Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Моделирование и диагностика персистентной гриппозной инфекции на мышах

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Моделирование и диагностика персистентной гриппозной инфекции на мышах"

Г»" л1

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВАКЦИН И СЫВОРОТОК

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

На правах рукописи УДК 616.988.75.078.735

ВИКТОРОВА Людмила Михайловна

МОДЕЛИРОВАНИЕ И ДИАГНОСТИКА ПЕРСИСТЕНТНОЙ ГРИППОЗНОЙ ИНФЕКЦИИ НА МЫШАХ

(03.00.06 — вирусология)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

. Санкт-Петербург

. \__^

Работа выполнена в научно-исследовательском институте вакцин и сывороток г. Санкт-Петербурга.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор О. К. Кузнецов доктор медицинских наук М. Н. Медведева

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Ф. И. Полежаев доктор медицинских наук М. А. Бичурина

Ведущее учреждение: Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт детских инфекций РАМН. ^

.Защита диссертации состоится « ^Т » утЦ 992 г. в

JA. ч. на заседании специализированного совета (Д. 074.48.01) при научно-исследовательском институте гриппа РАМН (197022, г. Санкт-Петербург, ул. проф. Попова, 15/17).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке научно-исследовательского института гриппа РАМН. .„

Автореферат разослан « »

Ученый секретарь специализированного совета

И. Н. Жилинская

Акт^альность_проблему: Явление персистенции различных микроорганизмов широко распространено в природе. Персистенция выступает в качестве универсального механизма взаимодействия инфекционного агента с организмом хозяина. Многие вирусы, вызывающие острые инфекции, при определенных условиях способны к персистиро-ванию. Оце в 40-е годы ßurnet высказал мысль о том, что для выживания вируса как вида "популяция большой численности, наряду с вирулентными особями, обязательно должна содержать особи, имеющие безусловные потенции к латентному переживанию в организмах" (Burnet, 19/17 )•

По-видимому, способность к латенции свойственна всем группам вирусов. Более того, еще в 1961 году высказано положение о том, что состояние персистенции является наиболее распространенным типом взаимодействия вирусов и клеток (Янова Н.И., Богомолова И.Н., 1981).

Способность вируса гриппа персистировать в клеточных культурах (Гаврилов Б.И., 1966-1974) и в организме лабораторных животных (Зуев Б. А. и др., 1957-1965; Фролов А.5. и др. 1979-1983) не подлежит сомнению. Однако многие детали механизмов персистенции вируса гриппа в организме еще подлежат дальнейлему изучению и уточнению. Е частности, не ясен вопрос о роли иммунодепрессии в развитии гриппозной персистенции и возможности применения различных существовавших ранее способов диагностики этой формы инфекции.

Если для основной массы населения развитых стран заболевание гриппом не несет большой опасности для жизни людей, то для людей, которым по разным показаниям вводят иммунодепрессанты, любое инфекционное заболевание, и в том числе, грипп, непосредственно угрожает жизни, поэтому изучение хода гриппозной инфекции в условиях подавления иммунореактивности организма имеет большое значение.

Использование иммунодепрессантов получило широкое распространение в экспериментальных и клинических наблюдениях вскоре после начала применения стероидов в качестве противоопухолевого препарата. В настоящее время успешная трансплантация органов и тканей немыслима без предварительного подавления иыцунгсяс реакций у реципиента. Однако, считается доказанным, что подобное взаимодействие вызывает усиление острых и латентных внрусных инфекций, болезней, вызываемых бактериями, грибами, простейшими, а таете

сопровоздается повышением частоты злокачественных новообразований.

Немаловажное значение имеет ухудшение экологической обстановки в целом ряде районов страны, что влечет за собой нарушение иммунного статуса человека, и, как следствие, хронизацию ряда инфекционных заболеваний.

Отсюда следует, что изучение закономерностей течения вирусных инфекций на фоне иммунодепрессии приобретает большое практическое значение.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось моделирование персистентной гриппозной инфекции на мышах и изучение способов ее диагностики, для чего предполагалось решить следующие основные задачи:

1. Смоделировать персистентную гриппозную инфекцию на белых мышах.

2. Шяснить, как влияет на этот процесс иммунодепрессант циклофосфан.

3. На сконструированных моделях определить возможности иммунологической диагностики персистентной гриппозной инфекции.

4. Шяснить перспективность метода молекулярной гибридизации для диагностики персистентной гриппозной инфекции.

5. Изучить закономерности изменения антигенной структуры и биологических свойств вирусов в процессе персистенции.

Научная новизна работы. В результате проведенных исследований было обнаружено, что штаммы вируса гриппа в разной степени способны гызывать не только острую, но и персистентцую инфекцию со сроком пребывания возбудителя в организме до 122 дней.

Показана' регулярная воспроизводимость процесса персистенции вируса гриппа А в организме белых мышей.

Еыделение вирусов гриппа от персистентно инфицированных мышей требует проведения комплекса специальных лабораторных методов; заражение куриных эмбрионов, "слепые" пассажи, ультрацентрифугирование.

ШерЕые для вируса гриппа показано, что применение иммуно-депрессанта на фоне инфицирования мышей способствует продлению сроков персистенции вирусов в организме и активирует его проявления.

Епервые показано, что при сочетаном воздействии на организм мышей вируса гриппа и циклофосфана с 6 по 9 дни после инфицирования систезируются иммуноглобулины класса М, с 9 по 70 дни - 3 и М, после 70 дня - только М.

Установлено, что молекулярная гибридизация типа ДНК-РНК с помощью рекомбинантной плазмидной ДНК с клонированными генами вируса гриппа позволяет выявлять РНК вируса гриппа в легких мышей в сроки, существенно превышающие такоше при использовании других способов выявления вирусов (до 230 дня).

Установлено, что процесс персистирования вируса гриппа в организме мышей сопровождается закономерными изменениями комплекса основополагающих биологических свойств. Епервые на основе анализа структуры генома исходных и персистирующих вирусов гриппа методом РНК-РНК гибридизации с последующим анализом двуцепочечных гибридов показано закономерное появление мутаций в геноме персистирующих вирусов, приводящих к изменению электрофоретической подвижности полипептццов.

Научно-практическая значимость.

1. В результате проведенной работы в Государственной коллекции вирусов депонировано два оригинальных авторских штамма вируса гриппа А/Еиктория/35/72, изолированных из организма персистентно инфицированных мышей, охарактеризованные по вирусологическим и молекулярно-биологическим параметрам: ПБ5 (удостоверение № 2149 от 16.У.1988 г.) и ПВ 122 (удостоверение Р 2150 от 16.У.1988 г.).

2. Техника получения специфических молекулярных зоццов для проведения точечной гибридизации суммирована в инструкции - "Инструкция по изготовлению и контролю ДНК-зондов для диагностики гриппа". Утверждена директором ЛенНИИВС 22.12.1989 г.

3. Методика применения молекулярной гибридизации для выявления геномных последовательностей в органах персистентно инфицированных мышей в качестве самостоятельного раздела вошла в методические рекомендации "Использование молекулярных ДНК-зовдов для диагностики гриппозной инфекции и генотипирования вирусов гриппа" (ред.проф.Д.В.Голубева), - Ленинград, 1990.

4. Разработки по сравнительной оценке чувствительности разнообразных методов обнаружения вирусов в процессе персистенции в организме животных нашли свое отражение в рацпредложении5 "Способ-

выделения персистирущих вирусов из организма млекопитающих". Удостоверение 264 от 5.УЛ986 г.

Ссно1нш:_по ложенил ,еыиоскмнс_ на_ задиту:

1. Штаммы вируса гриппа А с разной интенсивностью способны формировать персистентную инфекцию у белых мышей при интраназаль-ном методе введения.

2. Иммунодепрессэнт циклофосфан при разных способах введения в организм инфицированных мышей способствует продлению сроков пребывания ьируса гриппа в организме и более позднему вирусо-гвделенип (до 115-120 дня от момента первичного инфицирования).

3. Молекулярная гибридизация типа ДНК-РНК с помощью рекомби-нантной плазмидной ДНК с клонированными генами вируса гриппа позволяет выявлять РНК вируса гриппа в легких мышей в сроки, существенно превышающие таковые с помощью любых других способов индикации вирусов (до 230 дня).

4. Процесс персистирования вируса в организме животного приводит к стабильным изменениям генетических свойств персистируюцих вирусов, основой которых является возникновение и накопление множественных мутаций в геномах вирусов и селекция мутантов.

Апробацутработы. Материалы диссертации доложены на конференциях молодых ученых во Ш1П Гриппа Минздрава СССР (19*^3,1979 г.). в Институте микробиологии им.А.Кирхенштейна А.Н. Латв.ССР г.Рига (1980 г.), на Юбилейной конференции, посгященной 50-летию ЛенНИИГС (1986 г.), а также на заседании вирусологической секции Общества микробиологов и эшщемнологов (1968 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, составлены Методические рекомендации по использованию молекулярных ДНК - содержащих зондов, в Государственной коллекции вирусов депонировано два авторских штамма.

Диссертация изложенп на 145 страницах машинописи, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, обсуждение результатов, выводов. Текст иллюстрирован 21 табл1*ц®ли, 10 рисунками. Список литературы содержит 221 название ре.бот отечественных и заруСсж.".ых нвторов.

Собственные исследования.

Материалы и методы

В работе использовали следующие варианты штамма вируса гриппа А/Викт ор ия/35/72 (Н3п2).

1. Низкопассажный ингибиторочувствительный к сыворотке теленка (I).

2. Температуро- и ингибиторорезистентный (2).

3. Температурорезистентный, выделенный из легких мышей на

4 день после инфицирования ( ta +) (3).

4. Температурочувствительный, вьщеленный из легких мышей на

5 день после инфицирования ( ts -) (4).

5. Эталонные штаммы А/ v/sit /31/33 (HI i;I) (А) Киев/59/79/r (H3n2), А/Еиктория/35/72 (Н3к2), полученные из музея вирусов лаборатории этиологии гриппа ШИИ Гриппа Минздрава СССР.

Работу проводили на беспородных белых мышах весом 9-12 г и мышах линий С/57/вlack СЗНА весом 9-12 г, которых получали из питомника АМН СССР "Рапполово".

Заражение мышей проводили интраназально под легким эфирным наркозом аллантоисным препаратом вируса, вводя 0,05 мл 10 lg ЭВД/50/0,2 мл.

Циклофосфан (производства Саранского завода медицинских препаратов) вводили внутрибргаинно в объеме 0,5 мл в концентрации 50 мг/кг веса животного по различным схемам в зависимости от модели опыта. Для выделения вирусов в различные сроки развития гриппозной инфекции отбирали группы животных по 4-5 штук. Извлеченные под наркозом органы растирали с электрокорувдом, готовили 10 % -суспензии на физиологическом растворе (рН 7,0-7,2) и вводили в КЭ. Бирус определяли в аллантоисной жидкости КЭ по реакции гемагглю-тинации с куриными эритроцитами. При отрицательных результатах проводили на КЭ не менее 3-х "слепых" пассажей, используя на каждую исследуемую пробу не менее 3-х КЭ. В тех случаях, когда дополнительные пассажи в КЭ не завершались выделением инфекционного вируса, материал 3-го "слепого" пассажа использовали для накопления "возможного инфекционного вируса на 20-30 КЭ с последующим центрифугированием аллантоисной жадности при 25 тыс.об/мин. в течение 1,5 часа (ротор Б-85, JIC -601,4 °С).

б

Для выявления уровня противовирусных антител в сыворотках крови инфицированных мышей, типирования вирусов, наделенных в различные сроки инфекции,.использовали реакцию торможения гемаг-глютинации (FITA), РГГА ставили по общепринятой методике.

Разграничение антител по классам иммуноглобулинов проводили по методу Хаэенсона (Хазенсон П.Б. и сотр.., 1969) с обработкой сывороток ыаркамииом и постановкой РТГА до и после обработки.

Изучение температурочувствительности непродукции наделенных вирусов осуществляли, используя метод титрования инфекционной активности в 10-ти дневных КЭ при двух температурах: перыиссив-ной (34 °С) и непермиссивной (40 °С).

Определение "термостабильности" гемагглютинина проводили после прогревания аллантоиснкх препаратов исходных и персистирую-щих вирусов в водяной боне при температуре 56 °С в течение 10,20 и 30 мин.б РТА по остаточной гемагглютинирующей активности.

Определение ингибиторочувствительности исходных и персисти-рующих вирусов проводили в реакции торможения гемагглютинации с набором нативных и прогретых сывороток лабораторных жиеотных, используя 4АЕ вируса, I Й взвесь эритроцитов.

Для электрофореза вирионных белков аллантоисный вирус очищали и концентрировали градиентным центрифугированием в соответствии с методикой Tobitn.XilbCTtrne (1975).

Электрофорез вирусных полипептадов в 7,5 или 10 % полиакри-ламидном геле проводили по методу Laemraii (1970) в присутствии додецилсульфата натрия и мочевины с последующей окраской Яумасси R - 250. При анализе вирусиндуцироБэнных полипептидов в клетках ЦДСК электрофорезу подвергали лкзаты инфицированных клеток, при культивировании которых через 4 часа после инфекции в поддерживающую среду еносили смесь меченых аминокислот

С-ала, С-лпй, С-вал) из расчета I нБк/млн.клеток. После ЭФ гель высушивали и экспонировали с рентгеновской пленкой PM-I.

Для сравнительного анализа структуру геномов исходных и пер-систирущих вирусов использовали метод ГШ-РНК гибридизации с последующим анализом дгуцепочечннх гибридов методом электрофореза в ПААГ (Ноу и др., 1977), вРНК Еирусов гриппа выделяли из сконцентрированных и очищенных препаратов вируса . sos - фонольньм методом ( Schervpr , 19СР.). Концентрация очищенных б ГШ сос-тагляло но менее I мг/мл.

Для молекулярной гибридизации нуклеиношх кислот использовали плазмиды рВН 322 с встроенными ДНК - копиями генов вируса гриппа А/Яенингра,ц/385/80/й , полученные в лаборатории экспериментальной вирусологии ЛенНШВС и зонды, любезно представленные нам Н.А.Петровым (НИИ молекулярной биологии г.Новосибирск), полученные на основе вируса гриппа А/Киев/59/79/н , и А/Рн /8/ 34. Есе зоццы были получены клонированием в плазыиду рВ1?/з22 о/ С коннекторным методом по Рв-ь I сайту с инактивацией маркера устойчивости к ампициллину. Еведенение метки (^Р) проводили в реакции ник-трансляции (Маниатис, 1984). Предгибрилизацию и гибридизацию иммобилизованных на фильтрах НШ с мечеными зондами проводили в 50 %~нои формамиде при 40-42 °С в течение 2 суток, после чего фильтры отмывали от избытка меткл и авторадиографировали на рентгеновской пленке РМ-1 с экраном ЗУИ-1 при -25 °С до 72 часов.

Определение средней арифметической выборки, ее ошибки и достоверности различий мевду средними двух выборок по критерию Стыэдента изложено в пособии И.П.Ашмарина и др. Разницу между двумя средними считали достоверной при значении Р/ 0,05.

Моделирование персистентной инфекции на мытах с использованием различных вариантов вируса гриппа. Изучение влияния цикло-фосфана на характер течения инфекции.

Представленная часть работы состоит из трех разделов.

На первом этапе была сделана попытка изучить возможности моделирования гриппозной инфекции на мышах с помощью дцух вариантов неадаптированного к животным вируса гриппа А/Ейктория/35/72 (НЗ и2) без иммунодепрессантов; на втором и третьем этапах проводили опыты по моделированию персистентной инфекции на мышах с использованием того же вируса гриппа А/Еиктория/35/72 при периодическом или постоянном введении животным иммунодепрессанта. Была изучена интенсивность репродукции менее патогенного (I варианта) вируса гриппа в легких мышей в зависимости от первоначально внесенной дозы вируса. При этом была выявлена отчетливая корреляция меящу заражающей дозой и величиной инфекционного титра вируса в. легких мышей. Так, через I день после инфицирования максимальной дозой инфекционный титр вируса в легких оказался на 3,0 1гЭОД/0,2 мл выше, чем при использовании минимальной дозы.

Эта закономерность сохраняется и в последующие сроки (4 и 9 дни), хотя абсолютные величины инфекционных титров были соответственно ниже. Независимо от заражающей дозы вируса по мере увеличения срока наблюдения от момента инфицирования инфекционный титр вируса в легких снижался. Было обнаружено, что через 3 суток вирус вццеляется из крови, легких и печени мышей, зараженных обоими вариантами вирусов. Через 5 суток у животных, зараженных апатоген-ным вирусом, он выявляется лишь в легких и печени, в то время, как у мышей, инфицированных патогенным вариантом - в легких, печени, почках и селезенке. К 7 суткам - независимо от варианта -ввделение вируса было возможно лишь в легких.

На втором этапе работы. В данном разделе был использован вирус гриппа А/Виктория/35/72 (НЗн 2) (I вариант), выделенный на 4 день после инфицирования из легких мшей и прошедший после этого 2 пассажа в КЭ. Вирус имел te + - фенотип. Инфекционный титр использованного вируса - 6,0 lg ЭИД 50/0,2 мл титр гемаг-глютининов - I/5I2. Циклофосфан вводили внутрибрюшинно в объеме 0,5 мл в концентрации 50 мг/кг веса животного за 24 часа до заражения вирусом гриппа. Еведение 1Щ повторяли на 7,12 и 21 дни после инфицирования. Контролем служили мыши, зараженные вирусом в той же дозе, но без введения иммунодепрессанта. Опыт был проведен на 400 мышах и продолжался 122 дня.

Ьвделение вируса в первые 16 дней после заражения мышей было возможно при первичном заражении КЭ материалом 10 % суспензии легких. Инфекционный титр вируса на 3-5 сутки достигал высоких показателей - 7,5-7,0 1в ЭЦД/50/0,2 мл, на 7-16 сутки величина инфекционного титра снижалась до 4,0-3,0 lg Э!Щ 50/0,2 мл. С 19 по 42 сутки выделение вируса было возможно на первом "слепом" пассаже. Инфекционный титр вируса при этом составил 2,0-1,0 Э1Щ 50/0,2 мл. Начиная с 69 дня и до конца срока наблюдения (122 день), наделения вируса было возможно только при использовании метода ультрацеитрифугировачия материала, накопленного после третьего "слепого" пассажа, с последующим титрованием полученного осадка на КЭ (табл.1).

В группе мышей, зараженных вирусом гриппа А/Глктори<(/35/72, которым Ц5А не вводился на 20,36 и 70 дни после шф-цироглния га-деление еируса из легких было возможно только при использоегш'и метода ультрацентри^угироганш' оллантоисного материал? П! "слепого" пассажа с последующи.! заражением КЭ.

Таблица I

Наделение вирусов из легких мьшей, зараженных ■ 'вирусом гриппа А/Виктория/35/72 и обработанных циклофосфаном

Сроки после заражения

(дни)3"0

Методы выделения

первичное заражение

КЭ*>

1-й "слепой" пассаж3^

ультрацентрифугирование*)

3 7,5 - -

5 7,0 - —

7 4,0 - —

16 3,0 - -

19 - 1.0 -

21 - 1,0 -

29 - 1.0 -

37 - 1,0 щ

42 - 1,0 -

60 - - 2,0

85 - - 2,0

108 - - 1,0

ИЗ - - 1,0

118 - - 2,0

122 - - 1,0

Глфегсционннй титр вируса при гаделгнии (в ЭПД/50/0,2 мл) ■

1цдоление вируса проводили из пула мотей (5-5 птук).

Всего за 122 дня наблюдения над мышами, зараженными вирусом гриппа А/Виктория/35/72 и обработанных Шк из легких животных было веделено 15 вирусных изолята.

В Ш части данной работы мы попытались оценить возможность развития персистентной инфекции на фоне вторичного иммунодефицита при заражении мышей адаптированным вариантом вируса, обладающим ta - - фенотипом.

Как и в ранее описанных опытах, критерием персистенции являлось наличие инфекционного вируса в легких мшей в поздние сроки после первичного заражения.

Для моделирования персистентной инфекции в этом опыте использовали вирус гриппа А/Виктория/35/72, выделенный на 5-й день после инфицирования из легких мышей. Инфекционный титр использованного вируса равнялся 7,0 lg ЭВД 50/0,2 мл, титр гемагглютини-на I/I28. В данном опыте при моделировании персистентной инфекции циклофосфан вводили по следующей схеме: за 24 часа до инфицирования вирусом гриппа А/Еиктория/35/72 в дозе 50 мг/кг веса животного, затем с 2 до 20 сутки после заражения вирусом - через кавдые 5 дней в той же дозе, и далее - в дозе 25 мг/кг веса животного с интервалом в 10 дней. Контролем служили мши, зараженные вирусом гриппа А/Еиктория/35/72, но необработанные циклофосфаном.

При первичном заражении КЗ вирус гриппа выделялся из материала 10 %-ной легочной суспензии подопытных животных только до б суток от момента инфицирования (табл.2). Инфекционный титр вируса достигал 5,5-5,0 lg ЭИД/50/0,2 мл. Начиная с 9 дня до 44 дня развитие инфекции ввделение вируса было возможно только "на слепых" пассажах. Инфекционный титр вируса при этом составил 1,0-1,5 lg ЭИД/50/0,2 мл. Начиная с 52 дня и до конца срока наблюдения над инфицированными мышами (115 день), ввделение вируса удавалось при использовании метода ультрацентрифугирования материала с последующим заражением КЭ. Всего за 115 дней наблюдения над мылами было выделено 13 вирусных изолятов. Таким образом, te— вариант вируса гриппа А/Виктория/35/72 так же, как и te +, способен вызывать персистентную инфекцию.

Полученные данные свгщетельствуют о том, что введение цикло-фосфана - по разным схемам способствует значительному повыпению

Таблица 2

ЕМделение вирусов из 10 Й-ной суспензии легких мышей, зараженных вирусом гриппа А/Еиктория/35/72 на фоне систематического введения циклофосфана

Дни после ч заражения ллл' Методы выделения

первичное заражение КЭ "слепые" пассажи ультрацентрифугирование

3 5,0 К, _

6 5,5 - -

9 - 1,0 (2-ой) -

20 - 1,0-1,5 (3-й) -

36 - 1,0 (3-й) -

44 52 70 94 115 - 1,0 (3-й) 1,0 1,0 1,0 1,0

Примечание: I. В таблице представлены данные о наделении вирусов В 1г, ЭДД/50/0,2 мл.

2. В скобках указано число "слепнх" пассажей.

3. х) - вирусы, поделенные на П пассаже после

ультрацрнтрифугироБяния.

хх) - вирусы, выделенные на И пассаже после ультрпцентрпфугирояпния.

хтх) - выделение гируса из пула мыл ей (5-6 штук).

вадедяеыости персистирупцих вирусов из органов инфицированных животных, что связано с более выраженной репродукцией вируса в условиях иммунодепрессии. Как было показано в опыте без обработки ыыпей Ц$А, вирус из легких ыышей позднее 70 дня от момента инфицирования вирус обнаружить вообще не удается, в то время, как из органов инфицированных вирусом гриппа мышей, которым вводили иыцунодегтрессант, выделение вирусов было возможно до 122 дня (2-ой опыт) и до 115 дня (3-ий опыт).

Диагностика острой и персистентной инфекции у мышей, зараженных различными вариантами вируса гриппа.

Определение специфических антител в сыворотке крови и, в частности, документация нарастания их титров, является одним из важнейших методов ретроспективной диагностики инфекционных заболеваний, а возможность использования метода дифференцирования иммуноглобулиношх фракций противовирусных антител позволяет уточнить форму инфекции, т.к. наличие Ig М антител является показателем персистенции вирусов в организме (Б.А.Зуев, 1979).

Б связи с этим представлялось важным изучение напряженности и сроков формирования специфического гуморального иммунитета в организме мышей, зараженных вирусом гриппа А/Еиктория/35/72 при острой и персистентной инфекциях.

Анализ показателей нарастания титра антител к главному про-тективному белку вируса гриппа - гемагглютиничу - при персистентной инфекции позволил сделать следующие выводы.

1. Иымунодепрессант ЦФА не вызывает полной блокады синтеза гуморальных антител, а лишь частично ингибирует его, о чем свидетельствует снижение титров антигемагглютининов по сравнению с уровнем антител у животных, которым не вводили ЩА.

2. Относительно шсокий уровень антител к ГА в крови животных не предотвращает развитие персистентной гриппозной инфекции.

•3. Персистентная гриппозная инфекция в организме мшей, независимо от наличия или отсутствия факторов иммунодепрессии, сопровождается длительным присутствием иммуноглобулинов класса М.

Применение ДНК - зондов для диагностических целей является перспективным направлением в технологии рекомбинантных молекул. Достоинством точечной гибридизации по сравнению с традиционными

методами является ее высокая чувствительность, специфичность и сравнительно короткий срок выполнения.

Основная диагностическая процедура при всех видах гриппозной Инфекции (острой и персистентной) - вирусоЕыделение. Однако практическое его осущестгление-^алеко не всегда возможно, поскольку вццелясмость трусов в разные эпидемически? периоды весьма значительно вариирует. Б этой связи рекомендуется использовать точечную гибридизацию с ДНК-овыми зондами для выявления вирусоспеци-фических РНК в носоглоточных смывах - при острой гриппозной инфекции - и гомогенатех органов людей (при постмортпльных исследованиях) или лабораторных животных (при экспериментальных работах).

Нами использованы ДНК-эонды вируса гриппа для обнаружения его генома в легких инфицированных мшей в различные сроки после заражения (от 7 до 230 дней).

Использование ДНК-зондов с гибридизации в Р1ПС различных штаммов вируса гриппа (А/ «та /1/33, Л/ Гп-^ г,е /1975/31, А/Сингапур/1/57, А/Еиктория/35/72, А/Гонконг/1/бО, А/Хабаровск/ 1/79, А/Киев/59/79/Р, Е/СССР) показало; что:

1) зоццы типоспецифичны и не гкбрлдизуются с РНК вируса гриппа типа В в жестких условие;

2) зонды с консервативными генами (Р,Н,РА,РЕ2, гя ) перекрестно достаточно интенсивно гибрндизуются с РНК вирусов гриппа всех использоганных сероподтипов;

3) зонды с генами, кодирующими гемагглптинин и нейраминида-зу, гибрцдизуются вцутри сероподтипа намного эффективнее, чем с РНК другого сероподтипа. Чувствительность метода составляла в среднем 10 пг ГНК на точку.

Для проведения данного раздела исследований были созданы 3 модели персистентной инфекции на минах линии С/57/л1аск и СЗНА.

В первой серии опытов вирусом А/Пикторил/35/72 было заражено 60 пыней линии С/57/ тппск и 60 гп-стей линии СЗНА.

Во второй серии опытов, заражали мышей линии СЗНА следующими гирусанн гриппа: А/ -г /1/33 (Н1 г I), А/!Сиер/59/79/ Н (Н1 п I) и А/&:кторпя/35/72 (ИЗ г 2) по 2Р0 житотннх на квчдий гарус, было показано, что ггрусн с применением комплекса обм'чтнх методических

приемов удавалось ьвделить лишь до 28 дня. Ьсе выделенные изоля-. ты по данным РГГА с набором диагностических сывороток были подобны тем штаммам, которыми проводилось заражение.

Использование ДНК-зондов при гибридизации с РНК, щдеденной из легких инфицированных мышей в различие сроки персистентной инфекции, показало, что на ранних сроках инфекции (7-14-28 дни) после заражения последовательности вируса гриппа выявляются у мышей, инфицированных вирусами А/Ьжтория/ЗЬ/72 и А/1Сие в/59/79/к . У мышей, инфицированных вирусом А/.'.зп /1/33, уже на 7 день после заражения последовательности генома вируса гриппа в легких не определяются.

При собственно персистентной гриппозной инфекции использование в гибридизации отдельных зондов в стандартной концентрации (0,5-1,0 мкг) оказалось неэффективным для увеличения концентрации зоцда использовали их смесь - от 2 до 8 ДНК-зондов - в одной реакции гибридизации. При этом вирус гриппа А/Ьиктория/35/72 обнаруживали при гибридизации со смесью зондов на 230 день после инфицирования.

Полученные денные свидетельстьуют о возможности использования ДНК-зондов для диагностики хронических форм гриппа, у лодей и осложнений, связанных с персистенцией вируса гриппа в организме.

Характеристика вирусов, ввделяемых от мышей при персистентной гриппозной инфекции.

Ранее было показано, что вирусы гриппа, персистироьашие длительное время в клеточных культурах, претерпевают значительные изменения своей структуры и свойств (Медведева, 19%-1990).

Ь этой связи представлялось важным выяснить, каковы свойства вирусов гриппа, ввделеншлс от мышей с персистентной гриппозной инфекцией.

Изучение биологических свойств вирусных изолитов осуществляли по ряду параметров: антигенный профиль гемагглютинина, ингибиторо-чувстьительность, температурочувствительность репродукции, термостабильность ГА, гемадсорбирующвя активность, полипептидный состав вирусов, структура его генома.

Ь работе проводили изучение антигенной структуры гемагглютинина персистирующих вирусов в сравнении с исходным, взятым для моделирования персистенции, по результатом РГГА с набором гиперишун-

ных сывороток. Было получено, что гемагглготинин выделенных персистирующих вирусов относится к сероподтипу ИЗ, при постановке РТГА выяснилось, что антигенный профиль некоторых персистирующих вирусов . близок, но не идентичен гемагглютинкну вируса АДиктория/35/72, взятому для моделирования персистенции, однако, в целом наделенные вирусы были подобны вирусу А/1лктория/35/72 (НЗ v 2).

Основой дефекта, обуславливающего неспособность ta" -мутанта к размножению при непермиссивной температуре, является особенность структуры его белка (Арон, i960; Медведева, IS65).

При исследовании температурочувствительности репродукции персистирующих вирусов в опыте с четырехкратны:.! введением циклофосфа-на было показано, что на ранних сроках (до 19 дня) в популяции происходит селекция ta" -мутантов, далее по мере наблюдения над мышами после 29 дня течения инфекции репродукционная способность выделенных изолятов восстанавливается. Ь опыте с систематическим введением циклофосфана, где в качестве исходного был взят вирус, тлеющий ts -фенотип, было показано, что выделенные изоляты довольно быстро (к 9 дню) теряют исходный признак и уже к 21 дню выдел енные вирусы еноеь приобретают способность к размножению при непермиссивной температуре. Клональный анализ популяций исходных вирусов и некоторых персистирующих изолятов позволил выявить отсутствие на поздних сроках ts" -мутантов в опытах как с систематическим, так и периодическим применением циклофосфана.

Изучение ингибиторочувствительности персистирующих вирусов в сравнении с аналогичным свойством исходного вируса показало, что ейрусы по мере перс йотирования приобретоли резистентность к ингибиторам ряда сывороток, и, в частности, сыворотки мили, вирусы, вцце-ленные на поздних сроках (115 и 122 дни) были полностью резистентны к ингибиторам сывороток организма-хозяина.

Ь разделе молекулярно-биологического анализа персистирующих вирусов было проведено сравнительное изучение генома наделенных изолятов, а также состава вирионных и вирусивдуцированкых белков. Было установлено, что при заражении клеток ¡ДОС исходным вирусом и вирусами, ввделенннми на 5, 6, 115 и 122 дни из легких инфицированных мышей происходит синтез всех основных вирусспецифических поли-иептидов. При сравнении вирионных бглков указанных вирусов выявляются некоторые изменения б подвижности белков полимерезы, а также большой цепи ГЛ (IIAI), подвижность которой уменьшается у вирусов L5, ПИЬ и ПП22.

При изучении особенностей мутационных изменений генома вирусов L5 и ПИ22 ь сравнении с исходным А/1.иктория/35/72 были обнаружены следующие особенности. L использованных услоьига разделения дц РНК обнаружены отличия генома I1LI22 от генома l5 и исходного вируса в генах 1,2,4 и незначительные в гене 7, что соответствует белкам PI2, PLI, НА и М. Таким образом, было показано, что в геноме персистирущих Еирусоь к 122 дню прог.сходит накопление мутационных изменений, что проявляется ь изменении сеойсть вирусоь.

L заключение необходимо отметить, что изучение хода гриппозной инфекции в условиях подавления и.'.'мунореактиьности организма имеет большое значение, поскольку ыедение людям иммунодепрессантов, необходимое по разным показаниям при лечении других заболеваний, может вызывать активацию вирусных и бактериальных инфекций, при этом такое заболевание, как грипп, которое, казалось бы не несет большой опасности для жизни людей ь условиях имиунодепрессии может стать заболеванием, угрожающим их жизни.

■ В U В о д ы

1. Различные штаммы вируса гриппи в разной степени способны вызывать не только острую, но и персистснтную инфекции со сроком пребывания возбудителя ь организме до 7U дней.

2. Иммунодепресант циклофосфан П[>и разных способах Еьедения ь организм инфицированных мышей способствует продлению сроков пребывания вируса гриппа в организме и более позднему ейрусовыделению (до ПЬ-120 дня после первичного инфицироЕшшг). 1ццеление вирусов гриппа от пе^систентно инфицированных мышей требует проведения комплексе специальных лабораторных методов.

3. При сочетанном воздействии на организм мышей вируса гриппа и циклофосфана с 5 по 9 день после инфицирования синтезируются иммуноглобулины класса М, с 9 по 70 день - & и Ï.1, после 70 дня -только М.

4. Молекулярная гибридизация типа ДНК-РНК с помощью рекомби-нантной ДНК с клонированными генами вируса гриппа позволяет выявлять FHK вируса гриппа в легких мышей в сроки, сущестЕенно превышающие таковые с помощью любых способов вирусовццеления (до 230 дня).

5. Вирусы, выделенные в поздние сроки развитие персистентной гриппозной инфекции у мышей, характеризуются многообразными отличиями се?их биологических свойств, полипептидного состава и структуры генома от вирусов, взятых для моделирования персистенции.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

X. Ьикторова Л.М., Прозорова И.Н., Арон P.A., Медведева М.Н. "Лабораторная характеристика вирусов гриппа, ввделенных от мшей при экспериментальной гриппозной инфекции" //Молекулярная биология и генетика вирусов гриппа, 1983, С,145-153.

2. Ьикторова Л.Ii., Медведева М.Н. "Экспериментальная гриппозная инфекция мышей на фоне иммунодепрессии, вызванной цинлофосфа-ном" //Иммунологические исследования в клинике и эксперименте".-1983. - С.90-93.

3. Ьикторова Л.Ы.- "Характеристика вирусов гриппа, наделенных от мышей при персистентной инфекции" //Современные проблемы медицинской вирусологии. Тез.докл.конф.молодых ученых. - Рига, 1987. -С.И.

4. Ьикторова Л.Ы., Медведева 1,1. Н., Юхнова Л.Г., Симановская Б.К., Голубев Д.Б. "Биологические свойства и молекулярная структура вариантов вируса гриппа, ьвделенных из организма мышей в процессе, персистентной инфекции" //Микробиол.журнал - 1988. - С.63-69.

5. Ьикторова Л.LI., Арон P.A., Кузнецов O.K. "Использование гибридизационных зондов для выявления последовательностей вируса гриппа при персистентной инфекции" //Актуальные проблемы прикладной иммунологии, биотехнологии и производства бактерийных препаратов. Тез.докл.научн.конф. Пермь. - 1983, С.192-194.

6. Кузнецов O.K., Арон P.A., Мигунова Б.Ь., Ьикторова Л.М. "Применение ДНН-зовдов в диагностике инфекционных заболеваний" // Проблемы медицинской иммунобиотехнологии. Тез.докл. - 1990, C.II-I3.

7. Голубев Д.Б., Арон P.A., Ьикторова Л.М. "Использование молекулярных ДНК-содержащих зондов при изучении гриппозной инфекции". //Пробл.мед.иммунобиотехнологии. Тез.докл. Л.1990. С.27-29.

7ил ßt'uvhs у)* jTi ¡up ¡ее. uftj <¡¿1.