Вирус карельской лихорадки (биологические свойства, моноклональные антитела, экспериментальные подходы к диагностике)

Ионова, Кира Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Вирус карельской лихорадки (биологические свойства, моноклональные антитела, экспериментальные подходы к диагностике)
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Вирус карельской лихорадки (биологические свойства, моноклональные антитела, экспериментальные подходы к диагностике)"

3 1 ч 9 9 $

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ИНСТИТУТ ВИРУСОЛОГИИ им. Д. И. ИВАНОВСКОГО РАМН

На правах рукописи УДК 575.085; 578.833, 11; 57.083.33.

ИОНОВА Кира Сергеевна

ВИРУС КАРЕЛЬСКОЙ ЛИХОРАДКИ

(биологические свойства, моноклональные антитела, экспериментальные подходы к диагностике)

03.00.06 — Вирусология

Доклад, обобщающий опубликованные работы, на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1992

Работа выполнена в Институте вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН.

Директор Института — Академик РАМН, профессор

Д. К. Львов

Научный руководитель — доктор медицинских наук

Л. В. Урываев

Официальные оппоненты:

— доктор медицинских наук, профессор

Н. В. Логинова

— доктор биологических наук

В. В. Малиновская

Ведущее учреждение — Центральный институт усовершенствования врачей, кафедра вирусологии.

Защита диссертации состоится Сг~;____ 1992 года

в часов на заседании специализированного совета Д 001.20.02. при институте вирусологии им. Д. И. Ивановского АМН СССР по адресу: 123098, Москва, ул. Н. Ф. Гамалеи, 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института вирусологии им. Д. И. Ивановского АМН СССР.

Автореферат разослан ¥ вЖч^в}1992 года.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат медицинских наук

А. М. Жуковский

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

В 1981 - 82 гг на территории венноскандии ( Швеция, Финляндия, Карелия) была отмечена вспышка лихорадочного заболевания, сопровождающегося характерными симптомами: лихорадка, экзантема, суставные и мышечные боли. Болезнь начиналась остро с повышения температуры, познабливания. В ряде случаев имели место сильная головная боль, миалгия, слабость. Длительность лихорадки не превышала 3-4 дней. В течение 1-2 го дня заболевания появляется сыпь, которая носила везикулярный или геморрагический характер. Сыпь держалась от.,2 до 7 дней, но известны случаи сохранения сыпи до 3 недель. '.

Ведущим симптомом заболевания является отечность и резкая болезненость суставов, их ограниченная подвижность. Поражение суставов носили чаще множественный характер (полиартриты), с преимущественным поражением крупных суставов - голеностопных, лучезапястных, коленных, локтевых.

Заболевания со сходной клинической картиной описываются в этих регионах с середины 1960-х г. (М.Skogb, 1973г.). Большинство случаев этого заболевания наблюдались в лесных районах (мегеду 60° и 64° северной широты) в конце лета - начале осени. Новая нозологическая форма инфекционного заболевания была названа в нашей стране - карельская лихорадка, в Финляндии - болезнь Погоста, в Швеции - болезнь Окельбо (по названию местности).

После выделения вируса от комаров (родов Aedes communis, Culex, Culisetta), собранных в очагах инфекции, этиологическое значение этого изолята было . подтверждено-нарастанием титров антител к вирусу в парных сыворотках, собранных от переболевших.

Типичная для альфавирусов морфология вирирнов, биологические свойства и характер антигенных связей (в PH, РСК) с вирусами Синдбис и западного энцефаломиелита лошадей (ЗЭЛ) позволили авторам сделать заключение, что выделенный штамм LEIV-9298 является представителем антигенного комплекса Синдбис - ЗЭЛ и более близок к вирусу Синдбис.

Антигенный комплекс вирусов группы Синдбис - ЗЭЛ включает вирусы: ЗЭЛ, Синдбис, Форт Морган, Хайяендс Лжи, У-62, Вато-

- г -

роа, Кзыл-агач, Еабанки (С. Calisher et al,1988). К этой группе были отнесены вирусы карельской лихорадки (ЕКЛ) и Окельбо, выделенные во время вспышки инфекционного заболевания в начале 80-х гг в Скандинавии (Д. К. Львов и др. 1983, Во Nlk-lasson et al,1984).

Ранние серологические наблюдения показывают, что заболевания человека, вызываемые вирусом Синдбис. относительно редки (U. Skogh a A. Espmark, 1982, R. Tesh et al,1975). Одним из объяснений этого является тот факт, что основные переносчики вируса Синдбис питаются в основном на птицах, реже - на человеке. Поэтому вспышка Синдбис-подобного заболевания среди людей позволила Во Niklasson (1983,1984) высказать предположение, что ,„экология вируса Окельбо (и близкого к нему вируса ЕКЛ, Д. К. Львов и др. 1988г) может иметь специфические черты в Скандинавии. Вероятно, здесь может циркулировать более вирулентный штамм вируса или его переносчиком в этом регионе могут быть более антропофильные комары, или обе эти причины.

Высказанные соображения заставляют более подробно изучить биологические свойства вируса ВКЛ, его антигенную структуру и другие характеристики, сравнив с прототипным штаммом вируса Синдбис.

Типичный и наиболее хорошо изученный представитель альфави-русов - вирус Синдбис (ВС) и его варианты распространены на территории Африки в ее южных и северных регионах, в странах Ближнего Востока, южных регионах нашей страны (Азербайджан, Средняя Азия, Южное Поволжье, Западная Украина), ЧСФР, Италии, Зенноскандии (Швеция, Финляндия, Карелия), в странах юго-восточной Азии, Океании и Австралии. Данные о распространении адьфавирусов на территории страны были существенно дополнены и расширены экологическими исследованиями, выполнеными большим коллективом под руководством Д. К. Львова в 1974-1990. • Полученные данные указывают на возможность циркуляции Синдбис-подобных вирусов в более высоких широтах, в то время как раньше они встречались только в тропических странах.

• Основное значение в циркуляции вируса Синдбис имеют птицы и комары, хотя факты изоляций вируса иа клещей Hyalomma marginatum в Сицилии, Hyalomma anatolicum в Таджикистане, от лягушек з ЧСФР и Таджикистане, и от туркестанских крыс в Таджикистане говорят о шрокой экологической пластичности вируса

Заражение мышей /м типом AR-339 или AR -86 (интерцереб-рапьное иди периферическое) вызывает энцефалиты, а детальность зависит от возраста мышей (Reinolcfe et al 1971). После периферического заражения мышей в любом возрасте вирус Синдбис размножается в скелетной мускулатуре, продуцируя ви-ремию и вторичную инфекцию в мозгу с развитием менингита В лабораторных условиях получены штаммы как с ослабленной вирулентностью для мышей, так и штаммы с повышенной нейровиру-лентностыо даже для взрослых мышей ( Е.Griffin and В. Johnson, 1977, S.Lustig et al.1990).

Ранние серологические наблюдения показывают, что инфекция в определенных регионах мира широко распространена, но клинически выраженные проявления довольно редки (XI R.Taylor et-al 1955, R. L. Doherty 1977).

Несмотря на невыраженную картину заболевания человека при заражении вирусом Синдбис или карельской лихорадкой и практическое отсутствие летальных исходов и тяжелых острых форм инфекций, контагиозность этого вируса, возможность распространения с миграцией птиц, суставные осложнения при хроническом течении делает» эту инфекцию потенциально опасной для любой страны.

В ряде стран, где это заболевание является эндемичным, проводятся исследования по созданию различных диагностических методов и препаратов,а так же разработка вакцин и лечебных препаратов.

Таким образом, к началу нашей работы было известно, что заболевание карельской лихорадкой связано с вирусом, относящимся к альфавирусам и антигенно близким к вирусу Синдбис; более подробной характеристики ВКЛ проведено не было. Не была известна связь с другими представителями серокомплекса ВС-ЗЗЛ; недостаточно изучена репродуктивная активность вируса и особенности его размножения в различных клеточных культурах, что важно для характеристики биологических, признаков вируса; закономерности репликации и особенности структурной организации вирионов ВКЛ. Несмотря на то , что структурные эпитопы вируса ВС были изучены довольно хорошо, моноклональные антитела (МКА) к вирусу ВС были практически недоступны, а потому требовалось получение МКА к ВКЛ; не существовало методов диагностики ВКЛ инфекции.

Настоящая работа выполнена по плану научных исследований

Института вирусологии им. Д И. Ивановского РАМН и тематики Проблемной комиссии "Арбовирусы".

Цели и задачи исспедоданкя. Целью настоящего исследования было: сравнительное изучение биологических свойств вируса ВКЛ (штамм LEIV-9298) и прототшшого штамма вируса Синдбис (Eg AR 339); получение моноклональных антител к вирусу ВКЛ; разработка методов выявления антител к ВКЛ для целей индикации этой инфекции.

Для выполнения поставленной цели в процесе работы решали следующие задачи:

- сравнительный анализ накопления ВКЛ в различных клеточных культурах и оценка продуктивности ВКЛ при разных способах культивирования с целью получения препаративных количеств вируса;

- клонирование вируса карельской лихорадки, селекция быет-ропроникаицего в клетку вируса и анализ их бляшечного фенотипа;

- сравнительный анализ иммуно-химических свойств ВКЛ (штамм LE1V-9298) и прототипного штамма вируса Синдбис Eg AR-339; а также предварительная характеристика трех штаммов альфавиру-сов (1381, 1383, Ф-720 Ар), выделенных от перелетных птиц на территории Эстонии и Армении;

- получение клеточных гибридом, продуцирующих моноклональньк антитела к вирусу карельской лихорадки и характеристика их биологических свойств;

- отработка выявления антител ВКЛ в сыворотках' крови человека методом иммуноферментного анализа и исследование сывороток, собранных в эндемичных районах Карелии;

- разработка метода агглютинации сенсибилизированных вирусным антигеном латексных частиц для выявления антител к нему.

Научная новизна. Изучены биологические закономерности репродукции ВКЛ в культуре ткани (уровни накопления и цитопато-генность вируса в различных клеточных культурах, S-признак, термочувствительность) и получен адаптированный к клеткам фибробластов эмбрионов кур (Í8K) и Vero продуктивный штамы ВКЛ со сниженной патогенностью для мышей. Установлено, что ВКЛ эффективно размножается в первично-трипсинизированных и перевиваемых клетках: «ЭК, ЛЭЧ. ФЗЧ, Vero, ВНК-21, СПЭВ, уровни продукции 2-BxlO5 БОЕ/кл.-, аналогично другим альфави-

русам. Продемонстрирована низкая чувствительность клеток лимфобластоидного ряда к ВКЛ (уровни продукции 60-200 ЕОЕ/кл.)

Показана возможность развития острой цитоцидной инфекции в перевиваемых клетках насекомых, зараженных ВНЛ-9298, в отличие от хронического течения инфекции в тех же клетках, инфицированных вирусами Синдбис, штамм Ев А!?-339-БУ, венесуэльского энцефаломиелита лошадей (БЭЛ-230), ЗЭЛ (пггамм 56-14). Показано изменение фенотипа вируса ВКЛ-9298 (Б- и Ьэ-признака) при последовательных пассажах в клетках А. аИэорюик (6с1).

Выявленные нами разные исходы вэаимодействия"БКЛ-(ВС)-клетка" в зависимости от штамма вируса и типа клеток обеспечивает удобную модель для изучения механизмов гибели клетки.

Впервые описано выделение двух изолятов альфавирусов от перелетных птиц в Прибалтике (гаги БотаЬепа тоШввИпа), которые на основании серологического анализа отнесены к серова-рианту вируса Синдбис.

Получены серии клеточных гибридом, продуцирующих монокло-нальные антитела к вирусу ВКЛ (14 гибридом) и изучены биологические свойства продуцируемых ими моноклональных антител. Среди продуцируемых шестью гибридомами моноклональных антител к белкам оболочки ВКЛ (четыре к белку Е-1, две - к белку Е-2) выявлены моноклинальные антитела с выраженной антигемагглюти-нирующей активностью и нейтрализующей инфекциоиность активностью, а также МКА, дифференцирующие отдельно изученные представители серокомплекса Синдбис-ЗЭЛ в реакциях РТГА и НЙФМ.

Показано, что изолят ЬЕ1У-9298 ВКЛ и вирус Синдбис (прото-типный штамм АЯ-339 ) не дифференцируются в иммунохимичес-ких реакциях с поливалентными сыворотками, однако различаются с помощью авторских МКА (Карел-34) в РТГА и НИШ. Изоляты альфавирусов 1381 и 1383 рассматриваются как варианты вируса Синдбис, более близкие проготипному штамму ВС, чем к ВКЛ в реакциях с монокпональными антителами.

На основании выявленных особенностей (размножение в перевиваемых культурах, реакция с МКА) и сходства основных физико-химических характеристик белков вириона с прототипным штаммом вируса Синдбис, вирус ВКЛ был расценен как локальный, северный, зоогеографический вариант вируса Синдбис.

Широкое распространение инфекции ВКЛ на территории Карелии подтверждено данными о высоком проценте положительных реакций

среди обследованных (с помощью ИФА) сывороток человека, собранных б эндемичных районах. Наиболее высокие титры антител отмечены у лиц, в анамнезе которых присутствовали лихорадки и суставные заболевания, что подтверждает ранние наблюдения (Д. К. Львов и др. ,1989; Т. М. Скворцова и др. ,1989.) о частых суставных осложнениях после перенесенной инфекции.

Основные положения, вии ¡oci2.fi» на зациту.

- Вирус ВКЛ (штамм ЦПУ-9298) и авторские иэоляты адьфави-русов 1381 и 1383 относятся к серокомплексу Сикдбис-ЗЗЛ и являются вариантами вируса Синдбис. ВКЛ обладает сходными с прототипным штаммом Ег АЯ-339 биологическими, иммунохимичес-кими и физико-химическими свойствами, однако имеет и черты отличия. Он вызывает острую инфекцию в перевиваемых клетках А. аИхрюЬив, в структуре белков его оболочки обнаружен домен, обеспечивающий возможность его дифференциации от прото-типного штамма вируса Синдбис и вируса ЗЗД с помошыо монокло-нальных антител. Последовательное клонирование быстропроника-одего вируса ВКЛ приводит к изменению бляшечного фенотипа и снижению патогенности дня лабораторных животных, что может быть использовано для получения аттенуированных штаммов вируса

- Ма но«локальные антитела к вирусу ВКЛ и характеристика их биологических свойств: разные уровни активности четырех МКА к ВКЛ в реакциях РН, РТГА, НИФМ, а также их специфичность по отношению к белкам оболочки вириона ВЯЛ (Е-1 или

Е-2) определятся их индивидуальной направленностью к различным антигенным эпитопам ВКЛ. Гибридома серии "Ка-рел-34" обладает высокой продуктивностью специфических МКА, пригодных для дифференциации вирусов внутри серокомллекса Синдбис-ЗЭЛ (иташьг 1381 и 1383 и Ф-720 Ар) наиболее близки к прототипному штамму Ее АЯ-339, а ЬЕ1У-9298 расценивается как северный локальный воогеографический вариант вируса Синдбис).

- Полученные высокопродуктивный аттенуированный перспективный штамм ВКЛ и моноклонадьные антитела к ВКЛ являются исходными компонентами для создания диагностических тест-систем. Разработанные на их основе методы иммуноферментного анализа

и агглютинации окрашенных полимерных (на акролеиновой основе) частиц обеспечивают возможность высокочувствительного выявления маркеров ВКЛ и ВС инфекции. Методом ИФА выявлен высокий процент положительных реакций в сыворотках, собранных в эпидемических районах Карелии.

Практическая ценность.

- Выделены два иэолята апьфавирусов 1381 и 1383, которые расцениваются 1сак тождественные и отнесены к варианту вируса Синдбис. Изоляг 1383 депонирован в Государственной коллекции вирусных штаммов в Институте вирусологии им. Д. Л Ивановского РАМН (зав. лаб., проф. Л. Л. Фадеева).

- Получен высокопродуктивный аттенуированяый вариант ВКЛ,обеспечивающий возможность получения препаративных количеств вируса для создания диагностических тест-систем.

- Авторские гибридомы,к вирусу ВКЛ, обеспечивающие стабиль- . ную продукцию моноклональных антител к струютурным белкам оболочки вириона, являются источником получения реагентов (антител) для создания и совершенствования методов диагностики на их основе и загаданы авторским свидетельством N 1522582 от 1989г. на изобретение "Штамм гибридных культивируемых клеток животных "Карел"- продуцент моноклональных антител к ви- ' русу карельской лихорадки".

- Проведены экспериментальные исследования по разработке метода агглютинации сенсибилизированных латексных частиц, который служит основой для создания простого, специфического и эффективного способа анализа маркеров ВКЛ инфекции.

Публикация работ. Основные подозрения диссертации отражены в 11 опубликованных научных работах, в том числе двух авторских свидетельствах.

Апробация работы Результаты исследований были представлены и обсуждены на научной конференции "Арбовирусы", Таллинн, 1984; Межинститутской научной конференции "Актуальные вопросы разработки медицинских иммунобиологических препаратов", Томск, 1986; Международном симпозиуме "Арбовирусы и арбови-русные инфекции", Москва, 1989; Республиканской конференции "Новые методы диагностики СПИД, других вирусных и бактериальных инфекций и противоэпидемической службы", Алушта, 1990;

Международной конференции'" Медицинская Сиотехнология, иммунизация и СПИД", Ленинград, 1991; на' заседании Совета по предварительной экспертизе диссертационных работ Института вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН в июле 1991.

Автор выражает благодарность за продуктивное сотрудничество научным сотрудникам Института вирусологии: К А. Параскк, Г. М. Скворцовой, Е. А. Гущиной, Т. Г. Шхеевой, А. Ю. ЗлоОину; сотрудникам НИИ профилактической медицины Эстонии: В. А. Василенко, А. А.Д5уллапере; сотруднику ИБХ Е Е Лукину, совместно с которыми. выполнялись отдельные разделы работы.

Ообстаонныэ ксслодовашга Ua-ге риал и методы

Вирусы. В работе были использованы следующие вирусы и приготовленные ив них антигена

- Вирус карельской лихорадки, штамм LEIV-9298, был получен от д-ра Е Л. Громашевского.

- Вирус Синдбис, штамм Eg AR-339, получен от проф. С. Я Гай-дамович

- Вирус Синдбис, штамм 138Í и штамм 1383 был выделен иа мозга больных птиц. Выделение описано в разделе 1.

- Изолят Спи дат- подобного вируса, штамм Ф-720 Ар был выделен от египетской цапли (Bubulcus ibis) и любезно предоставлен д-póM Закаряном к А.

- Вирус венесуэльского энцефаломиелита лошадей, пггамм ВЭЛ-

230

- Вирус вападного энцефаломиелита лошадей, штамм 56-14 и штамм California

- Вирус восточного энцефаломиелита лошадей, штамм Virginia

- Вирус леса Секлжи.

- Вирус Мукамбо.

- Вирус Чикунгуиья.

Все вирусные аяткгены были- ииактик црованы обработкой

- 9 -

0,27. бета-пропиолактоном.

Инфекционную активность вирусов определяли методом бляшек в монослое клеток куриных фябробласгов, ВНК-21 или Vero под агаровым покрытием. Титры вирусов в реакции гемагглютинации (РГА) определяли по стандартной методике (С. Я. Гайдамо-вич,1978). Клонирование ( для поддержания генетической однородности) альфавирусов осуществляли путем последовательного отбора однородных по величине бляшек, материал из которых использовали для размножения и последующего определения инфек-ционности и гемагглютинирующей активности. Патогенность вирусов для мышей разных возрастных групп определяли путем внутри-мозгового или периферического введения вируса по общепринятой методике (ЕЯ. Цилинский и др. ,1983). Все вирусы были получены через Государственную Коллекцию вирусных штаммов (зав. лаб. музейных штаммов проф. Л Л Фадеева) Института вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН.

Пдслга. В работе были использованы первично-трипсинизиро-ванные клетки куриных фибробластов (ФЭК), перевиваемые клетки: ВНК-21 (почки сирийского хомяка), Vero (почки зеленой мартышки); клетки насекомых Aedes alboplctus (клон С 6/36); лимфобластоидные клетки U-937 (моноциты), ОТ-4 и Н-9 ( лимфо-идные); мышиная миеломная клеточная линия NS-0. Клетки А. alboplctus получены из Института полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН (лаб. проф. С. IL Чунихина). Остальные использованные клеточные линии получены из Коллекции перевиваемых клеточных линий Института вирусологии (зав. лаб. докт. мед. наук Р. Я Подчерняева).

Перевиваемые и первично-трипеинизированные клетки культивировали в атмосфере СОг при температуре 37 С, клетки A. albopictus (клон С б/Зб) - при температуре 26 С.

Яшютиые. В работе использовали иммунизированных мышей Balb/c весом 18-20гр. как доноров иммунных спленоцитов и новорожденных беспородных мышей для определения инфекционности вирусов, а также белых крыс, морских свинок и кроликов для получения гипериммунных сывороток. Иммунные асцитические жидкости (ИАЖ) к вирусам получали по общепринятым методикам.

Получение гибридом. Гибридомы получали методом, разработанным G.Kohler и С. Mt lsteín (1975-76) в модификации (А.С. Новохатский, 1986; Т. Г. Михеевой, 1988). Иммунизацию мы-

шей линии Balb/c проводили по методике С. Я. Гайдамович (1986), А. А. Кущ (1987,1988) в модификации. Спленоциты иммунных мышей сливали с клетками мышиной миеломы NS-0. В качестве сливающего агента использовали Б0£ раствор полиэтиленгликоля (м. в. 4000). Для отбора позитивных гибридом использовали методы непрямой иммунофлюоресценции (ЩфМ) и иммуноферментного анализа (ИФА).

Излученные гибридомы клонировали методом предельных разведений на слое клеток-"кормилок", которыми служили спленоциты или макрофаги неиммунных мышей Balb/c. Гибридные клетки культивировали в среде Игла, в модификации Дальбекко с ■ 15% сыворотки эмбриона теленка (ТЭС), 4г/л глюкозы, 2мМ глю-тамина и 50цкг/мл гентамицина. 2-3 раза в неделю клетки пересевали с кратностью 1:3-1:4. Наиболее продуктивные гибридомы использовали для получения иммунной асцитической жидкости (ИАЖ). Для этого мытам линии Balb/c, предварительно сенсибилизированным за 7-10 суток введением внутрибрюшинно 0,3-0,5 мл адъюванта "Пристан" (Dlfco), инокулировали в брюшную полость 8-12x10 клеток. По мере образования асцита, обычно на 12-15 сутки, производили отбор ИАК, клетки осаждали центрифугированием (1000 об/мин) и либо вводили следующей партии мышей, либо замораживали по 5-6x10* клеток с 50-60Х ТЭС, 10% глицерина (Marek) или 10Х диметилсульфооксида (Merck). ИАЖ использовали в серологических реакциях;.

Серологические реакции. Непрямую иммунофлюоресценции осуществляли на монослое клеток Vero или ВНК-21, выращенных на покровных стеклах и зараженных соответствующим вирусом. Реакцию оценивали по ярко-зеленому свечению по 4-х крестовой шкале (А. А. Свешникова, 1981).

Активность и специфичность поливалентных сывороток и препаратов моноклональных антител проверяли в реакции торможения гемагглютинации (РТГА), реакции связывания комплемента (РСК), нейтрализации инфекционности (РН) и ИФА.

Реакцию гемагглютинации с вирусным антигеном ставили по стандартной методике (D.Clarke a J. Casals, 1968) с гусиными эритроцитами микрометодом, в зоне pH от 5.6 до 7,0. Для повышения гемагглютинирукшэй активности исследуемый материал предварительно обрабатывали эфиром или нейонным детергентом Triton Х-100 (Serva). Инфекционную активность определяли методом бляшек в культу-

ре клеток куриных фибробластов, используя десятикратные разведения вируса Среду покрытия готовили по прописи Д. Портер-филда (J. Porterfield,1961). Покрытие включало следующие компоненты (на 40мл): раствор гидролизата лактальбумина (7,2мл), среда 199 (7,2мл), бычья сыворотка (0,8мл), ДЕ-АЕ-декстран 1% (0,8мл), раствор Эрла 10% (2,8мл), сода 7,5% (0,5мл), нейтральный красный 1:1000 (1мл). Полученный раствор смешивали в пропорции 1:1 с 2,6% агаром (Difco). Инкубирование клеточной культуры, инфицированной вирусом, под агаром проводили при 37°С, результаты учитывали на 2-3 сутки после заражения.

Полученные МКА в виде культуральной жидкости или ИАЖ или после выделения из них иммуноглобулинов (Ig) анализировали "в НИШ, РТГА, РН. Для определения уровня нейтрализующей активности (индекс нейтрализации) антител в исследуемом материале, вирус смешивали с равным объемом сыворотки и инкубировали в течение 1 часа, а затем титровали как описало выше. При определении влияния антител на уровни накопления вируса в жидкой фазе инфицированных клеточных культур в среду поддержки вносили исследуемую сыворотку в разведениях 1:10, 1:20, 1:50 и учитывали результаты через соответствующий интервал времени.

Определение класса Ig прводили в реакции диффузной преципитации в агаре, используя антисыворотки к IgM и IgG мыши (Sigma).

Постановку твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА, непрямой вариант) проводили в полистироловых пластинах фирмы " Флоу", которые сенсибилизировали очищенным антигеном по стандартной методике. После инкубации в.течении 18 часов при 4 С, пластины трижды отмывали О,01М фосфатным буферным раствором (ФБР) с добавлением 0,05% твина-20. -Пассивирование проводили внесением в лунки 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА, Sigma или отеч.) на том же растворе. После отмывки через 2 часа в лунки на 1 час (37"С) вносили разведения исследуемых сывороток, затем - антивидовой пероксидазный конъ-югат в рабочем разведении, еще через 1 час добавляли субстратную смесь, содержащую ортофенилендиамин 400 мкг/мл в 0,06% НРеакцию останавливали 4 и. раствором серной кислоты, результаты учитывали на спектрофотометре фирмы "Dynateck" рри 490 пш. Положительными считали те разведения сыворотки, в которых разность величины сигналов опытного и контрольного об-

- 12 -

разцов составляла не менее'2,1-

При проведении иммуноблота препараты очищенного вируса перед нанесением на гель обрабатывали в соответствии с методом Лзммли (1970). После электрофореза в SDS-полиакрилашдном геле перенос белков на нитроцеллюлозу ВА-85 ("Sohleicher-Schull", ФРГ) осуществляли в аппарате "Трансфор" (ЛКБ, Швеция) при 0,5 А в течении 6 часов по методу (H.Towbin et al,1979). Затем полосы целлюлозы последовательно инкубировали в раст -воре антител, в сухом молоке, конъюгате и "проявляющем" растворе в соответствии с методом (D. Karget,1981).

Концентрация и очяеиса вирусов. Для иммунизации лабораторных животных, постановки ИФА и сенсибилизации латексных частиц использовали концентрированный и очищенный вирус,выращенный в клетках <Ш (роллерное или суспензионное культивирование). Обычно использовали множественность заражения 0,010,1 БОЕ/клетку. Вируссодержащую жидкость собирали череа 16-24 часа после заражения клеток, осветляли центрифугированием (при 8000.об/мин - 30 мин - i'o, затем осаждали вирус в роторе 35 (центрифуга L 5-50 фирмы Beckman, 120 минут - 28000 об/мин. - 2 часа). Осадок вируса наслаивали на линейный градиент сахарозы 20-60%(вес/вес) в 0,01 М трис-HCl буфере pH 7,2; тартрата калия (10-60%) или глицерина (15-60%) на том же буфере. Фракции вируссодержащего материала собирали, и после осаждения вируса определяли в них белок, инфекционную и ГА-активность. Концентрированный и очищенный вирус хранили при -70" С.

Электронная мккросколия. Клетки ФЭК или A. albopictus через различные сроки от начала заражения (24, 48, 72 часа) фиксировали 2,5% глкяаровым альдегидом на 0,01 Ы фосфатном буфере, pH 7,2; затем 1% раствором OsO^,,далее проводили обезвоживание препаратов. Осадок фиксированных клеток заключали в эпоксидную среду аралдит. Ультратонкие срезы окрашивали ура-нил-ацетатом (27. раствор на 70% метаноле) и лимонно-кислым свинцом. Морфологические исследования проводили на микроскопе Jeol- 100SX. Суспензию очищенного вируса наносили на формва-ровые подложки и контрастировали с помощью ZX раствора уранид -ацетата.

- 13 -

2. Сравнительный анализ биологических свойств вирусов ВИЛ и двух юолятов альфавирусов с прототют-1!ым ятыэ.юм вируса Сгасцбис.

Существующие данные по анализу отдельных представителей серокомллекса Синдбис-ЗЭЛ (С. СаИзИег е1 а1,1988; ,]. ЬипсЫлпт еЬ а1, 1990) можно'кратко суммировать следующим образом.

В тесте нейтрализации инфекционной активности представители этого комплекса разделяются на две далеко отстоящие группы: вирусы западного полушария (ЗЭЛ и Хайлендс) и вирусы других континентов (ЕС и Сивдбис-подобные вирусы). Титры сывороток к вирусам ЗЗЛ с другими представителями серокомллекса отличаются в 16 и более раз (Но/Нд>1б). Вирус Синдбис и Синд-бис-подобные вирусы отличаются от вирусов западного полушария (Но/Нг>64-128). Особое место занимают два представителя этого серокомплекса: вирус ^ (выделен на Флориде), который равно удален от вирусов ЗЭЛ и Синдбис-подобных вирусов (Но/Н§-16), и вирус У-62 (ит. Смородинцев, выделен в Удмуртии)- Но/Нг=64-128.

Сравнение двух известных представителей серокомплекса Синдбис-ЗЭЛ, выделенных на территория СССР (ВКЛ-9298 и У-62), позволило получить следующие данные: вирус ВКЛ наиболее близок к прототипному итамму ВС-339 (разница индексов нейтрализации!: о Ш -0, 7 БОЕ) и равно удален от вируса ЗЭЛ и У-62; штамм У-62 равно удален от вирусов Синдбис и ВКЛ (о [N=1,1-1,2); вирус ЗЭЛ равно удален от ВС, ВКЛ и У-62 (<>Ш-3,0);прототипный штамм ВС наиболее близок ВКЛ (<>1Н»0,31е) и удален от ЗЭЛ и У-62 (<>Ш=2,3 и 1,3 соответственно).

Эти данные , полученные наш в 1987г. , подтверждаются более поздними подробными исследованиями серологических перекрестов внутри серокомплекса (С. СаПэЬег ^ а1Д989).

Вирусные штаммы, идентифицированные как сероварианты вируса Синдбис, как указывалось, были выделены в Европе, Африке, Азии и Австралии. На основании исйользования высокочувствительных методов анализа (РНК-РНК гибридизации, олигонуклеотидного анализа, • анализа молекулярных масс структурных белков и олигопептидного картирования) было сделано предположение, что родоначальный вирус Синдбис (предшественник) эволюционировал на четыре группы вирусов, распространение которых совпадает с палеарктической, эфиопской, ориен-

тальной и австралийской 'зоогеографическими зонами. Точное таксономическое положение их может быть установлено на основании анализа гомологии первичной структуры всех генов, сравнения серологических перекрестов выделенных в разных регионах вирусов (включая использование мояоклональных антител) и их биологических свойств.

Используя данные о циркуляции вируса Синдбис в северо-западных регионах СССР (Д. К. Львов и др. ,1987; Е А. Василенко, личное сообщение), мы провели попытку выделения альфавирусов на территории Прибалтики, в областях, прилегающих к резонам циркуляции ВКЛ (Окельбо) на территории Эстонии.

2.1. Выделенка и вдеипфшация вируса Синдб;гс от перелетных ютщ в Эстонии.

Территория Прибалтийских республик является уникальным местом для изучения экологии вирусов, связанных с птицами и комарами. На территории Эстонии гнездует более 80 видов перелетных птиц, а в период осенней миграции на полуострове Сырве острова Сааремаа собираются птицы со всей Эстониии и, возможно, территоримй прилежавдх прибалтийских государств. Эстонский Государственный заповедник располагается на острове Виль-санди и прилегающих островах на крайнем западе республики (около острова Сааремаа) в Матсалузском заливе Балтийского моря.

Исходный материал (образцы 1381 и 1383) от птенцов птиц гаги (Somatena mollissima), отстрелянных на острове Вильсан-ди в мае-июне 1987 года, пассировали через мозг мышей Balb/c. На четвертом пассаже после проявления признаков заболевания (нарушение координации движения, атаксия, вялость) суспензией мозга заболевших животных заражали клетки BHK-21,CIBB, Vero и проводили последовательные пассажи материала в клеточной культуре и на мышах. Достоверно выраженного цитопатического эффекта в клеточной культуре не наблюдалось, однако под агаровым покрытием в клетках Vero (второй пассаж, разведение 10-i ) были выявлены несколько бляшек округлой формы с ровными краями величиной 6,0-6,0 мм (48 часов от начала заражения). Величина бляшек не зависела от присутствия в покрытии ДЕЛЕ-декстрана (рис.1 ), Материал иэ бляшек трижды клонировали отколом-"из бляшки в бляшку", затем заражали монослой клеток под жидким покрытием и натопленный через 24 и 48 часов мате-

рнс.1 характеристика Б-признака у разных штаммов вируса Сиилбнс

а - крупные бляшки нзоля.тов 1381 н 1353, в:-крупные бляшки вируса ашдбнс-339 , Г-гетерогешшй Б-фенотнп ВКЛ, Д-мел-кобляшечиый вариант ВКЛ, Е - крупноОляшечный вариант ВКЛ

Рис.2 Иммунофлюоресценция. Клетк1! Уего, инфицированные вирусом 138 3 _

л - б часов после заражения клеток, Б - 12 часов от начала инфекции, В - 24 часа инфекции.

риал анализировали.

Инфицированные исследуемым материалом клетки фиксировали и проводили индикацию агента с помощью антисывороток к флави-, альфа- и буньявирусам( японский и клещевой энцефалит, Синдбис Семлики, ЗЭЛ, Чикунгунья, Пиксуна и др.) методом непрямой им-мунофлюоресценции (НИФМ). С помощью НИФМ в клетках Vero было обнаружено диффузное цитоплазматическое свечение в виде околоядерного ободка, нарастающее по интенсивности с удлинением срока инфекции (от 12 до 28 часов). Свечение было специфическим и наблюдалось только при использовании антисывороток к вирусу Синдбис (рис.2) или ВКЛ. С антисыворотками к вирусам трех семейств (тога-, флави-, бунья-) включая антитела к вирусу ЗЭЛ, Леса Семлики, свечения не наблюдалось. Размножение обладающего цитопатическим действием и вызывающего образование бляшек в клетках ФЭК и Vero агента до титров 10f ТЦД/ 50 было отмечено к 3-6 пассажу. Последовательное клонирование агента из бляшки в бляшку с подращиванием в клетках <ЮК до развития ЦПЭ (++) позволило отобрать к 6 пассажу материал, накапливающийся в культуральной жидкости клеток Vero и ШК до 5x1 cf- 1х109Б0Е /мл. Высокие титры вируса сохранялись при последующих пассажах. S-признак не менялся при культивировании в клетках 4QK (около 20 пассажей - срок наблюдения).

При электронной микроскопии зараженных анализируемым материалом клеток ®ЭК через 24-48 часов от начала инфекции обнаружены скопления вирусных частиц диаметром 60 нм с типичной морфологией тогавирусов: злектронноллотным нуклеокапсидом диаметром 50 нм и наружной оптически светлой оболочкой. Этапы морфогенеза частиц подтверждали их принадлежность к тогавирусам (рис. 3, 4). Морфологическое исследование клеток в световом микроскопе позволило охарактеризовать стадии развития ЦПЭ: нарушение формы клеток Vero, образование отростков, округление клеток, сморщивание ядра, отслоение клеток от подложки.

Идентификацию выделенного Ьйруса проводили с использованием референс-сывороток (Центр ВОЗ по арбовирусам) к арбовирусам семейств тога-(Синдбис, ЗЭЛ, ЮЛ, Пиксуна, Чикунгунья, Леса Семлики, Миддельбург, Восточного энцефаломиелита), флави-(японского энцефалита, клещевого энцефалита) в РСК, РТГА, РЕ Положительные реакции были отмечены только с сыворотками к вирусам Синдбис и ЗЭЛ, причем в последнем случае титры сывороток были ниже (табд. 1)

рис.) Электронная микроскопия. Часть среза поверхности клетки через 24 часа после заражения вирусом ПХЛ

^ ■ &

А - почкующиеся частицы алыравируса х 90000, Б - скоплемня вириомоп альфавнруса вблизи плазматической мембраны к в межклеточном пространстве х м'ооо.

из-2

10 00 Л

г О ¥ В Г

Ш ъ м — — 5гк

г 3 гг к £2----8,4

г £( м» £ 3

• с ел ®зм<

Вкя 8С

•1

Рис.4 Физические характеристики вирноноп ВКЛ: А - плотность, Б - величина вирионов В - мол. пасем (¡елкоп Г - июзлектричсские точки

Табл. 1.

Показатели титрования в РТГА BKJI и изо'лятов 1381 и 1383.

Сыворотки (ЛАЖ)

Антиген ВС ВКЛ 1381 1383 Ф-720 ЗЭЛ

1* 4 4 2 2 128

ВС 1280** 1280 1280 640 640 80

БКЛ 2 1 8 4 4 128

640 5120 640 640 640 80

1381 "4- 8 1 1 32 128

* ' 320 640 5120 5120 40 80

1383 2 8 1 1 32 128

640 640 5120 5120 40 80

Ф-720 1 8 32 64 1 256

1280 640 160 80 1280 40

ЗЭЛ 32 ' 80 40 128 64 1

40 64 128 . 40 20 10240

* * - титры сывороток в РТГА * - отношение титров сыворотки с гомологичным и гетеро-логичным вирусом ( Ho/Hg). В качестве антител использовали ИАЖ.

В таблице указали средние титры сывороток трех параллельных титрований.

На основании полученных данных выделенные изоляты были расценены как сероварианты вируса Синдбис. BKJI был близок к ним. Наиболее далеко от них располагается штамм Ф-720 (Ho/Hg=32). Показатели нейтрализации (индекс нейтрализации) приведены в табл. 2.

Полученные в перекрестных реакциях нейтрализации результаты коррелируют с данными по титрованию вирусных антигенов в РТГА и позволяют расценивать изоляты 1381 и 1383 как сходные между со-

Табл. 2.

Индексы нейтрализации ( БОЕ) ВКЛ, 1381 и 1383 с сыворотками

Сыворотки

Вирусы

ВС ВКЛ ЗЭЛ 1381 1383 Ф-720

ВС

ВКЛ

ЗЭЛ

1381

1383

Ф-720

3,6 3,0 0,4 2,8 2,5

3,3 3,5 0,75 2,5 2,5

0,8 0,5 3,0 0,5 0,5

3,0 2,5 0,5 3,0 3,0

2,5 2,5 0,5 3,0 З.Ь

2,0 1,5 0,5 1,5 1,5

2,0 1,5 0,5 1,5 1,5 2,5

бой и прототипному штамму вируса Синдбис. Серологические различия не были выражены, чтобы обозначить выделенные изоляты гак новые вирусы. Штамм Ф-720 более отличался отВС-339 и ВКЛ.

Совокупность полученных данных (ЮШ, РТГА, РН) по характеристике выделенных изолятов 1381 и 1383 позволяют отнести их к вариантам вируса Синдбис, близкородственных афро-европейскому варианту Ее АЯ-339. Вирус карельской лихорадки был отнесен к этой же группе.

2.2. Размножение вируса в различных типах клеток.

Анализ закономерностей накопления ВКЛ в различных типах клеток является необходимым моментом для проведения последующих исследований биологических и физико-химических характеристик вируса и его компонентов, приготовления вирусспецифических реагентов, создания диагностических тест-систем, получения моношю-нальных антител и исследований по аттенуации вируса Определение оптимальных параметров накопления вируса. при разных способах культивирования в доступных для производственных целей клеточных культурах мы рассматривали как предварительный этап для получения препаративных количеств вируса, а анализ вируса в течение длительных пассажей в одной системе - как необходимый контроль постоянства их свойств.

Сводные данные об уровнях накопления ВКЛ и двух штаммов

Таблица 3

Уровни, накопления вируса и продукции на клетку в условиях стационарного монослойного культивирования клеток

Титры вируса /продукция на клетку (БОЕ) в клетках

Ийамм вируса

аек

БНК-22

Vero

A. albopíctus

Вирус ВКЛ 4 пас.

Вирус ВКЛ 35 пас.

Синдбис 1381 7 пас.

Синдбис 1383 7 пас.

Синдбис AR-339

ВЭЛ-230

ЗЭЛ-56-14

Ф-720 Ар.

2-8x10

200-800 5

1-5x10

2-5x10

200-500

9-12x10

\ .1-5x1000 900-1200

Н. 0.

0,7-5x10 .70-500

0,2-1x10

200-1000

г-exio 200-800

н. о.

4-8X10 400-800

н. о.

4-9Х10 400-900 0,8-4x10 80-400

1,5-15x10

150-1500 8

5-9x10 500-900

1-3x10 0,2-6

н. о.

9 9

0,85-2x10 0,6-2x10

850-2000 0,8-бхЮ5 800-5000 1-5x10 ^ 1-5x1000

0,6-2x10 600-2000 600-2000

0,5-2x10 500-2000

Н. О,

0,7-2x10 700-2000 1-5x10 ® 1-5Х1000

н. о. н. о,

1-5x10 0,1-0,5 3X10 0,3

0,5-1х10~ 0,05-0,1

Н.о.

»О&оиес^венность варакения во всех случаях составляла 1 ВОЕ/кл. у;хшя собирали через 20 ч. Средние значения 3-х опытов,

вируса Синдбис (1381 и 1383) в' первично-трипсинизированных и перевиваемых клеточных линиях приводятся в табл. 3. Были использованы шт. 1381 И1383 после 7 пассажа в клетках ФЭК (предельные разведения) и ВКЛ-9298 (4-й и 35 пассажные уровни). Адаптация вирусов к клеткам ФЭК сопровождалась повышением уровней продукции на клетку.

ВКЛ после 35 пассажа накапливался в первичных и перевиваемых клеточных культурах до уровней, пригодных для получения препаративных количеств вирусной биомассы (до 1x10^ БОЕ/мл).

Уровни продукции вируса на клетку варьировали от вида клеток и использованного вируса в пределах 0,05-5000 ВОЕ/кл -цикл инфекции. Максимальный урожай для вирусов ВКЛ, 1381, 1383 в этих пределах зависел от качества клеточной культуры и компонентов среды.

Известно, что разный оптимум рН для выявления гемагглюти-нирующей активности может влиять на показатели РТГА, уровни которой снижаются в неоптимальиых условиях (J.Smith,1966). Способность вызывать агглютинацию при определенных значениях рН может коррелировать с другими биологическими свойствами (Б. Ф. Семенов, 1968). Отношение ИД-50: ГА для разных штаммов может также варьировать. Имеются данный, что слияние вирионов ВС с клеточной мембраной определяется белком Е1 вириона, с которым связывается ГА-активность (W. Boggs et al, 1989; G. Chang et al, 1987), причем оптимальные показатели рН для эффективного слияния с клеточной стенкой отличаются у исходного и нейроадалтированных штаммов вируса Синдбис (штамм AR-339). В наших опытах сравнение оптимумов рН для ГА-активности у разных штаммов вируса Синдбис (1381, 1383, Eg AR-339) и ВКЛ показало постоянство этого признака у изученных штаммов (рН 5,8-6,0), в отличие от вирусов ВЭЛ (рН 5,6-5,8) и ВЛС (рН 5,5-5,6). Уровни продукции ГА в конце 1ог-фаэы вирусной инфекции для ВКЛ и Синдбис были обычно значительно ниже, чем у вирусов взл-гзо и ЗЗЛ-5614 (8-32 ГАЕ/мл и 128-256 ГАЕ/мл, соответственно) .

В условиях стационарного культивирования клеток фаза логарифмического накопления внеклеточного вируса (4-12 ч) коррелировала с интенсивным синтезом вирусспецифических РНК в клетке, которые выявлялись методом РНК-ДНК (зонд)-гибридизации уже на ранних сроках инфекции (4-6 ч после заражения) (ЛЕУрываев и др. 1990).Накопление вирусной РНК коррелировало с выявлением вирус-специфических антигенов в клетках методом непрямой иммунофлкйрес-

ценши.

Накопленный опьгг культйвирования ВКЛ в условиях стационарного культивирования ( однолитровые флаконы; 100 мл среды, -10 клеток; "фабрики"- 1000 мл среды, -1G*клеток),. суспензионногоСплотность клеток до 2,5x10 /мл, 300мл ) и ролл'ерного культивирования (2x10** клеток, обьем среды до 60-100 мл) позволяет сделать вывод о предпочтительном использовании роллерного культивирования для получения препаративных количеств BKJL В последнем случае за счет повышения плотности клеток на единицу объема среды и оптимальной аз-

/р

рации достигается максимальный титр вируса - до 1-2x10 ЕОЕ/мл. Обдай выход вируса на 1 клетку повышается и колеблется в пределах 1200-5000 блящкообразующих (инфекционных) частиц на 1 клетку. Использованный подход позволяет получать до 0,5-1,0 мг вирусной биомассы на 1 роллерную бутыль.

Получение в оптимальных условиях препаративные количества вируса ВКЛ позволили провести сравнительный анализ молекулярных масс (ММ) структурных белков вириона ВКЛ и прототипного аггамма ВС методом электрофореза в SDS-лолиакрилашдном геле ( штаммы вируса Сия-дбис, выделенные в разных регионах мира,отличаются по этому признаку, К. Olson a D.Trent, 1985). Ранее было показано, что варианты вируса Синдбис с измененной патогенностью для лабораторных животных могут по-разному адсорбироваться на клетках мишенях, что коррелирует с изменением суммарного заряда белков El и 12: у вирусов с повышенной вирулентностью белки оболочки имели более низкую изозлектрическую точку (J. Symington а М. Schlesinger, 1978).

В наших опытах было показано сходство ММ белков вириона у ВКЛ и Синдбис AR-339,а также тождество изоэлектрических точек белков El и Е2 у данной пары вирусов ( pl El-6,3; pi Е2-8.4),рис4. в отличие от ранее опубликованных данных (J. Dalrymple et al, 1976; Т. Miki,1984: pl El-6,0; pl E2-9.0), что может быть связано с штам-мовыми отличиями использованных вирусов. Т. о., более высокая пато-геиность ВКЛ для человека не коррелирует с указанными свойствами белков вириона.

2.3. Харакхеристмса Sí-признака.

Как указывалось выше, ВКЛ хорошо размножается в различных типах клеточных культур. Его размножение в клетках ФЭК, Vero, ЕНК-21 сопровождается характерными морфологическими изменениями инфицированных клеток и их последующей гибелью. Адаптация вируса ВКЛ к клеткам ФЭК коррелировала с изменением S-признака вирусной популяции:t исходно гомогенно среднебляшечный вариант ВКЛ (величина бляяек 2.5-3,0 мм) после пятого паасажа менял свой S-фено-

тип. Популяция вируса становится гетерогенной по величине бляшек ( 2,0 мм-18%; 2,5-3,5 мм-52%; 4,0-5,0 мм-30%). Такая характеристика вируса ВКЛ сохранялась на протяжении последующих пассажей. (35-срок наблюдения). ПараЭдально этот признак анализировали и у прототипного штамма ВО-АИ-ЭЗЭ, взятого в качестве контроля. З-лризнак у ВС-339 отличался стабильностью и не менялся в процессе культивирования (3,0-4,0 мм; на протяжении 30 пассажей). Еляшечный фенотип характеризовался постоянством и у других использованных в работе лабораторных вариантов вирусов ЗЭЛ и ВЭЛ.

Известно, что З-признак -фенотипическое проявление, связанное практически с любым этапом репродукции вирусов, поэтому мы провели трехкратное клонирование крупно- (4,0-5,0 мм) и мелкое л я печного (1,5-2,0 мм) вариантов ВКЛ и сравнение их чувствительности к прогреванию при 50 С (дробно от 10 мин до 1 часа) и размножению при различных температурах (.40° ,37°,20"). Полученные результаты позволили сделать заключение об их сходной термочувствительности (сходная кинетика инактивации вируса) и репродуктивной активности при разных температурах. Это означает, что обнаруженные вариации Э-признака у вируса карельской лихорадки не связаны с термочувствительностью (рис.1, табл.4).

Выявленные вариации Б-признака у альфавирусов часто коррелируют с чувствительностью к лоликатионам в агаровом покрытии (Я. Я. Щшшский, 1989). Поэтому мы проверили и эту возможность. Было показано, что добавление в стандартное агаровое покрытие ДЕАЕ-декстрана ("о)гпв") приводило к возрастанию величины бляшек " у зр-варианта ВКЛ (до 1,5-2,0 мм), при сохранении 5-признака у 1р -варианта Сходный эффект наблюдался при замене в агаровом покрытии агара ("01Гсо") на агарозу ("ВоеЬппгег").

Таким образом, появляющаяся в процессе культивирования ВКЛ в клетках КЭК гетерогенность по З-признаку может быть объяснена формированием чувствительной к лоликатионам агарового покрытия частиц вирусной популяции. Этот признак не был связан с изменением репродуктивной активности вируса.

Нами было показано, что заражение клеток А. аПзорЮЬиэ (С1 6/36)-1,0-0,1 ВОЕ/кл вызывает развитие острой инфекции с выраженным ЦПЭ (гибель 100£ клеток) и накоплением внеклеточного вируса до более высоких титров ( до 1-3x10 ВОЕ/мл), в отличие от вирусов ВС-339, ВЭЛ- гЗО, использованных в качестве гон ¿-рольных. В последнем случае, максимальные титры вируса сохранялись на более низком уровне: 3-8х10*ЕОЕ/мл, а накопление вируса в клетках и в

такой- Фазе сопровождалось устаковленкем хронической кнйешм

Табл. 4

Характеристика разных штаммов вируса Синдбис

Свойства Вирус Ю-339 Вирусные штаммы ВКЛ 9298 9298 * 1381 1383 Ф-720

Источник выделения Сх. Aedes univittatus spp. ФЭК ВПК-21 Somateriа mollisslma Bubulcus Ibis

Место выделения Египет Карелия - Эстония Армения

История пассажей ФЭК >50п. МЫШИ-2П. ФЭК-2П. 14пас. 4QK.BHK Vero-5n. ФЗК-5п. Vero-5n. 40К-5п.

Патоген-ность для ti/tí 9 гибель на 4-5сут- гибель на 4-5сут. выжив. @@ гибель 100% на 14дн. 4-5сут. гибель на 2-Зсут.

1ЩЭ: «ЭК, Vero, ЕНК-21 A. alb. + + + + и.о. + Н. 0. + Н. 0.

S-признак s-зш S-A. alb. 5,0-4,Омм 3,0-4, ОММ 2,5-3,5мм 1,2-1,5мм мелкие 1,0-1,5мм н. 0. крупные 6,0-5,Омм Н. 0. мелкие 1,0-1,5мм Н. 0.

Зависим, от ДЕАЕ-d - - + - -

ts-признак - sp - IP " н. 0. Н. 0. Н. 0.

л - пггамм 9298 Г- быстропроникающкй

ё - в каждом случае новорожденным мышам весом 4-5 г интраце-ребрально вводили по 1О0БОЕ/5Ор1

- выживание 100Х 'мышей ( 10 животных/опыт), результаты 3 ОПЫТОВ

(цитоплазматическое свечение более 70Х клеток в НИФМ). Вирус ВЭЛ -230 из хронически инфицированной культуры A. albopjctus характеризовался темлературочувствительностью, которая коррелировала с изменением размера бляшек в два раза (S-IQK).

S-признак был характерен для калодого из модельных вариантов вируса Синдбис (табл.4, рис.1).

У исходного штамма ВКЛ (LEIV-9298) при последовательном культивировании в клетках A. al bopictus (14 пассажей,2б") фенотип по S-приэнаку не менялся. Лабораторные штаммы других использованных нами альфавирусов (ВС, ЗЭЛ, ВЭЛ), адаптированных к клеткам ®ЭК (более 100 пассажей), изменяли "бляшечньгй " фенотип: размер бляшек уменьшался в 2 раза по сравнению с исходным в процессе пересева хронически инфицированных клеток (A. alb.-ВЭЛ-230; A. alb.-ВС -339; A. alb. -ЗЭЛ-5614).

Таким образом, была отмечена интересная закономерность: у "свежего" природного иэолята LEIV-0298, выделенного из комаров Aedes communis, при культивировании в клетках теплокровных (©ЭК, Vero, 37е)меняется фенотип бляшкообразования. S-приэнак сохраняется у LEIV-9298 при культивировании в клетках насекомых. Наоборот, у лабораторных, длительно культивируемых в клетках теплокровных (<ХШ, Vero, ВНК-21, 37г ) альфавирусов. фенотип (по S-признаку) сохраняется в процессе пассажей в этих метках и изменяется после культивирования в клетках комара.

2. 4. Селекция быстропронккаючего варианта ПИЛ.

В работах последних лет было показано, что селекция быстроп-роникающих в клетку вариантов альфавирусов приводит к быстрому снижению их патогенности для лабораторных животных (R. Barle et al, 1980; R.Olnsted et al, 1986; R. Johnston a J.Smith, 1988) уже через 6-8 пассажей. Этот эффективный принцип получения атте-нуированных штаммов был подтвержден и на модели флавивирусов -вирус японского энцефалита (L. Dunster et al,1990),и, как предполагается, он может быть использован для получения вакцинных штаммов.

Патогенные для человека свойства ВКЛ-9298 делают актуальной проблему получения его аттенуированных штаммов. Поэтому мы использовали описанный подход для селекции быстропроникаюшего варианта ВКЛ. Для этого монослойную культуру клеток BEÍK-21 или ФЗК заражали "свежим" вирусом 1 BOE/ia. после 15- минутной инкубации зараженных клоток вирусом ВКЛ-9298 при 37е, инокудят тщательно отбирали, lueTKH трижды промывали теплой средой 199, а затем

вносили по 0,5 мл кроличьей анти- сыворотки (титр в РТГА-1/1280, в РН- 1/640) в разведении 1:20 (в среде 199). Через 30 минут среду с анти-ВКЛ-сывороткой отбирали и клетки запивали средой поддержки, урожай вируса собирали через 16 часов. После титрования собранного вируса проводили его последовательные пассажи как описано выше (всего 14 пассажей). Полученные результаты суммированы в табл. 5.

Табл. 5.

Патогенность ВКЛ лосле селекции для новорожденных мышей.

Вирус титр lg BOE/LD S-признак Зависимость

вируса 50 от ДЕАЕ-d

9298 S 3,5x10 7x10 3,2 2,5-3,5мм -

6 селекц. 5,0 1,0-1,5 +

9 селекц. 2,6x10 5,2 Н, 0 Н. 0.

12 селекц. 1x10 ? 5,2 1,0-1,5 +

14 селекц. 1,5x10 5,2 1.-1.5 +

Последовательная селекция быстропроникаюшего вируса приводила к отбору аттенуированного варианта ВКЛ-9298F со сниженной патогенностью для мышей: уровни lg BOE/LD 50 повышались на 2 порядка уже после 6 пассажа и сохранялись до 14 пассажа (срок наблюдения). Снижение пагогенности ВКЛ-9298 F сопровождалось изменением S-признака исходного вируса, который коррелировал с зависимостью от ДБАЕ-декстранцг в агаровом покрытии.

Проведенные эксперименты позволяют сделать следующие выводы: 1) отбор быстропроникающего вируса ВКЛ приводит к его атте-нуации для мышей, что подтверждает ранее полученные данные (R.Olmsted et al.1986; N. Davis et al, 1988), 2)аттенуация альфа-вируса может быть проведена не только на клетках ВПК-21, но и на клетках ФЭК, которые коммерчески более доступны; 3) аттенуация (селекция бистропроиикагацэго вируса) происходит быстро - через 4 - 6 пассажей (R. Olmsted et al, 1984), что позволяет существенно сократить время для отбора аттеиуированных вариантов альфавиру-сов (для лабораторных животных) в сравнении с классическими способами получения адаптированных штаммов. Полученный вариант ВКЛ-9298 F является удобнбй моделью для анализа аттенуирующих мутаций в геноме вируса ВКЛ.

3. Получений ишгашнЕшыож антител к вирусу ШСЛ и характеристика их бодпогкческкх свойств.

Развитие гибридомной техники производства моноклональных (МКА) антител CG-Kohler а С. Milsteln, 1975) и их широкое использование для изучения антигенных свойств белков вириона, анализа серологических связей внутри серокомплексов, корреляции молекулярной структуры и биологической функции белков вириона ( С. Я Гайдамович и др. 1986; A.C. Новохатский, 1984; А. А. Кущ и др. , 1987; J. Roehrig, 1986;)позволяют рассматривать получение МКА как один из необходимых этапов работы по исследованию новых вирусов.

Возможности практического использования МКА подкрепляют это положение. Применительно к альфавирусам к настоящему времени МКА получены к вирусам: Синдбис (ВС), леса Семлики (ВЛС), Западного энцефаломиелита лошадей (33JI), Восточного энцефаломиелита лошадей (ВсЭЛ), венесуэльского энцефаломиелита лошадей (ВЭЛ) и ряду мутантов и вариантов представителей этой группы (A. Chañas et al, 1982; A.Hunt a. J. Roehrig, 1985; R. Ol instead et al,1986; В. Б. Локтев и др. ,1991).

В данном разделе описаны получение, свойства, специфичность и особенности биологических реакций МКА к вирусу карельской лихорадки (ВКЛ).

3.1. Характеристика моноклональных шггмтел к вирус у карельской лихорадки.

В предварительных опытах было показано, что у мышей линии Balb/c.CBA, Wistar, A/sn при использовании одинаковых схем иммунизации специфические антитела к альфавирусному антигену накапливаются в крови в высоких титрах ( РТГА до 160320, РН до 320-1280) одинаково у мышей всех линий и коррелируют с титрами антител в селезенке ( до 160 в РТГА и до 320 в РН),что важно для получения позитивных гибридом. Мыши Balb/c были использованы в работе как наиболее коммерчески доступные.

Самкам мышей вводили внутрибрюшинно по 10 мкг очищенного вируса ВКЛ, смешанного в отношении 1:1с полным адъюсаятом Фрейнда Через один месяц иммунизацию повторяли ( та же доза антигена без адъюванта). Бустерную дозу вводили в разные сроки после последней иммунизации (2,4 и 6 недель). Череа 3 дня определяли титр антител к вирусу в сыворотке крови и селезенке и мышей с наиболее высокими титрами антител в РТГА (160 и выше) использовали для получения спленоцитов. На каж-

дую партию для иммунизации использовали по 10 мышей. В каждом опыте после гибридизации клетки высевали на 2 Панели. Схема иммунизации и полученные результаты приведены в таблице N 6.

Табл. 6. Схема иммунизации и показатели формирования гибридом в опытах по гибридизации.

Время Доза Титр антител Процент лунок с гиб-

N введения антигена в сыво- в спле- ридными и позитивными бустера в мкг/ ротке ноцитах клонами

_инъек._

1. через

2 недели 10 мкг 160-640* 160-320 2.4 недели 10 мкг 160-1280* 80-160 3.6 недель 10 мет 160-640* 80-320

* Указаны вариации титров в партии мышей.

Использование указанной схемы иммунизации позволяло проводить эффективную гибридизацию клеток при разных сроках введения бустерной дозы вирусного антигена. Показано, что процент позитивных гибридом был выше при использовании схемы 3.

При предварительном тестировании МКА, продуцируемых 14 отобранными гибридомами, в НИФМ ( с инфицированными ВКЛ клетками Vero), в 6 случаях была показана стабильная продукция антител на протяжении 5-7 клеточных пассажей (гибридомы N 1,17,30,34,36,37). Специфичность МКА была подтверждена наличием свечения только при использовании гомологичного вируса в клетках Vero и-отсутствием его в незаралвнных клетках ВНК, ФЭК ( последовательного разведения МКА 1/20 и выше), а также в зараженных вирусами других семейств (гриппа, осповакцины, клещевого энцефалита) или другого серокомплекса (вирус БЭЛ) альфавирусог, (табл.7). Титры продуцируемых разными гибридома-ми МКА варьировали от 10 до 10*в реакции ЮШ. После повторного реклонирования наиболее высокий уровень антител был отмечен у клона К-34 ( до 10 и более).

На основании характера наблюдаемого в НИФМ свечения клеток (диффузное цитоплазматическое) нельзя было сделать предположения о специфичности МКА по отношению к определенным белкам вириона. В РТГА и PH. р которых принимают участие гликопротеины ооолички вириона аль-фавирусив. удались показать направленность

20% 57. 257. 87. 227. 13Х

Таблица 7.

Уровни продукции и специфичность продуцируемых гибри-домами МКА

Титры антител в ГОШ к вирусам и клеткам

Серия гибридомы ВКЛ ВЭЛ ов Грипп ФЭК Уего

Карел 01-3 100 <10 <10 <10 <20 <20*

Карел 17-5 10 ООО <10 <10 <10 <20 <20

Карел 30-5 1 ООО <10 <10 <10 <20 <20

Карел 34-5 10 ООО <10 <10 <10 <80* <80*

Карел 36-? 100 20* <10 <20* <10 <10

Карел 37-4 100 <10 <10 <30 <10 <10

Контроль

ИАЖ К ВКЛ • 512 <10 10 10 10 <10

ИАЖ к вирусу гриппа

А/СССР/90 <10 <10 10 1024 <20 <20

нормальная А1 <10 <20-* <20* <20+ <20* <20*

Примечание: приведены величины, обратные разведениям МКА; *- меньшие разведения не использовали.

шьсти исследованных МКА к антигенным эпитопам белков оболочки вириона (табл. 8).

Эти результаты были подтверждены данными анализа антител в иммуноблоте (рис. 5).

Четыре из шести проанализированных клонов гибридом (17-5, 30-5, 34-5, 37-4) продуцировали тормозящие агглютинацию антитела в высоких титрах ( от 160 до 5120), специфичность которых была подтверждена использованием соответствующих контроле». Так, при использовании в качестве антигена альфавируса ВЭЛ или ВЛС, а также флавивирусов японского (ЯЭ) и клещевого (КЗ) энцефалита, приготовленных по сходной методике, или контрольных асцитических жидкостей (к ВКЛ, ЯЭ или "нормальной") с соответствующими антигенами, неспецифических реакций отмечено не было.

Высокие уровни нейтрализующих антител (титры в пределах 160-640) обнаружены в трех из вести случаев, причем продукция гибридомами тормозящих агглютинацию и нейтрализуют* инфекш-

Таблица 8.

Уровни тормозящих гемагглюгинацию и нейтрализующих инфекционность антител в культуральной жидкости культивируемых гибридом.

Титры антител в Титры нейтрализующих

РТГА с вирусами антител с вирусами

Серия -------------------------------------------------

гибридомы ВКЛ ЯЗ КЗ ВЗЛ ВКЛ ЯЗ КЭ ВЭЛ

Карел 01-3 0 <10* <10* <10 640 <10 <10 20

Карел 17-5 1280 <10 <10 <10 <10 <10 <10 <10

Карел 30-5 1280 <10 <10 <20 <10 <10 <10 <10

Карел 34-5 5120 <20 <20 <40 160 <10 <10 <10

Карел 35-3 10 <10 <10 <10 160 <10. <10 <10

Карел 37-4 640 <10 <10 <10 <10 <10 <10 <10

Контроль:

ИАЖ к ВКЛ 2560 <10 <10 <10 1280 <10 <20 <20

ЙАЖ к ЯЭ <10 1280 <10 <10 <10 2560 <20 <20

нормальная АЖ <10 <10 <10 <10 <10 <10 <10 <10

Рис. 5. Специфичность исследованных МКА серии Карел к структурным белкам вирюна, определяемая методом иммуно-блота.

Е1,Е2,С -структурные белки вириона ВКЛ; 1,17,30,34,35,36,37-М0-ноклональные антитела, продуцируемые соответствующими гибридомами; к- поликлональная мышиная сыворотка против ВКЛ

К 1 I? ; 30 34 '35 36 37 к

онность антител не коррелировали. Так, гибридомы серии Карел 01-3 не продуцировали МКА, выявляемых в РТГА, однако уровень антител в РН в этом случае был наиболее высоким. Клетки серии Карел -34-5 и 36-3 продуцировали в культуральную жидкость нейтрализующие антитела в сходных титрах, одншсо их активность в РТГА резко отличалась (от 10 до 5120).

Проанализированные по уровням продукции специфических ША гибридные клоны клеток серии Карел обладали разной способностью к образованию опухолей в асцитической жидкости. Введение гибридных клеток мышам вызывало у них образование асцита на 7-20-е сутки; объем асцитической жидкости составлял 3-8 мл, в котором содержалось 8xl<f- 40xl(f клеток, что свидетельствует о различиях репродуктивной активности гибридом

Таблица 9.

Специфичность антител и уровни биологической активности МКА и ИАЖ гибридом серии Карел

Титры антител в РТГА Титры антител в НИФМ с вирусами с вирусами Серия __

гибридом ВКЛ ВС яэ ВЭЛ ВКЛ ВС яэ ВЭЛ

Карел 30-5-A3 1280 1280 <20 <20 10000 10000 <20 <20

Карел 17-5-A3 1280 640 <20 <20 10000 10000 <20 <20

Карел 34-5-A3 640000- 40000- <20 40 1000000 1000 <20 <40

1280000 80000

Контроль

ИАЖ к ВКЛ 10240 10240 <10 <20 1280 1280 <20 <20

КАЖ к ВЭЛ <20 10 <20 5120 <20 <20 <20 1280

разных серий. Клетки серии Карел-34 обладали наиболее высокой приживаемостью на мышах (90%) с накоплением 4-6 мл асцита на 7-Ю-е сутки при последовательном культивировании гибридомы в брюшной полости мышей. Характеристика трех наиболее продуктивных гибридных клонов приведена в табл. 9.

Клоны серии 30-5-/3 и 17-5-АЗ продуцировали в ИАЖ высокие титры МКА, обладающих тормозящей гемагглютинацию активностью, т. е. взаимодействугакшх с сформированными антигенными детс-рминан-

тами, причем титры их при использовании вирусов ВКЛ и ВС (оба штамма относятся к афро-европейской группе альфавирусов серокомллекса ВС на основании сходства молекулярных масс и ивоэлектрическкх точек их структурных белков, pl El-6,3; pl Е2= 8,4) были практически сходны. В то же время они не реагировали в этих реакциях с представителями других серокомплек-сов альфавирусов - вирусами ВЭЛ или ВЛС, что позволяет сделать предположение о специфичности их только в отношении вирусов серокомллекса ВС-ЗЗЛ и об индивидуальной направленности по крайней мере четырех из изученных клонов к разным эпитопам белков оболочки вириона BKJL Рис.6. Титрование MRA в непрямом ИФА.

------------1. -МКА-34 с ВКЛ; '

~ 2. -нормальная ИАЖ с ВКЛ;

1 4 16 6h 256 IOZ4

На рис. 6 приведены данные о титровании МКА серии 1-5, 17-5 и 34-5 в ИФА. Особый интерес представляет клон серии Карел-34, продуцируемые которым антитела специфичны в отношении изученных вирусов серокомллекса ВС-ЗЭЛ и позволяют дифференцировать два близкородственных альфавируса LEIV-9298 и AR-339 (см. табл. 10).

Можно было сделать предположение, что в функциональном сайте вириона, обеспечивающем агглютинацию (белок Е-1 и комплекс El - Е2) существует не только несколько эпитопов, выявляемых разными МКА групповой специфичности, но по крайней мере один, дополнительный для каждого из изученных нами штаммов эпитоп.

Для проверки этого предположения были проанализированы новые иэоляты вирусов группы Синдбис, выделенные на территории

3. -МКА-1 С ВКЛ

4. -МКА-17 с ВКЛ

5.- МКА-34 с ВЭЛ.

По оси ординат-величина оптической плотности при 490 нм;

По оси абсцисс- разведение МКА (начиная с 1:100)

Таблица 10.

МКА серии К-34 в РТГА и НИФМ с антигенами серокомплекса Синдбис - ЗЭЛ.

Тип Анти- Вирусные антигены

реакции тела ----------------------------------------

ВКЛ ВС ЗЭЛ 1381 1383 ^720 Ар

РТГА МКА 160000 10000 40 5120 5120 10000

ИАЖ

к ВС 640 1280 40 3 20 640 1280

НИФМ МКА >100000 1000 16 1000 1000 1000

ИАЖ

к ВС 5000 5000 160 5000 5000 5000

Прибалтики (см. раздел 1) и в Армении и не дифференцирующиеся в перекрестных серологических решениях (РН и РТГА) от прото-типного варианта Синдбис с гипериммунными сыворотками.

МКАТ серии Карел-34 в РТГА реагировали с антигенами новых иэ'олятов Синдбис ( см. табл.10) по-разному: титры для вирусов 1381,1383 и Ф-720 Ар были одного порядка с прототипным штаммом и отличались от титров с ВКЛ в 10 - 20 раз.

Приведенные результаты позволяют сделать заключение о сходстве или тождестве изолятов 1381, 1383 и Ф-720 Ар с прототипным вирусом Синдбис и отличии ВКЛ по зпитопу ГА-34 от изученных нами вирусов сероварианта Синдбис. Таким образом, было показано, что клон Карел-34 позволяет дифференцировать близкородственные вирусы одного сероварианта, выделенные в разных регионах.

При выраженных антигемагглЮгинирувдих свойствах МКА серии Карел-34 обладали нейтрализующей инфекционность активностью, которая определялась при контакте инфекционного вируса с разведениями ИЛИ (индекс нейтрализации) или при добавлении в куль-туральную жидкость инфицированной клеточной культуры (табл.11). Снижение уровней наюзпления зшфекционности в присутствии специфических антител может быть отражгнием поли -

Таблица N 11.

Нейтрализующая активность антител серии Карел-34 при разных способах их использования

При титровании по классическому! При добавлении в среду поддержи способу ! инфициров. клеток через 2ч. после _!_ заражения_

Срок Индекс 1 уровень снижения

предварительной нейтрализации, 1 разведения инфекционности в инкубации с ан- БОЕ I МКА (МАЖ) сравнении с кон-

тителами, час* ! тролем, 1е ВОЕ

_!_через 12 ч. р. _

1 1 ! 1:10 3,5

6 1,5 I 1:20 2,0

18 2,0 ! 1:50 0,5

24 3,0 1 -

_I_

Примечание: Исходное разведение МКА 1:20. специфичности таких антител: связывание их с сайтами вируса, участвующими не только в гемагглигинации, но и в адсорбции и проникновении вируса в ¡слетку.

Протективная активность МКА-34, продуцируемых наиболее интересными с практической точки зрения гибридомами (хорошая приживаемость на мышах, стабильная продукция МКА, высокие уровни МКА,- наличие анти-ГА и нейтрализующей активности) была оценена в опытах пассивной иммунизации на мышах. Для этого мышам-сосункам весом 4 г за 12 часов до интракраниального введения разрешающей дозы вируса ВКЛ (10 Ш-50) внутрибрюшин-но инокулировали по 0,2 мл МКА-34 в разведении 1/20. В трех опытах, при использовании 10 мышей на титрование, было показано, что МКА-34 обеспечивают выживание мышей в 80 - 100% случаев. Фэномен защиты для других МКА, обладающих нейтрализующей активностью в культуре ткани ( МКА-1 и МКА-36), был менее выражен.

Таким образом, проведенные исследования панели гибридом и продуцируемых ими антител позволил нам отобрать наиболее перспективные для анализа штаммов апьфавирусов и использования К'; в практических целях. Среди проанализированных МКА два били специфичны к бежу Е2, четыре - Е1; четыре клона обладали разной степенью антигемагглютинирутощей активности (17,30,

34,37) среди них есть и анти - Е1 (17. 30,37), и анти - Е2(34), три - нейтрализующей активностью(1,34,35); все шесть взаимодействовали с вирусным антигеном в зараженной (снетке, причем в разной степени с вирусами ВКЛ и ВС. Можно полагать, что пять клонов МКА специфично направлены к разным линейным эпи-топам ВКЛ, экспонированным в формирующихся структурах вириона на поверхности клетки и в структуре зрелого вириона (табл. 12).

При использовании конкурентного анализа в структуре гетеро-димерного (Е1-Е2) шипа вириона было обнаружено несколько участков (отдельные эпитопы белков или их ассоциация), связывание которых с МКА приводит к нейтрализации инфекционности или торможению гемагглютиниругацей активности, причем взаимное сцепление разных эпитопов варьирует у изученных представителей альфавирусов, обеспечивая их биологические особенности и

Таблица N 12.

Серия (ЖАТ к ВКЛ Специфичность в реакции иммуноблота НИФМ Реакцки РТГА РН

1 Е2 +

17 Е1 4- 4- -

30 Е1 4- + -

34 Е2 4- + +

36 Е1 4- - +

37 Е1 4- + -

специфику иммунохимических реакций С А. С. Нэвохатский, 1984; R.Johnston, 1988; В Б. Локтев л др., 1991). Группоспецифич-ных МКА, реагирукящус с представителями всех альфавирусов, аналогично клону E2ft> к ЗЭЛ, среди проанализированных нами клонов выявлено не было. Клоны Карел-1 и Карел-34, вероятно, по функции близки к узнающему Е2 сайт клону гибридом к вирусу ВЭЛ (J. Roehrlg a. J. Mathews, 1985), однако узнаваемые иш участки различны ( клон Е23 обладает выраженной антигемагглю-

тинирующей и ослабленной нейтрализующей активностями, у клона Е2 более выражена нейтрализующая активность). Клоны серий Карел 17, 30, 35, 36,37 реагировали в иммуноблоте с белком El, с которым связывают гемагглютинируюшую, гемолизирующую активности и участие в нейтрализации ( в составе оболочки вирио-на). Их свойства наиболее близки к свойствам МКА, специфически реагирующим с El и рядом расположенными сайтами.

4. Экспериментальные подходы к разработке

тест-систем для выявления маркеров ВКЛ-инфекции.

Получение высокопродуктивного штамма вируса карельской лихорадки, отработка способов получения препаративных количеств вируса и его концентрации и очистки, а также получение монокло-нальных антител послужили основой для разработки экспериментальных подходов к созданию тест-систем для обнаружения маркеров ВКЛ -инфекции.

4.1. Использование полученных моноклинальных антител в реакции не прямой «шупофлиюреспенции.

Усовершенствование методов диагностики инфекционных заболеваний - одно из основных направлений прикладной вирусологии. Наряду с разработкой новых современных диагностических тестов, совершенствуются классические методы диагностики. Одним из простых, чувствительных и быстрых методов выявления и индикации вирусов является метод иммушфлюоресценции (С. Я. Гайдамович и др. 1989).

Как показано в разделе 3, нами была получена серия монокло-нальных антител к вирусу карельской лихорадки, различающихся по биологическим характеристикам, в том числе высокопродуктивная линия гибридом Карел-34, продуцирующая ШАТ, реагирующие с антигеном ВКЛ в реакциях РН, РТГА, НИФМ, ИФА. Поэтому мы проверили возможность специфического выявления структурных белков ВКЛ с помощью "стандартных" препаратов МКАГ разных серий в реакции непрямой иммунс ^юресценции.

Используя иммунную асцитическую жидкость, содержащую МКА к ВКЛ, мы обнаруживали вирусспецифический антиген в зараженных клетках при разведении МКА 1:100-1:100000. Из серии МКА к ВКЛ особо выделялся клон, обладающий дифференцирующими свойствами для разных представителей серокомллекса Синдбис-ЗЭЛ. Асцитичес-кая жидкость этого клона реагировала в ШЫ с зараженными ВКЛ клерками Vero в рплведСНии 1:100000. В случае инфицирования клеток прототипным гирусом Синдбис уровень реакции снижался в

50-100 раз, а вирусом ЗЭЛ - в 500 раз. В контрольных клетках, инфицированных представителем другого серокомплекса ВЭЛ-230 - свечения не наблюдалось при разведении ИДЯ данного ША 1/10.

Полученные результаты свидетельствуют о возможности использования MKAT к ВКЛ в качестве стандартного биореагента в оптимальном разведении 1:10000, что позволяло выявлять специфический антиген ВКЛ независимо от исходной множественности заражения клеток. МКАТ-34 в таком разведении не давали специфического свечения с клетками, зараженными вирусами ЗЭЛ и представителями других серокомплексов альфавирусов.

Интересно отметить, что максимальные разведения МКАТ-34, позволяющие выявить в зараженных разными штаммами вируса Синдбис клетках варьировали, располагаясь в следующем порядке: ВКЛ —> Ф-720 -—> 1381,1383 —> AR-339 ---> ЗЭЛ

4.2. Нспользовгипю IÎ3A для выявления антител к шгрусу гса-ролзсгсой лзаорадш в сыворотках, ссбрсипнл в эдхшяшгяс païîoinx.

Выделение этиологического агента заболевания - вируса карельской лихорадки - ВКЛ (Д К. Львов и др., 1983), получение его адаптированного и высокопродуктивного варианта и отработка способов концентрации и очистки позволило разработать метод иммуно-ферментного определения специфических антител в сыворотках крови человека. Выбор в качестве сорбента антител вируса ВКЛ был основан на том, что ВКЛ обладает сходными, но не тождественными с * прототипным штаммом (Eg AR-339) вируса Синдбис свойствами

Оптимальную концентрацию наносимого в лунки планшет ( "Dynateck") очищенного вирусного антигена определяли в предварительных экспериментах с заведомо положительными сыворотками, используя от 20 нг/мл до 10,0 мкг/млСбелки ВКЛ). В экспериментах по анализу сывороток использовали подобранную оптимальную дозу -0,1 мкг антигена на лунку.

В исследование было взято 185 сывороток, преимущественно от лиц старше 40 лет, проживающих в сельской местности эндемичных районов Карелии и в анамнезе которых были отмечены заболевания с клинической картиной, сходной по симптоматике с карельской лихорадкой. Больная часть таких случаев проходила под диагнозом ОРВИ и "лихорадка невыясненной этиологии", артриты, артрозы, ревматизм. Число положительных сывороток в ИФА составило 64%. Все положительные сыворотки можно было условно разделить на 3 группы: высокотитражнио (вше 12000), средне-(от 6000 до 12000) и низио-титраж;'/ fм-ньа:о ЗССО). В парной и второй группах процент ¡тар--

реляции с положительной реакцией РТГА составлял 29-35£, что может объясняться участием в этих реакциях разных по специфичности (к разным детерминантам вирусного антигена) антител (рис.7).

Практически все сыворотки с высокими титрами специфических антител были получены от лиц, в анамнезе которых были отмечены лихорадка и суставные заболевания, что подтверждает ранние наблюдения о частых суставных осложнениях во время или после перенесенного заболевания.

Разработанный метод может быть использован как высокочувствительный метод скрининга сывороток для изучения степени распространения карельской лихорадки в эндемичных районах.

4.3 1,!этод агглютинации полодэриде частиц для выявления маркеров 1сарельской лихорадки.

Мы использовали также один из альтернативных методов выявления маркеров инфекции карельской лихорадки, основанный на агглютинации полимерных частиц, сенсибилизированных вирусспецифичес-ким антигеном или иммуноглобулинами.

Для разработки новой иммунологической тест-системы были использованы окрашенные (красный или синий цвет) полимерные частицы на основе полиакролеина с узким распределением по размерам (патент ИБХ РАН ). Частицы несут на поверхности альдегидные группы (2,2-2,5 мМ/г), способные в мягких условиях связываться с аминогруппами белков с образованием прочной ковалентной связи. Сенсибилизированные специфическими вирусными антигенами частицы были использованы в реакции пассивной агглютинации (РПА) в ми-кротитрационном варианте. Благодаря высокой удельной плотности полимерных частиц и яркой окраске достигается экспресеность анализа (около 2-2,5 ч) и высокая демонстративность реакции. За положительную реакцию принимается оседание частиц в виде зонтика, за отрицательную - в виде точки (рис.8).

Проведены опыты по отработке условий связывания антигена (цельного и разрушенного детергентом вируса) с носителем, апробированы вариации доз связывания антигена ВКЛ в пределах 10-200 мкг вирусного белга на 1 мл 1%-ной суспензии частиц. Для отработки связывания вирусного агтигена с носителем использовали препараты очищенного вируса Пассивирование сенсибилизированных ПАЛ-частиц проводили с помощью БСА отечественного или импортного производства. " Наилучшие результаты были получены при использовании в качестве стабилизатора продуктов ступенчатого гидролиза яичного альбумина. На нем же готовили разведения

ч во

па-

о а

О &

н о

ТИТРОВАНИЕ Рис. 7 ООО

СЫВОГОТОК ©0

МЕТОЛОМ ИФЛ

■ N « <10 ОввФООФО

X лВ севезоеэеооэо во ОЭ

1 <4 .АТ 1—а—1вкл « овеээвФввоФвэ 00906009 09 N » 39

N я 40

О 0 9 О О 9 О о о О 0

ФФОФО О 0 О 0

еоэоооесвовово о о о о о о'

а.

а. н-

вда

оо*

■а а

Всего 183 проб Положительных 64 %

Габл. N13

Корреляция титров сыворотки в разных тестах

Сыворотки 1 ! РН РТГА ИФА РПА

мышь 1280 640 • 12800 3840.

кролик 640 2560 50000 25600

морск. свинка 320 640 12800 6400

ИАЖ 1280 5120 100000 6000

человек н. 0. 20-80 12800-64000 3200-6400

Примечание. Титр антител дан в величинах, обратных разведении сыворотки

РЕАКЦИЯ ПАССИВНОЙ АГГЛЮТИНАЦИИ СЕИОШИЛИЗИРОВАННЫХ

ЛЛТЕШШХ ЧАСТИЦ - РИА Рис.8

.¿г/.

{

РИА представляет собой метод, основанный на принципе специфической, агглютинации сферических частиц на полианролеиновой

* "*"* основе. При наличии в тестируемой сыворотке антител к ВКЛ реакция между антигеном к антителом вызывает агглютинацию частиц, покрытых вирусным антигеном. Во избежание неспецифической реакции используется искусственный окрашен шй носитель, ковалентло связанный с очищенным вирусным антигеном.

РПА: - высокочувствительна и специфична - время решщии 2,0 - 2,5 часа - проста и экономична (25 м(сл крови)

- визуальная оцешса решсции

- не требует специального оборудования - не требует специального обучения

- безопасна для оператора - пригодна для массового скрининга

Разведение сыворотки »«.^м^м^

(номер ячейки) 1 2 3 (разведение) ¡4 ]д

Распределение частиц

НесенсиОипи 25ы«п 25 мкп/«„сибитоХ аироваиные / э„рова„мь,в

иш

(номер ячейки) ^ 2 з (иомечкое разведение) ] ^ 1'32

титруемых сывороток, которые предварительно прогревали по стандартному методу. Титрование сывороток проводили в планшетах с У-образным дном в микроварианте (объем реакции 50-75мкл).

Для проверки специфичности проверенного диагностикума реакцию ПАЛ-агглютинации проводили с сыворотками крови различных ' животных, иммунными и неиммунными. Было отмечено, что антисыворотки с высокими титрами специфических антител в начальных разведениях (1:5 - 1:20) могут давать ложно отрицательную реакцию. Поэтому за исходное разведение сыворотки обычно брали разведение 1:10. Отрицательная реакция наблюдалась во всех случаях при использовании неиммунных сывороток. Следует подчеркнуть чрезвычайно высокие требования к чистоте вирусного антигена. Показано, что для снижения риска спонтанной агглютинации нагруженных частиц оптимальным является использование 0,1%-ного белкового гидролиэата в фосфатном буфере (0,02 М.рН 7,2) на физиологическом растворе. Испытание полученных конъю-гатов с иммунными сыворотками разных видов животных позволило показать высокую чувствительность и специфичность реакции (табл. 13).

Чувствительность реакции пассивной агглютинации РПА превышала по показателям реакцию нейтрализации в 3-20 раз (для иммунной сыворотки мыши в 3-10 раз, для ИАЖ в 4-8 раз, кроличьей сыворотки более чем в 20 раз, сыворотки морской свинки в 20 раз), в сочетании с высокой специфичностью метода. В сравнении с реакцией РТГА (классическая постановка с эритроцитами гуся) РПА была более чувствительна (до 20 раз с иммунными сыворотками разных видов животных).

Приготовленный ПАЛ-ВКЛ диагностику»« позволял выявлять специфические антитела (разной видовой принадлежности) ко всем исследованным нами вирусам серокомплекса Синдбис - ЗЭЛ. В последнем случае титры сывороток к ЗЭЛ были в 50-100 раз ниже, чем с гомологичным вирусом. С контрольными сыворотками ( к вирусам ВЭЛ, леса Семлики, японского и клещевого энцефалитов) в разведениях, 1:20 и выше положительных реакций не было отмечено. Высокая чувствительность (ПАЛ уступает ИФА в 5-10 раз), специфичность и воспроизводимость реакции ПАЛ-агглютинации была подтверждена при исследовании более 120 сывороток разных видов.

Таким образом, нами были разработаны обгаие принципы конструирования простой диагностической тест-системы, пригодной для проведения массового скрининга сывороток.

ВЫВОДЫ

1. При сравнительном изучении биологических свойств виру- ' га карельской лихорадки и прототипного штамма вируса Синдбис. выявлены штаммовые различия ВКЛ ( ЬЕ1У-0298) и ВС (Ее ЛЯ-339): разный фенотип Оляшкообразования, литическая или хроническая инфекция прч заражении клеток насекомых, изменение З-феногила при смене «щеточной системы культивирования.

Получен высокопродуктивный итамм ВКЛ. адаптированный к клеткам <ЮК, обеспечивающий возможность накопления вируса в препаративных количествах (до 1,2х1010 ВОЕ/мл). Показано, что последовательное клонирование быстропроникаодего в клетки ФЗК вируса ВКЛ приводит к снижению его патогенности для мышей при внутри-мозговом заражении.

2. Впервые получена панель авторских гибридом к вирусу ВКЛ (14 гибридом), обеспечивающих стабильную продукцию моноклональ-ных антител к структурным белкам оболочки вириона.

3. Показано, что шесть высокопродуктивных клеточных гибридом (4-к белку Е1, 2 - к белку Е2) продуцируют МКА к ВКЛ с выраженной антигемагглюгинируодэй (Карел-17,30,34,37) или нейтрализующей инфекционность активностью (Карел-1.34,36). Высокая продуктивность клона Карел-34 в культуре ткани и асците (до 640-1280x10 ед./мл), хорошая приживаемость на мышах (до 902) .позволяют рекомендовать его для создания диагностических тест-систем.

4. Впервые выделены два изолята аяьфавирусов от перелетных птиц в Прибалтике. Штаммы 1381 и 1383 отнесены к Синдбис-ло-добным вирусам на основании перекрестных серологических реакций с поливалентными сыворотками.

5. Изоляты ЬЕIV-9298, 1381 и 1383, 3^720 не дифференцируются в серологических реакциях с поливалентными сыворотками, однако различаются с помощью авторских МКАТ (Карел-34) в РТГА и ШММ. Изоляты ВКЛ. 1381 и 1383. 0-720 рассматриваются как варианты вируса Синдбис, близкие к прототипному штамму Ее АН-339, на основании выявленных биологических особенностей и сходства основных иммуно-химических характеристик.

С. Среди обследованных методом ИФА сывороток человека, собранных в эндемичных районах Карелии, выявлен высокий процент положительных реакций (64%). Наиболее высокие титры антител

отмечены у лиц, в анамнезе которых присутствовали лихорадки и суставные заболевания, что подтверждает литературные данные о частых суставных осложнениях после перенесенной инфекции.

7. Разработаны принципиальные основы конструирования диагностической тест-системы с использованием метода агглютинации ла-, тексных частиц на полиакролеиновой основе для выявления антительных маркеров ВКЛ инфекции.

Список работ, опубликованных по материалам доклада

1. Штамм гибридных культивируемых клеток животных "Карел"-продуцент моноклональных антител к вирусу карельстой лихорадки. / Урываев Л. К , Новохатский А. С. , Михеева Т. Г. , Парасюк Е А. , Попова К С., Шуткова Т.М. , Скворцова Т. М. , Львов Д. К., Дданов ЕМ.// Авт. свидетельство N 1532582. Москва, 1989. /

2. Репродуктивная активность и структурные компоненты вируса карельской лихорадки. /Урываев Л В. , Ионова К С., Парасюк Е А. , Березина Л. К., Злобин А. КХ , Львов Д. К. //Сб. материалов конференции в г. Фрунзе,1986,0. 66-68.

3. Сравнительный анализ полипептидов вирусов Синдбис и карельская лихорадка. /Урываев Л. В. , Злобин А. КЗ. , Березина Л. К. , Ионова К С. , Парасюк Е А. , Глущенко 0. П , Скворцова Г. М., Львов Д. К//Вопросы вирусологии. 1990. N5. С. 393-396.

•4. Выделение и идентификация вируса Синдбис от перелетных • птиц в Эстонии. /Урываев Л. Е , Василенко Е А., Парасюк Е А. , Ионова К. С., Гушяна Е. А., Куллапере А. А. , Лейбак Э. , Львов Д. К. // Вопросы вирусологии. 1992. N 1. С. 67-70. /

5. Моноклональные антитела, дифференцирующие вирусы карельской лихорадки и Синдбис в серологических реакциях. / Парасюк Н. А. , Ионова К. С. , Михеева Т. Г. , Скворцова Г. Ы. , Мельникова Е. Э. , Львов Д. К., Урываев Л. К //Сб. Экология вирусов и диагностика арбовирусных инфекций. Москва, 1989,С. 74-78.

6. Моноклональные антитела к ВКЛ, характеристика биологических свойств. /Урываев Л Е , Гзраскк Е А. , Ионова К. С. , Михеева Т. Г. , Злобин А. Ю. , Скворцова Т. Ы. , Мельникова Е. Э., Глущенко 0. П. , Львов Д. К. //Вопросы вирусологии. 1990. N4. С. 322-326. /

7. Выявление вируса карельской лихорадки методом непрямой иммунофлюоресценции с использованием монооональных антител. /

Парасюк Н. А. , Попова К. С., Урываев Л. Е //Тезисы республиканской конференции. Новые методы диагностики СПИД, других вирусных и бактериальных инфекций в практике инфекционной и противоэпидемической службы, Алушта, 1990,. С. 94-95.

8. Structural and functional characteristics of karellan fever virus and methods of viral infection diagnostics. /L. V. Uryvaev, N. A. Parasjuk.K. S. Ionova.E. I. Samochvalov E. A. Rusavskaya.//Abstracts of International Conference on Medical Biotechnology, Immunization and AIDS, 1991, Leningrad, p2 -15./

9. Разработка метода агглютинации полимерных частиц для выявления маркеров заболевания карельской лихорадкой. /Урываев Л. В. , Ионова К. С. , Парасюк Н. А. , Лукин Ю. Е , Ерохин Е. IL . Зубов В. П. , Львов Д. К. //Материалы юбилейной конференции Томского НИ-ИВС, 1991, С.

10. Рекомбинантная плазмидная ДНК pSKl с ДНК-копией гена гликопротеина El вируса карельской лихорадки. /Урываев Л. В., Русавская Е. А. , Юферов Е П. , Самохвалов Е. И. , Парасюк tt А. , Ионова К. С., Березина Л. К. , Львов Д. К. // Авт. свидетельство N 1526228, Москва, 1989.

11. Выявление РНК вируса карельской лихорадки с помощью ре-комбииангных плазмидных зондов. /Русавская Е. А. , Ионова К. С. , Парасюк IL А., Самохвалов Е. И. , Мельникова Е. Э. , Урываев Л. Е / /Сб. Экология вирусов и диагностика арбовирусных инфекций. Москва, 1989,С. 65-69.

12. Использование зондов, содержащих клонированные гены вируса карельской лихорадки, для выявления генетического материала вируса в заражнных клетках методом молекуляной гибридизации.

/Урываев Л В. , Русавская Е. А. , Самохвалов Е. И., Ионова К С., Парасюк IL А. , Льеюб Д. К//Вопросы вирусологии, 1989,N1,С. 65-69.

Информация о работе

Ионова, Кира Сергеевна
кандидата биологических наук
Москва, 1992
ВАК 03.00.06

Автореферат

Похожие работы