Активность азоло-адамантанов в отношении вируса гриппа

Анфимов, Павел Михайлович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Активность азоло-адамантанов в отношении вируса гриппа
ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Активность азоло-адамантанов в отношении вируса гриппа"

На правах рукописи

АНФИМОВ Павел Михаилович

ИССЛЕДОВАНИЕ АКТИВНОСТИ АЗОЛО-АДАМАНТАНОВ В ОТНОШЕНИИ ВИРУСА ГРИППА

03.02.02 - вирусология

005005644

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

-8 ДЕК 2011

Санкт-Петербург-2011

005005644

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт гриппа» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации в лаборатории молекулярных основ химиотерапии вирусных инфекций

Научный руководитель: академик РАМН, доктор биологических наук,

профессор Киселев Олег Иванович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

Бурцева Елена Ивановна

доктор биологических наук, Соколова Екатерина Дмитриевна

Ведущая организация: Учреждение Российской академии медицинских

наук «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» Северо-Западного отделения РАМН

Защита диссертации состоится «23» декабря 2011 года в ЛЗ часО^мин. на заседании Диссертационного совета Д.001.043.01 при ФГБУ «Научно-исследовательский институт гриппа» Минздравсоцразвития, России (197376, Санкт-Петербург, ул. проф. Попова, 15/17).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Научно-исследовательского института гриппа» Минздравсоцразвития России.

Автореферат разослан » ноября 2011 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

кандидат медицинских наук Суховецкая Вера Федотовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Проблема гриппа является актуальной на сегодняшний день. Уникальная способность вирусов гриппа к изменчивости путем мутаций, рекомбинаций и реассортации генов, сопровождающаяся модификацией биологических свойств вируса - причина неконтролируемого распространения инфекции. Несмотря на успехи в создании вакцин и средств химиотерапии, эпидемии гриппа по-прежнему имеют огромные масштабы. Подтверждением этому стала пандемия 2009/2010 года, вызванная вирусами гриппа A(HlNl)pdm09. На сегодняшний день мировое признание получили только два класса лекарственных соединений для терапии гриппозной инфекции: производные адамантана (амантадин, римантадин), являющиеся ингибиторами функциональной активности белка М2 и производные сиаловой кислоты, имеющие специфическую мишень действия - нейраминидазу (занамивир, осельтамивир). Среди циркулирующих эпидемически актуальных вирусов зафиксирован рост устойчивости к данным препаратам, а резистентность к римантадину среди выделенных вирусов в последние эпидемические сезоны достигла практически 100% (http://www.cdc.gov/flu/about/qa/antiviralresistance.htm). В пределах подтипа H1N1 стопроцентная устойчивость к осельтамивиру была достигнута всего за полтора года (ноябрь 2007 — март 2009). В связи с этим чрезвычайно актуальны поиск и разработка новых, активных в отношении вируса гриппа, лекарственных средств, а также исследование механизма их действия.

Целенаправленный синтез соединений с противовирусной активностью позволил получить принципиально новые соединения азоло-адамантанового ряда, содержащие адамантановый цикл, который входит в состав классического противогриппозного препарата римантадин. Азотистые гетероциклы, включенные в структуру азоло-адамантанов, обладают собственной противовирусной активностью, кроме того, по литературным данным, введение триазольных производных в химическую структуру занамивира усиливает ингибирование нейраминидазы (Lu et al, 2007). Таким образом, дизайн азоло-адамантанов определяет перспективность исследования их противовирусного действия и возможность получения этиотропных препаратов с несколькими мишенями.

Цель исследования.

Целью исследования являлось изучение противовирусного действия химических соединений класса азоло-адамантанов в отношении вируса гриппа.

Задачи исследования

• Провести первичный скрининг противовирусной активности тестируемых соединений в опытах in vitro, выявить среди них наиболее активные.

• Изучить активность азоло-адамантанов в отношении циркулирующих вирусов гриппа А, в том числе A(HlNl)pdm09.

• Оценить активность азоло-адамантанов как ингибиторов вирусной нейраминидазы.

• Исследовать протективную активность отобранных соединений на модели летальной гриппозной пневмонии у мышей.

• Получить устойчивые к азоло-адамантанам штаммы вируса гриппа и изучить генетические изменения при смене фенотипа с чувствительного на резистентный.

Научная новизна работы.

1. Впервые исследована противовирусная активность азольных производных адамантанов.

2. Сформулированы основные условия противовирусной активности азоло-адамантанов. Определена зависимость противовирусной активности азоло-адамантанов от их химической структуры.

3. Впервые показано, что соединения класса азоло-адамантанов обладают высоким уровнем противовирусной активности in vitro в отношении лабораторных (референс) и циркулирующих сезонных вирусов гриппа А, и умеренной активностью против вирусов гриппа A(HlNl)pdm09.

4. Впервые показано, что азоло-адамантаны не проявляют ингибирующей активности в отношении вирусной нейраминидазы.

5. Впервые показано, что азоло-адамантаны обладают умеренной противовирусной активностью или не активны на модели летальной гриппозной пневмонии у мышей.

6. Впервые путем многократных пассажей в клеточных культурах получены и охарактеризованы вирусные варианты, резистентные к азоло-адамантанам и изучены молекулярно-биологические основы резистентности к ним.

Практическая значимость работы.

В результате проделанной работы сформулированы основные требования к структуре соединений класса азоло-адамантанов как противовирусных средств. Установлен механизм формирования резистентности вирусов гриппа к азоло-адамантанам. Полученные результаты являются основой для дальнейшей разработки соединений с целью создания новых противогриппозных препаратов широкого спектра действия.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Триазольныс и тстразольные производные адамантанов обладают высоким уровнем противовирусной активности in vitro в отношении лабораторных (референс) и циркулирующих сезонных вирусов гриппа А и умеренной активностью против вирусов гриппа A(HlNl)pdm09.

2. Тстразольные производные адамантанов более активны, нежели их триазольные гомологи. На реализацию противовирусной активности влияют следующие параметры:

- Молекула должна содержать не более одного тетразолыюго и не более одного адамантилыюго остатка.

- Адамантильные заместители должны занимать в тетразольном цикле положение 1.

3. Азоло-адамантаны не проявляют ингибирующей активности в отношении нейраминидазы вируса гриппа.

4. Азоло-адамантаны проявляют умеренный уровень активности или не проявляют противовирусной активности in vivo на модели летальной гриппозной пневмонии у мышей.

5. Пассирование вируса в присутствии азоло-адамантанов приводит к снижению чувствительности вируса и появлению мутации S31N в М2-белке, характерной для римантадин-устойчивых вирусов. При этом мутаций в гемагглютинине и РВ2-белке не зафиксировано.

Апробация материалов диссертации

Материалы диссертационной работы доложены на международных конференциях: Strengthening influenza pandemic preparedness through civil-military co-operation, Saint-Petersburg, Russia, May 9-11, 2003, XI международная научно-техническая конференция, Волгоград, Россия, 3-6 июня 2008 г., конференция "Third European influenza conference" Vilamoura, Portugal, September 14-17, 2008.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 118 страницах машинописного текста, включая 11 таблиц и 17 рисунков. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и

списка цитируемой литературы. Список литературы содержит 144 источника на русском и английском языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Исследуемые соединения

Соединения класса азоло-адамантанов были синтезированы на кафедре химии и технологии органических соединений азота (ХТОСА) Санкт-Петербургского технологического института. Изучены 3 группы соединений: диазоло-, триазол- и тетразоладамантаны (Рис. 1).

он

А.

•■-У '' \

И\

"ы'

А,

я ^ %

Лз> 2

2Ь: Я = а

Н......

N4 > N

Щгй,»Н R-.Br й»«СООН

- сн>

За: И = Н ЗЬ; р = СН,СООН Зй:й«СН;СООС.Л

Зе: К » СНгСОО{СН,),СН,

к » СКуГОСКНШ; зд: к - С1 (..сос^нсн^нрн

Рис. 1. Структурные формулы соединений: 1 - диазалоадамантаны, 2 -триазоладамантаны, 3 - тетразоладамантаны, Я - заместители

Вирусы и клетки

В работе использовали штаммы вируса гриппа А/РКУ8/34 (НШ1), А/А1сЫ/2/68 (НЗЫ2), А/Рапаша/2007/99 (НЗЫ2), А/СаИГогша/07/09 (НШ1)рс1т09, полученные из Музея вирусов гриппа ФГБУ «НИИ гриппа», а также изоляты циркулирующих вирусов эпидемических сезонов 2008/2009 и 2009/2010, выделенные в ФГБУ «НИИ гриппа», а также присланные опорными вирусологическими базами ФГБУ «НИИ гриппа». Клетки \4DCK были получены из коллекции клеточных культур ФГБУ «НИИ гриппа». Клеточную

культуру (106 клеток/мл) рассевали на 96-луночные микропланшеты (Orange Scientific cat. №5530100) по 0,2 мл в лунку и инкубировали при 37°С при концентрации С02 5% до образования клеточного монослоя на дне планшетов.

Питательные среды

В работе использовали среду игла MEM (РАА cat. №Е15-825) для клеток MDCK. Для пассирования вирусов в среду на каждые 100 мл добавляли 5% альбумин (Calbiochem cat. №12659), ТРСК трипсин 1мкг/мл в количестве 100 мкл (Fluka cat. №93610) и HEPES IM раствор 1,6 мл (Sigma cat. №H4034-500G) pH 7,4.

Препараты

В качестве препаратов сравнения использовали римантадин (1-(1-адамаитил)-амииоэтил гидрохлорид, Aldrich Chem. Co., Milw., WI cat. #39.0593) и карбоксилат осельтамивира (LaRoche, Швейцария).

Исследование токсичности препаратов

Все синтезированные соединения тестировали на токсичность в отношении клеток в культуре MDCK. Готовили серию двукратных разведений каждого из препаратов от 1000 до 4 мкг/мл на среде игла MEM. Клетки инкубировали в течение 48 часов при 37°С при концентрации С02 5% в присутствии растворенных препаратов, после чего степень деструкции клеточного монослоя оценивали при помощи микротетразолиевого теста (MIT) (Mosmann, 1983). МТТ тест ставили на 96-луночных планшетах, содержащих клетки MDCK. Готовили раствор МТТ в физрастворе (Calbiochem cat. №475989) в концентрации 0,5 мкг/мл. Раствор МТТ вносили в предварительно отмытые от среды лунки с клетками в объеме 0,1 мл. После 1 часа контакта МТТ с клетками лунки промывали и заливали по 0,1 мл диметилсульфоксида (DMSO), после чего оптическую плотность в лунках измеряли на ридере Victor 2 1440 (Perkin Elmer, Victor2 1420) при длине волны 535 нм. На основании полученных данных рассчитывали CTD50, то есть концентрацию препарата в лунке, при которой происходит 50% деструкция клеточного монослоя.

Подготовка вируса

Вирусы гриппа культивировали в 10-11 дневных куриных эмбрионах, вводя в аллантоисную полость 1-10 ИД5о/0,2 мл вируссодержащей аллантоисной жидкости (ВАЖ). Вирусы гриппа культивировали 48 часов при +37°С.

Определение противовирусной активности препаратов

В монослойную культуру клеток МЭСК на 96-луночном планшете добавляли двукратные разведения препаратов начиная с Уг СШ50,

растворенных в клеточной среде, после чего выдерживали планшеты в С02 инкубаторе 1 час при 37С°. Далее клеточную культуру заражали 10-кратными разведениями вируса от 10"' до 10"6. Микропланшеты с вирусом и препаратами инкубировали в С02 инкубаторе 48 часов при 37С° (5% С02). Инфекционную активность вируса оценивали в реакции гемагглютинации (РГА) с куриными эритроцитами. РГА ставили общепринятым методом в микропланшетах для иммунологических реакций (Медполимер ТУ кат. 64-2-278-79). В лунки микропланшета для иммунологических реакций добавляли 100 мкл вируссодержащей среды из соответствующей лунки планшета для клеточных культур, после чего в лунки вносили равное количество 1% суспензии куриных эритроцитов. Реакцию учитывали через 30-40 минут при комнатной температуре. За титр вируса принимали наибольшее разведение вируса, вызвавшее полную агглютинацию эритроцитов. О противовирусной активности препаратов судили по снижению инфекционного титра вируса по сравнению с контролем. На основании полученных результатов рассчитывали ЕС50, то есть концентрацию препарата, при которой титр вируса снижается вдвое. Основным критерием при изучении специфического противовирусного действия исследуемых соединений считали показатель SI, определявшийся отношением среднетоксической концентрации вещества (CTD50) к среднеэффективной вирусингибирукяцей концентрации (ЕС50). Активными считали препараты, SI которых был 8 и выше.

Определение ингибирования активности иейраминидазы флюоресцентным методом

Для изучения возможной активности азоло-адамантанов в отношении иейраминидазы вируса гриппа использовали флюоресцентный метод (Portier et al., 1979). Исследования проводили с использованием вируса A/CaIifornia/07/09 (HlNl)pdm09.

В опыте использовали следующие реактивы: Ферментный буфер: 32.5mM MES, рН 6.0 (Sigma №076К54241) 4шМ СаС12

Раствор субстрата: 32.5mM MES (Sigma №076К54241) 4mM СаС12

0.2mM MUNANA (Sigma cat. №69587) Стоп-раствор: 25% этанол

0.1М глицин, рН 10. (Sigma cat. №0001442285)

Для опыта использовали черные 96-луночные планшеты (Costar Cat.#3915). Готовили 1:5 вирусные разведения в ферментном буфере. Затем готовили 10

трехкратных разведений исследуемого препарата в MES. Далее добавляли 25

мкл каждого разведения в каждую лунку так, чтобы наименьшая концентрация получилась в колонке 10. Потом добавляли 25 мкл вирусного разведения в каждую лунку колонок 1-11. Следом в колонку 12 добавляли 50 мкл ферментного буфера. Инкубировали при 37°С примерно 30 минут. По прошествии этого времени добавляли 50 мкл раствора субстрата в каждую лунку. Далее инкубировали при комнатной температуре 30 минут. Далее добавляли по 150 мкл стоп-раствора в каждую лунку и немедленно проводили измерения прибором Victor 2 при помощи флюоресцентного протокола. ЕС50 высчитывалась с помощью функции линейной регрессии в программе Microsoft Ecxel для Windows.

Получение устойчивых к азоло-адамантанам штаммов вируса гриппа

Несколько соединений ряда азоло-адамантанов использовали для селекции устойчивых штаммов вируса гриппа A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) и A/Aichi/2/68 (H3N2). Для этого вирусы культивировали в клеточной культуре MDCK на 24-луночном планшете в присутствии нарастающих концентраций азоло-адамантанов, начиная с концентрации равной 1ЕС50. В качестве препарата сравнения использовали римантадин в концентрациях 1,5 - 24 мкг/мл. Далее в клеточной культуре MDCK на 96-луночном планшете провели тестирование инфекционности полученных после 5 пассажей вирусов в присутствии исследуемых соединений и римантадина в концентрации Vi CTD50 по сравнению с исходным вирусом в присутствии тех же соединений. По снижению противовирусного эффекта у препаратов в отношении пассированных вирусов по сравнению с исходными (контрольными) судили о приобретении ими резистентности.

Молекулярно-биологические методы

Выделение РНК. Выделение вирусной РНК производилось с помощью набора QIAGEN Rneasy TotalTM RNA Isolation Kit в соответсвии с инструкцией производителя. Для предотвращения попадания РНКаз из внешних источников рабочую поверхность обрабатывали с помощью RNAse Zap (Ambion).

Секвенирование проводили на приборе ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США) с использованием набора «BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit».

Исследование противовирусной активности азоло-адамантанов in vivo на модели гриппозной пневмонии у белых мышей

Опыты проводили на здоровых белых беспородных мышах, предоставленных питомником (пос. Рапполово, 10). Использовали адаптированный к белым мышам вирус A/Aichi/2/68 (H3N2). Пассирование вируса осуществляли по следующей методике: лиофильно высушенный вирус разводили в 2 мл физиологического раствора и вводили интраназально в объеме 50 мкл/мышь. Спустя 3 суток зараженных мышей вскрывали, и из пораженных

участков легких готовили гомогенат. Для титрования легочного гомогената мышей (п=5) заражали интраназально серийными десятикратными разведениями полученного гомогената от 10"' по 10"4 в объеме 50 мкл/мышь. Смертность животных учитывалась спустя 2 недели после заражения. На основании полученных результатов рассчитывали 50% летальную дозу вируса 1LD5o (Reed and Muench, 1938). Мышей заражали дозами 1 LD50 и 10 LD50 в объеме 50 мкл/мышь. Препараты вводили внутрибрюшинно в дозе 1/8 LD50 за 1 час до заражения и через 1, 2 и 3 суток после заражения. Противовирусную активность препаратов учитывали по снижению смертности мышей в опытных образцах (вирус + препарат) по сравнению с контролем (вирус), а также по разнице в снижении веса у животных между контролем и опытом.

Статистическая обработка данных

Статистическую обработку данных проводили с помощью параметрического теста Стьюдента для выборок с нормальным распределением, или непараметрических критериев Уилкоксона-Манна-Уитни с использованием программного обеспечения Microsoft Excel для Windows.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Первичный скрининг препаратов

В качестве тестового вируса для скрининга был выбран вирус гриппа A/Puerto Rico/8/34 (HINI). Он является римантадин-устойчивым благодаря замене S31N в трансмембранной области белка М2. Азоло-адамантаны и римантадин имеют много общего в химическом строении и было важно в ходе первичного скрининга отобрать соединения, активные именно в отношении вируса, устойчивого к римантадину. Азоло-адамантаны титровали начиная с концентрации Vi CTD50 с последующими двукратными разведениями до полной потери активности в отношении вируса гриппа. Всего было протестировано 42 химических соединения, из них 5 диазол-адамантанов, 5 триазоладаманатанов, 27 тетразолдаманатнов и 5 других адамантильных производных. В таблице 1 представлены химические формулы исследуемых соединений, а также результаты первичного скрининга на противовирусную активность наиболее активных соединений.

Активность азоло-адамантанов в отношении вируса гриппа A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) in vitro

Диазолоадамантаны

Номер соединения Формула ctd50, мкг/мл EC50,мкг/мл SI

3 \-н ЗНС| 600 100 6

372 1000 200 5

Триазоладамантаны

Номер соединения Формула CTDJO, мкг/мл EC5o,мкг/мл SI

5 jQ-o N— 700 100 7

73 HCI J0-O CI 150 15 10

Тетразоладамантаны

Номер соединения Формула ctds0, мкг/мл EC50,мкг/мл SI

108 N11, HCI 550 22 25

109 V^NII, 11(1 c>4 450 23 20,6

262 Nil, 11CI 250 25 10

263 .......М!. HCI 300 15 20

310 (х0 N" 250 56 4,4

313 Ь-о 300 11 27,2

335 500 500 1

336 N—N \ / N = N 150 150 1

438 ____ О" i 600 10 60

441 N 150 2 75

Адамантильные п роизводные

395 U.__у HNj 11(1 135 , . 5 27

Римантадин

римантадин ъ 60 5 12

Результаты первичного скрининга, представленные _ в таблице 1, свидетельствуют о том, что наиболее перспективные соединения класса азоло-адамантанов обладают высоким уровнем противовирусной активности in vitro в отношении римантадин-устойчивого штамма A/PR/8/34 (H1N1) (SI больше 8). Однако уровень активности значительно варьирует в зависимости от химической структуры.

Среди производных 1,2,4-триазолов только одно соединение - 1-(3-хлоро-1,2,4-триазол-1-ил)-3-(1-аминоэтил-1) адамантан (73) проявляло значительную активность в отношении вируса гриппа (SI=10). Низкий уровень активности не

зависел от наличия или отсутствия аминогруппы в адамантановом ядре, а также присутствия или отсутствия заместителей в азольной части.

В то же время, адамантильные производные тетразола продемонстрировали высокий уровень противовирусной активности, особенно аминоадамантильные производные тетразола (соединения 108, 109, 262, 263). Наличие алкильной замены в тетразольной части у 3 аминоадамантанов вело к снижению противовирусной активности в 2,5 раза (108-262), а у 3-(2-аминоэтил) адамантанов наличие алкильной замены в тетразольной части никак не сказывалось на противовирусной активности (109-263).

Ряд тетразольных производных адамантана без аминогруппы в адамантановом ядре (395, 310, 313) показал высокий уровень активности против вируса гриппа. Положение адамантильной части в тетразольном цикле, как было установлено, может играть важную роль в усилении активности соединений этого класса. Так, соединение 313, которое является 2-адамантилтетразолом, противовирусная активность была в 5 раз больше, чем у соединения 310 (1-адамантилтетразол). Диадамантильные и дитетразольные производные не проявили противовирусных свойств (335,336).

Базируясь на полученных данных, возможно сформулировать основные принципы зависимости «структура-активность» азоло-адамантанов in vitro.

1. Антивирусная активность 1-адамантилтетразолов выше, нежели у их 2-адамантильных изомеров.

2. Молекула должна содержать не более одного тетразолыюго и не более одного адамантильного остатка.

Сравнение активности азоло-адамантанов и римаптадина в эквимолярных концентрациях

В рамках сравнения азоло-адамантанов с римантадином был поставлен опыт по сравнению их противовирусной активности в эквимолярных концентрациях. С учетом молярной массы римантадина и исследуемых препаратов были пересчитаны концентрации азоло-адамантанов и использованы в опытах по снижению титра инфекционной активности вирусов гриппа. С учетом разницы в молекулярных массах исследуемых веществ концентрация римантадина 1 мкг/мл соответствовала 1,5 мкг/мл веществ 438 и 441 и так далее. Результаты этого опыта представлены в табл. 2.

Сравнение активности азоло-адамантанов и римантадина в эквимолярных концентрациях

Вирус Инфекционный титр вируса в присутствии препаратов, ИД50)

Контро ЛЬ вируса без препар ата Римантадин (мкг/мл) №438(мкг/мл) №441 (мкг/мл)

0 10 3 1 13 4 15 13 4 1.5

А/А1с1и/2/68 НЗЫ2 4.5±0,2 2,0±0,2 3,040,2 4.0±0* 3.0±0,2 3.5±0,2* 4.0±0 3.0±0,2 * 3.5±0,2 * 4.5±0,2

А/Рапата/200 7/99 НЗЫ2 5.0±0,2 2,5±0,2 4.0±0,2 5.0±0 3.0±0,2 * 3.5±0,2* 4.5±0 3.0±0,2 * 3.5±0,2 * 4.5±0,2

* - Статистически значимые различия при р<0.05

Из представленных в таблице результатов видно, что в одинаковых с римантадином молярных концентрациях азоло-адамантаны оказываются менее активными, нежели римантадин. При этом все исследованные соединения оказались значительно менее токсичны по сравнению с римантадином (см. табл. 1).

Исследование ингибирующей активности азоло-адамантанов в отношении нейраминидазы вируса гриппа

В литературе описывается высокая ингибирующая активность триазольных аналогов занамивира в отношении нейраминидазы вируса гриппа. В ряду исследованных нами азоло-адамантанов также встречаются соединения, содержащие триазольные заместители. Одной из задач данного исследования являлась оценка ингибирующей активности азоло-адамантанов в отношении вирусной нейраминидазы. ЕС50 азоло-адамантанов в отношении нейраминидазы вируса гриппа А/СаП1Ъгша/7/09 А(НШ1)рс1т09 варьировали в пределах от 1.7*1019 до 3.1*1078 пМ в зависимости от препарата, то есть находились в области очень высоких, токсических концентраций. У препарата сравнения осельтамивира этот параметр составил 140 пМ. Это свидетельствует о том, что азоло-адамантаны не являются нейраминидазными ингибиторами.

Исследование противовирусной активности азоло-адамантанов в отношении эпидемических изолятов вируса гриппа

Для изучения спектра активности азоло-адамантанов были исследованы противовирусные свойства двух соединений этого класса, 438 и 441, показавших наибольший уровень активности в отношении вируса A/PR/8/34 (H1N1) in vitro (SI 60 и 75 соответственно). Изучено действие этих соединений на эпидемических изолятах вируса гриппа: А/Москва/122/08 (H3N2), А/Санкт-Петербург/102/08 (H3N2), А/Санкт-Петербург/96/08 (H3N2), А/Хабаровск/933/08 (H3N2), А/Санкт-Петербург /72/08 (H1N1), А/Санкт-Петербург/72/08 (H1N1), А/Самара/78/08 (H1N1), А/Хабаровск/15/09 (H1N1) и А/Новосибирск/9/09 (H1N1). В качестве препарата сравнения был взят римантадин. Азоло-адамантаны в большинстве случаев оказались более активными в отношении циркулирующих штаммов вируса гриппа эпидемического сезона 2008/2009 in vitro (в том числе и в отношении римантадин-устойчивых), нежели римантадин. Разница в активности между соединением 441 (наиболее активным) и римантадином в отношении вирусов А/Москва/122/08 (H3N2), А/Хабаровск/933/08 (H3N2), А/Хабаровск/15/09 (H1N1), А/Новосибирск/9/09 (H1N1) достигала 1,5 lg ИД50, в отношении вирусов А/Санкт-Петербург/96/08 (H3N2), А/Санкт-Петербург/72/08 (H1N1) 1,0 lg ИД50.

Эпидемический сезон 2009/2010 года характеризовался появлением пандемического вируса гриппа A(HlNl)pdm09. Для изучения противовирусной активности соединений ряда азоло-адамантанов в отношении вируса гриппа A(HlNl)pdm09 были использованы следующие штаммы - А/Хабаровск /96/09, А/Санкт-Петербург/35/09, А/Санкт-Петербург/03/09 и А/Нижний Новгород/02/09. Было установлено снижение инфекционной активности вирусов до 1,5 lg ИД50 в сравнении с контролем в отношении вирусов А/Санкт-Петербург/35/09 и А/Нижний Новгород/02/09. Римантадин либо не снижал инфекционную активность изученных штаммов вирусов гриппа A(HlNl)pdm09, либо (в случае вируса А/Нижний Новгород/02/09 снижал на 1,0 lg ИД50 в максимальной, из использованных, концентрации.

Исследование активности азоло-адамантанов in vivo на модели гриппозной пневмонии у белых мышей

На следующем этапе исследования активность азоло-адамантанов протестирована in vivo на модели гриппозной пневмонии у белых мышей (Табл. 3). Для опыта взяты соединения 108, 313, 438 и 441. Все они показали высокий уровень активности in vitro (SI больше 8), при этом был сделан выбор соединений с различными заместителями.

Активность азоло-адамантанов in vivo на модели гриппозной пневмонии у белых мышей зараженных вирусом A/Aichi/2/68, H3N2

Препарат (мг/кг) Доза вируса, ld50 Процент смертности, % Индекс защиты, %

8 сут. 14 сут. В сут. 14 сут.

108 (150 мг/кг) 1 20 60 33 25

10 30 70 0 12.5

313 (5 мг/кг) 1 30 80 0 0

10 60 80 0 0

438 (100 мг/кг) 1 30 80 0 0

10 80 80 0 0

441 (25 мг/кг) 1 30 70 0 9

10 60 80 0 0

Римантади н (40 мг/кг) 1 0 30 100 62.5

10 30 50 50 38

Контроль вируса 1 30 80 0 0

10 60 80 0 0

Соединение 108 является тетразолом с аминогруппой в адамантановом цикле, у соединения 313 аминогруппа отсутствует, 438 является мезоионным производным адамантана, а вещество 441 является серосодержащим и обладает самым высоким уровнем активности, среди протестированных. Критериями активности соединений служили уровень смертности подопытных животных, а также динамика снижения их веса.

Анализ смертности у подопытных животных свидетельствовал о том, что азоло-адамантаны не проявляют существенной противовирусной активности in vivo на модели гриппозной пневмонии у мышей или в некоторых случаях (108) проявляют слабую активность, сильно уступающую по активности

римантадину. Эти результаты были подтверждены при анализе динамики весовых показателей животных в ходе гриппозной пневмонии

Исследования мутаций изменчивости в вирусах, устойчивых к азоло-адамантанам

В рамках дальнейших исследований была проведена селекция устойчивых вирусных штаммов к исследуемым соединениям, после чего определена первичная последовательность вирусных генов на предмет возникновения мутаций, которые могут быть ответственны за приобретение резистентности. Эти мутации могли косвенно указать на этапы вирусной репродукции, которые являются мишенью для противовирусного действия азоло-адамантанов. Для проведения эксперимента мы использовали 2 вируса: A/PR/8/34 (HIN1) и A/Aichi/2/68 (H3N2). В качестве исследуемых соединений мы взяли те же препараты, что и для опыта на животных и вещество 73, триазольное производное, которое показало противовирусную активность в опытах in vitro. В качестве препарата сравнения был использован римантадин.

Было проведено 5 последовательных пассажей вируса A/PR/8/34 (H1N1) с нарастающими концентрациями исследуемых соединений, а также римантадина. После этого вирусингибирующая активность соединений была протестирована в отношении исходного и конечных штаммов вируса на клетках MDCK. После 5 совместных пассажей ко всем представленным соединениям у вируса выработался определенный уровень устойчивости. К препаратам 73 и 313 образовалась полная резистентность, к препаратам 108, 441 и римантадину вирус остался слабочувствительным.

Далее у каждого из вирусов были проссквенировапы гены НА, РВ2 и М2 чтобы установить мутации, ответственные за резистентность. Не было зафиксировано ни одной мутации по сравнению с диким типом вируса.

Для того чтобы получить больше фактов в исследовании механизма приобретения устойчивости вирусов гриппа к азоло-адамантанам для совместных пассажей был взят A/Aichi/2/68 (H3N2), который, в отличие от вируса A/PR/8/34 (H1N1), не содержит в 31-ом положении М2-белка аминокислотной замены S31N. Было также проведено 5 последовательных пассажей вируса A/Aichi/2/68 (H3N2) с нарастающими концентрациями исследуемых соединений, а также римантадина. После этого вирусингибирующая активность соединений была протестирована в отношении исходного и конечных штаммов вируса на клетках MDCK. После 5 совместных пассажей ко всем представленным соединениям у вируса выработался определенный уровень устойчивости, а к римантадину практически полная резистентность. Далее был просеквенирован участок М2-белка, в котором происходят аминокислотные замены, ответственные за приобретение устойчивости к римантадину. Результаты представлены на рис 2.

A/Aichi/2/68 73 108 313 441

Римантадин

25 plvvaasi 25 plvvaani 25 plvvaani 25 plvvaani 25 plvvaani 25 plvvaani

gilhlilwild gilhlilwild gilhlilwild gilhlilwild gilhlilwild gilhlilwild

Рис. 2. Сравнение аминокислотных последовательностей в М2-белке вирусов А/АкЫ/2/68 (НЗЫ2) устойчивых к азоло-адамантанам с диким типом

Анализ аминокислотных последовательностей на рис. 2 показывает, что у всех вирусов в результате 5 совместных пассажей с азоло-адамантанами появляется мутация в М2-гене, приводящая к аминокислотной замене S31N в М2-белке вируса, с чем, по-видимому, и связано снижение чувствительности вирусов к азоло-адамантанам.

Выводы

1. Триазольные и тетразольные производные адамантанов обладают высоким уровнем противовирусной активности in vitro в отношении лабораторных (референс) и циркулирующих сезонных вирусов гриппа А и умеренной активностью против вирусов гриппа A(HlNl)pdm09.

2. Тетразольные производные адамантанов более активны, нежели их триазольные гомологи. На реализацию противовирусной активности влияют следующие параметры:

- Молекула должна содержать не более одного тетразольного и не более одного адамантильного остатка.

- Адамантильные заместители должны занимать в тетразольном цикле положение 1.

3. Азоло-адамантаны не проявляют ингибирующей активности в отношении нейраминидазы вируса гриппа.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ. Статьи:

1. Zarubaev V.V., Golod E.L., Anfimov P.M., Shtro A.A., Saraev V.V., Gavrilov

A.S., Logvinov A.V., Kiselev O.I. Synthesis and anti-viral activity of azolo-adamantanes against influenza A virus.// Bioorg. Med. Chem. - 2010. - V. 18(2). -P. 839-848.

2. Анфимов П.М., Киселев О.И., Зарубаев B.B. Сравнительный анализ активности триазольных и тетразольных производных адамантанов в отношении вирусов гриппа.// Молекулярная Медицина. - Москва. - 2010. - С. 13-18.

3. Зарубаев В.В., Беляевская С.В., Сироткин А.К., Анфимов П.М., Небольсин

B.Е., Киселев О.И., Рейхарт Д.В. Влияние ингавирина на ультраструктуру и инфекционность вируса гриппа in vitro и in vivo.// Вопросы вирусологии. -2011.-№5.-С. 21-25.

Тезисы:

1. Гаврилов А.С., Сараев В.В., Голод Е.Л., Киселев О.И., Зарубаев В.В., Анфимов П.М., Штро А.А. Противовирусная активность некоторых N-адамантилазолов. Перспективы развития химии и практического применения алициклических соединений.// Материалы XI международной научно-технической конференции. Волгоград. - 3-6 июня 2008 г., - С. 162.

2. AMandurdyeva A.D., Saraev V.V., Gavrilov A.S., Golod E.L., Guseva V.M., Zarubaev V.V., Anfimov P.M., Kalinina N.A. Synthesis and biological activity 1-azolil-3-R-adamantanes.// Advances of Chemistry and Applications of Alicyclic Compounds. - Samara - 2003. - Russia. - P. 58

3. Golod E.L., Gavrilov A.S., Anfimov P.M., Guseva V.M. Role of steric factors in reaction adamantilisation of pyrazoles.// Advances of Chemistry and Applications of Alicyclic Compounds. Samara. - 2003. - Russia, - P. Ill

4. Saraev V.V., AMandurdyeva A.D., Golod E.L., Zarubaev V.V., Anfimov P.M., Guseva V.M., Kalinina N.A. Features of alkylisation of 1,2,4-triazol to 1-adamantan.// Advances of Chemistry and Applications of Alicyclic Compounds. Samara. - 2003. - Russia. - P. 42

5. Zarubaev V.V., Anfimov P.M., Platonov V.G., Tetz V.V. New preparations perspective for treatment of influenza.// Strenghthening influenza pandemic preparadness through civil-military co-operation. Saint-Petersburg. - May 9-11 2003. - Russia. - P. 20

6. Zarubaev V.V., Anfimov P.M., Shtro A.A., Meleshkina I.A., Golod E.L., Saraev V.V., Gavrilov A.S., Logvinov A.V., Kiselev O.I. A novel class of synthetic compounds azolo- adamantanes with high anti- influenza activity.// Third European Influenza Conference. Vilamoura, - Portugal, 14-17 Sep. 2008. - abstract #6-032. -addendum. - P. 20.

7. Zarubaev -V.V., Guseva V.M., Shtro A.A., Anfimov P.M., Eropkin M.Y., Konovalova N.I., Yaglovskaya I.В., Gudkova T.M., Pisareva M.M., Grudinin M.P., Sominina A.A., Kiselev O.I. Susceptibility of influenza isolates circulating in Russian

Federation to anti-influenza drugs.// Third European Influenza Conference. -Vilamoura. - Portugal. -14-17 Sep. 2008, abstract #6-019. - P. 167.

Список сокращений

ВАК - Высшая аттестационная комиссия

ИД50 - 50% инфекционная доза

МТТ - микро-тетразолиевый тест

РГА — реакция гемагглютинации

DMSO - диметилсульфоксид

CTD50 — 50% цитотоксическая концентрация

ЕС50 - 50% эффективная концентрация

НА — гемагглютинин

LDSo- 50% летальная доза

SI - селективный индекс

Благодарности

Автор выражает глубокую благодарность и признательность своему научному руководителю - директору ФГБУ «НИИ гриппа» Минздравсоцразвития России академику РАМН, доктору биологических наук, профессору Киселеву Олегу Ивановичу за помощь и внимательное отношение на всех этапах работы. Автор также благодарит заведующего лабораторией молекулярных основ химиотерапии вирусов гриппа к.б.н. Зарубаева В.В. и других сотрудников лаборатории за различную помощь при выполнении работы. Автор признателен заведующему лабораторией молекулярной вирусологии и генной инженерии к.б.н. Грудинину М.П., а также сотрудникам лаборатории к.б.н. Писаревой М.М, м.н.с. Комиссарову А.И. за помощь в проведении молекулярно-биологических исследований. Автор также благодарит коллег и соавторов публикаций, принимавших участие в получении и оформлении результатов работы: к.б.н. Мельникову Т.И., к.б.н. Дееву Э.Г., д.б.н. Соминину A.A., к.б.н. Писареву М.М. и д.б.н. Козелецкую К.Н.

Подписано в печать 18.11.2011 Формат 60x90/16 Бумага офсетная. Усл. печ. л. 1,75 Тираж 150 экз. Заказ 556

Отпечатано в типографии «Адмирал» 199048, Санкт-Петербург, В.О., 6-я линия, д. 59 корпус 1, оф. 40

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Анфимов, Павел Михайлович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

РАЗДЕЛ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. Этиология и репродукция вируса гриппа.

1.1. Этиология вируса гриппа.

1.2. Строение и репродукция вируса гриппа.

Глава 2. Современные методы профилактики и лечения гриппа.

2.1. Вакцинопрофилактика.

2.2. Химиотерапия.

2.2.1. Ингибиторы адсорбции и проникновения.

2.2.2. Ингибиторы декапсидации.

2.2.3. Ингибиторы протеаз.

2.2.4. Ингибиторы репликации и транскрипции.

2.2.5. Ингибиторы кэпирования мРНК.

2.2.6. Ингибиторы высвобождения вируса из клетки.

2.2.7. Интерфероны и индукторы интерферонов.

2.2.8. Резистентность к противогриппозным препаратам.

2.2.9. Перспективы поиска новых химиопрепаратов.

РАЗДЕЛ 2. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Глава 1. Материалы и методы.

1.1. Исследуемые препараты.

1.2. Вирусы и клетки.

1.3. Питательные среды.

1.4 Препараты.

1.5. Исследование токсичности препаратов.

1.6. Подготовка вируса.

1.7. Определение противовирусной активности препаратов.

1.8.Определение ингибирования активности нейраминидазы флюоресцентным методом.

1.9. Получение устойчивых к азоло-адамантанам штаммов вируса гриппа.

1.10. Молекулярно-биологические методы.

1.11. Исследование противовирусной активности азоло-адамантанов in vivo на модели гриппозной пневмонии у белых мышей.

1.12. Статистическая обработка данных.

Глава 2. Результаты исследований.

2.1. Первичный скрининг препаратов.

2.2. Сравнение активности азоло-адамантанов и римантадина в эквимолярных концентрациях.

2.3 Исследование ингибирующей активности азоло-адамантанов в отношении нейраминидазы вируса гриппа.

2.4 Исследование противовирусной активности активных азоло-адамантанов в отношении эпидемических изолятов вируса гриппа.

2.5. Исследование активности азоло-адамантанов in vivo на модели гриппозной пневмонии у белых мышей.

2.6. Исследования мутаций изменчивости в вирусах, устойчивых к азоло-адамантанам.

ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Активность азоло-адамантанов в отношении вируса гриппа"

Актуальность проблемы

Проблема гриппа является актуальной на сегодняшний день. Уникальная^ способность вирусов гриппа к изменчивости путем мутаций, рекомбинаций и реассортации генов, сопровождающаяся модификацией биологических свойств вируса — причина неконтролируемого распространения инфекции. Несмотря на успехи в1 создании вакцин и средств химиотерапии, эпидемиш гриппа по-прежнему имеют огромные масштабы. Подтверждением этому стала пандемия 2009/2010« года; вызванная вирусами гриппа А(Н>Ш1)р(кп09. На сегодняшний день мировое признание получили только > два» класса лекарственных соединений для терапии гриппозной инфекции: производные адамантана (амантадин, римантадин), являющиеся ингибиторами функциональной активности белка М2 и производные сиаловой кислоты, имеющие специфическую мишень действия- - нейраминидазу (занамивир, осельтамивир). Среди циркулирующих эпидемически актуальных вирусов зафиксирован рост устойчивости к данным препаратам, а резистентность к римантадину среди выделенных вирусов в последние эпидемические сезоны достигла практически 100% (http://www.cdc.gov/flu/about/qa/antiviralresistance.htm). В пределах подтипа НШ1 стопроцентная устойчивость к осельтамивиру была достигнута всего<за полтора года (ноябрь 2007 - март 2009). В связи с этим чрезвычайно актуальны поиск и разработка новых, активных в,отношении вируса гриппа, лекарственных средств, а также исследование механизма их действия.

Цель исследования

Задачи исследования

• Провести первичный скрининг противовирусной активности Ч тестируемых соединений в опытах in vitro, выявить среди них наиболее активные.

• Изучить активность азоло-адамантанов в отношении циркулирующих вирусов гриппа А, в том числе A(HlNl)pdm09.

• Оценить активность азоло-адамантанов как ингибиторов вирусной нейраминидазы.

Научная новизна работы

1. Впервые исследована противовирусная активность азольных производных адамантанов.

5. Впервые показано, что! азоло-адамантаны обладают, умеренной противовирусной активностью или не активны на модели летальной гриппозной пневмонии у мышей.

Практическая значимость работы

В результате проделанной работы сформулированы основные требования к структуре соединений класса азоло-адамантанов4 как противовирусных средств. Установлен механизм формирования резистентности вирусов гриппа к азоло-адамантанам. Полученные результаты являются основой для дальнейшей разработки соединений с целью создания новых противогриппозных препаратов широкого спектра действия.

Основные положения, выносимые на защиту

2. Тетразольные производные адамантанов более активны, нежели их триазольные и диазольные гомологи.

3. Азоло-адамантаны не проявляют ингибирующей активности в отношении нейраминидазы вируса гриппа.

5. Пассирование вируса1 в присутствии азоло-адамантанов приводит к снижению чувствительности вируса и появлению мутации S31N в М2-белке, характерной для римантадин-устойчивых вирусов.

Апробация материалов диссертации

Материалы диссертационной работы доложены на международных конференциях: Strengthening influenza pandemic preparedness through civil-militaiy co-operation, Saint-Petersburg, Russia, May 9-11, 2003, XI международная научно-техническая конференция, Волгоград, Россия, 3-6 июня 2008 г., конференция "Third European influenza conference" Vilamoura, Portugal, September 14-17, 2008.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 118 страницах машинописного текста, включая 24 таблицы и 16 рисунков. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Список литературы содержит 144 источника на русском и английском языках.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Анфимов, Павел Михайлович

Выводы

- Молекула должна содержать не более одного тетразольного и не более одного адамантильного остатка.

- Адамантильные заместители должны занимать в тетразольном цикле положение 1.

3. Азоло-адамантаны не проявляют ингибирующей активности в отношении нейраминидазы вируса гриппа.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Анфимов, Павел Михайлович, Санкт-Петербург

1. Алферов В. П., Ариненко Р. Ю., Аникин В. Б., Малиновская Р. В. Система интерферона и интерферонотерапия: новые возможности и перспективы.// Росс. Семейный врач. 1998. - №.1. - С. 35-41.

2. Галегов Г. А., Наровлянский А. Н., Мезенцева М. В., Нестеренко В. Г.,t

3. Ершов Ф. И. «Кагоцел подавляет репродукцию вируса герпеса in vitro».// Russian Journal of Immunology. Official Journal of Russian Society of Immunology. 2004. - 9(suppl .1). - P. 44.

4. Гендон Ю.З. Новости вакцинопрофилактики.// Вакцинация. 1999. - №5. -С.З.

5. Гринбаум Е.Б., Литвинова О.М., Банников А.И. и др. Полиморфизм популяции современных вирусов гриппа А и В человека.// Вестник РАМН. -1994.-№9. -С. 36-40.

6. Грипп и другие респираторные вирусные инфекции. СПб.- 2003

7. Ерофеева М.К., Максакова М.А., Шадрин A.C. и др. Оценка эффективности применения препарата "иммунал" с целью профилактики гриппа и других острых респираторных недугов.// Terra medica.- 2000. N 4. - Р.379

8. Ершов Ф. И., Киселев О. И. Интерфероны и их индукторы (от молекул до лекарств). М. ГЭОТАР-Медиа. - 2005. - С.368.

9. Железникова Г.Ф., Иванова В.В., Монахова Н.Е. Варианты иммунопатогенеза острых инфекций у детей. СПб. - 2007. - С. 254

10. Иванова В.В. Острые респираторно-вирусные заболевания.// Инфекционные болезни у детей. М., - 2002.

11. Киселев О.И., Деева Э.Г., Слита A.B., Платонов В.Г. Антивирусные препараты для лечения гриппа и ОРЗ. Дизайн препаратов на основе полимерных носителей. 2000. - С-Петербург - С.46.

12. Лепехин А.В., Зорина 3:И., Бужак Н.С., Пучкова Н.Н. Йодантипирин -эффективное средство для профилактики гриппа и других ОРВИ.// Информационное письмо для врачей. — Томск. 2005

13. Литвинова О.М., Юхнова Л.Г., Коновалова Н.И. и др. Этиологический-надзор в России на базе Федерального центра по гриппу.// Тезисы научн. конф. "Грипп XXI век", 28 сент. - 2'окт. 1997 г., - С.-Петербург. - Россия.-1997. - С. 34.

14. Малашенкова И.К.,. Дидковский Н.А. Современные подходы к профилактике и лечению ОРВИ и гриппа.// Русский медицинский журнал. -2006. № 27. - С. 1968.

15. Малый'В.П:, Романцов M.F.,„Сологуб Т.В., Грипп. Пособие для врачей. -Санкт-Петербург — Харьков. 2007.

16. Никитин Е.В. Использование Амиксина в терапии и. профилактике вирусных инфекций.// Одесский* государственный, медицинский университет, кафедра инфекционных болезней.и.эпидемиологии. Украина. - Медицина сегодня. - 2007. - № 2. — С. 206.

17. Онищенко Г.Г., Киселев О.И., Соминина* А.А1. Усиление надзора и контроля за гриппом как важнейший элемент подготовки к сезонным эпидемиям и очередной пандемии. М., 2004. - С. 5-9.

18. Abed Y., Goyette N., Boivin G. Generation and characterization of recombinant influenza- A (H1N1) viruses harboring amantadine resistance mutations.//Antimicrob Agents Chemother. 2005. - V. 49 (2). - P.556-559.

19. Anhlan D., Grundmann N., Makalowski W., Ludwig S., Scholtissek C. Origin of the 1918 pandemic H1N1 influenza A virus as studied by codon usage patterns and phylogenetic analysis.// RNA. 2011. - P. 64-73.

20. Aoki F.Y., Boivin G., Roberts N. Influenza virus susceptibility and resistance to oseltamivir.// Antivir. Ther. 2007. -V. 12. - P. 603-616.

21. Arnaud P. The interferons: pharmacology, mechanism of action, tolerance and side effects.// Rev Med Interne. 2002. - Nov. 23. - Suppl. 4. - P. 449-458.

22. Azuma M., Suzutani T., Sazaki K., Yoshida I., Sakuma T., Yoshida T. Roleof interferon in the augmented resistance of trehalose-6,6'-dimycolate-treatedmice to influenza virus infection.// J Gen Virol. 1987. - Mar. 68 ( Pt 3). -P.835-843.

23. Balezina T.I., Fadeeva L.L., Zemskov V.M., Korneeva L.E., Loidina G.I. Interferonogenic and antiviral activity of the tobacco mosaic virus, tilorone and sodium-nucleinate.// Antibiotiki. 1976. - Mar. 21(3). - P. 250-254.

24. Baz M., Abed Y., McDonald J. and Boivin G. Characterization of multidrug-resistant influenza^ A/H3N2 viruses shed during' 1 year by an immunocompromised child.// Clin. Infect. Dis. 2006. - V. 43. - P. 1555-1561.

25. Borman S. Flu virus proton channel analyzed: structures of key surface protein suggest different drug mechanisms.// Chem Eng News. 2008. - V.86. -P. 53-54.

26. Bouvier N.M., Lowen A.C., Palese P. Oseltamivir-resistant influenza A viruses are transmitted efficiently among guinea pigs by direct contact but not by aerosol.// J. Virol. 2008. -V. 82. - P. 10052-10058.

27. Collins P.J., Haire L.F., Lin Y.P., Liu J., Russell R.J., Walker P.A., Skehel

28. J.J., Martin S.R., Hay A.J., Gamblin S.J. Crystal structures of oseltamivir104resistant influenza virus neuraminidase mutants .// Nature. 2008. - V. 453 (7199).-P. 1258.

29. Cox N .J., Fukuda K. Influenza // Infect. Dis. Clin. N. Amer. 1998. -vol. 12. -P. 27-37.

30. De Clercq E. Emerging antiviral drugs.// Expert. Opin. Emerg. Drugs. 2008. v. 3 -p. 393-416i

31. Dutkowski R., Thakrar B., Froehlich E., et al. Safety and pharmacology of oseltamivir in clinical use.// Drug Saf., 2003. - V. 26. - P. 787-801.

32. Fields B.N., Knipe D.M., Howley P.M. Fields. Virology. Philadelphia: Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams & Wilkins. - 2007.

33. Furuta Y., Takahashi K., Kuno-Maekawa M., Sangawa H., Uehara S., Kozaki

34. K., Nomura N., Egawa H., Shiraki K. Mechanism of action of T-705 againstinfluenza virus.// Antimicrob Agents Chemother. 2005. V.49. - P. 981-986.105

35. Gubareva L.V., Kaiser L., Matrosovich M.N., Soo-Hoo Y. and Hayden F.G., Selection of influenza virus mutants in experimentally infected volunteers treated with oseltamivir.// J. Infect. Dis. V. 183. - 2001. - P. 523-531.

36. Guo Y., Rumschlag-Booms E., Wang J:, Xiao H., Yu J1., et al. Analysis of hemagglutinin-mediated entry tropism of H5N1' avian influenza.// Virology Journal. 2009. - V. 6. - P. 39.

37. Hatta T., Ishikawa M., Takai K., Nakada S., Yokota T., Hata T., Miura K., Takaku H. Inhibition of influenza virus RNA polymerase by 5'-capped short RNA fragments.// Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998. - Aug. 10; -V. 249(1). -P. 103-106.

38. Hayden F.G. Antivirals for pandemic influenza.// J. Infect. Dis. 1997 Aug; 176. - Suppl. l.-P. 56-61.

39. Herlocher M.L., Carr J., Ives J., et al. Influenza virus carrying an R292K mutation in the neuraminidase gene is not transmitted in ferrets.// Antiviral Res. -2002.-V. 54.-P. 99-111.

40. Hope-Simpson R.E., Golubev D.B. A new concept of the epidemic process of influenza A virus // Epidemiol", and Infec. 1987. - vol. 99. - p. 5-54.

41. Hosoya M., Shigeta S., Ishii T., Suzuki H:, De Glercq, E. Comparative inhibitory effects of various nucleoside and nonnucleoside analogues on replication of influenza virus types A and'B in vitro and in ovo.// J: Infect. Dis. -1993.-V. 168.-P. 641-646.

42. Huffman J.H., Sidwell R.W., Barnard D.L. et al. Influenza virus inhibitory effects a series of germanium - and silicon-centred polyoxometalates // Antiviral Chemistry & Chemotherapy. - 1997 - V.8 - P.75-83.

43. Jackson H.C., Roberts N., Wang Z.M., et al. Management of influenza: use of new antivirals and resistance in-perspective.// Clin. Drug. Invest. — 2000: V.20. -P. 447-454.

44. Jakeman K.Jv Tisdale M:, Russell S., Leone A., Sweet C. Efficacy of 2'-deoxy-2'-fluororibosides against influenza A and B viruses in ferrets.// Antimicrob. Agents. Chemother. 1994. - V.38, P. 1864-1867.

45. Ison M.G., Gubareva L.V., Atmar R.L., Treanor J. and Hayden F.G. Recovery of drug-resistant influenza virus from immunocompromised patients: a case series.// J. Infect. Dis. -2006. P. 760-764.

46. Kido H., Yokogoshu Y., Saski K. et al. Isolaton and characterization of a novel trypsin-like protease found in rat bronchiolar epithelial cells // J. Biol. Chem. 1993. - V. 267. - P.13573-579.

47. Kinnunen L., Ikonen N., Pory T., Pyhala R. Evolution of influenza B/Victoria/2/87-like viruses: occurrence of a genetically conserved virus under condition of low epidemic activity.// Gen. Virol. 1992. -vol. 73. - P. 733-736.

48. Kiso M., Mitamura K., Sakai-Tagawa Y. et al. Resistant influenza A viruses in children treated with oseltamivir: descriptive study.// Lancet. 2004. - V. 364. -P. 759-65.

49. Klenk H.D., Garten W., Matrosovich M. Molecular mechanisms of interspecies transmission and pathogenicity of influenza viruses: Lessons from the 2009 pandemic.//Bioessays. 2011.-V. 33(3).-P. 180-188.

50. Kolocouris N., Zoidis G., Foscolos G.B1., Fytas G., Prathalingham S.R., Kelly J.M., Naesens L., De Clercq E. Design and synthesis of bioactive adamantane spiro heterocycles.// Bioorg. Med. Chem. Lett. 2007 - V. 17(15). -P. 43584362.

51. Kolocouris A., Foscolos G.B., Fytas G., Kolocouris N., DeClercq, E.

52. Synthesis of 2-(2-adamantyl)piperidines and' structure anti-influenza virus Aactivity relationship study using a combination of NMR spectroscopy andmolecular modeling.// Bioorg. Med. Chem. Lett. 1999. - V. 9. - P. 3465.108

53. Kolocouris A., Kolocouris N., Foscolos G.B., De Clercq E. Synthesis and antiviral activity evaluation of some new aminoadamantane derivatives. 2.// J. Med. Chem. 1996.-V. 39.-P. 3310.

54. Kramer M.J., Cleeland R., Grunberg E. Antiviral- activity of 10-carboxymethyl-9-acridanone.// Antimicrob. Agents. Chemother. 1976. - V. 9(2).-P. 233-238.

55. Li M.L., Rao P., Krug R.M. The active sites of the influenza cap-dependent endonuclease are on different polymerase subunits.// EMBO J. 2001. -V.20(8). -P. 2078-2086.

56. Lu Y., Gervay-Hague Ji Synthesis of C-4 and C-7 triazole analogs of zanamivir as multivalent sialic acid containing scaffolds.// Carbohydr Res. 2007 V.42(12-13). -P.1636-1650.

57. Ludwig S., Stilz L., Planz O. et al. European swine virus as a possible source for the next influenza pandemic.// Virology. 1995. - V. 212. - P. 555-561".

58. Luo G., Colonno R., Krystal M.Characterization of a hemagglutinin-specific inhibitor of influenza A virus.// Virology. 1996. - V. 226(1). - P. 66-76.

59. McGeer A., Green K.A., Plevneshi A., et al. Antiviral therapy and outcomes of influenza requiring hospitalization in Ontario, Canada.// Clin. Infect. Dis. -2007.-Y. 45.-P. 1568-1575.

60. McKimm-Breschkin J. L. Resistance of influenza viruses to neuraminidase inhibitors—a review.// Antiviral Research. 2000. - V. 47. - P. 1-17.

61. Mossmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Methods. 1983. -V. 65.-P. 55-63.

62. Nayak D.P., Balogun R.A., Yamada H., Zhou Z.H., Barman S. Influenza virus morphogenesis and budding.// Virus Res. 2009. - V. 143(2). - P. 147161.

63. Noboru U., Kunio O. Antiviral function of pyrrolidine dithiocarbamate against influenza virus: the inhibition of viral gene replication and transcription.// J. Antimicrob. Chem. 2003. -V. 52. - P. 8-10

64. Peiris M. Pathogenesis of avian flu H5N1 and SARS.// Novartis Found Symp. 2006. - V. 279. - P. 56-60.

65. Pielak R.M., Schnell J.R., Chou J J. Mechanism of drug inhibition and drug resistance of influenza A M2 channel.// Proc. Natl Acad Sci USA. -2009. -V. 106.-P. 7379-7384.

66. Poland G.A., Jacobson R.M., Ovsyannikova I.G. Influenza virus resistance to antiviral agents: A plea for rational use.// Clin. Infect. Dis. 2009. - V.48. - P. 1254-1256.

67. Pontoriero A., Baumeister E., Campos A.M., Moreno A., Cadario M.E., Savy V. Surveillance of adamantane resistance among influenza A H3 viruses isolated in Argentina between 2001 and 2007.// Rev. Argent. Microbiol. 2008. -V. 40(3).-P. 180-184.

68. Potier M., Mameli L., Belislem L., Dallaire L., Melanxon S.B. Fluorometric assay of neuraminidase with a sodium (4-methylumbeliferiyl-a-B-T-acetylneuraminate) substrate.// Anal.Biochem. 1979. V.94. - P.287-296:

69. Reed L.J., Muench H. A simple method of estimating fifty percent endpoints.// The American Journal of Hygiene. 1938. - V. 27. - P. 493^197.

70. Reid A.N., Fanning T.G., Hultin J.Y., Taubenberger J.K. Origin and evolution« of the 1918 "Spanish" influenza virus haemagglutinin gene. // Microbiol: 1999. -V. 96.-P. 1651-1656.

71. Robb N.C., Chase G., Bier K., Vreede F.T., Shaw P.C., Naffakh N., Schwemmle M., Fodor E. The Influenza A Virus NS1 Protein Interacts with the Nucleoprotein of Viral Ribonucleoprotein Complexes.// J. Virol. 2011. - V. 85(10).-P. 5228-5231.

72. Roberts N.A., Wiltshire H.R., Mendel D.B., et al. Oseltamivir carboxylate is effective against all subtypes of influenza neuraminidase.// Abstracts of the ASM Biodefense Research Meeting. 2003. - Baltimore. Poster.

73. Rosenberg M.R., Casarotto M.G. Coexistence of two adamantane binding sites in the influenza A M2 ion channel.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2010. -V. 107(31). -P.13866-13871.

74. Rothberg M.B., Bellantonio S., Rose D.N. Management of influenza in adults older than 65 years of age: Cost-effectiveness of rapid testing and antiviral therapy.// Ann. Intern. Med.-2003. -V.139.-P. 321-321.

75. Saito R, Sakai T., Sato I., Sano Y., Oshitani H., Sato M., Suzuki H. Frequency of amantadine-resistant influenza A viruses during two seasons featuring cocirculation of H1N1 and H3N2.// J. Clin. Microbiol. 2003 -V. 41(5).-P. 2164-2165.

76. Samji T. Influenza A: Understanding the Viral' Life Cycle.// Yale. J. Biol. Med.-2009.-V. 82(4).-P. 153-159.

77. Scharfenorth H., Glathe H., Giese H:, Diffmann, S. Zur Epidemiologic und Klinik der Influenza C-lnfektion.// ZKM: Z. Klin. Med. 1991. - V. 46. - P. 11831187.

78. Scholtissek C., Burger H., Bachmann P.A., Hannoun C. Genetic relatedness of haemagglu-tinins of the HI subtype swine and birds.// Virology. 1983. - V. 129.-P. 521-523.

79. Scholtissek C. Molecular evolution of influenza viruses.// Virus. Genes. -1996. VI1.-P. 209-215.

80. Scholtissek C., Quack G., Klenk H.D., Webster R.G. How to overcome resistance of influenza A viruses against adamantane derivatives.// Antiviral Res. 1998. - V. 37(2). - P. 83-95.

81. Shigeta S., Mori S., Yamase T., Yamamoto N., Yamamoto N. Anti-RNA virus activity of polyoxometalates.Biomed Pharmacother.// 2006. — V. 60(5). — P. 211-219.

82. Shigeta S., Mori S., Kodama E., Kodama J., Takahashi K., Yamase T. Broad spectrum anti-RNA virus activities of titanium and vanadium substituted polyoxotungstates.// Antiviral Res. 2003. - V. 58(3). - P. 265-271.

83. Shigeta S. Approaches to antiviral chemotherapy for acute respiratory infections.// Antivir Chem Chemother. 1998. - V. 9(2). - P. 93-107.

84. Shigeta S., Mori S., Watanabe J., Soeda S., Takahashi K., Yamase T. Synergistic anti-influenza virus A (H1N1) activities of PM-523 (polyoxometalate) and ribavirin in vitro and in vivo.// Antimicrob. Agents. Chemother. 1997.-V. 41(7).-P. 1423-1427.

85. Shultz-Cherry S., Dybdahl-Sisso N., Neumann O. et al.// J. Virol. 2001. -V.75.-P. 7875-7881.

86. Semenenko T.A., Selkova E.P., Nikitina G.Y., Gotvyanskaya T.P., Yudina T.I., Amaryan M.P., Nosik N.N., Turyanov M.H. Immunomodulators in the prevention of acute respiratory viral infections.// Russ. J. Immunol. 2002. - V. 7(2).-P. 105-114.

87. Shneider M.A., Golovkin V.I., Chizhov N.P., Shtil'bans EB. Amphoglucamine in the combined chemotherapy of viral diseases.// Vopr. Virusol. 1987. - V. 32(6). - P. 736-739.

88. Schnell J.R., Chou J J. Structure and mechanism of the M2 proton channel of influenza A virus.//Nature.-2008. V. 451(7178).-P. 591-595.

89. Sologub T.V., Shul'diakov A.A., Romantsov M.G., Zhekalov A.N.,

90. Petlenko S.V., Erofeeva M.K., Maksakova V.L., Isakov V.A., Zarubaev V.V.,

91. Stamatiou G., Foscolos G.B., Fytas G., Kolocouris A., Kolocouris N., De Clercq E. Heterocyclic rimantadine analogues with antiviral activity.// Bioorg. Med. Chem. 2003. - V. 11 - P. 5485.

92. Stephenson I., Democratis J., Lackenby A., et al. Neuraminidase inhibitor resistance after oseltamivir treatment of acute influenza A and B in children.// Clin. Infect. Dis. 2009. - V. 48. - P. 389-396.

93. Sukhinin V.P., Pleskov V.M., Zarubaev V.V., Slita A.V., Pestrinskaia E.A., Brzheskii V.V., Kovalenko A.L., Ershov P.I. The use of cycloferon in the therapy of experimental herpetic keratitis.// Antibiot .Khimioter. 2000. -V. 45(6). -P.13-16.

94. Sukhinin V.P., Zarubaev V.V., Platonov V.G., Kovalenko A.L., Ershov F.I. Protective effect of cycloferon in experimental influenza.// Vopr. Virusol. -2000.-V. 45(5).-P. 26-30.

95. Tao SJ. A screening method for anti-influenzal drugs; influenza virus propagation inhibition test (author's transí).// Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 1981 V. 61(6).-P: 359-361.

96. Taubenberger J.K., Reid A.M., Krafft A.E. et al. Initial genetic characterization of the 1918 "Spanish" influenza virus.// Science. - 1997. - V. 275.-P. 1793-1795.

97. Tellier R. Aerosol transmission of influenza A virus: a review of new studies.// J. R. Soc Interface. 2009. - V. 6. - P. 783-790.

98. Timofeev I.V., Chaplygina S.R., Zorin V.V., Khromykh A.A., Kolokol'tsov AA. Comparative study of interferon inducers obtained from natural sources.// Antibiot. Med. Biotekhnol. 1987. - V. 32(2). - P. 144-147.

99. Triana-Baltzer G.B., Babizki M., Chan M.C., Wong A.C, Aschenbrenner

100. M., Campbell E.R., Li Q.X., Chan R.W., Peiris J.S., Nicholls J.M., Fang

101. F.DAS181, a sialidase fusion protein, protects human airway epithelium againstinfluenza virus infection: an in vitro pharmacodynamic analysis.// J. Antimicrob.

102. Chemother. 2010. - V. 65(2). - P. 275-284.115

103. Tu Q., Pinto L.H., Luo G., Shaughnessy M.A., Mullaney D., Kurtz S., Krystal M., Lamb R.A. Characterization of inhibition of M2 ion channel activity by BL-1743, an inhibitor of influenza A virus.// J. Virol. 1996 - V. 70. - P. 4246-4252.

104. Update: drug susceptibility of swine-origin influenza A. (H1N1) viruses, April 2009. Centers for Disease Control and Prevention- (CDC). MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 2009: - V. 58(16). - P. 433-435.

105. Wang T., Wade R.C.// J. Med. Chem. 2001 - V. 44 - P. 961-971.

106. Wang M.Z., Tai C.Y. and''Mendel D.B. Mechanism by which mutations at His274 alter sensitivity of influenza A virus N1 neuraminidase to oseltamivir carboxylate and zanamivir.// Antimicrobial Agents Chemotherapy. 2002. - V. 46.-P. 3809-3816.

107. Wang J., Cady S.D., Balannik V., Pinto L.H., DeGrado W.F., Hong M. Discovery of spiro-piperidine inhibitors and their modulation of the dynamics of the M2 proton channel from influenza. A virus.// J. Am. Chem. Soc. 2009 -V. 131(23).-P. 8066-8076.

108. Ward P., Small I., Smith J., et al. Oseltamivir (Tamiflu) and its potential for use in the event of an influenza pandemic.// J. Antimicrob. Chemother. 2005. -V. 55.-P. 15-21.

109. White L.K., Yoon J.-J., Lee J.K., Sun A., Du Y., Fu H., Snyder J.P., Plemper R.K.// Antimicrob. Agents Chemother. 2007. - V. 51. - P. 2293.

110. Whitley R.J., Hayden F.G., Reisinger K.S., Young N., Dutkowski R., Ipe D., Mills R.G., Ward P. Oral oseltamivir treatment of influenza in children.// Pediatr. Infect. Dis. 2001. - V. 20. - P. 127-133.

111. Witkowski J.T., Robins R.K., Khare G.P., Sidwell R.W. Synthesis and antiviral activity of l,2,4-triazole-3-thiocarboxamide and l,2,4-triazole-3-carboxamidine ribonucleosides.// Ji Med Chem. 1973. - V.16. -P. 935-937.

112. Wray S.K., Gilbert B.E., Knight V. Effect of ribavirin triphosphate on primer generation and elongation during influenza virus transcription in vitro.// Antiviral. Res. 1985. - V. 5. - P: 39-48.

113. Yen H.L., Herlocher L.M., Hoffmann E., Matrosovich M.N., Monto A.S., et al. Neuraminidase inhibitor-resistant' influenza viruses may differ substantially in fitness and transmissibility.// Antimicrob. Agents Chemother. 2005. - V. 49. -P. 4075-4084.

114. Zoidis G., Kolocouris N., Kelly J.M., Prathalingam S.R., Naesens E., De Clercq E. Design and synthesis of bioactive adamantanaminoalcohols and adamantanamines.// Eur. J. Med. Chem. 2010. - V. 45(11). - P. 5022-5030.

115. Zoidis G., Kolocouris N., Naesens L., De Clercq, E.Design and'synthesis of 1,2-annulated adamantane piperidines with'anti-influenza virus activity.// Bioorg. Med. Chem. 2009. - V.17(4). - P. 1534-1541.

116. Zoidis G., Tsotinis A., Kolocouris N., Kelly J.M., Prathalingam S.R., Naesens L., De Clercq E. Design and synthesis of bioactive 1,2-annulated adamantane derivatives.// Org. Biomol. Chem. 2008. - V.6(17). - P. 3177-3185.

117. Zoidis G., Foscolos G.B., Fytas G., Padalko E., DeClercq E., Kolocouris N. Heterocyclic rimantadine analogues with antiviral activity.// Bioorg. Med. Chem. 2006.- V. 14-P. 3341.

118. Zoidis G., Kolocouris N., Foscolos G.B., Kolocouris A., Fytas G., Karayannis P., Padalko E., Neyts J., De Clercq E. Are the 2-isomers of the drug rimantadine active anti-influenza A agents?// Antivir. Chem. Chemother. 2003. -V. 14(3).-P. 153-164.

Информация о работе

Анфимов, Павел Михайлович
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2011
ВАК 03.02.02

Диссертация

Активность азоло-адамантанов в отношении вируса гриппа - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Активность азоло-адамантанов в отношении вируса гриппа ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Активность азоло-адамантанов в отношении вируса гриппа"

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Анфимов, Павел Михайлович

Введение Диссертация по биологии, на тему "Активность азоло-адамантанов в отношении вируса гриппа"

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Анфимов, Павел Михайлович

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Анфимов, Павел Михайлович, Санкт-Петербург

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Активность азоло-адамантанов в отношении вируса гриппа
ВАК РФ 03.02.02, Вирусология