Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Моделирование инфекции, вызванной вирусом гепатита C, у мышей

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Моделирование инфекции, вызванной вирусом гепатита C, у мышей"

На правах рукописи

СУХНО АНАТОЛИЙ СЕРГЕЕВИЧ

МОДЕЛИРОВАНИЕ ИНФЕКЦИИ, ВЫЗВАННОЙ ВИРУСОМ ГЕПАТИТА С, У МЫШЕЙ

03 00 06 - вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2007

003161763

Работа выполнена в ГУ НИИ вирусологии им Д И Ивановского РАМН

Научный руководитель. доктор медицинских наук, профессор

Дерябин Петр Григорьевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Кущ Алла Александровна доктор биологических наук Ляпустин Виктор Николаевич

Ведущая организация- ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии

им Н Ф Гамалеи РАМН

Защита диссертации состоится 14 ноября 2007 г в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 001 035 01 в ГУ НИИ вакцин и сывороток им И И Мечникова РАМН по адресу 105064, г Москва, пер М Казенный, д 5 а

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ вакцин и сывороток им И И Мечникова РАМН

Автореферат разослан «13» октября 2007 г

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Вирусный гепатит С (ВГС-инфекция) является актуальной проблемой здравоохранения Около 3% человеческой популяции в мире инфицировано вирусом гепатита С (ВГС) Заражение ВГС в 60-80% случаев ведет к развитию хронического гепатита, заканчивающегося в 10-20% случаев циррозом и в 1-5% - гепатоцеллюлярной карциномой До настоящего времени не разработана эффективная вакцина для профилактики ВГС-инфекции, а лечение препаратами интерферона или интерферона в сочетании с рибавирином дает положительный эффект лишь у 30 - 40 % больных [Балаян MC, 1999, Шахгильдян ИВ, Михайлов МИ, Онищенко Г Г , 2003, Шляхтенко Л И , 2003, Турьянов М X , 2004]

Одной из основных проблем в создании вакцины для профилактики вирусного гепатита С и новых средств лечения инфекции было отсутствие методически простых и экономически рентабельных экспериментальных моделей продуктивной ВГС-инфекции в культурах клеток и у лабораторных животных В 1997 году в НИИ вирусологии им Д И Ивановского РАМН были получены доказательства способности ВГС реплицироваться в культурах клеток и в организме лабораторных животных, используя принципы культивирования вирусов семейства Flaviviridae Также как и другие флавивирусы, цитопатогенные варианты ВГС, выделенные из крови ВГС-инфицированных людей, размножались в культурах клеток почек эмбрионов свиньи (СПЭВ), почек африканской зеленой мартышки (Vero), фибробластов куриных эмбрионов (ФЭК) после селекции в первичных клетках головного мозга сосунков беспородных белых мышей [Дерябин И Г , Исаева Е И , Вязов СО, Львов Д К, 1997]

Изучение экспериментальной ВГС-инфекции in vitro в культурах клеток различного происхождения [Дерябин П Г , 1997, 1999, Bartenschlager R , and V Lohmann, 2000, 2001, Trujillo-Murillo Kdel С, 2004, Tscherne DM, 2006, von

Hahn T , 2006, Yi M , 2006], а также in vivo y шимпанзе, древесных землероек, новорожденных беспородных белых и трансгенных мышей с трансплантированными человеческими гепатоцитами [Балаян MC, 1998, Дерябин ПГ, 1997, Полещук ВФ, 2006, Forns X, 1999, Abrignani S, 1999, Lanford R E , 2001, Mercer D F , 2001, Bukh J , 2004, Shin E С , 2005, Kneteman N M , 2006] позволило получить новые данные о биологических свойствах ВГС и некоторых особенностях патогенеза экспериментальной ВГС-инфекции Высокая стоимость предложенных биомоделей ВГС-инфекции in vivo и/или сложность методических подходов ограничивали исследования в данной области, что заставляли исследователей искать альтернативные варианты моделей инфекции Потребность в методически простых и экономически рентабельных экспериментальных моделях ВГС-инфекции у лабораторных животных продолжает оставаться очень актуальной Такие модели необходимы для выяснения причин длительной персистенции вируса при ВГС-инфекции, для изучения протективных свойств разрабатываемых вакцин, для экспериментальной оценки противовирусной активности различных соединений на моделях ВГС-инфекции m vivo

Таким образом, мало исследованными и исключительно важными являются вопросы изучения возможности моделирования персистентной ВГС-инфекции in vivo, органного тропизма вируса гепатита С, динамики продукции специфических антител и длительности вирусемии Представляется актуальным разработка достоверных методов регистрации маркеров ВГС-инфекции у мышей обнаружение РНК ВГС и определение инфекционной, гемагглютинирующей (ГА) активностей вируса, непосредственно в органах, где активно накапливается антиген, а также выявление различных видов специфических антител

Цель и задачи работы: моделирование персистентной инфекции у взрослых мышей с использованием выделенного варианта ВГС, изучение закономерностей патологического процесса при экспериментальной ВГС-инфекции и получение доказательств способности цитопатогенного варианта

ВГС размножаться в различных органах и тканях беспородных белых мышей В соответствии со сформулированной целью были определены следующие задачи исследования

1 Моделирование экспериментальной персистентной ВГС-инфекции у взрослых беспородных белых мышей

2 Обследование в динамике внутренних органов и тканей животных, зараженных ВГС на наличие РНК ВГС

3 Изучение динамики развития инфекционной, ГА и антигенной активностей ВГС в крови и тканях внутренних органах лабораторных животных при персистентной ВГС-инфекции

4 Выявление гепатотропных, лимфотропных и нейротропных свойств цитопатогенного варианта ВГС при экспериментальной хронической инфекции у беспородных белых мышей

5 Проведение патоморфологических исследований ткани печени мышей в условиях персистентной инфекции, вызванной ВГС

6 Изучение динамики антителообразования при экспериментальном хроническом вирусном гепатите С у беспородных взрослых белых мышей

Научная новизна исследований.

1 Впервые продемонстрирована возможность моделирования персистентной инфекции, вызванной вирусом гепатита С, в организме взрослых беспородных мышей

2 Впервые обнаружена способность ВГС накапливаться в различных органах и тканях хронически инфицированных мышей

3 Показано, что основными маркерами ВГС инфекции у мышей могут служить РНК ВГС, инфекционная и ГА активности вируса

4 Выявлена динамика накопления инфекционного ВГС и его антигенов в крови и тканях внутренних органов животных по мере развития и

становления хронической инфекции, свидетельствующая о медленно-прогрессирующем характере инфекции у животных

5 Впервые получены данные о способности ВГС преодолевать гематоэнцефалический барьер у животных

6 Выявлены особенности динамики специфического антителообразования при ВГС-инфекции у мышей

Практическая ценность исследований.

1 Полученная экспериментальная модель ВГС инфекции т vivo может быть успешно использована для проведения доклинических испытаний противовирусной активности химиопрепаратов, индукторов интерферона и других иммуномодуляторов

2 Способность ВГС, содержащегося в различных органах и тканях зараженных животных, агглютинировать гусиные эритроциты открывает перспективу использования РГА и РТГА для диагностики гепатита С

3 Экспериментальная модель инфекции, вызванная ВГС в организме мышей, может быть использована для оценки способности разрабатываемых против гепатита С вакцин защищать животных от инфекции

Основные положения выносимые на защиту.

Внутривенное введение цитопатогенного варианта вируса гепатита С взрослым беспородным белым мышам приводит к развитию персистентной инфекции с накоплением вируса в крови и тканях внутренних органов, а также к развитию в печени характерных патоморфологических изменений

РНК ВГС, инфекционная активность вируса, специфические антигены и антитела к ним, выявленные в крови и тканях внутренних органов мышей, являются основными маркерами экспериментальной инфекции, вызванной цитопатогенным вариантом ВГС

Апробация работы состоялась 06 июля 2006 года на совместном заседании Экспертного специализированного Совета по предварительной экспертизе диссертационных работ по медицинской вирусологии при

Институте вирусологии им Д И Ивановского РАМН, отделов молекулярной вирусологии, экологии вирусов, Государственной коллекции вирусов, общей вирусологии Основные положения диссертационной работы представлены в материалах VIII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2002 г), VI Всероссийской научно-практической конференции «Вирусные гепатиты - проблемы эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики» (Москва, 2005 г), Юбилейной научной конференции, посвященной 175-летию со дня рождения СП Боткина (Санкт-Петербург, Военно-медицинская академия им С М Кирова, 2007 г)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе, 2 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК, 1 статья в зарубежном журнале и 6 кратких сообщений в материалах конференций

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, 3 глав обзора литературы, 2 глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, приложения и списка цитированной литературы (56 отечественных и 139 зарубежных источников) Общий объем работы составляет 135 страниц машинописного текста Работа иллюстрирована 10 таблицами и 22 рисунками

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Вирус: использовали цитопатогенный вариант ВГС, штамм Д-1, идентифицированный как генотип Ib, выделенный из сыворотки крови больной хроническим вирусным гепатитом С методом заражения первичных культур клеток головного мозга новорожденных мышей [Дерябин П Г, Львов Д К, Исаева ЕИ, Вязов СО, 1999] Вирус гепатита С после титрования на культурах клеток СПЭВ использовали в дозе 100 ТЦД50 (тканевая цитотоксическая доза, вызывающая изменения в 50% монослоя тканевой культуры)

Лабораторные животные: в работе использовали взрослых белых беспородных мышей массой 18-20 г Перед началом эксперимента животных

подвергали 10-дневному карантину Работу проводили согласно инструкциям по работе с лабораторными животными [Санитарные Правила по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев) № 1045-73 от 06 04 1973] 200 взрослых мышей распределяли в группы по 10 животных, заражали внутривенным способом вируссодержащей жидкостью по 0,2 мл и наблюдали в течение 3 месяцев в динамике

Определение инфекционной активности ВГС в пробах органов и тканей зараженных животных: суспензии органов животных предварительно центрифугировали в течение 10 минут при скорости 2000 оборотов/минуту, затем - в течение 20 минут при скорости 12000 оборотов/минуту, в исследованиях использовали надосадочную жидкость, хранили при -70° С Титрование суспензий, приготовленных из компонентов крови и тканей внутренних органов ВГС-инфицированных мышей, проводили на перевиваемой культуре клеток СПЭВ или первично-трипсинизированной культуре ФЭК, используя двукратные разведения исследуемого материала с 1 10 до 1 5120 и регистрируя цитопатическое действие (ЦПД) вируса на 6-8 дни после инфекции Инфекционный титр вируса рассчитывали по методу Рида и Менча

Морфологическое исследование печени: печень от трех инфицированных и двух неинфицированных мышей фиксировали в 10% нейтральном формалине в течение 18 часов и заливали в парафин Гистологическое исследование каждого из исследуемых образцов было проведено под руководством профессора Н Т Райхлина в Российском Онкологическом Научном Центре (РОНЦ) им Н Н Блохина РАМН Из каждого парафинового блока готовили по 10 срезов толщиной 8-10 микрон, которые окрашивали гематоксилин-эозином Просматривали и фотографировали в микроскопе «Поливар» (Австрия) Для оценки тяжести поражения печени инфицированных мышей использовали индексы гистологической активности (ИГА) [Кпос1еШ1 С , 1981, Серов В В , 1996]

Обратно-транскриптазная полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР): выделение позитивной (геномной) РНК ВГС из исследуемых образцов

проводили, используя "гуанидин-изотиоционат-фенол-хлороформенный" метод [Chomczynski Р, 1987] Синтез кДНК проводили с использованием ВГС-специфических антисмысловых праймеров #194 [Okamoto Н, 1990] и обратной транскриптазы (Promega) в описанных ранее условиях [Viazov S, 1994 ] Амплификацию геномных РНК-специфических последовательностей ВГС проводили с использованием праймеров, полученных к 5'-нетранслируемой консервативной области и к области гена, кодирующего нуклеокапсидный белок (С-область генома ВГС) [Nakajima N, 1996 , Viazov S , 1994] Продукты амплификации подвергали электрофоретическому анализу в 2% агарозном геле для обнаружения в ультрафиолетовом свете при длине волны 254 нм полосы, специфичной для ВГС, которая служила доказательством наличия РНК ВГС

Реакция гемагглютинации (РГА): выполняли в соответствии с методом Clarke and Casals (1958) в микромодификации [Гайдамович СЯ, 1982] Вируссодержащий материал (надосадочная жидкость, полученная из суспензии тканей органов, эритроцитарные, лимфоцитарные фракции или сыворотки крови после центрифугирования при 1500 оборотов/минуту) разводили боратным буферным раствором, содержащим 0,4% бычьего альбумина (рН -9,0), используя 2-кратные разведения начиная с 1 10 до 1 5120

Иммуноферментный анализ (ИФА) для определения антигенов ВГС:

исследуемые суспензии тканей органов, эритроцитарные, лимфоцитарные фракции или сыворотки крови мышей иммобилизировали на разборных полистироловых плоскодонных планшетах фирмы «Медполимер» (Россия) в концентрации 5-10 мкг/мл в течение 24 ч при комнатной температуре Последующие этапы выполняли по обычной методике [Tkachenko Е А , 1989] в микромодификации Результаты реакции учитывали по величине оптической плотности (ОП), измеряемой на фотометре "Униплан" Россия при длине волны 492 нм

Для выявления разных типов антител к ВГС в сыворотках крови мышей применяли следующие серологические методы реакцию биологической

7

нейтрализации (РБН) на 96-луночных микропанелях производство "Со star" и "Linbro" в перевиваемой культуре клеток СПЭВ [Sullivan EJ, 1967, Львов Д К, Гайдамович С Я, 1991], реакцию торможения гемагглютинации (РТГА) в микромодификации на 96-луночных микропанелях [Clarke and Casals, 1958], реакцию связывания комплемента (РСК) по стандартной методике [Львов Д К, Гайдамович СЯ, 1991] IgG к вирусным белкам «core», NS3, NS4 и NS5, а также «суммарные», выявляли в сыворотках крови мышей с помощью иммуноферментных тест-систем производства «Вектор-Бест» (Новосибирск) в соответствии с прилагаемыми инструкциями с заменой конъюгата против IgG человека на конъюгат против IgG мыши производства «Sigma» в рекомендуемом рабочем разведении В РБН, РТГА, РСК и в ИФА (на IgG «суммарные») сыворотки крови мышей разводили двухкратно cl 10 до 1 1280, в РСК - с 1 10 до 1 160, в ИФА (на IgG к вирусным белкам) - 1 5

Статистический анализ: оценку существенности различий относительных показателей проводили с использованием следующих параметров средних геометрических титров, средних ошибок вычисляемых относительных показателей, средних квадратичных отклонений, t-критерия Стьюдента Степень корреляции результатов ОТ-ПЦР и ИФА оценивали с помощью коэффициента сопряженности Брависа (Bravis) Значимость (определение вероятности) коэффициента корреляции оценивали по ^ -критерию Пирсона [Поляков И В , Соколова H С , 1975, Реброва О Ю , 2006]

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Способность цитопатогенного варианта ВГС индуцировать персистентную инфекцию у мышей

Внутривенное введение взрослым беспородным белым мышам штамма «Д-1» ВГС в дозе 100 ТЦД50 объеме 0,2 мл сопровождалось развитием персистентной нелетальной ВГС-инфекции В течение всего срока наблюдения (12 недель) в сыворотке крови, в тканях селезенки, лимфоузлов, печени и головного мозга мышей обнаруживали РНК ВГС методом ОТ-ПЦР, гемагглютинины в РГА, антигены в ИФА Полученные результаты свидетельствовали о создании новой экспериментальной модели ВГС-инфекции in vivo

Выявление РНК ВГС в ОТ ПЦР и антигенов ВГС в ИФА в органах и тканях мышей, инфицированных цитопатогенным вариантом ВГС

РНК ВГС в ОТ-ПЦР, гемагглютинины вируса в РГА и антигены ВГС, выявляемые в ИФА, определялись в течение всего срока наблюдения (2-12 недели от момента заражения) в сыворотке крови, в тканях селезенки, лимфоузлов, печени и головного мозга В ткани лимфоузлов только на 2 неделе наблюдения был зафиксирован отрицательный результат ИФА на антиген вируса Данные ОТ-ПЦР и ИФА статистически значимо (р<0,01) совпадали в 97,5 % случаев с сильной прямолинейной корреляционной связью (г=0,93) В эритроцитах и лимфоцитах через 8-12 недель после заражения также обнаруживали РНК в ОТ-ПЦР, специфические гемагглютинины в РГА и антиген вируса в ИФА То есть, в течение всего срока наблюдения (12 недель) была выявлена постоянная персистенция и накопление вируса в тканях печени, лимфоузлов, селезенки и головного мозга, которые свидетельствовали о выраженных пантропных свойствах вируса В тканях почек, сердца и легких РНК ВГС в ПЦР и антиген вируса методом ИФА через 8, 10, 12 недель от

момента инфицирования цитопатогенным вариантом В ГС не выявлялись (рис.1).

Рисунок I. Определение РНК ВГС методом ОТ-ПЦР в сыворотке крови и в тканях органов мышей через 12 недель после инфицирования цитопатогенным вариантом вируса гепатита С

12345 6 78 9 10 11

Примечание:

1 - сыворотка крови незаряженной мыши (отрицательный контроль);

2 — ткани печени незаряженной мыши (отрицательный контроль);

3 — 5 — ткани почек, сердца и легких ВГС-ияфицировапной мыши; 6 — 9 - образцы органов ВГС-инфицированной мыши:

6 - печени,

7 - головного мозга,

8 - селезенки,

9 - лимфоузлов;

10 - сыворотка кр-ови ВГС-инфицированной мыши;

11 - сыворотка крови человека, содержащая Р1ГК ВГС (положительный контроль).

Динамика инфекционной и гемагглютинирующей активностей цитопатогенного варианта ВГС в крови и тканях внутренних органов мышей, инфицированных цнтопатогенным вариантом ВГС

Инфекционная активность вируса в лимфоузлах и в селезенке через 2 недели после заражения по сравнению с уровнем инфекционных титров ВГС в печени и головном мозге животных была статистически значимо (р<0,01) выше в 2-2,6 раза (табл 1) Этот факт наглядно продемонстрировал, что при наиболее распространенном пути передачи вируса - парентеральном, ВГС, в первую очередь, локализовался и накапливался в лимфоузлах, и, в меньшей степени, в селезенке Через 3 недели от момента заражения концентрация вируса в лимфоузлах незначительно снижалась (р<0,05), оставалась на прежнем уровне в селезенке, но увеличивалась в 2-2,5 раза в печени и в головном мозге (р<0,01) Размеры селезенки у инфицированных животных в сравнении с незараженными мышами через 2 недели от момента заражения были статистически значимо (р<0,05) увеличены в 2 раза, а размеры печени были практически в норме То есть, в начальный период экспериментальной ВГС-инфекции происходила активная диссеминация ВГС из лимфотропных органов животных в другие органы-мишени, в том числе, и через гематоэнцефалический барьер в центральную нервную систему

Поражения нервной ткани у людей (периферических нервов и центральной нервной системы) были описаны в некоторых публикациях как клинические проявления ВГС или сопутствующие заболевания [МсАпс1ге\У8 М Р, 2005, Сарога1е С М, 2006] В нашей работе нейротропные свойства ВГС были продемонстрированы обнаружением его РНК, инфекционной и гемагглютинирующей активностей в тканях головного мозга после внутривенного введения вируса Инфекционная активность ВГС в тканях головного мозга колебалась в зависимости от срока инфекции и составляла от 2,6 до 12,0 1о^2 ТЦД50/мл, а гемагглютинирующая - от 3,9 до 9,7 (табл 1, 2) Это подтверждало предположение других авторов, что, вероятно, у людей при ВГС-инфекции могут быть следующие фазы патогенеза во-первых,

проникновение ВГС через гематоэнцефалический барьер в головной мозг со спинномозговой жидкостью и (или) с мононуклеарными клетками периферической крови и, во-вторых, последующая репродукция вируса в головном мозге [Laskus Т , 2002]

Полученные результаты об инфицированности ВГС лимфоцитов при обследовании через 8-12 недель от момента заражения (табл 1, 2) согласуются с сообщениями о репликации ВГС не только в клетках печени, но и в моноцитах, Т-лимфоцитах и B-лимфоцитах [Bouffard Р, 1992, Muller HM, 1993, Zignego А L , 1992, Kato N , 2004, 2006]

При моделировании ВГС-инфекции у мышей было наглядно продемонстрировано накопление ВГС и в эритроцитах С 8 по 12 недели от момента заражения показатели инфекционной и гемагглютинирующей активностей ВГС в эритроцитах статистически значимо увеличились (табл 1,2)

Таблица 1 Инфекционная активность ВГС в крови (сыворотке, лимфоцитах и эритроцитах) и внутренних органах мышей, инфицированных цитопатогенным вариантом вируса

Исследуемые образцы Недели от момента заражения животных

2 неделя 3 неделя 8 неделя 10 неделя 12 неделя

Х±а ТЩЬо/мл Уровни значимости отличий показателей на 2 и 3 неделях* Х±а ТЦДзо/мл Уровни значимости отличий показателей на 3 и 8 неделях Х±а ТЦЦ50/МЛ Уровни значимости отличий показателей на 8 и 10 неделях Х±а ТЦД50/МЛ Уровни значимости отличий показателей на 10 и 12 неделях Х±о 10§2 ТЦД50/МЛ Уровни значимости отличий показателей на 2 и 12 неделях

Сыворотка крови 5,62±2,4 р<0,01 2,14±2,1 р<0,01 8,70±0,9 р<0,05 10,0±1,2 р<0,01 12,0±0,3 р<0,01

Лимфоциты н д н д 7,50±1,5 р>0,317 8,0±0,9 р>0,317 8,20±2,1 р>0,317

Эритроциты н д н д 11,3±0,9 р>0,317 10,90±0,6 р<0,01 12,0±0,3 р<0,1

Лимфоузлы 6,46±1,2 р<0,05 5,30±0,9 р<0,01 10,0±0,3 р<0,05 9,30±0,9 р<0,05 10,50±1,2 р<0,01

Селезенка 5,48±1,5 р>0,1 5,32±2,4 р<0,01 12,0±0,5 р>0,317 12,0±0,3 р>0,317 12,0±0,3 р<0,01

Печень 2,48±1,2 р<0,01 6,08±0,9 р<0,01 12,0±1,2 р>0,317 12,0±0,3 р>0,317 12,0±0,9 р<0,01

Головной мозг 2,60±0,9 р<0,01 4,80±0,6 р<0,01 11,0±0,9 р>0,317 10,6±1,2 р<0,01 12,0±0,3 р<0,01

Почки н д н д 4,0±0,9 р>0,317 4,7±1,5 р>0,317 5,3±1,2 р<0,05

Сердце н д н д 4,0±0,9 р>0,317 3,1±0,5 р>0,317 3,0±2,4 р>0,317

Легкие н д н д 3,9±0,9 р>0,317 3,0±1,8 р>0,317 3,0±2,4 р>0,317

Примечание X - средние геометрические титров представлены обратными ветичинами, о - среднее квадратичное отклонение, * - оценку существенности различий относительных показателей проводили по формуле 1= хгх: / V пи+пъ, уровни значимости <0,01 соответствуют вероятности различий не менее 99%, <0,05 - не менее 95%, <0,1 - не менее 90%, >0,1 - менее 90%, но более 68,3%, >0,317 - значимость различий показателей не установлена

Таблица 2 Гемагглютииирующая активность ВГС в крови (сыворотке, лимфоцитах и эритроцитах) и внутренних органах мышей, инфицированных цитопатогенным вариантом вируса

Исследуемые образцы Недели от момента заражения животных

2 неделя 3 неделя 8 неделя 10 неделя 12 неделя

Х±а log2 Уровни значимости отличий показателей на 2 и 3 неделях* Х±о Iog2 Уровни значимости отличий показателей на 3 и 8 неделях Х±а log2 Уровни значимости отличий показателей на 8 и 10 неделях Х±о l0g2 Уровни значимости отличий показателей на 10 и 12 неделях Х±а log2 Уровни значимости отличий показателей на 2 и 12 неделях

Сыворотка крови 3,42±0,6 р>0,317 3,99±2,4 р>0,317 4,59±062 р<0,05 5,78±1,2 р<0,01 7,71±0,6 р<0,01

Лимфоциты н д н д 4,22±1,1 р>0,317 4,49±0,3 р>0,317 5,12±1,1 р>0,1

Эритроциты н д н д 6,75±0,4 р<0,05 7,71±1,2 р>0,317 7,78±0,5 р<0,05

Лимфоузлы 7,24±0,6 р<0,01 6,15±0,5 р<0,01 9,50±1,2 Р<0Д 8,51±0,75 р<0,01 9,47±0,3 р<0,01

Селезенка 2,26±0,3 р<0,01 5,78±0,3 р<0,05 б,75±1,1 р>0,317 6,75±0,9 р<0,01 9,70±0,4 р<0,01

Печень 7,14±0 4 р<0,01 5,91±0,4 р<0,01 7,31±0,3 р<0,01 9,27±0,5 р<0,05 9,7±0,3 р<0,01

Головной мозг 3,42±0,3 р>0,317 3,99±2,4 р<0,01 9,74±0,6 р<0,02 8,61±0,9 р<0,05 9,34±0,2 р<0,01

Почки н д н д 6,75±1,8 р<0,05 8,51 ±0,9 р>0,317 8,84±0,7 р<0,02

Сердце н д н д 6,31 ±0,3 р<0,01 7,84±0,4 р>0,317 7,78±0,4 р<0,01

Легкие н д н д 5,48±1,4 р>0,317 6,31±1,1 р>0,317 6,31±1,6 р>0,317

Примечание X - средние геометрические титров представлены обратными величинами, а - среднее квадратичное отклонение, * - оценку существенности различий относительных показателей проводили по формуле t= Х1-Х2 / V Ш|+Ш2, уровни значимости <0,01 соответствуют вероятности различий не менее 99%, <0,02 - не менее 98%, <0,05 - не менее 95%, <0,1 - не менее 90%, >0,1 - менее 90%, но больше 68,3%, >0,317 -значимость различий показателей

Как клинические проявления ВГС или сопутствующие заболевания у людей были описаны мембранорродиферативный гломерулонефрит [Маянский А Н , 2004] и летальная кардио'миопатия [Condat В , 2006] При исследовании проб тканей почек, легких и сердца инфицированных мышей нам удалось показать, что инфекционная активность ВГС в тканях почек, легких и сердца была в значительной степени слабее, чем в других органах, и составляла 3,0-5,3 log2 ТЦД50/мл При этом в тканях почек инфекционные титры вируса повысились за 4 недели на 1,3 log2 (р<0,05), а в сердце и легких - сохранялись на одном уровне Гемагглютинины в этих органах через 8 недель после заражения были обнаружены на уровне 5,5-6,8 log2, а к концу 12 недели инфекции - на уровне 6,3-8,8 log2, и статистически значимо свидетельствовали о нарастании инфекционного процесса в этих органах (табл 1, 2) РНК ВГС и антиген вируса не обнаруживались в тканях почек, легких и сердца через 8, 10 и 12 недель после заражения, что может быть связано с подпороговым (для ОТ-ПЦР и ИФА) количеством вируса в этих органах

Таким образом, с 8 по 12 недели после заражения мышей цитопатогенным вариантом ВГС уровень инфекционных титров вируса постоянно сохранялся на высоком уровне (11-12 log2 ТЦД50/МЛ) в тканях печени, головном мозге и селезенке, косвенно свидетельствуя о доминантном поражении вирусом именно этих органов Это предположение подтверждалось и статистически значимым увеличением размеров печени (в 2-2,5 раза) и селезенки (в 3-4,5 раза) у мышей на 8-12 неделях после заражения в сравнении с незараженными животными (р<0,05) Высокие показатели инфекционной и антигенной активностей ВГС в печени, селезенке, лимфоузлах, лимфоцитах, эритроцитах, головном мозге и, в меньшей степени, в почках, легких и сердце ВГС-инфицированных мышей, вполне согласуются с данными о типичных печеночных и нетипичных внепеченочных клинических проявлениях вирусного гепатита С у людей, который, в этой связи, рекомендуется рассматривать как мультисистемное заболевание [Mondelli М , 1996, Alter Н J , 1996, Маянский А Н , 2004, Caporale С М , 2006, Condat В , 2006]

Патоморфологическое исследование тканей печени при моделировании ВГС-инфекции

В совместных исследованиях с лабораторией гистохимии и электронной микроскопии (РОНЦ им Н Н Блохина РАМН) под руководством профессора Н Т Райхлина были проведены гистологические исследования тканей печени у трех мышей через 8 недель после заражения изолированным вариантом ВГС, которые иллюстрировали возможности и значение моделирования ВГС-инфекции на взрослых мышах для дальнейшей углубленной оценки патоморфологических нарушений в печени в динамике и условий возникновения неопластических процессов В качестве контроля были исследованы ткани печени двух неинфицированных мышей, имевших обычное строение (рис 2)

В тканях печени двух ВГС-инфицированных мышей наблюдалось образование воспалительных инфильтратов, состоящих главным образом из лимфоидных клеток Чаще инфильтраты были мелкими, чем крупными Часть инфильтратов локализовались в портальной зоне, другие, разрушая портальную границу, проникали в перипортальную зону (рис 3) Некоторые инфильтраты обнаруживались непосредственно в паренхиме дольки печени, располагаясь среди гепатоцитов В некоторых инфильтратах выявлялись некрозы отдельных гепатоцитов Некрозы отдельных гепатоцитов иногда были видны и вне инфильтратов В печени обеих мышей встречались очаговая зернистая жировая дистрофия гепатоцитов и местами, дискомплексация печеночных балок Склероз и полнокровие печеночной ткани не были выражены Сосуды, синусоидные образования чаще были пустыми, реже содержали кровь Только у одного животного в единичных участках был обнаружен некробиоз печеночной ткани В печени третьей мыши была выявлена другая картина патоморфологических изменений, характеризующаяся мелким единичным портальным инфильтратом, состоящим из 8-10 лимфоидных клеток, и выраженной мелко- и крупнокапельной жировая дистрофия гепатоцитах, имеющей очаговый характер Местами отмечалась дискомплексация балок,

Рисунок 2. Печень здоровой нсипфжшровапной мыши (имеет обычное дольчатое строение; видна центральная вена, балки, состоящие из генатоцигов; внизу портальная зона - портальная вена, артерия и желчный каналец). Увеличение X100.

Рисунок 3. Крупный пери порта л т.иый клеточный инфильтрат. Увеличение X 200.

расширение синусоидных пространств Строма не была выражена Кровеносные сосуды были, преимущественно, пустыми

Наблюдаемые поражения тканей печени, подобные патоморфологическим изменениям при хроническом гепатите С у людей [Соринсон С Н, 1996], свидетельствовали о целесообразности использовании моделей ВГС-инфекции in vivo для дальнейшего углубленного изучения патоморфологических нарушений в печени в динамике и для выявления условий возникновения неопластических процессов при персистентной ВГС-инфекции

Закономерности специфического антителообразования и спектр антител при экспериментальной инфекции у взрослых беспородных белых мышей, индуцированной цитопатогенным вариантом ВГС

При изучении закономерностей специфического антителообразования при моделировании персистентной ВГС-инфекции т vivo было установлено, что у мышей продуцировались в постепенно нарастающих титрах разные типы антител (АТ) к ВГС антигемагтлютинины (АГА), IgG, вируснейтрализующие и комплементсвязывающие антитела (табл 3)

Спектр индуцируемых иммуноглобулинов класса «G» к структурным и неструктурным белкам вируса был следующим АТ к нуклеокапсидному белку или анти-«соге», airm-NS3, aHra-NS4 и анти-NSS (табл 4) С 13 дня эксперимента и до конца срока наблюдения (120 дней) в сыворотках крови мышей обнаруживались антитела к нуклеокапсидному белку ВГС С 18 дня от момента заражения были выявлены антитела к неструктурному белку вируса NS3 Антитела к неструктурным белкам ВГС NS4 и NS5 начали определяться в более поздние сроки с момента заражения соответственно на 30 и 100 дни наблюдения

Таблица 3 Динамика выявления специфических антител и инфекционная активность ВГС в сыворотках крови мышей при моделировании ВГС-инфекции

Дни после заражения Инфекционная Титры антител к ВГС в реакциях

активность ВГС (10Й2>*

(1о82ТЦД50/мл)* РБН РТГА ИФА РСК

3 н д н д - - -

6 н д Н д - - -

10 4,9 н д - - -

13 5,6 6,0 4,32 - -

18 2,2 6,0 6,32 5,32 -

22 2,8 8,0 7,32 6,32 -

30 4,3 н д 7,32 6,32 -

60 8,7 н д 8,32 6,32 5,32

100 12,0 Н д 8,32 7,32 6,32

120 12,0 9,0 7,32 6,32 5,32

Примечание *- титры представлены обратными величинами (средние геометрические титров не вычислялись, так как в каждой реакции исследовался пул из сывороток), н д - нет данных, «-» - отрицательный результат

Таблица 4 Спектр антител к структурным и неструктурным белкам ВГС в сыворотках крови мышей при моделировании ВГС-инфекции

Дни после заражения Антитела к структурным и неструктурным белкам ВГС*

Соге N8 3 N8 4 N8 5

3 - - - -

6 - - - -

10 - - - -

13 + - - -

18 + + - -

22 + + - -

30 + + + -

60 + + + -

100 + + + +

120 + + + +

Примечание * - сыворотки крови мышей использовались в одном разведении (1 5), «-» - отрицательный результат, «+» - положительный результат

АГА, вируснейтрализующие антитела, анти-«соге» и анти-ШЗ выявлялись с 13-18 дня от момента заражения и до конца срока наблюдения (120 дней), а анти-К'БД, анти-МБб и комплементсвязывающие антитела обнаруживались позднее - с 30-100 дня Одновременное обнаружение анти-«соге», анти-ЫБЗ и анти-Ы85 другие исследователи считали показателем активной репликации вируса при вирусном гепатите С у людей [Маянский А Н , 2004, Жердева А И , 2005]

Также нами было обнаружено, что ВГС с высокой инфекционной и гемагглютинирующей активностями циркулировал в сыворотках крови мышей одновременно с разными видами специфических антител (табл 1-4) Параллельная персистенция вируса и антител характерна и для людей больных острым или хроническим гепатитом С [УоБ^кига Н, 1996] Иммунный ответ при ВГС-инфекции характеризуют как «субоптимальный», не обеспечивающий контроль над инфекционным процессом [1псЬаир8е О , 1996, Масу Е , 1997]

ПЦР, определение инфекционной активности вируса и РБН для выявления вируснейтрализующих антител являются высокоспецифичными тестами При обследовании сывороток крови ВГС-инфицированных мышей на специфические антигены и антитела результаты вышеперечисленных методов практически полностью коррелировали с результатами РГА, РТГА и ИФА Что касается реакции связывания комплемента, то она является классическим качественным подтверждающим тестом, но отличается значительной методической сложностью и необходимостью проводить обследование парных сывороток крови не ранее, чем через 8-9 недель от момента заражения Однако, принимая во внимание тот факт, что при моделировании ВГС-инфекции т v/vo комплементсвязывающие антитела были выявлены на 30 дней позже анти-М84 и на 40 дней раньше анти-Ы85 (обнаружение которых по данным и других авторов свидетельствует о длительности инфекционного процесса и коррелирует со степенью поражения печени), можно предположить, что обнаружение специфических комплементсвязывающих антител у ВГС-

инфицированных людей, вероятно, будет является показателем хронизации инфекционного процесса

Таким образом, моделирование инфекции у беспородных взрослых белых мышей, индуцированной цитопатогенным вариантом ВГС, можно использовать для скрининга противовирусных препаратов, а также для углубленного изучения патоморфологических изменений в печени и патогенеза вирусного гепатита С Цитопатогенный вариант ВГС, индуцирующий у мышей вирусоспецифические антитела различных классов, в том числе, вируснейтрализующие, может быть использован для получения высокоактивных поликлональных и моноклональных антител Оптимальными параметрами, способными оценить протективные свойства разрабатываемых вакцин, может служить определение вируснейтрализующих антител в сыворотках крови иммунизированных мышей Определение антигенов, РНК ВГС, инфекционной и гемагглютинирующей активностей вируса в сыворотках крови, в печени и в головном мозге мышей, зараженных после иммунизации, также будет необходимо для оценки протективных свойств вакцины против гепатита С

выводы

1 Впервые получена экспериментальная модель инфекции, вызванная высокопродуктивным для культур клеток вариантом вируса гепатита С (ВГС), в организме взрослых белых мышей

2 Выявлены основные маркеры при экспериментальной инфекции у мышей, позволяющие регистрировать ВГС-инфекцию и оценивать ее особенности в организме животных, а именно наличие РНК ВГС, антигенов ВГС, инфекционного для культур клеток вируса в органах и тканях мышей и вирусспецифических антител в сыворотках крови зараженных животных

3 Установлено, что инфекция, вызванная ВГС в организме лабораторных животных, характеризуется пантропными (в том числе, гепато -, лимфо нейротропными) свойствами возбудителя геном вируса, его антигены и инфекционная активность ВГС обнаруживались в печени, лимфатических узлах, селезенке, в тканях головного мозга на всем протяжении наблюдения

4 Длительное наблюдение за изменением параметров инфекции, вызванной ВГС у мышей, позволило показать, что вирус способен вызывать у этих животных персистентную инфекцию, характеризующуюся медленно прогрессирующим течением

5 Показано, что для диагностики ВГС-инфекции у мышей, кроме традиционных методов (ИФА и ОТ ПЦР), могут быть успешно использованы РГА и РТТА, РСК и РБН

6 Экспериментальная модель инфекции, вызванная ВГС in vivo, может быть использована для изучения основных параметров взаимодействия вируса и клетки на уровне организма, для скрининга противовирусных препаратов, для оценки протективных свойств разрабатываемых вакцин и других иммунобиологических препаратов

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1 Deryabin Р G , Isaeva Е I, Viazov S О , Sukhno A S and Lvov D К Identification of highly productive cytopathogemc hepatitis С virus variants // 10th International Symposium on Viral Hepatitis and Liver Diseases - Atlanta, USA -2000 -P 145

2 Дерябин П Г, Исаева E И , Гренкова Е П , Сухно А С Цитопатогенные варианты вируса гепатита С (ВГС), пригодные для разработки вакцины // Аллергия, астма и клиническая иммунология -2001 -№ 1 -С 28-30

3 Дерябин П Г, Исаева Е.И , Сухно А С , Львов Д К Патогенность изолированных вариантов вируса гепатита С (ВГС) для мышей И Материалы VIII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов Т 3 - Москва -2002 - С 18

4 Дерябин П Г , Исаева Е И , Сухно А С , Львов Д К Гемагглютинирующая активность вируса гепатита С (ВГС) // Материалы VIII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов Т 3 - Москва - 2002 - С 27

5 Дерябин П Г , Исаева Е И , Иноземцев А К , Ботиков А Г , Сухно А С Разработка культуральной инактивированной вакцины против гепатита С // Материалы VI Всероссийской научно-практической конференции «Вирусные гепатиты - проблемы эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики» - Москва -2005 -С 80-81

6 Сухно А С, Дерябин П Г, Исаева Е И , Райхлин H Т Изучение патогенеза и патоморфологических изменений в печени на модели вирусного гепатита С in vivo II Вестник КазНУ Серия биологическая -Алматы - 2007 -№2(32) - С 133-135

7 Сухно А С , Дерябин П Г , Исаева Е И Особенности патогенеза при экспериментальной инфекции, вызванной цитопатогенным вирусом гепатита С (ВГС) // Материалы юбилейной научной конференции, посвященной 175-летию со дня рождения СП Боткина / «Военно-медицинская академия им С M Кирова» — Санкт-Петербург - 2007 -С 292-293

8 Сухно А С, Райхлин H Т, Дерябин П Г, Исаева Е И Патоморфологические изменения в печени при экспериментальном вирусном гепатите С // Материалы юбилейной научной конференции, посвященной 175-летию со дня рождения С П Боткина / «Военно-медицинская академия им С M Кирова» — Санкт-Петербург - 2007 -С 293-294

9 Сухно А С , Исаева Е И , Дерябин П Г Перспективы изучения патогенеза вирусного гепатита С // Здоровье населения и среда обитания - 2007 - № 9(174) - С 42-47

Заказ № 152/10/07 Подписано в печать 11 10 2007 Тираж 100 экз Уел пл 1,5

ООО "Цифровичок", тел (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 1 >,, N www cfr ru , e-mail info@cfr ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сухно, Анатолий Сергеевич

Список сокращений

Введение 6 ЧАСТЬ I. Литературный обзор

ГЛАВА 1. Краткая характеристика вируса гепатита С и особенности географического распространения его генотипов

1.1. Краткая характеристика возбудителя и его генотипов

1.2. Географическое распространение ВГС и его генотипов

ГЛАВА 2. Особенности патогенеза и иммунитета при вирусном гепатите

2.1. Клиническая характеристика острой и хронической инфекции гепатита С

2.2. Патоморфологические изменения в печени при вирусном гепатите С

2.3. Пантропные свойства ВГС

2.4. Гуморальный и клеточный иммунитет при вирусном гепатите С

2.5. Лабораторная диагностика гепатита С

2.6. Профилактика и лечение гепатита С

ГЛАВА 3. Моделирование экспериментальной инфекции, вызванной

ВГС в культурах клеток и в организме лабораторных животных

3.1. Моделирование ВГС-инфекции в культурах клеток.

3.2. Моделирование ВГС-инфекции в организме лабораторных животных 48 ЧАСТЬ 2. Собственные исследования

Глава 1. Материалы и методы

1.1. Вирус

1.2. Подготовка ВГС-содержащей культуральной жидкости для моделирования персистентной ВГС-инфекции у мышей

1.3. Лабораторные животные

1.4. Выделение лимфоцитов

1.5. Выделение эритроцитов

1.6. Морфологические исследования печени

1.7. Определение инфекционной активности ВГС в пробах органов и тканей зараженных животных

1.8. Полимеразная цепная реакция

1.9. Реакция гемагглютинации

1.10. Иммуноферментный анализ для выявления антигенов

1.11. Методы определения антител к ВГС

1.11.1. Реакция биологической нейтрализации

1.11.2. Реакция торможения гемагглютинации

1.11.3. ИФА для определения специфических IgG

1.11.4. Реакция связывания комплемента

1.12. Статистические методы

Глава 2. Результаты.

Способность цитопатогенного варианта ВГС индуцировать персистентную инфекцию у мышей

2.1. Выявление геномной РНК ВГС в ОТ-ПЦР и антигенов ВГС в ИФА в органах и тканях мышей, инфицированных цитопатогенным вариантом ВГС

2.2 Динамика показателей инфекционной и гемагглютинирующей (ГА) активностей вируса в крови и в органах мышей, инфицированных ВГС

2.2.1. Инфекционная и ГА активности цитопатогенного варианта ВГС в сыворотке крови, эритроцитах и лимфоцитах зараженных мышей

2.2.2. Инфекционная и ГА активности цитопатогенного варианта ВГС в тканях печени зараженных мышей

2.2.3. Инфекционная и ГА активности цитопатогенного варианта ВГС в тканях лимфатических узлов зараженных мышей

2.2.4. Инфекционная и ГА активности цитопатогенного варианта ВГС в тканях селезенки зараженных мышей

2.2.5. Инфекционная и ГА активности цитопатогенного варианта ВГС в тканях головного мозга зараженных мышей

2.2.6. Инфекционная и ГА активности цитопатогенного варианта ВГС в тканях почек зараженных мышей

2.2.7. Инфекционная и ГА активности цитопатогенного варианта ВГС в тканях сердца зараженных мышей

2.2.8. Инфекционная и ГА активности цитопатогенного варианта ВГС в тканях легких зараженных мышей

2.3. Динамика гепатоспленомегалии

2.4. Патоморфологическое исследование тканей печени при моделировании ВГС-инфекции у взрослых беспородных мышей

2.5. Закономерности специфического антителообразования при экспериментальной инфекции у взрослых беспородных белых мышей, индуцированной цитопатогенным вариантом ВГС 92 2.5.1 Выявление вируснейтрализующих, комплементсвязывающих антител, антигемагглютининов и IgG к ВГС 92 2.5.2. Спектр IgG к белкам ВГС при экспериментальной ВГС-инфекции у взрослых беспородных белых мышей

Обсуждение результатов

Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Моделирование инфекции, вызванной вирусом гепатита C, у мышей"

Актуальность проблемы

Вирусный гепатит С (ВГС-инфекция) является актуальной проблемой здравоохранения. Около 3% человеческой популяции в мире инфицировано вирусом гепатита С (ВГС). Заражение ВГС в 60-80% случаев ведет к развитию хронического гепатита, заканчивающегося в 10-20% случаев циррозом и в 1-5% - гепатоцеллюлярной карциномой. До настоящего времени не разработана эффективная вакцина для профилактики ВГС-инфекции, а лечение препаратами интерферона или интерферона в сочетании с рибавирином даёт положительный эффект лишь у 30 - 40 % больных [3].

Одной из основных проблем в создании вакцины для профилактики вирусного гепатита С и новых средств лечения инфекции было отсутствие методически простых и экономически рентабельных экспериментальных моделей продуктивной ВГС-инфекции в культурах клеток и у лабораторных животных. В 1997 году в НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН были получены доказательства способности ВГС реплицироваться в культурах клеток и в организме лабораторных животных, используя принципы культивирования вирусов семейства Flaviviridae. Также как и другие флавивирусы, цитопатогенные варианты ВГС, выделенные из крови ВГС-инфицированных людей, размножались в культурах клеток ФЭК, СПЭВ, ВНК-21, Vero после селекции в первичных клетках головного мозга сосунков беспородных белых мышей [9, 10,11].

Изучение экспериментальной ВГС-инфекции in vitro в культурах клеток различного происхождения [9, 10, 11, 64, 111, 181, 182, 187], а также in vivo у шимпанзе, древесных землероек, новорожденных беспородных белых и трансгенных мышей с трансплантированными человеческими гепатоцитами [3, 9, 10, 11, 34, 39, 57, 73, 99, 121, 126,

142, 174] позволило получить новые данные о биологических свойствах ВГС и некоторых особенностях патогенеза экспериментальной ВГС-инфекции. Высокая стоимость предложенных биомоделей ВГС-инфекции in vivo и/или сложность методических подходов ограничивали исследования в данной области, что заставляли исследователей искать альтернативные варианты моделей инфекции. Потребность в методически простых и экономически рентабельных экспериментальных моделях ВГС-инфекции у лабораторных животных продолжает оставаться очень актуальной. Такие модели необходимы для выяснения причин длительной персистенции вируса при ВГС-инфекции, для изучения протективных свойств разрабатываемых вакцин, для экспериментальной оценки противовирусной активности различных соединений на моделях ВГС-инфекции in vivo.

Таким образом, мало исследованными и исключительно важными являются вопросы изучения возможности моделирования персистентной ВГС-инфекции in vivo, органного тропизма вируса гепатита С, динамики продукции специфических антител и длительности вирусемии. Представляется актуальным разработка достоверных методов регистрации маркеров ВГС-инфекции у мышей: обнаружение РНК ВГС и определение инфекционной, гемагглютинирующей (ГА) активностей вируса, непосредственно в органах, где активно накапливается антиген, а также выявление различных видов специфических антител.

Цель и задачи работы: моделирование персистентной инфекции у взрослых мышей с использованием выделенного варианта ВГС, изучение закономерностей патологического процесса при экспериментальной ВГС-инфекции и получение доказательств способности цитопатогенного варианта ВГС размножаться в различных органах и тканях беспородных белых мышей. В соответствии со сформулированной целью были определены следующие задачи исследования:

1. Моделирование экспериментальной персистентной ВГС-инфекции у взрослых беспородных белых мышей.

2. Обследование в динамике внутренних органов и тканей животных, зараженных ВГС на наличие РНК ВГС.

3. Изучение динамики развития инфекционной, ГА и антигенной активностей ВГС в крови и тканях внутренних органах лабораторных животных при персистентной ВГС-инфекции.

4. Выявление гепатотропных, лимфотропных и нейротропных свойств цитопатогенного варианта ВГС при экспериментальной хронической инфекции у беспородных белых мышей.

5. Проведение патоморфологических исследований ткани печени мышей в условиях персистентной инфекции, вызванной ВГС.

6. Изучение динамики антителообразования при экспериментальном хроническом вирусном гепатите С у беспородных взрослых белых мышей.

Научная новизна исследований.

1. Впервые продемонстрирована возможность моделирования персистентной инфекции, вызванной вирусом гепатита С, в организме взрослых беспородных мышей.

2. Впервые обнаружена способность ВГС накапливаться в различных органах и тканях хронически инфицированных мышей.

3. Показано, что основными маркерами ВГС инфекции у мышей могут служить: РНК ВГС, инфекционная и ГА активности вируса.

4. Выявлена динамика накопления инфекционного ВГС и его антигенов в крови и тканях внутренних органов животных по мере развития и становления хронической инфекции, свидетельствующая о медленно-прогрессирующем характере инфекции у животных.

5. Впервые получены данные о способности ВГС преодолевать гематоэнцефалический барьер у животных.

6. Выявлены особенности динамики специфического антителообразования при ВГС-инфекции у мышей.

Практическая ценность исследований.

1. Полученная экспериментальная модель ВГС инфекции in vivo может быть успешно использована для проведения доклинических испытаний противовирусной активности химиопрепаратов, индукторов интерферона и других иммуномодуляторов.

2. Обнаружение способности ВГС, содержащегося в различных органах и тканях зараженных животных, агглютинировать гусиные эритроциты открывает перспективу использования РГА и РТГА для диагностики гепатита С.

3. Экспериментальная модель инфекции, вызванная ВГС в организме мышей, может быть использована для оценки способности разрабатываемых против гепатита С вакцин защищать животных от инфекции.

Основные положения выносимые на защиту.

Внутривенное введение цитопатогенного варианта вируса гепатита С взрослым беспородным белым мышам приводит к развитию персистентной инфекции с накоплением вируса в крови и тканях внутренних органов, а также к развитию в печени характерных патоморфологических изменений.

РНК ВГС, инфекционная активность вируса, специфические антигены и антитела к ним, выявленные в крови и тканях внутренних органов мышей, являются основными маркерами экспериментальной инфекции, вызванной цитопатогенным вариантом ВГС.

Апробация работы состоялась 06 июля 2006 года на совместном заседании Экспертного специализированного Совета по предварительной экспертизе диссертационных работ по медицинской вирусологии при Институте вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, отделов молекулярной вирусологии, экологии вирусов, Государственной коллекции вирусов, общей вирусологии. Основные положения диссертационной работы представлены в материалах: VIII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2002 г.), VI Всероссийской научно-практической конференции «Вирусные гепатиты - проблемы эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики» (Москва, 2005 г.), Юбилейной научной конференции, посвященной 175-летию со дня рождения С.П. Боткина (Санкт-Петербург, Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова, 2007 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе, 2 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК, 1 статья в зарубежном журнале и 6 кратких сообщений в материалах конференций.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Сухно, Анатолий Сергеевич

1. Впервые получена эксперимептальная модель инфекции,

вызванная высокопродуктивным для культур клеток вариантом

вируса гепатита С (ВГС), в организме взрослых белых мышей. 2. Выявлены основные маркеры при экспериментальной инфекции у

мышей, позволяющие регистрировать ВГС-инфекцию и оценивать ее

особенности в организме животных, а именно: наличие РНК ВГС,

антигенов ВГС, инфекционного для культур клеток вируса в органах и

тканях мышей и вирусспецифических антител в сыворотках крови

зараженных животных. 3. Установлено, что инфекция, вызванная ВГС в организме

лабораторных животных, характеризуется пантропными (в том числе,

гепато -, лимфо -, нейротропными) свойствами возбудителя: геном

вируса, его антигены и инфекционная активность ВГС обнаруживались

в печени, лимфатических узлах, селезенке, в тканях головного мозга на

всем протяжении наблюдения. 4. Длительное наблюдение за изменением параметров инфекции,

вызванной ВГС у мышей, позволило показать, что вирус способен

вызывать у этих животных персистентную инфекцию,

характеризующуюся медленно прогрессирующим течением. 5. Показано, что для диагностики ВГС-инфекции у мышей, кроме

традиционных методов (ИФА и ОТ ПНР), могут быть успешно

использованы РГА и РТТА, РСК и РБН.

6. Экспериментальная модель инфекции, вызванная ВГС ш vivo,

может быть использована для изучения основных параметров

взаимодействия вируса и клетки на уровне организма, для скрининга

противовирусных препаратов, для оценки протективных свойств

разрабатываемых вакцин и других иммунобиологических препаратов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сухно, Анатолий Сергеевич, Москва

1. Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия. М.: Медицина. 1990. 384 с.

2. Балаян М. С Полещук В. Ф. Вирусные гепатиты у приматов: экспериментальное воспроизведение и естественная инфекция Информац. бюлл. 1998. No 3-4. 3-11.

3. Балаян М.С, Михайлов М.И. Энциклопедический словарь вирусные гепатиты. М. 1999. 304 с.

4. Бушуева Н.В., Крель П.Е., Исаева Е.И., Игнатова Т.М., Некрасова Н.П. значение определения РНК и антигена печени, сыворотке хроническим и мононуклеарных гепатитом вируса клетках Клинико-патогенетическое гепатита С в ткани периферической крови больных С Росс. ж. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. 2003. N 2. 42-50.

5. Вершинина М.Ю., Дерябин Н.Г., Мезенцева М.В., Наровлянский А.Н. Нротивовирусный эффект а-интерферона и активность мРНК цитокинов в культурах клеток, инфицированных цитопатогенным вариантом вируса С Вопр. вирусол. 2003. 1. 26-30.

6. Вишневская Т.В. Маркеры вируса гепатита С в клетках и в сыворотке крови больных острым и хроническим гепатитом С Автореф. на соискание ученой степени канд. биол. наук. М. 2006. 24.

7. Выявление циркуляции арбовирусов. Методы вирусологических и серологических исследований. Клинико-эпидемиологические характеристики природных малоизученных арбовирусных инфекции. Нодходы к мониторингу очагов арбовирусов Итоги науки и техники. Сер. Вирусология (под ред. ЛьвоваД.К.). М.—1991. —Т.25. 5 0 с.

8. Гайдамович Я. Общие сведения о лабораторной диагностике вирусных инфекций Общая вирусология. М.: Медицина. —1982. Т.1. 437-447.

9. Дерябин П.Г., Исаева Е.И., Вязов CO., Львов Д.К. Летальная инфекция новорожденных мышей, вызванная вирусом гепатита С Вопр. вирусол. 1997.— №.6. —С.251-253.

10. Дерябин П.Г., Исаева Е.И., Вязов СО. и др. Хроническая инфекция культур клеток почки эмбриона свиньи, вызванная вирусом гепатита С Вопр. вирусол. 1997. }(2.6. 259-263.

11. Дерябин П.Г., Львов Д.К., Исаева Е.И., Вязов СО. Штамм Virus hepatitis С, Д-1. для приготовления диагностических и профилактических препаратов. Российский патент на изобретение Ш 2130967. 1

12. Приоритет установлен по дате 07.10.97.

13. Десмет В., Гербер М., Хуфнэгл Дж. Г. и др. Классификация хронического гепатита: Диагностика, определение степени тяжести и стадии течения Росс, жури, гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. 1995. Т. 5. №2 С38-45.

14. Дунаева Н.В., Эсауленко Е.В. Структурно-функцональная организация генома вируса гепатита С Вопр. вирусол. 2006. .№2. С10-14.

15. Ершов Ф.И., Касьянова Н.В. Новые лекарственные средства в терапии вирусных гепатитов Инфекции и антимикробная терапия. 2001. J b 1. V С17-24.

16. Жаворонок СВ., Михайлов М.И., Крысенко И.А. и др. Вирусные гепатиты В и С у лиц, пострадавших от аварии на ЧАЭС Новые направления в гепатологии: Тезисы международного Фальк Симпозиума Ш 92. С-Нетербург. —1996. 140.

17. Жердева А.И., Воронцова Г.А.,Григорьева Л.Н., Усова И. О. К вопросу о возможностях «антительной» диагностики ВГС-инфекции Тезисы докладов VI Всероссийской научно-практической конференции «Вирусные гепатиты проблемы эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики». Москва. 2005. —С110-111.

18. Игнатова Т.М., Серов В.В., Апросина З.Г. и др. Клинико-морфологическая характеристика хронического гепатита С: анализ 105 наблюдений Новые направления в гепатологии: Тезисы международного Фальк Симпозиума Ш

19. Санкт-Петербург. 1996. С160.

20. Иммуноферментный анализ /Под ред. Т. Т. Нго, Г. Ленхоффа. Москва. 1988. С 172-242.

21. Красавцев Е.Л., Жаворонок СВ., Мицура В.М., Демчило А.П. Снектр антител к разным антигенам вируса у больных хроническим гепатитом С// Микроб, эпидем. и иммунол. —2006.— №2. 57-61.

22. Круглов И.В., Знойко О.О., Огиенко О.Л. и др. Снектр антител к различным антигенам ВГС при разных вариантах течения хронической ВГС-инфекции Вонр. вирусол. 2002. 2. 11-15.

23. Лакина Е.И., Самохвалов Е.И„ Левченко О.Г. и др. Выявление позитивных (геномных) и негативных (репликативных) цепей РНК вируса гепатита С в сыворотке крови, лимфоцитах и ткани печени больных хроническим гепатитом С с помощью полимеразной цепной реакции Вопр. вирусол. 2000. N2 4. 37-41.

24. Лобзин Ю.В., Жданов К.В., Ключарева А.А. и др. Хронические гепатиты В и С: критерии диагностики и патоморфология Вирусные гепатиты: достижения и перспективы. 2003.—№2. —С.14-16.

25. Львов Д.К., Дерябин П.Г. Географическое распространение вируса гепатита С и его генотипов Вопр. вирусол. 1997. Ш.5. 196-199.

26. Львов Д.К., Миширо С, Селиванов НЛ. и др. Распространение генотипов вируса гепатита С, циркулирующих на территории Северо-Западной и Центральной частей России Вопр. вирусол. 1995. 5. 251-253.

27. Львов Д.К,, Самохвалов Е.И., Мищиро и др. Закономерности распространения вируса гепатита С и его генотипов в России и странах СНГ Вопр. вирусол. 1997. Яо 4. 157-161.

28. Масалова О. В., Абдулмеджидова А. Г., Моргунов К. В., Грищенко В., Шкурко Т. В., Лакина Е. И., Келли Е. И., Львов Д. К., Кущ А. А. Изменение

29. Масалова О.В., Речкина Е.А., Шкурко Т.В., Блохина Н.П., Вишневская Т.В., Завалишина Л.Э., Петров А.Н., Франк Г.А., Малышев Н.А., Львов Д.К., Кущ А.А. Белки вируса гепатита С в клетках печени при остром гепатите С: связь с повреждением печени и исходом заболевания Вопр. вирус. 2005. 3. 18-23.

30. Маянский А.Н., Обрядина А.П., Уланова Т.И. и др. Диагностика гепатита Нижний Новгород, НПО «Диагностические системы». 2004. 47 с.

31. Михайлов М. И., Попова О. В., Павлова И. П. и др. Маркеры инфицирования вирусом гепатита С и методы их выявления Росс. журн. гастроэнтерологии, гепатологии, колопрокгологии. 1995. 2. 21-26.

32. Момыналиев К.Т., Говорун В.М. Перспективы применения методов ДНКдиагностики в лабораторной службе Клин, лабор. диагн. 2000. Ш 4. 25-32.

33. Наровлянский А. Н., Вершинина М. Ю., Дерябин П.Г., Мезенцева М.В., Ершов Ф.И. Влияние тетрациклина на инфекционные свойства вируса гепатита С и активность мРНК цитокинов в инфицированных культурах клеток SW-13 и МТ-4 Вонр. вирусол. 2003. 1. 35-38.

34. Николаева Л.И. Новости с XI международного симнозиума по вирусу гепатита С и родственным вирусам Новости Вектор-Бест. 2005. М 2 (36).

35. Николаева Л.И., Финогенова М.П.; Шибнев В.А. Выявление антител к консенсусной последовательности первого региона белка Е2 вируса гепатита С в зависимости от фазы инфекции// Вопр. вирусол. 2006. Х2 4. 16-19.

36. Оленина Л.В., Соболев Б.Н. Тканевой тропизм вируса гепатита С Вирусные гепатиты. 1999. Ш 1. 11-17.

37. Павлов Ч.С. Гепатит С: естественное течение и подходы к терапии Клинические перспективы в гастроэнтерологии, гепатологии. 2001. 2-11.

38. Павлович А. Основы вирусологии. Минск. 2001. 117.

39. Поляков И.В., Соколова Н.С. Практическое пособие по медицинской статистике. Ленинград «Медицина». 1975. 150 с.

40. Практическая вирусология /Под ред. Штарке Г. Москва. 1970. 352 с.

41. Райхлин Н.Т. Отчет по теме о создании экспериментальной модели вирусного гепатита С и испытанием препарата для его лечения от 30.06.2003 г.

42. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Москва. 2006. —312 с.

43. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. Москва. 2000. 592 с.

44. Рязанцева А.А. Завлишина Л.Э., Маныкин А.А., Петров А.Н., Кучерова Т.Е., Франк Г.А., Клименко СМ. Детекция РНК вируса гепатита С (ВГС) у больных с хроническим гепатитом С и гепатоцеллюлярной карциномой с помощью метода ОТ-ПЦР in situ II Вопр. вирусол. 2005. J b 6. 9-14. V

45. Санитарные правила по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев) от 06.04.1973 г., 1045-73

46. Семененко Т.А. Клеточный иммунный ответ при гепатите С Вирусные гепатиты.— 2000. 1. С 10-14.

47. Серов В.В. Сравнительная морфологическая характеристика хронических вирусных гепатитов В и С Росс. журн. гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. —1999. Т. 9, 1. 36-40.

48. Скляр Л.Ф., Маркелова Е.В. Локальное содержание

49. Собчак Д.М., Корочкина О.В. Оценка показателей Т-клеточного иммунитета и медиаторов иммунного ответа у больных хроническим гепатитом С Эпидем. иинфекц. болезни. 2007. №2. 37-42.

50. Соринсон Н. Вирусные гепатиты А, В, С, D, Е, ни А-Е в клинической практике. —Санкт-Петербург: Теза.— 1996.— 420.

51. Суслов А.П., Фельдшерова А.А., Эльгорт Д.А.и др. Сравнительное исследование тест-систем для диагностики гепатитов В и С, различающихся по конструкции, включая тест-системы четвертого поколения Гепатит В, С, D и G

52. СюткинВ.Е., Лопаткина Т.Н., Попова И.В. Оценка степени 1997. морфологической активности и стадии процесса у больных хроническими заболеваниями печени, обусловленными коинфекцией вирусов гепатитов В, С и/или D// Архив патологии. 1998. 6 31-37.

53. Чешик Г, Шкурко Т.В, Знойко 0 0 Сочетанная острая HBV- и ВГСинфекция и влияние полинаркомании Новые направления в гепатологии: Тезисы международного Фальк Симпозиума J T 92. -Петербург. 1996. N» 426.

54. Шахгильдян И.В., Михайлов М.И., Онищенко Г.Г. Парентеральные вирусные гепатиты (эпидемиология, диагностика, профилактика). М. 2003. —120 с.

55. Шляхтенко Л.И. Системный подход к изучению эпидемического процесса гепатитов В и С Эпидем. и вакцинопроф. 2003. 4. 15-19.

56. Abrignani S., Hougton М., Hsu Н. Perspectives for а vaccine against hepatitis С virus Hepatology. 1999. Vol.

58. Akula S. M., Wang F. Z., Vieira J., and Chandran B. Human heфesvirus 8 interaction with target cells involves heparan sulfate Virology. 2001. V. 282. P.245-255.

59. Allander, Т., Drakenberg K., Beyene A., Rosa D., Abrignani S., Houghton M., Widell A., Grillner L., and Persson M. A. Recombinant human monoclonal antibodies against different conformational epitopes of the E2 envelope glycoprotein of hepatitis С virus that inhibit its interaction with CD81 J.Gen.Virol. 2000. V. 81. Pt. 10. —P.2451-2459.

60. Ausubel F.M., Brent R., Kingston R.E., Moore D.D., Seidman J.G., Smith J.A., Struhl K. (ed.) Short protocols in molecular biology-4* ed. By John Wiley and Sons, Inc.USA—1999.—.P.342.

61. Bacon B. R. Iron and hepatitis C. —1997. V. 41. 1. P.127-129.

62. Barban V., Fraysse-Corgier S., Paranhos-Baccala G., Petit M., Manin C Berard Y., Prince A. M., Mandrand В., and Meulien P. Identification of a human epitope in hepatitis С virus (HCV) core protein using a molecularly cloned antibody repertoire

63. Barba G., Harper F., Harada Т., Kohara M., Goulinet S., Matsuura Y., Eder G., Schaff Z., Chapman M.J., Miyamura Т., Brechot C. Hepatitis С virus core protein shows a cytoplasmic localization and associates to cellular lipid storage droplets Proc. Natl. AcadSci. 1997. V. 94. P.1200-1205,

64. Bartenschlager R., Lohmann V. Novel cellculture systems for the hepatitis С virus Antiviral Research. 2001. V. 52. P.1-17.

65. Behrens S. E., Tomei L., and De Francesco R. Identification and properties of the RNA-dependent RNA polymerase of hepatitis С virus EMBO J. 1996. V. 15. P.12-22.

66. Bendinelli M., Vatteroni M.L., Maggi F., Pistello M. Hepatitis С virus: biology, pathogenesis, epidemiology, clinical description and diagnosis Viral hepatitis: diagnosis, therapy, and prevention. Ed. By Specter S. 1999. P.65. P. 127.

67. Bertoletti A., DElios M.M., Boni C. et al. Different cytokine profiles on intrahepatic T cells in chronic hepatitis В and hepatitis С virus infection Gastroenterology. 1997. V. 112, Xo 1. P. 193-200.

68. Bertolini L., Iacovacci S., Ponzetto A. et al. The human bone-marrow-derived Bcell line CE, susceptible to hepatitis С virus infection Res. Virol. 1993. 144.-P. 281-285.

69. Booth J.C, Foster G.R., Levine T. et al. The relationship to genotype in chronic HC V infectoin. 1997. V. 17, }f2 3. P. 144-151.

70. Bouffard P., Hayashi P.H., Acovedo R. et al. Hepatitis С virus is detected in monocytomacrophage subpopulation of peripheral blood mononuclear cells of infected patients//! Infect. Dis. 1992. —V. 166. P.1276-1280.

71. Bruna-Romero 0., Lasarte J.J., Wilkinson G., Grace K., Clarke В., Borras-Cuesta F., Prieto J. Induction of Cytotoxic T-cell response against hepatitis С virus structural antigens using a defective recombinant adenovirus Hepatology. 1997. V.25. P.470-477.

72. Bruno S., Siline E., Crosignani A. et al. Hepatitis С virus genotypes and risk of hepatocellular carcinoma in cirrhosis: A prospective study Hepatology. 1997. V.25. 3 —P.754-759.

73. Bukh J. A critical role for the chimpanzee model in the study of hepatitis С Hepatology. 2004. Vol. 39, 6. P. 1469-1475.

74. Buratti E., McLain L., Tisminetzky S., Cleveland S. M., Dimmock N. J., and Baralle F. E. The neutralizing antibody response against a conserved region of human immunodeficiency virus type I gp4l (amino acid residues 731-752) is uniquely directed against a conformational epitope J Gen.Virol. 1998. V. 79. P. 2709-2716.

75. Burioni R., Plaisant P., Manzin A., Rosa D., Delli C, V, Bugli F., Solforosi L., Abrignani S., Varaldo P. E., Fadda G., and Clementi M. Dissection of human humoral immune response against hepatitis С virus E2 glycoprotein by repertoire cloning and generation of recombinant Fab fragments Hepatology. 1998. V. 28. P. 810814.

76. Cabot В., Esteban J. I., Martell M. et al. Structure of replicating hepatitis С virus (HCV) quasispecies in the liver may not be reflected by analysis of circulating HCV virions//J.Virol. —1997. —V.71. —P.1732-1734.

77. Caponi L. and Migliorini P.(ed) Antibody usage in the lab. Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg. 1999. P. 523.

78. Caporale СМ., Capasso M., Ragno M., Di Muzio A., Uncini A. Lewis-Sumner syndrome in hepatitis С virus infection: a possible pathogenetic association with therapeutic problems Muscle Nerve. 2006. 34 (1). P.I 16-121.

79. Chen M., Sallberg M., Sonnerborg A., Weiland 0., Mattisson L., Jin L., Birkett A., Peterson D., Milich D. Limited Humoral immunity in hepatitis С virus infection Gastroenterology. 1999. V.I 16. P.135-143.

80. Chen K.S., Lo S.K., Lee N. et al. Superinfection with hepatitis С virus in hemodialysis patients with hepatitis В surface antigenemia: its prevalence and clinical significance in Taiwan //Nephron. 1996. —V. 73. P.158-164.

81. Chen Y., Maguire Т., Hileman R.E., Fromm J.R., Esko J.D., Linhardt R.J., and Marks R.M. Dengue virus infectivity depends on envelope protein binding to target cell heparan sulfate Nat.Med. 1997. V. 3. P.866-871.

82. Chien D. Y., Arcangel P., Medina-Selby A., Coit D., Baumeister M., Nguyen S., George-Nascimento C, Gyenes A., Kuo G., and Valenzuela P. Use of a novel hepatitis

83. Chomezynski P., Sacchi N. Single step metod of RNA isolation by acid guanidium thiocyanate-phenol-chlorophorm extraction Analyt. Biochem. —1987. V.162. —P.156-159.

84. Choo Q. L., Kuo G., Ralston R., Weiner A., Chien D., Van Nest G., Han J., Berger K., Thudium K., and Kuo С Vaccination of chimpanzees against infection by the hepatitis С virus//Proc.Natl.Acad.Sci. 1994. —V. 91. —РЛ294-1298.

85. Choukhi A., Pillez A., Drobecq H., Sergheraert Ch., Wychowski C, Dubuisson J. characterization of aggregates of hepatitis С virus glycoproteins J.Virol. 1999. V.80. —P.3099-3107.

86. Clarke D. H., Casals J. Techniques for hemagglutination and hemagglutinationinhibition with arthropod-borne viruses.// Am. J. Trop. Med. Hyg. 1958. Vol. 7. P.561-573.

87. Clarke B. Molecular virology of hepatitis С virus J. Gen. Virol. 1997. V.78. —P.2397-2410.

88. Cleveland S. M., Jones T. D., and Dimmock N. J. Properties of a neutralizing antibody that recognizes a conformational form of epitope ERDRD in the gp41 Cterminal tail of human immunodeficiency virus type 1 J Gen.Virol. 2000. V. 81. P t 5 —P.1251-1260.

89. Condat В., Asselah Т., Zanditenas D., Estampes В., Cohen A., OToole D., Bonnet J., Ngo Y., Marcellin P., Blazquez M. Fatal cardiomyopathy associated with pegylated interferon/ribavirin in a patient with chronic hepatitis С Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 2006. 18(3). P. 287-289.

91. Immunological disorders in С virus chronic hepatitis. —Nephrol. Dial. Transplant. 1996. V.I 1. P.31-35.

92. Davis G.L., Lau J.Y., Urdea M.S., Newald P.D., Wilber J.C., Lindsay K., et al. Quantitative detection of hepatitis С virus RNA with a solid-phase signal amplification method: definition of optimal conditions for specimen collection and clinical application in interferon-treated patients Hepatology. 1993. V.19. P.13371341.

93. Deryabin P.G., Viazov S.O., Isaeva E.I.et al. Primary cultures of suckling mouse brain cells realize hepatitis С vims cytopathogenic potention 4-th AsiaPacific Congress of Medical Virology. 1997. P.45.

94. Deryabin P.G., Viazov S.O. Isaeva E.I., Samokhvalov E.I., and Lvov D.K. HCV reproduction in primary cell cultures of suckling mouse brain origion Vth Intern. Conference Current trends in Chronically Evolving Viral hepatitis, Gastroenterologie Clinique Biologique. 1 9 9 7 P 4 8

95. Deryabin P.G., Lvov D.K., Viazov S.O., Isaeva E.I., Uryvaev LV. Establishment of new in vitro and in vivo systems for the propagation of highly pathogenic hepatitis С virus (HCV) VIII International symposium on viral hepatitis, oral presentations and posters. 1998. P.57. 96. Emi K., Yuh K., Nakamura K. et al. Possibility of contribution to chronicity of HCV infection of apoptosis in peripheral specific T cells for HCV-related antigen Gastroenterology. 1997. V.I 12. Яг

97. English J.C., Peake M.F., Becker L.E. Hepatitis С and porphyria cutanea tarda Cutis. 1996. 57. P.404-408.

98. Farci P.,Bukh J., Purcell R. The quasispecies of hepatitis С virus and the host immune response Springer Semin Immunopatol. 1997. V.I9. P.5-26.

99. Foms X., Bukh J. The molecular biology of hepatitis С virus:genotype and quasispecies Clin. Liver Dis. 1999. 3. —P.693-716.

100. Fujji K., Hino K., Okazaki M. et al. Differences in hypervariable region 1 quasispecies of hepatitis С virus between human serum and peripheral blood mononuclear cells Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996. V.225. P.771-776.

101. Gale M. J., Jr. Korth M. J., Tang N. M., Tan S. L., Hopkins D. A., Dever T. E., Polyak S. J., Gretch D. R., and Katze M. G. Evidence that hepatitis С virus resistance to interferon is mediated through repression of the PKR protein kinase by the nonstructural 5A protein Virology. 1997. V.230. P.217-227.

102. Georg S., Klinzman D., Schmidt W.N. et al. Antibody negative HCV infection in HIV-positive individuals. Antiviral Therapy 10th International, Symposium on Viral Hepatitis and Liver Disease 2000. V.5 (Suppl. 1). P.70.

103. Germi R., Crance J.M., Garin D., Guimet J., Thelu M.A., Jouan A., Zarskl J.P., Drouet E. Mosquito Cells Bind and Replicate Hepatitis С Virus J. Med.Virol. 2001.-Vol.64.-P.6-12.

104. Ghosh A.K., Majumder M., Steele R., Ray R., Ray R.B. Modulation of interferon expression by hepatitis С virus NS5A protein and human homeodomain protein PTXl Virology. 2003. Vol. 306(1). P.51-59.

105. Goodman Z.D., Ishak K.G. Histopathology of hepatitis С virus infection Semin. LiverDis.-1995.-V.15.-№l.-P.70-81.

106. Gowans E.J. Distribution of markers of hepatitis С virus infection throughout the body Semin. Liver Dis. 2000. V.20. 21. P.85-102.

107. Grakoui A., Shoukry N.H., Woollard D.J., Han J.H., Hanson H.L., Ghrayeb J., Murthy K.K., Rice СМ., Walker CM. HCV persistence and immune evasion in the absence of memory T cell help//Science. 2003. V.302. P.659-662.

108. Grovatto M., Pozzato S., Zorat F. et al. Peripheral blood neutrophils from hepatitis С virus infected patients are replication sites of the virus Haemotologica. 2000.-V.85.-№4.-P.356-361.

109. Guida M., DElia G., Benvestito S., Casamassima A., Micelli G., Quaranta M. et al. Hepatitis С virus infection in patients with B-cell lymphoproliferative disorders Leukemia. 2002. 10. P.2.

110. Hahn Т., Lindenbach B.D., BouUier A., Quehenberger 0., Paulson M., Rice СМ., McKeating J.A. Oxidized low-density lipoprotein inhibits hepatitis С virus cell entry in human hepatoma cell Hepatology. 2006. Vol. 43 (5). P 932-942.

112. Horie C Iwahana H., Horie T. et al. Detection of different quasispecies of hepatitis С virus core region in cancerous and noncancerous lesions Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996. V. 218. P.674-681.

113. Ikeda M., Kato N., Mizutani T. et al. Analysis of the cell tropism of HCV by using in vitro HCV-infected human lymphocytes J. Hepatol. 1997. V.27. P.445-454.

114. Johnson R.J., Gretch D.R., Yamabe H. et al Membranoproliferative glomerulonephritis associated with hepatitis С virus infection N. Engl. J. Med. 1993.-№ 328.-P.465-470.

115. Kage M., Shimamatu K., Nakashima E. et al. Long-term evolution of fibrosis from chronic hepatitis to cirrhosis in patients with hepatitis C: morphometric analysis of repeated biopsies Hepatology. 1997. V.25. 4 P.1028-1031.

116. Kaito M., Watanabe S., Tsukiyama-Kohara K., Yamaguchi K., Kobayashi Y., Konishi M., Yokoi M., Ishida S., Suzuki S., and Kohara M. Hepatitis С virus particle detected by immunoelectron microscopic study J Gen.Virol. 1994. V.75. P. 1755-1760.

117. Kamimura Т., Sato H., Iwamoto M. et al. Sjogrens syndrome associated with chronic hepatitis C, severe thrombocytopenia, hypertrophic cardiomyopathy, and diabetes mellitus Intern. Med. 2005. No 44(6). P.657-66L

118. Kato N., Ikeda M., Sigiyama K. et al. Hepatitis С virus population dynamics in human lymphocytes and hepatocytes infected in vitro J. Gen. Virol. 1998. V.79. -P.1859-1869.

119. Labonte P., Morin N., Bowlin Т., Mounir S. Basal replication of hepatitis С virus in nude mice harboring human tumor J. Med. Virol. 2002. Vol. 66. 3. P.312-319.

120. Lanford R. E., Bigger C Basset S.,Klimpel G. The chimpanzee model of hepatitis С virus infection ILAR J. 2001. Vol. 42. 2. P.I 17-126.

121. Laskus Т., Radkowski M., Bednarska A. et al. Detection and analysis of hepatitis S virus sequences in cerebrospinal fluid II]. Virol. 2002. 76(19). P. 1006410068. 127. Lau J.Y. Hepatitis С virus: From epidemiology and molecular virology to immunobiology //Hepatology. 1994. Vol.20. P.760-762.

122. Lerat H., Berby F., Trabaud M.A. et al. Specific detection of hepatitis С minus strand RNA in hematopoetic cells J. Clin. Invest. 1996. V.97. Я» 3. P.845851. 129. Lo S.Y., Selby M.J., and Ou J.H. Interaction between hepatitis С virus core protein and El envelope protein J.Virol. 1996. V.70. P.5177-5182.

123. Lohmann V., Komer F., Herian U., and Bartenschlager R. Biochemical properties of hepatitis С virus NS5B RNA-dependent RNA polymerase and identification of amino acid sequence motifs essential for enzymatic activity J.Virol. 1997. V.71. -P.8416-8428.

124. Lohr H.F., Schlaak J.K., Kollmannsperger S., et al. The role of cellular immune response in chronic HCV infection (Abst 533) Hepatology. 1994. V.20. P. 232.

125. Lotz G., Szalay F., Fimeisz G. et al. Localization of hepatitis С virus RNA of human erythrocytes by RT in situ PCR technique Scand.J.Gastroenterol. 2002. №37(5).-P.578-584.

126. Maillard P., Krawczynski K., Nitkiewicz J., Bronnert C Sidorkiewicz M., Gounon P., Dubuisson J., Faure G., Crainic R., and Budkowska A. Nonenveloped nucleocapsids of hepatitis С virus in the serum of infected patients J.Virol. 2001. V.75.-P.8240-8250.

127. Malaguamera M., Restuccia S., Di Fazio I. et al. Serum (З2 microglobulin in chronic hepatitis С Dig. Dis. Sci. 1997. V. 42. 4. P.762-766.

128. Manns M.P. Viruses and autoimmune hepatitis New trends in hepatology. Falk symposium 92 Dordrecht, Kluwer Acad. Publishers. 1997. P.32-44.

129. Masalova O.V., Lakina E. I., Abdulmedzhidova A. G. et al. Characterization of monoclonal antibodies and epitope mapping of the NS4 protein of hepatitis С virus Immunol. Lett. 2002. Vol. 83. P. 187-196.

130. Matsumoto M., Hsieh T.Y., Zhu N., VanArsdale Т., Hwang S.B., Jeng K.S., Gorbalenya A.E., Lo S.Y., Ou J.H., Ware C.F., and Lai M.M. Hepatitis С virus core protein interacts with the cytoplasmic tail of Iymphotoxin-beta receptor J.Virol. 1997.-V.7L-P.1301-1309. 139. McAndrews M.P., Farcnik K., Carlen P. et al. Prevalence and significance of neurocognitive dysfunction in hepatitis С in the absence of correlated risk factors Hepatology. 2005. 41(4). P.801-808.

131. Mehta S.H., Brancati F.L., Sulkowski M.S. et al. Prevalence of type-2 diabetes mellitus among persons with hepatitis С virus infection in the United States Ann. Intern. Med. 2000. 133. P.592-599.

132. Mellor J., Haydon G., Blair С et al. Low level or absent in vivo replication of hepatitis С virus and hepatitis G virus GB virus С in peripheral blood mononuclear cells J. Gen. Virol. 1998. V.79. 4. P.705-714.

133. Mercer D.F., Schiller D.E., Elliott J.F., Douglas D.N., Hao C Rinfret A., Addison W.R., Fischer K.P., Churchill T.A., Lakey J.R., Tyrrell D.L., Kneteman N.M. Hepatitis С virus replication in mice with chimeric human livers Nat Med. 2001. №8.-P.890-891.

134. Meyer-Wyss В., Bianchi L., Mantegani A. et al. Hepatitis C-virus genotype Ib is associated with more extensive fibrosis but not inflammatory activity in liver biopsies of patients with chronic hepatitis С Gastroenterology. 1997. V.I 12.

136. Mihm S., Fayyazi A., Hartmann H. et al. Analysis of histopatological manifestations of chronic hepatitis С virus infection with respect to virus genotype Hepatology. 1997. V.25. 3. P.735-740.

137. Missale G. et al. Different clinical behaviors of acute HCV infection are associated with different vigor of the anti-viral cell-mediated immune response J. Clin. Invest. 1996. V.98. 3. P.706-714.

138. Mondelli M.U. Is there a role for immune responses in the pathogenesis of hepatitis C? J. HepatoL, 1996, V. 25, 2, P. 232-239.

139. Muller H.M., Pfaff E., Goeser T. et al. Peripheral blood leukocytes as a possible extrahepatic site for hepatitis С replication //J. Gen. ViroL 1993. V.74. P.669676.

140. Nakagiri I., Ichihara K., Ohmoto K., Hirokawa M., Matsuda N. Analysis of discordant test results among five second-generation assays for anti-hepatitis С virus antibodies also tested by polymerase chain reaction-RNA assay and other laboratory and clinical tests for hepatitis J. Clin. Microbiol. -1993. V.31. P.2974-2980.

141. NakajimaN., Hijikata M., Yoshikura H., Shimizu Y.K. Characterization of longterm cultures of hepatitis С virus J. Virol. 1996. V.70. P.3325-3329.

142. Nakajima H., Takagi H., Yamazaki Y. et al. Immune thrombocytopenic рифига in patients with hepatitis С vims infection Hepatogastroenterology. 2005. 52(64).-P. 1197-1200.

143. Navas S., Martin J., Quiroga J. A. et al. Genetic diversity and tissue compartmentalization of hepatitis С virus genome in blood mononuclear cells, liver, and serum from chronic hepatitis С patients J.Virol. 1998. V.72. P.1640-1646.

144. Nelson D.R., Marousis C.G., Davis G.L. et al. The role of hepatitis С virusspecific cytotoxic T lymphocytes in chronic hepatitis С J. Immunol. 1997. V.I58. -P.1473-1481.

145. Okumura A., Yoshioka K., Aiyama T. et al. Different constitution of hepatitis С vims population in peripheral blood mononuclear cells and plasma in patients with type С chronic liver disease Didest. Diseases and Sciences. 1998. V.43. P.377383.

146. Pawlotsky J.M. Diagnostic tests for hepatitis С Journal of Hepatology. Suppl.l.-Vol. 31. 1999. -P.71-79.

147. Prince A.M., Huima-Byron Т., Parker T.S., and Levine D.M. Visualization of hepatitis С virions and putative defective interfering particles isolated from lowdensity lipoproteins J.Viral Hepat. 1996. V.3. P.I 1-17.

148. Quinn E. R., Chan С H., Hadlock K.G., Foung S. K. H., Flint M. and Levy S. The B-cell receptor of a hepatitis С virus (HCV)-associated non-Hodgkin lymphoma binds the viral E2 envelope protein, implicating HCV in lymphomagenesis Blood. 2001. Vol. 98. No 13. P.3745-3749.

149. Rasul I., Shepherd F.A., Kamel-Reid S. et al. Detection of occult low grade В cell non-Hodgkins lymphoma in patients with chronic hepatitis С infection and mixed cryoglobulinemia Hepatology. 1999. N2 29. P.543-547.

150. Radkowski M., Kubicka J., Kisiel E. et al. Detection of active hepatitis С virus and hepatitis G virus/GB virus С replication in bone marrow in human subjects Blood. 2000. V. 95. 212. P.3986-3989. 160. Ray R., Meyer K., Steele R., Ray R. Transcriptional repression of p53 promotor by hepatitis С virus core protein J. Biol. Chem. 1997. V.272. P. 10983-10986.

151. Realdon S.,Gerotto M.,Dal Pero F, Marin O,Granato A,Basso G, Muraca M, Alberti A. Proapoptotic effect of hepatitis С virus CORE protein in transiently transfected cells is enhanced by nuclear localization and is dependent on PbCR activation J. Hepatol. 2004. Vol. 40. 1. P.77-85.

152. Reed K.E. and Rice CM. Overview of hepattis С virus genome structure, polyprotein processing, and protein properties Current topics in Microbiology and Immunology. 2000. V.242. P.55-83.

153. Rosen H.R. and Gretch D.R. hepatitis С virus: current understanding and prospects for future therapies Molecular Medicine Today. 1999. V.5. P.393399.

154. Rumin S., Berthillon P., Tanaka E., Kiyosawa K., Trabaud M.A., Bizollon F., Gouillat Ch., Gripon Ph., Guguen-Guillouzo Ch., Inchauspe G., Trepo Ch. Dynamic analysis of hepatitis С virus replication and quasispecies selection in long-term cultures of adult human hepatocytes infected in vitro J.Gen.Virol. 1999. Vol.80. -P.3007-3018.

155. Sabin С A., Telfer P., Phillips A.N., et al. The association between hepatitis С virus genotype and human immunodeficiency virus disease progression in a cohort of hemophilic men J. Infect. Dis. 1997. V.I75. 1. P. 164-167.

156. Samokhvalov E.L, Hijikata M. Gylka R.L., Lvov D.K., Mishiro S. Full-genome nucleotide sequence of a hepatitis С virus variant (isolate name VAT96) representing a new subtype within the genotype 2 (arbitrarily 2k).VirusGenes.2000;20(2): 183-7.

157. Santolini E., Pacini L., Fipaldini C Migliaccio G., and Monica N. The NS2 protein of hepatitis С virus is a transmembrane polypeptide J.Virol. 1995. V.69. -P.7461-7471.

158. Scheuer P.J. The nomenclature of chronic hepatitis: Time for a change J. Hepatol.-1995.-V.22.-P.112-114.

159. Seipp S., Mueller H.M., Pfaff E., Stremmel W., Theilmann L., Goeser T. Establishment of persistent hepatitis С virus infection and replication in vitro J. of General Virol. 1997. Vol. 78. P. 2467-2476.

160. Sherlock S., Dooley J. Diseases of the liver and biliary system Blackwell Science Ltd. Oxford, London, Edinburg, Maiden. 1997. P.274-335.

161. Shimizu Y., Yamaji K., Masuho Y., Yokota Т., Inoue H., Sudo K., Satoh S., and Shimotohno K. Identification of the sequence on NS4A required for enhanced cleavage of the NS5A/5B site by hepatitis С vims NS3 protease J.Virol. 1996. V.70.-P. 127-132.

162. Shimizu I., Yao D.-F., Horie C. et al. Mutations in a hydrophilic part of the core gene of hepatitis С virus in patients with hepatocellular carcinoma in China J.Gastroenterol. -1997. V.32. 1. P.47-56.

163. Shin E.C., Protzer U., Untergasser A., Feinstone S.M., Rice СМ., Hasselschwert D., Rehermann B. Liver-directed gamma interferon gene delivery in chronic hepatitis С //J. Virol. -2005. Vol. 79. -X2 21. P. 13412-13420.

164. Simmonds P. Variability of hepatitis С virus Hepatology. 1995. 2.-P.570-583.

165. Sullivan E.J., Rosenbaum H. J. Metods for preparing tissue culture in disposable microplates and their use in virology// Am. J. Epidemiol. 1967. Vol.85. 7. P. 424-437.

166. Taliani G., Badolato M.C., Lecce R. et al. Hepatitis С virus RNA in peripheral blood mononuclear cells: Relation with response to interferon treatment J. Med. Virol-1995.-V.47.-№l.-P.16-23.

167. Tarantino A., Campise M., Banfi G. et al. Long-term predictors of survival in essential mixed cryoglobulinemic glomerulonephritis Kidney Int. 1995.-2 47. P.618-623.

168. Tkachenko E.A., Ivanov A.P., Rezapkin G.V. Immunosorbent methods for detection of HFRS antigens and antibodies Manual of Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome. Editor Lee H.W., Dalrymple J. M- WHO Collaborating Center for Virus Reference and Research (Hemorrhagic fever with renal syndmme) Institute for Viral Diseases, Korea University. 1989. P.88-89.

169. Tong M.I., EI-Farra N.S., Reikes A.R., Co R.L. Clinical outcomes after transfusion associated hepatitis С N. Engl. J. Med. 1995. V.332. N2 22. P.1463-1466.

170. Trujillo-Murillo Kdel C Garza-Rodriguez Mdel L., Martinez-Rodriguez H.G. et al. Experimental models for hepatitis С virus (HCV): new opportunities for combating hepatitis С //Ann. Hepatol. 2004. Vol. 3. 2. P.54-62.

171. Tscheme D.M., Jones C.T., Evans M.J., Lindenbach B.D., McKeating J.A., Rice CM. Time- and temperature-dependent activation of hepatitis С vires for low-pHtriggered entry J. Virol. 2006. N2 80 (4). P. 1734-1741.

172. Vargas H.E., Wang L.F., Laskus T. et al. Distribution of infecting hepatitis С virus genotypes in end-stage liver disease patients at a large american transplantation center// J.Infect Dis. 1997. V.175. 2. P.448-450. -Y.2i.-N2

173. Willson R.A. Extrahepatic manifestations of chronic viral hepatitis Am. J. Gastroenterol. 1997. N2 92. P.4-17.

174. Yasuda K., Okuda K., Endo N. et al. Hypoaminotransferasemia in patients undergoing long-term hemodialysis: clinical and biochemical appraisal Gastroenterology. -1995.-V.109.-P.1295-1300. 187. Yi М„ Villanueva R.A., Thomas D.L., Wakita Т., Lemon S.M. Production of infectious genotype la hepatitis С virus (Hutchinson strain) in cultured human hepatoma cells Proc. Natl Acad Sci U S A 2006 (PMID: 16461899).

175. Young K.C., Chang T.T., Liou T.C., Wu H.L. Detection of hepatitis С virus RNA in peripheral blood mononuclear cells and in saliva J. Med. Virol. 1993. V.41. №l.-P.55-60.

176. Yoshikura H., Hijikata M. Replication of hepatitis С virus J. Viral Hepatitis. 1996.-V.3.-Xol.-P.3-ll.

177. Yoshioka K., Aiyama Т., Okumura A. et al. Humoral immune response to hypervariable region of hepatitis С virus differs between genotypes 1 b and 2 a J. Infect. Dis. 1997. V.175. J o 3. -P.505-511. V

178. Yuki N., Hayashi N., Moribe T. et al. Relation of disease activity during chronic hepatitis С infection to complexity of hypervariable region 1 guasispecies Hepatology. 1997. V.25. 2. -P.439-446.

179. Zein N.N., Abdulkarim A.S., Wiesner R.H. et al. Prevalence of diabetes mellitus in patients with end-stage liver cirrhosis due to hepatitis C, alcohol or cholestatic disease J. Hepatol. 2000. 32. P.209-217.

180. Zhao X., Tang Zh.-Ya, Klumpp В., Wolff-Vorbeck G., Barth H., Levy Sh., von Weizsacker F., Blum H. E., Baumert Th. F. Primary hepatocytes of Tupaia belangeri as a potential model for hepatitis С virus infection J. Clin. Invest. 2002. Vol.109. -№2.-P.221-232. 194. Zhi-Qiang Song, Fei Hao, Feng Min, Qiao-Yu Ma and Guo-Dong Liu Hepatitis С virus infection of human hepatoma cell line 7721 in vitro World J. Gastroenterol. 2001.-Vol.7(5).-P.685-689.

181. Zignego A.L., De Carli M., Monti M. et al. Hepatitis С viras infection of mononuclear cells from peripheral blood and liver infiltrates in chronically infected patients J. Med. Virol. 1995. V.47. 1. P.58-65. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ НО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

182. Deryabin P.G., Isaeva E.I., Viazov S.O., Sukhno A.S. and Lvov D.K. Identification of highly productive cytopathogenic hepatitis С virus variants 10* International Symposium on Viral Hepatitis and Liver Diseases. Atlanta, USA. 2000. P. 145.

183. Дерябин Н.Г., Исаева Е.И., Гренкова Е.П., Сухно А.С. Цитопатогенные варианты вируса гепатита С (ВГС), пригодные для разработки вакцины Аллергия, астма и клиническая иммунология. 2001. 1. 28-30.

184. Дерябин П.Г., Исаева Е.И., Сухно А.С., Львов Д.К. Патогенность изолированных вариантов вируса гепатита С (ВГС) для мышей //Матер. VIII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. Т.

186. Дерябин П.Г., Исаева Е.И., Сухно А.С, Львов Д.К. Гемагглютинирующая активность вируса гепатита С (ВГС) Матер. VIII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. Т.

188. Дерябин П.Г., Исаева Е.И., Иноземцев А.К., Ботиков А.Г., Сухно А.С. Разработка культуральной инактивированной вакцины против гепатита С Матер. VI Всероссийской научно-практической конференции «Вирусные гепатиты проблемы эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики». Москва.-2005.-C.80-8L

189. Сухно А.С, Дерябин П.Г., Исаева Е.И., Райхлин Н.Т. Изучение патогенеза и патоморфологических изменений в печени на модели вирусного гепатита С in vivo II Вестник КазНУ. Серия биологическая. Алматы. 2007. 2 (32). 133-135.

190. Сухно А.С, Дерябин Н.Г., Исаева Е.И. Особенности патогенеза при экспериментальной инфекции, вызванной цитопатогенным вирусом гепатита С (ВГС) Материалы юбилейной научной конференции, посвященной 175-летию со дня рождения СП. Боткина «Военно-медицинская академия им. СМ. Кирова». Санкт-Петербург. 2007. 292-293.

191. Сухно А.С, Райхлин Н.Т., Дерябин П.Г., Исаева Е.И. Патоморфологические изменения в печени при экспериментальном вирусном гепатите С Материалы юбилейной научной конференции, посвященной 175-летию со дня рождения СП. Боткина «Военно-медицинская академия им. СМ. Кирова». СанктПетербург. 2007. С293-294.

192. Сухно А.С, Исаева Е.И., Дерябин П.Г. Перспективы изучения патогенеза вирусного гепатита С Здоровье населения и среда обитания. 2007. 9 (174).-С.42-47.