Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительный анализ противогриппозной активности соединений ряда азоло-азинов, флуоренов и акридонов

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Сравнительный анализ противогриппозной активности соединений ряда азоло-азинов, флуоренов и акридонов"

Российская академия медицинских наук Научно-исследовательский институт гриппа

На правах рукописи ДЕЕВА Элла Германовна Г" 5 ОД

" 3 АИР 2113

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПРОТИВОГРИППОЗНОЙ АКТИВНОСТИ СОЕДИНЕНИЙ РЯДА АЗОЛО-АЗИНОВ, ФЛУОРЕНОВ И АКР И ДОНОВ

(03.00.06 - вирусология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург 2000

Работа выполнена в отделе молекулярной вирусологии Научно-исследовательского института гриппа РАМН.

Научный руководитель:

профессор, доктор биологических наук О.И. Киселев.

Ведущая организация:

Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробио-

логии им.Пастера.

Официальные оппоненты:

д.м.н., профессор, академик РАМН Ф.И.Ершов,

д.м.н., профессор О.К.Кузнецов.

Защита диссертации состоится марта 2000 г.

в./5 л оо .мин. на заседании Диссертационного совета Д.001.46.01. при НИИ гриппа РАМН по адресу: ул. Проф. Попова, д.15/17.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ гриппа

РАМН.

Автореферат разослан.

2000 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д.001.46.01.

к.б.н. Покровская Е.Е.

рл?'- ¿н , 0

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Гриппозная инфекция занимает особое место среди вирусных заболеваний человека и является уникальной по своей способности вызывать внезапные эпидемии глобального масштаба (Webster R.G. et al., 1992). Постоянное появление новых антигенных вариантов вирусов гриппа типов А и В в значительной степеш1 снижает эффективность специфической вакцинопрофилактики гриппозной инфекции. В связи с этим, в арсенале методов борьбы против гриппа, видное место занимают хтаиопрофилактика и химиотерапия (HaydenF.G., 1997). Однако выбор препаратов против гриппа весьма ограничен, что определяет безусловную актуальность проблемы усовершенствования традиционных противовирусных препаратов и изыскания новых.

Настоящая работа посвящена ревизии противовирусных препаратов, использующихся для лечения и профилактики гриппозной инфекции и возможным методам усовершенствования их свойств, а также изысканию новых препаратов, обладающих широким спектром противовирусной активности. В этом отношении с нашей точки зрения перспективными являются индукторы интерферона и соединения ряда азоло-азинов.

В настоящее время для лечения и профилактики вирусных инфекций весьма успешно стали применяться рекомбинантные препараты шгтерферонов человека и индукторы интерферонов (Ершов Ф.И., 1998). В частности, наиболее известными являются препарат группы акридо-нов - циклоферон (неовир, камедон) и препарат группы флуоренов -амиксин (тилорон), которые обладают противовирусной, иммуномо-дулирующей и противоопухолевой активностью. Вместе с тем, свойства этих препаратов недостаточно изучены, учитывая их весьма широкий спектр противовирусной активности.

Кроме того, в современных тенденциях развития противовирусных препаратов наблюдается преимущественный интерес к синтезу аналогов нуклеозидов, так как известно, что на их основе уже создано целое поколение противовирусных препаратов против герпетической, цито-мегаловирусной инфекций, болезни Эпштейн-Барра (Киселев О.И., 1999). Так, разработанные в Уральском техническом университете препараты ряда азоло-азинов, которые являются синтетическими аналогами гуанина, оказались весьма перспективными соединениями в отношении их противовирусной активности, которая распространяется на широкий спектр вирусов (Русинов В.Л., 1990).

Однако недостатки^присущие многим противовирусным препара-тамдюдводят к необходимости использования принципиально новых подходов в проблеме получения лекарственных средств. С этой точки зрения перспективным направлением является включение традиционных лекарственных препаратов в полимерную матрицу (Платэ H.A., 1986). И действительно, вследствие включения физиологически активных веществ в полимерную матрицу происходит повышение их эффективности, преодолевается эффект резистентности, регулируется скорость действия и время пребывания препаратов в клетке и организме, снижается токсичность (Киселев О.И., 1999). Так, уже создан препарат "Полирем", который представляет собой ремантадин на полимерном носителе, содержащем вшшламидоянтарную кислоту. Этот препарат прошел весь комплекс предклинических и клинических испытаний. От мономерного ремантадина он отличается лучшими показателями по фармакокинетике, токсичности и терапевтической эффективности. Следовательно, создание физиологически активных полимеров представляет собой внесение принципиально новых химических и биологических идей в проблему получения лекарственных средств, в частности, направленных на борьбу с вирусными инфекциями.

Целью настоящей работы было изыскание новых эффективных противовирусных средств и анализ механизмов противовирусной активности индукторов интерферона.

Задачи настоящего исследования

1. Проанализировать этиологическую структуру последних эпидемий в России с точки зрения формулирования тактики химиопрофи-лактики и лечения современной гриппозной инфекции.

2 Изучить противогриппозную активность соединений ряда азоло-азинов и выявить корреляции между структурой и биологической активностью препаратов данной группы.

3. Изучить противовирусную активность индукторов интерферонов, таких как циклоферон и амиксин.

4. Определить возможности технологии включения препаратов данной группы в полимерную матрицу с целью усовершенствования их базовых и появления новых положительных свойств, что способствовало бы расширению их спектра применения.

5. Провести анализ корреляций между структурой и функциональной активностью противовирусных препаратов и индукторов интерферона.

Научная новизна

Впервые проведен широкий анализ препаратов группы азоло-ази-нов, близких по структуре к ациклическим нуклеозидам и изучено их действие на репликацию вируса гриппа. Впервые разработан полимерный носитель катиошюго типа, позволяющий получать комплексы с кислотами, в частности с акридонуксуеной кислотой и для данного препарата получены основные биологические характеристики.

Практическая значимость работы

Расширение спектра действия противовирусных препаратов для лечения основных форм вирусных инфекций человека, таких как грипп, герпес.

Основные положения, выносимые па защиту

1. Длительная и стабильная смешанная циркуляция вирусов гриппа А/НШ1/, А/НЗШ/ и В в последние годы определяет необходимость поиска и разработки химиопрепаратов широкого спектра действия.

2. На основании полученных данных о противовирусной активности препаратов ряда азоло-азннов, стало очевидно, что использование ациклических заместителей, приближающих их по структуре к ациклическим нуклеозидам гуашшювого ряда, может существенно повысить их противогриппозную активность.

3. Среди разрешенных в настоящее время индукторов интерферо-нов большинство из препаратов по основным элементам структуры способны проявлять ДНК- или РНК-связывающие свойства. Это позволяет прогнозировать их способность к подавлегасо репликации вирусов.

4. На основе ранее полученных данных (Патент РФ, 1Ш 2071323 С1, 10.01.1997, «Противовирусный препарат «Полирем»»), очевидна необходимость применения полимерных носителей, что может существенно изменить фармакологические свойства индуктороз интер'фе-рона.

5. Анализ корреляций между структурой и функциональной активностью индукторов интерферона и противовирусных препаратов на основе акридонов (циклоферон) и флуоренов (амиксин) показал, что введение боковых заместителей основного характера, начиная от ами-но-групп, и включая амино-этокси группы во флуореновое или акридиновое ядро, существенно изменяют их фармакологические свойства, что приводит, для некоторых из них, к появлению антибактериальной н противовирусной активности, а некоторые из этих модифи-

кадий делают данные препараты перспективными в плане реализации противоопухолевой активности.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на юбилейной научной международной конференции «Грипп-XXI век», Санкт-Петербург, 1997, на выездной сессии РАМН, Архангельск, 1999 и Совещании опорных баз ФЦГ, Санкт-Петербург, 1999.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения; обзора литературы, включающего 3 главы; результатов собственных исследований, включающих "Материалы и методы" и "Результаты и обсуждение", изложенные в 5 главах, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 145 страницах машинописного текста, содержит /3 таблиц, рисунков; список литературы содержит 190 наименований на русском и английском языках.

Автор пользуется случаем выразить искреннюю благодарность своему научному руководителю - д.б.н. проф. О.И. Киселеву, консультанту по вопросам испытаний противовирусных препаратов - к.м.н. В.Г. Платонову, сотрудникам НИИ гриппаРАМН-д.м.н. проф. В.И. Ильенко, К.6.Н. О.М. Литвиновой, K.6.H. Л.Ф. Литвинчук, к.м.н. В.П. Сухинину, к.м.н. В.В. Зарубаеву и A.B. Слите за оказанную помощь в выполнении диссертационной работы, ценные советы и рекомендации, а также д.х.н. Л.Б. Пиотровскому и д.х.н. проф. В.Л.Русинову за консультации и замечали по химическому разделу работы.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы

Клеточные культуры

В эксперименте использовались следующие клеточные линии:

Постоянная клеточная линия Mg-бЗ. Посевнаядоза- 2,5 х 105кл/мл.

Трансформированная клеточная линия Vero, обеспечивающая развитие продуктивной инфекции вируса герпеса. Посевная доза - 2,5 х 105 кл/мл.

Клеточная шипи Нер-2, обеспечивающая развитие продуктивной инфекции вируса герпеса. Посевная доза - 2,5 х 105 кл/мл.

Клеточные линии получены из Российской Коллекции клеточных культур.

Перевиваемая клеточная линия МДСК, обеспечивающая развитие продуктивной инфекции вируса гриппа. Посевная доза- 2,5х 105кп/мл. Клеточная линия получена из CDC, Atlanta, USA.

Вирусы

В работе использовались:

Чувствительный к ремантадину вирус гриппа А/Гонконг/1/68 (H3N2), зирус гриппа В/Самара/253/99, ремантадинрезистептные штаммы вируса гриппа - А/Монголия/5б/87 (H0N1) и A/PR/8/34 (H0N1). Штаммы вирусов получены из музея штаммов НИИ гриппа

Вирус гриппа A/Duck/Singapore-Q/F 119-3/97 (H5N1) получен из CDC, Atlanta, USA.

Вирус герпеса простого штамм ЕС, получен из Российской Коллекции ВИруСОВ (институт ВИруСОЛОГИИ ИМ. Д.И.ИванОБСКОГО).

Вирус везикулярного стоматита, штамм Индиана, заражающая доза 100 ЦЦЦ50/лунку, получен из Российской Коллекции вирусов ( Институт вирусологии им. Д.И.Ивановского).

Животные

Во всех опытах были использованы белые беспородные мыши, весом в 10-12 гр. из питомника АМН РФ "Рапполово".

Препараты

1 .Препараты ряда азоло-азинов, которые являются близкими аналогами азотистого основания гуанина и синтезированы в Уральском техническом университете (г. Екатеринбург).

Рисунок 1. Общая формула препаратов ряда азоло-азинов.

Для сравнения использовали традиционный препарат ряда адаман-танов - ремантадина гидрохлорид.

РАМН.

О

2. Препараты акрццокуксусной кислоты, относятся к классу акрццо-нов.

В качестве базового препарата был использован индуктор интерферона цшшоферон - К-метил-Н(а, В-глюкопиранозол)аммоний-10-ме-тилен-карбоксштат акридона.

Рисунок 2. Структурная формула акридонуксусной кислоты (щисло-

ферон). о

н2?-Ч

Препараты цшшоферона на полимерной матрице были синтезированы в Институте Высокомолекулярных Соединений (г. Санкт-Петербург). Препараты представляют собой соединения из 2-х компонентов - акридонуксусная кислота и соли сополимера №винилпирролидона и имеют различия в структуре полимерного носителя.

Рисунок 3. Структурная формула препаратов циклоферона на полимерной матрице.

—(СН2 — СН)т—(СН2-СН)п

3. Препарат амиксин относится к синтетическим соединениям класса флуоренов - 2,7-Бис(2-[дштиламино]этокси)флуоренона-9-дигидрох-лорид.

Рисунок 4. Структурная формула амиксина.

/С2Н5

О—CH-I-LC—N

С2Н5

О 2 5

Методы

1. Накопление вируссодержащей жидкости

1.1. Вирусы гриппа пассировали в аллантоисной жидкости 10-дневных развивающихся куриных эмбрионов (КЭ), заражение которых осуществлялось введением 0,2 мл раствора, содержащего 103-104 ЭИД30 вируса гриппа. Зараженные вирусом гриппа эмбрионы инкубировали 48-72 часа при Т +34°С. Наличие вируса в аллаотоисной жидкости определяли в РГА.

1.2. Вирус герпеса накапливали путем пассажей вируссодержащей жидкости на клеточной культуре Vero, титр вируса составлял 6,0 lg ТЦД/ мл. Наличие вируса определяли по формированию характерного ЦПД через 48 часов инкубации.

2. Определение противовирусной активности исследуемых препаратов

Противовирусную активность препаратов определяли в опытах на модели переживающих фрагментов хорион-аллантоисных оболочек куриных эмбрионов (ХАО) и клеточных культурах МДСК, Vero и Нер-2.

2.1. Изучение активное™ репликации вируса гриппа в присутствии и отсутствии препаратов проводили на 96-луночных микроплашиетах и результаты оценивали через 48 часов (для гриппа А) и 72 часа (для гриппа В) культивирования зараженных клеток МДСК по реакции ГА с 1 % куриными эритроцитами.

2.2. Определение противовирусной активности препаратов в отношении вируса гриппа проводили на 72-луночных панелях с использованием фрагментов ХАО. Препараты в исследуемых концентрациях вносили в лунки планшета с фрагментами ХАО, куда затем добавляли вирус в разведениях и инкубировали при температуре 33-34°С. Инги-бирующее действие препаратов оценивали по реакции ГА при добавлении 1% куриных эритроцитов.

2.3. Изучение противовирусной активности препаратов в отношении вируса простого герпеса проводили на 96-луночных микрогшан-шетах с использованием клеток Vero и Нер-2. Результаты оценивали

через 48 часов культивирования зараженных клеток по степени цито-патического действия, вызываемого вирусом.

3. Определение токсичности препаратов

Токсичность препаратов изучали на культуре клеток .МДСК, Нер-2, Vero и фрагментах ХАО.

3.1. При изучении токсичности на клетках Vero, МДСК и Нер-2 состояние клеточного монослоя оценивали через 1,3-5 дней культивирования незараженных клеток Vero в присутствии исследуемых концентраций препаратов. Наименьшее разведение препарата, вызывающею дегенерацию клеток, считали минимальной токсической дозой (МТД). В работе использовали разведение, составляющее 1/2 минимальной токсической дозы.

3.2. Токсичность соединений для культуры ХАО определяли через 48 часов инкубации фрагментов ХАО в присутствии исследуемых концентраций препаратов по состоянию оболочек. Минимальной токсической дозой (МТД) считали наибольшую концентрацию препарата, вызвавшую гибель 50 и более процентов фрагментов ХАО.

4. Исследование внутриклеточного распределения препаратов с использованием люминесцентного микроскопа

Учитывая особенность акридонуксу спой кислоты, которая обладает естественной флюоресценцией, мы имели возможность использовать люминесцентный микроскоп для изучения внутриклеточного распределения и распределения по органам мышей исследуемых препаратов.

4.1. На микроскопе МЛ-2 (х20, х40) исследовали распределите препаратов по органам на модели белых мышей, используя криостатные срезы органов, взятые через 10,30 и 60 минут после введения препаратов. Препараты вводили внутрибрюшишю в концентрации 0,12 г/мл активного вещества.

4.2. Для изучения динамики и внутриклеточного распределения, препараты в концентрации 5 мг/мл (в пересчете на активное вещество) наслаивали на покровные стекла с однослойной культурой клеток МДСК nMg-63 и инкубировали 1,5,10,30,60 минут; 2,3,4,5,6,8,18 и24 часа. Затем, после фиксации клеток в ацетоне, результаты учитывали на микроскопе МЛ-2 (х90).

5. Определение интерферон-индуцирующей активности препаратов

Белым беспородным мышам вводили растворы изучаемых соединений. Уровень противовирусной активности сывороток крови мышеи после различных сроков экспозиции препаратов определяли биологи-

ческим методом: титрованием проб в 96-луночных микропланшетах в культуре клеток Ь-929 против вируса везикулярного стоматита. Учет результатов проводили после окрашивания клеточного монослоя 0,1 % раствором кристаллического фиолетового. За титр противовирусной активности принимали величину, обратную разведению, обеспечивающему 50% противовирусную защиту клеток Ь-929.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Этиологическая структура эпидемий гриппа 1995-1999 тт.

В настоящее время во всем мире наблюдается сложная этиологическая ситуация по гриппу. Современный эпидемический процесс характеризуется выраженными изменениями антигенных свойств вирусов гриппа А/НШ1/, гетерогенностью современной популяции вирусов гриппа А/НЗЫ2/ и В и актшзизацией вирусов гриппа В в развитии эпидемий (рисунок 5).

Рисунок 5. Этиологическая структура эпидемий 1995-1999 гг. вРоссии.

1995-1996 гг.

1996 -1997 гг.

□ Н1№1 ННЗИ2

□ В

ПН1Ж

анзыг □ в

1997 -1998 гг.

□ Н1Ж

ннзыг ов

1998- 1999 гг.

ПН1Ж Н НЗМ2 □ В

Кроме того, в последш!е годы вирусологи разных стран обеспокоены возможностью возникновения 1ршшозной пандемии. Затянувшийся период циркуляции Гонконгского гргаша (31 год) является одним из

мотивов для беспокойства с точки зрения возможности появления новою пандемического вируса. Другой возможностью появления пандемических вирусов является непосредственное преодоление межвидовых барьеров вирусами гриппа птиц и животных, как это впервые произошло в Гонконге в 1997 году, когда среди людей были зарегистрированы случаи тяжелых заболеваний, вызванных вирусами гриппа гггиц - А/Н5Ы1 и повторилось в 1999 году, когда были выделены вирусы гриппа А/Н9Ы2. При этом заболевания протекали крайне тяжело и сопровождались высокой смертностью среди заболевших.

Поэтому важнейшее значение приобретает заблаговременное создание новых противовирусных средств и определение подходов для усовершенствования уже имеющихся традиционных антивирусных препаратов, использующихся для лечения и профилактики гриппозной инфекции. Кроме того, разработка новых препаратов для лечения и профилактики заболеваний, вызванных гриппом типа В в настоящее время становится крайне актуальной ввиду отчетливого повышения активности вирусов гриппа типа В в структуре современных эпидемий.

2. Изучение противовирусной активности соединений ряда азоло-азинов

В данном разделе работы мы попытались определить судьбу производных ряда азоло-азинов в отношении вируса гриппа, так как известно, что соединения этого ряда являются синтетическими аналогами природного азотистого основания гуанина, на основе которого уже создано целое поколение противовирусных препаратов широко использующихся в клинической практике.

На первом этапе нами было изучено 47 соединений ряда азоло-ази-нов в отношении вирусов гриппа типа А и В, и два из них оказались перспективными в плане дальнейшего изучения. В таблице 1 показано подавление репродукции различных штаммов вируса гриппа при использовании соединений №1531 и№1532, которые оказались активными в отношешш как гриппа А, так и гриппа В, что свидетельствует о независимом механизме их действия. Являясь аналогами гуанина, они действуют непосредственно на процесс репликации вирусных нуклеиновых кислот.

Анализируя структуру соединений ряда азоло-азинов мы сделали вывод, что ациклическая группа (&,) является важным структурным компонентом в плане реализащш их противовирусной активности.

Что касается механизма действия препаратов данной группы, то по-видимому он состоит в том, что они, встраиваясь в растущую цепь нуклеиновой кислоты, приводят к формированию неспаренного участка (рис.6). Из рисунка видно, что препараты ряда азоло-азинов не способны образовывать пару, аналогичную гуанин-цитозин, в связи с наличием экспонированного объемного заместителя ГЦ , который полностью блокирует формирование всех трех водородных связей. В не-

Таблица 1. Изучение противовирусной активности препаратов ряда азоло-азинов (снижение репродукции вируса гриппа в 1§ЭИД50).

Модельные вирусы

Шифр препарата Концентрация препарата А/НЗК2 А/НОШ А/НОШ А/Н5Ы1 В

А/Гон-конг/1/68 А/РЫ/8/34 А/Монго-лия/56/87 АЛЭиск/ Зйща-роге-Л/Р 119-3/97 В/Самара/ 253/99

№ 20 мкг/мл 2,01§ 2,51§ 4,01§ 2,5 \Ъ 2,51ё

1532 40 мкг/мл 2,518 4,018 4,018 3,018 3,018

№ 20 мкг/мл 0,518 2,518 2,5 1,51ё 1,018

1531 40 мкг/мл 2,01§ 4,0 ^ 3,01§ 3,01§ 2,5

Реман- 20 мкг/мл 2,5 ^ 1,0 0 3,01§ 0 Ы

тадин 40 мкг/мл 2,51ё - 1,51ё 1,518 3,018 0,51§

Исходный титр вируса 3,51а 5,5 5,0 4,01ё 4,5

спаренном участке РНК-полимераза не выполняет своих функций дальнейшего роста полкнуклеотидной цепи. Учитывая природу заместителей и их локализацию, следует о тметить, что исследованные нами производные азоло-азинов, содержащие ациклические заместители, существенно отличаются по структуре от ацикловира, и главным образом -локализацией псевдосахарного остатка. Поэтому, для окончательного суждения о механизмах действия необходимы дальнейшие исследования структурных аналогов с различной локализацией ациклических заместителей. Таким образом, азоло-азины представляют собой перспективный класс соединений, на основе которых возможна разработка противовирусных препаратов широкого спектра действия.

Рисунок 6. Сравнение Г-Ц (гуанин-цитозин) пары нуклеиновых кислот с аналогичной парой, где гуанин заменен соединением ряда азоло-азинов.

Н

Н- ^м 0 ---Н-Ы Н

Ы-Н----О 13

ГУАНИН Н ЦИТОЗИН

н /

N О Н-Ы Н

%

I N

И--

О Р

АЗОЛО-АЗИН 1ДИТОЗИН

3. Изучение противовирусной активности амнксина

Амиксин является индуктором а- и |3-интерферонов и в настоящее время широко применяется для лечения вирусных инфекций. В силу своей химической природы, связываясь с вирусными РНК и ДНК, он

должен проявлять противовирусную активность в отношении различных вирусов, независимо от их принадлежности к тем или иным семействам. И действительно, при изучении противовирусной активности амиксина в отношении вирусов гриппа была показана сопоставимая с ремантадином активность препарата в отношении вируса гриппа типа А (в том числе и A/H5N1), а также, в отличии от ремантадина, амиксин снижал репродукцию вируса гриппа В (до 4,0 lg) и ремантадин-резистентных штаммов (до 4,0 lg). Однако, в концентрации 100 мкг/мл амиксин проявил токсичность на модели ХЛО.

Кроме того, на модели клеток Vero и Нер-2 в концентрации 10 мкг/мл, противогерпетическое действие амиксина составляло 60-70%, а токсичность проявлялась при концентрации выше 10 мкг/мл. Таким образом, амикснп обладает противовирусной активностью, но вследствие выраженного токсического действия на клетки, имеет низкий терапевтический индекс. Более того, учитывая наличие у препарата сильно экспонированных положительно заряженных амино-этокси гругпт, его токсичность на клетках может быть связана со взаимодействием с отрицательно заряженными головками фосфолипидов клеточных мембран. Также не исключена модификация в организме при резорбтив-ном действии препарата.

Проведенный анализ корреляций между структурой и функциями противовирусных препаратов на основе флуоренов показал, что характер симметричных заместителей флуоренового "ядра" в значительной степени определяет как токсичность этих соединений, так и их биологическую активность. В частности полученный совместно с сотрудникам и кафедры органической химии Уральского технического yini-верситета 2,7-бис(п-бутилсульфеноил) флуорен (рис. 12), несущий два симметричных гидрофобных заместителя проявят исключительно высокую противовирусную активность и низкую токсичность. Поэтому, на основании полученных результатов, можно сделать вывод о том, что сильный положит ельный симметричный заряд аминоэюкси-групп у амиксина является причиной повышенной способности этих производных к связыванию с нуклеиновыми кислотами, а использование других заместителей позволяет сохранить высокий уровень противовирусной активности и на 2 порядка снизить токсичность препарата. Это свидетельствует о том, что существенно возрастает селективность этих производных флуоренов.

4. Изучение биологических свойств препаратов акр5!донуксусной кислоты. Применение полимеров-носителей для улучшения биологических свойств акридонуксусной кислоты

Для обоснования перспектив технологии включения физиологически активных веществ в полимерную матрицу, нами был выбран другой индуктор ингерферонов относящийся к классу акридонов - циклофе-рон (акридонуксусная кислота). В рамках этого исследования были получены полимерные аналоги циклоферона - соли сополимера М-ви-шшпирролидона с акридонуксусной кислотой (№394, №395).

4.1. Противовирусная активность

Изучение противовирусной активности препаратов мономерного и полимерного циклоферона показало, что в достаточно большом диапазоне концентраций (20-200 ммг/мл) ни одно из тестируемых соединений не подавляло репродукцию вирусов гриппа (А и В) и вируса герпеса. Эти результаты позволили сделать вывод о том, что циклоферон не обладает прямым противовирусным действием, а использование его в качестве противовирусного препарата связано с опосредованным действием на вирус через индукцию эндогенного интерферона.

4.2. Интерферон-ипдуцирующая активность

Далее нами были предприняты попытки оценить интерферон-инду -цирующую активность мономерного циклоферона и сравнить ее с активностью ряда полимерных препаратов, в качестве активного вещества в которых была использована акридонуксусная кислота (циклоферон). Все представленные в этом и в последующих опытах данные пересчитаны пропорционально весовому содержанию акридонуксусной кислоты (рисунок 7).

В результате проведенных исследований было показано, что полимерный препарат №395 проявил наибольшую шггерферон-индуциру-ющую активность, которая составляла 2000 ед/мл через 8 часов после парентерально введения. Максимальный уровень образования интерферона в ответ на введение мономерного циклоферона наблюдался через 2 часа после его введения и составлял 1485 ед/мл. Таким образом, полимерный аналог циклоферона, являясь более активным стимулятором образования эндогенного интерферона, вызывает пик ин-терферонообразования позднее, чем мономерный циклоферон. Очевидны определенные преимущества мономерного циклоферона в отношении быстрой индукции шггерферона (2 часа), что позволяет его рекомендовать в качестве препарата для лечения острой фазы вирус-

Рисунок 7. Динамика образоваши шггерферона при введении мономерного пиклоферона и его полимерных аналогов.

¿4/м 2000

1500

1000

500

*=

11 WI т -И

□ №395 О N2392

□ №394

□ циклоферон

12 24 юсь/

ной инфекции, в то время как полимерный аналог циклоферона, с несколько отсроченной и удлиненной фазой индукции интерферона (8 часов), может проявить себя эффективным средством предупреждения развития осложнений вирусных инфекций и перехода их в хроническую стадию, а так же как средство профилактики вирусных заболеваний.

4.3. Изучение внутриклеточного распределения циклоферона

Изучение динамики и внутриклеточного распределения мономерного циклоферона и циклоферона на полимере-носителе проводилось на клеточной линии Mg-63. Препараты исследовались в концентрации 5мг/мл.

Что касается полимерных препаратов, то, начиная с 1 минуты экспозиции полимера с клеткой, мы наблюдали начальный этап проникновения препарата через плазматическую мембрану и транспорт вещества вдоль волокон эндоплазматическото ретикулума к ядру и накопление его в перину клеарном пространстве. Причем, для 30-40% клеток на этом этапе характерно накопление полимера в ядрышках.

Уже к 10 минутам экспозиции основная часть препарата переходит из перинуклеарного пространства в ядро, где, равномерно распределяясь по всей его площади, депонируется в ядрышках. В то же время,

препарат, поступая в ядро, вызывает в нем, по-видимому, структурные перестройки и связывается с ядерными структурами, что проявляется а виде флюоресцирующих гранул, расположенных по периферии ядра (рис 8).

На этапе 30 минутной экспозиции препарата с клетками, можно скачать, что картина достигла максимального завершения - свечение препарата в клетках наиболее интенсивно (рис. 9).

На всех последующих сроках экспозиции, вплоть до 20 часов, данная картина сохраняется и только при контакте 24 часа, препарат практически не определяется в клетках.

Для подтверждения механизма внутриклеточного транспорта полимеров, несущих физиологически активное вещество, нами был поставлен опыт с полимерами мечеными данзилхлоридом. В результате мы наблюдали картину внутриклеточного распределения меченого полимера аналогичную предыдущему опыту с солями сополимера К-винштпирролидона с акридонуксусной кислотой.

Что касается мономерного циклоферона, то картина внутриклеточного распределения отличалась от его полимерного аналога и эта отличия можно систематизировать следующим образом:

1. Появление препарата отмечается на 5-й минуте экспозиции.

2. В силу того, что цпклоферон является низкомолекулярным веществом, связывание его с ядрышками нестабильно и присутствие циклоферона в ядрышках (это составляет максимально до 30% клеток) отмечается лишь при экспозиции 10 минут (рис. 10), а к 30 минутам контакта циклоферон практически не определяется в них, а равномерно распределен по всей площади ядра (рис. 11).

3. Однако, начиная с 60-минутного контакта, отмечается снижение интенсивности свечения большинства клеток, и уже к 1,5 часам контакта циклоферон в клетках не определялся, что говорит об активном "выбросе" препарата из клеток и о том, что нового его поступления в клетки не происходит. Эти результаты могут служить косвенным доказательством того, что в ответ на поступление мономерного циклоферона включаются механизмы множествешюй лекарственной резистентности.

■4.4. Изучение распределения циклоферона по органам

Также нам представлялось интересным проанализировать распределение препаратов по органам на модели белых мышей. 1лавные отличия, при сравнении в этом опыте мономерного циклоферона и циклоферона на полимере-носителе, состояли в том, что мономер, в

icyiiOK 8. Циклоферон на лимсрной матрице, штакт 10 минут.

Рисунок 10. Циклоферон (мономерный). Контакт 10 минут.

исунок 9. Циклоферон на элимерной матрице. Контакт ) минут.

Рисунок 11. Циклоферон (мономерный). Контакт 30 минут.

отличие от полимера, определялся в головном мозге мышей. Это говорит о том, что полимер препятствует проникновению активного вещества через гематоэнпефалическнй барьер. Кроме этого, мономерный циклоферон в большом количестве определялся в почках, причем присутствие препарата было максимально через 30 минут после введения, в то время как полимера на всех сроках в почках было значительно меньше. Это обстоятельство указывает на ускоренное выведение мономерного препарата почками и возможную пролонгацию действия полимера по сравнению с мономерным активным веществом, за счет замедления почечной фильтрации макромолекул полимера, а также удержания их клетками ретикулоэндотелиалькон системы.

5. Анализ корреляций между структурой и функциональной активностью противовирусных препаратов н шщукторов интерферона

В этой главе мы хотели обратить внимание на то, что амиксин и циклоферон не являются неожиданными препаратами. И тот и другой имеют своих предшественников (таблица 2).

1. Так, циклоферон имеет отношение к акрихину, половине молекулы актшюмицина Д, и эта связь во многом определяет уникальность его свойств, в том числе и противоопухолевых.

1. В отношении амиксина создается впечатление, что выбран не самый удачный представитель класса флуоренов и надо иметь ввиду, что предшествешипси амиксина - флореналь, уснинат натрия, как противовирусные препараты уже давно известны в действующих фар-макопеях. Более того, препарат, разработанный независимо от амиксина в Уральском техническом университете - 2,7-Бис(п-бутилсульфено-ил)флуорен (рисунок 12) - более интересен и перспективен, так как найдено достаточно удачное решение в отношении его дизайна и синтеза, Несмотря на то, что по сбоим основным элемента?,1 структуры он близок к амиксину, в отличие от него он обладает низкой токсичностью и более выраженными противовирусными свойствами.

Рисунок 12.2.7-Бис(п-бутилсульфеноил)флуорен.

Таим образом, производные близких по структуре акридонов и флуорепов представляют собой перспективный ряд соединений, среди которых возможно получение лекарственных средств с разнообраз-

эжсныгоэ

502ЫНС4Н9

иыми свойствами: индукторов лимфокшюв, противоопухолевых препаратов с интеркаляциошшми свойствами, ингибиторов теломераз, ингибиторов топоизомераз и других перспективных препаратов. Относительная простота получения полимерных препаратов с использованием производных полиалиламинов и виниламидоянтарной кислоты, позволяет существенно улучшить их фармакологические свойства и перевести всю эту группу веществ в новое поколение препаратов с принципиально новыми свойствами.

Таблица 2. Фармакологические свойства препаратоз гру1ш акр идо-нов, флавшюв и флуоренов.

Классы Препараты Фармаколошчсские св-ва

1 2 3

АКРИДОНЫ Риванол - антисептическое

Акрихин - противомалярийное - противоглистное

Актиномицин Д - противоопухолевое

Аридонуксусная кислота (Неовир, камедон, цшшоферон) - индуктор интерферона (а-'шпа) - иммуномодулирующее - противовирусное - противовоспалительное - противоопухолевое

1 -гцдрокси-10-метил-9, 10-дигидроахридин-9-он - аши-ВИЧ активность - ингибитор протеинкиназы С

Замещенные бис(акрид1ш-4- карбоксамиды) - противоопухолевое

бН-пиразоло (6б5б1-де)акридин-6- она(пиразолоакридона) - противоопухолевое

ФЛАВИНЫ (ФЛАВОНЫ) Флакозид - противовирусное (вирус герпеса простого)

Рутин - общеукрепляющее - метаболический корректор

Продолжение табл. 2

1 2 3

- повышает энергетический потенциал клетки

Рибофлавин - метаболический корректор - участие в синтезе гемоглобина

ФЛУОРЕНЫ Флореналь - противовирусное(вирус герпеса простого, герпес Зостер, аденовирус)

Усшшат натрия - антибактериальное - противовирусное

Амиксин - индуктор интерферона (а-и Р-тшгюв) - противовирусное - иммуномодулирующее - антибактериальное - противоопухолевое

2,7-двузамещенные амидофлуореиы - противоопухолевое (ингибиторы теломераз)

ВЫВОДЫ

1. Изучение этиологии эпидемий гршиза показывает, что во всех странах мира в настоящее время наблюдается смешанная циркуляция вируса гриппа типов А/НЗШ, А/ШШ и В. Поэтому на современном этапе, в преддверии пандемии гриппа, поиск новых препаратов широкого систра действия является важной практической задачей.

2 Среди соединений азоло-азинового ряда, являющихся уникальными аналогами гуанина, наибольшую противогриппозную активность проявляют соединения, имеющие ациклические заместители. Данные препараты представляются эффективными для дальнейшей разработки ингибиторов репликации РНК вируса гриппа.

3. Изучите противовирусных свойств амиксина показало, что он обладает отчетливым противовирусным эффектом в отношении РНК-и ДНК-содержащих вирусов. Вместе с тем, его относительно высокая

токсичность в дозах, ингибирующнх вирусную репродукцию, свидетельствует о том, что данный препарат, как противовирусное средство, нуждается в дальнейшем усовершенствовании.

4. Изучение противовирусных свойств циклоферона показало, что активное вещество этого препарата - акридонуксусная кислота, не обладает отчетливой противовирусной активностью в системах in vitro. Поэтому противовирусная активность данного препарата in vivo, по-видимому, в большей степени связана с его интерферон-индуцирую-щей активностью.

5. Изучение полимерных производных акридонухсусной кислоты показало, что для данного препарата, и для многих других противовирусных препаратов, применение полимерных носителей может явиться перспективным путем повышения их биологической активности за счет резкого повышения эффективности внутриклеточного транспорта, увеличения сроков циркуляции в крови, времени пребывания в клетках и замедления выведения из организма.

6. Анализ корреляции между структурой и функциями противовирусных препаратов и шщукторов интерферона показывает, что среди соединений ряда акридонов и флуоренов встречаются как противовирусные препараты, так и индукторы интерферонов, что позволяет рассматривать их в ряду перспективных соединений для дальнейшей разработки противовирусных препаратов.

Список литературы, опубликованной по теме диссертации

1. Банников А.И., Юхнова Л.Г., Родионова В.Б., Деева Э.Г. и др. Применение ПЦР для диагностики острой и персистенгной 1р:шпозной штфекции. Актуальные проблемы вирусологии, Тезисы докладов научной конференции, СПб., 1994, Ч. 2, С.21. •

2. Башшков А.И., Родионова В.Б., Деева Э.Г. и др. Длительное носи-тельство геномных структур вируса гриппа в лейкоцитах крови детей с врождешюй патологией ЦНС. Вестник РАМН, 1994, №9, С.25-28.

3. Башшков А.И., Юхнова Л.Г., Родионова В.Б., Деева Э.Г. и др. Возможности и перспективы применения ПЦР для диагностики гриппа. Рабочее совещание представителей опорных баз ФЦГ, СПб., 1994.

4. Киселев О.И., Слита A.B., Смирнова A.B., Деева Э.Г. и др. Трансформация эукариотических клеток плазмидной ДНК в комплексе с полимерными катионами. Доклады Российской Академии Наук, 1999, Т.366, № 5, С.699-701.

5. Киселев О.И., Деева Э.Г., Слита A.B. Новые подходы в конструировании антивирусных препаратов. Экология человека, Архангельск, 2000.

6. Киселев О.И., Деева Э.Г., Слита A.B., Платонов В.Г. Антивирусные препараты для лечения гриппа и ОРЗ. Дизайн препаратов на основе полимерных носителей, Издательство «Роза мира», СПб., 2000.

7. Литвинова О.М., Юхнова Л.Г., Коновалова Н.И., Родионова В.Б., Лобова Т.Г., Деева Э.Г. и др. Этиологический надзор в России на базе Федерального Центра по гриппу. Тезисы юбилейной научной международной конференции "Гршш-XXI век", СПб., 1997, С.34.

8. Литвинова О.М., Родионова В.Б., Юхнова Л.Г., Деева Э.Г. и др. Вирусологическая характеристика эпидемий гриппа 1997-1998 гг. в России. Научная конференция "Вирусные штфекции на пороге XXI века: эпидемиология и профилактика", СПб., 1999, С.112-113.

9. Литвинова О.М., Родионова В.Б., Юхнова Л.Г., Деева Э.Г. и др. Сопоставление вирусов гриппа А/НШ1/1997-1998 гг. выделения в России и Монголии. Научная конференция "Вирусные инфекции на пороге XXI века: эгащемиология и профилактика", СПб., 1999, С.113.

10. Литвинова О.М., Юхнова Л.Г., Родионова В.Б., Деева Э,Г. и др. Характеристика вирусов гриппа A/H1N1/1997-1998 гг. выделения. Вторая международная конференция "Идеи Пастера в борьбе с инфекциями", Материалы конференции, СПб., 1998, С.39.

11. Родионова В.Б., Деева Э.Г., Юхнова Л.Г. и др. Опыт применения полимеразной цепной реакции для выявления смешанных популяций.

Актуальные проблемы инфекционной патологии. Иммунология и биотехнология, СПб., 1993,Ч.Ш,С.26.

12. Сомишша A.A., Литвинова О.М.. РодионоваВ.Б., Коновалова Н.И., Деева Э.Г. и др. Этиологическая природа эпидемий гриппа сезона 19961997 гг. Тезисы юбилейной научной международной конференции "ГриппXXI век", СПб., 1997, С.23-33.

13. ЮхноваЛ.Г., Литвинова О.М., Деева Э.Г. идр. Оценка антивирусной активности некоторых препаратов на основе лекарственных растений. Тезисы Всероссийской научной конференции "Гомесстаз и инфекционный процесс", Саратов, 1998.