Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Вирус Синдбис, резистентный к производным адамантана

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Вирус Синдбис, резистентный к производным адамантана"

РГ8 ОД

г зпи ^

11а правах ругашксн

АйДРОЗШД Валерка .Еьваггка

ВИРУС СШЩБКС, РКШСТЕНТНШ К ЕРЕШОЙШЭ! АДАШШШД:

получение и шюторые свойства.

СЗ. 00. Об - Щфуеаяпгкя

АВТОРЕ&ЕРДТ ДЕСсерхацки на сшскашзе ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1997

Работа выполнена в лаборатории химиотерапии вирусных инфекций НИИ вирусологии им. Д.. И. Ивановского РАМЕ

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор биологических наук, профессор

Г. А. Галегов

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор медицинских наук, профессор доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник

Я. Я. Цилинский

В. Н. Ляпустин

Ведущее учреждение - Государственный НИИ стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им. Л А. Тарасевича

часов на заседании специализированного Ученого совета Д 001. 20.01 при НИИ вирусологии да. Д. И. Ивановского РАШ (Москва, 123098, ул. Гамалеи, 16) С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН.

Автореферат разослан /У^-Р_1997 г.

Ученый секретарь Специализированного

Совета, доктор медицинских наук Е П. Косякова

Защита состоится

1997 г. В

Актуальность проблемы. Среди вирусов, передающихся членистоногими арбовирусов) и вызывающих у людей тяжелые инфекционные заболевания ллоть до энцефалитов, немаловажное место занимают альфавирусы. В ео-тав этого рода входят высокопатогенные для человека вирусы венееу-льского, западного, восточного энцефаломиелитов лошадей, Чикунгунья, 'осс-Ривер и другие. Большинство патогенных для человека альфавирусов, ■ том числе вирус Синдбис и близкородственный ему вирус карельской ш-орадки, способны вызывать эпидемические вспышки. Имеются данные о эджуляции на территории бывшего СССР вирусов Синдбис, Гета, леса Семики, карельской лихорадки, Кыаылагач ( Гайдамович С. Я. ,1986-, Львов Д. К. : др., 1986). Кроме того, нельзя не считаться с возможностью случаев :абораторного заражения вирусами, которые в естественных условиях в ашей стране не встречаются. Поэтому проблема лекарственной терапии льфавирусных инфекций заслуживает серьезного внимания и обусловливает еобходимость поиска антивирусных агентов, на базе которых можно было ы в перспективе создать лекарственные препараты. К сожалению, и в на-тоящее время достижения химиотерапии вирусных инфекций продолжают тетавать от потребностей практической медицины: до настоящего времени и один из ингибиторов репродукций альфавирусов, проявивших достаточно ысокую активность в экспериментах m vitro и in vivo, не прошел кли-ических испытаний.

Производные адамантана ( ашнтадкн и ремантадин), известные прежде сего как эффективные противогриппозные средства, являются ингибитора-и широкого спектра действия. В частности, ремантадин обладает слабой ротивовирусной активностью в отношении альфавирусов (Casse11 S. et 1. , 1984; Helenius A. , Marsh ML , White J. 4 1982). В Киевском политех-ическом институте на основе адамантана в ходе направленного синтеза олучены новые соединения, исследование которых, выполненное в НЖ ви-усологии, показало несомненную перспективность этой группы химических □единений в качестве избирательных ингибиторов репродукции альфавиру-гш (Исаев С. Д., 1982, 1989; Леонтьева Е А., Сычева И. В., 1982).

Использование химиотералевтических средств в клинической практике эетавило врачей перед новой проблемой - развитием лекарственной ре-истентности у вирусов. В лабораторных условиях получены штаммы виру-эв с частичной или полной резистентностью практически ко всем соеди-

нениям, обладающим избирательной противовирусной активностью. (У. больных вщелены шташы, устойчивые к действию имеющих практическое значение противовирусных лекарственных средств. Иыеетея обширная литература о существовании амантадик- и ремантадин-резистентных клинических изолятов вируса гриппа, ацикловир-резистентных штаммов вирусе; герпеса простого и варицелла зоетер, AZT -резистентных штаммов вирус; иммунодефицита человека, ганцикловир-резистентных отаммов цитомегало-вируса человека (Козелеикая К. Е и др. , 1987, 1991; Chow Y.-К. et al., 1993-, Field Н. J. , 1989; Stanat S.C., 1991) . Такие штаммы с измененный геномом присутствуют в вирусных популяциях, и это может влиять на успешность проводимых химнотерапевтических мероприятий, особенно в условиях массового применения лекарственных препаратов. Позтому, презкде чем предложить то или шое соединение для клинического изучения, целесообразно сначала ь экспериментальных условиях получить ингибитор-резистентные штаммы, изучить их свойства и условия ингибирования. Сравнительное изучение чувствительных и резистентных штаммов вируси позволит изучить механизм действия антивирусных агентов. Кроме того, такой подход дает возможность еше на уровне лабораторных иселедовани? предложить принципиальную схему рационального применения данного соединения, обеспечивающую не только его максимальную эффективность, не и сводящую к минимуму риск сформирования лекарственной резистентности, установить возможности ингибирования таких штаммов в условиях организма.

Возможность формирования штаммов альфавирусов с лекарственной резистентностью практически не исследована, так как в настоящее врем* опубликовано лишь одно сообщение о получении мутанта вируса Синдбис, резистентного к миксфеноловой кислоте (Seheidel L. M. et al., 1987). P началу наших исследований информация о наличии резистентных к адаыан-тановым соединениям штаммов вируса Синдбис или каких-либо другш представителей альфавирусов в литературе отсутствовала

Цель и задачи исследования. Исходя из изложенного выше, мы предприняли исследования, цель которых заключалась в селекции и всестороннее анализе соединений ряда адамантана, обладавших наибольшей противовирусной активностью в отношении альфавирусов на моделях вирусов Синдбис (ВС) и венесуэльского энцефаломиелита лошадей (ВЭЛ).

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Сравнительное изучение цитотоксичности и антивирусной активности ряда производных адамантана.

2. Получение резистентных к наиболее активным соединениям штаммов ВС, изучение возможных путей предупреждения их формирования.

3. Сравнительное исследование свойств штаммов ЕС, чувствительных и резистентных к. действию производных адамантана.

4. Изучение некоторых аспектов механизма действия производных адамантана на модели ВС.

Изложения, выносимые на зашиту.

1." Эффективность производных адамантана как ингибиторов репродукции иьфавирусов на моделях ВС, а тага® ВЭЛ лп vitro и iv vivo.

2. Возмолсноеть получения и условия формирования штаммов ЕС, устойчивых к действию производных адамантана и исследование их свойств.

Научная новизна. Продемонстрировано избирательное ингибирующее действие 4 производных адамантана на репликацию альфавирусов; установ-гено, что наибольшей избирательной противовирусной активностью обладает амиды 1-адамантанкарбоновой (ААКК) и 1-адамантануксусной кислот ААУК). Показано, что они не обладают вирулицидным эффектом, но в зна-штельной степени ингибируют образование вирусепецифичееких полипепти-5ов и РЖ Впервые получены in vitro устойчивые к производным адамантана штаммы ВС, определены их характеристики по сравнению с исходным гувствительным вирусом: установлено увеличение продолжительности ла-■ентного периода и, вследствие этого, репродуктивного цикла в целом >езистентного варианта вируса

Практическая ценность работы. Полученные результаты показали перс-[ективность исследований ААКК, обладающего максимальной эффективностью ■реди изученных соединений, в качестве антиальфавирусного средства, [оказана целесообразность сочетанного применения ингибиторов с различил механизмом действия, что, во-первых, обусловливает синергидный эф-ект, во-вторых, затрудняет, а, возможно, и предотвращает формирование ггаммов, устойчивых к действию хишогерапевтичеекях препаратов, и, в-ретьих, обеспечивает ингибирование резистентных штаммов, -что особенно ажио в клинической практике.

Апробация работы. Основные результаты представлены на всесоюзжгё шкоде-семинаре "Молекулярная биология и медицина" (Ленинград, 1990 г.) конференции "Новые подходы к химиотерапии вирусных инфекций" (Рига, 1991), конкурсе молодых ученых в НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН в 1993 г.. Диссертация апробирована 23.12 .96 на Ученом Совете НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМЕ

Публикации. По материалам диссертации опубликовано Б работ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 222 с. машинописного текста, иллюстрирована 23 рисунками и 21 таблицей. Работа состоит из введения, 2-х глав обзора литературы, 6-и глав собственных исследований, обсувдения результатов, выводов и списка литературы, включающего 268 источников, в том числе 48 отечественных и 220 иностранных.

СОБСТВЕННЫЕ ИССВДОВШШ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Культуры клеток. Использовали культуру перевиваемой линии клеток почек зеленой мартышки Vero, полученную из лаборатории культуры тканей Института вирусологии им. Д. К Ивановского РАЖ Культуру 2ЭК получади путем трипеинизацш куриных эмбрионов по общепринятой методике.

Вирусы. В работе использовали ВС (штамм Ag/339) и ВЭЛ-230, полученные из Государственной коллекции вирусов Института вирусологии ш. Д. И. Ивановского РАЖ Пассирование вирусов проводили в культуре клеток Vero по общэпринятой методике.

Препараты. Гидрохлориды <х - ме г ил-адамантанметиламина (ремантадин), ос-метокси-1-адамантанметиламина (соединение III), с* -хлорметил-1-ада-ыантанметиламина (соединение IV), амиды 1-адамантанкарбоновой (ААЯК) и 1-адамантануксуеной кислот (ААУЮ синтезированы в Киевском политехническом институте профессором Юрченко А. Г. , д. х. н. Исаевым С. Д..

В работе использовались также рибавирин (виразол, 1 -J-D-рибофурано-зил-1,2,4-триазол-3-карбоксамид), синтезированный в Институте органического синтеза АН Латвии профессором Лидаком М. Ю. и производства ICN Pharmaceutical (США), и хлорид аммония производства фирмы Merck (ФРГ).

Определение инфекционной активности вируса методом бляшек проводили в соответствии с общепринятой методикой. Культуру клеток Vero или ФЭК заражали 10-кратными разведениями вируса. Шсле адсорбции клетки про-

швали раствором Хенкса и вносили содержащую 1,25% агара среду покрытия. Бляшки учитывали после 48-часовой инкубации при 37"с .

тонирование вируса осуществляли путем изоляции бляшек из-под агарового покрытия с последующим пассированием в культуре клеток под жид-гай средой поддержи.

Цитотоксичяость соединений определяли (а) методом окрашивания клеток 1% раствором трипанового голубого после инкубации в присутствии различных концентраций соединений; (.Ь) по включению С3 Ю -тимидина мкКи/мл) в кислотонерастворимую фракцию клеток в соответствии с методом DeClercq Е. с соавторами, 1977.

Испытание противовирусной активности соединений проводили (а) путем окрашивания инфицированных клеток трипановш голубым после инкубации их в присутствии различных концентраций ингибитора; (Ь) методом редукции бляшек; (с) по степени снижения инфекционного титра вируса по эбщэпринятой методике.

Изучение динамики синтеза вирусспецифичееюпс РЖ проводили в соответствии с методом Susuki J. и др. (1981) по включению [ в Ш-уридина !5 мкКи/мл) в инфицированные клетки в присутствии актиномицина Д.

Электрофорез белков в ПМГ (лолиакриламидном геле) с последующей эадиографией гелей проводили в соответствии с методикой Laemmli D.К., 1970. Использовали 3Z фокусирующий гель и 10Z разделяющий гель.

Для мечения вирусспецифических белков использовали безметиониновую :реду Игла, содержащую [35"S]-метионин (50 мкКи/мл) в присутствии акти-юмицина Д (2 мкг/мл).

Изучение антивирусной активности соединений в опытах на жщют-щх. м|ппей весом 10-12 г заражали интрацеребрально культуральным ВС 5 дозе 1x10* Б0Е/0,05 мл. Антивирусный агент вводили перорально. По ic-течении указанного периода времени животных забивали, извлекали мозг, 'отовили 10Z суспензию, центрифугировали ее и определяли инфекционный ;итр суяернатанта титрованием методом бляшек. Эффективность испытуемо-■о соединения оценивали по снижению величины инфекционного титра виру-:а в мозговой суспензии.

Статистическая обработка данных проводилась в соответствии с об-щринятыми методиками (Урбах В. Ю., 1975). Представлены данные 3 неза-шсимых экспериментов.

- 8 -

РЕЗУЛЬТАТЫ Г ОБСУЖДЕНИЕ. Изучение цитотоксшигости х антивирусных свойств производных адаиалтаиа in vitro на иода лях вирусов Синдбкс я ВЭЛ-230.

Цитотоксичность соединений оценивали в первичнотрипсинизированных (ФЭК) и перевиваемых (Vero) культурах клеток. Соединения вносили в культуры в составе среды поддержки через 24 часа после высева клеток, когда клеточный монослой полностью сформировался. Спустя 72 часа определяли МЖ Затем в тесте окрашивания клеток трипановым голубым определяли величины ЦДу^ и). Токсичность всех изучаемых соединений, установленная в культуре клеток Vero, близка их токсичности в культуре ФЭК. Как видно из таблицы 1, цитотоксичность соединений МКК, МУК, III и IV оказалась приблизительно в 5, 4, 3 и 3 раза, соответственно, ниже токсичности ремантадина.

Величины БД¿j, (2) соединений, определенные, в тесте включения РШ-

Таблица 1.

Изучение цитотоксичности и защитного действия ряда производ-

ных адамантана в культуре клеток Vero.

Соедине- ыпк - ВД»(1) ДДде (2) ад« ХТИ

ние ' [ мкг/шО [мкг/млЗ [ мкг/шО t даг/ыл]

ремантадин 50,00 51,25+1,01 56,06+4,61 21,25+0,14 2,41

МКК 250,00 191,25+3,26 186,50+8,28 11,25+0,12 17,00

МУК 200,00 170,25+2,70 140,25+7,61 20,00+0,09 8,50

III 150,00 131,46+1,38 132,76+5,56 19,32+0,10 6,80

IV 150,00 135,77+1,68 136,21±6,32 20,02±0,02 6,78

Примечания: ШК - максимально переносимая концентрация соединения, не вызывающая видимых под микроскопом изменений клеточного монослоя. Продолжительность инкубации 72 ч.

ЦД?$Ш - концентрация соединений, вызывающая гибель 50% клеток. Продолжительность инкубации 72 ч.

ЦДда(2) ~ концентрация ингибитора, в присутствии которой на 50% подавляется включение [3НЗ-тишдина. Продолжительность инкубации 18 ч.

Щцд - концентрация соединения, предотвращающая гибель 50% клеток в инфищрованной культуре, когда в контрольных инфицированных культурах гибнет >95% клеток после 72 ч. инкубации (МИ 0,01 ВЭЕ/кл).

ХТИ'(химиотерапевтический индекс) вычисляли как отношение к

имидина в шслотонерастворимуто фракцию клеток, незначительно отличатся от величин- ПДз-,? (1) (таблица 1). Таким образом, тремя независимы-и методами установлена низкая цитотоксичноеть производных адамантана, тносяшихся к классу амидов адамантанкарбоновых кислот (ААКК, ААУК), о сравнению с ремантадином, относящимся к классу первичных аминов.

Изучение противовирусного действия производных адамантана на модели С показало, что ААКК и ААУК обладают способностью в нетоксичных кон-ентрациях полностью предотвращать развитие вирус индуцированного цито-атического эффекта (ЩВ), который мы регистрировали микроскопически о состоянию клеточного монослоя. Такие результаты были получены при спользовании ААКК, ААУК, соединений III, IV, ремантадина в концентра-иях 12,5, 25, 50, 50, 50 мкг/мл, соответственно. Результаты изучения ротивовирусгого действия исследуемых соединений представлены в табли-е 2, из которой следует, что ААКК обладает значительной активностью, несколько раз превосходящей действие ремантадина. Из таблицы следу-т, что ингибиторные способности ремантадина крайне ограничены, в то ремя как ААКК, а тагаш ААУК обладают высоким ХГИ. Важно, что такой ффект полностью сохраняется в условиях высокой множественности инфи-ирования (МИ) 10 ВОЕ/кл. Б этих условиях, как видно из таблицы 2, ействие ремантадина не может быть отнесено к хишотерапевтическому ффекту. Таким образом, ААКК превосходит ремантадин как по величине АК, равной, как следует из таблицы, 6,25 мкг/мл, так и по величинам, арактеризующим в сравнительном плане показатели их цитотоксичности. еличина ХГИ ААКК равна 30,60, в то время как для ремантадина анало-ичный показатель равен 2,05.

Избирательное подавление репродукпщ ВС, отраженное нами в таблице , сопровождающееся полным предотвращением развития вирусиндуцирован-ого ЩВ, привело нас к необходимости количественно охарактеризовать тепень зашиты клеток (предотвращение гибели) изучаемыми соединениями использованием теста окрашивания клеток тршановым голубым. Эти ре-ультаты отражаются в таблице 1 (см. графу ИДда ). 11з нее следует, что АКК обладает способностью максимально защищать клетки от гибели по равнению с другими соединениями. Защитная способность ремантадина роявляется минимально.

В дальнейших экспериментах мы проверили антивирусную активность

Таблица 2.

Действие производных адамантана на репродукцию вируса Синдбис в культуре клеток Vero: влияние на инфекционный титр вируса.

Концент-_Инфекционный титр вируса tlg БОЕ/мдЗ

рация МИ 0,01 БОЕ/кл_№1 10 БОЕ/кл

[мкг/мл] ремантадин ААКК ААУК ремантадин ААКК ААУК

0 9,50+0,02 9,50+0,02 9,50+0,02 9,41+0,05 9,41+0,05 9,41+0,05

6,25 н. и. 8,2340,11 н. и. и. и. 8,1540,11 н. И.

12,50 9,04+0,34 7,95+0,12 8,93+0,21 9,12+0,27 7,81+0,13 8,57+0,26

25,00 7,88+0,11 7,48+0,07 8,24+0,09 8,60+0,09 7,30+0,09 8,13+0,15

50,00 7,30+0,11 5,48+0,08 6,70+0,10 7,21+0,11 5,39+0,05 6,81+0,12

100,00 н. и. 3,48+0,07 5,02±0,11 н. и. 3,35±0,08 4,80±0,10

ЭТИ 2,05 30,60 6,81

Примечания: Учет результатов проводили через 48 ч. при использовании МИ 0,41 БОЕ/кл и через 8 ч. при Ш 10 БОЕ/кл. н. и. - не исследовали.

МАК - минимально активная концентрация, в присутствии которой величина инфекционного титра вируса снижалась по сравнению с контролем на 1,25 БОЕ/мл.

ХТИ - отношение ЦД55(1) к МАК: для ААКК ХТИ-191,25: 6,25=30,6.

производных адамантана в отношении вируса ЮЛ-230. Показано, что эти соединения эффективно ингибируют репродукцию вируса. ААКК в концентрации 100 мкг/мл снижает инфекционный титр вируса по сравнению с контролем на 6,48 lg БОЕ/мл (Ш 0,01 БОЕ/кл), его ХГИ равен 18.

Анализ связи структуры изучаемых нами производных адамантана с антивирусной активностью на модели ВС позволил обнаружить группу актив-яых соединений, содержащих в структуре компакент -NH¿ и, вместе с тем, сличающихся по выраженности противовирусного эффекта. Наш четко показано, что амиды адамантанкарбоновых кислот (в первую очередь ААКК, а гакжв ААУК) обладают значительно более высокой активностью, например, ю сравнению с известным препаратом ремантадином. Последний, ¡сак известно, содержит первичную аминогруппу. Амины типа ремантадина ( III и IV) обладают выраженными основными свойствами и повышают рН в биологи-геских системах. В отличии от них высокоактивные амиды ААКК и ААУК характеризуются величиной pKg , очень близкой к нейтральной. Вероятно, jto свойство может играть важную роль в проявлении высокого антивируе-юго действия, которое носит несомненный селективный характер.

фи изучении комбинированного действия ААКК и рибавирина на репро-!укцию ВС выявлен выраженный синергидный эффект. Полученные данные фиведены в таблице 3. Ркбавкрин в неэффективной концентрации Ю мкг/мл существенно усиливает противовирусную активность ААКК.

Таблица 3.

[зучение комбинированного действия МКК и рибавирина на репродукцию вируса Синдбис в культуре клеток Vero (МИ 0,01 БОЕ/кл).

¡нгибитор Концентрация [ мкг/мл] Инфекционный титр вируса [ IgBOE/MJü

- - 8,10+0,23

мбавирин 50,0 7,68+0,12

100,0 6,88+0,30

ААКК 50,0 3,90+0,19

100,0 1,90+0,20

ибавирия 50/50 г, ю+о да

+ ААКК 100/50 0,99+0,22

Примечание: при изучении противовирусного действия рибавирина провощи 1-часовую прешкубацию клеток с препаратом перед инфицированием.

Влияние амидов адаманганкарбоновых кислот и адамантанамишв на различные этапы репродукции вируса Синдбкс.

В дальнейших исследованиях мы изучали действие на различные этапь репродукции КЗ ААКК, как наиболее эффективного в группе производньо адамантана соединения. Ремантадин в этих экспериментах также использовался в качестве референс-препарата.

С целью проверки наличия вирулицидного эффекта у ААКК вируссодержа-щий материал инкубировали в течение 3 часов при комнатной температуре с ААКК или ремантадином в концентрации 190,0 и 50,0 мкг/мл (Ц%0), соответственно. Инфекционную активность проб, отобранных через 1, 2 и £ часа, определяли методом бляшек. Установлено, что ни ААКК, ни ремантадин не снижают инфекционный титр вируса, т. е. не обладают непосредственным вирус-инагсгивирующим действием.

Максимальный ингибиторный эффект ремантадина наблюдается при его введении непосредственно после адсорбции (таблица 4). При введении препарата через 3 часа после инфицирования его ингибиторный эффект существенно снижается. Внесение препарата через 4 часа приводит к потере противовирусной активности.

Максимальная противовирусная активность ААКК проявляется при его внесении непосредственно после адсорбции. Однако ААКК, в отличие от ремантадина, эффективно ингибирует репродукцию вируса при его внесении

Таблица 4.

Сравнительное изучение влияния ААКК и ремантадина на репродукцию

вируса Синдбис в зависимости от времени введения ингибитора

Соеди- Концент- Инфекционный титр вируса, ВОЕ/мл

нение рация Время внесения ингибитора, ч.

[ мкг/шО 12 3 4 5

ААКК 50 3,58+0,12 3,72+0,11 3,71+0,09 4,04+0,03 4,68+0,10

100 1,72+0,46 1,92+0,07 1,98+0,15 2,47+0,12 2,64+0,04

реман-

тадин 50 5,55+0,24 5,64+0,12 6,22+0,15 6,66+0,12 7,00+0,13

Примечания: 1. Результаты - через 8 часов после инфицирования клеток ВС (МИ 10 ВОЕ/мл).

2. Инфекционный титр вируса в контроле без ингибитора составил 7,76+ 0,43 БОЕ/мл.

в культуральную среду даже через 5 часов после инфицирования.

Полученные результаты указывают на то, что для проявления ингиби-торного действия ремантадина необходимо его присутствие в течение латентного периода репродуктивного цикла, когда реализуются процессы пе-нетрации и депротеинизации вируса. Е случае значительно более активного соединения ААКК наблюдается аналогичный, но значительно более выраженный ингибиторный эффект. Вместе с тем, его ингибиторное действие сохраняется и при внесении его в последующие часы.

Изучение динамики синтеза вирусспецифичеекой РНК проводил!'! методом включения [гШ-уридина в кислотонерастворимую фракцию клеток, инфицированных ВС (МИ 50 БОЕ/кл), в присутствии актиномицина Д в концентрации 5 мкг/мл. Вирусспецифический синтез РНК впервые регистрируют уже через час после адсорбции (рисунок 3, кривая 3). Максимальное включение И3Н]-уридияа происходит через 5 часов, затем интенсивность синтеза постепенно снижается.

С целью изучения синтеза РНК ВС в культурах, содержащих ААКК и ремантадин, их вносили з экспериментальную систему сразу после адсорбции в концентрации 50 мкг/мл. Уже через час после адсорбции наблюдают значительное, на 63,58%, угнетение синтеза РНК вируса в присутствии ААКК. К ,3-му часу ингибиция синтеза РНК достигает максимума (75,91%), затем постепенно снижается, но не существенно, и к 9-му часу составляет 57,35% по отношению к контролю (см. таблицу 6).

Ремантадин также снижает эффективность синтеза РНК ВС. Его максимальный ингибиторный эффект такте развивается через 3 часа после адсорбции (89,15X относительно контроля). К 9 -му часу ингибиция синтеза РНК снижается до 63,51% (см. таблицу 5).

Вышеприведенные экспериментальные результаты о селективном действии ШЖ на репродукцию ВС послужили основанием для изучения его способности предотвращать образование вирусспецифических макромолекул. По 1ашему мнению, полученные результаты; приводимые ниже, во многом могут шляться следствием действия изучаемого соединения в течение латентно-'о периода. Результаты» приведенные в таблицах 5 и б, в немалой степе-ш подтверждают это положение. Из таблицы 5 следует, что в случае с >емантадшом снижение включения Е3Ш-уридина в вирусепецифическую РБК [аблюдается только при условии присутствия ремантадина непосредственно

Таблица Б.

Влияние времени внесения ремантадина на включение СаШ-уридина в ви~ русспепифическую РЕК в культуре клеток Vero, инфицированных вирусов Синдбис (МИ 50 БОЕ/кл). _'

Время вне- Жнгибировавие синтеза вирусной РНК [%3 сения ■_время после адсорбции [чЗ_

агента СчЗ 1 " 3 5 7 9

0 72,78+0,45 89,15+0,39 81,31+0,54 69,85+0,46 63,51+0,64

2 - 79,96+0,61 71,64+0,86 61,14+0,44 51,17+0,55

3 - - 46,64+0,78 34,69+0,90 24,77+0,71

5 - - - 12,65+0,96 10,95+0,99

7 - - - - 10,46í0,86

йружчапия: Концентрация ремантадина 50 мкг/мл. Результаты выражены Z. За 100% принята величина включения [зщ-уркдина в вирусспецифическую РНК в клетках, инфицированных вирусом Синдбис в отсутствии соединения.

Таблица 6.

Влияние времени внесения ААКК на включение [■»ВЗ-уридина в вирусспецифическую РНК в культуре клеток Vero, инфицированных вирусом Синдбис

(МИ 50 БОЕ/кл).____________

Время вне- _Ингибирование синтеза вирусной РНК [ %3______

сения ААКК _время после адсорбции СчЗ_______________

СчЗ_1_3_5_____1_____9______

О 63,58+0,38 75,91+0,62 83,49«), 48 63,20+0,?2 ^7,&5jü,43

2 - 77,00+0,59 64,54+0,57 60,974), 79 52,2-40,6:'

3 - - 72,25+0,55 57,38+0,36 65,51+0,41 5 74,89+0,71 79,31+0,70

_7_:___:__-_81,78±0,61

Примечания: Концентрация ААКК 50 мкг/мл. Результаты выражены е Z. За 1001 принята величина включения С3ЕЗ -урвдяна в вирусепецафическую РЖ в клетках, инфицированных вирусом Синдбис в отсутствии соединения.

после инфицирования клеток. Сходная но далеко не идентичная картина наблюдается при использовании ААКК. Полученные результаты указывают на более сложное антивирусное действие этого соединения. Присутствие АА1Ж

в самом начале инфекции обуславливает ингибирование включения [3Ш -ури-дина в РНК Однако, в отличии от ремантадина, при введении ААКК через 2, 3 ч. и позже после заражения клеток сохраняется его ингибиторный эффект. По нашему млению, полученные результаты не отражают способность соединений непосредственно влиять на аппарат вирусной транскрипции. Это видно на примере ремантадина - соединения с выраженными основными свойствами.

С целью дальнейшей иллюстрации антивирусного действия' изучаемых соединений мы исследовали их влияние на синтез вирусспецифических полипептидов, используя метод электрофореза в ПААГ в варианте Laemmli. В соответствии с данными литературы нами установлено, что в инфицированных ВС клетках в присутствии актиномивдна Д и t^S]-метионина в качестве предшественника наблюдается образование вирусспецифических полипептидов: капсидного белка С (29 кДа), гликопротеинов оболочки El и S2 (50 +50 кДа), имеющих одинаковую скорость миграции, и полипептид рЕ2 (62 кДа). Дополнительно обнаружен ряд минорных компонентов, отсутствующих в контрольных незаражэнных клетках. Компоненты с молекулярными массами р130,р90 по-видимому представляют собой ненарезанные предшественники структурных белков вириона. Выявленный на радиоавтограф; более подвижный вирусный белок на основании данных литературы (в количественном отношении и с учетом его молекулярной массы) можно отнести к неструктурному белку nsP3 ( р78) ( Жирнов 0. II, Гайдамович С. Я. , 1987; Collins et al., 1982).

Наш установлено, что ААКК, будучи введен непосредственно после инфицирования клеток, предотвращает образование вирусспецифических полипептидов. Т.о. ААКК в нецитогоксичных концентрациях ингибирует репродукцию ВС и образование вирусспецифических макромолекул.

На оснований наших собственных результатов и анализа зарубежной и отечественной литературы есть больше основания считать, что ААКК является наиболее эффективным ингибитором репродукции ВС и, по видимому, других альфавирусов.

Полученные результаты послужили основанием для проведения последующих исследований, связанных с возможностью получения резистентного к ААКК вируса.

Получение вируса Синдбке, резистентного к амиду 1-адамантан карболовой кислоты.

Резистентный вариант ВС мы получали путем проведения серийных пассажей вируссодержащего материала в присутствии ААКК. Наш было установлено, что при пассировании в присутствии возрастающих концентраций ААКК удается получить резистентный вариант вируса после 4-го пассажа (см. рисунок 1). Из рисунка следует, что кривая 2 отражает оптимальные условия этого процесса по сравнению с кривой 3. По нашему мнению, из рисунка 1 следует, что снижение чувствительности к амиду 1-адамантан-карбоновой [шслоты характеризует процесс селекции резистентных клонов. Эти же результаты подтверждаются данными, изложенными в таблице 7.

Более детальное изучение чувствительности резистентного ВС к ААКК также' подтвердило его резистентность: величина МАК = 6.25 мкг/мл для исходного Еируса, в случае резистентного ВС МАК возросла до 200 мкг/мл

Таблица 7.

Изменение чувствительности к ААКК популяции вируса в процессе пассирования в присутствии возрастающих концентраций ААКК.

Экспериментальная система N пассажа Степень подавления инфекционного титра вируса [ 1е БОЕ/млО

концентрация ААКК [мкг/мл]

25 50 100

Контроль 1-5 2,23+0,06 4,10+0,04 6,02+0,09

Вирус, пас- 1 1,87+0,07 3,31+0,10 4,61+0,11

сированный 2 0,74+0,07 2,31+0,08 3,04+0,12

в присутст- 0,00+0,18 0,23+0,06 1,61+0,05

вии ААКК 4 0,00+0,10 0,00+0,09 0,32+0,07

5 0,СЮ±0Д2 0,00±0,00 0.29*0,06

Ерттчавт: Чувствительность вируса к ААКК контролировали в каждом пассате в тесте снижения величины инфекционного титра вируса. Вирус считали чувствительным к действию рассматриваемой концентрации ААКК, если .его титр снижался не менее, чем на 1,25 1® БОЕ/мл. Чувствительность контрольного вируса в процессе пассирования существенно не менялась,- поэтому величины подавления инфекционного титра вычисляли исходя из результатов,полученных в трех параллелях из пяти пассажей.

О А 2 3 А 5 6 ? 8 9 40 а 24 Пассаж, II

РИСУНОК 1. Изменение чувствительности популяции ВС к ААКК в процессе пассирования в присутствии ААКК.

1 - вирус пассируемый в отсутствии ингибитора (контроль);

2 - вирус пассируемый в присутствии постепенно возрастающих концентраций ААКК: 50 мкг/мл в 1-2 пассажах, 75 мкг/мл - в 3 пассаже, 100 мкг/мл (1/2 ЦДй-0 ) - в последующих пассажах;

3 - вирус пассируемый в присутствии ААКК в концентрации 100 мкг/мл. Ш в 1-ом пассаже составляла 1 БОЕ/кл, в последующих - 0,01 БОЕ/кл.

О

4 8. 3 4 5 6 ? 8 50 25 50 Пассам, Н

РИСУНОК 2. Сравнительное изучение чувствительности к ААКК резистект-

юго клона и резистентной популяции ВС в процессе пассирования.

I - резистентный клон вируса;

I - резистентная популяция вируса;

Ъ - репродукция исходной чувствительной популяции ВС.

(онцентрация ААКК - 100 мкг/мл; МИ - 0,01 БОЕ/кл.

и находится б цитотоксической зоне, что делает невозможным вычисление ХШ •

В дальнейшем из полученного резистентного вируссодерзкащего материала были изолированы бляшки с последующи определением их чувствительности к ААКК. Было изолировано несколько резистентных клонов. Вместе с тем, из резистентной популяции был изолирован клон, сохранивший исходную чувствительность к ААКК. Определение чувствительности изолированного клона показало, что его репродукция не ингибировалась в диапазоне концентраций ААКК от 0 до 100 мкг/мл.

При сравнительном пассировании резистентной популяции и изолированного резистентного клона в отсутствии ингибитора мы показали, что чувствительность вирусного клона к ААКК не изменяется в процессе пассирования. Чувствительность резистентной популяции, напротив, постепенно снижается и к 8-му пассажу полностью восстанавливается до уровня чувствительности исходного вируса. Т. о. , нами установлена стабильность признака резистентности в случае клона и нестабильность этого признака в случае резистентной популиции. Эти результаты отражены на рисунке 2.

Репродукция полученного резистентного ВС изучалась в отношении чувствительности к гомологу ААКК амиду 1-адатнтануксусной кислоты, а также к первичным аминам : ремантадину и его производным III и IV. В ходе исследования мы обнарудали явление перекрестной резистентности в группе этих соединений. Кроме того, репродукция резистентного ВС не ингибировалась в присутствии NfyCi - слабого лизосомотропного основания, препятствуюшэго закислени» эндосомального содержимого и, следовательно, активации белка слияния вируса. Эти результаты указывают на определенное сходство в механизме действия всей группы соединений; иными словами, они могут иметь обшую мишень антивирусного действия.

Сравнительное изучение репродукции резистентного н чувствительного вариантов вируса Синдбие.

Экспериментальные результаты по этому разделу исследований представлены на рисунке 3. При анализе кривой 1, отражающей динамику накопления чувствительного к ААКК варианта К! в условиях одноциклового эксперимента, видно, что в течение первых 2-х часов после адсорбции инфекционный тктр вируса незначительно снижается (латентный период). С 3-го часа начинается постепенное увеличение титра вируса (период экс-

шенциального роста), достигающего максимальной величины между 9 и И ¡асами. С 13-го часа после адсорбции, титр вируса начинает постепенно нижаться.

При изучении динамики накопления ААКК-резистентного варианта ВС в ультуральной среде (кривая 2) выявлено одно его принципиальное отлише от чувствительного ВС. Нарастание инфекционного титра резистент-ого ВС начинает обнаруживаться только через 5 часов после адсорбции, о есть латентный период в этом случае на 2 часа продолжительнее акового ААКК-чувствительного вируса. Максимальной величины титр ре-иетентного вируса достигает также на 2 часа позяе, то есть между 11 13 часами. Продолжительность периода экспоненциального роста резис-енткого вируса не отличается от продолжительности такового чувстви-ельяого ВС. Через 15 часов после адсорбции начинается постепенное нижение титра ААКК-резистентного ВС.

В целях подтверждения и уточнения полученных результатов изучали азвитие вируеиндуцированного ЦГО в условиях одноциклового опыта с по-ощыо метода окрашивания клеток трипановым голубым. Условия инфициро-ания клеток и последующей инкубации не отличались от таковых при изу-ении динамики накопления вируса в культуральной среде. Полученные анные отражены на рисунке 4. ЦПЭ в клеточных культурах, зараженных езистентным вирусом, развивается на 2 часа медленнее (кривая 2), чем клетках, инфицированных чуствительным ВС (кривая 1). Так, если в пером случае после 16 часов инкубации 2,6% клеток не окрашивались краси-елем, то во втором случае уже через 14 часов после адсорбции ни одной ивой клетки обнаружить не удалось.

Таким образом, наш было выявлено принципиальное отличие ААКК -ре-иетентного ЕС от чувствительного. Установлено увеличение продолжи-эльноети его латентного периода на 2 часа. Это дает возможность пред-эложить, что гликопротеины ААКК-резистентного варианта вируса содер-ат аминокислотные замены.

В следующей серии экспериментов мы провели сравнительное изучение антеза РНК чувствительного и ААКК-резистентного вариантов ВС. В кле-эчной культуре, инфицированной ААКК-резистентным ВС (рисунок 3, кри-ая 4) максимальное включение [ -3 Н1 -уридина обнаруживают на 2 часа эзже,чем у чувствительного вируса (кривая 3). Таким образом, нам уда-

Время после инфицирования, СчЗ

РИСУНОК 3. Сравнительное изучение вирусной репродукции и синтеза РШ чувствительного и резистентного к ААКК вариантов ВС в культуре клетор Vero.

1 - репродукция ААКК-чувствительного вируса (МИ 10 БОЕ/кл);

2 - репродукция ААКК-резистентного вируса (МИ 10 БОЕ/кл);

3 - включение Г.3 Н]-уридина в кислотонерастворимую фракцию клеток, инфицированных ААКК-чувствительным вирусом (Ш 50 БОЕ/кл); актиномицин I - 5 мкг/мл;

4 - включение [5Н] -уридина в кислотонерастворимую фракцию клеток, инфицированных ААКК-резистентным вирусом (МИ 50 ВОЕ/кл); актиномицин Д -

5 мкг/мл;

5 - включение [ 5 Н]-уридина в кислотонерастворимую фракцию неинфициро-ванных клеток; актиномицин Д - 5 мкг/мл.

лось подтвердить результат, полученный при сравнительном изучении репродукции ААКК-чувствительного и ААКК-резистентного вариантов ВС: репродуктивный цикл резистентного варианта оказался продолжительнее на ¿ часа за счет увеличения продолжительности латентного периода.

Врешт, СчЗ

РИСУНОК 4. Изучение развития вирусиндуцированного Щ1Э в культуре клеток VERO, инфицированных чувствительным и резистентным к ААКК вариантами ВС с применением красителя трипанового голубого (Ш 10 ШЕ/кл).

1 - ААКК-чувствительный вариант вируса;

2 - ААКК-резистентный вариант вируса.

При сравнении эффективности включения [¿Ш-уридина в. кислотонераст-воримую фракцию клеток, инфицированнных чувствительным и резистентным вариантам! ВС в момент его максимального включения, то есть через 5 и 7 часов после адсорбции, соответственно, установлено следующее. Эффективность синтеза РНК в клетках, инфицированных резистентным ВС (рисунок 3, кривая 4), ниже в 1,38 раза и составляет 72,16% по сравнению с чувствительным вирусом (кривая 3).

Синтез вирусной РНК резистентного ВС в течение первых часов инфекции полностью резистентен к ААКК. Ингибирование синтеза обнаруживается только через 5 часов после адсорбции и составляет 25,94% по отношению к контролю при использовании ААКК в концентрации 100 мкг/мл. К 9-му

часу ингибиция снюхается до 11,23%. Концентрация ААКК, обеспечивающая 50%-ингибирование синтеза РНК резистентного варианта ВО в момент максимального включения Г 3 ffl-уридина, равна 162,50 мкг/ш. Эта величина близка к ив 7,22 раза превышает величину 22,50 мкг/мл, харак-

теризующую чувствительность к ААКК синтеза РНК исходного вируса.

При проведении сравнительного анализа полипептидов чувствительного и резистентного к ААКК вариантов ВС установлено, что электрофорети-ческая подвижность белков резистентного варианта и последовательность их распределения в ПААГ практически не отличается от чувствительного вируса. Белковый синтез ААКК-резистентного вируса практически не подавляется ААКК в отличии от чувствительного вируса, полипептидный синтез которого существенно ингибирован.

Изучение влияния ААКК на течение экспериментальной шгфекцки, вызванной вирусом Сивдбие, в мозге мыгей.

Заражение мышей производили как описано в главе "Материалы и методы". ААКК и ремантадин вводили перорально в разовой дозе 150 мг/кг веса животного по профилактической, лечебной и лечебно-профилактической (ЖЮ) схемам введения. Инфекция была нелегальной. По истечении указанного периода времени животных забивали и определяли инфекционный титр ВС в мозговой суспензии методом бляшек.

Полученные результаты представлены на рисунке 5. Уже через 5 часов после заражения вирус удается обнаружить, хотя и в очень невысоком титре (кривая 1). К 24-му часу инфекции титр ВС достигает максимального значения и держится на этом уровне еще по крайней мере 6 суток. На 7-е сутки намечается тенденция к снижению тигра вируса. На 14-сутки титр падает до 1 lg БОЕ/мл. На 15-е сутки вирус обнаружить не удается.

При однократном введении ААКК по профилактической или лечебной схемам введения (за 4 или через 4 часа после заражения) не обнаруживается существенного ингибирующего влияния на репродукцию вируса в мозге инфицированных мышей. Оптимальной оказалась ЛШ с многократным введением ингибитора, как показано на рисунке 5 (кривые 2 и 3). На рисунке 5 показано, что ААКК оказывает гораздо более сильный эффект по сравнению с ремантадином (кривая 4).

При изучении репродукции ААКК-резистентного варианта вируса в мозге мышей при титровании мозговой суспензии через 5 часов после заражения

Вреия, ЕчЗ

РИСУНОК 5. Эффект ААКК и ремантадина при экспериментальной аяьфавирус-ной инфекции мышей.

1 - репродукция чувствительного вируса в мозге мышей, не получавших препарат (контроль вируса)

2 - репродукция чувствительного вируса в мозге мшей, получавших ААКК за 4 часа до заражения, а также через 4 часа после заражения;

3 - репродукция чувствительного вируса в мозге мшей, получавших ААКК за 4 ч до и через 4+24+48+72 часа после заражения;

4 - репродукция чувствительного вируса в мозге мышей, получавших ремантадин за 4 часа + через 4+24+48+72 ч после заражения;

5 - репродукция резистентного вируса в мозге мышей, не получавших препарат (.контроль вируса);

6 - репродукция резистентного вируса в мозге мышей, получавших ААКК за 4 ч до и через 4+24+48+72+95+120 ч после заражения.

вирус обнаружить не удалось. К 10-му часу инфекции титр составляет 2,10 БОЕ/мл. Через сутки он достигает величины 5,51 1д БОЕ/мл и держится на этом уровне в течение б суток. На 7-е сутки инфекции начинается постепенное снижение титра вируса.

Титр резистентного вируса в мозге мышей, получавших ААКК по оптимальной ШС, не отличался существенно {менее чем на 0,5 lg) от титра i мозге мышей контрольной группы, не получавших ААКК, при определенш через 1, 4 и 7 суток после заражения.

Таким образом в результате проведения серии экспериментов с лабораторными животными, инфицированными инграцеребрально культуральным ВС, показано, что ААКК эффективно ингибирует репродукцию вируса в мозге инфицированных мышей. Эффективность ААКК не зависит существенно oi схемы введения ингибитора. Однако максимальный эффект достигается npi использовании многократного его введения по ШС: снижение титра вируса в мозговой суспензии составляет 4 и более lg БОЕ/мл (кривая 3).

Накопления ААКК-резистентного варианта вируса в мозге мышей (рисунок 5, кривая 5) не отличается существенно от таковой чувствительного вируса (кривая 1). Репродукция ААКК-резисгентного вируса полностью устойчива к действию ААКК при введении этого соединения по оптимально!1 схеме в разовой дозе 150 мг/кг веса животного (кривая 6).

Таким образом, в результате проведенных исследований выявлена высокая хиыиотерапевтическая активность ряда производных адамантана (е первую очередь, амидов адамантанкарбоновых кислот) в тканевой культуре, а также активность в опытах при экспериментальной инфекции мышей.

Представленные результаты изучения противовирусной активности производных адамантана указывают нз несомненную целесообразность дальнейшего изучения указанной группы соединений для поиска новых высокоэффективных ингибиторов альфавирусов. Высокая противовирусная активность ААКК, установленная на моделях вирусов ВС и ВЭЛ-230 (ХГИ=31 в 15 раз больше чем у ремантадина), позволяет рекомендовать дальнейшее изучение этого соединения с перспективой его использования в клинической практике.

Впервые показана принципиальная возможность формирования у альфавируеов, в частности, у ВС, in vitro резистентности к группе препаратов - производным адамантана Предложены две схемы пассирования для селекции -резистентного варианта вируса- в присутствии постоянной высокой концентрации ингибитора (1/2 ЦД^) и в градиенте концентраций. Показано, что использование градиента концентраций приводит к существенному

\

ускорению формирования резистентной популяции, что имеет практическое значение при выборе схемы введения соединения. Установлен механизм формирования резистентной популяции: селекция в присутствии ингибитора резистентных к производным адамантана вирусных частиц, предсуществую-щих в исходной чувствительной популяции. Представленные в работе данные (высокий уровень резистентности, стабильность признака, изменение продолжительности латентного периода резистентного варианта вируса по сравнению с чувствительным) дают основание предполагать, что признак ААКК-реэистентности закреплен генетически и может передаваться в последующих генерациях.

Установлено наличие перекрестной резистентности в группе производных адамантана, а также со слабым ливоеомотропным основанием хлоридом аммония, что позволяет сделать заключение о связи механизма действия рассматриваемых ингибиторов с первым этапом репродуктивного цикла вируса - проникновением вируса в клетку. В то хв время, выраженный антивирусный эффект ААКК при внесении этого соединения через 2-3 часа пос-яе инфицирования в условиях одноциклового опыта однозначно указывает на связь механизма действия ААКК с более поздним этапом репродукции ВС.

Новый клон ВС, характеризующийся резистентностью к ААКК и увеличением продолжительности латентного периода, представляет интерес для фактической вирусологии в качестве инструмента для изучения репродук-дии альфавируеов, а само активное соединение - ААКК может стать кандидатом для клинического изучения.

выводы.

I. В группе производных адамантана обнаружен ряд соединений, способных в диапазоне концентраций 6,25-100 мкг/мл, не токсичных для клеточных культур, избирательно ингибировать репродукцию вируса Синдбис. ХТЙ наиболее активного из них (амида 1-адамантанкарбоновой кислоты) равен 30,6. Испытуемые соединения способны полностью предотвращать развитие вирус индуцированного" ЦГО и гибель >90% клеток. Противовирусный эффект этих соединений проявляется в условиях многоциклового (МИ 0,01 БОЕ/кл) и одноциклового опыта (МИ 10 БОЕ/кл и вше). Во втором случае ингибиторный эффект сохраняется при введении препарата через 2-3 ч. после инфицирования клеток.

2. Установлено, что активные соединения в нецитотоксичных концентрациях в условиях одноциклового опыта предотвращают синтез вирусепеци-фических макромолекул: РНК и полипептидов С, El, Е2, р62. Амид 1-адамантанкарбоновой кислоты в концентрации 22,5 мкг/мл предотвращает синтез вирусспецифической РНК на 50%. Такой эффект наблюдается при введении активного соединения через 2-5 ч. после инфицирования.

3. Установлена, что амид 1-адамантанкарбоновой кислоты при пятикратном оральном введении по лечебно-профилактической схеме в разовой дозе 150 мг/кг веса снижает инфекционный титр вируса Синдбис в головном мозге мышей на 4 lg БОЕ/мл.

4. Путем серийного пассирования исходного чувствительного вируса Синдбис в присутствии амида 1-адамантанкарбоновой кислоты был получен вирус, характеризующейся полной резистентностью к этому соединению. Из исходной ингибитор-чувствительной популяции вируса Синдбис изолирован клон, резистентный к действию амида 1-адамантанкар0ояоБОй кислоты. Установлено, что продолжительность латентного-периода резистентного вируса увеличена на 2 часа по сравнению с исходным чувствительным вирусом.

5. Показано, что резистентный к ашду 1-адамантанкарбоновой кислоты вируссодерзйащий материал обладает перекрестной резистентностью к менее активным производным адамантаяа (ашду 1-адамантануксусной кислоты, ■£* -метокси-1-адамантанметиламину, с<-хлорметил-1-адамантан-метиламину и ремантадину).

6. Пассирование резистентной к ашду 1-адамантаккарбоновой кислоты популяции вируса Синдбис в отсутствии ингибитора приводит к восстановлению исходной чувствительности к этим соединениям. Пассирование резистентного клона вируса (30 пассажей) в отсутствии этого соединения не привело к реверсии резистентности, что указывает на стабильность признака

9. Комбинация рибавирина с амидом 1-адамантанкарбоновой кислоты оказывает синергидный эффект на чувствительную популяцию вируса Синдбис и затрудняет формирование резистентной популяции.

- 27 -

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

Андронова В. JL Адамантанрезистентные варианты вируса Синдбис: получение и некоторые свойства. // Всесоюзная школа - семинар "Молекулярная биология и медицина":- Тез. докл. - Москва; 1990. - С. 116-117.

Андронова В. JL , Леонтьева Е А., Галегов Г. А. Получение и свойства штаммов вируса Синдбис, резистентных к ремантадину и его структурным аналогам. - В кн.: Новые подходы к химиотерапии вирусных инфекций. - Рига; 1991. - С. 123-128.

Galegov G. А., Andronova V. L. Leontieva N. A. Resistance of Sindbis virus to some adamantane compounds, // Antiviral Research. - 1992.

- V. 17, Suppl.l. - P. 151.

Андронова E JL , Леонтьева H. А., Галегов Г. А. Изучение действия некоторых соединений адамантака на репродукцию вируса Синдбис. Получение и свойства резистентного штамма // Антибиотики и химиотерапия. - 1992. - Т. 37, N 10. - С. 38-42.

Андронова В. JL Сравнительное изучение механизма' ингибирования репродукции вируса Синдбис производными адамантана: ремантадином и амидом 1-адамантаккарбоновой кислоты. // Антибиотики и химиотерапия.

- 1996. - Т. 41, N7/8. - С. 26-30.