Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эффективность новых высоко- и низкомолекулярных индукторов интерферона при экспериментальных вирусных инфекциях

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Эффективность новых высоко- и низкомолекулярных индукторов интерферона при экспериментальных вирусных инфекциях"

1ч:091

ахадзил .ялтинских наук ссс? . институт Б'/.руса-.оте: им.д.и.ивановского

эффективность новых высоко- и низк0м0лекулярных индукторов интерферона при экспериментальных вирусных инфекциях (03.00.06 - вирусология)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи УДК:516-ОС2.6+576.8.097.3-092.6/9

ИВАНОВА Алла Михайловна

Москва - 1991

Работа выполнена в Научно-агследоЕательском институте ъиру логиа ¡¿3 УзССР, Научно-нсследоьательском институте эшиегш! лопш и микробиолога: иг.:.л.¿.Гамалеи А-'.Гг: СС.?, учно-;:ссЛ' вателъскоы институте "вирусологии ш.:.1.;;.Лвзнозского А"Н СС-:

Научные руководители : член-корреспонде нт А\!Н СССР, акадеа:

РАЕН, профессор в.П.ЕР-ОВ

заслуженный деятель наука УзССР и КК АССР, доктор медицинских наук, профессор 1:.Х.ХЭШ£В

Научный консультант - к.к.н. С.С.ГРИГОРЯН Офтлалъные оппоненты:

д.б.н., профессор - Г.А^ГаЛЕТШ д.м.н., профессор - Е.П.КУЗКЩОВ

Ведущее учреждение: Государственной научно-исследозательсю институт стандартизации и контроля медицинских препаратов им.Л.А.Тарасевича

•Защита состоится ОЛУгЯЛ^/иЯ 19 Ш г. в 14 часов

на заседании специализированного совета Д 001.¿0.02 при Институте вирусологии им.Д.й.Ивановского А.МН СССР (г.Москва, ул.Гамалеи, 16)

С Диссертацией гюжно ознакомиться в библиотеке Института вирусологии иы.Д.И.Ивановского АМН СССР

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета

к.и.н., с.н.с. /1.;.:.ЕУлОВСгЗЬ

1 ВВЕДЕНИЕ

• i

fj,: i ^Актуальность проблемы. Рачительное место в инфекционной патологии человека занимают заболевания» вызванные вирусами гриппа и гепатита А. Разработка средств профилактики данных инфекций - важная задача современной медицины, успешное решение которой, по ряду социально-экономических причин, наиболее актуально для Среднеазиатского региона.

Имеющиеся сведения о достаточно высокой профилактической эффективности интерферона №Н) при гепатите А и гриппе указывают на перспективную значимость его медицинских препаратов, а тзкяе индукторов IiiH-а для предупреждения и лечения этих инфекций (Ф.И.Ершов и др., IS85; Л.К.Браханова и др., 1585),

Основными критериям оцени: эффективности интерфероногенов являются их интерферониндуцирукцая и противовирусная активности, проявляющиеся в различных биологических системах (Н.П.Чшеов и др., 1988).

Из нескольких сотен известных к настоящему времена индукторов »foîî-a только немногие отвечают требованиям .выдвигаемым к данным препаратам. Выраженной интерферониндуцируищей и противовирусной активностью обладает ряд низкомолек^лярных соединений, среди которых наиболее известен тилорон (отечественный аналог амихсин) (с.и.^бг п н.Р.Кшаег IS70; З.Б.Тазулахова и др., 1585). Из высокомолекулярных соединений особое место занимают природные полинуклеотиды: дронзевые и фаговые дс?НК (А.БДкак и др., 1885; И.В.Трофимов и др., 1587; Ю.Б.Умбрашко и др., 1587). Па основе природного полифенола госсшгала были синтезированы многочисленные соединения (Tain) с выраяенными интерферошвдуци-руидага и противовирусными эффектами (А.М.Сайиткулов, ISC5). Поиск иктерфеооногенов среди известных фар!.;акопе1Шых препаратов» ллроко применяемых в клинической практике .показятт^ что в nendyo

грушу интерфероногенов иогут быть отнесены такке вазодилатато-ры: дибазол, папаверин, дипирвдамол (А.с.СаШюу, ы.ыаз^коуа 1984; С.С.Григорян и др., 1£87).

Б доклинических исследованиях был определен круг наиболее перспективных отечественных индукторов ИФЯ-а (ларифан, ридостин, рифастин, госсипол, ГБК, ыегасин, аыиксин цдр.), которые рекомендованы к фармакотоксикологическиы и клиническим испытаниям. В многочисленных исследованиях показана их эффективность в отношении ряда вирусных инфекций. В частности, препараты ыегасин и госсипол используют в клинической практике при лечении герпетических инфекций и козных заболеваний (М.А.Сашлш и др., 1982). В качестве иммунодепре'санта при пересадке почек применят1 препарат ГЕК (А.С.Садыков и др., 1563), а при лечении кератитов -полудан (А.А.Каспаров, З.В.Попова, 1278; Ы.^.Краснов и др., 1982).

В настоящее время получены убедительные данные об эффективности препаратов дсИПС при лечении больных хроническими рецидивирующими вирусныз.щ дерматозами (Дз.К.Бранта, Г.Я.Фелдцане, 1589) и герпетическими инфекциями (М.А.Самгин и др., 1£82).

До настоящего времени не изучено влияние индукторов 1Ш~а на продукцию вируса гепатита А.

Данные .жтературы о влиянии отечественного препарата амик-син на экспериментальную гриппозную инфекцию и гепатит : ааол малочисленны. При профилактическом введении амиксила не учитывался путь проникновения возбудителя в организм .тлвотных и не предпринимались попытки защитить входные ворота инфекции.

Отсутствуют сведения о влиянии аьаксина на иммунный и ин-терфероновый статус экспериментальных ;.тзотнкх и человека.

2се вышеизложенное побудило нас провести кск.пдекс нсследо-

ваний»актуальность которых определяется необходимостью поиска эффективных при вирусных инфекциях отечественных интерфероноге-нов.

Цель и задачи исследований. Цель наших исследований заключалась в сравнительном изучении эффективности отечественных индукторов интерферона в отношении вируса гепатита А в культуре клеток и экспериментальных вирусных инфекций мышей.

Для достижения поставленной цели осуществляли peneime следующих задач:

1. Апробация в качестве экспериментальной модели вирусного гепатита Ain vitro культуры меток Frhk-4 (клетки почки эмбриона макаки резус)■ инфицированных Еирусом гепатита А (штамм iias-15 ).

2. Изучение влияния некоторых отечественных клинически перспективных индукторов ИФН-а (лари фана, рифастила, рддостина, Таш-1,2,3,4, ашисика, дибазола и папаверина) ка продукцию вируса гепатита А а культуре меток почки эмбриона макаки „резус.

3. Изучение влияния а>яжспна на интврфероновий статус здоровых я чшГицироваш-ых вирусом гепатита икшей.

4. Изучение яродукцик ЙОН-а в организме мышей при интрана->альном введении амиксина и его ааияние на экспериментальную 'ршшозную инфекцию у мышей.

Ь„ Оптимизация схем профилактического введения индукторов йН-а Самаксия, дсРНК, папаверин) при гриппе и гепатите шшей.

6, Оценка влияния амиксина на иммунную и интерфероневув истему человека.

Научная новизна. Впервые изучено влияние отечественных ия-укто^ов ¡IwH-a лариГака, ридостина, рис>стина„ Таш-i,2,3,4, ■xi.cmia, дибазола >; палазерина на культуру клеток почки эмб-

риона макаки резус и продукцию вируса гепатита А в этой клеточной культуре. Показана способность папаверина полностью подавлять продукцию вируса гепатита А в данной клеточной культуре.

Впервые установлено, что амиксин в субтоксической дозе стимулирует продукцию вируса гепатита А в клетках почки эмбриона макаки резус.

Показано .влияние энтерально введенного амиксина на динамику продукции сывороточного интерферона и интерфероновый статус у мышей.энтерально инфицированных вирусом гепатита мышей.

На модели энтерального гепатита мышей показан пролонгированный защитный эффект амиксина при однократном пероральном его введении.

Установлено влияние папаверина на штер&ерониндуцирующую и противовирусную активность амиксина и дсРЯК при сочетанном профилактическом их введении (на-модели энтерального гепатита и энцефаломиокардита мышей).

Впервые исследованы закономерности синтеза эвдогенного интерферона в крови и органах (мозг, легкие) мышей при китраназаль-ном введении амиксина. Получены новые данные о развитии состояния гилореактивности в тканях легкого в ответ на интраназ&тьное введение амиксина. Показана зависимость динамики продукции сывороточного ЖН-а от дозы и кратности введения амиксина в верх-гае дыхательные пути.

На модели экспериментальной гриппозной инфекции у мышей впервые показан профилактический эффект амиксина при интрана-зальнои его введении.

Впервые изучено влияние длительного приема амиксина на иммунный и штерйероновый статус ладей.

Практическая значимость работы. Выявление в эксперименте эффективных в отношения гепатита А индукторов ИЭД-а (разрешенных Фармкомитетом для клинического испытания)в качестве профилактического и лечебного средства при вирусной гепатите А у лвдеЗ.

Экспериментальное изучение природных индукторов 1®Н-а, полученных на основе госсипола (Таш-1,2,3,4), обладающих низкой токсичностью и проявлявши тенденцию подавлять продукции вируса гепатита А в клеточной культуре, дает возможность рекомендовать их для дальнейшего углубленного доклинического ъ фарма-{о-токсикологпческого исследования.

Выявленная в экспериментах in vitro способность субток-¡ической дозы амаксина значительно стимулировать продукции шру-:а гепатита А дает основание рекомендовать его в качестве аген-■а. повышающего накопление вируса гепатита А при производстве пецифических диагностикумов и вакцины.

Установленная на модели экспериментальной гриппозной ип-екции профилактическая эффективность амиксина при интраназаль-ом введении позволяет рекомендовать его для клинических испы-зяий в качестве средства экстренной профилактики гриппа у одей.

Учитывая результаты углубленного клинического изучения П1ЯШ1Я амиксина на систему интерферона у .идей, считаем цело-юбразным ограничить его пероральное прлаенение 4-5 кратным ^недельным приемом.

Изменения,внесенные нами в методику определения инторфе-новэго статуса у лвдей и составленные на основании их мето-ческие рекомендации: "Определение интерфероиового статуса в льнол крови у ладеГ: при иассовьж обследованиях",-позволяют

проводить массовые клинические и эпидемиологические исследования с большей эффективностью и с меньшими материальными затратами „ Особый интерес представляет возможность использования данного метода в педиатрии, поскольку исключает необходимость забора крови из вены.

Разработанные наш рекомендации нашли практическое применение в клинической практике и научно-исследовательской ра-. боте, что подтверадено актами об использовании предложения, полученными из Детской городской клинической больннцн й 2 им.М.О.Русакова, г.Москва; Института педиатрии ЫЗ РСЗСР; Львовского ГЕК эпидемиологии и гигиены КЗ УССР.

Полодения выносимые на защиту.

1. Лля целенаправленного поиска препаратов эффективных при-вирусном гепатите А может быть использована культура клеток почки эмбриона макаки резус (линия ргЬк-4 ). инфицированных вирусом гепатита А (шташ наз-15 ).

2. Отечественные аддукторы интерферона ридостин, рифастин, дибазол и папаверин обладают противовирусной активностью в отношении вируса гепатита А и достоверно подавляют продукцию этого вируса в культуре клеток РгШс-4

3. Амиксин наиболее эффективен как средство экстренной . профилактики при однократной пероральном введении мышам, инфицированным вирусом гепатита.

Экспериментально установлено, что профилактическое введение амиксина приводит к коррекции интерферокового статуса у инфицированных вирусом гепатита мышей.

4. Для профилактики острых респираторных внруснкх инфекций шиксин целесообразн^вводить иктраназалько. Уровень и динамика накопления интерферона при этом ь сыворотке крови зав;:-

- 7 -

сят от дозы и кратности введения препарата.

5. Чувствительность лвдей к действию аыихспна различна и зависит от исходного состояния иг.глункоЛ и интерфероновой системы организма. Профилактическое введение а'.пшсяна влияет на ди-намшгу продукции сывороточного интерферона и интерфероновый статус лвдей.

Продолтлтельное введение амиксгда (до 10 недель) не вызывает выходящих за рыки :;ор:.:сльнкх значений изменений количественных показателей иммуноглобулинов классов 1е А, ^ м, 1е с, Т- и В-лпмфоцптов крови.

Апробация работы. Результаты исследований были долояены на объединенном заседании научных сотруднш;ов Научно-исследовательского шютнтута вирусологии Министерства здравоохранения УзССР . (г.Ташкент, 1990г.), на научной конференции отдела Интерферона Научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии ш.Н.О.Гамалеи А1Ш СССР (г.Москва, 1590г.).

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 173 страницах машинописного текста и состоит аз введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, списка литературы. Включает 22 таблицы, иллюстрирована ¿3 рисунками.

Еиоллографпя представлена 318 источниками отечественной и зарубежной литературы.

Публикации. По теме диссертации опублековано 3 печатных работ.

X я X

Автор пользуется случаем выразить пскроннви благодарность своим научным руководителям член-корреспонденту А1Н СССР, профессору О.М.Ьршозу а заслуженному деятелю науки УзССР и КК АССР,

профессору Ш.Х.Ходааеву за оказанную помогу* в выполнешш диссертационной работы. От всей душ благодари к.ц.н. С.С.Григорян за оказание всесторонней методической и консультативной поыовд в выполнешш научных исследований. Выражаю такзе сердечную благодарность всем соавторам и коллегам за поддеряку и помочь з работе.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы

Животные. Исследования проводили на самцах белых нелинейных мыиеЛ весом 14-16гр, и 18-2Сгр.

/клетка.Использованы клеточные культуры перевиваемых цыши-ных фибробластов (L-929 ), первично трипсинизировакные клетки йабробластов S-IC дневных куриных эмбрионов (СЭК), диплоидная культура фибробластов эмбриона человека (M-I9), перевиваемая культура клеток почки эмбриона макаки резус (линия Prhk-4) Ьирусы.Использовали вирус везикулярного стоматита (ВВС) -штамм "Индиана", вирус энцефаломиокардита ишей (¿.К) - зтада "Колумбия Sc-Col-Sc вирус болезни Ньюкасла (БЕН) - гтами "Манзас", вирус гриппа - шташ A/Aichi/66/n^N2/ , з^ру. гепатита мышей (БШ) - аташ Мецерина, вирус гепатита А (ЗГА) -этачм HAS-15 . • .

Препгоаты.Изучили иятерферонинцупкруадуго п противовирусную активность аддукторов ИЛ1-а ларифана (двуспиральная дсРЯК, вццеленкая пэ «Тага г2 в.Coli ), рафастияа Сдвуспиралькая геномная РНК фага / 6), рвдосгана (двуспиральяал РНК из дролсгей S.;erevi3iae ), Таш-1,2,3,4 (природ£Ше полифенолы), амих-сша (аналог тклорона), дибазола (производное кмздазола) и папаверина (производное нэохинолпна).

- 9 -

Для определения штерфаронввдуцирувдей способности препаратов последние вводили мышеи перорально, внутрибрюшияно я инт-раназаяьно. На кавдуэ исследуемую точку использовали по 10 мышей. С целью изучения противовирусной активности аддукторов КФН-а in vivo различные дозы препаратов вводили животным по профилактической и/ала лечебной схеме. На каадое экспериментальное условие использовали не менее 20 мышей. Способ зар&адния животных зависел от особенностей патогенеза экспериментальной инфекции. Определение интерферонового статуса у мышей проводили по трем показателям: сывороточного, и f-ЙФН-а. Индукцию <¿ - и ]f-IK>H-a in vitro проводили в суспензии спленсцитов селезенки мышей. Выделение ЖН-а из органов проводили по методу, разработанному Н.НоАмитиной и др. (IS84).

При определении интерферошщдуцируицей активности амиксина у лвдей препарат в дозе 0,125г„ вводили добровольцам перорально I раз з неделю в течение 10 недель.. Оценку, функциональной активности системы ШН-а человека проводили модифицированным нами методом з цельной крови по трем показателям: уровень сывороточного Н-а in vivo , индукция л - и f -iI*H-a fii vitro . постановку реакции осуществляли макро- и микроиетодоы. Определение относительного числа Т- и В-лимфоца?ов в периферической крови осуществляли .методом спонтанного розеткообразования с эритроцитеш барана и-человека (0/1/), соответственно. Коли-гесгвенный показатель основных классов юкуноглобулинов А , а и g в сыворотке крови определяли методом радиальной

1ммунодпфузии по ¡ftfirichiny

Противовирусную активность -ивдукторов in vitro оцвнива-по накохтеяд» HAAg з клеточном лизате, количественное оп~ едсле[пк! которого пуоводют. методом твердофазного аимунофер-

рентного анализа.

Титрование ИйН-а производили ыикрометодои по подавления размножения тест-вируса ЕЖ и ВВС. За единицу активности !йК-а принимали величину, обратную его разведению, задерживающую деструкцию монослоя на 50£.

Достоверность полученных в экспериментах результатов оценивали по критерию Стыцента. Результаты считачи достоверными при Р*0,С5.

РЕЗУЖЕАЛЫ ¡¡ССДВДОБАШЙ

Испытание перспективных индукторов интерферона в опытах ка культуре клеток ргыс-4

Для экспериментального обоснования применения индукторов К4Н-а при гепатите А нами была использована культура клеток РгЫс-4 . зараженная вирусом гепатита к (штамм алз-15 ).

Изучение интерфероницдуцируицей активности препаратов ри-фастина, рвдостина, ларпфана, Таг-1,2,3,4, амиксина, дибазола и папаверина в клетках РгЬк-4 показало, что высокомолекулярные индукторы П1Н-а (рифастин, ларифан, Таш-3) в присутствии ДЕлЕ-декстрана индуцируют умеренную продукцию ШГ-в (32-64ед/м Амиксан таюхе индуцирует синтез ¿¿Н-а в клеточной культуре, од нако уровень И5Н-а в среде культивирования в этом случае не превышает 16 ед/мл. Другие препараты либо вообще не индуцируют продукция !Ш-а з определяемых количествах,либо стимулируют продукцию чрезвычайно низкого урогня 1КН-а (2-4 ед/мл).

Таким образом, полученные результаты указывают на низкую интерферонивдуцируэдую способность этой культуры.

3 дальнейших исследованиях зд определили кштсние индукторов 1&Н-а продукции вируса гепатита А в клеточной культуре.

с частности,установлено, что природше дзусхшралыше поли

- п -

»

нуклеотиды (рифастин и рвдостин) в концентрации 10 мкг/мл подавляют продукцию вируса гепатита А в культуре на 54^ и 44,4/5, соответственно. При этом ваяно подчеркнуть, что относительно высокая противовирусная активность рвдостина не коррелирует с его интерферонивдуцируюцей активностью, поскольку препарат почти не ивдуцирует продукцию ИФН-а клетками.

Природные пйлифенолы (препараты группы Таш) в условиях нашего эксперимента проявляет менее выраженное ингнбирущее действие на вирус. Было установлено, что препараты Тап-I и Таи-4 в концентрации 25 мкг/мл и в соотношении с ДЕАЕ-декстраном 1:2 снижают урозай вируса в инфицированных клетках на 27,5^ и 25,1%. В меньшей степени подавляют продукцию вируса Тап-3 (22,1^) и только на 7,3,1 - Таш-2. Следует отметить - изменение соотношения концентраций препарата и ДКАЕ-декстрана'в пользу препарата (4:1), несмотря на 2-х кратное увеличение его концентрации (до 50 мкг/ мл) приводит к резкому снигению- противовирусной активности индукторов. Степень подавления продукции вируса гепатита А для Таш-2 и Таи-3 соответствуют при этом 0,5;1 и 5,3%, а после обработки клеток препаратом Таи-4 наблвдается даяе стимуляция продукции вируса на 2$.

Интересные результаты получены при изучении штерферонин-цуцпрутацей и иротиъовируской активности гмикснна. Наряду с до-зозависпмык подавленней продукции вируса гепатита А (амиксин в хозе 3 мкг/мл подавляет продукцию вируса в клетках до 24£) суб-гоксическая ого доза (6 мкг/мл) вызывает резкое увеличение уровня продукции вируса в клетках Prhk-4 (5SS спекуляции) .

»

Особого внимания заслуапванг результаты .полученные при изу-1ЭШ1П противовирусной активности вазодалататоров. Четырех- и 1В?.дцатачетырех часозая предобработка меток дибазолом в концен-

трации 100 шсг/мл обеспечивает подавление продукции вируса гепатита А в разных сериях опытов на 27-352 и 18-43,1. При снизе-нии концентрации препарата до 50 мкг/кя антивирусная резистентность обработанных клеток возрастает в 1,6-1,8 раза, вопреки ожидаемому уменьшении. При этои, уровень тестируемого вируса в клеточном лизате обработанной культуры на 43-565 нияе такового в контроле. 2тот факт указывает ка критическую зависимость от дозы противовирусной эффективности препарата и, вероятно, свя-saH с накоплением избыточного количества дАШ в клетках, который, как известно, в больших концентрациях подавляет иммунологический ответ в клетках.

лнализируя результаты испытания противовирусной эффективное ности папаверина »определили, что степень противовирусной резистентности обработанной папаверином культуры зависит как от дезы препарата, так и времени его контакта с клетками. Однако, решающее, статистически достоверное значение имеют сроки воздействия препарата, мы найлвдали прямо пропорциональную зависимость противовирусного эффекта от времени адсорбции папаверина. Урожай вирусного антигена при 4-х и 24-х часовой предобработке клеточного монослоя снижается на 32£ и 74,5.1, соответственно. Практически полностью (на I0QJ?) прекращается репродукция вируса в клетках при постоянном присутствии папаверина в культуральной среде (100 ыхг/ил за 24 часа до и 5 мкг/гл в течение 2-3 недель после заражения).

Так"м образом, изучение эффективности индукторов HíH-a на модели вирусного гепатита А показало, что все отобранные препараты в разной степени подавляют продукцию вируса в клетках Frhk-4 . Степень ингиблрувдего эффекта зависит от концентрации аддуктора IrwK-a а ДЕАЕ-декстрана, а так::з продолжительное

ти контакта препарата с клеточным монослоем. Способность препаратов подавлять продукцию вируса гепатита А в клетках Frhk-4 при отсутствии К*Н-а в культуральной жидкости подтверждает предположение Т.!а.Соколовой и др. (IS37) о существовании механизма антивирусного действия,независимого от индукции ИФН-а, который реализуется путем прямой активации внутриклеточных ферментов.

Антивирусная активность амиксина пси гепатите мыдей

Для дальнейшие экспериментальных исследований in vivo был отобран синтетический низкомолекулярнш": индуктор ЖН-а - амиксин. При пероральном введении амиксина мышам максимальное количество эндогенного И$Н-а определяют в кишечнике и печени зивотных. Это обстоятельство позволяет предположить его еозкозныЛ профи- ■ лактический эффект яри гепатите А, возбудитель которого проникает в организм человека через пищеварительный тракт, а основной патологический процесс развивается в печени.

Результаты изучения ¡штер^ерониндуцпрующей и противовирусной активности амиксина при энтеральном гепатите мышей показывает, что однократное введение амиксина при последующем пероркль-юм заражении нивотных вирусом гепатита мышей (BT¡¿) через 2412 часа обеспечивает 40-50* зациту азотных. Обращает на се-5я внимание отсутствие прямой корреляции медду уровнем сыворо-■очного KJH-a и противовирусной активностью препарата в эти роки. Резистентность зивотных к инфекции остается кеизмешгой i течете 3-х суток,несмотря на значительное снижение уровня иркулируидего в крови ЖН-а (до 10-20 едДм) через 48-72 часа осле введения препарата. ¡Jozho предположить, что пролонгирован-эффект однократного введения агякссна, по-видимому, обуслов-гн шглукоиодулирувдим действием как самого шщуктора, так и

индуцированного игл И&Н-а.

Профилактическое введете амиксина влияет на динашку продукции сывороточного ИОН-а и иитерфероновый статус как здоровых, так и инфицированных гивотных. В частности, индукция. эндогенного И£Н-а амиксином не подавляет продукцию л - и f -iüH-ов лимфоцитами селезенки нпвотных, тогда как при заражении мыией Bill, на фоне повышения уровня сывороточного HSH-a, отмечается снижение их иктерферошщдуцирущей способности. Профилактическое введение препарата препятствует развитию инфекционного процесса и способствует восстановлению показателей интерферонового статуса до нормальных значений.

Установлено такке, что наиболее эффективная ашксин-опосре-дованнач защита -лшоткых от 2П.1 проявляется при однократном его применения.

Продукция интерферона в организме гддлеД ппи интрачазальном »ведении амиксина

В исследованиях противовирусной активности амиксина на модели вируса гриппа мы такхе исходили из принципа защиты входных ворот инфекции и легких, где,в основном.локализуется патологический процесс.

Продукция сывороточного пнтегхТ-ерона. Hai.ui была изучена динамика накопления эндогенного ¡lüí-a в сыворотке крови мкшей в ответ на интраназалъное введение амиксина (25, 5С, 100 и 2QQ ur/кг). Исследования показали, что при интраназальном введо-нии амиксина в дозах й-ЮОиг/кг уровни индуцированного им ПаН-а в сыворотке крова возрастают по мере увеличения дозы препарата. Пакотильное накопле!ше KvH-a в сыворотке крови наблвдается через 24 часа при введении амиксина в дозах ICG--00 иг/кг и через 1У ч&сов, если аддукцию проводить препаратом

- 15 -

в дозе 25 % 50 иг/кг. Таких! образом, амиксия при ия-траназальном введении интантным мышам вызывает дозо-зависимую шщукцшо эндогенного ИИ-а в крови. Ваяно отметить, что при ин-траназальном введении эффективные дозы препарата (25-50 мг/кг) в 4-8 раз ниге, чем таковые при пероральном введении (100200 иг/кг). К тому же эти дозы препарата вызывают большую и, что естественно ватшо, раннюю (через 2-4 часа) и пролонгированную (до 72 часов) продукцию сывороточного ИОН-а.

Было установлено тагсхе, что при интраназальном введении амиксина на интенсивность и динамику интерфероногенеза (количеств во индуцированного белка, сроки его появления и циркуляции в кровотоке) влияат как доза препарата, так и кратность его введения.

Продукция интерферона в органах (мозг, легкие). Локальная концентрация ИФН-а в органах играет существенную рать в патогенезе вирусной инфекции. Все чаще высказывается мнение о несоответствии динамики продукции и уровня эндогенного ЖН-а в кровотоке реальной картине его накопления и распределения в организме. В последующем была изучена динамика накопления ИйК-а в легких. Учитывая, что при интраназашюм зведэнш а'.жкссна возмокно его быстрое попадание в мозг, нами также определялось содеряание ИОН-а в этом органе. Концентрацию ИФН-а определяла по активности белка в I мл 25;> экстракта органа.

В первуа очередь следует подчеркнуть невысокий уровень 11СН-а.определяемы:! в крови л органах после иадукция, что, по-видимоиу, цозно объяснить малой дозой вводимого препарата (¿5 мг/кг). !Ь.;еэтся существенные различия в д]шамике накопления »КН-а в крови и органах при пероральном а интранаэатьно.-.! пзеде-" • нил индуктора. 2слц ери пероральном введении препарата пик продукции ¡ЮН-а з крови и органах отвечали через '/Л часа, пра ая-

траназальном - обращает на себя внимание наличие 2-х пиков активности интерфероногенеза как в крови (15 и 72 часа), так и органах (легкие - 4 и 72 часа, мозг - 2 и 48 часов) у индуцированных животных. Примечательно, что при интраназальном введении амиксина наиболее интенсивная продукция ИФН-а в органах наступает значительно позже, чем при пероральном его введении. В моз-.гу максимальное количество ИФН-а накапливается через 48 часов (64-128 ед/кт) после индукции. В легких небольшое количество ИФН-а (8-16 едД'л) определяется практически в течение всех 96 часов насшэдения. Второй более выраженный пик продукции ИФН-а в легких определяется через 72 часа (64-128 ед/мл).

Определение Аазы гипореактивности. Суцественные различия в динамике интерферонообразования в крови и органах мышей (мозг, легкие) при интраназальном введении амиксина позволили предпо-.южть наличие гипореактивности в продукции не только сывороточного ИШ-а, но и в продукции И5Н-а синтезируемого непосредственно в органах.

Изучая эффект гшореактивности в крови и органах яавотннх, установили, что при интраназальном введении индуктора йаза гипореактивности в крови у мышеи наступает через ¿4 часа. Частичное восстановление интерферо^низдуццрувдей функции организма отмечается через 72-96 часов, однако уровень 1"Н-а в крови в это врсш остается еще очень низки:.! (8-16 и 16-32 ед/цл)/рис.1-А/.

Ткань легкого перестает реагировать на повторное введение

с

ивдуктора через 72 часа. В это время ИОН не удается определить б легких да~е в самых низких значениях, но у^е через сутки, к -о часам после первого введения препар;:га,легочнач ткань почти полностью восстоназлиггст иптерфероногеннуи активность /рпс.1-Б/.

3 :.;озгу гльотннх за ире:.щ на-лсго наблщенил (£6- часов) ?.щ

I

Рис.1. Определенно фазы гипореактивности в сыворотке крови и органах (легкие, мозг) мышей,возникающей в ответ на -ведение агшссша, А - в сыворотке крови; Б - в легких; В - в мозгу; I - динамика продукции Ш1 ; П - динамика развития ¿[тазы гипореактивности; по ос;_пл ординат - ектиаюиь (в од/мл); по осям абсцисс - время поело введения препарата (в часах).

- 18 -

не отметила эффекта рефрактерности /рисД-В/.

Оптимизация схемн взедения акиксина шддам с целью профилактики гриппа и энце^лоьаокардита мшея

Грипп. Амиксш при пероральном введении проявляет незначительный профилактичес;а1й эффект в отношении экспериментальной гриппозной инфекции мышей, максимальное профилактическое действие препарата при однократном перорельном введении (200 мг/кг) проявляется через 72 часа, при этом процент защиты животных от ищекции j превышает 20£. Интересным является тот факт, что через 24 часа после введения препарата, когда уровень ИФН-а в • крови довольно высокий (640-1230 ед/мл), гибель животных от инфекции резко возрастает (на 11% по сравнению с контролем).

Этот результат подтверждает предложенную V.Riviere и др. (1280) гипотезу о возмолшом отрицательном влиянии на организм сверхсиль эго интерферонового ответа.

Профилактическая эффективность препарата при гриппе значительно увеличивается при интраназальном. его введении. Сравнительное изучение защитного эффекта различных доз амикспна (1^,5-1С0 мг/кг) "ри однократном интраназальном его введении показало, что практически все испытанные дозы препарата в разной степени защищают мышей от гриппозной инфекции (от % до 46% защиты). Однако, наиболее высокий процент защиты наблюдается при введении препарата в дозе 25 цг/пг веса (42-43о защиты).

Прч изучении профилактического эффекта оптимальной (25 мг/ кг) дозы амиксина при многократном введении установлено, Что выраженная антивирусная активность (44-56* защиты) проявляется лр'л 2-х гратном (с интерв?лом 2 часа) введении этой дозы препарата /габл.1/.

"■аолич^н;!® кратности введения о^кеина, как пру. янтраиа-

Таблица I

Антивирусная активность ашксина при двух- и трехкратном интраназальном введении / на модели экспериментальной гриппозной инфекция /

Схема введения препарата Время введения до заражения (часы) Титры 1ЮК-а ' в крови (ед/мл) Защита зивот- № С1Ш (дни) II Р

х 2 с интервалом 2 часа 24 48 72 32-64 256 8-16 44 43 56 43,9 48,0 150,0 2,7 2,9 9,7 <0,01 <0,01 <0,001

Контроль54 - 4 ' - 16,5 -

х 2 с интервалом 2 дня 24 48 72 <2 <2 ■ <2 38 23 19 38,4 20,0 18,0 2,5 1,3 1.2 <0,05 >0,05 >0,5

Контроль®' - <2 - 15,1 - -

х 3 с интервалом 2 часа 24 48 72 512 128 15-32 21 41 18 34,3 67,8 26,8 2.1 4.1 1,6 >0,05 <0,05 >0,05

Контроль* - 4 - 16,5 - -

х 3 (3 дня подряд) х 3 (через день) 24 24 8-16 8-16 22 -5 41,5 16,3 1.9 0,7 <0,05 >0,05

Контроль5601 <10 - 22,0 - -

х 3 с интервалом 2 дня 24 43 72 4 <2 <2 28 16 8 20,4 20,0 13,2 1.4 1,3 1,2 >0,05 >0,05->0,05. •

Контроль104 - <2 - 15,1 - -

ршлечаяие: I.Одноразовая доза а:я1ксгяа - 25кг/кг;

¿.Гибель :ддоткых в контроле » - &о%, - 52/., && - 47,1.

-20 -

зальном, так и пероральноы его применении закономерно приводит к ухудшении течения инфекционного процесса. В то ае время, если при многократном антраназ&тьном введении препарата процент защити гивотннх- лишь снижается, при пероральном - гибель мышей

л

от гриппа значительно увеличивается (на 40-5055 по сравнению с контролем при 3-х кратном пероральном введении 200 мг/кг препа-•рата).

Энце'1томжжардит мышей. На модели зараженных вирусом Н.;С мышей показано, что резистентность гшвотных в значительной мере зависит от содержания ИФН-а в пораженном органе. Так, интерферон, который определяется в большом количестве в мозгу милей через 2 и 46 часов после введения амиксина (32-64 ед/мл и 64123 ед/мл 255? экстракта органа, соответственно).не защищает мышей от Ш3„ Более того, именно в эти часы отмечается повышение гибели животных з опытной группе на и 15$. В то же время, результаты проведенных экспериментов показала, что в мозгу ия-тактных (контрольных) мышей присутствует неоолыиое количество ЖН-а (8-10 зд/ш), при незначительном снижении которого (до 24 ед/ыл) гибель животных от Suß возрастает на

Полученные б vvo'A серии экспериментов результаты, также подтверждают гглопиу о возможном негативно!.« эффекте сверх-сельного интерфероноЕого ответа организма и согласуется с предположением w.c.Kofi и А.J.Fidler (Г235) о отрицательном влиянии гиперстицуляцш ш/мунной системы (макрофагов) на тече-нде инфекционного процесса,вызванного цитологическими вирусами .. с коротким циклом репродукции.

- 21 -

Влил;гие длительного пру.ома амиксина на интерхероновнй и иммунныи статус человека

Полученные в экспериментах на нивотных дачные послуяилп основанием для изучения биологической активности амиксина на волонтерах. Изучили 1штерферо1швдуцирувдую активность амиксина в организме человека, а такке его влияние на пнтергТеронсЕыМ и некоторые показатели таенного статуса человека. Зтот раздел работы представляет собой фрагмент углубленного клинико-4.иэио-логического исследования, проводиглого в соответствии с программой испытания профилактической эффективности амиксина.

Прозеденгшс исследования позволили выявить различную чувствительность лвдей к действию а'ликсина. У 5% лиц с изначально высокими показателя:™ сывороточного антивирусного белка интер-(¿ероновш! ответ на введение амиксина выра-хается либо синением уровня сывороточного ИФН-а, либо этот показатель остается без изменения.

В группе добровольцев (35£), у которых до приема аипксина определяются не превышающие фон значения циркулирующего белка (2-6 ед/мл) .выразенная и стабильная продукция эндогенного 1ЭЯ-а

с

под действием амиксина тестируется у 62£, слабовыралзяная -у 33%. Среднегеометрическое значение сывороточного №Н-а в этих группах разнялось 54 ед/:лл и 16-32 ед/ил, соответственно.

Характерно, что сила интерфероноэого ответа была тем вше, чем киле было количество ИШ-а,циркулирутэ^его в кровотоке до начала приема препарата.

Анатазируя среднегруппозуп динамику накопления эндогенного-:»П-а з крови лиц .длительно получаваса а^лксик,определили, что ::акс;у.:яльная разншха в урезнэ сывороточного 1Ж-г ь кскг.сольнсИ и опкткоп группах отмечается з первые 4 недели

Рис.2. Динамика продукции, сывороточного (А), <о- (Б) а (и) инторХеронов у ладей при длительном еженедельном приеме амиксина /I/ и шшцебо /2/.

г*

По оси ординат - иягивность И£й в ед/мл; по оси абсцисс - число приемов препарата.

Среднегеометрический уровень И5К-а „определяемый в крови у лиц эпктной группы з этот срок, превышает аналогичный показатель а контрольной группе в 2,5 раза. В последующие б недель этот юказатель снижается до 1,6 раза /ркс.2/„

Способность лимфоцитов крови цро,цуцировать л -®Н остался практически неизменной в течение всего периода приема амик !йна и сопоставима по своим показателям с" уровнем * -ИЖ-а, »пределяеглым в контрольной группе (640-1260 ед/ил). Вместе с 'ем, р -звено системы ИСН-а после 5-го приема аьшкеина проявив т прогрессирующую недостаточность и истощение« Уровень щю-укцик р -ЖН-а снижается в среднем в 4-8 раз по сравнению с онтролем.

Вачяо отметить, что увеличение выработки эвдогенного ®Н-а од действием амикс>ша в первые 4 недели наблюдения не сопро-овдаотся подавлением продукций * - и г -И5>Н-ов лк&юцитгмн ровн,столь характерным для острых и хронических вирусные ня- ,

ВКИДЙ.

В рамках наакх исследований мы не выявшж отрицательного таяния амяксина на иммунный статус человека, функциональна?® *тивяость которого изучали по количественным показателям ым-гноглобулшов классов 1<5 А, 1в и, 1е е , а такв Т- и -лшлфоцитов крови. Значительные колебания уровне?: ишужн'лс-глинов класса 1г к , тлевшие место как в опытной, так а кон-юлькой группах,не коррелировали с приемом препарата.

Суммируя результаты изучения биологической активности этила в организме человека.отмечаем различную чувствительность ие2 к его действию, которое предг.:уцестзояно определяется но- ' дны?л состоянием и мнтср'.ероногой систем: органична,

епарат влилет на дш-.гмку продукпж эндогенного 1&Й-2. л :?н-

тероероповш статус лвдей в, вместе с тем, не вызывает у них oí клоненлй от нор!?ш количественных показателей глобулинов ig А Ig 11, Ig с, Т- а Ь-димтоцитов крови.

о Ц В О Д U "

1. Установлено, что в ответ на издукцию отечественными

• препаратами рифастин, ларифсн и ашксин, отобранными для последующего клинического использования, клетйи почки эмбриона макаки резус. ( PRhK-4 ) продуцируют умеренное количество \Ш~а. Ь экспериментах in vi-tro показано:

- рифастин, радостин, дибазол и папаверин достоверно ингибиру-ыт продукция вируса гепатита А в клетках FRhK-4 ;

- индукторы интерферона Тгш-1,^,3,4 подавляз» продукции вируса гепатита А в клетках íHhK-4 . При этом степень ингибищщ возбудителя зависит от концентрации аддуктора л уровня ДЕА2-дек-страна в среде инкубирования клеточной культуры;

- отечественный низкомолекулярный ивдуктор интерферона гшк-син в субтокоической дозе стимулирует продубит вируса гепатита А в культуре клеток рйьк-4 .

2. Профилактический эффект ампксина in vivo более выражен при однократном введении оптимальных доз препарата непосредственно перед контактом- с ивфек^ей. Гиперинфляция системы интерферона посредством введения висоюх доз адлаксина приводит к усилении инфекционного процесса у эксперамеитачышх зздрткых.

3. Аниксия при интраяачалыюм вьедешш стимулирует продукцию интерферона в организме мышей. Уровень и динамика накопления эодогеняого ;iK^ep¡í&poiia а кроьн и органа', животных определяются дозой' препарата и кратностью его пзеденгл.

П.-и шлралазалпем ньодеюш препарата ароявяям аыракенкое

фофилактическое действие в отношении экспериментальной грип-гозной инфекции мышей. Протективный эффект препарата повышайся при поэтапном Св 2 приема) введении оптимальной дозы шдуктора.

4. Показано, что фаза гипореактивности в ответ на интра-[азальное повторное введение амиксина в тканях легкого развяжется через 72 часа после повторного интраназалыюго ввсде-шя препарата.

. 5. Амиксин при пероральном введении стимулирует у лвдей [родукцив эндогенного интерферона. Интенсивность интерфероно-юго ответа снизается у лиц, в крови которых циркулируют пре-ишающие фон количества интерферона.

Длительное введение амиксина лэдям (более 5 недель) п_:и-юдит к подавлению f-звена системы интерферона.

Амакснн при длительном введении здоровым лэдям (I раз в еделю, 10 недель) не вызывает отклонений от нормы колпчест-енных показателей суммарных иммуноглобулинов классов ig а , к и , ig g , относительного числа Т- и S-лимфоцитов крове.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

. Оценка интерферонового статуса лвдей по пробам цельной крови / С.С.Григорян, П.А.Майоров, A.M.Иванова, Ф.И.Ершоз // Вопр. вирусологии.- 1938.- Т.ЗЗ, J3 4.- C.433-43S. . Григорян С.С., Иванова A.M., Семшенко Т.А. Влияние нового отечественного индуктора интерферона - амиксина на ин-терфероновый статус // Тез. докл. ХУЛ съезда Всесоюз. общества эпидемиологов, мшсробислогоЕ а паразитологов пм.П.".Мечникова.- , IS89.- C.2GS-2I0. . Интерферонпндулрукщая активность амиксина п его влпякио на

-26 -

пнтерфероновый статус / ффГригорян„ А „Н.Иванова, П.ХсХодваев, Ф„И»Ершов // Вопр. вирусологии.- 1930.-Т.35, Я X.- С„61-64о 4. Григорян С.С„„ Иванова А.У„ , Ершов Ф.И» Противовирусная активность амикснна я его влияние яа ннтерфероновый статус при энтеральном гепатите мышей // Вопр. вирусоло-ш.- 1990.- Т. 35, й 2.- С.138-140. 5„ Ингайирующее действие препаратов группы вазодилататоров на продукцию вируса гепатита А в культуре клеток почки эмбриона макаки резус / АЛЛ,,Иванова, С.С.Григорян, Я.Х.Ходааев, Н. В Дорошенко, Ф.И.Ершов // Вирусные гепатиты: Тез. республиканского семинара-конференции,- Ташкент, 1990.- С.31-32. 3. Влияние индукторов интерферона на продукцию вируса гепатита А а культуре меток почки, эмбриона макаки резус / А.М.Иванова, С.С.Григорян, Ш.Х.Ходжаев, Н.ВДороыен-ко, 7оМ„0рлова, Ф.И.Ершов // Вирусные гепатиты: Тез. республиканского семинара-кощ.еренции.- Таякент, 1930.-С.29-31.