался родственным другому вакцинному зтамму А/Шев/59/79/Р(ШШ),применявсемуся для : '2.0 с обой вакцинации з составе шактлвированвой вакцины в 1984-85 годах. Этот загаданный атамм, как у,-© отмечалось, представляет собой реассортавт.нееусяй гены U,HS,РА от лабораторного варианта стажа A/PR/8/34(HlNl),a остальные гены от эпидемического вируса ¡УКиев/59/79(НШ1), который сам представляет собой природный реассортант с генаш FS1, РВ2, HP и РА от вирусов А(ШК2)(р:-я.З).

В гене Ш вируса "А/йэсква/771 /88 сохранены все 4 уникальные молиэчие закгиу нуклеотидоэ,отличавдие ген вируса-прототипа А/Киев/59/79 от веек остальных штаммов, и появились две дополнительные .мутации С-737-Т и A-91Z-G, последняя I© которых приводит к замене аминокислоты T-Z77-A (табл.11). Частичное секвенирование 6 генов кора показало их идентичность соответствующим генам вакцинного гоамма А/Ки-ев/59/79/Р,включая происхождение генов FBI, РВ2 и NP от вирусов А( ЬШ2), а генов РА,М и KS именно от того лабораторного варианта штамма A/PR/8/34, который применяется в СССР для получения вачцин. В гене Ii имеется замена нуклеотида

T-5S-A,как и у вируса А/МНР/128/86,что говорит об общности их происхождения.

Само по себе,наличие дополнительных мутаций в генах изучаемых вирусов делает весьма маловероятной возможность тривиального загрязнения,тем более,что в лабораториях выделения с ¡кишии вирусами не работали, а сами выделения вирусов от больных сделаны спустя 3-7 лет после окончания производства и применения соответствующей вакцины. Очевидно,эти мутации закрепились за время реального существования их в чело-ь» чес (То и поп у.л л ции.

Сйраиает ка себя внимание не само появление дополнительных мутаций,а их относительно малое количество. Ведь в процессе антигенного дрейфа в НА1 за эти 3-7 лет накапливается 80-40 замен нуклеотидов. Можно предположить,что сохранение происходило не посредством микроциркуляции от одного Сольного к другому,а в персистентном состоянии в одном и том >;е организме с последующей активацией.

4. б. ПЕРСИСТЕНТНЫЕ ВИРУСЫ ГРИППА А.

Длительная лерсистенцкя в организме человека могла бы служить способом сохранения истинных "реликтовых" вирусов гриппа. Нами была исследовала первичная структура генов НА мо- ' дельного вируса А/Виктория/35/72(БЗМ2) на 62 т 158 день пер-систенции в культуре клеток MDC-K и вируса А/Ки-ев/1/84( H3.N2) .сходного с А/Гоконг/1/б8(НЗМ2) и выделенного в. августе 1984 года из лимфоцитарной фракции крови тяжелого больного 18 лет (табл. 12). У вируса А/Киев/1/84 обнаружено 10 отличий нуклеотидов от гена КА прототипа А/Гонконг/1/68,причем 9 из них приводят к аминокислотным заменам,не совпадающим ни с одним из известных дрейфовых вариантов доминантных популяций. За разделявшие их 16 лет при свободном антигенном дрейфе мутаций додшо было накопиться на порядок больше. Таким образом, вирус А/Киеь/1/84 представляете собой истинно "реликтовый"

анахронизм.

При сравнении двух пероистентных вирусов выявляется Ht-K' торая аналогия в расположении и возможных функциональных нос-»""'''•тт'млх ешвж-шшх изменений. К первой группе относятся еближеннме г пространс1?* мутяцуч ьм^окнелот ъ приьк-кйраыь :"! области молекулы НА и вблизи сайтов процесоинга. Это дея'муи аминокислоты в положении 2,замены в положениях 3,5,323 тяжелой цепи НА вируса А/Киев/1/84 и мутация Т-1П6-М г, легкой цени НА вируса. А/Виктория/53/72 на 153 день якспери,\:ентаяьноЯ потенции, приводящая к потере единственного в этой цепи сайта глтозилирования. По литературным данным,такая потеря блокирует транспорт синтезирующихся молекул НА на клеточную мембрану и,соответственно,приводит к прекращению продукции яралт вкри-оков.

Ро вторую группу входят мутации в области антигенной детерминанты А в положениях 1-М и 145 у вируса А/Ь'и<?вЛЛ34. Однако замена Б-144-D присутствовала ул;е у некоторых самых первых вирусов А(B3N2) 1968 года,так что антигенно значимой заменой можно считать лишь 5-145-/»'.которая появилась у. ес<=х доминантных вирусов А( H3N2) только после 1975 г.

Самую обюрную третью группу мутаций составляют -замени в области . "кармана" НА,отвечавшие за специфичность связывания вируса клеточным рецептором. Таким образом,в случае обоих пероистентных вирусов,аминокислотные замены в основном располагаются не в антигенных детерминантах,а в двух областях молекулы НА,функционально отвечавших за раепоакавание клеточного реце-тора, процесеинг и, возможно, транспорт белка на мембрану (сбопк-у вириона). Еще одной чертой,сблиглицей эти два вируса, являете« необычно малое число молчащих мутаций нуклеотпдов в гене НА. Соотношение молчащих и аминокислотных замен в FTA модельного ' персистентного вируса составляет 1/5,а у вируса А/Киев/1/34 даже 1/10,тогда как в ходе обычного антигенного дрейфа «иело молчзших яамен равно или превышает число аминокислотных (рис. 1).

Исходя из изложенного вш»е нагаего понимания процессов из-

- 32 - '

менчивости вирусов гриппа,изменения в гене НА при персистенции должны появляться за счет постепенной адаптации к этому состо: янию и при повторном переходе в активную <£орму. Однако в таких процессах адаптации число замен в гене НА само по себе крайне мало,и они сводятся в основном к заменам аминокислот,причем эти замены,как правило, расположены вне антигенных детерминант, поскольку не являются следствием отбора под действием антител. Число молчащих мутаций в гене НА при этом также должно быть крайне малым,поскольку отсутствуют стадии передач от особи к особи с периодическими резкими уменьшениями эффективной численности иопуляции вируса и случайным отбором минорных еуб-пооуляций Бее это должно создавать своеобразную картину распределения мутаций в генах вирусов,прошедших персистентную фа-*у,реако отличную от оакономеряоетей антигенного дрейфа и сходную с тем,что имеет место у двух , изученных персистентных вирусов. Однако,судя по результатам секвенирования.сам по себе переход к персиотенции и последующая реактивация вызваны в основном не изменениями в гене НА. Они лишь сопровождают упомянутые процессы,но не являются абсолютно необходимыми для них . или их причиной. Так,в гене НА вируса А/Виктория/35/72 на 62 день персистенции в культуре ШСК никаких изменений не обнаружено. Основные функционально значимые молекулярные перестрой-. ки.еидимо,происходят в других генах вируса,а сами механизмы,

перехода в персистентное состояние могут быть различны.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ. СШРЕМЕННЫЙ ЭТАП ГОШИЦИОННОГО РАЗНООБРАЗИЯ ВИРУСОВ ГРИППА А ЧЕЛОВЕКА И ЭТИОЛОГИЧЕСКОГО НАДЗОРА ЗА ГРИППОМ.

Основные результаты, приведенные в настоящей »работе,получены в 1986-89 г. За это время секвенировано более 100000 нук-леоткдов в нескольких десятках генов гемагглютияина и около 100 других генов различных штаммов вирусов! гриппа А. Это стало возможным в результате применения новых методов анализа Наш была разработана новая схема прямого определения первичной

структуры вирусных РНК на основе комбинации ферментативной достройки праймера на матрице вирусного генома и химического секвенирования,соединяющая достоинства обоих методов. Зто позволило использовать для анализа практически неочищенный суммарный нуклеотидный материал,выделяемый из концентрата осветленной аллантоисной жидкости куриных эмбрионов,зараженных вирусом гриппа. Сущность схемы сводится к трем этапам. Сначала меченный по 5'-концу радиоактивной меткой специфический олиго-нуклеотидннй праймер,комплементарный единственному участку генома вируса,достраивается ревертазой и нерадиоактивными три-фоефатами на матрице негативной цепи вирионной РНК,присутствующей в суммарном нуклеотидном материале. На втором этапе радиоактивные продукты достройки (кДШ) разделяются электрофорезом в геле и для дальнейшего анализа берется фракция размером более 300 нуклеотидов,что позволяет отсечь все продукты преждевременной' терминации синтеза цени. Зта операция позволяет ликвидировать "паразитные" полосы в интервале от 1 до 300-го нук-леотида от меченного конца праймерь при последующем секвениро-вании химическим методом Максама-Гилберта,нечувствительным к вариациям первичной и вторичной структуры. Если еще в 1985 году д."» • рэесчфровки структуры гена НА приходилось тратить 2-4 месяца,то сейчас в оптимальных условиях этот срок сократился до нескольких дней.

.На практике была применена и новая: схема этиологического надзора за гриппом, включаодая стадии первичного отбора классическими вирусологическими методами необычных по своим биологическим ^*ли антигенным свойствам .вирусных изолятов и пи, напротив, наиболее репрезентативных,их генотипирование методом конкурентной точечной гибридизации с финальным отбором наиболее интересных штаммов для прямого секвенирования генома.

Быстрое накопление информации о первичной структуре генсв вирусов гриппа поставило проблему ее осмысления,упорядочивания и сопоставления с данными классической вирусологии. Такой процесс привел к формированию определенной концепции зволюционно-

>-о процесса в популяции эпидемических вирусов гриппа А - "молекулярной эпидемиологии". Этот структурно-эволюционный подход позволяет описать наиболее общие популяционные закономерности в роджгин эпидемических л'>оц«ееов к«к обусловленные спецификой строения генош самого ьо«"'удителя и обратным влиянием на него яй^к^ний в нопулянии хозяина,вызванных саморазвитием эпидемического процесса. Под этим углом зрения подробно рассмотрен процесс антигенного дрейфа вирусов А(БЗН2) за последние 20 лет,дрейфа вирусов А(Н1К1) после их "возвращения" в эпидемическую циркуляцию в 1977 году,изменений в генах вирусов при лабораторных манипуляциях, в частности,при создании вакцинных ытаммов,расшифрована структура генов ряда антигенных анахронизмов, документирована их аутентичность и,наконец,выявлена ео-ь-еркенно не учитываемая ранее роль так называемых" ангропоген-' ны.ч авторов в увеличили разнообразия генофонда циркулирующих вирусов гриппа.

Выяснилось,что современный этап антигенного дрейфа вирусов гриппа А(НЗК2) характеризуется нарастающей гетерогенностью антигенных характеристик мировой популяции вследствие длительного сосуществования представителей локально сформировавшихся антигенных подгрупп и ярко выраженным реверсивным характером аминокислотных замен в гене НА.

Вирусы подтипа А(Н1Щ) дока сохраняют линейность накопления молчавдх нуклеотидных и аминокислотных замен в ходе дрейфа.

Некоторые из изученных, изолятов,по-видимому,представляют собой истинно "реликтовые" вирусы гриппа,сохранившиеся в течение десятилетий практически без мутаций,возможно,в результате длительной персистенции.

Наряду с этим было обнаружено,что значительная часть так называемых антигенных анахронизмов не является такими истинными "реликтами",но прямо или косвенно связана с использовавшимися цельновирионными вакцинными препаратами - как инактивиро-взнными,так и живыми аттенуированными. Теоретически,появление а циркуляции отдельных генов вакцинных штаммов можно было бы

объяснить их "спасением" в результате реассортации с природными эпидемическими вирусами. Однако в большинстве исследованных случаев признаков такой реассортации не обнаружено. Напрашивается вывод о реальной способности цельнопирионных вакцин к спонтанному восстановлению вирулентности или частичному сохранению жизнеспособности вследствие несовершенства применяемых технологий инактивации п отсутствия полноценного контроля,что иногда приводит к достаточно длительному сохранению их в человеческой популяции.

В-поддержку такого утверждения могут свидетельствовать результаты исследования этиологии элизоотий ящура в Европе (в том числе проведенные нами в СССР),согласно которым до двух третей случаев вспнкек заболевания спровоцированы реактивацией иналтивироганных формалином вакцин.

Вероятно,чисто технические усовершенствования методов инактивации не смогут в ближайшее *ремя' гарантировать полное исключение возможности контаминации блос^рн измененными т-русячми геномами через вакцинаций. Поэтому, с нашей точки зрения,представляется целесообразным пересмотр общей стратегии вакцинопрофилактики гриппа и отказ от массового применения всех типов цельновирионных противогриппозных вакцин без соответствующего специального контроля.

• По-видимому,в настоящий момент доля вакцинных штаммов в общем вирусном генофонде в человеческой популяции незначительна. Однако нет никаких оснований считать,что такое положение сохранятся,если практика приготовления и использования вакцин не претерпит существенных изменений.

Переход, вирусов из латентного состояния в инфекцион-но-продуктивный процесс моле"* привести к значительному обогащению генофонда эпидемических вирусов человека с непредсказуемыми последствиями,особенно при значительном снижении иммунного фона в популяции хозяина.

Похоже, подобный прецедент уже имел место в 1977 году,когда и циркуляры " вернулись вирусы, практически тожественные

штаммам, хранившимся б лабораториях, с 1950 года.

Изучение отдельных разновидностей "антигенных анахрониз-юв" позволяет предположить,что переход в латентное состояние ».¡■л-ет слулить одьш из способов длительного сохранения в чело-оческой пояулмции ¥аю*е истин» "реликтовых" штатов вирусоь П'иигн. Пиатому ыюлне до>мо1ко,чги яе. каждый, а только истинный «¿(тигриный мгйфа (л'чвател.ьш дол>л»к быть связан с реас-сор-1'пгеномов вирусов ча.ц^ека и мииотных.

РОГИОН Подгруппа Y. НА 32 55 9Í 94 124 128 144 IF«;

>!илшшины/1/8£ D H 3 F G Y D Y

},'лс споили СССР/231 /85

С ¡HA СССР/3/85 У

Филиппины Иыо Д>нрс и/4/85 V

Мичиган/l/£t> V

Европа Сгокгольк/4/85 Б R V

Рига/9977/8б Е й V

------- Кен СССР/2/35

Тснга/?3/85 V

Иокогама/С5/85 У Вйнгкок/?746/65

Азия

Ятнат/чЯГ/оБ D v н

Снчуань Фукуоку/сяд/бп О V h'

•rpm/ea Е v

Сычуань/2/87 Y У D V !¡

а»сгоркя/7/37 У TD Y

155 159-153 ÍS3 201 2.3 246 251 ESVDRSNR

*н

к A

к Y A

Y A

к v A

Y A

P H

Нумерация аминокислотных оетаттр везде даиа от М-шнца зрелого безнз, а иу^ко-гу.дс-г: - vi 5' -jxmm ¡шххшый июни гена.

f;,ñ¡¡iuu> i, ('¡с-нивные особенности перяичнои структуры НА различиях локальных ая'х'шчгм.чк п- руиа ьИрусЛ} j'^n'-ina А(НЗН2). Зв*<«оч:и>й ииозначе.ча утеря сайта г.*ито?н«1}н->я?5нм.

Рисунок 1. Нчрастание числа итличий от гена и белка прототипного штамма в процессе антигенного: дрейфа. • ■.

1. Молчащие нуклеотидные замены в гене. НА вирусов гриппа A(H3N2) относительно прототипа А/Гонконг Л/68(БЗМ2)..

2: Аминокислотные отличия .от прототипа А/Гон-конг/1 /68( H3N2) в белке, НА1.вирусов гриппа A(H3N2).

8. Мэячаще замены нуклеотидов в. гене H.A.вирусов, гриппа A(HwNl) относительно гена' прототипа А/СССР/30/'77(. Ш N1).

А. Отличин аминокислот в белке НА1 вир/сов гриппа

- ч£

/Виктория/1

Ысмфис/1 Мемфис/102 У^Удорн/307

АС/29 Виктория/--Виктория/3 ^-Ленинград -Токио/1

л-X-\-\\\-

\ Виктория/35 РС/1 Ленинград/538\ Англия/864 Англия/12 VM0/1

чСингаяур/4

НК/107 /1971 /1972

/1973 /1974

/1975 /1976

Бельгия/2

Англия/321

Техас/1

Шзнхай/31 \«ешшград/385

Нидерланды/.'

ппины/1 НК/1

'1977

/1978 /1979

/1980

/1981

/1982

—:----CCCF/261

/ .СССР/3

/,НьюДжерси/4 ¿Мичиган/1

-Рига/9077

/ Стокгольм/4 Сычуань/2

Оита/3 \\\ ГФукуока/гэ /■Яманаим/497 ЗК/Я746 чйокогнма/5 Тонга/23 СССР/? /(Я^Л /1984 /ISttñ

Еиктсрия/7

/1936' /1957

■ СССР/21

'¡933

Рисунок 7.. Схема Фнлогеытич^екмх «йг-имоеся*«4!* генов ш ьируоор. п'ипин АСНЗНЗ*1 рУо.«.ичн>'л лет выделения.

- 41.-

М М М NS РА ' FB2 PB1

А/Ленинград/0139/76(H3N2)

A/PR/8/34C НОШ)

А/Ленинград/0139/76/Р(H3N2) +

А/Киев/59/79(НШ)

' ' ! ' ■ V

А/Киев/59/79/?( H1N1)

Ртакнш 3. Схема получения путем реассортации вакцинного шта1йЬ^а№В/5дА79/Р( H1N1).

N РВ1 (60-2.0Q). a/PR/8/34

a/vsm/зз ; а ;

А/Ленйнград/23/81 0. МЯвнттгШ/ШгЩ. I „ m

А/Сингапур/1/ST."; ■ • 2. G C Т

А/Знн Арбор/6/Ш; 2 6 С Т

А/КТ/60/63"' 3 G C

А/Киев/59/79 3; G С

н 66 75 81 84 87 105 111 123 129.135 147 о .a t сатст6аат

G Т Т

CAT С А

А Т А Т

А А А А

с с С

а, ft;-

А' Л

Я- й

а', й

А*. 1

А G А G А "С

G А

е А А

G А G

А G А G

Таблица 2. Различия в первичной структуре 5' -концевой части позитивной цепи гена РВ1 различных штаммов вирусов гриппа А человека.'Цифра'в гра^ "Н" означае^принадлежность гена вирусам сероподткпа соответственно: 2 - B2N2, 3 - H3N2.'

о - hdn1, 1 - h1n1,

- м>

N НА

А/Гонконг/1/68 G А/Гуинес/832/85 А А/Куба/1915/86 А A/COCIVodS/SB А A/CCCP/394/8S А

168 260 550 754 815 1076 1169 1511

С Т

А в

G G

Тгблп^а 3. Различия в первичной структуре гена НА го-конго- подобнык "антигенных анахронизмов" вирусов гриппа Л(НЗМ2). Точка обозначает отсутствие данных о первичной структуре гена в данной участке.

Г'

N НА ■ 1074 1542 1563 1631 1653

А/ВиктОрия/35/72 А 3 G Т Г

А/Виктория/35/72/50 5 Т А G и

А/Свердловск/7862/82 В т А G с

А/0десса/2880/82 S т А S с

Тс5л?!ца 4. Различия в' первичной структуре гена НА Еик-тория/72-лодобных вирусов гриппа A(E3N2).

N HAI

А/Порт Чалмерс/1/73 А/Ленинг рад/538/74 А/Ленинград/153/83 А/Свердловск/8373/83

215 224 754 839 С В т т I А

i г

Таблица 5. гриппа А(H3N2).

Различия в гене НА РС/73-подобных вирусов

N НА1

А/Ленинград/23/81 А А/Денинград/32'52 A/PR/8/34 М. Sinai A/PR/8/34 Cambr. G А/Ш/ЗЗ

140 200 301 349 377 383 445 469 471-3 499

А 5

С Т Т

С Т Т Т

6 в

А ААА

575 587 630 644 6'5"4 690 838 895 958 975 1049

а G Т т С Т G С Т G Т

Т А 6

т А С А А Т А G

т А А G

Г 6 А

Тайлэда 6. Различия нуклеогидных остатков в области НА1 гена НА вирусов гриппа А(ЮМ). Тире означает делецию остатка. Для штамма A/WSN/33 указаны остатки только в тех положениях, где они различаются у остальных четырех штаммов.

N HAI 73 89

А/Лешшград/23/81 А Т А/Ленинград/32/52 I A/PR/8/34 М. Sinai V I A/PR/8/34 Cambr. V I A/'WSN/ЗЗ А

- 43 -

73 89 121 129 130 139 1S3 187 191 203 252

N К

271 292 298 F V I

•Y

Таблица 7. Различия в аминокислотной последовательности НА в области НА1 вирусов гриппа A(H0N1).

N NP (240-380) Н 261 264 267 270 275 279 282 291 297 306

A/V3N/33 0 С G G G А Т А Т Т А

A/PR/3/34 М. Sinai 0 А А С Т

А/ Ленинград/23/81 г> G 0

А/Ленинград/621/86 i □ с

А/Сингапур/1/57 2 G с

А/Энн Арбор/б/60 2 G с 5

A/NT/60/68 3 А А G с G

А/Гонконг/1/68 3 А >4 G с G

А/Виктория/35/72 3 Т А В G с

Л'Удорн/307/72 3 Т А G G с

А/Киев/59/79 Г\ ц~\ Г А G G с

А/Гояконг/5/83 3 А А G . G С с

Н 327 330 338 339 346 348 349 353 354 359 363 377

0 А Т . G . G G Т G А G S А А

0 А С ' Т

С А т G G

i С А А г G G

2 0 А * т

2 С А т G

о о С А т G

3 с А т G

3 с Л А т

3 G с А А I G

3 G п А А j G

3 G п А G А Т G

Таблица 8.

ГаШаща 8. Сравнение первичных структур генов NP в оС>-ЛЙС'Г'Л нукяеотадос "'>'0-380.

-1,1,.

М РА (80-280) А/РН/3/34 А/Ленинград/23/81 А/Ленинград/621/36 А/Сингапур/1/57 А/Знн Арбор/6/б0 А/МТ/бО/бЗ ' А/Виктория 35/72 Д/Ленинград/403/86

н 9й 105 108 126 136 153 156 159 180 192

0 0 С : в А А А А С С б

А Т Т

1 А Т б 'Г

2 А Т т

3 А ' Т т 1

3 А Т б а 7 г А

3 А Т и Т т А

,ч 203 210 216 221 231 261 273

0 А С А 6 Т с Г

V А 6 Д г: А С

1 А В А С А с

2 А 0 А

Г1 (0 А 0 А А

о а А А с

0 б 0 Л

Таблица 3.

Таблица 9. Сравнение первичиьос структур генов РА в области нуклеотидов 80-280.

N MS H 275 276 277 279 284 287 290 293 294

1. A/V5N/33 0 Т G Г с А G С С С

2. A/PR/8/34 HS. 0 G Т

3. А/Ееллаш/'12 0 С Т

4. А/РК<1/1/47 1 с Т

5. A/FV/1/БО 1 С '. с Т Т А

б. A/CCCP/SQ/77 Í С с Т А

7. А/Киев/59/79 1 С с Т А

8. ЛЛСенинград/23/81 9. А/Мариленд/2/80 •7 i С С с с А Т Т А А т

10. А/Хьюстон/13515/84 1 С с А Т А А

1!. А/ХбКйТон/23234/85 1 с с А т А А

12. А/Лск;;::град/621/86 1 с с Т Т А

is. А/Денвер л/57 о «Г. г. п т M

J 4. А/Онн Арбор/С/60 с с т А

i5. А/8»рклч/1/68 • 2 с с г А

í 5. А/Удорц/307/Г2 3 с А с т А А

i 7. А/AjiHOKñ/ñ/77' 3 п А с т А А -

16. А/Ьйстон/242б9/85 3 с А с I А А

H NS H 309 314 318 ЗКо 327 334 341 344 360 365 374 375

1. ОС 6 А G С т С . G с С 7 А

2. 0 G с А

3. 0 А G

4. 1 А G

г;. 1 А G

С. 1 А G

7. 1 А G

а. ? А G

9. 1 А G G

10. 1 А А 6 G

Ii. .1 А А ' G G

■12. 1 А А G G

13. 2 Ä G А т

14. Я А S А

1П. А Т G А А т П

IG. 3 А Т • G А А А- П

37. 3 А Т А G А А А С

3 А 7 А G А А А П

ТаГисгца 10. Сравнение первичных структур генов НЗ в об-Айсгуи кугакотидоЕ 2GÎ3-4CO.

HAI

А/Хабаровск/74/7 А/МНР/i 28/86 Л/Киев/59/79 Л/!'оеква/771 / 88

215 226 294- 536 737 912 950 1040 Г G С

G G

Табдаца it. Отличия от обобщенной последовательности гена НА вирусов гриппа А(НШ) в генах "антигенных анахронизмов" и соответствующих вакцинных штаммов A(H1N1).

Прсцеесинг-трзнспорт? Антиген Рецептор N НА 154 156\2 3 5 323 144 145 165 167 219 220 226 228

А/ГонкогФ/1/68 . Т \D L G V G S TSR LS'

А/Киев/1/84 \- 1 V I D N * N Q G

HBj58 a- N \ F G Q

HA2XHA1

Тгбякца 12. Отличия бкинокколотной последовательности НА иерсиетенткнх штаммов от аротилн А/Гон-K0Hr/l/68(H3N2), приобретенные в процессе перс-потенции. Знн?-дочкой обозначено исчезновение сайт?, глико&илщювания. ПВ1П8 - вирус А/оикторил/35/72(НЗМ,?) на 158 день т»реиет<гнции в культуре клеток. .VDOK.

- к'i-

Основные результаты диссертации аацищрны авторскими свидетельствами на изобретения:

1. Способ геногилирования реассортантов вирусов гриппа. // Золотарев Ф. К. .Петров Н. А. .Голубев Д. В. ,Мамаев Л. В. -полок, реш. N4382523/30-13(028944) от -23.11.1938.

2. Рекомбинантная плазмидная ДНК pERI-N3/3 - молекулярный зонд для индикации гена N3 вируса гриппа А. // Петров Е А. .Нетесов С. В. .Головин С."Я. и др. - полк. реш. N4332861 /30-13( 028755.) от 27.02.1989.

3. Рекомбинантная плазмидная ДНК pBRI-M/4 - молекулярный, зонд для индикации гена И вируса гриппа А. // Петров Н. к , Нстеоов С. В. , Головин С. Я. и др. - полол реш. N4382361/30-13(023755) от 27.02.1936.

4. Рекомбинантнал плазмидная ДНК pBRI-MA/5 - молекулярный зонд для индикации гена МА вируса гриппа А(Н1К1) и A(H0N1). //.Петров H.A. .Нетесов С. В. .Головин С.Я. к др, -полок, реш. N4332861/30-13(028755) от 27.02.1989.

5. Рекомбинантная плазмидная ДНК pBRI-HF/8 - молекулярный зонд для индикаций гена РА вируса гриппа А. // Петров Е А. . Нетесов С. Е , Головин С. Я и др. - полок, рея:. N4332861/30-13(028755) от 27. 02Л989.

6. Рекомбинантная плазмидная ДНК pBRI-PB2/9 - молекулярный зонд для индикации гена РВ2. вируса гриппа А. // Петров H.A. .Нетесов С. В. .Головин С. Я. и др. - полок, реш. N4332361/30-13(028755) от 27.02.1989.

7. Рекомбинантная плазмидная ДНК pBRI-PBl/Ю - молекулярный вонд для индикации гена РВ1 вируса гриппа А. // Петров Н. А. .Нетесов С. В. .Головин С.Я. и -др/ - . .ролож. реш. N4332861/30-13(028755) от 27. 02. 1989.

Ихдои&вы в публикациях:

0. Бекдемкнев а. Б. .Блинов В. М. .Петров Н. А. и др. - Сик-

полноразметной ДНК- копии гена гемагглютинина вируса

гриппа A(H1N1)-подтипа,ее клонирование и определение первичной структуры. // Биоорган, химия.-1984. Т. 10.-Nil. С.153,'

9. Беклемишев А. Б. .Блинов В. М., Петров H.A. и др. -тез,клонирование и определение первичной структуры исмжорнз-мерной ДНК-копии гена нейраминидазн вируса гриппа А ¡¡'чдт'тн'' НШ. // Биоорган, химия. -19S5. -Г. 11-W5. -О. ОРЗ-ОЗЯ

10. Беклемишев А. Е , Блинов a It .Петров Я./-, и др. -Первичная структура полноразмерной ДНК-копии неЯраганн-дазы вируса гриппа А/Киев/59/79>. H1N1). // Биооргн.е. лг -мия. -1985. -Т. 11. -N10. -С. 1433-14Р.6.

11. Беклемишев А. Б. .Блинов Е. М. .Петрив H.A. и др. -Синтез.клонирование и определение первичной структуры ncwwo-размерной ДНК-копии гена белка ИР вируса гриппа А. // Вииор-"ОП. ХИМИЯ. 1981». '1.11. -N5. -С. 63G-640.

12. ЕеклешнФв A. R , 71 К л^троз ». н др. Синтез,клонирование п определение первичной структуры полноразмерной ДНК-копии фрагмента 3 генома вируса гриппа А. // Биоорган, химия. -1985. -Т. 11. -N5. -С. 641-645.

13. Петров Н. А. // Канд. дисо. Первичная структура геномов рекомбинантннх вариантов вакцинных штаммов вирусов гриппа А. - 1985. -М.

14. Нетесов С. Е .Петров Е А. .Блинов В. М. , Каргинов Б. А.

- К вопрсу обзволюции гена гемагглотинина вируса гриппа A(H1N1)-подтипа (1977-1983 г.). // Молек. генетика-1986.-N11.'-С. 3-7.

15. Петров RA. , Нетесов С. В. .Блинов Б. М. .Василенко O.K.

- Эволюция гена гемагглютинина подтипа R3 вируса хрипла А человека. // Молек. генетика. -1980. -N11. - С. 7-14.

16. Беклемишев А. Б. .Блинок В. М. .Петров H.A. и др. -Первичная структура полноразмерной ДНК-копии гена белка NP вируса гриппа А/Киев/59/79(ЯШ). //Биоорган, химия. -1936. -Т. 12. -N3. -С. 309-374.

17. Беклемишев А. Е., Блинов В. М. , Петров H.A. и др. -Первичная структура полноразмерной ДНК-копни гена гемагглю-

тинина вируса гриппа A/KneB/53/79(HlNl). ' //Биоорган, химия. -1986. -Т. 12. -N3. -С. 375-381.

18. Петров Е L, Нетесов С. В.. Головин С. Я. и др. - Первичная струтура полноразмерной ДНК-копии гена белка РВ2 вируса гриппа А/Киев/59/79(НШ). // Биоорган, химия. -1987. -Т. 13. -N7. -С. 915-920.

19. Петров Е А. .Головин С. Я .Мамаев JL В. идр. - Первичная структура полноразмерной ДНК-копии гена белка РВ? вируса гриппа А/Киев/59/79(Hl rJ 1). // Биоорган, химия. -1987. -Т. 13-N9. -С. 1170-1175.

20. Гринев А. А. .Петров Е А..Головин С. Я. и др. - Первичная структура полноразмерной ЛИК-копии гена нейраминидазы вируса гриппа антигенного. подтипа N7. // Биоорган, химия. -1938. -Т. 14. -N3. -С. 416-418.

21. Петров К А. , Шмаев Л- В., Головин С. Я. - Первичная еруктура гена бела РВ" вируса гриппа A/FPV/Вейбридк. // Биоорган. химия. -1988. -Т. 14. -N4. -С. 548-550.

22. Петров Н. А. .Гринев А. А. .Василенко . С. К. и , др. Структура гена гемагглютинина вируса, гриппа при серийных п&.ъахах на куриных эмбрионах. // Бюлл. эксп. биол. к мед. -19-33. - НИ. -С. 596-593. . • •

ZZ. Петров Н. А. .Василенко С. К. .Гринев A.A. и др. - Пер-ьичнчя структура гена ГА вариантов вируса А/СССР/2/85С H3N2},. // Б сб. Проблемы конструирования гриппозных вакцин. ■ -1033. -ВНИК гриппа.-Л..-С. 54-«).' • •

РА. Сандахчиев Л. С. ,Пу'?).)иВ Н. А. .Гркнеа A.A. и др. -Первичная ст)»уктура геномов современных гонконго-подобных Вйрусоь гриппа. // ДАН СССР. -1983. -Т. 302. -N6. -СЛ494-1497.

1Ъ. 'с ' Ф. Е ,Голуси?в Д] Е , Петров H.A. - Метол точечной

гибридизации в вкру'.'ояигии. И Успехи ооьр. бимл. -1938. -Т. 508. -Ьмн.СЧО).- С. 375-335.

20, Жданоь R E-,IfeTp"B H.A. .Гринев A.A. и др. - Первичная структура гумапмшитмнина вирусов гриппа А( H3N2).изолированных в СССР

- 50 -

3 1985 году. // Еопр. вирусологии. - 1989. - N2. - 0.155-160.

27. Голубев Д. Б»,Какфэрия Я. Е, .Петров Н. А. - !&>лекулярная зпиде-imomrm и диагностика гриппа и других вирусных респираторных заболеваний. // Итоги науки и техники. ВШШИ. Сер. Вирусология. Генетика вирусов животных. - 1989.- Т. 18. - С. 3-63.

28. Сандахчиев Л С. .Петров Е А.. Василенко С. К. и др. - Первичная структура атипичных вирусов гриппа А(НЗ?12) 1982-86.//ДАН СССР. -1989. - Г. 308. - N2. -С. 477-480.

29. Петров Н. А , Гринбауы S. Б., Литвинова О. М. и др. - Структура генома вируса гриппа А/Ленинград/23/81(Н1Н1). //Йэлек. генетика. -1990. - N7.- С.17-21.

30. Петров ЕА,Еаеиленко С.Б. ,Горбунов 10. А. и ду. - Первичная струтстура гона Feí.íanvüorIÍHÍTHH ^г^амма л /р^г^уооуу/.^р,

"И1 ■•}■ и! ¿it /V Т* )(1J i, 4MIIVt'll ni U'Mrt. — í Qmi i. —

b*c*. . 37*?— 373.

Si. H. H. »titrrp'.tó H.A. ,Вйслш?fcrio С. К. я' др. ~ лмракт»?-

рлст:га гемзгглкгиыша переистентних вариантов вируса гриппа ¡VБикторкя/35/72( НЗN2). // Шпр. вирусологии. - 1990.- N5.-0.374-376. 32. Петров Е А. , Василенко 0. Б. - Современное разнообразие вирусов гриппа А человека на молекулярном уровне. // Мэлек. генетика.-1990.-Ш2. - С. 3-10.

основные швода

ПСЮлВРИЯ, БЫНОСШЫЕ НА ЗАЩИТУ

I Впервые установлены первичные структуры нескольких де-снтко в генов доминан-'нн* и атипичных вирусов гриппа А человека, л&кцининх и лабораторных штаммов,в сумме составляющих около 100 тысяч оснований.

2. С'Знаруле.нн нов ну закономерности поздних фаз антигенного др^йфг! вирусов гриппа пидтииа А(НЗН2).выражающиеся в сохранении линейности накопления молчащих нукдеотидных замен в гене г^магглкгтинчна; резком замедлении скорости накопления числа отличий аминокислот от белка прототипа с переходом к его стабилизации и нарастанию количества ревесиЕных замен аминокислот при повторных мутациях; формированию локальных антигенных подгрупп, длительно сосуществующих без взаимного вытеснения,что приводит к резкому возрастанию антигенной, гетерогенности в природных популяциях вируса гриппа; частичной имитации антигенных характеристик предшествовавших дрейф-вариантов.

3. Вирусы гриппа А(Н1Н1) продолжал1 сохранять линейный характер накопления как молчащих нуклеотидных.так и аминокислотных замен в гене и белке НА в процессе антигенного дрейфа.

4. На уровне первичной"структуры показано,что после изоляции - и адаптации вируса гриппа А к лабораторной культуре, дальнейшие изменения в последовательности нуклеотидоь гена НА в процессе обычного пассирования накапливаются чрезвычайно медленно и практически не влияют на структуру гена НА вакцинных штаммов.

5. Исследована первичная структура геномов родительских и вакииниых штаммов У/Ленинград/54/1(ШТ1) ,А/Киев/59/79/Р(НШ). Д/РН/3/34( НОШ),А/Виктория/35/72/50(НЗМ2),А/СССР/2/85( НЗЫЗ).

6. Создан банк клонированных и ееквенировннных ДНК-копий всех сегментов генома вируса гриппы А человека,относящихся к рсг.'-л'.ичйь'.м сероподтипуи, г; а осн"Ио к'ч^юги р-.'оработам уииа^-р-самонмв метод ш.и'Ииго геногинирог.шмч реаоеортантннх рирусннх

О ПОМОРЮ ЭТОГО М^ТРДе. Н':.,Н"~уп'г,Н'1'НОр ТОЧеЧН'.1!'' 1 ■" ■ -

йации ¿ьилен ряд природных реассоргантных вйрускых г<? чо^ов, р--зультаты анализа подтверждены лрямим е^квешфээинк'гм.

7. Открыто явление яшфта гена белка РБ1 у вирусов гр;ч;.:-А человека,происшедшее в интервале 1950-57 г.

8. Установлена первичная структура геномов рядь акткг-н-ных анахронизмов 1955-86 г. выделения, сходных с прототк-;. V А/Гонконг/1 /б8(ВЗЬ52) ,и показано отсутствие следов кх реа-гсл.-;.-тации с вирусами тавотных.

9. Для антигенных анахронизмов 1982 г. выделения,сходных с эталоном А/Енктория/35/72(ВЗШ).показана их прямая свлан с вакцинным пасса>ньм штампом А/1033/17.

10. Б случае изолятов 1983 г. .сходных с эталоном ¿/"орт Чапмере/1/73СНЗМ2), показана возможная связь части иг них с боартордам вмрз'сом А/РЯ/8/34.

И. для ряда геномов вирусов 1936-88 г. выделения,сходных е эталоном 4/СС!ОР/0О/7'г{Б1Я1) ,1токав«ча их прямая связь с к^ак-тиьироэалныма реаессртантными вакцинными штаммами Х/Лентаг-рад/54/1 и А/Киев/59/79/Р.

12. доследована первичная структура геномов вирусов п.д-типа А(ЭШ) разных лет выделения. Показана их гетерогенности: от полгного тождества с лабораторным штаммом А/Рй/8/34 в случае вируса А/МНР/193/83 до отличия от всех известны?: эталонов в случае вирусов А/Ленинград/32/52 и А/Ленинград/23/81. Б геноме последнего обнаружены гены, происходящие от- современных вирусов подтипа А(Н1Ы1).

13. Исследованы изменения, происходящую в гене 'пА в процессе переистентяой гриппозной инфекции у человека и г мо<г.»ъ-ной системе..

Информация о работе

Петров, Николай Алексеевич
доктора биологических наук
Москва, 1991
ВАК 03.00.03

Автореферат

Похожие работы