Современные особенности экологии и биологические свойства различных субтипов вируса гриппа A, циркулирующих в популяциях диких птиц юга Западной Сибири

Сивай, Мария Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Современные особенности экологии и биологические свойства различных субтипов вируса гриппа A, циркулирующих в популяциях диких птиц юга Западной Сибири
ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Современные особенности экологии и биологические свойства различных субтипов вируса гриппа A, циркулирующих в популяциях диких птиц юга Западной Сибири"

На правах рукописи

005533533

СИВАЙ МАРИЯ ВЛАДИМИРОВНА

СОВРЕМЕННЫЕ ОСОБЕННОСТИ ЭКОЛОГИИ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА РАЗЛИЧНЫХ СУБТИПОВ ВИРУСА ГРИППА А, ЦИРКУЛИРУЮЩИХ В ПОПУЛЯЦИЯХ ДИКИХ ПТИЦ ЮГА ЗАПАДНОЙ СИБИРИ

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология 03.02.02-экология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

26 СЕН 2013

Новосибирск - 2013

005533533

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» и Федеральном государственном бюджетном учреждении высшего профессионального образования «Новосибирский национальный исследовательский государственный университет».

доктор биологических наук, профессор Шестопалов Александр Михайлович,

доктор биологических наук, профессор Сергеев Михаил Георгиевич

Аликин Юрий Серафимович доктор биологических наук, Институт медицинской биотехнологии ФБУНГНЦ ВБ «Вектор», ст. науч. сотр. лаборатории,

Щелканов Михаил Юрьевич доктор биологический наук, доцент, ФГБУ НИИ вирусологии им. Ивановского РАМН, заведующий лабораторией

Федеральное государственное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт защиты животных

Защита состоится «_£_» октября 2013 г. в « 12-00 » часов на заседании диссертационного совета Д 006.045.01. при ГНУ Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии по адресу: 630501, Новосибирская обл., Новосибирский район, п. Краснообск, ГНУ ИЭВСиДВ, а/я 8, тел/факс (383) 348-44-62. E-mail: dis.ievsidv@list.ru

С диссертацией можно ознакомиться в Сибирской научной сельскохозяйственной библиотеке Россельхозакадемии.

Автореферат разослан «_*£_» ceuf J>f/>st 2013 г.

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Ученый секретарь диссертационного совета

Стеблева Г.М.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Заболевание животных и человека, называемое гриппом, вызывают представители семейства ортомиксовирусов: вирусы гриппа родов А, В и С. Из них только вирус гриппа А (ВГА) имеет широкий круг хозяев, включающий различные виды млекопитающих и птиц (R.G. Webster et al., 1992). Дикие птицы отрядов гусеобразные и ржанкообразные являются основным природным резервуаром ВГА, в организме которых инфекция часто протекает бессимптомно. К настоящему моменту инфекция зарегистрирована у 105 видов диких птиц 26 отрядов (В. Olsen et al., 2006). Вирусы гриппа А также были выделены у свиней, лошадей, собак, различных видов грызунов, некоторых видов морских млекопитающих, кошек, норок, а также людей (R.G. Webster et al., 1992).

Сезонные миграции диких птиц способствуют распространению различных вариантов ВГА в отдаленные географические регионы и обеспечивают их долговременное присутствие во многих экосистемах, что определяет важность и необходимость эпизоотологического мониторинга вируса гриппа птиц в естественных условиях. Во время сезонных миграций различные экологические группы диких птиц перемещаются различными путями, придерживаясь благоприятных для их обитания мест.

На путях миграций и в местах зимовок осуществляются контакты между популяциями птиц, изолированными друг от друга в период гнездования. Это создает предпосылки для последующего географического распространения различных вариантов вируса ВГА как внутри одного вида, так и между видами (Д.К. Львов и В.Д. Ильичев, 1979). ВГА циркулирует повсеместно среди водно-болотных птиц, однако мониторинг этого вируса не может быть проведен на всей территории. В связи с этим наиболее актуально осуществление такого мониторинга в районах массовых скоплений водно-болотных птиц различных популяций.

Всё это определяет особую сложность ситуации, поскольку наши представления как о разнообразии ВГА, так и характерных для него эпизоотологических и экологических особенностях, до сих пор крайне поверхностны.

Поскольку все известные высокопатогенные для птиц штаммы ВГА относятся к одному из трех субтипов гемагглютинина: Н5, Н7 или к Н9, особое внимание при проведении мониторинга вируса гриппа в популяциях птиц необходимо уделять выявлению и изучению именно таких вариантов.

Другим важным аспектом изучения ВГА является выяснение филогенетических связей штаммов, выделенных от птиц разных регионов, что позволит изучить пути географического распространения вируса в природном резервуаре и разработать превентивные противоэпизоотические мероприятия.

Цкр

эпизоотии у домашней птицы. Высокопатогенные варианты вируса H5N1 также были обнаружены у некоторых видов млекопитающих, в том числе и у человека. На 13 февраля 2013 г. по данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) всего в мире зарегистрировано 620 случаев заболевания человека вируса гриппа A H5N1 субтипа, из которых 367 закончилось летальным исходом (WHO, 2013).

Таким образом, варианты вируса гриппа А, циркулирующие среди диких птиц, являются как причиной эпизоотий среди сельскохозяйственных птиц, приводящим к огромным экономическим потерям, так и источником опасности для здоровья человека. Поскольку основным резервуаром таких вариантов являются птицы естественных экосистем, для контроля над инфекцией необходимо выявить закономерности циркуляции вируса гриппа А в популяциях диких птиц и его распределения в разных таксономических и экологических группах последних.

На севере России располагаются главные места гнездования многих мигрирующих птиц отрядов гусеобразные. Особую важность представляет территория Западно-Сибирской равнины (М. Gilbert et al., 2006). Территориальные связи западно-сибирских птиц, формирующиеся в процессе сезонных миграций, весьма обширны. Территорию юга Западной Сибири пересекают центрально-азиатский, западноазиатский-восточноафриканский и восточноазиатский-австралийский перелетные пути, объединяя популяции птиц, зимующих в различных регионах мира - Европе, Африке, на Ближнем Востоке и в Средней Азии, Индостане и Юго-Восточной Азии, Австралии, Океании, полуострове Аляска (К.Т. Юрлов, 1981). Экологические особенности данного региона - наличие большого количества пресных и слабосоленых водоемов, а также резко континентальный климат - создают благоприятные условия для длительного сохранения вируса в воде и почве. В связи с этим на территории юга Западной Сибири существуют благоприятные условия для распространения различных вариантов патогена, его персистенции и эволюции (R.L. LaBelle et al., 1980; J. Nazir et al., 2011).

Таким образом, все вышеизложенное указывает на важность изучения экологии вируса гриппа А на территории юга Западной Сибири, исследование его генетического разнообразия, а также изучение биологических свойств и филогенетических связей выделенных штаммов вируса. Результаты, полученные в ходе данной работы, помогут не только улучшить знания о генетике и эволюции вируса, но также исследовать пути распространения вируса и прогнозировать развитие эпизоотической ситуации в случае ее возникновения.

Цели и задачи исследования. Цель данной работы - выявление биологического разнообразия и экологических особенностей вирусов гриппа А, циркулирующих у диких птиц юга Западной Сибири.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи: 1. Оценить биологическое разнообразие вариантов вируса гриппа А в популяциях диких птиц юга Западной Сибири.

2. Выявить закономерности распределения вирусов гриппа А в различных таксономических группах птиц.

3. Разработать последовательности синтетических олигонуклеотидов-праймеров для получения нуклеотидных последовательностей генов РВ2, РВ1, PA, NP, MP, NS вирусов гриппа А евразийской генетической линии.

4. Изучить основные биологические свойства выявленных редких и уникальных вариантов вируса гриппа А.

5. Провести анализ первичных структур генов вирусов гриппа А и установить филогенетические связи штаммов вируса гриппа А, выделенных на юге Западной Сибири.

Научная новизна. В ходе данной работы получены современные данные о циркуляции вирусов гриппа А среди диких птиц на территории юга Западной Сибири в период с 2008 по 2011 гг. Представлены результаты мониторинга вируса гриппа А на территории Новосибирской и Омской областей, а также Алтайского края. Всего было выделено и изучено 105 штаммов вируса гриппа А, относящихся к 21 субтипу.

Впервые в мире выделены вирусы гриппа А с субтипами H8N8 и HJ5N4 (штаммы A/teal/Chany/444/2009 и A/teal/Chany/7119/2008 соответственно). Изучены основные биологические свойства данных штаммов и показана возможность использования штамма A/teal/Chany/7119/2008 H15N4 субтипа для создания диагностикума (патент № 2478705 «Штамм вируса гриппа A/teal/Chany/7119/08/ H15N4-cy6THna для получения антигенсодержащего препарата и поликлональной сыворотки для диагностических целей»).

Также выделены такие варианты вируса гриппа, как низкопатогенные H5N1 и H16N3, данные о которых в исследуемом регионе отсутствовали.

Показана возможность использования штамма A/common gull/Altai/804/2011 H16N3 субтипа для создания диагностикума (заявка на патент: регистрационный номер 2012123090 от 04.06.2012).

Проведен молекулярно-биологический и филогенетический анализ матриксного гена (MP) выделенных штаммов вируса гриппа.

Теоретическая и практическая значимость. Разработаны последовательности синтетических олигонуклеотидов-праймеров для получения первичных структур генов (РВ2, РВ1, PA, NP, MP, NS) вирусов гриппа А с учетом особенностей вирусов евразийской генетической линии (заявка на патент 2012143573 от 11.10.2012).

Штаммы вирусов гриппа, полученные в ходе данной работы, могут быть использованы в диагностических целях в качестве антигенов и полученных на основе данных антигенов поликлональных сывороток.

Полученные данные о биологическом разнообразии выделенных штаммов вируса гриппа от диких птиц могут быть использованы в изучении экологии патогена, эволюции, а также путей распространения вируса.

Внедрение полученных результатов. Получена коллекция из 105 штаммов вируса гриппа различных субтипов, выделенных на юге Западной

Сибири. Восемь штаммов приняты на патентное депонирование в коллекцию культур микроорганизмов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор».

В международной базе данных GenBank задепонированы 132 первичных структуры генов вирусов гриппа.

Разработаны методические рекомендации «Комплексный эпизоотологический мониторинг вируса гриппа А на территории Сибири и Дальнего Востока», утвержденные подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 3 от 21 сентября 2011 г.) в целях использования в образовательном процессе в специализированных ВУЗах, а также в дальнейших научных исследованиях и в практической противоэпизоотической работе.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на: XLVII Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (г. Новосибирск, 2009 г.), Школе-конференции молодых ученых «Секвенирование полных геномов» (г. Иркутск, 2009 г.), 14th International Congress on Infection Diseases (г. Майами, 2010 г.), XLVIII Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (г. Новосибирск, 2010 г.), X International Conference of Molecular Epidemiology and Evolution Genetics of Infectious Diseases (г.Амстердам, 2011 г.), XIV International Symposium on Respiratory Viral Infections (г. Стамбул, 2012 г.), "Influenza 2012: One Influenza, One world" (г. Оксфорд, 2012 г.).

Публикации результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 16 работ, в том числе 3 статьи - в российских журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ («Вестник Новосибирского государственного университета», «Бюллетень Восточно-Сибирского Научного Центра СО РАМН», «Сибирский вестник сельскохозяйственных наук»), 1 патент РФ и 2 статьи - в зарубежных научных изданиях («Avian Diseases», «Journal of Virology»).

Объем и структура диссертации: Диссертация изложена на 155 страницах машинописного текста, включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов собственных исследований, выводы, практические приложения, список литературы и приложение.

Диссертация иллюстрирована 12 таблицами и 22 рисунками. Список литературы включает 179 источников, в том числе 163 работ зарубежных авторов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Биологическое разнообразие вирусов гриппа А циркулирующих у диких птиц юга Западной Сибири.

2. Разработанные последовательности синтетических олигонуклеотидов-праймеров для получения нуклеотидных

последовательностей генов РВ2, РВ1, PA, NP, MP, NS вирусов гриппа А евразийской генетической линии.

3. Основные молекулярно-биологических свойства редких и уникальных вариантов вирусов гриппа А субтипов H8N8, H15N4, H5N1 и H16N3.

4. Филогенетический анализа матриксного гена выделенных штаммов вируса гриппа А.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы исследований

Работа выполнена в отделе зоонозных инфекций и гриппа Федерального бюджетного учреждения науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» в 2008-2012 гг., а также на кафедре общей биологии и экологии и в научно-исследовательской части химии и биологии Федерального государственного бюджетного учреждения профессионального образования «Новосибирский национальный исследовательский государственный университет» (Новосибирский государственный университет, НГУ) с 2010 по 2012 гг. при поддержке Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы» - Госконтракты № 11.519.11.2014 и № 16.522.12.2011, РФФИ в рамках научного проекта №13-04-911-79 (ГФЕН-а) и при частичной финансовой поддержке Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» -соглашение № 14.В37.21.0661.

Собранный биологический материал исследовали на наличие ВГА с использованием стандартных методик, рекомендованных ВОЗ (WHO, 2012). Клоакальные смывы от птицы были собраны с помощью стерильного ватного тампона и помещены в стерильную пробирку, содержащую транспортную среду. Изоляция вируса производили путем введения первичного биологического материала в аллантоисную полость 10-ти дневных SPF (specific pathogen free) развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ). Наличие вируса в аллантоисной жидкости определяли реакцией гемагглютинации (РГА) и полимеразной цепной реакцией (ПЦР) с детекцией в режиме реального времени, с использованием технологии Taqman. Выделение вирусной РНК осуществляли с использованием коммерческого набора согласно инструкции производителя.

Субтипирование вируса осуществляли с использованием универсальных праймеров на гены НА и NA (Е. Hoffmann et al., 2001).

Определение нуклеотидных последовательностей осуществляли на автоматическом генетическом анализаторе согласно инструкции производителя. Анализ полученных нуклеотидных последовательностей производили с использованием компьютерной программы Vector NTI 10

(Invitrogene, США). Построение филогенетических деревьев осуществлялось с использованием компьютерной программы MEGA v5.3.

IVPI (intravenous pathogenicity index) исследуемых штаммов определяли на б-недельных SPF цыплятах породы Леггорн путем внутривенного введения вируссодержащей аллантоисной жидкости в объеме 0.2 мл (1063 ЭИД50). Зараженные цыплята наблюдались в течение 14 дней на проявление клинических признаков заболевания или смертность. При значении IVPI>1.2 штамм считали высокопатогенным (WHO, 2002).

Получение поликлональных сывороток на исследуемые штаммы вируса осуществляли на 4-недельных SPF цыплятах породы Леггорн путем внутривенного введения вируссодержащей аллантоисной жидкости в объеме 2.5 мл (106'3 ЭИД50). По истечению 21 дня у зараженных птиц тотально производили забор крови.

Антигенные свойства вирусов исследовали в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с использованием панели референс антисывороток, предоставленных доктором Р. Вебстером согласно протоколу ВОЗ и OIE (WHO, 2012; OIE, 2009).

Разработка структуры олигонуклеотидных праймеров осуществляли путем сравнения нуклеотидных последовательностей различных штаммов ВГП выделенных на территории Евразии и Африки, и депонированных в международной базе данных GeneBank. Локализация в геноме позиций сконструированных олигонуклеотидных праймеров соответствует наиболее консервативным районам генов.

Апробацию праймеров осуществляли с использованием большого числа изолятов ВГП, выделенных от различных видов диких птиц на территории Западной Сибири и Дальнего Востока России, а также Монголии.

Определение географических координат точек сбора образцов было осуществлено с помощью пакета GarminMapSource 6.15.11 и сформирована база данных мест отбора проб. На следующем этапе эта база была .интегрирована в свободно распространяемый пакет ESRIArcGISExplorer 1500. На основе входящих в состав пакета карт, сгенерированных на основе космоснимков, были созданы цифровые карты распространения субтипов, включенных в картографический анализ.

2.2. Результаты собственных исследований 2.2.1. Результаты мониторинга вируса гриппа А у диких птиц юга Западной Сибири

В период с 2008 по 2011 гг. на территории Бараба-Кулундинской низменности был собран биологический материал от 4678 диких птиц и исследован на наличие ВГА. Значительное количество образцов было собранно от птиц отрядов гусеобразные (60.82%), ржанкообразные (11.89%) и воробьинообразные (13.79%). На долю остальных восьми отрядов проходится 13.50% собранных образцов (табл. 1).

Собранный биологический материал исследовали на наличие ВГА с использованием стандартных методик, рекомендованных ВОЗ (WHO, 2012). Все выделенные изоляты ВГА не вызвали гибель РКЭ. В результате было получено 105 изолятов вируса гриппа. У изолятов вируса определили следующие субтипы: H1N1 (n=2), H1N2 (п=1), НЗ (п=1), H3N1 (n=l), H3N2 (n=l), H3N3 (n=l), H3N6 (n=2), H3N8 (n=37), Н4 (п=6), H4N6 (n=16), H5N1 (n=3), H5N3 (п=1), H6N2 (n=l), H8N4 (п=2), H8N8 (n=l), H13N2 (n=3), H15N4 (n=l), H16N3 (п=3), N1 (п=2), N6 (п=1), N8 (п=2). У 18 изолятов вируса при использовании стандартных наборов универсальных и субтипирующих праймеров субтип определить не удалось. Самыми распространенными субтипами НА у выделенных вариантов ВГА из общего количества явились НЗ (41.91%) и Н4 (21.91%), самыми распространенными субтипами NA - N8 (39.01%) и N6 (19.05%).

Изоляты ВГА были выделены от птиц отрядов гусеобразные, ржанкообразные, аистообразные и журавлеообразные.

Таблица 1-Таксономическая и количественная характеристика диких птиц юга Западной Сибири, обследованных на наличие ВГА

Название отряда Количество особей Количество видов Количество выделенных вирусов гриппа А

Гусеобразные 2842 17 94

Ржанкообразные 556 18 8

Воробьинообразные 645 14 0

Гагарообразные 2 1 0

Голубеобразне 209 3 0

Аистообразные 18 2 1

Журавлеообразные 259 3 2

Соколообразные 24 7 0

Совобразные 11 1 0

Курообразные 4 3 0

Поганкообразные 105 5 0

Всего: 4678 74 105

2.2.2. Разработка последовательности синтетических олигонуклеотидов-праймеров для получения первичных структур генов (РВ2, РВ1, РА, ИР, МР, N8) вирусов гриппа А

Генетически, все циркулирующие вирусы гриппа птиц делятся на 2 линии - Американскую (циркулирующие в Западном полушарии) и Евразийскую (циркулирующие в Восточном полушарии). Большинство используемых в настоящий момент наборов последовательностей типирующих и секвенирующих праймеров разработаны с ученом последовательностей генов вирусов Американской линии.

В связи с тем, что ВГП, циркулирующие на территории юга Западной Сибири относятся к Евразийской генетической линии, в ходе данной работы возникла необходимость разработки последовательностей синтетических праймеров, специфичных для получения нуклеотидных последовательностей штаммов вирусов гриппа А евразийской генетической линии.

В ходе данной работы для получения нуклеотидных последовательностей выделенных изолятов ВГА нами были разработаны последовательности синтетических олигонуклеотидов-праймеров. Праймеры фланкируют участки генов РВ2, РВ1, PA, NP, MP, NS низкопатогенных ВПТ, кДНК каждого из которых не имеет полиндромных повторов нуклеотидов и не образует выраженных вторичных структур, не имеет протяженных G-C участков. Для пар праймеров расчетная температура плавления была близкой и составила Тт=50°С. Специфичность образующегося фрагмента кДНК устанавливали прямым секвенированием полученного фрагмента.

К моменту разработки нового заявляемого набора праймеров, опубликованных данных по молекулярно-генетическому изучению вирусов гриппа птиц, циркулирующих на территории Евразийского континента и России в частности, не известно.

2.2.3. Изучение биологических свойств штамма A/teal/Chany/7119/2008 (H15N4)

В ходе мониторинговых работ за ВГА у диких птиц на территории Новосибирской области в 2008 г. нами был выделен и охарактеризован штамм ВГА A/teal/Chany/7119/2008 субтипа H15N4. Данный штамм вируса был выделен от птицы вида чирок-свистунок (Anas сгесса) на территории Чановской озерной системы (Новосибирская область). Это единственный случай выделения ВГА субтипа H15N4 в мире и первый случай выделения ВГА с субтипом НА-Н15 с 1983 г. Ранее ВГА с субтипом Н15 были выделены только на территории Австралии (1979 и 1983 гг.).

Была исследована патогенность выделенного нами штамма ВГА A/teal/Chany/7119/2008 (H15N4) на курах и мышах. При внутривенном заражении кур по истечению 21 дня нами не были обнаружены клинические признаки инфекции (IVPI=0). Также отсутствовали признаки проявления инфекции при интраназальном заражении мышей. Таким образом, исследуемый нами штамм является низкопатогенным для кур и мышей.

Путем внутривенного заражения исследуемым штаммом 6-недельных кур получили поликлональную сыворотку. Титр РТГА полученной сыворотки с гомологичным антигеном составил 1/1280 при диагностическом значении >1/40 (WHO, 2009).

Для изучения антигенных свойств, сравнили кросс-реактивность указанного штамма и референс-штамма A/shearwater/Australia/2376/1979 (H15N6). Как указано в таблице 2, кросс-реактивность референс-сыворотки на штамм A/shearwater/Australia/2376/1979 (H15N6) с исследуемым антигеном

имеет значение 1/1280. Сыворотка на штамм A/teal/Chany/7119/2008 (H15N4) не взаимодействует с референс-штаммом (титр РТГА<10). Полученные результаты указывают на то, что сыворотка на референс-нггамм может быть использована для выявления циркулирующих в настоящий момент изолятов ВГА Н15 субтипа.

Был проведен анализ аминокислотной последовательности субъединицы НА1 белка НА. Для этого провели сравнение аминокислотных последовательностей штаммов с субтипом Н15 (A/Australian shelduck/Western Australia/1756/1983, A/Australian shelduck/Western Australia/1762/1979, А/duck/Australia/341/1983, A/wedge-tailed shearwater/Western

Australia/2327/1983, А/shearwater/ Australia/2576/79), исследуемого штамма A/teal/Chany/7119/2008, а также штаммов с субтипом НЗ A/duck/Memphis/928/1974 и Н7 A/Anas crecca/Spain/1460/2008. В результате проведенного анализа штамма 2008 г. было выявлено 16 уникальных аминокислотных мутаций, 6 из которых находятся в функционально значимых районах белка.

Таблица 2 - Результаты РТГА ВГА субтипа HI 5

Антиген Антисыворотка (ГАЕ/мл)

A/shearwater/Australia/2376/1979 (H15N6) A/teal/Chany/7119/2008 (H15N4)

A/shearwater/Australia/2376/1979 (H15N6) 1280 <10

A/teal/Chany/7119/2008 (H15N4) 640 1280

Был проведен филогенетический анализ генов штамма A/teal/Chany/7119/2008 (H15N4). Дендрограмма гена НА (рис. 9) указывает на то, что штамм A/teal/Chany/7119/2008 относится к субтипу Н15, однако образует отдельную линию и не входит в субкладу с ранее выделенными ВГА субтипа Н15. Это может свидетельствовать о значительном генетическом отличии штамма 2008 г. от других вирусов Н15 субтипа. Филогенетический анализ гена NA исследуемого штамма указывает на то, что он относится к субтипу N4 и наиболее гомологичен с вирусами, циркулирующими на территории Европы. Филогенетический анализ генов РВ1, РВ2, PA, NP, MP, и NS (А аллель) штамма A/teal/Chany/7119/2008 (H15N4) указывает на то, что исследуемый штамм относится к Евразийской генетической линии вирусов гриппа птиц (рис. 11-13). Гены изучаемого штамма гомологичны генам штаммов ВГА субтипов H8N8, H3N6 и H3N8, раннее выделенных на территории Западной Сибири, что указывает на персистенцию генов Евразийской линии в данном регионе. Таким образом, исходя из результатов молекулярно-биологического и филогенетического анализа штамм A/teal/Chany/7119/2008 (H15N4) генетически значительно отличен от ВГА

субтипа Н15, выделенных ранее на территории Австралии и представляет собой вирус, содержащий гены Евразийской линии с геном НА, вероятней всего занесенным с Австралийского континента на территорию Западной Сибири за счет миграций диких птиц.

2.2.4. Характеристика штаммов вируса гриппа H5N1 субтипа, выделенных на территории Новосибирской области в 2011 г.

В 2011 г. на территории Новосибирской области было выделено 3 изолята ВГА H5N1 субтипа (A/European teal/Novosibirsk/203/2011, A/European teal/Novosibirsk/239/2011, A/European teal/Novosibirsk/261/2011) от птиц вида чирок-свистунок. Субтип выделенных изолятов был определен путем получения первичных структур генов НА и NA.

Изучение патогенности штаммов вируса гриппа H5N1 субтипа для кур. При внутривенном заражении кур вновь выделенными изолятами ВГА H5N1 субтипа но истечению 14 дней после заражения проявление клинических признаков заболевания не наблюдалось. Вследствие этого выделенные нами штаммы явились низкопатогенными для кур (IVPI=0).

Генетический и филогенетический анализ штаммов вируса гриппа H5N1 субтипа. Особенности структуры белков вирусов ВПГП H5N1 субтипа обуславливают проявления данными вариантами вируса высокой патогенности для различных видов животных. Основными молекулярными детерминантами патогенности вируса являются наличие в белке НА мультиосновного сайта расщепления и делеция в 11 аминокислот в белке NA (J.S.M. Peins et al., 2007).

Анализ последовательности белка НА выделенных нами ВГА H5N1 субтипа показал отсутствие мультиосновного сайта расщепления. Генетический анализ гена NA данных изолятов вируса указал на отсутствие делеции в 33 нуклеотидных остатка. Данные результаты также указывают на низкую патогенность выделенных нами вариантов ВГА H5N1 субтипа.

Филогенетический анализ гена НА штаммов A/European teal/Novosibirsk/203/2011, A/European teal/Novosibirsk/239/2011, A/European teal/Novosibirsk/261/2011 указывает на высокую гомологию исследуемых вирусов со штаммами вирусов Hill 11, ранее выделенными на территории Европы и Африки. Исходя из филогенетического анализа NA гена исследуемых штаммов H5N1 субтипа видно, что сибирские штаммы ВГА наиболее родственны с азиатскими и европейскими штаммами вируса различных субтипов НА.

Результаты исследования биологических свойств штаммов ВГА A/teal/Chany/444/2009 (H8N8), A/common gull/Altai/804/2011 (H16N3), /common gull/Altai/805/2011 (H16N3), /common gull/Altai/807/2011 (H16N3) представлены в тексте диссертации.

2.2.5. Филогенетический анализ гена матриксного белка штаммов вируса гриппа А

В ходе данной работы, в период с 2008 по 2011 гг. на территории юга Западной Сибири было выделено и охарактеризовано 105 штаммов вируса гриппа. Были получены первичные структур матриксного (М) гена выделенных штаммов и проведен его филогенетический и аминокислотный анализ.

Филогенетический анализ гена показал, что все М гены исследуемых вирусов относятся к линии М гена птиц. На полученной дендрограмме можно условно выделить 2 основные группы — вирусы гриппа птиц Евразийской линии (Евразийская клада) и вирусы гриппа чаек. Однако М ген одного из вирусов, выделенного от кряквы, филогенетически оказался более близок к М гену ВГА, выделенных от чаек.

В кладе вирусов гриппа чаек можно выделить 2 субклады — 1 и 2, представленные вирусами субтипов Н13 и Н16. Субклада 1 представлена ВГА, выделенных от различных видов чаек на территории Евразии и северной Америки. Субклада 2 - ВГА чаек, выделенных на Евразийском континенте. Четыре из 7 вирусов юга Западной Сибири попадают в субкладу 1. Другие два вируса относятся к субкладе 2. Оставшийся ВГА (A/mallard/Altai/843/2011(Hc)), также относящийся к данной кладе и образует отдельную генетическую линию, не относящуюся ни к одной из выделенных субклад.

Евразийская клада представлена вирусами гриппа птиц, выделенными на территории стран Азии, Африки и Европы, а также Австралии, Японии и России от птиц различных отрядов. Кроме того, в данную кладу входят ВГА, выделенные от нескольких видов млекопитающих — свиньи, ондатры и человека. Интересно заметить, что один из исследуемых штаммов наиболее гомологичен штамму, выделенному на территории Северной Америки, а также группируется со штаммами ВШ 11 H7N7 субтипа, выделенными в 2003 г. в Нидерландах и Германии от кур и человека. Группа, состоящая из пяти штаммов ВГА, выделенных в различные года на юге Западной Сибири, наиболее гомологична штаммам, выделенным в 2000 г. на территории Бурятии от ондатры и дикой утки. Кроме того, в данной кладе также встречаются ВГА субтипа Н5 как низкопатогенных, так и высокопатогенных вариантов, выделенных на территории Евразии. Более того, М гены двух из исследуемых штаммов, выделенные от сизой чайки, также относятся к Евразийской кладе и наиболее родственны вирусам, выделенных от диких уток.

Относительно периода выделения, все вирусы на дендрограмме М гена располагаются хаотично, что свидетельствует о персистенции различных вариантов М гена в популяции диких птиц юга Западной Сибири.

Из полученных данных филогенетического анализа можно судить о том, что на территории юга Западной Сибири среди диких птиц циркулируют различные варианты М гена. Среди птиц отрядов гусеобразные, аистообразные, журавлеобразные и ржанкообразные циркулируют ВГА обоих клад. Также, М гены некоторых исследуемых штаммов гомологичны штаммам ВГА млекопитающих.

Анализ аминокислотной последовательности М2 белка показал наличие а.к. 26L, 27V, ЗОА, 31S, 77R, обуславливающих лекарственную чувствительность штаммов вируса к амантадину.

3. ВЫВОДЫ

1. В период с 2008 по 2011 гг. на территории юга Западной Сибири было собрано 4678 образцов от диких птиц, от которых выделено 105 изолятов вируса гриппа, относящихся к 21 субтипу: H1N1, H1N2, НЗ, H3N1, H3N2, H3N3, H3N6, H3N8, Н4, H4N6, H5N1, H5N3, H6N2, H8N4, H8N8, H13N2, H15N4, H16N3, N1, N6, N8. Наиболее распространенными субтипами вируса явились H3N8 (п=37) и H4N6 (п=16).

2. Штаммы вируса гриппа были выделены от диких птиц отрядов гусеобразные, ржанкообразные, журавлеобразные и аистообразные, относящиеся к водно-болотной экологической группе. Наибольшее количество штаммов вируса гриппа было обнаружено у гусеобразных (94 штамма) и ржанкообразных (8 штаммов). Процент выделения у гусеобразных (3.30 %) достоверно выше, чем у ржанкообразных (1.44 %), что подтверждает основную роль птиц отряда гусеобразные в распространении и поддержании циркуляции вирусов гриппа.

3. Разработаны и протестированы последовательности синтетических олигонуклеотидов-праймеров для получения нуклеотидных последовательностей генов РВ2, РВ1, РА, NP, МР, NS вирусов гриппа А, специфичных для вирусов гриппа А евразийской генетической линии. Эффективность разработанных праймеров показана при получении первичных структур генов штаммов вируса гриппа А, выделенных от диких птиц на территории юга Западной Сибири.

4. Впервые в мире выделен и изучен уникальный штамм вируса гриппа А H15N4 субтипа (A/teal/Chany/7119/2008). Штамм является низкопатогенным для кур (IVPI=0) и мышей. Гемагглютинирующий титр антигена штамма при культивировании в РКЭ составил 1280 ГАЕ/мл. Титр антигемагглютинирующих антител при внутривенном заражении кур достигал 1/320-1/640. Данные характеристики позволяют эффективно использовать штамм A/teal/Chany/7119/2008 для получения диагностической поликлональной сыворотки и приготовления антигенсодержагцего диагностического препарата.

5. Впервые в мире был выделен изолят вируса гриппа новой уникальной комбинации субтипов НА и NA - H8N8 субтип (A/teal/Chany/444/2009). Филогенетический анализ всех восьми сегментов генома штамма показал принадлежность вируса к евразийским генетическим линиям вируса гриппа птиц. Штамм является низкопатогенным для кур (IVPI=0). Гемагглютинирующий титр антигена штамма при культивировании в РКЭ составил 5180 ГАЕ/мл. Титр антигемагглютинирующих антител при внутривенном заражении кур достигал 1/320. Данные характеристики позволяют эффективно использовать штамм A/teal/Chany/7119/2008 для получения

диагностической поликлональной сыворотки и приготовления антигенсодержащего диагностического препарата.

6. Выделено 3 штамма вируса гриппа A H5N1 субтипа (A/European teal/Novosibirsk/203/2011, A/European teal/ Novosibirsk /239/2011, АУЕигореап teal/ Novosibirsk /261/2011). Штаммы оказались низкопатогены для кур (IVPI=0). При исследовании аминокислотной последовательности белка НА показано отсутствие мультиосновного сайта расщепления, что также указывает на принадлежность данных штаммов к низкопатогенным вариантам.

7. Филогенетический анализ гена матриксного белка выделенных штаммов вируса гриппа выявил циркуляцию на территории юга Западной Сибири нескольких генетических вариантов данного гена, относящихся к евразийской генетической линии вируса гриппа птиц и линии вируса гриппа чаек. Показана циркуляция общего пула генов вируса гриппа А у диких птиц различных отрядов на территории юга Западной Сибири. Аминокислотный анализ белка М2 показал отсутствие маркеров устойчивости к амантадину у всех выделенных штаммов вируса гриппа А.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Результаты, полученные в ходе данной работы, могут быть использованы широким кругом вирусологов, молекулярных биологов, ветеринарных специалистов, экологов и студентов ВУЗов, а также специалистов в области организации и проведения противоэпизоотических мероприятий.

Штаммы A/teal/Chany/7119/2008(H15N4) и A/teal/Chany/444/2009(H8N8), как представители вируса гриппа А новых комбинаций субтипов НА и NA, могут быть использованы для приготовления антигенсодержащих препаратов и получения диагностических поликлональных сывороток в целях дальнейшего использования в системе эпизоотологического мониторинга.

Разработанный набор структур синтетических олигонуклеотидов-праймеров для получения первичных структур генов (РВ2, РВ1, PA, NP, MP, NS) целесообразно использовать для изучения молекулярно-биологических свойств штаммов вируса гриппа.

Практические предложения, изложенные в опубликованных методических рекомендациях «Комплексный эпизоотологический мониторинг вируса гриппа А на территории Сибири и Дальнего Востока», утвержденных подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока», отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 3 от 21 сентября 2011 г.) могут быть использованы в образовательном процессе в специализированных ВУЗах, а также в дальнейших научных исследованиях и в практической противоэпизоотической работе.

5. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Сивай, М.В. Анализ циркуляции вирусов гриппа типа А, выделенных на территории Чановской озерной системы / М.В. Сивай, Ф.А. Ильиных, М.В. Кулак, Е.М. Шестопалова, А.К. Юрлов, А.М. Шестопалов, И.Г. Дроздов // Вестник НГУ. - Серия: Биология, клиническая медицина. - 2010. - Т. 8., вып.2. - с. 25-28.

2. Сивай, М.В. Уникальные варианты вируса гриппа юга Западной Сибири / М.В. Сивай, А.К. Юрлов, A.B. Друзяка, К.А. Шаршов, А.М. Шестопалов // Бюллетень Восточно-Сибирского Научного Центра СО РАМН. - 2012. - № 5(87), 4.1. - С. 319-322.

3. Донченко, A.C. Генотипирование вирусов гриппа А, выделенных от диких птиц на юге Западной Сибири в 2011 году / A.C. Донченко, Ю.Г. Юшков, М.В. Сивай, К.А. Шаршов, А.М. Шестопалов // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. -2012.- №6.-С.84-89.

4. Пат. 2478705 Российской Федерации МПК C12N7/00, А61К39/145 Штамм вируса гриппа A/teaI/Chany/7119/08/ Н15М-субтипа для получения антигенсодержащего препарата и поликлональной сыворотки для диагностических целей / М.В. Сивай, В.Ю. Марченко, А.Г. Дурыманов, К.А. Шаршов, А.М. Шестопалов.; заявитель и патентообладатель Гос. науч. центр вирусол. и биотехн. Вектор - № 2012107189/10 ; заявл. 27.02.12 ; опубл. 10.04.13.

5. Sivay, M.V. Surveillance of Influenza A Virus in Wild Birds in the Asian Part of Russia in 2008 / M.V. Sivay, S.G. Sayfutdinova, K.A. Sharshov, A.Y. Alekseev, A.K. Urlov, J. Runstadler, A.M. Shestopalov // Avian Diseases. -2012.-V. 56.-P. 456-463.

6. Sivay, M.V. Influenza A (H15N4) Virus Isolation in Western Siberia, Russia / M.V. Sivay, T. Baranovich, V.Y. Marchenko, K.A. Sharshov, E.A. Govorkova, A.M. Shestopalov, RJ. Webby // Journal of Virol. - 2013. - V 87 №6.-P. 3578-82.

7. Сивай, М.В. Анализ циркуляции вирусов гриппа типа А, выделенных на территории Чановской озерной системы в 2008 году / М.В. Сивай // Научно-практическая конференция «Современные аспекты эпидемиологического надзора и профилактики особо опасных и природно-очаговых болезней». - Журнал инфекционной патологии. - Иркутск 2009 -Т. 16, №3. - С. 196.

8. Сивай, М.В. Анализ циркуляции вирусов гриппа типа А в постэпизоотический период на территории Чановской озерной системы в 2008 году / М.В. Сивай // XLVII Международная научная студенческая конференция «Студент и научно-технический прогресс». - Новосибирск, 2009. - С. 156.

9. Сивай, М.В. Анализ циркуляции вирусов гриппа типа А в постэпизоотический период на территории Чановской озерной системы в 2008

году / М.В. Сивай // Школа-конференция молодых ученых «Секвенирование полных геномов». - Иркутск, 2009. - С. 38.

10. Сивай, М.В. Генотипирование вирусов гриппа типа А, выделенных на территории Чановской озерной системы в 2008 году / М.В. Сивай // XLVIII Международная научная студенческая конференция «Студент и научно-технический прогресс». - Новосибирск, 2010. - С. 142.

11. Хрипко, Ю.И. Метод ПЦР в режиме реального времени в диагностики вируса гриппа А в фекальных массах птиц / Ю.И. Хрипко, М.В. Сивай, Н.Ю. Силко, JI. Лайсинг, Я. Мин, Ч. Шенг, A.M. Шестопалов // Молекулярная диагностика. - Москва, 2010. - С. 367.

12. Sivay, M.V. Surveillance for Influenza A Viruses in Wild Birds in the Asian Part of Russia in 2008 / M.V. Sivay, S.G. Sayfutdinova, M.V. Kulak, P.A. Ilinykh, A.K. Urlov, F. Hautmann, J.A. Runstadler, A.M. Shestopalov // X International Conference of Molecular Epidemiology and Evolution Genetics of Infectious Diseases. - Amsterdam, The Netherlands, 2010. - № 0082.

13. Sivay, M.V. Analysis of circulation Influenza A viruses on the Chany Lake (Novosibirsk region, Russia) in 2008 / M.V. Sivay, P.A. Ilinykh, E.M. Shestopalova, M.V. Kulak, A.M. Shestopalov, I.G. Drozdov // 14th International Congress on Infection Diseases. - Miami, USA, 2010. - №1766.

14. Sivay, M.V. A Role of Wild Goose (Anser) Populations of Russia and Tibet Plateau in the Spread of the Avian Influenza Viruses / M.V. Sivay, N.Y. Silko, K.A. Sharshov, A.V. Prokudin, L. Laixing, Y. Min, C. Sheng, A.M. Shestopalov // Chinese Birds Journal. - 2011. - V. 2(3). - P. 140-146.

15. Sharshov, K.A. Avian and Human Influenza Virus Surveillance in Asian part of Russia (2010-2011) / K.A. Sharshov, A.G. Durymanov, M.V. Sivay, S.G. Saifutdinova, V.Yu. Marchenko, O.G. Kurskaya, I.A. Sobolev, I.M. Susloparov, A.V. Zaikovskaya, A.Yu. Alekseev, T.N. Ilyicheva, A.M. Shestopalov // XIV International Symposium on Respiratory Viral Infections. - Istanbul, Turkey, 2012. -P. 56.

16. Sivay, M.V. Surveillance for Avian Influenza Viruses in the Western Siberia (Russia), 2008-2011 / M.V. Sivay, K.A. Sharshov, V.Yu. Marchenko, A.K. Yurlov, A.V. Druzyaka, A.M. Shestopalov // "Influenza 2012: One Influenza, One world". - Oxford, UK, 2012. - P. 25-27.

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Сивай, Мария Владимировна, Новосибирск

Министерство здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия

человека

Федеральное бюджетное учреждение науки ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ВИРУСОЛОГИИ И БИОТЕХНОЛОГИИ «ВЕКТОР» Федеральное государственное бюджетное учреждение высшего профессионального

образования

«НОВОСИБИРСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» (НОВОСИБИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ, НГУ)

На правах рукописи

Сивай Мария Владимировна

СОВРЕМЕННЫЕ ОСОБЕННОСТИ ЭКОЛОГИИ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА РАЗЛИЧНЫХ СУБТИПОВ ВИРУСА ГРИППА А, ЦИРКУЛИРУЮЩИХ В ПОПУЛЯЦИЯХ ДИКИХ ПТИЦ ЮГА ЗАПАДНОЙ

СИБИРИ

06.02.02 — ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология,

микология с микотоксикологией и иммунология. 03.02.08 — экология

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

д.б.н., профессор Шестопалов А. М.

д.б.н., профессор Сергеев М. Г.

Новосибирск -2013

ОГЛАВЛЕНИЕ Стр.

Список используемых сокращений 3

ВВЕДЕНИЕ 4

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11

1.1. Вирус гриппа А 11

1.1.1. Структура вируса гриппа А и устройства его генома 11

1.1.2. Генетика вирусов гриппа 22

1.1.3. Эволюционная генетика вирусов гриппа А 24

1.2. Экология вируса гриппа 24

1.2.1. Циркуляция вируса гриппа А среди диких птиц 25

1.2.2. Циркуляция вируса гриппа А людей 33

1.2.3. Циркуляция вируса гриппа А среди других млекопитающих 36

1.2.4. Межвидовая трансмиссия вируса гриппа А 40

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы

2.2. Результаты собственных исследований

1.3. Экологические особенности территории юга Западной Сибири и роль данного региона в циркуляции вирусов гриппа А в популяции диких птиц___

1.4. Заключение по обзору литературы___47

2.2.1. Эпизоотология вирусов гриппа птиц на территории юга Западной Сибири в 2008-2011 годах

2.2.2. Распределение вируса гриппа А у птиц юга Западной Сибири

2.2.3. Дизайн и тестирование праймеров-олигонуклеотидов для целевой амплификации генов вирусов гриппа птиц_____

2.2.4. Редкие субтипы вируса гриппа птиц. Их молекулярно-биологические свойства

2.2.4.1. Изучение молекулярно-биологических свойств штамма A/teal/Chany/7119/2008 (H15N4)___

2.2.4.2. Изучение молекулярно-биологических свойств штамма A/teal/Chany/444/2009 (H8N8)__

2.2.4.3. Изучение молекулярно-биологических свойств штаммов A/European teal/Novosibirsk/203/2011 (H5N1), A/European teal/Novosibirsk/239/2011 (H5N1), A/European teal/Novosibirsk/261/2011 (H5N1)__

2.2.4.4. Изучение молекулярно-биологических свойств штаммов A/herring gull/Altai/804/2011 (H16N3), A/herring gull/Altai/805/2011 (H16N3), A/herring gull/Altai/807/2011 (H16N3)________

2.2.5. Филогенетический анализ матриксного (М) гена выделенных штаммов вируса гриппа птиц_______

2.2.6. Картографический анализ распределения субтипов вируса гриппа птиц на юго-востоке Западно-Сибирской равнины__

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИИ

78 83 83

93 95

105

110

113

4. ВЫВОДЫ

133

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРИЛОЖЕНИЯ

135

6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

136

ПРИЛОЖЕНИЕ

155

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

НА - гемагглютинин

IVPI (Intra venous pathogenicity index) - индекс патогенносте при

внутривенном введении

М - матричный белок

NA - нейраминидаза

NP - нуклеопротеид

NS - неструктурный белок

РА - полимеразный белок

РВ1 - полимеразный белок 1

РВ2 - полимеразный белок 2

А.ж. - аллантоисная жидкость

А.к. - аминокислота

ВГА - вирус гриппа А

ВГП - вирус гриппа птиц

ВПГП - высокопатогенный грипп птиц

вРНК - вирусная РНК

ГАЕ - гемагглютинирующая единица

ДНК- дезоксирибонуклеиновая кислота

кРНК - РНК, комплементарная геномной РНК

КЭ - куриный эмбрион

ЛД5о - доза, вызывающая 50% гибель

мРНК - матричная РНК

Hill П - низкопатогенный грипп птиц

ОТ - обратная транскрипция

П.н. - пара нуклеотидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РГА - реакция гемагглютинации

РКЭ - развивающийся куриный эмбрион

РНК - рибонуклеиновая кислота

РНП - рибонуклеопротеидный комплекс

РТГА — реакция торможения гемагглютинации

САЖ - стабилизирующий раствор, содержащий 10% сахарозы и 15% желатина

ФСБ - фосфатно-солевой буфер

ЭИД50 - доза, инфицирующая 50% эмбрионов

ВВЕДЕНИЕ

Начиная с 1997 г. на территории стран Юго-Восточной Азии формируется эндемичный очаг вируса гриппа A H5N1 субтипа. На территории данных стран вирус был обнаружен не только среди диких птиц, но и вызвал крупнейшие эпизоотии у домашней птицы. Высокопатогенные варианты вируса H5N1 также были обнаружены у некоторых видов млекопитающих, в том числе и у человека. На 13 февраля 2013 г. по данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) всего в мире зарегистрировано 620 случаев заболевания человека вируса гриппа A H5N1 субтипа, из которых 367 закончилось летальным исходом (WHO, 2013).

А в популяциях диких птиц и его распределения в разных таксономических и экологических группах последних.

Цель и задачи исследования. Цель данной работы - выявление биологического разнообразия и экологических особенностей вирусов гриппа А, циркулирующих у диких птиц юга Западной Сибири.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Оценить биологическое разнообразие вариантов вируса гриппа А в популяциях диких птиц юга Западной Сибири.

2. Выявить закономерности распределения вирусов гриппа А в различных таксономических группах птиц.

4. Изучить основные биологические свойства выявленных редких и уникальных вариантов вируса гриппа А.

Впервые в мире выделены вирусы гриппа А с субтипами H8N8 и H15N4 (штаммы A/teal/Chany/444/2009 и A/teal/Chany/7119/2008 соответственно). Изучены основные биологические свойства данных штаммов и показана возможность использования штамма A/teal/Chany/7119/2008 H15N4 субтипа для создания диагностикума (патент № 2478705 «Штамм вируса гриппа A/teal/Chany/7119/08/ Н15Ж-субтипа для получения антигенсодержащего

препарата и поликлональной сыворотки для диагностических целей», Приложение 10).

Также выделены такие варианты вируса гриппа, как низкопатогенные Н5Ш и Н16№, данные о которых в исследуемом регионе отсутствовали.

Показана возможность использования штамма АУсошшоп ёи11/Аиа1/804/2011 Н16Ю субтипа для создания диагностикума (заявка на патент: регистрационный номер 2012123090 от 04.06.2012, Приложение 11).

Проведен молекулярно-биологический и филогенетический анализ матриксного гена (МР) выделенных штаммов вируса гриппа.

Теоретическая и практическая значимость. Разработаны последовательности синтетических олигонуклеотидов-праймеров для получения первичных структур генов (РВ2, РВ1, РА, МР, N8) вирусов гриппа А с учетом особенностей вирусов евразийской генетической линии (заявка на патент: регистрационный номер 2012143573 от 11.10.2012, Приложение 12).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Биологическое разнообразие вирусов гриппа А циркулирующих у диких птиц юга Западной Сибири.

2. Разработанные последовательности синтетических олигонуклеотидов-праймеров для получения нуклеотидных последовательностей генов РВ2, РВ1, РА, ЫР, МР, N8 вирусов гриппа А евразийской генетической линии.

4. Филогенетический анализа матриксного гена выделенных штаммов вируса гриппа А.

iL _

Иркутск, 2009 г.), 14 International Congress on Infection Diseases (г. Майами, 2010 г.), XLVIII Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (г. Новосибирск, 2010 г.), X International Conference of Molecular Epidemiology and Evolution Genetics of Infectious Diseases (г.Амстердам, 2011 г.), XIV International Symposium on Respiratory Viral Infections (г. Стамбул, 2012 г.), "Influenza 2012: One Influenza, One world" (г. Оксфорд, 2012 г.).

Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 16 работ, в том числе 3 статьи - в российских журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ («Вестник Новосибирского государственного университета», «Бюллетень Восточно-Сибирского Научного Центра СО РАМН», «Сибирский вестник сельскохозяйственных наук»), и 2 статьи - в зарубежных научных изданиях («Avian Diseases», «Journal ofVirology»).

Внедрение результатов исследований. Получена коллекция из 105 штаммов вируса гриппа различных субтипов, выделенных на юге Западной Сибири. Восемь штаммов приняты на патентное депонирование в коллекцию культур микроорганизмов ФБУНГНЦВБ «Вектор» (Приложение 1-8).

Сто тридцать две первичных структуры генов вирусов гриппа депонированы в международной базе данных GenBank (Приложение 13).

Опубликованные методические рекомендации «Комплексный эпизоотологический мониторинг вируса гриппа А на территории Сибири и Дальнего Востока», утвержденных подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 3 от 21 сентября 2011 г.) могут быть использованы в образовательном процессе в специализированных ВУЗах, а также в дальнейших научных исследованиях и в практической противоэпизоотической работе (Приложение 9).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 155 страницах машинописного текста, включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов собственных исследований, выводы, практические приложения, список литературы и приложение.

Диссертация иллюстрирована 12 таблицами и 22 рисунками. Список литературы включает 179 источников, в том числе 163 работы зарубежных авторов.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Вирус гриппа А

Вирус гриппа принадлежит к семейству Orthomyxoviridae, включающему шесть родов - Influenza virus A, Influenza virus В, Influenza virus С, Togovirus, Quaranjavirus и Isavirus, отличающиеся по антигенным различиям в нуклеопротеидном (NP) и матриксном (М) белках (М.Ю. Щелканов и др., 2011; ICTV, 2012). Вирус гриппа А (ВГА) является наиболее патогенным и инфицирует разнообразные виды позвоничных,

включая свиней, лошадей, морских млекопитающих и птиц, периодически

вызывая пандемии в человеческой популяции. Все известные вирусы гриппа птиц относятся к ВГА. Геном вируса сегментирован и представлен восемью молекулами одноцепочечной РНК негативной полярности, кодирующими 8 генов (N.J. Сох and К. Subbarao, 2000; B.W. Jagger et al., 2012).

Штаммы ВГА классифицируют на субтипы на основании антигенных свойств двух поверхностных гликопротеидов вирусной частицы -гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA). К настоящему моменту известны 17 субтипов НА (HI-HI7) и 10 субтипов NA (N1 - N10) ВГА (V.S. Hinshaw et al., 1982; Y. Kawaoka et al., 1990; S. Tong et al., 2012).

1.1.1. Структура вируса гриппа А и устройство его генома.

Вирионы ВГА представляют собой частицы плейоморфной, чаще округлой формы, диаметром 80-120 нм (рис. 1). Липидный компонент оболочки вируса имеет клеточное происхождение. На поверхности липидной оболочки присутствуют два типа шипиков (диаметром 10-14 нм), образованных гликопротеинами, - стержнеобразными шипами гемагглютинина (НА) и в меньшем количестве грибообразными шипами нейраминидазы (NA) (М.Ю. Щелканов и Д.К. Львов, 2011; R.A. Lamb and

R.M. Krug, 2001). Шипы первого типа представлены тремя молекулами НА, каждая из которых состоит из двух субъединиц (НА1 и НА2), соединенны�

Информация о работе

Сивай, Мария Владимировна
кандидата биологических наук
Новосибирск, 2013
ВАК 06.02.02

Диссертация

Современные особенности экологии и биологические свойства различных субтипов вируса гриппа A, циркулирующих в популяциях диких птиц юга Западной Сибири - тема диссертации по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы