Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль вируса гриппа в генезе острых и хронических патологических процессов в легких

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Роль вируса гриппа в генезе острых и хронических патологических процессов в легких"

^ #

^АЖТЯЗЁТЕРБУ^ГСШ! НАУЧНО-ИСЛЕДОВАТЕЛЬСКИИ ИНСТИТУТ ГРИППА

«С

«V АКАДЕМИЯ МЕШИНСКИХ НАУК РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

На правах рукописи УЖ 616.983.75.078.735

ЗАРУБАЕВ Владимир Викторович

^ЛЬ ВИРУСА ГРИППА В ГЕНЕЗЕ ОСТРЫХ И ХРОНИЧЕСКИХ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ

ПРОЦЕССОВ В ЛЕГКИХ

£03.00.06 - вирусология}

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1995

Работа выполнена в научно-иследовательском институте гриппа г.Санкт-Петербурга.

Научные руководители:

кандидат медицинских наук В.П-Сухинин

I-1

доктор медицинских наук IН. П. Чижов I

I___|

Ведущее учреждение: Институт пульмонологии МЗ России

Официальные оппоненты: д.м-н. Парусов В. Н.

к-б.н. Л. М- Викторова

Зашита диссертации состоится.^? г. в

на заседании специализированного совета СД 074.48.01D при научно-исследовательском институте гриппа РАМН (197376, Санкт-Петербург, ул. проф. Попова, 15/17).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке научно-ис-следователъского института гриппа РАМН.

Автореферат разослан

. 1995 г.

Актуальность проблемы.

Свойства вируса гриппа, такие как способность его к персис-тенции в зараженном организме, к инфицированию клеток иммунной системы и транспладантарной передаче с Формированном, врожденной медленной инфекции с летальным исходом заставляют более пристально изучать патогенетические механизмы вызываемых вирусом процессов. Ухудшение экологической обстановки и, как следствие, снижение общего иммунитета человека приводит к тому, что многие вирусные заболевания, в том числе и грипп, переходят в хроническую Форму с проявлением новых, нехарактерных для исходных штаммов свойств.

Изучение процессов, протекающих в зараженном вирусом организме, позволило обнаружить специфические для гриппозной инфекции черты. Характерным ее свойством является формирование на острой стадии деструктивно-геморрагического синдрома, т. е. массовой гибели эпителиальных клеток на Фоне ярко выраженной зритоци-тарной экссудации. Никакая другая респираторная вирусная инфекция (аденовирусная, парагриппозная, РС-вирусная) не приводит к этим процессам.

Отдельного рассмотрения заслуживает ироническая гриппозная инфекция, приводящая к формированию в легких людей и лабораторных животных характерной патогистологической картины. Клетки бронхиолярного эпителия - первичные клетки-мишени для вируса гриппа - погибшие в период острой инфекции, начинают замещаться новыми пролиФерирушими клетками, однако процесс регенерации не останавливается на стадии реснитчатого эпителия, а приводит к формированию многослойного эпителия и снижению степени дифферен-цировкм клеток, (метаплазии). Эта процессы в сочетании с обильной инфильтрацией ткани лимфоидныш клетками приводят к выключению целых областей и долей легкого из нормального процесса дыхания, вызывают хронические пневмонии смешанной этиологии и приводит к легочной недостаточности.

Ранее в нашей лаборатории были получены данные о корреляции между тяжестью протекания гриппа у лабораторных животных в острой Фазе (определяемой по проценту смертности) и процентом животных, V которых на стадии хронической инфекции развивались аде-номатозные разрастания. Такая корреляция была показана для разных штаммов вируса гриппа с различной патогенностью для мышей.

что делало необходимым определить, не зависит ли развитие разрастаний от первичного повреждения клеток, а не от непосредственно вирусного присутствия на поздних сроках заболевания (персистен-ции).'

В литературе имеются сведения о том, что гриппозная инфекция у лабораторных живоных в острой Фазе сопровождается резким повышением протеолитической активности в легочной ткани и сыворотке крови. Применение ингибиторов протеаз в значительной мере облегчает течение заболевания и повышает процент выживаемости животных. Геморрагический отек легких обуславливается повышением проницаемости сосудов пои инфекции, процессом, в котором протеа-зы также играют важную роль С Чернух A.M.). В связи с этим актуальной задачей является выяснение роли в патологическом процессе при гриппозной инфекции отдельно протеолитических ферментов и отдельно - вируса. Решение поставленной проблемы требует, с одной стороны, разработки системы контроля, позволяющей отделить специфические для вируса изменения в легких от изменений неспецифических, и с другой стороны - применения чувствительного метода выявления вируса в структуре ткани для определения его локализации.

Выявлению вируса гриппа в ткани посвящено большое количество работ. Проанализировав сушествушие методы индикации возбудителя, мы установили, что ни одна из методик, где используются тканевый гомогенат или выделенная и очищенная РНК, не могут способствовать решению поставленной задачи, поскольку исключают соотнесение вирусспециФического сигнала с теми или иными тканевыми структурами. В этом смысле речь может идти лишь о методах иммуногистохимии, гибридизации in situ и недавно разработанном методе транскрипции in situ. Авторами метод транскрипции in situ был использован для выявления мРНК одного из гормонов гипофиза. В вирусологии этот метод ранее применен не был. Способность вируса гриппа к Формированию абортивной инфекции без продукции вирусных белков делает нецелесообразным применение иммунологических методик, а малое количество копий генома, наблюдаемое при персистен-тной инфекции и лежащее ниже порога чувствительности гибридизации in situ приводит к неоднозначным результатам при использовании этого метода.

Достоинства метода транскрипции in situ заключаются в том, что зонд, полученный в ходе полимеразной реакции, отличается очень высокой удельной активностью, что позволяет значительно по-

высить чувствительность и разрешающую способность метода и снизить время экспозиции гисторадиоавтографов.

Из сказанного следует, что исследования в двух направлениях - отдаленные последствия неспецифической деструкции клеток бронхиального эпителия и выявление вируса гриппа в ткани и определение его локализации - является актуальной проблемой, поскольку позволяет определить взаимоотношения двух процессов - метаплазии эпителиальной ткани и персистенции вируса гриппа на поздних сроках инфекции, а также может служить основанием для разработки комбинированных методов терапии отдаленных последствий при гриппе.

Цели и задачи исследования.

Лля выполнения работы были сформулированы следующие цели.

1. Выяснить, существуют ли морфологические признаки экспериментальной гриппозной инфекции, не являкщиеся результатом неспецифического разрушения эпителиальных клеток.

2. Провести сопоставление метода транскрипции in situ с методами иммуногистохимии и гибридизации in situ и определить границы его применимости в вирусологии.

3. Определить тканевую и клеточную локализацию вируса гриппа в легких инфицированных животных на стадии хронической гриппозной инфекции.

В соответствии с целями для проведения исследования были поставлены следующие задачи.

1. Разработать модель хронической пневмонии под воздействием протеолитических ферментов.

2. Провести морфологическое исследование патологического процесса и сопоставить его характеристики с таковыми при персис-тентной гриппозной инфекции.

3. Провести выявление вирусспеиифических РНК на различных стадиях гриппозной инфекции при помощи гибридизации на Фильтрах CNothern-блоттанг).

4. Исследовать динамику распространения вируса гриппа в ходе экспериментальной инфекции при помощи иммуногистохимического метода с использованием поликлональных антител.

5. Провести выявление РНК вируса гриппа на гистологических срезах при помощи метода транскрипции in situ на различных сро-сах инфекции,включая хроническую стадию.

6. Сопоставить данные по локализации и динамике распростра-

нения метки, полученные в ходе иммуногистохимического анализа и анализа при помощи транскрипции In situ.

Научная новизна работы.

1. Впервые установлено, что закономерности течения патологических процессов при гриппозной инфекции и неспецифической деструкции эпителия протеолитическими ферментами являются одинаковыми для всех сроков эксперимента вплоть до иронических последствий. что ставит под сомнение способность вируса гриппа как внутриклеточного паразита стимулировать разрастания бронхиолярно-го эпителия на стадии персистентной гриппозной инфекции и доказывает ведущую роль неспецифических разрушений легочной ткани в индукции этого процеса.

2. Впервые метод транскрипции in situ применен для исследования вирусной инфекции. Показано, что этот метод может быть использован для обнаружения вирусного присутствия в организме, причем предварительный шаг гибридизации исследуемого препарата с оли-гонуклеотидным праймесом может быть исключен из процедуры анализа.

3. При помощи метода транскрипции in situ показано, что на стадии хронической гриппозной инфекции вирус находится исключительно в клетках иммунной системы - лимфоцитах, макрофагах и ней-троФилах, находящихся в пределах аденоматозных структур и не проявляет тропизма к клеткам пролиферируицего эпителия.

Научно-практическая значимость работы.

В результате проведенных исследований разработана и охарактеризована модель хронической пневмонии на основе введения в легкие экспериментальных животных протеолитических ферментов.

Впервые метод транскрипции in situ использован для диагностики вирусной инфекции, и показана его высокая чувствительность и разрешающая способность в отношении морфологической индикации вирусов, Показано, что исключение из методики этапа гибридизации с праймером не влияет на результат исследования, что позволяет рассматривать это как модификацию процедуры, значительно упрощакщую и удешевляющую проведение анализа.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Неспецифическая деструкция бронхиолярного эпителия про-теолитаческими Ферментами приводит к развитию хронической пневмонии, сохраняющейся в течение 3 месяцев со дня обработки без признаков регрессии.

2. Патологические процесы, вызванные интраназальным введением протеолитических Ферментов и заражением вирусом гриппа являются сходными по целому ряду морфологических характеристик.

3. Методы гибридизации РНК-ДНК на фильтрах не позволяют обнаружить РНК вируса гриппа на стадии хронической инфекции.

4. Метод транскрипции in situ является чувствительным методом для выявления в исследуемом органе вирусного присутствия, но не может быть использован для дифферениировки самих вирусов.

5. На стадии хронической гриппозной инфекции вирус гриппа локализован в иммунокомпетентных клетках в пределах аденоматоз-ных разрастаний и не проявляет тропизма к клеткам.пролиферирукще-го эпителия.

6. Ведущую роль в генезе патологических разрастаний в легких на стадии хронической гриппозной инфекции играет не вирус гриппа как внутиклеточный паразит, а вызываемое им повреждение слоя клеток бронхиального эпителия и последующая лимфоидная инфильтрация пораженной ткани.

Апробация работы.

Материалы по теме диссертации доложены на конференции молодых ученых с участием специалистов из Университета Невада-Рино (1991), а также на заседании ученого совета института (1993).

Публикации по теме.

По теме диссертации опубликовано 4 печатные работы.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 78 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов, их обсуждения и выводов. Текст иллюстрирован 24 рисунками. Список литературы содержит 210 названий работ отечественных и зарубежных авторов.

Собственные исследования.

Материалы и методы.

Вирус. Для экспериментов использовали вирусы гриппа штаммов А/Шогп С HIMl) и A/PR/8/34 CH1N1). пассированные в куриных зм-брионак до титров по ге«агглютинации 1:256 - 1:512. Для заражения брали 0,1 мл аллантоисной жидкости в разведении 10-4.

Животные. Использовали белых беспородных ыьшей и мышей линии СБА весом 20 г. Заражение проводили интраназально под эфирным наркозом. По прошествии срока эксперимента животных забивали декапитацией, вскрывали и через трахею вводили в легкие 1% раствор желатина в PES. Органокомплекс, включаший легкие, тимус, сердце,, пищевод и трахею, извлекали и замораживали при температуре жидкого азота. Из замороженных органов готовили криостатные срезы толщиной 9-11 мкм, монтировали на предметные стекла, фиксировали в свежеприготовленном парафошальдегиде, промывали 2 раза в PBS и обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации.

Для экспериментов по исследованию роли неспецифического разрушения эпителия в развитии патологического процесса в легких при хронической гриппозной инфекции мышам интраназально под эфирным наркозом были ввведены растворы протеолитических ферментов -протеиназы К СО, 2 иг/мл) или химотрипсина СО,5 мг/мл) в буфере PBS. Животных забивали на 1, 3, 5, 10 и 37 день после введения Ферментов, из легких готовили парафиновые срезы и иследовали под микроскопом. Параллельные препараты готовили для исследования под электронным микроскопом.

Иммуногистохимия. Криостатные срезы легких обрабатывали 0,1% химотрипсином в 0,1% растворе хлористого кальция рН 7,8 при 37°С 30 минут. Эндогенную пероксидазу блокировали при помощи обработки 3% перекиси водорода в течение 5 минут. Неспецифические сайты связывания белка блокировали 1X БСА в буфере ТЕЗ СБОгаМ Tris-HCl рН 7,4, 150mM NaCl) 20 минут при 37°С, отмывку проводили 15 мин. буфером TBS при комнатной температуре. На стекла наносили раствор первичных антител (кролика против вирусного го-могената) в буфере TES в разведении сыворотки 1:50 и инкубировали при комнатной температуре в течение 20 минут. Отмывку проводили 30 мин. буфером TES +■ 0,053£ NP-40. Срезы затем инкубировали в растворе вторичных антител (козы против кролика) в разведении 1:20 в буфере TBS в течение 20 мин. при комнатной температу-

- g -

ре. отмывали 30 мин. буфером TES + 0,05% NP-40. Проводили реакцию на пероксидазу с диаминобензидином (0,8мг/мл) и перекисью водорода С0,15%). Срезы подкрашивали гематоксилином, обезвоживали и заключали в бальзам.

В качестве контроля использовали срезы легких интактных животных и животных, ложноинфишрованных IX раствором ВСА в PBS. Анализу подвергали препараты органов, выделенных через 3. 6, 12, 18 и 24 часа, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 69 и 150 суток после заражения.

Гибридизация In situ. Зонды. Смесь рекомбинантных плазмид с копиями генов вируса гриппа подвергали рестрикции по ВатН1-сайту с последующим мечением методом рассеянной затравки СMultiprime DNA labeling system. Amersham). В качестве предшественника использовали уН-дазоксицитидин (Amersham). Удельная активность полученного зонда составляла 5- 10у - 1-10s cpm/мкг. Для гибридизации брали приблизительно 5 000 ери зонда.

Гибридизация. Для проведения анализа срезов методом гибридизации in situ криостатные срезы легких мышей монтировали на стекла, предварительно обработанные в течение 3 часов в среде 450 шМ NaCl / 40 n¡M Ма-цитрат рН 7,0 / 1 * р~р Ленхардта при 65°С. Срезы высушивали на воздухе. Фиксировали в смеси спирт-ацетон (3:1) в течение 20 мин. при комнатной температуре и инкубировали в растворах 0,2н НС1 20 мин. при 20°С и 2*SSC 30 мин. при 70°С с отмывкой в течение 5 мин. дистиллированной водой после каждой инкубации C1XSSC: 0,15 M NaCl, 0,015 M цитрат натрия рН 7,0). После этого срезы обезвоживали и гибридизовачи с меченным зондом в среде следующего состава: 50% формамид / 10 мМ трис-HCl рН 7,5 / 1 мМ ЭДТА / 600 мМ NaCl / 1" р-р Денхардта / 1 мг/мл БСА/ 1 мг/мл озвученной ДНК из тимуса теленка / 1 мг/мл тРНК / 10% декстран-сульфат. Гибридизацию проводили в объеме 20 мк.л под покровным стеклом во влажной камере при 25°С в течение 24-43 часов. От нес-вязавшейся метки срезы отмывали в растворе 50% Формамид / 10 мМ трис-HCl рН 7,5 / 1 мМ ЭДТА / 600 мМ NaCl / 2 раза по 30 мин. при комнатной температуре и в той же среде без формамида в течение ночи в непрерывном токе буфера (4-6 литров) при 37°С. Срезы обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации, покрывали Фотоэмульсией и экспонировали при -20°С в течение 30-60 суток. Препараты проявляли в амидоловом проявителе, окрашивали гематоксилин-эозином, заключали в бальзам и анализировали под световым микроскопом.

Транскрипция in situ- Криостатные срезы легких инкубирова-

ли в среде, содержащей протеиназу К С 20 мсг/шО в буфере PES. Контрольные срезы обработке протеиназой не подвергались. Гибридизацию с синтетическим олигонуклеотидным праймером проводили в растворе 4XSSC. В качестве поаймера брали смесь 20-членных олиго-нуклеотидов (40нг/мл каждого), комплементарных 3'-концам генов НА, М и NP вируса гриппа, после гибридизации в течение 12-16 часов при 25°С проводили отмывку от несвязавшегося праймера 2 раза по 30 мин. при комнатной температуре в растворе 2*SSC, 1 раз 2 часа в О,1XSSC при 37°С. После обезвоживания в спиртах возрастающей концентрации проводили реакцию транскрипции, in situ в реакционной среде следующего состава: Трис-HCl ЬОяМ рН 8,3, КС1 40тпМ, MgClg 6шМ, дитиотреитол 7,5гаМ, РНКазин 0.12 ед. /мкл РНК-зависимая ДНК-полимераза С обратная транскриптаза, ревертаза) в концентрации 600 ед./ш из следующих источников: из вируса миелобласто-за птиц - Proraega, США: Омутнинский химический завод, из вируса лейкемии мышей - Вильнюс, Fermentas. В качестве меченных предшественников использовались ^Н-дНТФ, выпаренные из 50-100 мкл спиртового раствора каждый. Реакцию проводили в течение 1-1,5 часов при 3?°С, невключившуюся метку отмывали 2 раза при комнатной температуре в 2KSSC, в течение ночи при 37°С в непрерывном токе О,5Х55С. После обезвоживания в спиртах стекла покрывали Фотоэмульсией, экспонировали 2-3 суток при -20°С, проявляли в амидоло-вом проявителе, окрашивали гематоксилин-эозином и заключали в бальзам. Для анализа использовали срезы легких животных, забитых через 3, 6, 12, 18 и 24 часа, 2, 3, 4, 6, 7, 3, 69 и 150 суток после.инфицирования. Б качестве негативного контроля использовали препараты органов интактных животных или животных, ложноинфи-цированных 1% раствором БСА в PES, срезы, подвергнутые процедуре гибридизации без специфического праймера, срезы, прошедшие инкубацию в реакционной среде в отсутствие ревертазы, а также в отсутствие меченного предшественника ДНК.

Выделение и анализ РНК.

Для анализа использовали клетки бронхолегочных смывов интактных и зараженных животных, полученых от 15-20 мышей. Клетки отмывали от внеклеточного вируса и неструктурного дебриса 3 раза стерильным буфером PBS. Выделение тотальной РНК из клеток бронхоле-гочных смывов проводили по методу Chirguln С1979). Клеточный осадок ресуспендировали в растворе 4М гуанидинизотиошанат / 5 гпМ Ыа-цитрат рН 7,0 /0,1 М 2-меркаптоэтанол / 0,5% Ма-саркозилат. К раствору добавляли сухой CsCl из расчета 0,4 г на 1 мл раствора.

- и -

После растворения полученную жидкость наслаивали на 1,2 мл 5,7 M CsCl / 0,1 M ЗДТА рН 7,5 в пробирке от ротора SW 50.1 CBeckman). Центрифугирование проводили в течение 20 часов при 30 ООО об./мин при 20°С. Надосадочную жидкость отбрасывали, стенки пробирки высушивали и осадок растворяли в среде 10 гоМ Трис-НС1 рН 7,4 / ЗДТА / 1% SES. Полученный раствор экстрагировали равным объемом смеси хлороформ - 1-бутанол С 4:1), водную фазу переносили в другую пробирку, органическую Фазу снова экстрагировали средой 10 тМ Трис-НС! рН 7,4 / 5гаМ ЭДГА / i% SDS. Водные фазы после обеих экстракций объединяли, добавляли 0,1 объема 3 M ацетата Ma рН 5,2 и 2,2 объема этанола и выдерживали в течение ночи при -20°С.

Осажденную РНК центрифугировали 40 мин. при 16 ООО об./мин на центрифуге К23 при -4°С, высушивали под вакуумом, растворяли в дистилированной воде, концентрацию РНК измеряли спектрофотометрм-чески при 260 нм. - •

. Для разделения фрагментов РНК в геле проводили денатурацию РНК. Для этого смешивали 2,7 мкл 6М глиоксаля, 8 мкл диметил-сульфоксида, 1,6 мкл 0,1 M NaH2F04 рН 7,0 и 3,7 мкл раствора РНК С1-20 мкг). Смесь инкубировали 1 час при 50°С, наносили на 1,5% агарозный гель в 0,01 M фосфатном буфере и проводили электрофорез при напряженности тока 3 В/см.

По окончании разделения РНК гель окрашивали бромистым эти-дием. Показателем интактности выделенной РНК служили полосы рибо-сомальной РНК C28S, 18S и 5,85). Разделенные фрагменты РЕК переносили на нитроиеллюлозные Фильтры в течение ночи (Маниатис, 1984). Фильтры высушивали на воздухе и выдерживали 2 часа при 80°С под вакуумом.

Гибридизацию с радиоактивным зондом проводили по стандартной методике СМаниатис, 1984). В качестве зонда брали смесь плазмид. каждая из которых несла ДНК-копию одного из генов вируса гриппа. Мечение проводили при помош случайного праймирования (Multiprime DNA labeling system, Amersham) и жР-дЦТФ. Буфером для гибридизации служила смесь 6XSSC / О,5%SDS / 50% Формамид / 5-кратный раствор Денхардта / ЮО мкг/мл денатурированной ДНК из эритроцитов цыплят. Гибридизацию проводили в течение ночи при 42°С. от несвязавшейся метки Фильтры отмывали 2 раза по 30 минут s 2*SSC / 0,1% SDS при комнатной температуре и 2 раза по 1,5 ча-:а в 0,1XSSC / 0,1% SD5 при 65°С. Фильтры высушивали на воздухе и экспонировали с рентгеновской пленкой при -20°С.

- 12 -Результаты и обсуждение.

1. Гистологическое и электронно-микроскопическое исследование хронической пневмонии, вызванной вирусом гриппа и обработкой протеазами.

Сравнительный гистологический анализ, проведенный на срезах легких мышей, зараженных вирусом гриппа, с одной стороны и подвергшихся обработке протеазами - с другой, выявил сходные закономерности течения патологического процесса. В обоих случаях на ранних стадиях указанные воздействия приводили к быстрому появлению в легких, в первую очередь в периферических отделах, мощного

<1

геморрагического экссудата с боьшим количеством фибрина. Случаи гибели животных отмечались начиная с 1 суток в случае гриппа и с 20 минут в случае применения протеаз. Появление в экссудате ней-трофилов и макрофагов, свидетельствующих о воспалительных процессах в ткани, отмечалось начиная с 1 суток эксперимента. Эпителий бронхов и альвеол при протеолитической обработке обнаруживал признаки деструкции в несколько меньшей степени, чем это присуще гриппозной инфекции, обработка протеазами приводила к частичному разрушению клеток, а таете к сильно выраженному нарушению межклеточных контактов и отеку базальной мембраны, что было подтверждено при помощи электронно-микроскопического исследования.

С течением времени происходило рассасывание экссудата с нарастанием признаков воспаления. В легких обнаруживались очаги распада ткани и интенсивная инфильтрация ее лимфоцитами, макрофагами и нейтроФилами. Регенерация эпителиальных клеток приводила к гиперплазии бронхиального слоя и Формированию аденоматозных структур, сходных с таковыми при гриппозной инфекции. Начиная с 5 суток эксперимента выявлялась значительная активация микоплазмы на поверхности пролиФерирунадих клеток эпителия и коккоидной микрофлоры в просветах бронхов.

На дальних сроках опыта процессы метаплазии и инфильтрации легочной ткани приводили к полному заполнению просветов мелких и крупных бронхов нейтроФилами, а альвеолярных полостей - лимфоцитами и макрофагами. Как при гриппе, так и в контрольных срезах наблюдалось формирование из эпителиального слоя гигантских клеток с зернистой цитоплазмой. Электронно-микроскопическое исследование выявило в обоих случаях большое количество металлизированных эпителиальных и плазматических клеток в очагах разрастаний, а

также значительное количество микоплазмы на поверхности эпителиальных клеток. Такая морфологическая картина сохранялась в течение 90 дней эксперимента без признаков регрессии.

2. Выявление вирусспецифической РНК при помощи гибридизации

на Фильтрах.

Обнаружение вирусспецифической РНК среди тотальной РНК из бронхолегочных смывов было проведено при помощи стандартной методики электрофореза в агарозном геле с последующим переносом на нитроцеллюлозные Фильтры и гибридизации с радиоактивным зондом. В качестве образцов были взяты клетки бронхолегочных смывов животных, находящихся на острой и хронической стадиях гриппозной инфекции, интактных животных (негативный контроль) и РНК, выделенная из вирусной культуры, выращенной на куриных эмбрионах (позитивный контроль). Поскольку использованная методика не позволяет определить клеточную локализацию вирусспецифической РНК, мы ставили своей задачей лишь определить, на каких стадиях заболевания выявление вРНК возможно при помощи Мо^егп-блотгинга. Было показано, что этот метод выявляет вРНК только на стадии острой инфекции.

3. Иммуногистохимическое исследование срезов легких животных на острой и хронической стадиях гриппозной инфекции.

При выявлении вирусспециФических белков при помощи метода иммуногистохимии с использованием поликлональных антител были установлены следукшие закономерности. Клетки, несушме пероксидаз-ную метку, начиная с 1 суток развития заболевания, появлялись в составе воспалительного экссудата в просветах бронхов и в слое клеток бронхиолярного эпителия. С течением времени (3-4 сутки) их число нарастало, и они проявляли тенденцию к распространению из бронхов в альвеолы и строму лёгкого. Мы предполагаем, что эти клетки являются альвеолярными макрофагами, которые выполняют не только антиген-презентиругацую Функцию, но и являются резервуаром для поддержания вирусной популяции £ 1- К 6-8 суткам после заражения их число сокращалось, и на стадии хронической гриппозной инфекции их не было обнаружено вообще.

4. Исследование срезов легких лабораторных животных на стадии острой и хронической гриппозной инфекции при помощи транскрипции in situ.

После анализа срезов методом транскрипции in situ меченные клетки появлялись в просвете бронхов начиная с 3 часов после инфицирования. Число их нарастало в течение 3-4 суток заболевания, затем несколько снижалось или оставалось на том же уровне. Как и в случае иммуногистохимического анализа, эти клетки проявляли тенденцию к распространению из просветов бронхов в соединительную ткань легкого.

Начиная с 6 часов развития патологического процесса, меченные клетки появлялись также в тимусе. Число их и плотность метки нарастали вплоть до 8 суток эксперимента, к этому времени они формировали здесь скопления, занимающие обширные области.

На стадии хронической гриппозной инфекции меченные клетки локализовались исключительно в просветах альвеолярных ходов среди аденоматозных разрастаний эпителия. Ни в одной из других морфологических структур их обнаружено не было.

Известно, что полимеразный комплекс вируса гриппа обладает активностью, позволяющей отщеплять короткие участки от клеточных мРНК и присоединять их к матрице вирионной РНК в качестве затравки. Таким образом, в инфицированной клетке изначально уже присутствуют эндогенные структуры типа "матрица-праймер", которые могут быть использованы обратной транскриптазой при проведении транскрипции in situ. На основании этого факта мы предположили, что если в исследуемой ткани есть вирус гриппа, то его РНК может быть выявлена независимо от наличия или отсутствия синтетического праймера. В опытах по проверке этого предположения было выяснено, что действительно, при отсутствии в среде олигонуклеотида на срезах легких инфицированных животных была получена та же картина, что и в его присутствии. В то же время в негативном контроле (интактные или ложноинфицированные животные) превышения уровня метки над Фоном обнаружено не было, как и в случае отсутствия или инактивации обратной транскриптазы в реакционной среде.

Наши данные позволяют в известной степени разделить персис-тенцию вируса гриппа в клетках и индукцию аденоматозных разрастаний на дальних сроках гриппозной инфекции. Вирус гриппа, несомненно, присутствует в легких на стадии хронической инфекции, однако он присутствует в иммунокомпетентных клетках, а не в клет-

ках пролиферирующего эпителия, а кроме того, изменения, сходные с хроническими поражениями легких при гриппе развиваются и при невирусном воздействии на легочную ткань. На основании полученных результатов можно утверждать, что метаплазия эпителия и принципиальная морфологическая картина поздней стадии заболевания обусловлена в первую очередь не специфическим воздействием вируса гриппа на жизненный цикл клеток, а реакцией легких как дифференцированной системы на деструкцию эпителиального слоя бронхов и вирусиндуцированное повышение протеолитической активности в легочной ткани. Присутствие персистирукшего вируса может вносить лишь незначительные изменения С прямо или опосредованно) в общую картину патогенетического процесса.

Выводы.

1. Для выявления вирусного присутствия в клетках на модели экспериментальной гриппозной инфекции впервые применен метод транскрипции In situ, обладающий преимуществом перед другими методами индикации вирусов: значительно более высокой интенсивностью сигнала, позволящай сократить время анализа в 6-8 раз, и большей чувствительностью по сравнению с гибридизацией на Фильтрах и гибридизацией in situ.

2. Установлено, что метод транскрипции in situ выявляет наличие и тканевую локализацию вируса в исследуемом препарате. Особенностью метода является его способность обнаруживать вирус в клетках как в присутствии, так и в отсутствии синтетического прайме ра,

3. Проведено изучение морфогенеза патологического процесса, вызванного у экспериментальных животных вирусом гриппа в сравнении с патологическими процессами, развивающимися в легких мышей при интраназальном введении протеаз. Установлено сходство основных морфологических характеристик патологических процессов на острой и хронической стадиях легочных поражений, что свидетельствует о ведущей роли первично-деструктивных процессов в морфогенезе гриппозной инфекции.

4. При помощи транскрипции in situ установлено, что в острой фазе экспериментальной гриппозной инфекции (3 дня) вирус локализован в воспалительном экссудате в просветах бронхов и эпителии бронхов и респираторных отделов, к концу острой Фазы (7 дней) локализуется в макрофагах, которые перемешаются в периброн-хиальное пространство, и сохраняется в лимФоидно-макроФагальных инфильтратах на хронической стадии С30-150 дней). В метаплазиро-ванном эпителии бронхов и альвеол на этой стадии вирус не обнаруживается.

5. Роль вируса гриппа в генезе острых и хронических поражений легких заключается в инициации деструктивных процессов в острой фазе инокини и дальнейшей персистенции в клетках лимфоид-но-макрофагальной системы очагов хронического воспаления легких.

Список работ, опубликованных по теш диссертации.

1. Prianishnikov V.A., Zarubaev V.V., Slita A.V., Sukhinln V.P. The use of in situ transcription for cyto- and histopathological diagnoses of a latent HIV-1 infection.

8-th International Congress of Virology. Abstracts. Berlin, 1930.

2. Сухинин В.П., Прянишников В.А., Зарубаев В.В., Голубев Д.Б. Исследование морфэ- и патогенеза экспериментальной гриппозной инфекции при помощи молекулярной гибридизации РНК-ДНК in situ. "Иммунология и патогенез гриппа и гриппоподобных заболеваний". Л., 1991.

3. Зарубаев В. В., Прянишников В. А., Сухинин В. П., Голубев Д.Б. Изучение возможности использования транскрипции in situ для морфологического обнаружения РНК вируса гриппа на гистологических срезах. "Иммунология и патогенез гриппа и гриппоподобных заболеваний". JL , 1991.

4. Зарубаев В.В., Сухинин В.П. Этиопатогенетические аспекты мофогенеза гриппозной инфекции. Свердловск, 1995.

АОЗТ СКВ "ИНДИКАТОР". За к. 1480. Тир. 60 Ш Т.