Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генотипирование альфавирусов серокомплекса синдбис-западного энцефаломиелита лошадей

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Генотипирование альфавирусов серокомплекса синдбис-западного энцефаломиелита лошадей"

На правах рукописи

РГБ ОН

Селиванова Татьяна Константиновна

- з МАР Щ

Генотипирование альфавирусов серокомплекса Сшщбис - Западного энцефаломиелита лошадей. Воспроизведение процесса рекомбинации у альфавирусов в культуре клеток при смешанной инфекции

03.00.06- Вирусология

диссертация па соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2000 г.

Работа выполнена в Институте вирусологии им.Д.И.Ивановского Российской Академии Медицинских наук.

Научные руководители:

доктор биологических наук Т.М. Соколова

профессор, доктор медицинских наук Л.В. Урываев

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Л.М. Селимова доктор биологических наук Э.Б. Тазулахова .

Ведущее учреждение: Научно Исследовательский Институт вирусных препаратов им. О.Г. Анджапаридзе, РАМН, г. Москва

на заседании специализированного совета Д 001.20.01 при Институте вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН (123098, Москва, ул. Гамалеи, 16)

Автореферат разослан "/<Р" февраля 2000г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН

Ученый секретарь специализированного совета, доктор медицинских наук Н.П.Косякова

Защита состоится

/7 О // . ^ р

Введение

Актуальность проблемы. Вирусы Синдбис (ВС) и западного энцефаломиелита лошадей (ЗЭЛ) объединены в один серокомплекс рода альфавирусов (семейство Togaviridae) на основании частичного антигенного сходства белков оболочки вирионов, выявляемых в серологических реакциях [Calisher, 1994]. Входящие в указанный серокомплекс вирусы широко распространены в разных регионах мира: вирусы Синдбис выделяются на 4-х континентах (Евразия, Африка, Австралия, Южная Америка), а вирусы ЗЭЛ-преимущественно на Американском континенте. Однако, описаны случаи обнаружения ЗЭЛ-подобных вирусов и на Евро-азиатском континенте (Словакия и Россия). Эти данные требуют дополнительной проверки с использованием методов анализа вирусного генома. Случаи выделения ВС-подобных вирусов описаны для многих областей России и ближнего зарубежья (Карелия, Эстония, Урал, Поволжье, Кавказ, Алтай и др.) и в странах Европы (Скандинавия, Италия, Греция) [Львов, 1989].

Вирусы ЗЭЛ, восточного и венесуэльского энцефаломиелитов лошадей (ВсЭЛ и ВЭЛ) относятся к особо опасным вирусам (летальность при заражении может достигать 10-30% у человека и 40-70% у лошадей). Вирусы Синдбис менее патогенны и вызывают лихорадочные состояния, часто с сыпью, артралгиями и развитием полиартритов [Львов, Скворцова с соавт., 1982]. Основными переносчиками этих вирусов являются комары, но известны случаи выделения их от клещей. К началу наших исследований для диагностики этой группы вирусных инфекций, главным образом, использовались иммунологические методы анализа (выявление антител к белкам оболочки и обнаружение вирусных антигенов в серологических реакциях) [Calisher, 1988]. Расшифровка первичной структуры геномов основных представителей альфавирусов, в том числе, вирусов Синдбис (штаммы HRSP, AR 339, Окельбо и частично-ВКЛ) и вирусов ЗЭЛ Мак Миллан (штаммы BFS, 16310-5614) [Strauss a. Strauss,1994; Shirako, 1991 ; Урываев с соавт., 1994-95; Hahn et.al.,1988; Weaver et.al., 1997; Netolitzki et. al., 2000] создает предпосылки для разработки методов генодиагностики альфавирусных инфекций. Метод ОТ-ПЦР является высокочувствительным и высокоспецифическим. Он позволяет в течение нескольких часов накопить значительные количества ДНК-копий генов и их участков, достаточных для рестрикционного анализа. В настоящее время данный метод широко применяется для обнаружения и идентификации вирусов в разных биологических пробах в практике медицинского и эпидемиологического надзора за вирусными заболеваниями [Глухов с соавт., 1996]. Особую ценность метод ОТ-ПЦР приобретает для индикации вирусов с неизвестной первичной структурой, а также для обнаружения природных вирусов-рекомбинантов. Несмотря на существенный прогресс в области изучения молекулярной биологии альфавирусов (Синдбис-ЗЭЛ и Леса Семлики), методы их генодиагностики по-прежнему остаются не разработанными.

S

Представленные результаты исследований по оптимизации метода ОТ-Е для определения генетического материала альфавирусов серокомпле Синдбис-ЗЭЛ демонстрируют решение ряда поставленных в э-направлении задач. О применении метода ПЦР для индикации вир> ВсЭЛ, циркулирующих на территории Северной и Южной Амерр сообщили зарубежные авторы [Vodkin et.al., 1993; Monroy a.Webb, 1! Strizki a. Repik, 1996].

Строение генома и этапы репродукции альфавирусов хорошо изучены модели вируса Синдбис (вирионная 49S РНК, размером 11тыс. нуклеотщ имеет положительную полярность, кодирует неструктурные бе полимеразного комплекса nsPl-nsP4; структурные белки вириона С, Е2, Е белки, участвующие в сборке вириона -ЕЗ и 6К, синтезируются на матр 26S субгеномной РНК). Геном вируса ЗЭЛ имеет рекомбинант происхождение от двух родителей ( 5'-NTR и гены белков полимеразн комплекса и белка нуклеокапсида родственны генам вируса ВсЭЛ, а г< белков оболочки и участок 3'- NTR имеют высокое сходство с аналогичнь областями генома ВС). Поэтому объединение вирусов ЗЭЛ и Синдбис в о, серокомплекс на основании только антигенных взаимосвязей соответствует данным об их генетической структуре. В связи с этим возник ■необходимость разработки методов генной дифференциации этих вирусоБ ряда РНК- содержащих вирусов животных и растений с позитивн непрерывным геномом показан процесс рекомбинации в системах ин вив ин витро [Duggal а. Wimmer, 1999; Worobey а. Holmes, 1999]. Актуальн является изучение явления рекомбинации у вирусов при смешан] инфекции- как модель для выяснения возможностей образова рекомбинантов в природных условиях. Образование рекомбинантных Р было показано в условиях трансфекции клеток фрагментами РНК ВС и i . высокой множественности заражения, ведущей к образованию дефект! ¡' частиц [ Weiss а. Schlesinger, 1981; Monroe et. al.,1982; Raju et. al.,1995]. настоящего времени публикации о межвидовой рекомбинации альфавиру в эксперименте при смешанной инфекции отсутствовали.

Цели и задачи исследования. Целью диссертационной работы бь генотипирование природных изолятов вирусов серокомплекса Синдбис-3 и воспроизведение явления рекомбинации у альфавирусов при смешан! инфекции. Для достижения поставленной цели в ходе работы решал следующие задачи:

1. Применение метода ОТ-ПЦР с последующим рестрикционным анали: участков генов для дифференциации вирусов Синдбис и ЗЭЛ.

2.Проведение генотипирования природных изолятов альфавиру серокомплекса Синдбис-ЗЭЛ, выделенных в разных географических регион

3. Моделирование процесса межвидовой рекомбинации у альфавирусо] условиях смешанной инфекции вирусами ВЭЛ и ВКЛ в культуре клеток.

. Выявление рекомбинантных альфавирусов методами ОТ-ПЦР, рестрикции гибридизации среди природных ЗЭЛ-подобных вирусов и в популяции, бразующейся при смешанной инфекции.

[аучная новизна и практическая ценность работы.

1.Разработан способ дифференциального обнаружения вирионной РНК льфавирусов серокомплекса Синдбис-ЗЭЛ в биопробах с помощью метода >Т-ПЦР и последующей рестрикции ДНК-продуктов. Предложенный способ снован на обязательном анализе вирусных генов, кодирующих белки олимеразного комплекса и структурные белки вирионов альфавирусов, и вязан с наличием в этой группе вирусов-рекомбинантов. Данный [етодический подход может быть рекомендован для экологических бследований очагов альфавирусных инфекций и для диагностики ызываемых ими заболеваний.

. Метод апробирован на природных изолятах с неизвестной первичной груктурой генома, выделенных в разных географических регионах, [спользование предложенного метода позволяет получить дополнительные арактеристики вирусов, классифицирующие их как Синдбис и ЗЭЛ-одобные.

. Установлено, что российский вирус У62-33 является вариантом особо пасного вируса ЗЭЛ Мак Миллан, циркулирующего на американском онтиненте.

. Впервые описано образование межвидовых рекомбинантов вирусов ВЭЛ ВКЛ при смешанной инфекции в культурах клеток и способ их выявления [етодами ОТ-ПЦР и гибридизации с использованием олигонуклеотидных раймеров и зондов в качестве генетических маркеров.

. Выяснены закономерности накопления рекомбинантных вирусов и их одителей в смешанной популяции в условиях естественной селекции и ммунного давления. Показано доминирование в популяции ысокорепродуктивного родителя- вируса ВЭЛ и быстрое преимущественное бразование на его основе вирусов- рекомбинантов (в области генов труктурных белков), ускользающих от действия нейтрализующих антител боих вирусов-родителей. Наблюдается вытеснение из популяции менее ктивного вируса-родителя ВКЛ. Полученные данные позволяют обьяснить озникновение в природе рекомбинантного вируса ЗЭЛ, унаследовавших ысокую репродуктивную активность от вируса ВсЭЛ и приобретших змененные антигенные свойства.

Положения, выносимые на защиту. . Способ дифференциальной генодиагностики альфавирусов серокоплекса Синдбис-ЗЭЛ методам ОТ-ПЦР с использованием специфических лигонуклеотидных праймеров к генам белков полимеразного комплекса и труктурных белков вирионов, включая рекомбинантные области генома ируса ЗЭЛ.

2. Генетические взаимосвязи и классификационные характеристики геномов ряда географических вариантов вирусов Синдбис и ЗЭЛ с неизвестной первичной структурой.

3. Демонстрация явления межвидовой рекомбинации у двух альфавирусов (ВЭЛ и ВКЛ) при смешанной инфекции и анализ состава вирусной популяции по биологическим, антигенным и генетическим свойствам.

Апробация работы и публикации. Основные результаты работы были представлены на Международной научной конференции "Вирусные, риккетсиозные и бактериальные, переносимые клещами"; Иркутск (1996 г.), 10-ом Международном Конгрессе по вирусологии, Израиль (1996 г.), 4-ом Тихоокеанском Конгрессе по медицинской вирусологии, Южная Корея (1997 г.), Научной конференции с международным участием "Вирусные инфекции на пороге XXI века", Санкт-Петербург (1999 г.), Научной конференции "Актуальные проблемы медицинской вирусологии" НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов им.М.П.Чумакова, Москва (1999 г.). По материалам диссертации опубликовано 15 научных сообщений.

Структура и обьем диссертации. Диссертация построена по традиционному плану и состоит из введения, обзора литературы; глав "Материалы и методы", "Результаты исследований", "Обсуждения", выводов и списка литературы. Материалы диссертации изложены на страницах

машинописного текста. Работа иллюстрирована 2.рисунками и содержит таблиц. Библиография представлена {£(? источниками.

€

Материалы и методы.

\льфавирусы: Синдбис (7), ЗЭЛ (4) и ВЭЛ (эталонные штаммы и природные ыты) пассировали в первичной культуре ФЭК и перевиваемых клетках Yero протяжении 2-6 пассажей. Множественность инфицирования клеток |)авирусами составляла от 0,1 до 0,001 БОЕ/кл. Урожай инфекционного г'са определяли в культуральной жидкости через 14-16 часов инкубации при 2, когда ЦПД проявлялось в 50-70 % клеток монослоя. Определение екционности вирусов проводили высевом 10-кратных разведенией на ослое ФЭК по бляшкам под агаровым покрытием макрометодом и по апатическому действию в клетках ФЭК и Vero микрометодом. Для .тивирования клеток и вирусов использовали питательные Среды N 199 и а с глютамином производства НИИ полиомиелита и вирусных ¡фалитов, с добавлением 5-10 % бычьей сыворотки и антибиотика амицин 150 мкг/мл. Культуры первичных и перевиваемых линий клеток /чены из лаборатории культуры тканей НИИ вирусологии им. Д.И. новского. Приготовленные "культуральные" вирусы исследовали в реакции рализации инфекционной активности (РН) с высокотитражными телональными антисыворотками (АС) к вирусам ВКЛ 9298, ВЭЛ 230, ЗЭЛ i (10 тыс. ед.).Индекс нейтрализации (ИН) рассчитывали как разницу между Секционного титра и титром вируса без добавления АС и после инкубации

Для моделирования процесса генетической рекомбинации проводилась цанная инфекция (СИ) альфавирусами разных серокомплсксов (ВЭЛ и ВС) .тур клеток (ФЭК и Vero) (рис.7). Множественность инфекции вирусами 1 сотавляла 0,1 БОЕ, а ВКЛ 1 БОЕ на клетку. Параллельно, в тех же 1виях, ФЭК были инфицированы каждым вирусом отдельно с той же жественностью (МИ). Зараженные вирусом культуры инкубировали до ития ЦПД в 50-70 % клеток монослоя в течение 12 часов при 37 С. ьтуральная жидкость после удаления клеточного дебриса низкоскоростным грифугированием была использована для проведения последующих ажей в клетках ФЭК и Vero в разведении 1:10 ( 3-й и 4-й пассажи проводили давлением АС к ВКЛ, а 5-й пассаж -с добавлением смеси АС к обоим /сам-родителям). Параллельно на клетках было продолжено раздельное ирование исходных родительских вирусов ВЭЛ и ВКЛ. Из культуральных д:ов ультрацентрифугированием были получены вирусные частицы. Для шза вирусного потомства, образуемого при смешанной инфекции, были )льзованы следующие методы: определение родительских и гибридных РНК щом ОТ-ПЦР и рестрикционного анализа; определение инфекционное™ /сов, освобождающихся из клеток; нейтрализация внеклеточного вируса :ью АС к вирусам-родителям (ВЭЛ+ВКЛ); гибридизация участков геномов щами к внутренним последовательностям исследованных областей. Вирусные РНК выделяли из очищенных и культуральных вирусов двумя стными методами: 1-депротеинизации горячим фенолом в присутствии 1% и последующей экстракцией РНК хлороформом; и 2- в буфере с гуанидин-

тиоционатом и дальнейшей быстрой экстракцией смесью фенола ( хлороформом [Chomzyncki a. Sacchi, 1987].

На основании элаймента и расшифрованных нуклеотидныг последовательностей участков геномов 3- вариантов вирусов Синдбис (штамы HRSP; Okelbo; BKJI 9298) и 2-х штаммов вирусов ЗЭЛ ( штамм 5614 и BFS) с помощью компьютерной программы "Oligo 3.4" был сделан выбор праймеро! и зондов. Выбранные пары праймеров для соответствующих участков геномов альфавирусов Синдбис, ЗЭЛ и ВЭЛ исключали возможность их перекрестного взаимодействия с гетерологичными матрицами в условиях ПЦР и блот-гибридизации.

Проведение ОТ-ПЦР включало два последовательных этапа: 1 этап-реакцш обратной транскрипции на матрицах РНК вирусов при 42 С 1 час, 2 этап-программная амплификация ДНК-продукта : плавление 95 С 2 минуты, отжиг-1,5 минуты при температурах, рассчитанных для каждой пары праймероь (допускается не более 1-2 ошибок в местах посадки праймеров); амплификация ■ при 72 С 3 минуты. Программа включала 30 циклов амплификации, затем этаг достраивания ДНК-продуктов при 72 С 9 минут. Состав реакционной смест обратной транскрипции на 20 мкл: х5 буфер (250 гаМ Трис-HCl pH 8,0; 50 mlV MgCl ; 70 шМ KCl; 50 шМ DTT) - 4 мкл; смесь 4-х дНТФ (АТФ,ГТФ,ТТФ, ЦТФ 10 шМ) - 4 мкл; ингибитор рибонуклеаз - 1 мкл; фермент обратная транскриптаза 20-30 ед./мкл - 1 мкл; вирусная РНК-матрица 9 мкл (0,2-20 иг) предварительно подвергнутая плавлению при 95 С 3 мин. с "обратным' праймером -1 мкл. ОТ останавливали нагреванием реакционной смеси при 95 С 5 минут. Состав реакционной смеси для проведения ПЦР на 25 мкл: 2,5 мкл xl( буфер (670 гаМ Трис-HCl pH 8,8; 166 шМ сульфата аммония ; 20 шМ Mg С1 ; 0,¡ % твин 20; 5 мкл синтезированной к-ДНК из смеси реакции ОТ; Taq полимераза (5 ед/мкл) - 1 мкл; "прямой " праймер - 1 мкл; "обратный" прайме1 повторно в количестве 0,8 мкл.

Для сравнения внутренних последовательностей амплифицированныз участков генов применяли рестрикционный анализ. Рестриктазы были выбрань с помощью пакета компьютерных программ Gene Pro. Реакции рестрикцш проведены в условиях, рекомендованных фирмой-изготовителем. Анализ ПЦР продуктов и фрагментов их рестрикции проводился в 1,4% агарозном геле i бромистым этидием.

Блот- гибридизация проводилась по стандартной методике [Maniatis et. al. 1989] на мембранах Hybond-N ("Amersham") в 50% формамиде. Мембраны i перенесенными на них ПЦР-продуктами вымачивали в 10 мл денатурирующеп раствора (1,5 М NaCl; 0,5 NaOH) 2-3 минуты, переносили в нейтрализующш раствор ( 1,5 NaCl; 0,5 М Трис-HCl pH 7,2) на 2-3 минуты, подсушивали h¡ воздухе и прогревали 2 часа при 80 С.

Ферменты: обратная транскриптаза ( M-MuLV), Taq- полимераза, полинуклеотидкиназа, рестриктазы, ингибитор нуклеаз - производства ГНИР генетика " MBI Fermentas".

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Генотипирование вирусов серокомплекса Сиидбис-ЗЭЛ методом ОТ- ПЦР и рестрикционного анализа.

В нашей работе анализ структуры геномов альфавирусов состоял из нескольких последовательных взаимосвязанных этапов:

■ разработка метода ОТ-ПЦР для дифференцирования антигеннородственных вирусов Синдбис и ЗЭЛ и проверка на РНК прототипных штаммов альфавирусов с известной первичной структурой;

- генотипирования природных изолятов вирусов серокомплекса Синдбис-ЗЭЛ с неизвестной первичной структурой;

- обнаружения вирусов с рекомбинантными геномами среди природных изолятов, а также в популяции альфавирусов при смешанной инфекции в

культуре клеток.

• Для расчета олигонуклеотидных праймеров были выбраны консервативные участки геномов вирусов Синдбис: африканского изолята A.R 339 (штамм HRSP), северо-европейских вирусов Окельбо (штамм Edsbyn) и ВКЛ (штамм LEIV 9298). Данные участки локализованы в генах nsPl [позиции 215-716) и El (позиции от начала гена 764-1249). Исследованные гены nsPl и El кодируют у альфавирусов функционально важные белки. Белок nsPl в составе белков полимеразного комплекса проявляет метил- и гуанил-трансферазную активности, участвует в синтезе минус нитей геномной РНК и регулирует активность протеазы nsP2. Белок El является гликопроте-яном оболочки и функционирует в комплексе с другим оболочечным гликопротеином Е2. С белком El связывают рецепторную и гемагглютини-рующую активности вируса. В его составе локализованы отдельные вирус-нейтрализующие антигенные детерминанты [Strauss a. Strauss, 1994]. Амплификация участков генов эталонных штаммов вирусов Синдбис. Подбор праймеров осуществляли таким образом, чтобы с их помощью

можно было выявить Синдбис-подобные вирусы, сходные по первичной структуре с африканским прототипным штаммом AR339 и северо-европей-скими вариантами (ВКЛ 9298 и Окельбо Edsbyn). Это допущение основано на оценке средней скорости эволюции генома альфавирусов [Weaver et. al., 1997]. Данных о первичной структуре генома в указанных областях для других изолятов ВС к началу нашей работы не было. После сравнения нуклеотидных последовательностей участков генов nsPl и El у разных представителей альфавирусов мы получили подтверждение того, что рассчитанные пары праймеров nsPl и Е1 являются специфическими только для группы ВС и не должны взаимодействовать в ОТ-ПЦР с РНК альфавирусов других серокомплексов (рис.1). Для амплификации участков генов nsPl и Е1 ВС были выбраны температуры отжига праймеров 60 и 56 С), допускающие в местах посадки праймеров не более 1-2 ошибок. Результаты экспериментальной проверки подобранных условий реакции и специфичности nsPl и Е1 праймеров ВС представлены на рис. 2 (а, б). На матрицах вирионных РНК 2-х эталонных штаммов ВС (AR 339 и ВКЛ) и вирусов ЗЭЛ Мак Миллан и ВЭЛ 230 (имеют в исследованных участках генов 5 и более замен), была проведена реакция амплификации участков генов nsPl и Е1. Ожидаемые по размерам амплификаты (nsPl- 522 н.п. и Е1 - 506 н.п.) были получены (по данным электрофореза ДНК-продуктов в агарозном , геле) только на матрицах двух ВС: AR 339 и ВКЛ 9298. ДНК-продукты на РНК вирусов ЗЭЛ 16310-5614 и ВЭЛ-230 в ОТ-ПЦР не обнаружены. В этих опытах удалось показать, что : 1) использованные олигонуклеотидные праймеры nsPl и Е1 взаимодействуют только с РНК ВС и их применение возможно для выявления ВС-подобных вирусов среди природных изолятов с неизвестной первичной структурой; 2) методом ПЦР при целевом подборе праймеров можно дифференцировать вирусы Синдбис не только внутри рода Alphavirus, но и внутри серокомплекса Синдбис-ЗЭЛ.

Амплификация участков генов nsP2 и Е2 эталонных штаммов вируса ЗЭЛ.

Известная в настоящее время первичная структура протяженных участков

I0

Рис.1. Сравнение последовательностей РНК альфавирусов в области предполагаемой посадки праймеров для вирусов Синдбис и ЗЭЛ

Прямой праймер вУ-пэР! Обратный праймер

>======•♦ ----------- ------------ -<

ВС 5-САТАСССАССССАСССССТСС-215 5-ССАСТТСААСССССССТСССС-716

ВЛС -Т.. С.....Т. .в . .ТТ . СА .- -. С . А.....А. . ТТ. ССАСАС-

ВЭЛ -. . .Т . .А. . Т. .в . .С. . С - .Т .Т.....А. .АТССААСАА-

ВсЭЛ-Т . .Т . .в.....О . .Т. ТАА .- - . А. А. . АС. А . . . АСТААТАА-

Прямой праймер БУ - Е1

ВС 5-ССССССАСТССАССАААСССС-

ВОк -.....................-

ВКЛ -.....................-

ЗЭЛ -А. . А. . С.....А.....А . .-

ВсЭЛ-СССА. .СТ. .А.С. . ССТА. .-ВЭЛ - Т. САТ. . Т. . А. АТ Т Т. . . . .-ВЛС -САСАС. С.. А А. Т АС в. АС. .Прямой праймер

ЗЭЛ 5-ССССССССА — ТТТСАССССТТС-

ВсЭЛ -. . .С. .ТА. —......С. . СА.-

ВС -. . ТААА. . . ААС.....й-. ..А.-

ВЭЛ - ... Т... А . - - -......Т. . СА.-

Прямой праймер

ЗЭЛ 5-СССТТССАСССААСССААССС-

ВС -.С..С. .С. .А.....ССГАА-

ВсЭЛ -АА.. А. . С........ТСАА . -

ВЭЛ -в... АА. . . . Т.....Т. С .А-

Обратный праймер 5-ТСГТ- - - -ТССССТТТТСССССССС -

-. .С.----... .А..С..С . . А. -

- .ААА----А. Т С. . СС. А. . А .АА -

-.ААС----АТ. . . . СС.С. .А..АТ-

-.. САСААААТ. Т. С Св. С. Т. Т.С .-

5-ССССССТТСССССАСТСССТС-

-А.АА.АС.С.. А.....АТ

-. . .А АТС. Т.. Т. . .ССТ.А-- А. АА . АС. . . . Т. . TG.Tr .А -

5-ТССССССТТТТТСССССТСТС--. . . ААС. . С. .С. . А. . в. .С-. . Т. АС. . С. .. АСА.....Т-... ААА. . С. . САСА. . С. . Т-

\УЕЕ - пзР2 Обратный праймер

< Е2-\VEE-E1 > Обратный праймер

//

Рис.2. Доказательство специфичности взаимодействия праймеров: шР1(а) и Е1 (б) вируса Синдбис и тР2 и Е2-Е1 вируса ЗЭЛ (с) с матрицами эталонных штаммов.

1 2 3 4 5.6 7 8

а- ДНК-продукт шР1- 522 н.п.; РНК вирусов: 1-ВКЛ 9298,2-ЗЭЛ 5614,3-ЮЛ 230,4- Сиадбис АЯ 339

б- ДНК-продуюг Е1-506 н.п.; РНК вирусов: 1- ВКЛ 9298,2- Синдбис АЯ 339,3-ЗЭЛ 5614,4-ВЭЛ 230

с- ДНК-продукт ШР2-517 н.п.; РНК вирусов: 1-ЗЭЛ 5614 (конц.), 2-ЗЭЛ 5614 (к.ж.), 3- Синдбис АЛ 339,4- Мак Миллан (к.ж.)

ДНК-продукт Е2-Е1- 475 н.п.; РНК вирусов: 5- ЗЭЛ 5614 (конц.), 6-ЗЭЛ 5614 (к.ж.), 7- Синдбис АЯ 339,8- ЮЛ 230

Рис. 3 (а,б). Сравнительный ОТ-ПЦР анализ геков ЫБР1 (а) и Е1 (б) географических вариантов ВС.

2 3 4 5 6 7 8 9

ыР1 522

I

* Электрофорез в 1,4% агарозе,окраска бромистым этидисм. Показано положение специфических ДНК-продуктов: тР1 (522 н.п.) и Е1 (506 н.п.). Вирусы: 1- Вирус Ватароа, 2- Синдбис АЛ 339,3- Бабанки, 4-ВКЛ 9298, 5-1381 (Эстония), 6- 1383 (Эстония),7- Ф-720 (Армения), 8- вирус ЗЭЛ Мак-Миллан, 9- вирус ЗЭЛ Форт Морган.

а

генома двух вирусов ЗЭЛ (штаммы BFS и Мак-Миллан 16310- 5614) была использована для расчета олигонуклеотидных праймеров с локализацией в гене nsP2 (позиции 1606-2102) и генах Е2 и El (позиции 2422 - 2886 по 26S РНК). Между штаммами имеются незначительные различия (3,1 %) в области структурных генов.Нуклеотидная последовательность неструктурной области генома (гены nsP2-nsP3) расшифрована только для штамма Мак-Миллан (16310-5614) [Урываев Л.В. с соавт., 1994]. Все эти вирусы обладают самым высоким уровнем гомологии по изученным генам среди известных альфавирусов. Сравнение нуклеотидных последовательностей сходных участков генов nsP2 и Е2-Е1 основных представителей альфавирусов выявило различия в 5 и более нуклеотидах (рис.1), что позволяет дифференцировать вирусы ВЗЭЛ от североамериканских вирусов ВсЭЛ и североафриканского вируса Синдбис методом ОТ-ПЦР.

Гены nsP2 и Е2, также как гены nsPl и El, являются функционально-значимыми в репликации альфавирусов. Белок nsP2 участвует в синтезе субгеномной 26S РНК в составе полимеразного комплекса, а также обладает протеазной и геликазными активностями. Оболочечный белок Е2 входит в состав зрелого вириона в комплексе с белком El, образуя пепломеры на поверхности вириона. Е2 гликопротеин содержит основные нейтрализующие детерминанты альфавирусов с выраженной вариабельностью [Strauss а. Strauss, 1994]. В процессе созревания полипротеина происходит ряд модификаций, включающих гликозилирование и ацилирование. У географических вариантов альфавирусов наиболее вероятны изменения первичной структуры белка Е2 в области 170-230 а.о.

Экспериментальная проверка специфичности праймеров nsP2 и Е2-Е1 была выполнена с использованием РНК двух штаммов вирусов ЗЭЛ: Мак-Миллан 16310-5614 (аттенуированный вариант) и штамм Мак-Миллан (природный) из Национальной коллекции США в сравнении с контрольными РНК ВС AR339 и ВЭЛ 230. На рис. 2с показаны результаты анализа полученных ДНК-амплификатов методом электрофореза в агарозном геле с

/3

бромистым этидием. Ожидаемые по величине ампликоны(шР2 517 н.п. и Е2-El 475 н.п.) были получены в обоих случаях с РНК вирусов ЗЭЛ ( природный и аттенуированный штаммы). Следовательно, выбранные праймеры могу] быть использованы для выявления ЗЭЛ-подобных вирусов среди природньи изолятов и для дифференцирования их от ВС внутри общего серокомплекса. Генетические связи и биологические свойства географических вариантов альфавирусов серокомплекса Синдбис-ЗЭЛ.

Проведено генотипирование ряда природных изолятов вирусов Синдбш и ЗЭЛ с неизвестной первичной структурой. В таблицах 1 и 2 приведень основные биологические характеристики изученных альфавирусов серокомплекса Синдбис-ЗЭЛ и указаны географические районы их выделения. Исследовались вирусы, прошедшие 1-2 пассажа в мозге новорожденных мышей шн в культурах чувствительных клеток ФЭК или Vero. Инфекционный матер и aj культуральных вирусов имел титр 7-9 lg БОЕ/мл.

Анализ географических вариантов вирусов Синдбис.

'j ;

Проведен сравнительный анализ нескольких Синдбис-подобны: вирусов Северной Европы (Карелия, Эстония), Северной и Центрально! Африки, Кавказа (Армения) и Новой Зеландии.

Изученные ВС различались между собой по скорости и уровня» накопления в клетках ФЭК (табл. 1). Цикл репродукции у разных вирусо: колебался от 6 до 10 часов. Штаммы 1381 и 1383 (Эстония), можно услов» отнести к быстроразмножающимся. Наиболее продуктивными сред изученных ВС являются Бабанки, ВКЛ, 1381, Ватароа, а наименее - штамм! AR 339 и Ф-720. Исследованные нами вирусы различались между собой п уровню нейтрализации инфекционной активности (ИН) антисывороткой ВКЛ. Наиболее высокий ИН (4 lg ЦПД) установлен для географическ близких изолятов Скандинавии (ВКЛ, 1381, 1383- Эстония). Низкие показатели в РН были обнаружены у географически отдаленных вирусов: Ватаро (Новая Зеландия) и ЗЭЛ (Северная Америка). Промежуточное положени

fit

Табл.1. Биологические свойства географических изолятов Синдбис-подобных вирусов в сравнении с вирусом ЗЭЛ.

Изоляты вирусов, Место выделения Цикл***рен-родукции.ч Инфекц. тигр ^ БОЕ/мл ИН** цпд

Синдбис АЯ 339 Африка,Египет 10 7 3

Бабанки Африка .Камерун 6 9 3

Ватароа Новая Зеландия 6 8 1,5

ВКЛ Северная Европа, Карелия 10 9 4

1381 Северная Европа, Эстония 6 9 4

1383 Северная Европа, Эстония 6 9 4

Ф-720 Южная Европа, Армения 8 7 2

Мак Мил лан ЗЭЛ(16 310-5614) Северная Америка, Канада 6 9 1

*ЗЭЛ 5614 - лабораторный штамм, производный штамма Мак Миллан. ** ИН- индекс нейтрализации, показывающий снижение инфекционной активности вирусов после инкубации с АС к ВКЛ 9298 (10000 ед.) (1 час при 37 С). ***-Цикл репродукции- время, з^ которое урожай вируса в зараженной клетке достигает максимальной величины.

Табд.2. Описание вирусов ЗЭЛ, исследованных методом ОТ-ПЦР.

Вирусы Штаммы Месго,год • изоляции Источник Географический район

ЗЭЛ МакМиллан 16310(5614)* МакМиллан США ,1975, Калифорния 1981« Лошадь С. Америка, юго-запад

Форт Морган СМ4-146 США, 1983**, Колорадо Птица С. Америка,центр

Хайлендс Джи В-230 США, 1960, Флорида Птица С. Америка .юго-восток

:у-62-зз Россия, 1962, Удмуртия Комар Евразия, среднее Поволжье

атгенумрованный лабораторный вариант штамма вируса ЗЭЛ 16310 **- дата предоставления вирусов из Национальной коллекции США д-ром Л,Е. БЬора

«Г

занимают вирусы из Африки (АЯ 339; Бабанки) и Армении (Ф-720), ИН антисывороткой которых равен 2-3 ЦПД.

Для генетического анализа описанных выше вирусов амплифицировалг участки их генов: неструктурного пвР1 и структурного Е1 с последующее рестрикцией полученных ДНК-продуктов. Результаты подобногс генотипирования вирусных изолятов с неизвестной первичной структурой приведены на рис. 3 (а, Ь). Географические изоляты Синдбис-подобны? вирусов Африки ( АЯ 339, Бабанки) и Европы (ВКЛ, 1381, 1383) оказалиа идентичными по ДНК-продуктам (522 н.п. и 506 н.п.), полученным < праймерами к генам неструктурного тР1 и структурного Е1 белков Результаты генотипирования штаммов 1381 и 1383 совпадают с антигенным* характеристиками, на основании которых они были отнесены к вирусал Синдбис. Вирус Ф-720 (Армения) имеет сходство с ВС других регионов пс гену неструктурного пвР1 белка, но отличается от них по гену белка оболочке Е1. Вирус Ватароа проявляет сходство с ВС по гену белка оболочки Е1 \ отличается от него по гену неструктурного белка пвРГ Вирусы Бабанки, 138: и Ф-720 были дополнительно исследованы с праймерами к гену тР2 вирус; ЗЭЛ. Отрицательный результат подтвердил отсутствие связей этих вирусов < группой ЗЭЛ. Из представленных данных ПЦР-анализа следует необходимость генотипирования вирусных изолятов, как минимум, по двум генам один из которых находится в области генов неструктурных белков генома, : другой - в области генов оболочечных белков, содержащих основньи антигенные детерминанты вирионов. Полученные данные дают основани! считать исследованные изоляты вирусов Бабанки, 1381 и 1383 сходными I африканским прототипным штаммом Синдбис АЯ 339 и европейские штаммом ВКЛ по генам структурного Е1 и неструктурного шР1 белков.

Для исследования внутренних последовательностей амплифицированны: участков генов природных изолятов ВС был проведен их рестрикционньп анализ несколькими ферментами (табл.3). Выявлены определенные различи:

в нуклеотидных последовательностях участка генов пбР1 географически

{£

Табл. 3. Рестрикционный анализ полученных в ПЦР участков генов и Е1 Сивдбис- подобных вирусов.

'ДНК- Рест- Размер ДНК- Рестрик Размер

Вирус продукт рик- фраг- про- таза фраг-

таза ментов дукт ментов

н.п.** н.п.**

Синдбис NSP1 Ava 11 201, El Hindi 282,224

HRSP* 522н.п. 150 506н.п. Pst J 293,201

Pvull 407,99

Alu 1 89-82

Fokl 457,65

Hpall 319,

203

ВКЛ NSP1 Ava 11 400+** El Hinc 11 фф

9298 522н.п. Alu 1 фф 506н.п. Pst 1 *ф

Fokl фф Pvu 11 фф

Hpall фф

Hhal фф

Бабанки NSP1 Ava 11 фф El Pstl фф

522н.п. Fokl 450, 506н.п.

- 150,

jоо***

Hpall фф

Hha 1 фф

1381 NSP1 Ava, 11 400, El Pst 1 фф

Эстония 522н.п. j50*** 506н.п.

100**

Hpall фф

Примечание: *- Синдбис HRSP- штамм с известной первичной структурой, для которого сделан расчет рестриктаз и приведены размеры ожидаемых фрагментов, ** - подвижность рестриктов ПЦР - продуктов близка к ожидаемым, ***- приблизительные размеры рестриктов с подвижностью, отличной от ожидаемой. В качестве маркеров использованы фрагменты ДНК фагаЛ, полученные рестрикцией Hind 111 и Pst 1.

f?

вариантов ВС. Так, распределение фрагментов после действия ресгриктазы Нра 11 на амплификат nsPl изолятов Бабанки, 1381, Ф-720 было близко к ожидаемому. Однако, в случае действия ресгриктазы Avail на ДНК-продукт nsPl BKJ1 и 1381 были получены фрагменты, не совпадающие < рассчитанными для nsPl ВС HRSP. Поскольку между BKJ1 и эстонским вирусом 1381 есть различия в наборе и величине рестриктов, можно сделать вывод об особенностях их первичной структуры в проанализированных участках гена nsPl. Рестрикцией (Hincll, Pstl, Pvull) амплифицированнью участков гена Е1 было показано сходство между ВС AR 339, Бабанки, BKJl v 1381.

Сходство и различие американских вирусов ЗЭЛ и ЗЭЛ- подобного

вируса У-62-33 из России (Удмуртия).

Проведен ПЦР-анализ генетического сходства географически? вариантов ЗЭЛ-подобных вирусов (Мак-Миллан, Форт Морган, Хайлендс Джи, У-62-33) (табл.4). Вирусы ВсЭЛ и ЗЭЛ широко распространены га территории Северной и Южной Америки, и вспышки заболеваний вызываемые этими вирусами в одних и тех же районах, часто совпадали вс времени [Iverson, 1994; Gibbs a. Tsai, 1994]. На территории России, i Удмуртии, от комаров был выделен ЗЭЛ-подобный вирус У-62-33, биологические и антигенные свойства которого были охарактеризованы [Ильенко Смородинцев, 1969; Calisher, 1988]. По патогенности для животных вирус У 62 сравним с вирусами американских энцефаломиелитов лошадей. Известны« из литературы сведения о вариабельности антигенного состава разных вариантов вирусов ЗЭЛ могут быть связаны с особенностями их генетическое структуры. Область генов неструктурных белков (гены nsP2 и nsP3] вирионной РНК вируса Мак-Миллан, расшифрованная у двух штаммм (16310-5614, 7IV), обладает очень высоким уровнем гомологии ( аналогичными генами вируса ВсЭЛ (-80 %). Область 26S РНК вируса ЗЭ1 (штаммы BFS и 5614) имеет рекомбинантную природу: ген нуклеокапсидногс белка вируса ЗЭЛ сходен с геном нуклеокапсидного белка вируса ВсЭЛ,

Рис. 4(а,б). Электрофорез в 1,4 % агарозе ПЦР- продуктов американских в^у^в^Л (а) и^^подобного российского вируса У62-33 (б). 1 2 3 4 5 6 "

Исследованы участки генов неструктурного белка шР2 и структурных белков С-Е2 и Е2-Е1;

а: 1- Мак-Мюшан; 2- Форт-Морган; 3,4- ЗЭЛ 5614; 5- Хайлендс Джи; б- Синдбис АЯ 339. РНК выделена из образцов " культуральных вирусов" (1,2,3) и концентрированных осадков вирусовг (4,5,6). Справа стрелками показаны положение и размер продуктов (вн. п.). б: ПЦР-продукты вируса У62-33:1кР2 517 н. п. (2);Е2-Е1 485 н. п.(3); С-Е2 (4). Дорожки 5,6,7- отсутствие ПЦР- продуктов У 62-33 с праймерами ВС к участкам генов геР1, Е1 и С-Е2. _ _

Табл. 4. Сопоставление результатов ОТ-ПЦР и данных перекрестного серологического анализа вирусов ЗЭЛ в реакции нейтрализации.

ПЦР* и РН** Вирусы

ЗЭЛ Мак У62-33 Хайлендс Форт Синдбис

5614 Миллан Джи Морган АЯ 339

Гены: ПЦР ПЦР ПЦР ПЦР ПЦР ПЦР

пвР2 + + + + + -

С + + + +- - -

Е2-Е1 + + + + - -

Антисыворотки РН РН РН РН РН РН

' ЗЭЛ 5614 5 5 4,5 2 3 2

ВКЛ 9298 1,5 2 1 1,5 2 4

гены оболочечных белков Е1 и Е2 вируса ЗЭЛ наиболее близки по первичной структуре генам ВС. Поэтому возникла необходимость генотипирования в ОТ-ПЦР ряда природных изолятов ЗЭЛ-подобных вирусов с неизвестной первичной структурой. Параллельно проверяли применимость праймеров для дифференцирования вирусов ЗЭЛ от ВС.

Результаты анализа амплификатов участков генов пбР2, С, Е2 и Е1 ВЗЭЛ сопоставлены с антигенными характеристиками вирусов в РН инфекционной активности (табл.4). На рис. 4 (а,б) представлены картины распределения в агарозных гелях ДНК-продуктов, полученных на участках неструктурного шР2, структурных С и Е2-Е1 генов разных вирусов ЗЭЛ.

Таблица 5 иллюстрирует обобщенные результаты сравнительного рестрикционного анализа- ДНК-продуктов генов исследованных нами вирусов ЗЭЛ. Было выявлено сходство всех исследованных вариантов вирусов ЗЭЛ (штаммы Мак-Миллан, Хайлендс Джи, У-62-33, Форт Морган) по исследованным участкам гена щР2. Полученные ДНК-продукты шР2 имели одинаковую подвижность с теоретически рассчитанными для вируса Мак-Миллан 5614 (517 н.п.) и давали идентичную картину рестрикции внутренних последовательностей... Препараты РНК из концентрированного вируса Форт Морган в реакции амплификации с тремя парами праймеров к соответствующим структурам генов С, Е1 и Е2 не дали ожидаемого продукта. Вероятно, проанализированные области существенно отличаются от аналогичных участков двух разных штаммов Мак Миллан. У вируса Хайлендс Джи проанализированные участки генов оболочечных белков, по-видимому, более близки к вирусу Мак-Миллан: РНК вируса Хайлендс Джи взаимодействовала с праймерами к участку гена Е2-Е1; картины рестрикции их ДНК-продуктов были идентичны. Все использованные нами пары праймеров к вирусу 5614 не взаимодействовали с РНК прототипного штамма ВС АЯ339 и, следовательно, могут быть рассмотрены как дифференцирующие ЗЭЛ по генам шР2, С и Е2-Е1 внутри серокомплекса. Данные ПЦР пс

трем генам и РН инфекционной активности с поликлонально-'

20

антисывороткой к вирусу ЗЭЛ 5614 коррелируют между собой. Способность вирусных РНК взаимодействовать с праймерами к структурным генам сочеталась у вирусов ЗЭЛ штамма Мак-Миллан с высоким ИН. Отсутствие ДНК-продуктов (вирусы Хайлендс Джи и Форт Морган) в ПЦР коррелировало с низким ИН этих вирусов антисывороткой к вирусу ЗЭЛ 5614. Поэтому, разработанный нами метод ПЦР по сравнению с методом нейтрализации инфекционной активности поливалентными сыворотками, несомненно, является более специфичным и точным для оценки классификационной принадлежности вируса, при условии использования нескольких пар праймеров.

Три вируса ЗЭЛ: Мак Миллан 16310-5614, Мак Миллан, полученный из Национальной коллекции США и вирус У62-33, выделенный в Удмуртии, оказались идентичными по 3-м участкам генов: nsP2, С-Е2, Е2-Е1. Специфические для штамма Мак Миллан 5614 пары праймеров позволяют получать ожидаемые по размеру ДНК-продукты на матрице РНК вируса У62-33 (рис.4 б). Более того, рестрикты этих продуктов вирусов У62-33 и ЗЭЛ 5614 аналогичны (табл. 5). Таким образом, есть основания считать вирус У62-33 весьма близким к американскому штамму Мак-Миллан. По данным перекрестного анализа в РН вирус У-62 считается ЗЭЛ-подобным, что подтверждается и нашими данными. Исследование РНК вируса У62-33 в ПЦР с праймерами к аналогичным участкам генома вируса Синдбис HRSP дало отрицательный результат.

Дифференциация антигеннородственных вирусов Синдбис и ЗЭЛ методом ОТ-ПЦР. Проведенные нами исследования по дифференцированию методом ОТ-ПЦР географических вариантов вирусов ЗЭЛ от географических вариантов ВС суммированы в таблице 6 . Из 8 проанализированных вирусов серокомплекса четыре (Бабанки, 1381, Форт-Морган и У62-33) относятся к природным изолятам с неизвестной первичной структурой генома, и три являются эталонными штаммами ВС и ЗЭЛ (Синдбис AR 339, ВКЛ 9298 и ЗЭЛ 5614), у

21

Табл. 5. Рестрикдионный анализ ПЦР- продуктов участков генов иЕ2 разных географических вариантов вирусов ЗЭЛ.

ПЦР- Рестриктазы

продукг (ожидаемые Сходство рестриктов ПЦР-продуктов

фрагменты)'* вирусов

ЗЭЛ Мак- У-62 Форт Хайлен

5614 Миллан Морган деДжи

NSP2 Alu1(296,86, + + н.и. + +

517 н.п. 83,52)

Нае 111 + + + + +

(365,146)

Pvu( 431,86) + + н.и. ' + +

Rsal + + н.и. + +

(302,215) -

Е2 Нае 111 + + 0 +

485 н.п. (429,56)

Bam Н 1 + н.и. н.и. 0 +

(268 Л 7)

* Ожидаемые фрагменты рестрикции рассчитаны на ДНК-продукты вируса ЗЭЛ 5614. Совпадение величины полученных фрагментов с ожидаемыми показано знаком +; н.и.- не исследованы ресгрикцией;0-отсутствие ДНК-продукта в ПЦР.

Табл. 6. Дифференцировка географических вариантов вирусов Синдбис и ЗЭЛ методом ОТ-ПЦР.

Вирусы Праймеры Праймеры

Синдбис АЯ 339 ВКЛ 9298 Бабанки 1381 Синдбис nsPl El + + + + + + + + ЗЭЛ nsP2 Е2-Е1

ЗЭЛ Мак Миллан ЗЭЛ 5614 Форт Морган У 62-33 1 1 1 1 II 1 1 + + + + + + + +

Знак "+"- наличие специфического ДНК-продукта; Знак "-- "- его отсутствие.

которых структура отдельных генов была определена. По данным ОТ-ПЦР анализа с соответствующими парами праймеров к генам полимеразных белков (nsPl и nsP2) и белков Е2 и El, исследованные вирусы четко разделились на 2 группы: Синдбис-подобные и ЗЭЛ-подобные. Полученные данные впервые демонстрируют успешное применение метода ОТ-ПЦР для разделения внутри серокомплекса Синдбис- и ЗЭЛ- подобных вариантов вирусов. Результаты дифференциального ОТ-ПЦР анализа позволяют усовершенствовать традиционные методы индикации альфавирусов серокомплекса Синдбис-ЗЭЛ и могут быть основой для разработки их современной генной классификации.

Рекомбинация у альфавирусов.

Рекомбинация у РНК-содержащих вирусов играет важную роль в эволюционном процессе. Изучение первичной структуры геномов различных животных и растительных РНК-вирусов доказывает, что некоторые природные вирусные изоляты возникли в результате генетической рекомбинации между близкородственными вирусами [Lai, 1992; Nagy, 1997; Strauss a. Strauss, 1997]. В определенных ситуациях рекомбинантные вирусы становятся доминирующими в популяции, приобретая селективные преимущества. К настоящему времени имеются убедительные доказательства рекомбинантной природы генома альфавируса ЗЭЛ Мак Миллан [Hahn et. al.,1988; Урываев с соавт., 1994-95].

Применение метода ОТ-ПЦР открывает новые возможности для быстрого и эффективного обнаружения вирусов-рекомбинантов в смешанной вирусной популяции. Опытным путем нами было показано, что при смешанной инфекции альфавирусами разных видов в культурах клеток может происходить рекомбинация их геномов. При исследовании явления рекомбинации у альфавирусов, мы применили вариант метода ОТ-ПЦР [Соколова с соавт., 1996], сходный с использованным на модели коронавирусов [Kottier et.al.,1995]. Комбинация праймеров (как генетических маркеров) к участкам генов двух вирусов-родителей позволяет выявить

ЯЗ

рекомбинантные молекулы с целью последующего определения первично структуры.

Сравнение участка С-Е2, содержащего сайт рекомбинации у географически: вариантов вируса ЗЭЛ.

Ранее была определена и подробно изучена первичная структура сайто рекомбинации у штаммов BFS и 5614 Мак Миллан. Полученные сведени имеют большое значение для понимания происхождения и изменчивосп разных природных вирусов ЗЭЛ с выраженной вариабельностью биологичес ких и антигенных свойств. Поэтому мы дополнительно провели сравнени области С-Е2 (содержит сайт рекомбинации у вируса ЗЭЛ Мак Миллан) вирусами Хайлендс Джи и У 62-33, подобрав специфические для ВЗЭЛ и В( праймеры. На рис. 5 показана гомология потенциальных участко праймирования у разных альфавирусов. Мы полагали, что дополнительны участки для анализа (в генах С, Е2 и внутренней области) могли дать сведени о сходстве этих вирусов. Перекрестное использование пар праймеров могл< бы также способствовать выявлению характерных особенностей в это! области у вирусов ЗЭЛ с неизвестной структурой генома.

При анализе были использованы пары гомологичных и гетерологичны праймеров вирусов ЗЭЛ и Синдбис. Использованная пара праймеров С-Е2 ЗЭЛ была специфична и не взаимодействовала с РНК ВС AR339. С помощью пары праймеров С-Е2 ЗЭЛ можно было выявить вирусы внутренним участком рекомбинации как у вируса Мак Миллаи Гетерологичные пары праймеров (С ЗЭЛ-С Синдбис, С Синдбис-Е2 ЗЭЛ] использовали для контроля и возможного обнаружения иных варианте рекомбинантных структур в этой области генома. Полученные в ОТ-ПЦ данные подтверждают сходство американского вируса Мак-Миллан i российского У62-33 в области С-Е2.

Мы провели сравнительное исследование в ОТ-ПЦР области С-Е2 вирус Хайлендс Джи с гомологичными и гетерологичными парами праймеров вирусам ЗЭЛ Мак Миллан и Синдбис HRSP (С-С Синдбис-выбра

2М

Рис.5.Элаймент праймеров С-Е2 ЗЭЛ с участками генов представителей разных групп альфавирусов.

С

ЗЭЛ5614 Синдбис ВсЭЛ ВЭЛ

ААА6СССАСАСТС(ЗАА(зАСС6 •С••«А••»•«О*.ТС.Т.•• • «0«•Т»••»«О* «О*»•••т

.'.в. .А.....С.. .С____С

£2

ЗЭЛ 5614 Синдбис ВсЭЛ ВЭЛ

СССГСбТСТТбСССАСАААСС ТА • АА»О • • • А TTCC.TCG.GTCG...С.С.. Т.АСАТ.С.С.АТбббС.С..

Рис.б. Сравнительный ПЦР-анализ области С-Е 2 в геноме вирусов ЗЭЛ, Хайлевдс-Джи и Синдбис. Электрофорез в 1,4 % агарозе.

ч -праймеры С-Е2 ЗЭЛ (1-9); РНК вирусов: 1,2,3-Синдбис (Т отжига 44,50,56 С); 4,5,6 - ЗЭЛ 5614 (Т отжига 44,50,56 С); 7,8,9 - Хайлендс-Джи(Т отжига 44,50,56 С). Слева стрелкой показано положение и размер ДНК-продуктов С-Е2 ЗЭЛ- 632 н.п.

консервативный участок) при трех разных температурах отжига, допускающих 1, 2 и 3 ошибки в местах взаимодействия. По нашим данным понижение температуры отжига повышает возможность взаимодействия праймеров с исследуемым участком генома вируса Хайлендс Джи, а потому увеличивает выход более высокомолекулярных ампликонов (300-500 н.п.) в ПЦР. Специфический ДНК-продукт (632 н.п.) является минорным на фоне доминирующих гетерогенных ДНК. Это можно объяснить наличием ряда нуклеотидных замен в гене нуклеокапсида вируса Хайлендс Джи в участке взаимодействия с праймерами. Вирус Хайлендс Джи, по-видимому, имеет отличия в структуре проанализированного участка, так как в ПЦР-продуктах преобладают гетерогенные низкомолекулярные ДНК. Исследованные комбинации праймеров (С-Е2 ЗЭЛ, С-С Синдбис, СЗЭЛ-С Синдбис) давали более сильный сигнал с РНК вируса ЗЭЛ, чем с РНК вируса Хайлендс Джи. Геномная РНК вируса Форт Морган с праймерами к ВЗЭЛ Мак Миллан не давала положительного сигнала после амплификации, что указывает на существенные различия в области С-Е2 этих вирусов.

Моделирование процесса рекомбинации при смешанной инфекции вирусами ВЭЛ и BKJI в культуре клеток.

Мы попытались показать образование рекомбинантных вирусов при смешанной инфекции двумя альфавирусами разных видов: ВЭЛ-230 и ВКЛ. Использованные альфавирусы относятся к разным серотипам и существенно различаются по первичной структуре и биологическим свойствам. Более цитоцидный и высокорепродуктивный вирус ВЭЛ мы условно назвали "сильным", а менее репродуктивный цитоцидный ВКЛ - "слабым". Схема проведенного исследования в культурах клеток ФЭК и Vero и методы выявления вирусов-рекомбинантов в 4-х пассажах вирусной инфекции представлены на рис.7 .

Анализ гибридных форм РНК в составе вирионов методом ОТ-ПЦР.

Мы полагали, что при использовании в качестве генетических маркеров коротких нуклеотидных последовательностей вирусных геномов, с которыми

26

Рис.7. Схема эксперимента получения вирусов-рекомбинантов при смешанной инфекции ( ВЭЛ + ВКЛ ) ■ культурах клеток.

Смесь вирусов-родитслсй: ВЭЛ 230 0,1 БОЕ/ мл+ ВКЛ 1 БОЕ/мл

__Клеточные культуры

<tSK_ФЭК « Vero АС * Vero АС

I -1

1-й 2-й. 3-й 4-â

п а с х а ж и

- Определение родительских и гибридных РНК методом ОТ-ПЦР и рестрикцнонного анализа

- Определение инфекционносги вирусов,освобождающихся из клеток

- Нейтрализация внеклеточного вируса смесью АС к вирусам-родителям (ВЭЛ+ВКЛ)

Табл. 7. Анализ вирусов- рекомбинантов, освобождающихся из клеток при смешанной инфекции ВВЭЛ и ВКЛ

Пассажи в Тнтры/ИН* ПЦР-продукгы**

'льтуре клеток 1*ЦПД/мл ( область генома С-Е2)

Родители Рехомбинанш

С Е2

ФЭК 7/7 . ВВЭЛ ++++ ВВЭЛ/ВКЛ +++

- ' v ВКЛ *+ ВКЛ/ВВЭЛ ++

ФЭК 8/7 ВВЭЛ ++++ ВВЭЛ/ВКЛ +

ВКЛ - ВКЛ/ВЭЛ +

Vero 9/6 ВВЭЛ ++-Н- ВЮЛ/ВКЛ ++++

ВКЛ ++ ВКЛ/ВВЭЛ ++

a + AT*** ВКЛ 8/5 ВВЭЛ ++++ ВЮЛ/ВКЛ +++

• ВКЛ - ВКЛ/ВЮЛ +

Vero 9/3 ВЮЛ ++++ ВЮЛ/ВКЛ +++

ВКЛ. — ВКЛ/ВВЭЛ +

а+АТ***ВКЛ 9/2 ВЮЛ ++++ ВЮЛ/ВКЛ +++

ВКЛ — ВКЛ/ВВЭЛ ++

индекс нейтрализация инфекционного культурального »руса,образующегося при смешанной инфекции, смесью ?ггосывороток к вирусам •родкгсляы. В контроле моноинфекцки ВЭЛ или ВКЛ инфекционный вирус нейтрализовали той же дозой лисыворолси на 100%. •

•'-количественная оценка специфических ОТ-ПЦР амплификатов: наличке продукта,отсутствие продукта, цоликлональкая ангисыворотка в дозе, нейтрализующей фехционный ВКЛ на 100%

Рис. 8. Электрофорез в агарскзном геле ПЦР- продуктов участков генов С-Е2 вирусов 1-4-го пассажа при смешанной инфекции (СИ).

си 4п I 4п + АС

1114

1 2 3 4 1 2 3 4

¿а:*!« •

1 2 3 4 1 2 3 4

1150 1140

1109

3 4 1

12 3 4

1.3 24

а-1-Й и 2-й пассажи; б-3-й пассаж без АС и с АС к ВКЛ; в-4-Й пассаж без АС и с АС к ВКЛ; г- сравнение ГЩР-продуктовдголучениых на искусственной смеси вирусных РНК(*РНК) и РНК, выделенных из вирусов ЮЛ и ВКЛ при моноинфекции (МИ). Справа и слева указано положение ДНК-продуктов и их размеры (в н. п.). Сверху- номер пассажа при СИ и МИ; снизу- праймеры, добавленные в ОТ-ПЦР: 1- С-Е2 ВЭЛ; 2-С ВКЛ - Е2 ВЭЛ; 3- С-Е2 ВКЛ; 4- С ВЭЛ -Е2 ВКЛ.

7-8.

в условиях ПЦР взаимодействуют специфические праймеры, можно обнаружить гибридные формы вирусных РНК в клетках и в составе вирусов-рекомбинантов. Возможность случайной "посадки" выбранных праймеров на гетерологичную РНК альфавирусов исключалась наличием более 6 "ошибок" в последовательностях взаимодействия праймеров с генами С, Е2 и Е1 ВС и ВЭЛ. Нами было проведено сравнительное изучение состава смешанной популяции двух вирусов (ВС и ВЭЛ) и возможных рекомбинантов, образующихся в отсутствии селектирующих факторов (естественный отбор) и в присутствии антител к родительским вирусам (иммунное давление). ОТ-ПЦР проводили с использованием РНК внеклеточных вирионов, осажденных из культуральной среды на 1-5 пассажах смешанной инфекции. Для нейтрализации вирионов ВКЛ в смешанной вирусной популяции на 3 и 4 пассажах как селектирующий фактор была добавлена антисыворотка к родительскому вирусу . ВКЛ. Параллельно вирусы пассировали без антисыворотки. Предварительно была установлена специфичность использованных гомологичных пар праймеров и показано отсутствие ПЦР-продуктов с комбинированными парами праймеров на РНК вирусов ВЭЛ и ВКЛ при моноинфекции и в искусственной смеси вирусных РНК. Ожидаемые ДНК -продукты (С-Е2 ВЭЛ 1109 н.п.; С-Е2 ВКЛ 1114 н.п.; Е2 ВЭЛ 453 н.п. и Е1 ВКЛ 506 н.п.) были получены на РНК вирусов-родителей только с гомологичными парами праймеров; с гетерологичными парами праймеров ( С ВЭЛ - Е2 ВКЛ; С ВКЛ- Е2 ВЭЛ ; Е2ВЭЛ-Е1ВКЛ) ДНК продуктов на РНК вирусов-родителей не обнаружено (рис.8). На искусственной смеси РНК вирусов ВЭЛ и ВКЛ определена вероятность процесса образования рекомбинантных форм ДНК на стадии ПЦР, а не в зараженных клетках при смешанной инфекции. Как следует из рисунка 8 (г), на искусственной смеси РНК вирусов-родителей с гомологичными парами праймеров образуются ДНК-продукты только одного из вирусов (ВЭЛ или ВКЛ). Образование рекомбинантных ДНК, взаимодействующих с гетерологичными парами

2.9

праймеров С ВЭЛ-Е2 ВКЛ; С ВКЛ-Е2 ВЭЛ; El ВКЛ-Е2 ВЭЛ, если и происходит, практически не определяется (менее 50 нг).

Результаты исследования вирионных РНК с гомологичными и гетерологичными парами праймеров в ПЦР в области генома С-Е2 представлены на рис. 8 и суммированы в табл. 7. Данные ПЦР демонстриру-уют присутствие в потомстве вирусов 1-го пассажа в ФЭК РНК двух родительских вирусов и дополнительно - рекомбинантных форм РНК, выявляемых гетерологичными парами праймеров С ВКЛ - Е2 ВЭЛ; С ВЭЛ -Е2 ВКЛ. Потомство 2 -го пассажа вирусов в области С-Е2 существенно отличается по составу от 1-го пассажа: преобладает РНК ВЭЛ, исчезает РНК ВКЛ и снижается количество рекомбинантной РНК, реагирующей с комбинацией праймеров С ВЭЛ- Е2 ВКЛ. В 3-м пассаже на обезьяньих клетках VERO состав РНК потомства вирусной популяции изменялся и был сходен с выявленным на 1-м пассаже в ФЭК. Нейтрализация антисывороткой к ВКЛ вызывала в 3-м пассаже ожидаемое подавление ВКЛ и его РНК, и, в меньшей степени, вирусов- рекомбинантов с РНК С ВКЛ - Е2 ВЭЛ. Вместе с тем, внесение антисыворотки к ВКЛ не влияет на количество выявляемого ампликона РНК ВЭЛ и слегка снижает уровень накопления рекомбинантного продукта РНК СВЭЛ-Е2ВКЛ. Вирусное потомство 4-го пассажа оказалось сходным по составу РНК с потомством 3-го пассажа, нейтрализованного антисывороткой к ВКЛ. Нейтрализация антисывороткой к ВКЛ на 4-м пассаже приводила к селекции вирусов с тремя преобладающими формами РНК : С-Е2 ВЭЛ и рекомбинантов С ВКЛ-EÍ ВЭЛ и С ВЭЛ-Е2 ВКЛ, размеры которых хорошо совпадали с теоретически ожидаемыми (1109 н.п., 982 н.п., 1141 н.п.). В 1-4 пассажах среди выявляемы? рекомбинантных форм преобладали РНК, содержащие нуклеокапсидньп белок "сильного" вируса и белок оболочки "слабого" вируса. Именно таки\ вариантом рекомбинанта являются природные штаммы вируса ЗЭЛ Мак Миллан. Из полученных данных следует, что в вирусной популяции 3 и ^

ассажей доминируют вирусы ВЭЛ и рекомбинанты на его основе с вмененными антигенными характеристиками.

Дополнительный интерес представляло изучение возможности екомбинации и в области генов белков оболочки Е2-Е1. На 1-м пассаже в ярусной популяции по данным ОТ-ПЦР преобладают РНК родительских ирусов, взаимодействующие с гомологичными парами праймеров Е2 ВЭЛ и 11 ВКЛ. Однако, с гетерологичной парой праймеров Е2-ВЭЛ - Е1ВКЛ олучено несколько форм ДНК-продуктов разного размера, в том числе и акая, которая включает участки генов Е2 и El 2-х вирусов (2450 н. п.). На 2-м ассаже спектр рекомбинантов менялся: наблюдалось накопление ДНК-родукта порядка 2450 н. п. и дополнительного продукта 505 н.п. Размер ысокомолекулярного продукта соответствовал расчетному для РНК екомбинанта Е2 ВЭЛ- El ВКЛ. На 3-м пассаже, как описано выше, была роизведена смена клеточной системы, в которой произошло изменение олученных ДНК- продуктов и размер рекомбинантного продукта стал еньше (1500 н.п.). Добавление АС родительского вируса ВКЛ приводило к счезновению продукта El ВКЛ и накоплению продукта Е2 ВЭЛ. При этом охранялся рекомбинантный продукт 1500 н.п.

Сравнительный рестрикционный анализ участков геномов рекомбинантных вирусов и вирусов-родителей.

Для сравнения внутренних последовательностей ДНК, полученных в ПЦР а РНК вирусов, образующихся в 1, 3 и 5 пассажах смешанной инфекции, ыл проведен рестрикционный анализ ДНК- репликонов. Спектры естриктов ПЦР - продуктов С-Е2 ВЭЛ и С-Е2 ВКЛ ферментом НАЕ111 тличались от спектров рестриктов гибридных ампликонов СВЭЛ-Е2ВКЛ и :ВКЛ-Е2ВЭЛ. Следовательно, в составе вирионных РНК действительно ыявляются рекомбинантные конструкции с измененной генетической груктурой. ДНК-продукты, полученные с парой праймеров С-Е2ВЭЛ были табильными в 1 и 3 пассажах по размерам и спектрам рестрикции

U

ферментом НАЕ III. В то же время, рекомбинантные ДНК СВКЛ-Е2 ВЭЛ, содержали отличающиеся от С-Е2 ВЭЛ по размерам рестрикты. Использование только одной рестриктазы не позволяло обнаружить в вирусной популяции 5-го пассажа рекомбинантные формы РНК, хотя в популяции сохранялся инфекционный вирус с измененными антигенными характеристиками.

Результаты сравнительного изучения инфекционной активности и антигенного состава вирусной популяции, образующейся при смешанной инфекции и исходных родительских вирусов. Культуральные вирусы 1-4-го пассажей при смешанной инфекции и родительские вирусы ВЭЛ и ВКЛ при моноинфекции имели высокий инфекционный титр по ЦПД (от 7 до 9 lg, табл 7). Потомство 1-го и 2-го пассажей в значительной степени нейтрализовалось смесью антисывороток к вирусам-родителям. После 2-го пассажа вирусное потомство было нечувствительно к действию АС к ВКЛ, что согласуется с данными ОТ-ПЦР о вытеснении "слабого" вируса ВКЛ из популяции. Для вирусов 3-го и, особенно, 4-го пассажей было характерно заметное ослабление чувствительности к действию АС ВЭЛ и смеси АС ВЭЛ+ВКЛ (ИН 5-21g). Таким образом, при смешанной инфекции в 3-4 пассажах наблюдается образование антигенно-измененных инфекционных вирионов, ускользающих от действия антител к исходным родительским вирусам. Измененные антигенные варианты , по- видимому, имеют скорость репродукции и цитопатичность, сравнимую с "сильным " вирусом ВЭЛ.

Гибридизационный анализ структуры области рекомбинации С-Е2.

С помощью набора олигонуклеотидных зондов, взаимодействующих с участками генов С, ЕЗ и Е2 вирусов ВЭЛ и ВКЛ было исследовано наличие £ составе гибридных ПЦР-продуктов СВЭЛ- Е2ВКЛ и СВКЛ- Е2ВЭЛ нуклеотидных последовательностей обоих вирусов-родителей (табл.8) Анализ ПЦР-продуктов после переноса их из агарозного геля на мембрану i гибридизации их с мечеными Р32-зондами показал, что рекомбинантньк

3Z

Табл. 8. Результаты взаимодействия гибридизационных зондов с ПЦР-продуктами вирусов родителей и рекомбинантов.

ПЦР-проду кты Размеры ПЦР- Результаты блот-

продуктов гибридизации**

зонды зонды

ЮЛ ВКЛ

родители:"

С-Е2ЮЛ 1109 + -

С-Е2ВКЛ 1114 - +

рекомбинанты:

С ВЭЛ - Е2 ВКЛ 1150 +

СВКЛ -Е2ВЭЛ 1114;1000 + +

родители:

С-Е2ВЭЛ 1109 + -

С-Е2ВКЛ 1114 - +

рекомбинанты:

С ЮЛ-Е2 ВКЛ .1150 + -

С ВКЛ-Е2 ЮЛ 1114;1000 + +

результаты блот- гибридизации: '+"- наличие Р-32-продуктов на авторадиограмме их отсутствие

структуры СВЭЛ-Е2ВКЛ взаимодействовали с зондами ВЭЛ (добавленг смесь 3-х зондов) с той же эффективностью, что и с продуктами С-Е2 ВЭЛ Зонды ВЭЛ также давали положительную реакцию в гибридизации < рекомбинантными ПЦР-продуктами состава С ВКЛ-Е2 ВЭЛ, хотя уровеш сигнала был ниже. ПЦР-продукты С-Е2 ВКЛ с зондами ВЭЛ » взаимодействовали. Уровень сигнала после гибридизации с зондами ВК1 родительского С-Е2 ВКЛ и рекомбинантного СВКЛ-Е2ВЭЛ ПЦР-продукто] был ниже. Гибридные ПЦР-продукты СВКЛ-Е2ВЭЛ взаимодействовали зондами к обоим вирусам-родителям. Данные гибридизации подтверждаю образование гибридных вирусных РНК при смешанной инфекции. Сочетани методов ОТ-ПЦР, рестрикции и блот-гибридизации позволяет выявлят участки рекомбинации вирусных геномов и уточнять их локализацию бе предварительной изоляции рекомбинантов из популяции.

ЗУ

Выводы

Разработан способ дифференциальной генодиагностики антигеннородст-х. вирусов Синдбис и ЗЭЛ на основе использования метода ОТ-ПЦР с танными специфическими олигонуклеотидными праймерами к участкам эелков полимеразного комплекса (nsPl, nsP2) и оболочки вирионов (Е1,Е2), нощимся у вирусов Синдбис и ЗЭЛ по первичной структуре.

Впервые сравнительным ПЦР-рестрикционным анализом определены ческие связи ряда географических вариантов вирусов Синдбис, выделенных >ритории Европы, Африки и Новой Зеландии. Установлено сходство европейских изолятов ( Карелия 9298, Эстония 1381 и 1383) с африканскими :ами AR339 и Бабанки по участкам генов nsPl и El. Выявлены отличия ландского вируса Ватароа в гене nsPl и изолята Ф-720 ( Армения) в гене наружены вариации в картах рестрикции участка гена nsPl у европейских и шских вирусов Синдбис.

Показано, что североамериканские варианты вирусов ЗЭЛ (МакМиллан, щс Джи и Форт Морган) родственны по гену белка полимеразы nsP2, по отличия в участках генов структурных белков. Выявлены различия в IX генов нуклеокапсида у вирусов Хайлендс Джи и МакМиллан и генов оболочки Е2 и El у вирусов Форт Морган и МакМиллан.

Установлено сходство участков геномов ЗЭЛ-подобного вируса У-62-33 ггия) с американским вирусом ЗЭЛ МакМиллан по 4-м генам ( nsP2, С, Е2 асти С-Е2), указывающее на общность их эволюционного происхождения.

Продемонстрирована возможность выявления рекомбинантных ирусов комбинацией методов ОТ-ПЦР, рестрикции и гибридизации при зовании в качестве генетических маркеров специфических уклеотидных праймеров и зондов к РНК вирусов-родителей.

Обнаружено явление межвидовой рекомбинации альфавирусов ВЭЛ и ри смешанной инфекции в культурах клеток ФЭК и Vero. Установлены мерности накопления рекомбинантных вирусов и вирусов-родителей (в ах естественной селекции и в присутствии антител) на протяжении >ких пассажей: доминирование в популяции высокорепродуктивного •родителя ВЭЛ, быстрое образование на его основе рекомбинантов в л генов структурных белков с измененными антигенными свойствами, гние из популяции менее активного вируса ВКЛ.

[ражаю глубокую благодарность научным руководителям Л.В. Урываеву и околовой, сотрудникам лаборатории энзимологии: А.Ю. Лебедеву, H.A. ж , К.С. Ионовой за совместное выполнение разделов работы, внимание и жку при оформлении диссертации.

Список опубликованных научных работ по теме диссертации

научного сотрудника лаб. этимологии Селивановой Т.К.

1. Урываев JI.B., Петров H.A., Соколова Т.М., Самохвалов Е.И., Лебедев А.Ю., Селиванова Т.К., Парасюк H.A., Ионова К.С., Гринев A.A. Анализ первичной структуры участков генома вируса Карельской лихорадки. Вопросы вирусологии, 1995, N5, с. 198-202.

2. Соколова Т.М., Селиванова Т.К., Лебедев А.Ю., Быстров Н.С., Парасюк H.A., Ионова К.С., Урываев Л.В. Вирусы Синдбис разного географического происхождения и дифференцирование их от вирусов Западного энцефаломиелита лошадей методом полимеразной цепной реакции. Вопросы вирусологии, 1996, N3, с. 117-122.

3. Соколова Т.М., Селиванова Т.К., Лебедев А.Ю., Быстров Н.С., Громашевский В.Л., Парасюк H.A., Ионова К.С., Урываев Л.В. Сходство и различие вирусов Западного энцефаломиелита лошадей ( ЗЭЛ) по генам неструктурного белка NSP2 и структурных белков С и Е2. Вопросы вирусологии, 1996, N5, с. 209-214.

4. Соколова Т.М., Селиванова Т.К., Лебедев А.Ю., Громашевский В.Л., Львов Д.К., Урываев Л.В. Данные о генетической структуре вируса У-62, выделенного в России ( Удмуртия). Материалы Международной научной конференции " Вирусные, риккетсиозные и бактериальные инфекции, переносимые клещами", Иркутск 24-26 сентября, 1996 г., с. 65-66.

5. Урываев Л.В., Соколова Т.М., Селиванова Т.К., Лебедев А.Ю., Парасюк H.A., Ионова К.С., Быстров Н.С., Львов Д.К. Разработкаметодов определения маркеров лихорадки Синдбис и Западного энцефаломиелита лошадей с помощью полимеразной цепной реакции и латекс-агглютинации. Материалы Международной научной конференции " Вирусные, риккетсиозные и бактериальные инфекции, переносимые клешами", Иркутск 24-26 сентября, 1996; с.36-37.

6. Соколова Т.М., Урываев Л.В., Селиванова Т.К., Боброва О.В., Лебедев А.Ю., Быстров Н.С. Рекомбинация у альфавирусов при смешанной инфекции в культурах клеток. Образование гибридных форм РНК вирусов венесуэльского энцефаломиелита лошадей (ВЭЛ ) и Карельской лихорадки (КЛ) в области генов белков нуклеокапсида и оболочки. Вопросы вирусологии, 1996, N6, с.245-252.

7.Sokolova Т.М., Bobrova O.V., Seiivanova Т.К., Lebedev A.Yu., Uryvaev L.V., BystrovN.C., Lvov D.K. Alphavirus genomes recombination in mixed infection of tissue culture. Materials of Xth International Congress of Virology, Jerusalem, Israel, 11-16 August, 1996, p. 131.

8. Урываев Л.В., Лебедев А.Ю., Соколова T.M., Селиванова Т.К. Вирусы-рекомбинанты - новая подгруппа рода Alphavirus Материалы Международной научной конференции " Вирусные, риккетсиозные и бактериальные инфекции, переносимые клещами".Иркутск, 24-26 сентября 1996 г., с. 44-45.

9. Sokolova Т.М., Seiivanova Т.К., Lebedev A.Yu., Uryvaev L.V. Genetic relations of several SV-WEE serocoraplex alphaviruses isolated in Russia and different parts of the world. Materials of 4Л Asia-Pasific Congress of Medical Virology, Seoul, Korea, 3-5 November, 1997.

10. Урываев Л.В., Соколова Т.М., Лебедев А.Ю., Селиванова Т.К. Рекомбинантные альфавирусы в природе и эксперименте. Журнал инфекционной

патологии, Иркутск, 1997, Т.4, N 2-3, с. 3-10.

U

11. Соколова Т.М., Урываев Л.В., Громашевский В.Л., Львов Д.К., Селиванова Т.К., Лебедев А.Ю., Мельниченко Е.И., Быстрое Н.С. Генетическая структура и антигенные связи новых вирусов Синдбнс, выделенных на территории России. Материалы Научной конференции с международным участием " Вирусные инфекции на пороге XXI века: эпидемиология и профилактика", Санкт-Петербург 21-22 апреля 1999 г., Военно-медицинская академия, 200-летие, с. 143-144.

12. Урываев Л.В., Соколова Т.М., Селиванова Т.К., Лебедев А.Ю., Быстрое Н.С. Дифференциация альфавирусов серокомплекса Синдбис-ЗЭЛ методом обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции (РТ-ПЦР). Материалы Научной конференции с международным участием " Вирусные инфекции на пороге XXI века: эпидемиология и профилактика", Санкт-Петербург 21-22 апреля 1999 г. Военно- медицинская академия, 200-летие, с.160-170.

13. Соколова Т.М., Селиванова Т.К., Урываев Л.В. Рекомбинация у альфавирусов. Материалы Научной конференции " Актуальные проблемы медицинской вирусологии", посвященной 90-летию со дня рождения М.П.Чумакова, Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П.Чумакова РАМН, М., 23-25 ноября 1999г., с. 9.

14. Урываев Л.В., Соколова Т.М., Прилипов А.Г., Селиванова Т.К., Громашевский В.Л., Львов Д.К. Первичная структура участков генома вируса У-62. Материалы Научной конференции " Актуальные проблемы медицинской вирусологии", посвященной 90-летию со дня рождения М.П.Чумакова, Институт полиомиелита и вирусных энце-фалитов им. М.П.Чумакова, РАМН, М., 23-25 ноября 1999 г., с.92.

15. LvovD.K., Sokolova Т.М., UryvaevL.V., Gromashevsky V.L, Seiivanova Т.К., AristovaV.A. Studyingofgeneticstructureofseveral Russion alphavirus isolatesof Sindbis-WEE serocomplex. Arbovirus Iiiformation Exchange, 1999.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Селиванова, Татьяна Константиновна

Введение.

Обзор литературы

Глава 1. Основные сведения о первичной структуре и филогенетических связях альфавирусов.

1.1. Общие черты строения геномов альфавирусов

1.2. Гены белков полимеразного комплекса

1.3. Синтез белков нуклеокахгёида^оболочки, кодируемых субгеномной 268 РНК

1.4. Сборка нуклеокапсидов и вирионов альфавирусов. Формирование химерных вирионов

1.5. Функциональная характеристика гликопротеидов оболочки

Глава 2. Рекомбинация у вирусов с непрерывным РНКгеномом.

2.2.1. Строение геномов вирусов-рекомбинантов

2.2.2. Экспериментальные доказательства процесса рекомбинации на модели ВС

Глава 3. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) для обнаружения и индикации РНК-содержащих вирусов.Н

3.1. Основные характеристики метода ПЦР

3.2. Цели и варианты ПЦР- анализа

3.3. Подходы к разработке метода ОТ-ПЦР анализа дня индикации альфавирусов

Часть 2 Собственные исследования.

Глава 4. Материалы и методы.

4.1. Альфавирусы: культивирование и определение инфекционности

4.2. Смешанное инфицирование клеточных культур двумя видами альфавирусов

4.3. Реакция нейтрализации (РН) инфекционной активности альфавирусов

4.4. Приготовление материала для ПЦР-анализа из природных изолятов альфавирусов серокомплекса Синдбис-ЗЭЛ

4.5. Методы выделения РНК альфавирусов

4.6. Постановка ОТ-ПЦР

4.7. Рестрикция ДНК- продуктов ОТ-ПЦР

4.8. Электрофоретический анализ ДНК в агарозном геле

4.9. Блот- гибридизация ПЦР- продуктов с олигонуклеотидными зондами. Исследование генетической структуры РНК вирусов-рекомбинантов

4.9.1. Метка зондов в реакции кинирования

4.9.2. Перенос ПЦР-продуктов на мембраны

4.9.3. Процедура гибридизации с Р-32 зондами

4.10. Расчет олигонуклеотидных ПЦР-праймеров и гибридизационных зондов

Глава 5. Результаты исследований.

5.1. Генотипирование вирусов серокомплекса Синдбис-ЗЭЛ методом ОТ-ПЦР и рестрикционного анализа

5.1.1. Структура олигонуклеотидных праймеров вирусов Синдбис (ВС)

5.1.2. Амплификация и рестрикция участков генов эталонных штаммов вирусов Синдбис

5.1.3. Структура олигонуклеотидных праймеров вирусов

5.1.4. Амплификация и рестрикция участков генов шР2 и Е2 эталонных штаммов вируса ЗЭЛ Мак Миллан

5.2. Генетические связи и биологические свойства географических вариантов альфавирусов серокомплекса Синдбис-ЗЭЛ

5.2.1. Анализ географических вариантов вирусов Синдбис

5.2.2. Сходство и различие американских вирусов ЗЭЛ и ЗЭЛ-подобного вируса У-62-33 из России (Удмуртия)

5.2.3. Дифференциация антигеннородственных вирусов Синдбис и ЗЭЛ методом ОТ-ПЦР

5.3. Рекомбинация у альфавирусов

5.3.1. Сравнение участка рекомбинации С-Е2 у географических вариантов вируса ЗЭЛ

5.3.2. Моделирование процесса рекомбинации при смешанной инфекции вирусами ВЭЛ и ВКЛ в культуре клеток

5.3.3. ОТ-ПЦР анализ гибридных форм РНК в составе вирионов

5.3.4. Сравнительный рестрикционный анализ участков геномов рекомбинантных вирусов и вирусов-родителей

5.3.5. Результаты сравнительного изучения инфекционной активности и антигенного состава вирусной популяции, образующейся при смешанной инфекции, и исходных родительских вирусов

5.3.6.Гибридизационный анализ генетической структуры области рекомбинации

Глава 6 Обсуждение.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Генотипирование альфавирусов серокомплекса синдбис-западного энцефаломиелита лошадей"

Актуальность проблемы.

Вирусы Синдбис (ВС) и западного энцефаломиелита лошадей (ЗЭЛ) объединены в один серокомплекс рода альфавирусов (семейство Togaviridae) на основании частичного антигенного сходства белков оболочки вирионов, выявляемых в серологических реакциях [СаН8Ьег,1994]. Входящие в указанный серокомплекс вирусы широко распространены в разных регионах мира: вирусы Синдбис выделяются на 4-х континентах (Евразия, Африка, Австралия, Южная Америка), а вирусы ЗЭЛ- преимущественно на Американском континенте. Однако, описаны случаи обнаружения ЗЭЛ-подобных вирусов и на Евроазиатском континенте (Словакия и Россия). Эти данные требуют дополнительной проверки с использованием методов анализа вирусного генома. Случаи выделения ВС-подобных вирусов описаны для многих областей России и ближнего зарубежья (Карелия, Эстония, Урал, Поволжье, Кавказ, Алтай и др.) и в странах Европы (Скандинавия, Италия, Греция) [Львов, 1989].

Вирусы ЗЭЛ, восточного и венесуэльского энцефаломиелитов лошадей (ВсЭЛ и ВЭЛ) относятся к особо опасным вирусам (летальность при заражении может достигать 10-30% у человека и 4070% у лошадей). Вирусы Синдбис менее патогенны и вызывают лихорадочные состояния, часто с сыпью, артралгиями и развитием полиартритов [Львов, Скворцова с соавт., 1982]. Основными переносчиками этих вирусов являются комары, но известны случаи выделения их от клещей. К началу наших исследований для диагностики этой группы вирусных инфекций, главным образом, использовались иммунологические методы анализа (выявление антител к белкам оболочки и обнаружение вирусных антигенов в серологических реакциях) [Calisher, 1988]. Расшифровка первичной структуры геномов основных представителей альфавирусов, в том числе, вирусов Синдбис (штаммы HRSP, AR 339, Окельбо и частично-ВКЛ) и вирусов ЗЭЛ Мак Миллан (штаммы BFS, 16310-5614) [Strauss a. Strauss, 1994; Shirako, 1991; Урываев с соавт., 1994-95; Hahn et. al., 1988; Weaver et. al., 1997; Netolitzki et. al., 2000] создает предпосылки для разработки методов генодиагностики альфавирусных инфекций. Метод ОТ-ПЦР является высокочувствительным и высокоспецифическим. Он позволяет в течение нескольких часов накопить значительные количества ДНК-копий генов и их участков, достаточных для рестрикционного анализа. В настоящее время данный метод широко применяется для обнаружения и идентификации вирусов в разных биологических пробах в практике медицинского и эпидемиологического надзора за вирусными заболеваниями [Глухов с соавт., 1996]. Особую ценность метод ОТ-ПЦР приобретает для индикации вирусов с неизвестной первичной структурой, а также для обнаружения природных вирусов-рекомбинантов. Несмотря на существенный прогресс в области изучения молекулярной биологии альфавирусов (Синдбис-ЗЭЛ и Леса Семлики), методы их генодиагностики по-прежнему остаются не разработанными. Представленные результаты исследований по оптимизации метода ОТ-ПЦР для определения генетического материала альфавирусов серокомплекса Синдбис-ЗЭЛ демонстрируют решение ряда поставленных в этом направлении задач. О применении метода ПЦР для индикации вирусов ВсЭЛ, циркулирующих на территории Северной и Южной Америки, сообщили зарубежные авторы [Vodkin et. al., 1993; Monroy a. Webb, 1994; Strizki a. Repik, 1996].

Строение генома и этапы репродукции альфавирусов хорошо изучены на модели вируса Синдбис (вирионная 49S РЕК, размером 11тыс. нуклеотидов, имеет положительную полярность, кодирует неструктурные белки полимеразного комплекса nsPl-nsP4; структурные белки вириона С, Е2, El- и белки, участвующие в сборке вириона -ЕЗ и 6К, синтезируются на матрице 26S субгеномной РНК). Геном вируса ЗЭЛ имеет рекомбинантное происхождение от двух родителей (5'-NTR и гены белков полимеразного комплекса и белка нуклеокапсида родственны генам вируса ВсЭЛ, а гены белков оболочки и участок 3'- NTR имеют высокое сходство с аналогичными областями генома ВС). Поэтому объединение вирусов ЗЭЛ и Синдбис в один серокомплекс на основании только антигенных взаимосвязей не соответствует данным об их генетической структуре. В связи с этим возникает необходимость разработки методов генной дифференциации этих вирусов. У ряда РНК- содержащих вирусов животных и растений с позитивным непрерывным геномом показан процесс рекомбинации в системах ин виво и ин витро [Duggal а. Wimmer, 1999; Worobey а. Holmes, 1999]. Актуальным является изучение явления рекомбинации у вирусов при смешанной инфекции- как модель для выяснения возможностей образования рекомбинантов в природных условиях. Образование рекомбинантных РНК было показано в условиях трансфекции клеток фрагментами РНК ВС и при высокой множественности заражения, ведущей к образованию дефектных частиц [Weiss а. Schlesinger, 1981; Monroe et. al., 1982; Raju et. al., 1995]. До настоящего времени публикации о межвидовой рекомбинации альфавирусов в эксперименте при смешанной инфекции отсутствовали.

Цели и задачи исследования

Целью диссертационной работы было генотипирование природных изолятов вирусов серокомплекса Синдбис-ЗЭЛ и воспроизведение явления рекомбинации у альфавирусов при смешанной инфекции. Для достижения поставленной цели в ходе работы решались следующие задачи:

1. Применение метода ОТ-ПЦР с последующим рестрикционным анализом участков генов для дифференциации вирусов Синдбис и ЗЭЛ.

2. Проведение генотипирования природных изолятов альфавирусов серокомплекса Синдбис-ЗЭЛ, выделенных в разных географических регионах.

3. Моделирование процесса межвидовой рекомбинации у альфавирусов в условиях смешанной инфекции вирусами ВЭЛ и ВКЛ в культуре клеток.

4. Выявление рекомбинантных альфавирусов методами ОТ-ПЦР, рестрикции и гибридизации среди природных ЗЭЛ-подобных вирусов и в популяции, образующейся при смешанной инфекции.

Научная новизна и практическая ценность работы

1.Разработан способ дифференциального обнаружения вирионной РНК альфавирусов серокомплекса Синдбис-ЗЭЛ в биопробах с помощью метода ОТ-ПЦР и последующей рестрикции ДНК-продуктов. Предложенный способ основан на обязательном анализе вирусных генов, кодирующих белки полимеразного комплекса и структурные белки вирионов альфавирусов, и связан с наличием в этой группе вирусов-рекомбинантов. Данный методический подход может быть рекомендован для экологических обследований очагов альфавирусных инфекций и для диагностики вызываемых ими заболеваний.

2. Метод апробирован на природных изолятах с неизвестной первичной структурой генома, выделенных в разных географических регионах. Использование предложенного метода позволяет получить дополнительные характеристики вирусов, классифицирующие их как Синдбис и ЗЭЛ-подобные.

3. Установлено, что российский вирус У62-33 является вариантом особо опасного вируса ЗЭЛ Мак Миллан, циркулирующего на американском континенте.

4. Впервые описано образование межвидовых рекомбинантов вирусов ВЭЛ и ВКЛ при смешанной инфекции в культурах клеток и способ их выявления методами ОТ-ПЦР и гибридизации с использованием олигонуклеотидных праймеров и зондов в качестве генетических маркеров.

5. Выяснены закономерности накопления рекомбинантных вирусов и их родителей в смешанной популяции в условиях естественной селекции и иммунного давления. Показано доминирование в популяции высокорепродуктивного родителя- вируса ВЭЛ и быстрое преимущественное образование на его основе вирусов-рекомбинантов (в области генов структурных белков), ускользающих от действия нейтрализующих антител обоих вирусов-родителей. Наблюдается вытеснение из популяции менее активного вируса-родителя ВКЛ. Полученные данные позволяют обьяснить возникновение в природе рекомбинантного вируса ЗЭЛ, унаследовавшего высокую репродуктивную активность от вируса ВсЭЛ и приобретшего измененные антигенные свойства.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. ОСНОВНЫЕ СВЕДЕНИЯ О ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЕ И ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИХ СВЯЗЯХ АЛЬФАВИРУСОВ.

Первичная структура геномов альфавирусов достаточно хорошо изучена, главным образом, на модели вируса Синдбис [Strauss et. al., 1984; Shirako et. al; 1991; Strauss a.Strauss, 1994; Rumenaph et. al., 1995; Mc.Knight et. al., 1996]. Известны нуклеотидные и аминокислотные последовательности геномной РНК основных представителей серокомплексов Синдбис/ЗЭЛ, ВЭЛ/ВсЭЛ, ВЛС (таблЛ).Представители рода альфавирусов на основании анализа степени гомологии нуклеотидных и аминокислотных последовательностей разделены на 3 основные группы: ВС, ВЛС, ВсЭЛ/ВЭЛ. В особую группу выделены ЗЭЛ-подобные вирусы, имеющие рекомбинантное происхождение от вирусов ВсЭЛ и Синдбис [Hahn et. al., 1988; Юферов, 1991; Урываев с соавт., 1994-1995; Weaver; 1991]. Филогенетические связи представителей рода альфавирусов по первичной структуре белков (структурных и неструктурных) демонстрируют происхождение от общего прародителя [Strauss a. Strauss, 1994; Лебедев, 1996] (рис.1). Последующее эволюционное разделение на 2 основные группы вирусов: Старого Света (Синдбис и ЛС) и Нового Света (ВсЭЛ/ВЭЛ и ЗЭЛ), по-видимому, произошло вследствии географического деления единого материка в далеком прошлом (табл. 2). Новые данные об изоляции Синдбис -подобного вируса Аура (ВА) в Южной Америке (в Новом свете) [Rumenaph, 1995] и ЗЭЛ-подобных вирусов на Европейском и Азиатском континентах (в Старом Свете) [Libikova, 1957; Ильенко, Смородинцев, 1969; Левкович, 1969], по нашему мнению, отражают современные процессы в эволюции представителей рода, связанные с их широким межконтинентальным распространением птицами, животными и людьми.

Таблица 1.

Данные о первичной структуре альфавирусов

Генотип/ серотип Типичный представитель Штаммы География Литература

Синдбис/ Синдбис/ЗЭЛ Синдбис HRSP* AR 339, Египет, дельта Нила, 1952 Strauss a.Strauss,1984 Мс Knight et.al.,1996

Окельбо Карельская лихорадка Edsbyn 5/82 LEIV 9298 Швеция, 1982 Карелия, 1983 Shirako et. al., 1991 # Урываев и др., 1994

Аура BeAR 10315 Бразилия Аргентина Rumenaph et.al., 1995

Ватароа Новая Зеландия Shirako et.al., 1994

Рекомбинанты ЗЭЛ/ Синдбис/ЗЭЛ Мак; Миллан Хайлендс Джи BFS 1703* 16310-5614 B-230 L2-34 A WX3-2AP и др. США, 1953, Калифорния Россия*, 1980 США Флорида Луизиана Техас 1952-1994 #Hahn et.al., 1988 # Юферов и др.1992 # Урываев и др. 1994 # Weaver et.al., 1993 # Cilnis et. al., 1996

ВсЭЛ-ВЭЛ ВсЭЛ 82V-2137 Новосибирск *1991 США, Флорида, 1982 # Chang, Trent, 1987 Волчков и др., 1991

ВЭЛ BR56.AR36 AR38.PA84 Южная Америка # Weaver et.al., 1994

Trinidad donkey TC 83* CM27* 230* Южная Америка Россия Kinney et.al., # 1986,1989 Юферов, 1991,Фролов и др.,1991,Нетесов идр.

Леса Семлики/ Гета ЛесаСемлик и, Гета О Nyong--Nyong Ross River Nelson Bay T 48* Африка, Евразия Африка Австралия, Океания # Garoff et. al.,1980 Takkinen et.al., 1986 Levinsos et.al., 1990 #Faragher et.al., 1988 лабораторные штаммы; #-первичная структура участков генома.

Рисунок 1.

Эволюционные взаимосвязи альфавирусов

Ш щ пэР2

СП пэРЗ

Е2

Е1 шР1

С-конц«но4 участок) иР4

-сонцс*»й упсток)

Весьма вероятно возникновение новых географических вариантов альфавирусов (подвидов) вследствии высокой генетической изменчивости РНК-содержащих вирусов. Естественный отбор подвидов, более адаптированных к разным экологическим условиям, зависит от переносчика и чувствительного хозяина - (животные,птицы). Дополнительно, при смешанной инфекции разными вариантами и видами альфавирусов в насекомых-переносчиках и хозяевах теплокровных могут возникать рекомбинантные формы, как результат внутри - и межвидовой рекомбинации. Условия и места образования рекомбинантных вирусов ЗЭЛ в природе точно неизвестны. Более вероятно, что появление рекомбинантных вирусов ЗЭЛ происходило, преимущественно, на Северо-Американском континенте, где вирусы ЗЭЛ широко распространены и циркулируют совместно с вирусами ВсЭЛ и ВЭЛ. Среди альфавирусов группа вирусов лошадиных энцефалитов является наиболее патогенной ( до 80% летальности у лошадей и до 75% у человека) [Львов с соавт., 1989]. По степени патогенности вирусы лошадиных энцефалитов относятся к особоопасным возбудителям 2 группы.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Селиванова, Татьяна Константиновна

выводы

1. Разработан способ дифференциальной генодиагностики антигеннородственных вирусов Синдбис и ЗЭЛ на основе использованияметода ОТ-ПЦР с рассчитанными специфическими олигонуклеотидными праймерами к участкам генов белков полимеразного комплекса (nsPl, nsp2) и оболочки вирионов (El, Е2), отличающимся у вирусов Синдбис и ЗЭЛ по первичной структуре.

2. Впервые сравнительным ПЦР-рестрикционным анализом определены генетические связи ряда географических вариантов вирусов Синдбис, выделенных на территории Европы, Африки и Новой Зеландии. Установлено сходство североевропейских изолятов (Карелия 9298, Эстония 1381 и 1383) с африканскими штаммами AR339 и Бабанки по участкам генов nsPl и El. Выявлены отличия новозеландского вируса Ватароа в гене nsPl и изолята Ф-720 (Армения) в гене El. Обнаружены вариации в картах рестрикции участка гена nsPl у европейских и африканских вирусов Синдбис.

3. Показано, что североамериканские варианты вирусов ЗЭЛ (МакМиллан, Хайлендс Джи и Форт Морган) родственны по гену белка полимеразы nsP2, но имеют отличия в участках генов структурных белков. Выявлены различия в участках генов нуклеокапсида у вирусов Хайлендс Джи и МакМиллан и генов белков оболочки Е2 и El у вирусов Форт Морган и МакМиллан.

4. Установлено сходство участков геномов ЗЭЛ-подобного вируса У-62-33 (Удмуртия) с американским вирусом ЗЭЛ МакМиллан по 4-м генам (nsP2, С, Е2 и в области С-Е2), указывающее на общность их эволюционного происхождения.

5. Продемонстрирована возможность выявления рекомбинантных альфавирусов комбинацией методов ОТ-ПЦР, рестрикции и гибридизации при использовании в качестве генетических маркеров специфических олигонуклеотидных праймеров и зондов к РНК вирусов-родителей.

6. Обнаружено явление межвидовой рекомбинации альфавирусов ВЭЛ и ВКЛ при смешанной инфекции в культурах клеток ФЭК и Yero. Установлены закономерности накопления рекомбинантных вирусов и вирусов-родителей (в условиях естественной селекции и в присутствии антител) на протяжении нескольких пассажей: доминирование в популяции высокорепродуктивного вируса-родителя ВЭЛ, быстрое образование на его основе рекомбинантов в области генов структурных белков с измененными антигенными свойствами, вытеснение из популяции менее активного вируса ВКЛ.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Селиванова, Татьяна Константиновна, Москва

1. Агапов Е.В., С.Д. Лебедева, И.А. Разумов, И.В. Фролов,А.А. Колыхалов, В.Б. Локтев, C.B. Нетесов, Л.С. Сандахчиев.

2. Варианты вируса ВЭЛ, резистентные к нейтрализующему действию моноклональных антител. Докл. АН, т. 320, № 6, с. 1485-1488, 1991.

3. Бобков А.Ф., В.В. Покровский, Л.М. Селимова, Е.В. Казеннова, Н.Г. Карасева, H.H. Ладная, A.B. Кравченко, Р. Чейнгсон- Попов, Д.Вебер. Генотипирование и филогенетический анализ изолятов ВИЧ-1, циркулирующих в России. Вопр. вирусол., № 1, с. 13-16, 1997.

4. Волчков В.Е., Е.А. Волчкова, C.B. Нетесов. Полная нуклеотидная последовательность генома вируса Восточного энцефаломиелита лошадей. Молекул, генетика, № 5, с. 8-15, 1991.

5. Глухов А.И., С.А. Гордеев, Л.В. Аврамова, В.И. Киселев, Е.С. Северин. Детекция инфекционных агентов вирусной и бактериальной этиологии методом ПЦР. Клиническая лабораторная диагностика, № 1, с. 32-38, 1996.

6. Григорьев В.Б. Особенности структуры ряда вирусов человека и животных, определенные криогенными и иммуноцитихимическими методами электронной микроскопии, Автореф. докт. дис., 1993.

7. Деконенко А.Е., Е. Ткаченко, Г. Липская, Т. Дзагурова, А. Иванов, Л.Иванов и др. Генетическая дифференциация хантавирусов с помощью ПЦР и секвенирования. Вопр. вирусол., № 1, с. 24-27, 1996.

8. Ильенко В.И., A.A. Смородинцев. Выделение нового вируса из группы А на территории Советского Союза. В кн. "Арбовирусы, передаваемые комарами". Труды Института полиомиелита и вирусных энцефалитов. М., т. 13, с. 23-28, 1969.

9. Ионова К.С. Вирус Карельской лихорадки (биологические свойства, моноклональные антитела, экспериментальные подходы к диагностике). Диссертация канд. биол. наук., 1992.

10. Киселев О. Генетическая инженерия иммуномодуляторов и вакцинных препаратов. Л., с. 56-65, 1988.

11. Лебедев А.Ю. Анализ первичной структуры генома альфавирусов серокомплекса Синдбис-ЗЭЛ. Автореф. канд. дис., 1996.

12. Левкович E.H. Биологическая и иммунологическая характеристика комариных арбовирусов. Труды Института полиомиелита и вирусных энцефалитов. М., т. 13, с. 41-53,1969.

13. Либикова Н. Природная очаговость северо-американского лошадиного энцефалита западного типа (WEE) в Чехословакии. Acta virologica, т. 1, с. 93-102, 1957.

14. Львов Д.К., Т.М. Скворцова, Н.Г. Кондрашова и др. Этиология Карельской лихорадки, новая арбовирусная инфекция. Вопр. вирусол., N 6, с. 690-692, 1982.

15. Львов Д.К., Т.М. Скворцова, В. Л. Громашевский, Л.К. Березина,

16. В.И. Яковлев, Б.В.Гущин, В.А. Аристова, Г.А. Сидорова, Е.А. Гущина, Ç.M. Клименко, С.Д. Львов, Н.В. Хуторецкая, И.А. Мясникова, Т.М. Хижнякова. Изоляция возбудителя Карельской лихорадки от комаров Aedes sp. Вопр. вирусол., N 3, с. 311-315, 1985.

17. Львов Д.К., С.М. Клименко, С.Я. Гайдамович. Арбовирусы и арбовирусные инфекции.-М., "Медицина" с. 7-49, 1989.

18. Львов Д.К., С. Миширо, H.A. Селиванов, Е.И. Самохвалов Распространение генотипов вируса гепатита С, циркулирующих на территориях Северо- Западной и Центральной частей России. Вопр. вирусол., N 6, с. 251-253, 1995.

19. Маныкин A.A. Исследование структуры вирусных нуклеиновых кислот и нуклеопротеидов методом электронной микроскопии. Автореф. докт. дис., 1993.

20. Нетесов C.B. Генно-инженерные исследования геномов РНК-содержащих вирусов. Автореф. докт. дис., 1992.

21. Радюк С.Н., Мацевич Г.Р., Анджапаридзе О.Г. Полимеразная цепная реакция в диагностике и прогнозе ВИЧ- инфекции. Вопр. вирусол. N 3, с. 98-101, 1994.

22. Соколова Т.М., Т.К. Селиванова, А.Ю. Лебедев, Н.С. Быстров,

23. В.Л. Громашевский, H.A. Парасюк, К.С. Ионова, Л.В. Урываев. Сходство и различие вирусов западного энцефаломиелита лошадей по генам неструктурного белка nsP2 и структурных белков С и Е2. Вопр. вирусол., N5, с. 209-213, 1996.

24. Урываев Л.В., H.A. Парасюк, К.С. Ионова, Т.Г. Михеева, А.Ю. Злобин, Т.М. Скворцова, Э.Е. Мельникова, О.П. Глущенко, Д.К. Львов. Моноклональные антитела к вирусу Карельской лихорадки. Вопр. вирусол., N 4, с. 322-326, 1990.

25. Урываев Л.В. Репродукция альфавирусов. Диссертация докт. мед. наук, 1991.

26. Урываев Л.В., В.А. Василенко, H.A. Парасюк, К.С. Ионова, Е.А. Гущина,A.A. Куллатяре, Э. Ленбах, Д.К. Львов. Выделение и идентификация вируса Синдбис от перелетных птиц Эстонии. Вопр. вирусол., N 1, с. 67-70, 1992.

27. Урываев Л.В., А.Ю. Лебедев, Т.М. Соколова, В.П. Юферов. Первичная структура гена С и кодируемого им белка нуклеокапсида у вируса Западного энцефаломиелита лошадей. Докл.РАН, т. 344, N 3, с. 397-401,1995.

28. Урываев Л.В., H.A. Петров, Т.М. Соколова, Е.И. Самохвалов, А.Ю. Лебедев,Т.К. Селиванова, H.A. Парасюк, К.С. Ионова, A.A. Гринев. Анализ первичной структуры участков генома вируса Карельской лихорадки. Вопр. вирусол., N 5, с. 198-202, 1995.

29. Фролов И.В., A.A. Колыхалов, В.Е. Волчков, C.B. Нетесов, Л.С.

30. Сандахчиев. Сравнение аминокислотных последовательностей структурных белков аттенуированных и патогенных штаммов вируса Венесуэльского энцефаломиелита лошадей. Докл. АН СССР, т. 318, N 6, с. 1488-1491, 1991.

31. Шипулина О.Ю., Шахгильдян В.И., Шипулин Г.А., Кравченко А.В., Серебровская JI.B., Покровский В.В. Полимеразная цепная реакция в диагностике ЦМВ у ВИЧ-инфицированных пациентов. Вопр. вирусол., N 2, с. 91-95, 1998.

32. Щербатых П.Я. Инфекционный энцефаломиелит лошадей в СССР. В кн.: Вирусные болезни животных. М., 1963.

33. Юферов В.П. Анализ первичной структуры индивидуальных генов РНК-содержащих вирусов. Автореф. докт. дис., М., 1991.

34. Bachmair A., A. Varshavasky. The degradation signal in a short-lived protein. Cell, v. 56, p. 1019-1032, 1989.

35. Barth B.U., M. Suomalainen, P. Liljestrom, H. Garoff. Alphavirus assembly and entry: role of the cytoplasmic tail of the El spike subunit. J. Virol., v. 66, p. 7560-7564, 1992.

36. Barrett A.D.T., W.D. Cubitt, N.J. Dimmock. Defective interfering particles of Semliki Forest virus are smaller than particles of standard virus. J. Gen. Virol., v. 65, p. 2265-2268, 1984.

37. Barton D.J., S.G. Sawicki, D.L. Sawicki. Solubilization and immunoprecipitation of alphavirus replication complexes. J. Virol., v. 65, p. 1496-1506, 1991.

38. Braakman I., J. Helenius, A. Helenius. Role of ATP and disulphide bonds during protein folding in the endoplasmic reticulum. Nature, v. 356, p. 260262, 1992.

39. Bujarski J.J. and P.D. Nagy. Different mechanisms of homologous and nonhomologous recombination in brome mosaic virus: role of RNA sequences and replicase proteins. Semin. Virol., N 7, p. 363-372, 1996.

40. Bujarski J.J., and A.M. Dzianoff. Generation and analysis of nonhomologous RNA-RNA recombinants in brome mosaic virus: sequense complementarities at crossover sites. J. Virol., v. 65, p. 4153-4159, 1991.

41. Biotechnology Catalog, Perkin Elmer Cetus, 1991.

42. Calisher C.H., N. Karabatsos. Arbovirus serogroups: Definition and geographic distribution. In "The Arboviruses: Epidemiology and ecology" ed. Monath T.P. CRC Press, Baca Raton, FL., p. 19-57, 1988.

43. Calisher C.H. Medically important arboviruses of the United States and Canada. Clin. Microbiol. Rev., v. 7, p. 89-116, 1994.

44. Chanas A.S., E.A. Gould, J.C.A. Clegg, M.G.R. Varma. Monoclonal antibodies to Sindbis virus glycoprotein El can neutralize, enhance infectivity and independently inhibit haemagglutination or haemolysis. J. Gen. Virol., v. 32, p. 295-300, 1982.

45. Chetverin A.B., Chetverina H.V., Demidenko A.A., Ugarov V.I. Nongomologous RNA recombination in a cell-free system: evidence for atransesterification mechanism guided by secondary structure. Cell, v. 88, p. SOS-SB. c

46. Choi H.K., L. Tong, W. Minor, P. Dumas, U. Boege, M.G. Rossman, G. Wengler. Structure of Sindbis virus core protein reveals a chymotripsin-like serine proteinase and the organization of the virion. Nature, v. 354, p. 37-43, 1991.

47. Chomczyncki P., N. Sacci. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem., v. 162, p. 156-159, 1987.

48. Chumakov K.M. PCR engineering of viral quasi-species: A new method to preserve and manipulate genetic diversity of RNA virus populations. J. Virol, v. 70, p. 7331-7334, 1996.

49. Cilnis M.J., Kang W. a. Weaver S.C. Genetikc Conservation of Highlands J Viruses. Virolog. v. 218, p. 343-351, 1996.

50. Collier N.C., S.P. Adams, H. Weingarten, S. Schlesinger. Inhibition of enveloped RNA virus formation by peptides corresponding to glycoprotein sequences. Antiviral. Chem. Chemother., v. 3, p. 31-36, 1992.

51. Ding M. a. M.G. Schlesinger. Evidence that Sindbis virus nsP2 is an autoprotease which processes the virus nonstructural polyprotein. Virology, v. 171, p. 280-294, 1989.

52. Doms W., R.A. Lamb, J.K. Rose, A. Helenius. Folding and assembly viral membrane proteins. Virology, v. 193, p. 545-562, 1993.

53. Dominguez G., C.Y. Wang, T.K. Frey. Sequence of the genome RNA of Rubella Virus: Evidence for genetic rearrangment during Togavirus evolution. Virology, v. 177, p. 225-238, 1990.

54. Dubuisson J., C.M. Rice. Sindbis virus attachment: isolation and characterization of mutants with impairewd binding to vertebrate cells. J. Virol., v. 67, p. 3363-3374, 1993.

55. Duggal R., Cuconati A., Gromeier M. a. Wimmer E. Genetic recombination of poliovirus in a cell-free system. Proc. Nat. Acad. Sei., v. 94, p. 13786-13791, 1997.

56. Duggal R. and E. Wimmer. Genetic recombination of Poliovirus in Vitro and in Vivo: temperature- dependent alteration of crossover sites. Virology, v. 258, p.30-41, 1999.

57. Eldadah Z.A., Asher D.M., Godee M.S. et. al. Detection of Flaviviruses by Reverse- Transcriptase PCR. J. of Med. Virol, v. 33, p. 260-267, 1991.

58. Frolov L., S. Schlesinger. A comparision of the effects of Sindbis virus and Sindbis virus replicons on host cell protein synthesis and cytopathogenicity in BHK cells. J. Virol., v. 68, p. 1721-1727, 1994.

59. Gaedigk-Nitschko K., M.J. Schlesinger. The Sindbis virus 6K protein can be de-tected in virions and is acylated with fatty acid. Virology, v. 175, p. 274281, 1990.

60. GaroffH., K. Simons. Location of the spikes glycoproteins in the Semliki Forest virus membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 71, p. 3988-3992, 1974.

61. GaroffH., K. Simons, B. Dobberstain. Assembly of the Semliki Forest virus membrane glycoproteins in the membrane of the endoplasmic reticulum in vitro. J. Mol. Biol., v. 124, p. 587-600, 1978.

62. GaroffH., A,M. Frischauf, K. Simons, H. Lehrach, H. Delius. Nucleotide sequence of cDNA coding for SFV membrane glycoproteins. Nature, v. 288, p. 231- 241, 1980.

63. GaroffH., D. Huylebroeck, A. Robinson, U. Tillman, P. Liljestrom. The signal sequence of the p62 protein of Semliki Forest virus is involved in initiation but not in completing chain translocation. J. Cell. Biol., v. 111, p. 867-876, 1990.

64. Gibbs E.P.J, a. Tsai T.F. Eastern encephalitis. Handbook of Zoonoses, Viral. CRC Press, p. 11-24, 1994.

65. Gorbalenya A.E., E.V. Koonin, A.P. Donchenko, V.M. Blinov. A novel superfamily of NTP-binding motif containing proteins which are probably involved in duplex unwimding in DNA replication and recombination. FEBS lett., v. 235, p. 16- 24, 1988.

66. Hahn C.S., S. Lustig, E.G. Strauss et al. Western equine encephalitis virus is a recombinant virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 85, p. 5997- 6001, 1988.

67. Hahn Y.S., C.M. Rice, E.G. Strauss, E.M. Lenches, J.H. Strauss. Sindbis virus tsl03 has a mutation in glycoprotein E2 that leads to defective assembly of virions. J. Virol., v. 63, p. 3459-3465, 1989b.

68. Hahn Y.S., E.G. Strauss, J.H. Strauss. Mapping of RNA temperature-sensitive mutants of Sindbis virus: assigment of complementation groups A,B and G to nonstructural proteins. J. Virology, v. 63, 3142-3150, 1989c.

69. HahnY.S., J.H.Strauss. Site-directed mutagenesis of the proposed catalytic amino acids of the Sindbis virus capsid protein autoprotease. J. Virol., v. 64, p. 3069 3073, 1990.

70. HardyW.R. a. J.H. Strauss. Processing the nonstructural polyproteins of Sindbis virus : nonstructural proteinase is in the C-terminal half of nsP2 andfunctional both in cis and in trans. J. Virol., v. 63, p. 4653-4664, 1989.

71. Harrison S.C., S. Schlesinger, M.J. Schlesinger, R.K. Strong. Crystallization of Sindbis virus and its nucleocapsid. J. Mol. Biol., v. 226, p. 277-280, 1992.

72. Hefti E., D.H.L. Bishop, D.T. Dubin, V. Stollar. 5'-nucleotide sequence of Sindbis viral RNA. J. Virol., v. 17, p. 149-159, 1976.

73. Jarvis T.C., and K. Kirkegaard. Poliovirus RNA recombination: mtchanistic studies in the absence of selection. EMBOJ., v. 11, p. 3135-3145, 1992.

74. Ivanova L., M.J. Schlesinger. Site-directed mutations in the Sindbis virus E2 glycoprotein identify palmytoylation sites and affect virus budding. J. Virol., v. 67, p. 2546-2551, 1993.

75. Justman J., M.R. Klimjack, M. Kielian. Role of spike protein conformational changes in fusion of Semliki Forest virus. J. Virol., v. 67, p. 7579-7607, 1993.

76. Jversen J.O. Western equine encephalomyelitis. Handbook of Zoonoses: Viral., 1994.

77. Kail M., M. Hollinshead, W. Ansorge, R. Pepperkok, R. Frank, G. Griffiths, D. Vaux. The cytoplasmic domain of alphavirus E2 glycoprotein contains a short linear recognition site required for viral budding. EMBO, v. 10, p. 2343-2351, 1991.

78. Kaneko S., R.H. Miller. Characterization of primers for optimal amplification of hepatitis B virus DNA in the polymerase chain reaction assay. J. Virol. Meth., v. 29, p. 225 230, 1990.

79. Kinney R.M., B.J.B. Johnson, J.B. Welch et al. The full-length nucleotide sequences of the virulent Trinidad Donkey strain of VEE virus and its attenuated derivative, strain TC- 83. Virology, v. 170, p. 19-30, 1989.

80. Kirkegaard K., and D. Baltimore. The mechanism of RNA recombination in poliovirus. Cell, v. 47, N3, p. 433-443, 1986.

81. Kottier S.A., D. Cavanagh, and P. Britton. Experimental evidence ofrecombination in Coronavirus infectious bronchitis virus. Virology, v. 213, p. 569-580, 1995.

82. Kuhn R.J., Z. Hong, J.H. Strauss. Mutagenesis of the 3-nontranslated region of indbis virus RNA. J. Virol., v. 64, p. 1465-1476, 1990.

83. Lai M.M.C. Recombination in large RNA viruses: coronaviruses. Semin. Virol., N7, p. 381-388, 1996.

84. Lai M.M. C. RNA Recombination in animal and plant viruses. Microbiol. Rev. , v. 56, N1, p. 61-79, 1992.

85. Larzul D., D. Chevrier, V. Thiers, J.-L. Guesdon. An automatic modified polimerase chain reaction procedure for hepatitis B virus DNA detection. J. Vir. Meth., v. 27, p. 49-60, 1990.

86. Lee H., D.T. Brown. Mutations in an exposed domain of Sindbis virus capsid protein result in the production of noninfectious virions and morphological variants.- Virology, v. 202, p. 390-400, 1994.

87. Lemm J.A., A. Bergqvist, C.M. Read and C.M. Rice. Template- dependent initiation of Sindbis virus RNA replication in vitro. J. of Virol., v. 72, p. 6546-6553, 1998.

88. Levin B., D.E. Griffin. Molecular analysis of neurovirulent strains of Sindbis virus that evolve during persistent infection of scid mice. J. Virol., v. 67, p. 6872-6875, 1993.

89. Levis R., B. Weiss, M. Tsiang, H. Huang, S. Schlesinger. Deletion mapping of Sindbis virus DI RNAs derived from c DNA defines the sequences essential for replication and packaging. Cell, v. 44, p. 137-145, 1986.

90. Lewis J., S. L. Wesselingh, D.E. Griffin a. J.M.Hardwick. Alphavirus-Induced Apoptosis in Mouse Brains Correlates with Neurovirulence. J. Virol., v. 70, N3, p. 1828-1835, 1996.

91. Li G., C.M. Rice. Mutagenesis of the in-frame opal termination codon preceding nsP4 of Sindbis virus: studies of translation readthrough and its effect on virus replication. J. Virol., v. 63, p. 1326-1337, 1989.

92. Li G., M.W.L. Starza, W.R. Hardy, J.H. Strauss, C.M. Rice. Phosphorylation of Sindbis virus nsP3 in vivo and in vitro. Virology, v. 179, p. 416-427, 1990.

93. Liljestrom P., H. Garoff. Internally located cleavable signal sequences direct the formation of Semliki Forest virus membrane proteins from a polyprotein precursor. J. Virol., v. 65, p. 147 154, 1991.

94. Lobigs M., H. Garoff. Fusion function of the Semliki Forest virus spike isactivated by proteolytic cleavage of the envelope glycoprotein precursor p62. J. Virol., v. 64, p. 1233-1240, 1990.

95. Lopez S., J.C. Yao, R.J. Kuhn, E.G. Strauss, J.R. Strauss. Nucleocapsid-glycoprotein interactions required for assembly of alphaviruses. J. Virol., v. 68, p. 1316-1323, 1994.

96. Maniatis T., E.F. Fritsch, J. Sambrook. Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratori, p. 324- 327, 1982.

97. Mc Pherson, P. Qurke, J.R. Taylor. PCR. A Practical Approach. Lond.,1991.

98. Meyerhaus A., J.P. Vartanian and S. Wain-Hobson. DNA recombination during PCR. Nucleic. Acid Res., v. 18, p. 1687-1691, 1990.

99. Mi S., R. Durbin, H.V. Huang, C.M. Rice, V. Stollar. Association of Sindbis virus RNA methyltransferase activity with the nonstructural protein nsPl. Virology, v. 170, p. 385-391 , 1989.

100. Mi S., V. Stollar. Both an amino acid changes in nsPl of Sindbis virus LM21 contribute to and are required for efficient expression of the mutant phenotype. Virology, v. 178, p. 429-434, 1990.

101. Mi S., V. Stollar. Expression of Sindbis virus nsPl and methyltransferase activity in Eschrichia coli. Virology, v. 184, p. 423-427, 1991.

102. Monroe S. S. a. S. Schlesinger. RNAs of two independently isolated defective interfering particles of Sindbis virus contain a cellular tRNA sequence at their 5' ends. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 80, p. 3279 3283, 1983.

103. Monroe S.S., J.-H. Ou, C.M. Rice, S. Schlesinger, E.G. Strauss, and J.H. Strauss. Sequence analysis of c-DNAs derived from the RNA of Sindbis virions and of defective interfering particles. J. Virolog., v. 41, p. 153-162, 1982.

104. Monroy C.D. a. B.A. Webb. Detection of WEE virus in mosquitoes by PCR. Proc. New Jersey Mosq. Control Assoc., v. 8 , p. 103-111, 1994.

105. NagyP.D. a. A.E. Simon. New insights into the mechanisms of RNA recombination. Virology, v. 235, p. 1-9, 1997.

106. Netolitzki et. al. J. Gen. Virol., N 1, 2000.

107. Niesters H.G.M., J.H. Strauss. Defined mutations in the 5-nontranslated sequence of Sindbis virus RNA. J. Virol., v. 64, 4162 4168, 1990.

108. Niesters H.G.M., J.H. Strauss. Mutagenesis of the conserved 51-nucleotide region of Sindbis virus. J. Virol., v. 64, p. 1639-1647, 1990b.

109. Norder H., J.O. Lundstrom, Oto Kozuch, L.O. Magnins. Genetic Relatedness of Sindbis Virus. Strains from Europe, Middle East and Africa. Virol., v. 222, p. 440-445, 1996.

110. Olmsted R.A., W.J. Meyer, R.E. Johnston. Characterization of Sindbis virus epitopes important for penetration in cell culture and pathogenesis in animals. Virology, v. 148, p. 245-254, 1986.

111. Omar A., H. Koblet. The use of sulfite to study the mechanism of membrane fusion induced by El of Semliki Forest virus. Virology, v. 168, p. 177-179, 1989.

112. Ou J-H., C.M. Rice, L. Dalgarno, E.G. Strauss, J.H. Strauss. Sequencestudies of several alphavirus genomic RNAs in the region, containing the start of subgenomic RNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 79, p. 5235-5239, 1982b.

113. Pardigon N., E. Lemches, J.H. Strauss. Multiple binding sites for cellular proteins in the 3'-end of Sindbis alphavirus minus sense RNA. J. Virol., v.67, p. 5003-5011, 1993.

114. A PCR Protocols: A Guide to methods and Applications, ed. Junis, M.A. et. al., Academic Press, Ca, p. 129-141, 1990.

115. Pence D.F., N.L. Davis, R.E. Johnston. Antigenic and genetic characterization of Sindbis virus monoclonal antibody escape mutants which define a pathogenesis domain on glycoprotein E2. Virology, v. 175, p. 41-49, 1990.

116. Peranen J., K. Takkinen, N. Kalkkinen, L. Kaarianen. Semliki Forest virus-specific non-structural protein nsP3 is a phosphoprotein. J. Gen. Virol., v. 69, p. 2165-2178, 1988.

117. Peranen J., M. Rikkonen, P. Liljestrom, L. Kaariainen. Nuclear localization of Semliki Forest virus-specific nonstructural protein nsP2. J. Virol., v. 64, p. 1888- 1896, 1990.

118. Polo J.M., N.L. Davis, C.M. Rice, H.V. Huang, R.E. Johnston. Molecular analysis of S indbis virus pathogenesis in neonatal mice by using virus recombinants constructed in vitro. J. Virol., v. 62, p. 2124 2133, 1988.

119. Presley J.F., D.T. Brown. The proteolytic cleavage of pE2 to envelope glycoprotein E2 is not strictly required for the maturation of Sindbis virus. J. Virol., v. 63, p. 1975 1980, 1989.

120. Puthavathana P., Ho Wang Lee< C. Y. Kang. Typing of Hantaviruses from five continents by polimerase chain reaction. Vir. Res., v. 26, p. 1-14, 1992.

121. Raju R., S. V. Subramaniam, N. Hajjou. Genesis of SV by in vivo recombination of nonreplicative RNA precursors. J. of Virol., v. 12, p. 73917401, 1995.

122. Rentier-Delrue F., and N.A. Young. Genomic divergence among Sindbis virus strains. Virology, v. 106, p. 59-70, 1980.

123. Rice C.M., J.H. Strauss. Nucleotide sequence of the 26S mRNA of Sindbis virus and deduced sequence of the encoded virus structural proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 78, p. 2062-2066, 1981.

124. Rikkonen M., J. Peranen, L. Kaariainen. Nuclear and nucleolar targeting signals of Semliki forest virus nonstructural protein nsP2. Virology, v. 189, p. 462 473, 1992.

125. Rikkonen M., J. Peranen, L. Kaariainen. ATPase and GTPase activities associated with Semliki Forest virus nonstructural protein nsP2. J. Virol., v.68, p. 5804- 5810, 1994.

126. Robertson D. L., B.H. Hahn a. P.M. Sharp. Recombination in AIDS viruses. J. of Mol. Evol., v. 40, p. 249-259, 1995.

127. Rychlik W. a. Rhoads R.E. A computer program for choosing optimal oligonucleotides for filter hibridisation, sequencing and in vitro amplification of DNA. Nucl. Acids. Res., v. 17, p. 8543-8551, 1989.

128. Rumenaph J., E.G. Strauss, J.H. Strauss. Subgenomic mRNA of Aura Alpha-virus is packaged into virions. J. Virol., v. 68, p. 56-62, 1994.

129. Rumenaph J., E.G. Strauss, J.H. Strauss. Aura virus is a New World representative of Sindbis-like viruses. Virology, v. 208, p. 621-633, 1995.

130. Russel D.L., J.M.Dalrymple, R.E. Johnston. Sindbis virus mutations which coordinately affect glycoprotein processing, penetration and virulence in mice. J.Virol., v. 63, p. 1619 1629, 1989.

131. Samuel C.E. Antiviralactions of interferon. Interferon- regulated cellular proteins and their surprisingly selective antiviral activities. Virology, v. 183, p. 1-11, 1991.

132. Sawicki D.L., and S.G. Sawicki. Alphavirus positive and negative strand RNA synthesis and the role of the polyproteins in formation of viral replicationcomplexes. Arch. Virol. Suppl., v. 9, p. 393-405, 1994.

133. Sawicki D.L., S.G. Sawicki. A second nonstructural protein functions in the regulation of alphavirus negative strand RNA synthesis. J.Virol., v. 67, p. 3605- 3610, 1993.

134. Sawicki D.L., S.G. Sawicki. Functional analysis of the A complementation group mutants of Sindbis HR virus. Virology, v. 144, p. 20-34, 1985.

135. Scheidel L.M. a. V. Stollar. Mutations that confer resistance of mycophenolic acid ribovirin on Sindbis virus map to the nonstructural protein nsPl. Virology, v. 181 p. 490-499, 1991.

136. Schlesinger S., and M.J. Schlesinger. Replication of Togaviridae and Flaviviridae. In Fundamental Virology, 2-nd ed., Fields, B.N. and Knipe, D.M., Raven Press, New Jork, 453, 1990.

137. Schlesinger S., R. Levis, B.G. Weiss, M. Tsiang, H. Huang. Replication and packaging sequences in defective interfering RNAs of Sindbis virus. In

138. Positive-strand RNA viruses" eds. M.A.Brinton and R.Rueckert. Alan R.Liss, Inc., New York. p. 241 250, 1986.

139. Schmaljohn A.L., E.D.Johnson, D.E. Dalrymple, G.A.Cole. Nonneutralizing monoclonal antibodies can prevent lethal alphavirus encephalitis. Nature, v. 297, p. 70-72, 1982.

140. Shirako Y., B. Nicklasson, J.M. Dalrymple, E.G. Strauss, J.H. Strauss. Structure of the Ockelbo virus genome and its relationships to other Sindbis virus. Virology, v. 182, p. 753 764, 1991.

141. Simon A.E. and J.J. Bujarski. RNA-RNA recombination and evolution in virus infected plants. Ann. Rev. Phytopathol., v. 32, p. 337-362, 1994.

142. Spall V.E., M. Shanks, and G.P. Lomonossoff. Polyprotein processing as a strategy for gene expression in RNA viruses. Seminars in Virology, v. 8, N1, p. 15-24, 1997.

143. Strauss E.G., C.M. Rise, and J.H. Strauss. Complete nucleotide sequence of the genomic RNA of Sindbis virus. Virology, v. 133, p. 92-110, 1984.

144. Strauss E.G., J.H. Strauss. Structure and replication of alphavirus genome. In:"The Togaviridae and Flaviviridae" eds. S.Schlesinger and M.J.Schlesinger. Plenum Publishing Corp., New York. p. 35-90, 1986.

145. Strauss E.G., D.S. Stec, A.L. Schmaljohn, J.H. Strauss. Identification of antigénically important domains in the glycoproteins of Sindbis virus by analysis of antibody escape variants. J.Virol., v. 65, p. 4654 4664, 1991.

146. Strauss J.H. Recombination in the evolution of RNA viruses. In S.S. Morse (ed) Emerging viruses. Oxford University Press, New Jork, p. 241-251, 1993.

147. Strauss J.H., E.G.Strauss. The Alphaviruses: gene expression, replication and evolution. Microbiol.Reviews, v. 58, p. 491-562, 1994.

148. Strauss J.H. a. E.G. Strauss. Recombination in Alphaviruses. Seminars in Virology, v.8, p. 85-94, 1997.

149. Strizki J.M., P.M. Repik. Coupled PCR- restriction enzyme analysis for rapid identification of structural gene relationships among strains of eastern equine encefalitis virus. Virus. Res., v. 43, p. 69-75, 1996.

150. Stubbs M.J., A. Miller, P.J.H. Sizer, J.R. Stepenson, A.J. Crooks. X-ray solution scattering of Sindbis virus: changes in conformation induced at low pH. J. Mol. Biol., v. 221, p. 39-42, 1991.

151. Torrisi M.R., S. Bonatti. Immunocytochemical study of the partition and distribution of Sindbis virus glycoproteins in freeze fractured membranes of infected baby hamster kidney cells. J. Cell.Biol., v. 101, p. 300-306, 1985.

152. Trent D.W. and J. A. Grant. A comparison of New World alphaviruses in the Western equine encephalitis virus complex by immunochemical and oligonucleotide fingerprint techniques. J. Gen. Virol., v. 47, p. 261-282, 1980.

153. Tucker P. C., E. G. Strauss, R. J. Kuhn, J. N. Strauss, and D. E. Griffin. Viral determinants of age- dependent virulence of Sindbis virus for mice. J. Virol., v. 67, p. 4605-4610, 1993.

154. RNAs. Nucleic Acids Res., v. 20, p. 3375-3381, 1992.

155. Vilcek J. and G.C. Sen. Interferons and other cytokines. In " Fundamental Virology", p. 341-365, 1996. Lippincott-Raven Press. New Jork.

156. Vodkin M.N., McLaghlin G.L., J.F. Day, R.E. Shope, Novak R.J. A rapid diagnostic assay for eastern equine encephalomielitis viral RNA. Am. J. Trop. Med. Hyg. v. 49, p. 772-776, 1993.

157. Weaver S.C., W. Kang, Y. Shirako, T. Rumenapf, E.G. Strauss and J.H Strauss. Recombinational history and molecular evolution of Western equine encephalomyelitis complex Alphaviruses. J. Virol, v. 71, N1, p. 613-623, 1997.

158. Weaver S.C., Hagenbaugh, L.A. Bellew, L. Gousset, V. Mallampalli, J.J. Holland, T.W. Scott. Evolution of alphaviruses in the eastern equine encephalomyelitis complex. J. Virol., v. 68, p. 158-169, 1994.

159. Weaver S.C., T.W. Scott, and R. Rico-Hesse. Molecular evolution of Eastern eqyine encephalomyelitis virus in North America. Virology, v. 182, p. 774-784, 1991.

160. Weiss B.G., and S. Schlesinger. Recombination between Sindbis virus RNAs. J. Virol., v. 65, p. 4017-4025, 1991.

161. Weiss B.G., H. Nitschko, I. Ghattas, R. Wright S. Schlesinger. Evidence for specificity in the encapsidation of Sindbis virus RNAs. J. Virol., v. 63, p. 5310-5318, 1989.

162. Wengler G. The model of assembly of alphavirus cores implies a mechanism for the disassembly of the cores in the early stages of infection. Arch. Virol, v. 94, p.1-14, 1987.

163. Worobey M., E.C. Holmes. Evolutionary aspects of recombination in RNA viruses. J. Gen Virol., v. 80, p. 2535-2543, 1999.

164. Zhao H., H. Garoff. Role of cell surface spikes in alphavirus budding. J.Virol., v. 66, p. 7089-7095, 1992.1. РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕН^сызатсз