Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Теоретическое исследование молекулярных механизмов индукции и противовирусного действия интерферона

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Теоретическое исследование молекулярных механизмов индукции и противовирусного действия интерферона"

На правах рукописи

МЕХАНИЗМОВ ИНДУКЦИИ И ПРОТИВОВИРУСНОГО ДЕЙСТВИЯ ИНТЕРФЕРОНА

. 03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Кольцове - 1996

Работа выполнена в НИИ молекулярной биологии Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии "Вектор" Минздравмедпрома РФ.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук С.И. Бажан

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор химических наук, профессор Малыгин Э.Г.

кандидат биологических наук Коваленко С.П¡-¿^Ъ-^? .

Институт цитологии и генетики СО РАН

Зашита состоится 30 мая 1996 г.

на заседании диссертационного совета Д 074.20.01 в НИИ молекулярной биологии ГНЦВБ "Вектор" по адресу: 633159. п. Кольцово Новосибирской обл.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ молекулярной биологии ГНЦВБ "Вектор".

Автореферат разослан а-И^зРМ^ 1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета '

Шубина Т.Н.

Актуальность темы. Интерферон (IFN) является важным фактором, обеспечивающим индукцию и поддержание резистентности организма к вирусным инфекциям. Развитие и результат инфекции предопределяются эффективностью индукции интерферона, а также его антивирусной и иммуномодулирующей активностями. Исследование молекулярных механизмов индукции и антивирусного действия интерферона представляется актуальным для лучшего понимания регуляции и функционирования системы интерферона. От этого зависит успешное использование интерферона и его индукторов в качестве лечебно-профилактических препаратов при вирусных инфекциях и некоторых других патологических состояниях.

Сложная сеть взаимоотношений в системе вирус-интерферон делает трудным, в определенных ситуациях, прямой экспериментальный анализ вклада индивидуальных механизмов в регуляцию системы. В связи с этим актуальным становится проведение теоретического анализа закономерностей индукции и действия интерферона и использование для этих целей технологии математического моделирования с прогнозирующими возможностями компьютерного эксперимента. Цель н задачи исследования. Общая цель работы заключалась в проведении теоретического анализа закономерностей индукции и противовирусного действия интерферона I типа.

Индукция интерферона двухцепочечными РНК (дцРНК) и вирусами - сложный процесс, требующий участия многочисленных позитивных и негативных факторов (IRF-1, IRF-2, NF-кВ, AF-1, NRE-BP и др.). Молекулярные механизмы, вовлеченные во взаимодействие этих факторов, остаются во многом неизвестными. Задача исследования состояла в анализе альтернативных механизмов регуляции экспрессии интерферона.

Интерферон I типа индуцирует синтез в клетке ряда регуляторных белков, функциональные свойства которых определяют широкий спектр его биологических активностей. Показано, что уровни экспрессии Трех из этих белков: протеинкиназы. 2',5'-олигоаденилатсинтетазы (2',5'А синтетазы) и белка Мх коррелируют с развитием антивирусного состояния в инфицированных клетках. Одной из задач исследования было изучение роли интерферон-индуцируемых белков в индукции и поддержании противовирусного состояния в клетке, а также анализ возможного участия интерферон-индуцируемых белков в регуляции интерфероном собственной экспрессии.

Для исследования закономерностей индукции и противовирусного действия интерферона в работе был предложен новый теоретический подход, основанный на интегрированном описании процессов регуляции и функционирования системы интерферона. Одной из задач исследования явилась реализация этого подхода в виде компьютерной системы, которая представляет собой интегрированную базу знаний и объединяет две традиционные технологии описания и исследования биологических систем: базы данных и математические модели.

Научная новизна.

Впервые проведено исследование молекулярно-генетической системы регуляции экспрессии интерферона I типа с помощью методов математического моделирования.

На концептуальном уровне обоснована антирепрессорная модель регуляции генетической экспрессии интерферона, согласно которой лимитирующей стадией индукции промотора интерферона является удаление конститутивных репрессоров.

Впервые сделан вывод, что регуляция интерфероном собственной экспрессии при прайминге и блокинге может быть основана на процессах, связанных с действием интерферон-индуцируемых белков: протеинкиназы и 2',5'-олигоаденилатсинтетазы.

Впервые показано, что молекулярные механизмы экспрессии и противовирусного действия белка Мх1 принципиально различаются в зависимости от того, индуцируется этот белок интерфероном или вирусом. Белок Мх1, индуцируемый интерфероном, блокирует размножение вируса гриппа на стадии первичной транскрипции, тогда как вирус-индуцируемый белок Мх1 - на стадии вторичной транскрипции. Максимальный противовирусный эффект требует синергического действия вируса и интерферона в активации промотора Мх1. Выдвинута гипотеза, что активной формой интерферон-индуцируемого белка Мх1 является тример, вирус-индуцируемого белка Мх1 - мономер.

Разработан новый теоретический подход к анализу и интегрированному описанию процессов регуляции и функционирования системы интерферона. Создана компьютерная система, которая впервые объединяет две технологии представления знаний: информационно-аналитическую автоматизированную базу данных и динамические математические модели. Оригинальный алгоритм блочного построения использован для автоматической генерации математических моделей различной сложности в соответствии с задачей исследования.

Теоретическая и практическая ценность работы.

В работе проведен теоретический анализ закономерностей индукции и действия интерферона и построены концептуальные и математические модели, описывающие процессы регуляции ключевых звеньев системы интерферона на молекулярно-генетическом уровне.

Проанализирована роль интерферон-индуцируемых белков в регуляции противовирусной активности и собственной экспрессии интерферона. Показано, что интерферон имеет механизмы, которые обеспечивают эффективный контроль его экспрессии, а именно амплификацию синтеза при низкой концентрации в среде и ограничение экспрессии при высокой концентрации.

Важное значение имеют результаты, свидетельствующие о синергизме действия интерферона и двухцепочечных РНК при экспрессии эндогенного интерферона, а также при экспрессии интерферон-индуцируемых белков, в частности, белка Мх.

При помощи моделирования показано, что противовирусный эффект препаратов, в состав которых входит интерферон или дцРНК, может быть значительно повышен при их комбинированном применении. Данный эффект требует оптимизации дозы и схемы применения этих препаратов в отношении экспрессии как эндогенного интерферона, так и IFN-индуцируемых белков.

Созданная компьютерная система позволяет исследователю, работающему в данной области, накапливать необходимый и легко доступный объем информации по исследуемой проблеме, представлять материал в формализованном виде, генерировать в соответствии с задачами исследования математические модели, проводить необходимые компьютерные эксперименты (в вычислительной среде системы DISAM) и планировать проведение лабораторных экспериментов.

Разработанные в настоящей диссертации концептуальные и математические модели, созданная компьютерная система и полученные результаты позволяют глубже понять молекулярные механизмы, лежащие в основе индукции и действия интерферона, и могут быть использованы для дальнейшего теоретического и экспериментального исследования закономерностей регуляции и функционирования системы интерферона. Апробация работы. Основные материалы исследования были представлены на Первой, Второй и Третьей Всесоюзных Конференциях "Геном человека" (Москва, 1990, 1991 и 1993 гг.); на Международной Конференции "Modeling and Computer Methods in Molecular Biology and Genetics" (Новосибирск, 1991 г.); на Симпозиуме "Structure & Function of Regulatory Polypeptides" (Москва, 1992 г.), на Симпозиуме Япония-СНГ "Knowledge Based Software Engineering'94" (Москва, 1994 г.); на Международной Конференции Восток-Запад "Human-Computer Interaction" (Санкт-Петербург, 1994 г.); на б-й Международной Конференции "Artificial Intelligence and Expert Systems Application" (Houston, США, 1994 г.); на Ежегодной Конференции ISICR (International Society for Interferon & Cytokine Research) (Baltimore, США, 1995 г.) . Публикации . По теме диссертации опубликовано 17 работ.

Структура и объем работы. Работа состоит из введения, четырех глав, заключения, выводов, списка литературы. Работа изложена на 147 страницах машинописного текста, включая 18 рисунков, 2 таблицы, 271 библиографическую ссылку. Основные результаты работы получены в соавторстве с Бажаном С.И. и Лихошваем В.А.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Исследование регуляции экспрессии интерферона

Регуляция экспрессии генов интерферона является сложным процессом. В обычном состоянии гены, кодирующие интерфероны, являются неактивными, но могут быть быстро активированы различными природными и синтетическими агентами, такими как вирусы, синтетические полирибонуклеотиды и антигены. Показано, что

индукция экспрессии генов IFN в инфицированных клетках временна и не зависит от синтеза клеточных белков (Maniatis et al., 1992).

Регуляторные районы генов IFN-a и IFN-ß имеют ряд четких структурно-функциональных различий, свидетельствующих о дифференцированном контроле экспрессии этих генов (Pitha, Au, 1995; Hiscott et al., 1995). Вместе с тем активация промоторов генов IFN-a и IFN-ß имеет ряд общих закономерностей, которые позволяют подойти к моделированию регуляции экспрессии этих генов с общих позиций.

Теоретический анализ механизмов экспрессии интерферонов I типа показал, что в неиндуцированных клетках конститутивные репрессоры (IRF-2, NRE-BP) связываются с соответствующими сайтами в промоторах генов IFN-a и IFN-ß, блокируя транскрипцию этих генов (Рис. 1). В соответствии с моделью, первичным событием, вызывающим индукцию IFN-a и IFN-ß в ответ на вирусы и дцРНК, является дерепрессия их промоторов, вызванная разрушением репрессоров IRF-2 (в случае IFN-a и -ß) и NRE-BP (в случае IFN-ß). Параллельно с этим происходит индуцируемая дцРНК-зависимой протеинкиназой активация позитивных факторов AF-1 (в случае IFN-a) и NF-кВ (в случае IFN-ß). Эти индукционные гетеромерные комплексы присутствуют в неиндуцированной клетке в неактивной форме, и для их активации не требуется синтез белков (Pitha, Au, 1995; Hiscott et al., 1995). После удаления репрессоров они связываются с соответствующими сайтами в промоторных областях IFN-a и IFN-ß, что приводит к увеличению первичной транскрипции этих генов. Вирус-опосредованная экспрессия интерферона на данном этапе индукции не требует участия IRF-1.

Дальнейшее повышение экспрессии IFN-a и IFN-ß происходит после появления в клетке фактора IRF-1, который синтезируется на поздней стадии индукции (Harada et al., 1989). При этом максимальный эффект достигается при синергическом действии факторов IRF-1 и AF-1 в случае активации промотора IFN-a или факторов IRF-1, NF-кВ и ATF-2 в случае активации промотора IFN-ß (Garoufalis et al., 1994). Экспрессия гена IFN-ß амплифицируется еще в большей степени в результате формирования стереоспецифического белково-нуклеотидного комплекса между NF-kB/PRDII, IRF-1/PRDI-PRDIII и ATF-2/PRDIV, индуцируемого HMG I(Y) (Tjian, Maniatis, 1994).

Известно, что продукция интерферона падает и полностью прекращается через 6-7 часов после начала индукции даже при постоянном присутствии дцРНК в среде (Stewart, 1979). Это состояние клеток (гипореактивность) связано с развитием процессов, обеспечивающих ингибирование экспрессии интерферона на транскрипционном и постгранскрипционном уровнях. Ингибитором, выключающим транскрипцию генов IFN, может быть либо сам фактор IRF-2, который индуцируется вслед за появлением IRF-I в поздний период индукции, либо еще более активные (как ДНК-связывающие белки и репрессоры) продукты его процессинга (In4, PRDI-BF1, PRDII-BF1 и др.) (Рис. 1). Посттранскрипционное ингибирование экспрессии генов

Г Вирусная | инфекция и клетки

Рибонуклеаза неактивная

т

дцРНК

Протеинкиназа неактивная

Рибонуклеаза активная

Протеинкиназа активная

ОТ-кВ/АЕ-1 неактивный

Деградация клеточной мРНК

Конститутивная

транскрипция - ^ ▼ -

▼

III

1ЯР-1

ЖР-!

неактивный

активный (III)

То Удаление репрессо^а и активация первичной транскрипшш

I

▼

333

ОТ-кВ/АР-1 активный

|(П)

днк

мРНК

Белки

Репрессор Интерферон Регуляторный белок (ШИ-г, Г^ЛЕ-ВР) (специфическая нуклеаза)

Неспецифическая деградация, постиндукционный процессинг 1ЯР-2

Гликозилирование и секреция _ интерферона

Рис. 1. Концептуальная модель индукции синтеза интерферона I типа.

- б -

IFN связано с синтезом de novo белка-регулятора (IFN-специфической нуклеазы), который необратимо инактивирует мРНК интерферона. Белок-регулятор отсутствует в неиндуцированных клетках. Предполагается, что его экспрессия, так же как и экспрессия интерферона, активируется дцРНК.

Поскольку все факторы, кроме IRF-1, участвующие в регуляции транскрипции интерферона, конститутивно экспрессируются в неиндуцированной клетке, то лимитирующей стадией в активации промоторов IFN-a и IFN-ß является удаление репрессоров, блокирующих экспрессию интерферона в неиндуцированной клетке. Поэтому при моделировании индукции интерферонов в явном виде учитывались только ранние события, ведущие к активации экспрессии генов IFN I типа и связанные с дерепрессией их промоторов. Роль других факторов, осуществляющих позитивный контроль транскрипции этих генов на более поздних этапах индукции, учитывалась в неявной форме.

Известно, что интерферон может регулировать собственную экспрессию (Stewart, 1979). Предобработка клеток низкими дозами интерферона вызывает увеличение синтеза IFN в ответ на последующее введение индуктора (прайминг), высокие дозы интерферона индуцируют снижение выхода IFN, вызывая блокинг (Рис. 2Б). Ряд данных ставит под сомнение участие позитивных факторов, таких как IRF-1 и NF-кВ, в регуляции интерфероном собственной экспрессии при прайминге и блокинге (Raj et al., 1991; Rosztoczy, Pitha, 1993). Вместе с тем существующие данные позволяют предположить, что как и в случае индукции интерферона вирусом или дцРНК, регуляция интерфероном собственной экспрессии при прайминге и блокинге может быть основана на антирепрессорной модели и связана с удалением из системы белков, ингибирующих экспрессию интерферона на уровнях транскрипции и трансляции (IRF-2 для IFN-a и IFN-ß, NRE-BP для IFN-ß) (Рис. 1).

Тот факт, что индукция интерферона при прайминге и блокинге происходит раньше, чем в неиндуцированных клетках (Stewart, 1979), свидетельствует о том, что в основе этих явлений лежат общие механизмы. Анализ возможных механизмов регуляции интерфероном собственной экспрессии позволил предположить, что эти механизмы могут быть связаны с действием двух IFN-индуцируемых белков, 2',5'А синтетазы и протеинкиназы. Обоснование этого предположения было проведено с помощью разработанной математической модели (Бажан и др., 1993; Bazhan et al., 1995).

Математическая модель регуляции экспрессии интерферона представляет формализацию концептуально-логической модели (Рис. 1) в терминах дифференциальных уравнений. Для того, чтобы упростить и автоматизировать построение и расчет математической модели, использовался специальный алгоритм, разработанный В.А. Лихошваем. Идея алгоритма состоит в том, что исходная биологическая система представляется как множество отдельных подсистем (элементарных процессов). Каждый процесс сначала рассматривается и описывается

д Часы после индукции

I

дцРНК

дцРНК

Рис. 2. Влияние предобработки клеток интерфероном на его продукцию. (А) - результаты компьютерного моделирования; - экспериментальные данные (Stewart, 1979); нормальный ответ, 2 - блокинг (предобработка дозой 1000 ед/мл); 3 - прайминг (предобработка 1 ед/мл); 4 - прайминг (предобработка 1000 ед/мл + цикпогексемид).

(концептуально и математически) изолированно от других процессов, т.е. выделяется в самостоятельный элементарный блок. Блок представляет собой систему

дифференциальных уравнений ёХ/сИ = Р (X, Р). Правые части дифференциальных

уравнений - нелинейные функции зависимых переменных X, параметров Р и

независимой переменной, времени. Модель всей системы составляется из блоков по

определенным правилам.

При моделировании элементарных биологических процессов был применен

химико-кинетический подход. При этом использовались три типа кинетических схем.

к,

Схема 1. Бимолекулярная обратимая реакция х,+х2^ х3; X = х,, х2, х3; Р = к,, к2,

к2

где к, и к, - соответственно скорости прямой и обратной реакций. Для схемы 1 имеем

следующую систему дифференциальных уравнений: ёх1_ ¿х, с!х, С1ХЧ

¿1 - к2 • хз - V Х1 • х2: <и ~ <и ~ * сИ •

к _ _

Схема 2.Мономолекулярная необратимая реакция х—> у,+у2 +...+у„; Х= х,у,,у2,...,уп; Р =

к:

ЙЬ._ ЙЬ__^_

(1г " " сИ ~ " «И " сИ ~ "К х>

Схема 3. Образование п продуктов, индуцируемое взаимодействием т одновременно реагирующих компонентов к< к

' — — х,+х2 + ...+ хт г->у,+у2+...+уп; X =х,,х2.....хт, у„у2.....у„, т>2, п>0; Р = к,, к „,

где к; - параметр скорости мономолекулярного перехода промежуточного комплекса X, ка - параметр Михаэлиса-Ментен.

$ = - ■ * ' =1.....= V 2, ........п; где 2 = (к,+Х|). -• ••• ■ хт

Последовательное применение блочного подхода к описанию биологических систем основывается на законе суммирования скоростей протекания элементарных процессов при объединении их в общую схему развития моделируемого объекта. Система

дифференциальных уравнений для всей биологической системы <1Р/<11 = О (У, Б) строится из блоков, описывающих отдельные процессы: С(У, Б) = Р), где

У=и х", У=иТ.

Построенная в терминах биохимических реакций (схемы 1-3) математическая модель системы регуляции индукции и действия интерферона была адаптирована к экспериментальным данным литературы, и затем использовалась для исследования

возможного участия 2',5'А синтетазы и протеинкиназы в регуляции интерфероном собственной эспрессии.

2',5'А синтетаза осуществляет синтез олигоаденилатов с 2'.5'-фосфодиэфирной связью, которые активируют латентную эндорибонуклеазу L. катализирующую деградацию вирусной и клеточной РНК (Hovanessian, 1991). Активированная дцРНК-зависимым автофосфорилированием протеинкиназа фосфорилирует и тем самым инактивирует два белка: рибосомальный белок PI и малую субъединицу фактора инициации трансляции eIF-2a. Это приводит к ингибированию процесса инициации трансляции в клетке, вызывая блокирование вирусной репликации (Samuel. 1991, 1995).

Исследование модели показало, что активация 2',5'А синтетазы и эндонуклеазы L при прайминге приводит к усилению экспрессии интерферона, поскольку активированная эндонуклеаза L в данном случае увеличивает скорость деградации мРНК репрессора и белка-регулятора, которые в обычных условиях разрушаются только короткоживущими дцРНК-зависимыми нуклеазами (Рис. 1). Инактивация репрессора амплифицирует транскрипцию гена интерферона, а инактивация белка-регулятора приводит к увеличению времени полужизни мРНК интерферона. В результате этих процессов интерферон при прайминге начинает синтезироваться раньше и в заметно большем количестве, чем в контрольных клетках (Рис. 2).

При блокинге предобработка клеток высокими дозами интерферона вызывает значительное повышение в клетке концентрации протеинкиназы и 2',5'А синтетазы. Это приводит к тому, что интерферон при блокинге, так же как и при прайминге, начинает синтезироваться раньше. Ранняя фаза индукции интерферона при блокинге быстро сменяется фазой ингибирования его синтеза. Исследование модели показало, что этот эффект обусловлен в основном высокой активностью протеинкиназы, которая в этих условиях обеспечивает практически полное подавление синтеза белка в клетке, в том числе продукции интерферона.

Таким образом, наиболее вероятный механизм реализации блокинга связан с активацией протеинкиназы, механизм прайминга - с активацией 2',5'А синтетазы и эндорибонуклеазы L. В рамках этих двух механизмов модель воспроизводит основные особенности индукции интерферона, полученные при предобработке клеток высокими и низкими дозами интерферона или циклогексемидом (Рис. 2). Несмотря на то, что прайминг непосредственно не связан с противовирусной активностью интерферона, он имеет важное значение для реализации этой активности, поскольку при прайминге значительно повышается продукция эндогенного интерферона, в результате чего эффективность его противовирусной защиты может существенно возрасти.

Исследование модели методами компьютерного моделирования позволило получить ряд дополнительных характеристик поведения системы интерферона в зависимости от условий индукции интерферона. Зависимость эффективности синтеза эндогенного интерферона от дозы экзогенного интерферона, которой были предобработаны клетки, имеет строго выраженный "пороговый" характер и

показывает, что изменение продукции интерферона при прайминге и блокинге происходит по закону "все или ничего". Исследование модели показало, что прайминг имеет место в относительно узкой области изменений концентраций интерферона, где ответ максимальный.

Интервал между добавлением в среду интерферона и индуктора может быть одним из оптимизируемых параметров. Результаты исследования показывают, что если интерферон вносится в среду раньше индуктора, то время обработки клеток интерфероном не имеет значительного влияния на его продукцию при прайминге. Если интерферон добавляется после индуктора, то амплификации экспрессии интерферона не происходит. Синтез интерферона в этом случае снижается значительно, так что обработка клеток интерфероном через 3-5 часов после индуктора фактически не вызывает прайминг.

Итак, интерферон имеет дополнительные механизмы, позволяющие обеспечить эффективный контроль его продукции: усилить синтез при низкой концентрации в среде (прайминг) и снизить синтез при высокой концентрации (блокинг). Как следствие, такая регуляция может обеспечить оптимальную противовирусную защиту.

Исследование регуляции и функционирования системы вирус-интерферон-белок Мх

IFN-индуцируемые белки Мх обеспечивают селективную резистентность к ряду РНК-содержащих вирусов. В настоящее время существует две точки зрения относительно регуляции экспрессии генов, кодирующих синтез белков Мх. Согласно одной из них экспрессия генов Мх контролируется исключительно интерферонами I типа (Von Wussow, 1990). В соответствии с другой точкой зрения, в регуляции экспрессии генов Мх могут принимать участие также дцРНК и вирусы через IFN-независимый механизм (Whatelet, 1988). Задача данной работы состояла в изучении закономерностей функционирования системы BHpyc-IFN-белок Мх с целью анализа ключевых звеньев регуляции экспрессии и противовирусного действия белков Mxl, обеспечивающих устойчивость мышей к инфекции, вызываемой вирусом гриппа.

С этой целью известные экспериментальные данные о регуляции и функционировании системы BHpyc-IFN-белок Мх были обобщены в виде концептуальной модели, которая явилась затем основой для разработки математической модели (Bazhan, Belova, 1995). Модель записана как система обыкновенных нелинейных дифференциальных уравнений с запаздывающим аргументом, заданная на интервале времени [t0,T].

Переменные модели: V(t) - концентрация инфекционных вирусных частиц [ТСШ50/мл]; I(t) - концентрация интерферона [ед/мл]; M,(t) - уровень интерферон-индуцированного белка Мх [уе/мл], уе - условные единицы; Mv(t) - уровень вирус-индуцированного белка Мх [уе/мл]; C(t) - концентрация чувствительных к вирусу клеток-мишеней [клетки/мл]; C,(t) - концентрация резистентных (предобработанных интерфероном) клеток [клетки/мл].

- и -

Т = - ■ Я. • ад • VO- V Я, ■ ад ■ V«,,. ■ V(„.

^ = а, • р, • C(t) • V(t-T3) + а, ■ р2 • c,(t) • V(t-t4) - а2 • q2 • C(t) • I(t) - k2 • I(t), ^Ö1=a,-m1-C(t)-V(t-x5).k,-Mv(t)1 (1)

^^ = a2 • m3 ■ C(t) ■ I(t-t6) + a, • m, • C,(t) • V(t-t7) - k3 • M,(t).

=- a, • C(t) • V(t-T,) - a2 • C(t) • I(t-t8) + ,'O),

dC,(t) a, • C,(t)

dt " a,' C(t) ■ I(t-ta) -

V(t0) = V0,1(t0) = I0, Mv(t0) = Mvo, M,(t0) = M,0, C(t0) = C0, C,(t0) = C,0, C(t0) + C,(t0) = C*.

Параметры модели: a, - константа скорости связывания вируса с клетками; а, -константа скорости связывания интерферона с чувствительными клетками; а3 -константа скорости перехода клеток из резистентного в чувствительное состояние; d -выход вируса на клетку; q,, q2 - количество рецепторов к вирусу и интерферону; р,, р2 -константы скоростей секреции IFN чувствительными и резистентными клетками; ш,, ш2 - константы скоростей продукции белка Мх в ответ на вирусную инфекцию в чувствительных и резистентных клетках; т3 - константа скорости продукции белка Мх в ответ на интерферон в чувствительных клетках; к,, к2, к3 - константы скоростей неспецифической деградации вируса, интерферона и белка Мх; Ь, - константа ингибирования скорости размножения вируса белком Мх, индуцированным в ответ на вирус; Ь2 - константа ингибирования скорости перехода клеток из резистентного в чувствительное состояние белком Мх, индуцированным в ответ на IFN; т,, т2, т3, т4, т5, т6, т7, т8 - времена запаздываний, />1, п>1 (количество белков Мх в составе олигомера).

При адаптации математической модели за основу были взяты экспериментальные данные Arnheiter и соавт. (1980) (Рис. ЗА). Полученные значения параметров модели приведены в таблице. Модель воспроизводит основные закономерности поведения системы вирус-интерферон-белок Мх1 при варьировании множественности инфекции, начального уровня интерферона и экспрессии белка Мх1 (Рис. ЗБ).

Проведен сравнительный анализ IFN- и вирус-индуцированной экспрессии белка Mxl. Исследование модели подтверждает данные (Goetschy et al., 1989) о том, что, кроме интерферона, эффективными индукторами белка Mxl могут быть репликативные формы,вирусной дцРНК. Впервые оценен индивидуальный вклад каждого из этих механизмов в индукцию и поддержание противовирусного состояния. Показано, что противовирусная активность белка Mxl, индуцируемого вирусом, ниже, чем при индукции интерфероном. Без участия других противовирусных механизмов индивидуальная экспрессия белка Mxl ни при каких условиях не может обеспечить устойчивость клеток к вирусу гриппа (Рис. За). Напротив, белок Mxl, индуцируемый интерфероном, имеет выраженный противовирусный эффект и обеспечивает

Время после инфекции (час)

24 48 72 Время после инфекции (нас)

Время после инфекции (час)

Время после инфекции (час)

D

24 48 72 Время после инфекции (час)

D о

24 48 72 Время после инфекции (час)

24 48 72 Время после инфекции (час)

24 48 72 96 Время после инфекции (час)

Рис. 3. Размножение вируса гриппа в культурах гепатоцитов A/J и A2G. (А) - экспериментальные данные [Arnheiter et at., 1980]; (Б) - результаты расчета, а, б - начальная концентрация интерферона в культуральнои среде равна нулю: в, г - начальная концентрация интерферона в культуральной среде равна 80 ед/мл.

ira4t№irau naoua 1ПП isk n) н f) ftl (fi г)

8

2

Таблица

Параметры модели регуляции системы вирус-интерферон-белок Мх

Параметры модели, Значения после Начальные Ссылки на данные,

[ед. измерения] адаптации приближения использованные для

оценивания

а,. 3.3- 10'9 6.0 • 10"9 [Arnheiter et

[мл • ТСГО50"' час '] al.,1980]

аг, [мл • ед"' ■ час"'] 1.0- 10"3 (0.2-0.5)- 10"3 [Arnheiter et

al.,1980]

а3, [час '] 2.0- 10'2 (1.1 - 2.5) • 10"2 [Arnheiter et

al.,1980]

Ь,, [мл-уе"'] 0.4 0.2 [Arnheiter et

al.,1980]

Ь2, [мл-уе'1] 10.0 • 10"2 4.0 ■ 10"2 [Von Wussow, 1990]

(1, [ТСЮ50 ■ кл"' ] 6000.0 1000.0- 10000.0 [Arnheiter et

- al.,1980]

Чр [ТСГО50 ■ кл"' ] 100 - -

Я3, [ед • кл"'] 100 200 - 6000 [Pestkaet al„ 1987]

к,, [час'1 ] 0.1 0.1 [Arnheiter et al.,1980]

к„ [час'1] 0.12 0.17 [Stewart, 1979]

к,, [час'1] 1.5- Ю-2 1.3- 10"2 [Ronniet al„ 1993]

р,, [ед ■ кл"'] 4.6- Ю-2 (3.0-12.0)- 10"2 [Roberts et al„ 1979]

р2, [ед • кл"'] 1.0- Ю-2 (3.0-12.0)- 10"2 [Robertset al„ I979|

ш,, [уе • кл"' ] 1.0- 10"3 3.0- 10° [Goetschy et al.,1989]

ш2-,- [уе • кл"' ] 1.8 ■ Ю-2 1.4- 10"2 [Goetschy et al.,1989]

ш3, [уе • кл"' ] 2.0- Ю-3 (1-5)- 10"3 [Ronni et al„ 1993]

т,, [час] 6 6-8 [Barry, Mahy, 1979]

т,, [час] 3 - -

Ь [час] 8 4-8 [Stewart, 1979]

т4, [час] 13 - -

т5, [час] 3 2-6 [Goetschy et al.,1989]

т6, [час] 6 2-6 [Ronniet al„ 1993]

т7, [час] 16 т7 + т8=22 [Goetschy et al.,1989]

т„ [час] 6 - -

устойчивость клеток к вирусу (Рис. Зв). Однако, как показало исследование модели, защита клеток, инфицированных с высокой множественностью (Рис. Зв), возможна только в случае одновременного выполнения двух условий: 1) действие интерферона предшествует инфекции; 2) интерферон и вирус синергически участвуют в активации промотора Мх1. Это позволяет говорить о том, что синергическое участие интерферона и вируса в регуляции экспрессии белка Мх1 может быть одним из ведущих механизмов устойчивости мышей к инфекции, вызываемой вирусом гриппа.

Исследование модели показало, что различная активность белка Мх1 в двух альтернативных схемах индукции связана с ингибированием разных этапов внутриклеточного размножения вируса гриппа. 1ПЧ-индуцируемый белок Мх1 блокирует размножение вируса гриппа на стадии первичной транскрипции, ингибируя активность родительской РНК-полимеразы. Переводя клетки из состояния С в

состояние С,, он обеспечивая абсолютную устойчивость к инфекции клеток, обработанных интерфероном. Анализ результатов моделирования позволяет сделать вывод, что на популяционном уровне роль 1РЫ-индуцируемого белка Мх1 заключается в том, что он увеличивает процент резистентных к вирусу клеток. Вирус-индуцируемый белок Мх1 ингибирует размножение вируса гриппа на стадии вторичной транскрипции, взаимодействуя с компонентами дочернего полимеразного комплекса. В этом случае белок Мх1 ограничивает наработку вируса, оставляя инфицированные клетки чувствительными к инфекции. Проанализирована роль олигомерных структур белка Мх1 в реализации его противовирусной активности. Сделано предположение, что активной формой вирус-индуцированого белка Мх1 является мономер, тогда как ШЫ-индуцируемый белок Мх1 проявляет свою антивирусную активность через образование тримера.

Компьютерная система для анализа и интегрированного описания регуляции молекулярно-генетической системы индукции и действия интерферона

Технология создания и исследования математических моделей сложных биологических систем является многоэтапным процессом, включающим анализ большого объема фактографической информации, обобщение этой информации в рамках концептуальной модели, построение и исследование математических моделей. Содержание и объем информации, полнота концептуальной модели, структура и параметры математических моделей определяются совокупностью задач, выбранных для исследования, и могут существенно модифицироваться в процессе изучения биологической системы. Возникает задача автоматизации технологии создания и исследования математических моделей в рамках некоторой информационно-аналитической компьютерной системы, объединяющей рассмотренные выше этапы представления знаний.

Исходя из этого одной из задач работы явилось создание интегрированной (информационно-аналитической) базы знаний для описания и исследования молекулярно-генетической системы регуляции индукции и противовирусного действия интерферона. Главными компонентами интегрированной базы знаний являются: I) реферативная база данных, содержащая качественную и количественную информацию по организации и функционированию системы интерферона и данные по регуляции внутриклеточного размножения вируса гриппа: 2) математические модели, описывающие процессы регуляции индукции и действия интерферона при инфекции, вызываемой вирусом гриппа; 3) модуль накопления, хранения и графического представления результатов моделирования.

Предлагаемый подход реализован как программное обеспечение в интеллектуальной оболочке компьютерной системы 013АМ (Ве!оуа е1 а1., 1994, 1995). Среда системы 01БАМ позволяет генерировать и модифицировать математические модели, варьировать значения их параметров. Исследование поведения системы

интерферона проводится с использованием алгоритма автоматического блочного построения моделей. Разработанная компьютерная система может быть использована при планировании и проведении научных экспериментов, а также как основа для построения обучающей системы. Исследовательский прототип системы DISAM в 1992 г. передан в Центр информации программы (ГНТП) "Геном человека".

ВЫВОДЫ

1. Предложен и реализован в виде компьютерной системы DISAM новый теоретический подход к анализу и интегрированному описанию процессов регуляции и функционирования системы интерферона. Подход объединяет две технологии представления знаний - информационно-аналитические базы данных и динамические математические модели.

2. Впервые с использованием методов математического моделирования проведено исследование молекулярно-генетической системы регуляции экспрессии интерферона I типа. На концептуальном уровне обоснована антирепрессорная модель регуляции генетической экспрессии интерферона, согласно которой лимитирующей стадией индукции промотора интерферона является удаление конститутивных репрессоров. Исследование модели показало, что основную роль в регуляции интерфероном собственной экспрессии при прайминге играет 2',5'А синтетаза, при блокинге - протеинкиназа. Синергическое действие интерферона и дцРНК при прайминге требует оптимизации дозы и времени предобработки клеток этими препаратами.

3. Построены концептуальная и математическая модели регуляции и функционирования системы вирус гриппа-интерферон-белок Mxl. Проанализированы альтернативные механизмы индукции белка Mxl, вызванной прямой активацией промотора Mxl интерфероном либо вирусом, и оценен вклад каждого из этих механизмов в индукцию и поддержание противовирусного состояния. С помощью математического моделирования показано, что синергическое действие интерферона и вируса в регуляции экспрессии белка Mxl является важным фактором противовирусной резистентности.

4. Проанализированы молекулярные механизмы, определяющие различную противовирусную активность белка Mxl в двух альтернативных вариантах экспрессии. На основании анализа результатов компьютерного моделирования сделан вывод, что вирус- и IFN-индуцируемые белки Mxl действуют на разные стадии внутриклеточного размножения вируса гриппа. Высказано предположение, что активной формой вирус-индуцируемого белка Mxl является мономер, а IFN-индуцируемого белка Mxl -тример. Исследование модели показало, что на популяционном уровне роль вирус-индуцированного белка Mxl состоит в снижении наработки вируса в инфицированных клетках, роль IFN-индуцируемого белка Mxl - в увеличении числа резистентных к вирусу клеток.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Likhoshvai V.A., Bazhan S.I., Belova О.Е. Mathematical modeling of molecular genetic system regulation of interferon induction and antiviral action. // In : Ratner V.A., Kolchanov N.A. (eds.), Reports of International Conference "Modeling on Computer Methods in Molecular Biology and Genetics", Nova Science Publishers, New York, 1992, p.293-299.

2. Бажан С.И., Лихошвай В.А., Белова О.Е. Теоретический анализ возможных механизмов индукции интерферона при прайминге и блокинге. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1993, том 116, N 9, с. 279-283.

3. Belova О.Е., Likhoshvai V.A., Bazhan S.I., Kulichkov V.A. Integrated Knowledge Base for Description and Investigation of Biological Systems. // In: Proceedings of Japan-CIS Symposium on Knowledge Based Software Engineering'94. (Ueno, H., Stefanuk, V.L., eds), Japan: ISSHINSHA, Ltd, 1994, p. 221-224.

4. Belova O.E., Likhoshvai V.A., Bazhan S.I. The Knowledge-Based System for Investigation of Regulation and Functioning of Molecular-Genetic Systems. // In: Proceedings of EWHCI'94 (The East-West International Conference on Human-Computer Interaction, St. Petersburg, 2-6 August, 1994), V.2, p. 115-118.

5. Belova O.E., Likhoshvai V.A., Bazhan S.I., Kulichkov V.A. Computer System for Investigation and Integrated Description of Molecular-Genetic System Regulation of Interferon Induction and Action. // Comput. Appl. Biosci., 1995, V. 11, N 2, p. 213-218.

6. Bazhan S.I., Likhoshvai V.A.. Beiova O.E. Theoretical Analysis of the Regulation of Interferon Expression During Priming and Blocking. // J. Theor. Biol., 1995, V. 175-, p. 149-160.

7. Bazhan S.I., Belova O.E. Alternative mechanisms of Mx protein induction and action: Mathematical modeling. //J. Interferon Res., 1995, V. 15, Suppl. 1, SI 56.

8. Bazhan S.I., Belova O.E. Molecular mechanisms of interferon gene expression: A theoretical analysis. //J. Interferon Res., 1995, V. 15, Suppl. 1, SI 56.