Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Персистенция белков вируса гриппа А - характерная черта экспериментальной инфекции

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Персистенция белков вируса гриппа А - характерная черта экспериментальной инфекции"

: 1 3 ОД 2 5 ЛПР Ш4

российская академия медицинских наук

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИИ ИНСТИТУТ

экспериментальной медицины

1

На правах рукописи

ИВАНОВА Инна Андреевна ПЕРСИСТЕШИЯ БЕЛКОВ ВИРУСА ГРИППА А - ХАРАКТЕРНАЯ ЧЕРТА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ИНФЕКЦИИ

03.00.06. - Вирусология

АВТОРЕФЕРАТ диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1774

. Работа выполнена в Научно-исследовательском институте экспериментальной медицины РАМН

Научный оукосодительг

кандидат ¿иологических наук Г.Я.Дубровина

3,

Научный консультанта доктоо биологических наук. поофессоо Р. Я. По л як

Официальные оппоненты: доктоо медииинских наук* А , А » Соминина кандидат биологических наук. Н.И.Чубаоова

й'

Ведущее учреждение — Институт эпидемиологии и микробиологии им. Гамалея РАМН .»

Зашита диссертации состоится "• \.. " 1994 г.

часов на заседании специализированного совета А.001.23.02. в Научно-исследовательском институте экспериментальной меаииины РАМН (197376, Санкт-Петербург, ул, акаа, И. П. Павлова, 12).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ экспериментальной медицины РАЖ

Автореферат разослан

1994 г.

Ученый секретарь .специализированного совета доктор медицинских наук

/1. А.Бурова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА -РАБОТЫ

Актуально^?»» га^рты^ Широко известно, что 'mгпчля инфекция сопровождается развитием множестаа осложнений, сгаидьт.:-'-таукнцих с возможном длительном присутствии е»фусных структур о организме хозяина. На это косвенно указывали данные о ссэпалении зон поражения органов и тканей и редкие находки вируса или его компонентов в отдаленные» сроки после перенесенной инфекции [ДубрсБина Т.Я. и др., 1968-1991? Witzleb W. » 1976? Козелеикая K.M., Дубровина Т.Я., 1977; Bronecn I.M., 1979? Анджапаридзе О .Г.* 19в4; Kilbourn E.D., 19Q73. Эти данные обобщены а pv-д^ £абот CAda, 1986; Дубровина Т.Я., 19S7: Леонтьеве Г.Ф.» 19S7 Ц»'м;'£рлинг А.В», 19S7; Kilbourn, 19В7; Зуев В.А. , 198В и ДрО% Всгг.зс о возможности персистениии генома вируса гриппа и его полииептиАча in vivo и роли этого процесса в патогенезе оставался открытым. Требовалось получить прямые доказательства присутствия вирусных компонентов как на острой стадии заболевания, так и на <зтда/?энных сроках после перенесенного гриппа в клетках очага инфекции и, особенно, вне него а маловосприимчизых тканях. Основанием для такого поиска служили данные витральных исследований о широком тропизме вируса гриппа к клеткам млекопитающих, о распространенности абортивных форм репродукции и склонности вируса гриппа к персистениии а условиях культуры тканей CLaraya-Cuasay L.ft., 1977* Ebisava I.Т., 1969? Edelen I,S.,1974; Дубровина Т.Я«, Иеоытьеаа Г.Ф., 1904$ Цинзерлинг А,В., 1987? Zamko-ff К. ,1979 и. мн. др. 3.

Впервые в условиях in vivo длительное присутствие антигенов s ируса гриппа было показано Леонтьев ой Г. Ф. и Дубровиной Т. Я. С1984]. Был предложен способ иммунохммического поиска вирусных антигенов и доказано их наличие даже о маловосприимчивых для вируса гриппа тканях. Однако трудоемкость предложенной модификации не позволила провести серийные исследования этого показателя в различных тканях & динамике гриппозной инфекции.

Цель и задачи работы. Основной цель» являлось создание экспериментальной базы для исследования динамики антигенов вируса гриппа в тканях in vivo и обоснования их рели в патогенезе инфекцмоммого процесса.

Выли поставлены следующие задачи!

1« Разработать высокочувствительный метод тестирования

вирусных антигенов в тканях зараженного животного.

2. Сопоставить динамику антигенов вируса в очаге поражения и .экстрареспираторных тканях при экспериментальном гриппе разной тяжести.

3. Провести анализ репертуара полипептидов вируса и их внутриклеточного распределения в легких и селезенке на разных стадиях экспериментального гриппа.

4. Раскрыть возможную роль присутствия антигенов вируса гриппа в тканях в патогенезе острой инфекции путем» сопоставления динамики содержания антигенов, тяжести заболевания и выраженности реакций цитотокеического лизиса; сравнения динамики содержания антигенов вируса при' моно- или смешанной вирус-бактериальной инфекции; анализа содержания пслипептидов вируса в тканях после применения эффективных антивирусных средств метаболической коррекции.

ручная новизна. В процессе модификации методов тестирования белков вируса гриппа, на основе иммуносвязывания в дотах и иммуноблоттинга, создан высокочувствительный, хорошо

воспроизводимый и доступный способ выявления небольших количеств вирусных антигенов (до 1 пкг) в различных тканях зараженных

животных. Впервые, с использованием предложенной модификации, доказано длительное (до 1.9 . месяцев) присутствие вирусных полипептидов в тканях перенесших, гриппозную инфекции животных, что свидетельствовало о формировании персистентной формы процесса. Персистениия вируса выявлена во всех случаях, независимо of патогенности конкретного возбудителя и тяжести развивающегося процесса.

Динамика количественного содержания, репертуар и внутриклеточное распределение полипептидов- вируса гриппа определялось тяжесть» инфекции и репродуктивносты» системы вирус-клетка. Так, в острый период продуктивной инфекции в легких (первые 5 дней) отчетливо выявляли белки пелимеравного комплекса, гямагглютинин I, неразрезанный гемагг/жтинин и нуклеопротеин. Формирование абортивной репродукции в легких на второй неделе инфекции зависело от дозы заражения и сопровождалось увеличением относительной концентрации неразрезанного гемагглютинина. Абортивная репродукция в малочувствительной ткани селезенки уже с 1 дня инфекции характеризовалась более высоким содержанием вирусных гтолимераз.

/

В астру» фазу инфекции вирусные антигены вываляли и в цитоплазме и не мембране в продактмзноЛ тканевой спгтрмя? (легкие). Фаза Формирования персистентньй инфекции в легких есГ'",к.--\-задалась резким снижением количества антигенов вируса и стсутстЕп*??м , их представительства на поверхности клеток, что, по-видимому, о 6 у с г. а в л и в а л с ускользание последних от ик.мунного надзора.

Впервые установлена фааность уровня содержания антигенов вируса гриппа как в очаге инфекции, так и а зкстрареспираторных тканях. Выявленная цикличность не зависела с-т свойств возбудителя,, тяжести инфекционного процесса и продуктизнссти тканевой системы. Колебания в уровне представительства антигерой опроса хорошо коррелировали с цикличностью выраженности реакций ниточоксического лизиса. Это свидетельствовало о -том, что вируеспеци.ти'ч'ская модификация поверхности клеток играет ведущую рг.;."ь> я индукции цитотоксичности и, следовательно, в патогенезе инфекции.

При сопоставлении изменений в уровне представительства антигенов вируса гриппа и активности натуральных киллеров в легких мышей при смешанной вируе-бектериальной инфекции

(грипп+стрептококк) по сравнения с гриппозной моноинфекцией выявлена корреляция, подтверждающая связь между' динамикой вирусных антигенов и наличием клеток—мишеней в органе.

Патогенетическая роль содержания вирусных белков в тканях хозяина подтверждена также и результатами приоритетных исследований о резком изменении их динамики на фоне действия эффективной противогриппозной терапии. Введение препаратов, регулирующих метаболический гомеостаэ, защищало мышей от гибели. При этом непосредственно после введения ингибитора протеолиза, амтисксиданта или других корректоров метаболизма возрастало содержание антигена в клетках и, как следствие, заметно усиливалась результативность цитатоксического лизиса.

Теоретическое значение работы состоит в раскрытии некоторых молекулярных механизмов патогенеза гриппозной инфекции, связанных с выявлением новой закономерности перехода острой инфекции в персистирумиу», цикличности накопления антигена и весомого вклада абортивных Форм процесса в легких и зкстрареспираторных тканях.

Практическая значимость работы. Работа носит преимущественно теоретический характер. Ее прикладной аспект связан с обоснованием целесообразности применения разработанных модификаций методов

выявления вирусных антигенов в тканях зараженного гриппом животного для расшифровки некоторых механизмов патологического проиесса.

Основные положения выносимые на защиту!

1« Для выявления полипептидов вируса гриппа и их репертуара в тканях заражЛчмого животного адаптированы методы иммун'освязывания в до так и иммуноблоттинга.

2. Экспериментальная гриппозная инфекция у мышей сопровождается широким представительством антигенов вируса, обнаруживаемых в самых различных тканях макроорганизма■ и завершается персистенцией антигенов вируса, по крайней мере, в легких и селезенке.

3. В динамике инфекции происходит изменение количества и качественного состава белков вируса гриппа в тканях.

4. Динамика антигенов вируса гриппа в легких и экстрареспираторных тканях в острый период заболевания зависит от патогенноети штамма, заражающей дозы вируса и всегда носит циклический характер.

5. Перераспределение вирусных антигенов между субклеточными Фракциями и отсутствие вирусспецифической маркировки мембран клеток легких на отдаленных сраках инфекции способствует ускользанию зараженных клеток от иммунного надзора.

6. Присутствие вирусных белков в тканях зараженного животного и их динамика в процессе инфекции является одним из ключевых Факторов патогенеза гриппа. ,

йпрр$«цип диссестаинрнногд материал».

• Материалы диссертации доложены .на Конференции молодых ученых по вирусологии (Рига, 1907), на Международном симпозиуме "Стратегия паразита в организме хозяина" (Ленинград, 1907), на Всесоюзном симпозиуме "Новые подходы к химиотерапии вирусных инфекций" (Рига, 1989), на Международном рабочем совещании "Математическое г'оаелироявние в иммунологии и медицине" (Киев, 1989), на заседаниях Санкт-Петербургского научного общества иммунологов и микробиологов с 1909-1992 гг, на XII Международном симпозиуме "Стрептококки и стрептококковые заболевания" (Санкт-Петербург, 1993 г).

ПуЗлчкашм

По материалам диссертации опубликовано 8 статей и 6 тезисов Международных и Всесоюзных конференций.

s

psygw ,и структуру, рафртьь

Диссертация изложена на страницах машинописного текста и

состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, главы, посвященной материалам и методам исследования, и 5 глав -результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и указателя литературы.

Работа иллюстрирована 23 рисунками и 6 таблицами. Список литературы включает 216 работ, ив них 73 отечественных и 143 иностранных источников•

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛ! И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Использовали штаммы вируса гриппа A/PR/8/34 (H1N1) (вирулентный) и A/PR/B/59/1 («вирулентный штамм, любезно предоставленный сотрудниками отдела вирусологии им. А.А.Смородинцева ИЭМ РАМН), накапливаемые в развив»»щихся куриных эмбрионах.

Эксперименты выполнены на мышах-самцах Fl (СВАхС37 Black), массой 16-18 г.

Прямой антивирусной конъюгат кроличьих антивирусных IgS и пероксидааы хрена <ПХ) получали по Farr A.G., Nakana P.K. С 1^813.

В качестве стандарта для методов иммуносвлаыванил в дотах и иммуноблотинга использовали препарат вируса гриппа A/PR/e/34, концентрированный и очищенный центрифугированием в градиенте сахарозы.

Гомогенаты ткани легких и мояга животных получали растирая с песком органы,замороженные при -20"С. Гомогенаты ткани селезенки и тимуса получали разрушая клетки в механическом гомогенизаторе "стекло-тефлон".

Концентрацию белка в гомогенатах ивмеряли методом Lowry [1931].

Экспериментальную гриппозную инфекцию моделировали

интранавальным заражением мышей под легким эфирным наркозом вирусом A/PR/8/34 в вазах от 1,3 до 3,3 Ig ЭИДвс. и вирусом A/PR/8/S9/1 в доэе 7,0 1о ЭИвм». Гибель мышей учитывали а течение »14 дней в группах, состоящих и= 20 животных.

Все исследования проводили в остром периоде инфекции (до 14

дня сключительно) и на отдаленных сроках (21, 28, 37 сутки). Инфекционную активность вируса гриппа о обследуемых органах определяли общепринятым методом титрования вируссад^ржащего матеои«л/кх на развивающихся куриных эмбрионах.

И»»/, прение активности натуральных киллеров и цитотоксических лимфоцитов в селезенке в процессе гриппозной инфекции провопила Н.К.Шидлавская СШидловская И.К. и др., 1987, 1989].

Определение количества антигенов вируса гриппа в различных тканях проводили методом иммуносвязыеания в дотах СТомЫп » 19841 в нашей модификации (подробнее см. раедел "Результаты собственных исследований") СИванова И.А. и ар.» 19893. Для определния количества вирусных белкоо а тканях. после выполнения иммунохимическоГ. части, нитроцаллюлозные фильтры (1~КВ) подвергали сканированию на лазерном денситометре '*и11гозсап ХЦ" (1.КВ) . Количественное содержание вирусных белков определяли по площади пика оптического поглощения в ед*П.Ш.О.П. (0-4). Качественный анализ вирусных полипептидоа проводили методом иммуноблотинга С'ГонЫп, 19843 в нашей модификации СИванова И.А. и др.> 1989],

Математическую обработку полученных результатов осуществляли стандартным методом СЗажнгаев Л.В. и др.» 19703«

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНА

Задачей первого этапа работы являлся выбор адекватных методов поиска антигенов вируса . в тканях 'зараженного животного, стандартизация и модификаций избранных подходов, применительно к исследованию полипептидов вируса гриппа in vivo.

Методо должны были удовлетворять ряду требований» высокой чувствительностью и специфичностью,* воспроизводимостью результатов, достаточно простым исполнением и возможностью количественной оценки содержания вирусных полипептидов»

Мы остановили свой выбор на методах иммуносвяэывания в дотах (ИД) и иммуноблотинга (ИБ)%

Ряд стадий метода ИД [Towbin, 19840 был модифицированí — показано преимущество использования слабых детергентов -дезоксихолата Na и нонидета Р-40 в качестве растворителей для мягкой лидирующей обработки;

- в качестве блокирующего раствора использовали обезжиренное 10 У. молоко tStanley, 19853)

- при использовании прямого конългата антивирусных 1дВ с ПХ выявили преимущество одноступенчатого выявления вирусных антигенов.

Были отработаны условия применения метода ИД для выявления вирусных белков в тканях зараженных животных. Предложенная модификация позволяла выявить до 1 пкг вирусных белков в препарате концентрированного очищенного вируса и обеспечивала минимальный уровень нэспецифического окрашивания дотов в контроле (гомогенат ткани интактных животных).

В нашей модификации метода ИД была определена зависимость между площадью пика оптического поглощения и количеством вирусных белков в доте с помощью препарата с. известной концентрацией

вирусных белков (концентрированный очищенный вирус).

' '

7.0 4,0 а В

2,1

1 г у г I,'* <41} «¡г* Л,24" <42/

Л л

г

г-

м

Рис.1 Выявление антигенов вируса гриппа методом ИД в тканях легких (а) и селезенки (б) инфицированных мышей

Условные обозначения: по оси абсцисс - дни поело заражения, по оси ординат - денситометрическое поглощение (ед. П.Ш.О.П.), цифрами сверху указан титр инфекционного вируса в ЭИД»«>.

На рис.1 представлены примеры выявления антигенов еируса гриппа в тканях легких и селезенки мышей в динамике инфекции вызванной вирусом А/Р1*/В/34 в дозе 6,0 1д ЭИД к.с Сенситограммы свидетельствуют о высокой воспроизводимости и чувствительности

е

нашей модификации иг года ИД,

Первые три стадии ИБ проводили стандартно по методам 1_ве.т!Г,т1у [¿9743 и Тс^Ып С1981Э. Иммунохимическую обработку осуществляли аналогично методу ИД, ееодя нонидет Р—40 в блокирующий раствор в концентрации 0,05%, что необходимо для ренатурации белков CPet.it X., 19343.

ИД,

гм

30

(о

то за

1Я

га го м

Рис.2 Быяаленис отдельные вирусных полипептидов методом ИБ в вирусе или ткани легкого (а) и селезенки (б) мышей, инфицированных вирусам гриппа

Условные обозначения! 1 - препарат концентрированного очищенного вируса, 2 - гомогенат ткани инфицированных животных, 3 - гомогенат ткани интактных животных, по оси абсцисс - мм, по оси ординат - денситометрическое поглощение (ед. П.Ш.О.П.); НАонеразрезанный гемагглютинин, НА* - первая субъединица гемагглютинина, НАи — вторая субъединица гемагглютинина, ЫР - нуклеопротеин

На рис.2 приведено сопоставление денситограмм блотоэ

препарата вируса или тканей инфицированных животных (эаражаммщая доза 6,0 ЙИДЛС> А/РЯ/а/34). В гомогенате легких на 3 сутки от начала инфекции зарегистрированы вирусные белки ЫР и НА* В гомогенате селезенки на,14 сутки от начала инфекции регистрировали НА 1 и НА.., при отсутствии инфекционного вируса.

Предложенные модификации методов ИД и № адекватны для выявления антигенов вируса гриппа а тканях зараженных животных и их

• ■ \

качественные характеристики повволяют оценить динамику присутствия ' вирусных белков при инфекции.

Сопоставлении атмии_енхисяшза_ВИРУС а_пвигша_В , ОЧ«Г«

поражения. /гегких. нив«^ при акпгрин«нтйя»нри пжгтравной.тдайсяц

На модели экспериментального гриппа равной тяжести прослежена динамика вирусных белков в основном очаге инфекции,как а острый период заболевания,так и на отдаленных сроках. ,

При заражении животных патогенным штаммом А/РЯ/в/34 в доае(4,0 1<3 ЭИЯ*.о> воспроизводили лет в льну» инфекцию <807. уровень гибели), при использовании дозы вируса 4,0 1ч ЭИД,.> - сублетальную форму (уровень гибели О — более низкие доеы вызывали бессимптомную

инфекции.

Сравнительный анализ динамики инфекционного вируса и антигенов позволил выявить ряд закономерностей (рис.3)I

- выделение инфекционного вируса заканчивалось в пределах первых 10 дней, между тем антигены вируса гриппа выявляли э легких на лмбрх сроках исследования, вплоть во 37 дня (срок наблюдения);

- в острую фазу инфекции, обнаружена четкая дововависимость содержания инфекционного вируса и его антигенов 1 ."'..-..

- установлен циклический характер содержания антигенов вируса гриппа|

- возрастание содержания вирусных антигенов: в легких при ■ снижении уровня инфекционного вируса. О сутки при летальной и 9 сутки при сублетальной формах инфекции) свидетельствуют о преобладании 4 абортивных процессов | динамика накопления инфекционного вируса носила стандартный характер и не коррелировала с содержанием антигена » тканях легких....

Полученные данные были подтверждены при бессимптомной форме гриппа, моделируемой заражением, мышей вирусом гриппа А/Р(*/8/34 в дозах 2.5 и 1,3 1д ЭИАао или «вирулентным. для мышей ^-мутантом А/РГ?/8/59/1 в дозе 7,0 1д ЭИДво.

Использование - предложенного на^и / принципа определения антигенов вируса гриппа в ткани легкого мышей позволило сделать ряд заключений! уровень содержания -антигена носит дозозависимый и циклический характер» персистенция вирусных белков в легких в течение 1-2 Месяцев неотъемлемое свойство экспериментального гриппа, а абортивные процессы в очаге инфекции начинает преобладать при высокой заражающей дозе уж® в остром периоде инфекции.

/

о- 6

Рис.3. Репродукция вирус« гриппе (а) и динамика содержания вирусных антигенов (б) в легочной ткани мышей при моделировании различных Форм инфекции

Условные обозначения! по оси абсцисс - время поел« заражения (сутки), по оси ординат - количество антигена (площадь пика двнеи-тоиетрического поглощения . (ед. П.Ш.0.П.*мма*10а)) (А). Стрелками обозначена доаа ааражения (1д ЭИДм-) указанным штаммом вируса.

Выявление антигенов вируса и их динамика в акстрараспираторных

гкзнпх пт»-, .гкепвриггентлльнри грилпь

Ссвсжулность данных о постгриппозных нарушениях в экстрарес-пираторнюс тканях явилась основой для постановки вопроса о возникновении ряда патологических состояний [Поляк Р.Я. и др., 1986» Поляк Р.Я., Дубровина Т.Я.,19873. Было высказано предположение о

проникновении вируса в ткани, отдаленные от очаге гриппозной инфекции, и появлении в них вирусмодифицированных клеток, поддерживающих абортивную вирусную репродукцию и являющихся объектом' действия защитных реакций организм« и формирования аутоиммунных ' процессов [Поляк Р.Я. и др., 1986; СШазМ Р. а1., 15932.

Обследовали различные ткани (рис. 4), общим.свойством которых являлась их неспособность поддерживать продуктивную форму репродукции вируса гриппа - органы иммунной системы (селезенка и тимус) и моэг, защищенный от контактов с чужеродными антигенами гематоэнцефалическим барьером. Содержание вирусных антигенов в клетках иммунной системы изучено при летальной, сублетальной и бессимптомной Форме гриппа, в мозгу лишь при летальной Форме.

Вирусологическое обследование гомогенатов органов показало лишь кратковременное присутствие инфекционного вируса в селезенке мышей при высоких заражающих дозах вируса А/РЯ/0/34. При заражении мышей апатогенным вариантом вируса й/РЙ/В/39/1 инфекционная активность в селезенке, тимусе и мозге не была выявлена. Наличие вирусных белков в тимусе и селезенке регистрировали на всех изученных сроках.

В селезенке, как и в легких, установлено длительное присутствие вирусных антигенов, вне зависимости «т дозы заражения вирусом гриппа А/РК/8/34, что, является характерной чертой гриппозной инфекции. Динамика содержания антигенов также носила циклический VI дозозависимый характер. " При заражении мышей вариантом вируса А/РР/8/59/1 в гомогенате селезенки антигены регистрировали только на 2 сутки от начала заболевания.

При моделировании летального гриппа•исследовали ткань мозга в остром периоде заболевания. Хотя инфекционной активности в мозгу животных не зарегистрировали, белки вируса гриппа обнаружили на 1 и 2 сутки у всех животных, что, по-видимому, свидетельствовало о проникновении вируса гриппа в мозг,. его переживании том или развитии абортивной Формы репродукции.

Применение предложенной нами модификации иммунохимического тестирования антигенов вируса" гриппа в тканях, позволило документировать присутствие антигенов вируса грип-па А/РЯ/8/34 не? только в органе-мишени, но и за его пределами в клетках иммунной системы и мозга. Выявление антигенов виоуса гриппа и о ачдгк инфекции, и з зкстрареспираторнык тканях на отдаленную сро-г- -

после «сражения, на стадии "клинического* вывдоровления свидетельствовало о (алм глубокой и длительном процессе ваболевания, чем это считалось до сих пор. Пврсиствниия вирусных антиовнов в тканях оргвнивма при отсутствии активного накопления ин«екиионног% вируса свидетельствует о длительном сохранении клеток, поддерживавших авортивну» форму инфекции,

Рис.4 Динамика выявления антигенов вируса грипп* в тимусе (а) и в селезенке <б) -при экспериментальной инфекции разной тяжести • Условные.обозначения! как на рис. 3.

хмикттаистиц_ihihtimix причин жшммигя присутствия

штг пюш. JHPvea гвтгт ш ввгшти у о» ими«

Исследован репертуар сиитевированных de novo полипептидов вируса и динамика их внутриклеточной локализации на равных этапах инфекционного процесса в легких и селевенке вараженных мышей. Изучение качественного состава вирусных полипегугивое осуществляли методом ИБ на сроках их максимального выявления а органах при летальной и сублетальной Формах инфекции, в остром периоде обследовали обе ткани, а на отдаленных сроках только легкие.

В ткани легких обнаружено снищгми* «бсолтирго количества всех белков вируса гриппа на сроках, когда .иифекиионнуи активность в легких уже не выявляли. Выявлено наличие NP, НАо и НА а., уровень ко-1торых равличен при равных варажаюших довах вируса. Соотношения между отдельными полипептидами меняется е процессе инеекции. Форми-роеаиие персистентной еормы репродукции сопровождается увеличением количества НАо по отношении к общему содержании гемагглютинина.

Также как в очаге инфекции, в гомогенате еелееенки выявлены •се антигены вируса гриппа. Отличие состояло е том, что при обоих варажампих дожах в ткани селееенки наблмдали большее количества белков полимеравного комплекса.

Наши эксперименты не выявили отклонений в молекулярном весе и антигенной ' специфичности белков вирусе гриппа, длительно присутствующих . в тканях. Поэтому еакономериым этапом. работы являлось исследование внутриклеточной локаливации и, в первую очередь, изменения их экспрессии иа клеточной мембране. Для такого анализа испольвоаали • летальну» форму грипгюеной инфекции.

Гомогеиаты ткани легких Фракционировали в линейном градиенте Сахаровы' 20-60 % при 100000 в в течение 1Вч. Было обнаружено три белковых ераю*»1 - легкая, мембранная и тяжелая <рис.3).

На 3 сутки, когда в клетках легких регистрировали максимальное содержание вируса и его антигена', последний равномерно распределялся между всеми субклеточными Фракциями. К 6 суткам, на фоне снижения инфекционной активности в ткани, наблюдали увеличение количества вирусных белков, сеяваниых с мембранной Фракцией. На 2S сутки после варажения инфекционный вирус и легких не обнаруживали, а антиген в достоверных количествах регистрировали только е тяжелой Фракции. Реаультат ивучеиия внутриклеточной локалиаации антигенов при гриппе свидетельтвует о перераспределении вирусных белков между

РисХарактеристика изменений внутриклеточного распределения вирусных антигенов в ткани ткани легкого после заражения мышей вирусом гриппа А/РР/8/34 (доза заражения 6,0 1д ЭИДло) Условные обозначение по оси абсцисс - время после заражения (сутки); по оси ординат — на естатсе - инфекиианныи вирус ^^ в 1д ЭИД^с, и антиген [ ] в ед. П.Ш.О.П. * 10э # мм'-'; Не» рис. по оси ординат — содержание антигена в ед .П.Ш.О.П. ео фракциях; ^^ - мембранной, - легкой, - тяжелой

1 г

субклеточными фракциями в процессе инфекции, которое характеризуется ярко выраженной вирусспецифической модификацией клеточных мембран в острый период и отсутствием их маркировки в отдаленный срок.

ПвТОГен*ТИЧ*СК«И РОЛЬ_антуг-еное вируса гриппа в очаг»

поражения

Для получения доказательств реального вклада показатели уровня содержания антигена вируса гриппа в патогенез инфекционного процесса было проведено несколько серий комплексных исследований« сопоставлена тяжесть заболевания и выраженность реакций неспецифического и специфического цитотоксического лизиса в зависимости от различного содержания антигена вируса гриппа в пораженном органе; изучено изменение динамики антигенов вируса гриппа в легочной ткани при формировании смешанной вирус-бактериальной инфекции? проведен анализ изменений уровня содержания антигена после профилактического или лечебного введения -

эффективных при гриппе корректоров метаболизма.

Представленные результаты этого раздела является часть» комплексных исследований! проводимых я лаборатории молекулярной вирусологии. Они выполнены совместно с Н.К.Шидловской, К.Б.Грабовской, /I.К.Четвериковой, Т.А.Крамской.

При сравнительном изучении динамики вирусных антигенов в легких мышей и цитолитической активности спленоцитов при летальной и сублетальной Формах экспериментального гриппа' выявили корреляции между этими показателями (рис.6). .

Максимальное выведение вирусных антигенов иа легких демонстрировали поел© регистрации наибольшей цитолитической активности в селезенке. Более тяжелая инфекция характеризуется более интенсивными процессами накопления и выведения вирусных антигенов.

При смешанной инфекции изменяется динамика содержания антигенов вируса гриппа в легких по сравнению с моноинфекцией. Анализ активности натуральных киллеров свидетельствовал, что изменение динамики содержания антигенов вируса гриппа при смешанной инфекции вызвана дополнительной их активацией в ответ на введение второго возбудителя. Следовательно, динамика содержания вирусных антигенов в легких при гриппе отражает динамику присутствия клеток-мишеней в этом органе.

Рис.6 Сравнение динамики содержания вирусных .^антигенов в легких мишей и цитолитической активности спленоцитов при гриппозной инфекции рваной тяжести.

Условные обозначения! по оси абсцисс - время после заражения (сутки), по оси ординат слева - содержание антигена А (ед.П.Ш.0.Г1.*ммаИ0и), справа - цитотоксический лизис по выходу Н-? уридина (X). Заражающая доза 6,01д ЭИД»<» (а) и 4,0 1д ЭИДво (б) —»— - антиген, —с— - цитотоксическая активность N14, - цитотоксическая активность ЦТ/1.

Представлены данные -типичного опыта

. ' XV

Исследования механизмов действия препаратов коррекции метаболического гомеостаза - ингибитора^. протеолиза (Е-аминокапроновая кислота), антиоксиданта (ионол), ьнтигипоксанта'("Ас") на экспериментальный грипп показали, что при незначительных изменениях инфекционной активности в легких имеют место выраженные изменения динамики содержания вирусных антигенов и цитолитиЧеской активности иммуноцитов (рис.7).

Совокупность приведенных данных свидетельствует о том, что динамика содержания антигенов вируса в легких . является важнейшим показателем при изучении патогенеза гриппа, т.к. отражает динамику присутствия клеток-кишеней в органе, а также является ключом к пониманию патогенеза смешанной вирус-бактериальной инфекции и механизмов антивирусного действия средств метаболической коррекции.

ГГпТТГ

Я

Л;

* И 4 * Лщ

4.0

.V .

Рис.7 Изменение показателей инфекционного процесса при введена препаратов коррекции метаболизма.

Условные обозначения: по оси абсцисс - время после заражения (сутки)$ по оси ординат - а — инфекционная активность <19 б

антиген (площадь пика оптического поглощения (ед. П.Ш.О.П. *мм=*10^)), в - активность ЦТ/1 (У.). Цифрами внизу указана заражающая доза вируса А/РК/8/34 в 1д ЭИД^о. Стрелками и цифроЛ под ось» абсцисс указано время и дозы введения препаратов

ВЫВОДЫ

1. На вазе методов иммунасв яэыаамия в дотах и блоттинга предложены модификации, адекватные задаче выявления антигенов вируса гриппа в тканях зараженных животных. Разработанная методика оказалась высокочувствительной (до 1 пкг белка) и хорошо воспроизводимой. Возможность количественной оценки содержания вирусных белков в тканях позволило оценить их динамику в процессе инфекции.

Применение разработанных методов определения вирусных антиг-енов в условиях in vivo при анализе различных моделей экспериментального гриппа позволило сделать ряд принципиальных заключений:

— впервые доказано, что персистенция антигенов вируса в легких и селезенке является характерной чертой гриппозной инфекцииs

- впервые описано, что динамика содержания антигенов вируса гриппа в очаге инфекции и иммунокомпетентных органах носит циклический и Аозозависимый характер;

— присутствие вирусных полипептидов во всех обследованных тканях (легкие, селезенка, тимус, мозг) свойственно гриппозной инфекции и не зависит от заражающей дозы и патогенности штамма;

- в легких, при заражении как патогенным, так и апатогенным вариантами вируса гриппа, абортивные процессы превалируют уже во второй половине острого периода инфекции, начиная с 5-9 дня.

3. Репертуар вирусных полипептидов в легких и селезенку остается постоянным, но в динамике инфекции изменяется их относительное содержание. Нарастание абортивных процессов в легких сопровождается увеличением количества неразрезанного

гемагглютинина• Абортивные синтезы , в селезенке характеризуются высоким содержанием в клетках белков вирусного полимеразного комплекса. «

,4. В течение инфекции происходит перераспределение вирусных ечлков между различными клеточными Фракциями. Острый период характеризуется ярко выраженной вируссрецифической модификацией мембран, отсутствующей на отдаленных сроках инфекционного процесса.

5. Получены веские доказательства патогенетической значимости уровня содержания белкое вируса гриппа в очаге поражения¡ 1) динамика антигена вируса гриппа в легких четко отражает динамику клеток- мишеней в органе« 2) уровень представительства антигена

вируса в ткани является одним из ключевых факторов патогенеза смешанной вирус-бактериальной инфекции; 3) изменение динамики антигенов вируса гриппа в легких под влиянием эффективных средств защиты свидетельствует о значимости определения этого показателя для раскрытия механизмов антивирусного действия препаратов метаболической коррекции.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ;

1. Роль вирусспецифической модификации мембран в индукции клеточного звена иммунного ответа // В кн. "Актуальные вопросы теоретической и прикладной иммунологии, механизмы противовирусной иммунологии".-М., 1987.- С.43 (Соавт.; Дубровина Т.Я., Шидловская Н.К., /1еонтьева Г.Ф. и др.).

2. Летальный синергизм вирус—бактериальных инфекций (модель: грипп-стрептококк) // Вестник АМН CCCP.-19B9.-N4.- С.17-22 (Соавт.; ЙуёрсЕпнг Т.Я., Грабоиская К.Б., Шидловская Н.К., Поляк Р.Я.).

3. Иммунологические и молекулярные механизмы формирования смешанных вирус-бактериальных инфекций // Тр. I Всесоюзного иммунологического сьеэда.— М., 1989.- Т.1.- С.214 (Соавт.: Дубровина Т.Я., Грабовская К.Б., Леонтьева Г.Ф., Скира A.B.).

4. Выявление вирусных антигенов в легких и селезенке мышей, инфицированных вирусом гриппа //Молек.генетика,микробиол.,вирусол.— 1989.—N5— С.39-45 (Соавт.: Мерингова /1.Ф., Дубровина Т.Я.).

5. .Применение математической модели для анализа механизмов действия химиопрепаратов // Тезисы "Математическое моделирование в иммунологии и медицине".- Киев.- 1989.- С.58 (Соавт.: Поляк Р.Я., Войцеховский Б. /1., Дубровина Т.Я. и др.).

6. Характерная черта экспериментального гриппа у «ышей -длительное присутствие антигенов вируса гриппа в селезенке // Вестн. АМН СССР.- 1989.- N11.-С.87-92 (Соавт.: Леонтьева /1.Ф., Варечкова Э., Дубровина Т.Я., Шидловская Н.К.).

7. Model for analysis of drug action during experimental, influenza // Selected topics on mathematical models in immunology and medicine.- ch.5.- Austria.- IIASA.- Í990.- P.45-53 (Cowork.:-PoljakR.Ya., Chetvericova L., Dubrovina T. et al.).

8. Monitoring of viral process from the stand point of molecular nature of infection's pathogenesis//The problem of medicine and biology today and tomorrow. L.-1990.-Р.?в-?9

(Cowork.iPolyak R. ct al.).

9. Мвмененио внутриклеточной локализации антигенов вируса в процессе гриппояной инфекции // Вест. АМН СССР,- 1991,- N4.- С.32-34 (Соавт.> Леонтьева Г.«.).

10. Новые представления о закономерностях формирования реакций противовирусной защиты, их роли в патогнеэе и влияния химиспрепаратов // В кн.I "Новые подходы к химиотерапии вирусных инфекций",- Рига.- 1991.- С. 15-30 (Соавт.: Поляк Р.Я., Войиехсдаский Б.Л., Дубровина Т.Я. и др.),

11. Биологическое равновесие в организме при вирусной инфекции равней тржести на фоне действия химиолреларатов /У Бестн. АМН СССР.- 1991,- N4.- С.34-40 (Соавт.: Поляк Р.Я., Войцеховский Б.Л., Дубровина Т.Я. и др.).

12. Возможным механизмы реализации защитного действия Е-амимокалронозай кислоты при гриппе // В кн.» "Новые подходы к химиотерапии вирусных инфакций",- Рига,- 1991.- С.154-162 (Соавт.: Дубровина Т.Я., Лазиикий В.П., Иидловская Н.К., Леонтьева Г.Ф., Поляк P.R,}.

13. Significance of long lasting persistence of influenza virum antigens at the portal of infection and in the spleen of mice // Acta virol.- 1992,- v.36.- P.450-458 (Cowork.» Dubrovina Т., Shidlovskaya N.. Poljak R.Ya.).

14. Molecular and immunological" synergic mechanisms of lethal mixed infection caused by influenza virus and BBS // in XII Uancefielii Inform. . symp. on streptococci and streptococci diseases.- St.Petersburg.- "• 1993,- abstr.N143.- P.121 (Cowork.» Dubrovina Т., Grabovskay* K,, Poljak R.,et al.).

f emiw, зм ^100