Специфическая диагностика арбовирусных инфекций и анализ ее возможностей

Кучкова, Елена Вадимовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Специфическая диагностика арбовирусных инфекций и анализ ее возможностей
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Специфическая диагностика арбовирусных инфекций и анализ ее возможностей"

На правах рукописи

КУЧКОВА Елена Вадимовна

СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА АРБОВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ И АНАЛИЗ ЕЕ ВОЗМОЖНОСТЕЙ

03.00.06 - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург - 2004

Работа выполнена в Екатеринбургском научно-исследовательском институте вирусных инфекций Минздрава РФ.

Научный руководитель: доктор медицинских наук,

профессор Глинских Нина Поликарповна

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Аксенов Олег Алексеевич

доктор медицинских наук Зазимко Любовь Александровна

Ведущая организация: Институт вирусологии

им. Д. И. Ивановского РАМН

Защита состоится «26» февраля 2004 года в « »часов на заседании диссертационного совета Д 001.043.01 при Научно-исследовательском институте гриппа РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Проф. Попова, 15/17.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Научно-исследовательского института гриппа РАМН.

Автореферат разослан 25 января 2004 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 001.043.01

кандидат медицинских наук Лобова Тамара Геннадьевна

2004-4

19984

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Арбовирусы- многочисленная группа вирусов, представители которой распространены практически повсеместно и выделены во всех климатических поясах, за исключением полярных широт. Для 100 из известных арбовирусов доказана способность вызывать заболевания у людей, и перечень вирусов, патогенных для человека и животных, продолжает увеличиваться [Д.К. Львов, 1989]. В структуре инфекционной патологии населения Российской Федерации особое место занимают природноочаго-вые болезни вирусной этиологии. На территориях Урала, Западной и Восточной Сибири, Дальнего Востока находятся самые обширные по своим масштабам и наиболее значимые по эпидемическому потенциалу природные очаги целого ряда инфекций, в частности: омской геморрагической лихорадки, калифорнийского энцефалита, геморрагической лихорадки с почечным синдромом [Н.С. Савосина, 1992; Ф.Ф. Бусыгин и др., 1999].

Самое широкое распространение из числа регистрируемых трансмиссивных природноочаговых заболеваний по-прежнему имеет клещевой энцефалит. На Урале проблема клещевого энцефалита (КЭ) на протяжении последних лет остается актуальной из-за высокой заболеваемости, большого числа тяжелых клинических форм, увеличения удельного веса хронических форм заболевания, значительной степени инвалидизации и летальности [О.П. Баженова и др.,1999; В.А Борисов, 2000; Л.М. Исачко-ва, 1999].

Сравнение данных о заболеваемости клещевым энцефалитом в Свердловской области с общероссийскими показателями подчеркивает актуальность этого заболевания для Уральского региона. В самом напряженном по клещевому энцефалиту 1996 году она составила 7,0 на 100 000 населения по России и 42,11 - по Свердловской области. Таким образом, заболеваемость жителей области была выше общероссийской в 6 раз [Е.И. Пургаев, 1998]. И хотя этот показатель в течение последних 6 лет снизился до уровня 3,57 на 100 тыс. населения по России и 8,81 - по Свердловской области, проблема клещевого энцефалита (КЭ) остается актуальной из-за высокой заболеваемости, большого числа тяжелых клинических форм, увеличения удельного веса хронических форм заболевания, значительной степени инвалидизации и летальности.

Широкомасштабные исследования по выявлению арбовирусов и их природных очагов показали, что эпидемическая обстановка в отношении арбовирусных инфекций изменилась. На территории России были зарегистрированы и расшифрованы вспышки новых

! птЯ^б 1

Карельская лихорадка, лихорадка Западного Нила, Крымская геморрагическая лихорадка [Д.К. Львов, A.M. Бутенко, С.Я. Гайдамович, 2000; Онищенко Г.Г. и др., 2000].

В ходе ряда исследований с целью обнаружения ранее неизвестных для нашей страны вирусов на территории России была выявлена практически повсеместная циркуляция арбовирусов комплекса калифорнийского энцефалита (Тягиня, Инко, зайца-беляка) и показана их роль в патологии человека [С.Д. Львов, Ю.А. Погорелый, Т.М. Скворцова, 1985; Л.Н. Абрамова и др., 1992; Р.Н. Воробьева и др., 1992; С.Д. Львов, В.Л. Гро-машевский, Т.Н. Морозова, 1997]. В 1990 г. сотрудниками ЕНИИВИ штамм вируса Тягиня был изолирован на территории Свердловской области. [В.Г. Мельников, Т.Т. Федотова, В.Д. Переверзев, 1991].

В сложившейся эпидемической обстановке важное значение имеет применение современных методов исследования арбовирусных инфекций, в том числе наиболее актуальных для Уральского региона клещевого и калифорнийского энцефалита. Иммуноферментный анализ (ИФА), применяемый в диагностических исследованиях, является высокоспецифичным и чувствительным методом. Однако при использовании ИФА для диагностики клещевого энцефалита не выработано еще единых подходов к интерпретации результатов исследований, не раскрыты диагностические возможности метода.

Широкое распространение и тяжесть клинического течения заболеваний, вызываемых арбовирусами, привлекают внимание медицинской науки. Основные направления исследований на сегодняшний день определяются запросами практического здравоохранения, выдвигающего на первый план вопросы совершенствования диагностики, профилактики и лечения клещевого энцефалита.

Цель работы:

Оценить диагностические возможности иммуноферментного метода для прогнозирования течения клещевого энцефалита, а также для определения степени эпиднапряженности природного очага калифорнийского энцефалита на территории Свердловской области.

Задачи исследований:

1. Оценить возможности использования иммуноферментного анализа для диагностики острой формы клещевого энцефалита, определения тяжести клинического течения и прогнозирования исходов заболевания;

2. Выявить динамику антителообразования у больных хронической формой клещевого энцефалита для оценки тяжести и прогнозирования клинического течения болезни.

3. Изучить биологические свойства штамма вируса Тягиня комплекса калифорнийского энцефалита (ККалЭ), выделенного на территории Свердловской области.

4. Определить широту распространения и роль в инфекционной патологии населения Свердловской области вирусов ККалЭ.

5. Оценить возможности применения метода ИФАдля проведения исследований с целью определения серий иммуноглобулина с высоким титром к вирусу Тягиня для перспективного использования в лечебных целях.

Научная новизна

1. Разработаны критерии оценки данных диагностических исследований в ИФА по определению уровня антител к вирусу КЭ у больных проживающих на территории природного очага клещевого энцефалита.

2. Показана возможность использования ИФА для прогнозирования клинического течения клещевого энцефалита с учетом динамики антителообразования.

3. Впервые описаны биологические свойства штамма вируса Тягиня ККалЭ, выделенного на территории Свердловской области, и определена широта его распространения среди населения г.Екатеринбурга.

4. Показана целесообразность применения ИФА для проведения исследований с целью определения серий иммуноглобулина с высоким титром к данному вирусу для перспективного использования в лечебных целях.

Практическая значимость работы:

Подтверждена высокая диагностическая ценность метода иммунофер-ментного анализа, позволяющего проводить оценку тяжести инфекционного процесса, прогнозирование течения заболевания, определение терапевтической тактики и эффективности проводимого лечения у больных острой и хронической формами клещевого энцефалита.

Исследования, проведенные методом иммуноферментного анализа, позволили определить широту распространения и этиологическую роль в возникновении заболевания у жителей Свердловской области вируса Тягиня ККалЭ.

Положения, выносимые на защиту

1. Результаты иммуноферментного анализа могут быть использованы для прогнозирования течения клещевого энцефалита, определения терапевтической тактики и оценки эффективности проводимого лечения у больных острой и хронической формой заболевания.

2. Вирус Тягиня ККалЭ циркулирует среди жителей Свердловской области, и является этиологическим фактором в возникновении инфекционных заболеваний в сезон активности переносчиков.

Апробация работы

Диссертация апробирована на заседании Ученого Совета ЕНИИВИ в 2003 г. Протокол № 3 от 10 апреля 2003 г.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседаниях Ученого Совета ЕНИИВИ, научных конференциях института, Свердловского отделения ВНОМЭП в 1999 - 2002 гг.

Сведения о внедрении

По результатам проведенных исследований оформлена аналитическая справка: «Калифорнийский энцефалит», представленная в Департамент Госсанэпиднадзора Минздрава РФ и получившая положительную оценку.

Результаты исследования нашли отражение в пособиях для врачей «Организация и проведение мониторинга за природными очагами арбови-русных инфекций на Урале» и «Использование иммуноферментного анализа для оценки тяжести и прогнозирования клинического течения клещевого энцефалита», утвержденных Минздравом РФ.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 9 работ.

Объем и структура: диссертации

Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста, содержит 11 таблиц, 8 рисунков, 18 фотографий. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав собственных, заключения, выводов и списка литературы, включающего 132 отечественных и 48 зарубежных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

В ходе выполнения работы серологическому исследованию подвергали сыворотки крови 1821 больного с различными клиническими формами клещевого энцефалита или с подозрением на это заболевание. Исследованы сыворотки крови 716 доноров. Для серологической диагностики клещевого энцефалита применяли ИФА и РТГА. Для постановки реакции торможения гемагглютинации по общепринятому микрометоду использовали 2 штамма вируса клещевого энцефалита: эталонный штамм Софьин, выделенный из мозга больного, погибшего от клещевого энцефалита, полученный из музея вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН и региональный штамм 54, выделенный в очагах КЭ сотрудниками ЕНИИВИ (Авторское свидетельство № 115251, зарегистрировано 22.12.84 г.). Для выявления антител классов М и G методом ИФА использовали тест-системы производства Екатеринбургского НИИ вирусных инфекций совместно с Институтом полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН. Титрование сывороток осуществляли путем 2-кратных серийных разведений, начиная с 1:160.

Провели исследование на наличие антител к вирусам Тягиня и Инко в 296 проб сывороток крови, полученных от 188 больных с отрицательным результатом при исследовании на обнаружение антител к вирусу КЭ и 442 сыворотки крови здоровых людей-доноров крови. Исследования проводили методом ИФА с целью определения антител к вирусу Тягиня и Инко. Для постановки ИФА с целью определения IgM и IgG к вирусу Тягиня использовали диагностическую иммуноферментную тест-систему производства Института вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН. Титрование сывороток осуществляли путем 2-кратных серийных разведений, начиная с 1:50. Учет результатов проводили на спектрофотометре «Multiscan» при длине волны 492 им.

В экспериментах при определении чувствительности лабораторных животных и клеточных культур использовали штамм 476 вируса Тягиня комплекса калифорнийского энцефалита (ККалЭ), изолированный сотрудниками ЕНИИВИ от комаров рода Aedes, собранных в Карпинском районе Свердловской области во второй декаде июля 1990 года.

Восприимчивость к штамму 476 вируса Тягиня ККалЭ лабораторных животных изучали на беспородных белых мышах разного возраста (363 головы) из питомника лабораторных животных Екатеринбургского предприятия бакпрепаратов.

Для выявления чувствительных линий клеточных культур к вирусу ККалЭ проводили исследования на культурах клеток СПЭВ, Vero, BHK-12, L-41 KD/84, RH. В работе использовали культуры клеток (256 проб) из банка-музея клеточных линий и штаммов ЕНИИВИ:

Обработку результатов проводили методом вариационной статистики с вычислением средних величин (М), среднеквадратического отклонения (у), ошибки средней (m). Критерий достоверности различий (р) определяли по таблицам Стъюдента - Фишера. Различия считали достоверными при р< 0,05. Средние величины, ошибку средней и значение среднеквадратического отклонения определяли с помощью программы «Микростат». Все статистические параметры были вычислены с использованием персонального компьютера IBM-486.

Результаты исследований

На первом этапе работы исследования методами РТГА и ИФА сывороток крови больных на наличие антител к вирусу клещевого энцефалита подтвердили высокую информативность и чувствительность иммунофер-ментного анализа, который позволяет выявить, примерно, на 11,7 % пол о-жительных результатов больше в сравнении с РТГА (табл. 1).

Таблица!

Результаты исследования в РТГА сывороток крови больных с диагнозом «острый клещевой энцефалит»

Всего обследовано больных Число больных с положительным результатом

в РТГА в ИФА

Абс.пок. % Абс.пок. %

1386 627 45,2±0,01 789 56,93±0,01

Учитывая то, что территория Свердловской области является напряженным природным очагом клещевого энцефалита, было проведено исследование сывороток крови здоровых людей методом ИФА. Оно показало, что в 72,8 % серопозитивных случаев титр антител класса IgG в сыворотке крови был определен в пределах 1:160-1:320, что позволило ориентировочно принять его за фоновый по Свердловской области (табл.2).

При исследовании сывороток крови больных с подозрением на клещевой энцефалит этот уровень антител имеет диагностическую значимость при наличии явных клинических признаков заболевания и положительных результатов других методов диагностики. Учитываются и данные

Таблица 2

Показатели титра антител класса О в сыворотках крови доноров, положительных при исследовании в ИФА

Титр антител класса в в сыворотке крови Число сывороток

абс.пок. % М±ш

1:160 -1:320 273 72,8±0,02

1:640 44 11,73±0,02

1:1280 40 10,66±0,02

1:2560' ■ 18 4,8±0,01

эпиданамнеза. В таких случаях необходимо повторное, спустя 7 дней после первого, исследование сыворотки крови больного. В этом случае может быть получен прирост антител класса О и определены антитела класса М, что подтверждает диагноз.

При проведении диагностических исследований были зарегистрированы 2 случая врожденного клещевого энцефалита, наблюдаемые у детей, родившихся от одной матери с интервалом 1,5 года. Летом 1997 г. в середине 1 -ой беременности эта женщина была укушена клещом в область головы, в течение 2-х недель отмечалась болезненность в месте укуса. Самочувствие не страдало. Осенью 1997 г. у нее родилась девочка. Состояние новорожденной в первые сутки после рождения тяжелое за счет неврологического статуса и дыхательных расстройств. Девочка поступила в отделение патологии новорожденных ОДКБ № 1. У ребенка наблюдалось отсутствие сухожильных, проприоцептивных, небного и глоточного рефлексов. В дальнейшем отмечались тонико-клонические судороги, нарастание признаков внутричерепной гипертензии, глазодвигательной симптоматики, угнетение сознания, нарушение ритма дыхания, гипертермия до фебрильных значений. При исследовании на наличие антител к вирусу КЭ парных проб сывороток крови девочки выявлено 2-кратное нарастание титра иммуноглобулинов класса М и О. Исследование проб сывороток крови матери, проведенное в это же время, выявило 2-кратное нарастание уровня антител класса М и 4-кратное нарастание титра антител класса О. Диагноз: Внутриутробный клещевой энцефалит, тяжелое течение. После проведенного лечения (б-интерферон, противоклещевой иммуноглобулин, кортикостероиды, противосудорожные препараты, ин-фузионная терапия), девочка в возрасте 2 мес. выписана с положительной динамикой. Дома в возрасте 6 мес. ребенок при невыясненных обстоятельствах умер. Родители от вскрытия отказались.

Спустя 1,5 года у этой женщины родился мальчик. С момента рождения у ребенка отмечалась неврологическая симптоматика: диффузная мышечная атония, арефлексия, бульбарные расстройства. В сыворотке крови на 15 сутки жизни были обнаружены антитела класса в к вирусу КЭ и поставлен диагноз: внутриутробный клещевой энцефалит, энцефаломиелитическая форма, тяжелое течение. Несмотря на проводимое лечение у ребенка в возрасте 1 мес. 26 дней отмечалось ухудшение состояния: эпизоды апноэ, судороги, гипертермия до фебрильных значений. Ребенок умер в возрасте 2 мес. Патоло-гоанатомический диагноз - острый менингоэнцефаломиелит, продуктивный васкулит, некроз и некробиоз нейронов; демиелинизация проводников головного и спинного мозга; отек головного мозга и его оболочек.

Описанные случаи представляют интерес как пример врожденного клещевого энцефалита у детей, родившихся от женщины, перенесшей во время беременности бессимптомную форму инфекции. В данных случаях важное значение приобретает своевременная диагностика клещевого энцефалита, если в анамнезе беременной женщины отмечается укус клеща.

В ходе проводимых исследований были получены данные, свидетельствующие о том, что при клещевом энцефалите отмечается определенная взаимосвязь динамики антителообразования и тяжести клинического течения заболевания. Анализируя динамику выявления антител классов М и в при остром клещевом энцефалите в первые дни болезни отмечали появление антител обоих классов. Уровень антител класса М в 48,53+0,04% случаев имел максимальное значение уже в первой сыворотке крови, при втором обследовании отмечали снижение уровня антител. Это, по нашему мнению, может быть связано с поздним взятием сывороток крови больных, когда антитела класса уже достигли своего максимального титра. При исследованиях, проведенных Кузяевым Р.З. (1997 г.) также наблюдалась отрицательная сероконверсия, которую рассматривали как диагностический тест, свидетельствующий о контакте человека с возбудителем энцефалита, что сопровождалось образованием в невысоком титре, кратковременной их циркуляцией и быстрой элиминацией из кровеносного русла или, возможно, нейтрализацией при формировании иммунных комплексов. В дальнейшем к концу 1-го месяца заболевания выявляли преобладание титра антител класса в над уровнем антител класса М в подавляющем большинстве случаев. Максимальный уровень антител класса М при лихорадочных и менингеальных формах клещевого энцефалита регистрировался в сыворотке крови больного к концу второй недели болезни, при очаговых формах заболевания максимальный уровень антител класса М отмечался на первой неделе заболевания. К концу второго месяца титр иммуноглобулинов класса М у больных лихорадочными и менингеальными формами

клещевого энцефалита понижался. При очаговых формах заболевания уровень антител класса М выявленный на первой неделе болезни снижался медленно, сохраняясь в поздние сроки болезни (31 -60 день). У больных очаговой формой тяжелой степени превышение титров антител класса ^М над уровнем антител класса отмечалось в течение 4 и более месяцев (рис. 1)

Исследования, проведенные методом ИФА, показали, что антитела класса G выявляются на первой неделе болезни в сыворотках крови 82 % больных клещевым энцефалитом. К концу 1-го месяца от начала болезни антитела класса G обнаруживаются в 94-100% при всех формах заболевания. В этот период их титр нарастает и достигает максимальных значений, а в дальнейшем медленно снижается до уровня, который может сохраняться в течение нескольких лет (рис. 2). Кветкова Э.А. (1984 г.) при проведении исследований динамики антителогенеза наблюдала сходную картину, отмечая особенность антителообразования у больных - жителей природных очагов. В этих случаях с первых дней заболевания в крови регистрируется высокий уровень антител IgM и IgG, смена синтеза антител класса М на иммуноглобулины G выражена нечетко в связи с высоким исходным титром антител G.

Как показали наши исследования, спустя 1 -1,5 года, после перенесенного острого КЭ антитела IgM в сыворотке крови реконвалесцентов обычно не обнаруживаются.

Обнаружение антител класса М, в сыворотке крови больного, перенесшего острый КЭ, в течение длительного времени без тенденции к снижению является неблагоприятным прогностическим признаком и указывает на цир -куляцию вируса КЭ в организме больного. Таким пациентам требуется дальнейшее наблюдение и разработка тактики лечения, предотвращающей развитие прогредиентного хронического течения заболевания.

Изучение уровня антител у больных с диагнозом «хронический клещевой энцефалит» позволило выявить, что динамика антителообразования имеет различный характер и может свидетельствовать об активизации инфекционного процесса. Изменение кривой уровня антител свидетельствует, что у больных в стадии обострения хронического процесса регистрировались высокие титры антител М и G в сыворотке крови, что указывало на репродукцию вируса в организме и активизацию инфекционного процесса. Затем наступала стадия стойкой ремиссии, об этом свидетельствовали отсутствие антител класса М и низкий титр антител G.

Наиболее часто встречающийся, волнообразный характер динамики антителообразования у больных с диагнозом «хронический клещевой энцефалит» указывает, что стадия стабилизации хронического процесса сменяется стадией его обострения, сопровождающегося репродукцией вируса.

У больных с относительно стабильным уровнем антител класса М и G инфекционный процесс развивался без заметных стадий ремиссии. При низким титре иммуноглобулинов класса G и постоянном росте в сыворотке крови уровня иммуноглобулинов класса М можно прогнозировать утяжеление инфекционного процесса и неблагоприятный исход заболевания.

Следовательно, наличие ^М в сыворотке крови больного хронической формой клещевого энцефалита свидетельствует об активном инфекционном процессе с репродукцией вируса, что можно выявить, используя метод иммуноферментного анализа, и тем самым оценить тяжесть клинического течения и прогнозировать хронизацию инфекционного процесса.

В ходе следующего этапа исследований были получены данные о биологических свойствах штамма 476 вируса Тягиня ККалЭ, выделенного на территории Свердловской области. С помощью вирусологических методов были изучены чувствительность животных, клеточных культур к штамму 476 вируса Тягиня ККалЭ и его инфекционная активность. Восприимчивость к вирусу изучали на беспородных белых мышах разного возраста. Установлено, что беспородные белые мыши 2-дневного, 10-дневного (массой 5-6 г) и 14-дневного возраста (массой 7-9 г) обладают высокой чувствительностью к выделенному на территории Свердловской области штамму 476 вируса Тягиня ККалЭ, наиболее восприимчивы мыши-сосунки 2-дневного возраста. Инкубационный период при внутримозговом заражении мышей-сосунков 2-дневного возраста составил 48 часа. При заражении в мозг белых мышей 10-дневного возраста инкубационный период был более продолжительным и составил 3-4 суток (72-96 часов), для мышей 14-дневного возраста -4-5 суток (96-120 часов). После инкубационного периода у мышей всех возрастных групп наблюдали клиническую картину экспериментального энцефалита, что проявлялось в виде парезов и параличей передних и задних конечностей. Повышенная возбудимость с нарушением координации движений сменялась вялостью, атаксией. Гибель наступала через 2-4 часа после появления первых клинических признаков. Титр инфекционной активности вируса при внутримозговом заражении исследуемых животных был достаточно высоким (табл.3).

Таблица 3

Восприимчивость экспериментальных животных _к штамму 476 вируса Тягиня_■

Наблюдаемые животные Продолжительность инкубационного периода (час.) Титр инфекционной активности вируса (\$ ЛД50 /0,02мл), М±у

Мыши -сосунки 2-дневного возраста 48 8,47±0,18

Мыши 10-дневного возраста 72-96 8,05+0,39

Мыши 14-дневного возраста 96-120 6,88±0,097

Патогистологическое исследование центральной нервной системы (ЦНС) мышей 10-дневного возраста, забитых на высоте клинических проявлений инфекции, показало, что патологический процесс носил диффузный характер и выявил дистрофически- некробиотические изменения нервных клеток и тяжелые расстройства кровообращения. Особо обращает внимание тяжелое изменения гематоэнцефалитического барьера (стенки сосудов, глии).

В легких наблюдали полнокровие сосудов, множественные кровоизлияния; В селезенке и поджелудочной железе наблюдали умеренно выраженный отек и полнокровие капилляров. При исследовании почек было отмечено резко выраженное полнокровие стромальных сосудов и клубоч-ковых капилляров.

Патологические изменения в печени были выражены в полнокровии печеночных синусов, диффузной вакуольной дистрофии гепатоцитов.

На основании проведенных исследований установлена высокая степень восприимчивости к штамму 476 вируса Тягиня белых мышей разного возраста, проявляющаяся в развитии клинически выраженной инфекции с летальным исходом у мышей при интрацеребральном заражении.

Были проведены также исследования чувствительности к штамму 476 вируса Тягиня линий клеточных культур СПЭВ, Vero, BHK-21, L-41 KD/84, RH. Высокой чувствительностью к штамму 476 вируса Тягиня ККалЭ обладают стандартизованные клеточные культуры СПЭВ и ВПК -21. Наиболее чувствительной к действию вируса Тягиня оказалась культура клеток СПЭВ. Первые цитопатические изменения наблюдали спустя 48 часов после заражения. Отмечали увеличение размера и округление клеток, с нарушением межклеточных связей. Наблюдалось отслаивание клеток от стекла, что в последующем приводило к полному разрушению монослоя. Было проведено электронно-микроскопическое исследование зараженной клеточной культуры СПЭВ и получена элект-ронограмма штамма 476 вируса Тягиня в зараженной этим вирусом культуре клеток СПЭВ.

Цитопатические изменения под воздействием штамма 476 вируса Тягиня в культуре клеток ВНК -21 наблюдали спустя 72 часа после заражения, что проявлялось в появлении большого числа увеличенных клеток округлой формы. Через 96 часов отмечали отслоение клеток от стекла с последующей деструкцией монослоя. Показатели инфекционной активности вируса в культуре клеток СПЭВ и ВНК-21 представлены в таблице 4.

Таблица4

Чувствительность клеточных культур к штамму 476 вируса Тягиня

Клеточные культуры Время появления ЦПД (час.) Титр инфекционной активности (18ТЦД„/мл)М±у.

СПЭВ 48 5,44±0,019

ВНК-21 .76 4,16±0,33

Vero Отсутствие ЦПД Не определяли

L-41 KD/84 Отсутствие ЦПД Не определяли

RH Отсутствие ЦПД Не определяли

Сравнение полученных результатов с данными других авторов, изучавших чувствительность культур клеток и лабораторных животных, подтверждает высокую инфекционную активность вирусов ККалЭ. Абрамова Л.Н. и соавт. (1992г.) определили высокую степень восприимчивости к штамму LEIV-15503, идентичного вирусу Инко ККалЭ, изолированного в республике Коми, отмечается, главным образом, при интрацеребраль-ном заражении белых мышей весом 6-7 г. Титр этого вируса в мозге через 72 часа после заражения составил 8,75 lg ЛД50. Другой штамм вируса ККалЭ LEIV-12718, выделенный и идентифицированный в Архангельской области Савосиной Н.С. и соавт.( 1992 г.), близкий вирусу зайца-беляка, также характеризовался высокой инфекционной активностью при заражении в мозг белых мышей 2-3 и 14-дневного возраста но, в отличие от других представителей ККалЭ, он характеризовался высокой степенью вирулентности при периферическом инфицировании белых мышей 14-дневного возраста. При исследовании чувствительности клеточных культур к штамму LEIV-12718 показано, что этот вирус репродуцируется в клеточных культурах СПЭВ и Vero.

Результаты проведенных исследований позволили выбрать наиболее оптимальные биологические объекты для выделения и культивирования штамма 476 вируса Тягиня, - новорожденные белые мыши, мыши 10-дневного возраста и клеточные культуры СПЭВ и ВНК-21.

Для того чтобы определить широту распространения вирусов ККалЭ среди жителей Свердловской области были проведены исследования сывороток крови здоровых людей. Оценивая результаты, полученные при исследовании с помощью ИФА, можно сделать вывод, что примерно 7% здорового населения имеют антитела класса G к вирусу Тягиня КкалЭ. Антитела к вирусу Инко обнаружены не были.

С целью установления роли вирусов ККАлЭ в инфекционной заболеваемости населения Свердловской области были исследованы сыворотки крови больных с подозрением на клещевой энцефалит, не подтвержденный в серологических реакциях.

При исследовании методом ИФА сывороток крови больных на наличие антител к вирусу Тягиня серопозитивными оказались 21,3 % от числа обследованных. Нарастание титра антител класса О наблюдалось в сыворотках крови 4,2% больных. При исследовании сывороток крови на наличие антител класса М они были обнаружены у 5,32 % обследуемых больных (табл. 5).

Таблица 5

Результаты исследования методом ИФА сывороток крови больных

на наличие антител класса О к вирусу Тягиня

Всего обследовано больных Обнаружены антитела к вирусу Тягиня

1§М 1йО

Лбс.пок. % Абс.пок. %

188 10 5,32±0,02 40 21,27±0,09

Выявление в крови больных антител класса М является подтверждением этиологической роли вируса Тягиня ККалЭ в заболевании и диктует необходимость дифференциальной диагностики клещевого и калифорнийского энцефалита у больных, серонегативных к вирусу клещевого энцефалита Учитывая широкую циркуляцию вирусов ККалЭ и роль этих вирусов в инфекционной патологии человека, нами были проведены исследования готового препарата крови - иммуноглобулина человека нормального донорского на наличие антител к вирусу Тягиня комплекса калифорнийского энцефалита. Метод иммуноферментного анализа позволил выявить 31 из 44 серий иммуноглобулина с высокими титрами антител класса О -1:500 -1:4000 (табл. 6). Высокий процент положительных результатов (70,45+0,068%) при исследовании серий иммунного препарата при относительно невысоких показателях иммунной прослойки населения (7,23+0,01%) объясняется, по-видимому, технологией производства иммуноглобулина, при которой концентрация иммуноглобулинов в готовом препарате во много раз превышает концентрацию в исходное сырье - сыворотке кровидоноров.

Полученные данные позволяют рекомендовать метод ИФА при проведении исследований с целью отбора серий иммуноглобулина с высоким титром антител к вирусу Тягиня для перспективного использования в лечебных целях.

Таблица 6

Серии нормального человеческого иммуноглобулина, ' в которых обнаружены антитела к вирусу Тягиня

Число серий препарата Титры антител в иммуно-препарате Серия и номер препарата

Всего исследовано Антитела обнаружены.

44- 17 1:500-1:1000 С.86 К.244 С.37К.375 С.5 К.72 С.19 К.228 С.94 К.405 С.28 К.294 С.87 К.358 С.45 К.452 С.91К.358 С.40 К.303 С.90К.293 С. 15 К. 185 С.82К.210 С.75К.195 С.6 К. 99 С.9 К.742 С.32 К.345

9 1:2000 С.92К.359 С. 10 К. 152 С.21К.225 С.22К.256: С.93К.395 С.69К.159 С.72К.155 С.9 К. 151 С.8 К.622

5' 1:4000 • С.85 К.243 С.83К.215 С.9 К. 152 С.73 К: 180 С.4 К.66

На основании проведенных исследований подтверждена высокая диагностическая ценность метода иммуноферментного анализа, позволяющего проводить оценку тяжести инфекционного процесса, прогнозирование течения заболевания, что может быть использовано для определения терапевтической тактики и эффективности проводимого лечения у больных острой и хронической формами клещевого энцефалита.

Исследования, проведенные методом иммуноферментного анализа, позволили определить широту распространения вируса Тягиня ККалЭ среди жителей Свердловской области и его роль в краевой инфекционной патологии.

С учетом результатов работы были разработаны и внедрены в практическое здравоохранение ряд предложений по совершенствованию методов специфической лабораторной диагностики клещевого и калифорнийского энцефалита.

выводы

1. Результаты иммуноферментного анализа могут быть использованы для оценки динамики процесса антителообразования в течение острого периода клещевого энцефалита. Титр антител класса М в сыворотке крови больных с лихорадочными и менингеальными формами снижается к началу второго месяца болезни и сохраняется на высоком уровне у больных с тяжелыми формами острого клещевого энцефалита в течение 2 и более месяцев;

2. Длительное присутствие в организме больного острым клещевым энцефалитом иммуноглобулинов класса М без тенденции к снижению является неблагоприятным прогностическим признаком и свидетельствует о развитии прогредиентного хронического течения заболевания.

3. Постоянное наличие антител класса М с незначительными изменениями их уровня в сыворотке крови больных хроническим клещевым энцефалитом характеризует непрекращающееся развитие инфекционного процесса без стадии ремиссии.

4. Титр антител класса в к вирусу КЭ в пределах 1:160 -1:320 является фоновым для жителей Свердловской области, что должно учитываться при интерпретации результатов исследований.

5. Установлено, что высокой чувствительностью к выделенному на территории Свердловской области штамму 476 вируса Тягиня ККалЭ обладают беспородные белые мыши 2,10,14-дневного возраста и стандартизованные клеточные культуры СПЭВ и ВНК - 21.

6. Показано, что вирус Тягиня циркулирует среди жителей Свердловской области и является этиологическим фактором в возникновении инфекционных заболеваний в сезон активности переносчиков.

7. Показана целесообразность использования метода ИФА с целью отбора серий иммуноглобулина с высоким титром антител к вирусу Тяги-ня для перспективного использования в лечебных целях.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. К вопросу о комариных арбовирусах на Урале // Вестник УГМА. -Екатеринбург. - 1997. - вып. 4. - с. 74-76 (в соавт. с И.П. Глинских, В.Д. Переверзевым, И. В .Устьянцевым).

2. Иммуноферментный анализ в диагностике клещевого энцефалита / / Материалы II научно-практической конф., посвящ. 75-летию инфекц. службы. Актуальные проблемы природноочаговых инфекций. -Ижевск, -1998. - с. 230-232 (в соавт. с Н.П..Глинских, И.Г. Перескоковой, В.Д. Переверзевым, Л.И. Волковой).

3. Арбовирусы: классификация, биологические особенности и роль в патологии человека // В сб. Клинико- эпидемиологические аспекты вирусных инфекций. - Екатеринбург. - 1999. - с. 104-110.

4. Принципы лабораторной диагностики арбовирусных инфекций // В сб. Клинико- эпидемиологические аспекты вирусных инфекций. - Екатеринбург. - 1999. - с. 110-114.

5. Комариные арбовирусы на Урале // В сб. Диагностика и, лечение и профилактика инфекционных заболеваний. Биотехнология. Ветеринария. Материалы юбилейной научной конф., посвящ. 50-летию Центра военно-технических проблем биологической защиты НИИ микробиологии МО РФ. - Екатеринбург. - 1999. - с. 44-46. (в соавт. с Н.П. Глинских, В.Д. Переверзевым).

6. Оценка возможностей иммуноферментного анализа для диагностики и прогнозирования клинического течения клещевого энцефалита // Материалы науч. конф., посвящ. 90-летию со дня рождения М.П.Чумакова. Актуальные проблемы медицинской вирусологии. - Москва, -1999, - т.2,-С.17 (в соавт. с Н.П. Глинских, И.Г. Перескоковой, В.А. Борисовым, В.Д. Переверзевым).

7. Биологические особенности комариных арбовирусов рода Буния-вириде, выделенных на Урале // Материалы науч. конф., посвящ. 90-летию со дня рождения М.П.Чумакова. Актуальные проблемы медицинской вирусологии. - Москва, - 1999, - т.2,- с.39 (в соавт. с. В.Д. Переверзевым, И.Г. Перескоковой, В.А. Борисовым, Н.П. Глинских).

8. Вирусы комплекса калифорнийского энцефалита (ККалЭ) на территории Свердловской области // Материалы VIII съезда всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. - Москва, -2002, -С.350. (в соавт. с В.Д. Переверзевым, Н.В.Пацук, Н.П. Глинских).

9. Случаи трансплацентарного заражения вирусом клещевого энцефалита // Принято к публикации материалов VI Российского съезда врачей-инфекционистов, С.-Петербург, 29-31 октября, 2003 г., с. 20-21. (в соавт. с Е.А.Внуковской, Л.А.Уфимцевой).

Автор выражает глубокую признательность доктору медицинских наук, Заслуженному деятелю науки Российской Федерации, профессору, директору ЕНИИВИ Н.П. Глинских; доктору медицинских наук, профессору, ведущему научному сотруднику, руководителю лаборатории трансмиссивных вирусных инфекций и клещевого энцефалита B.C. Кокореву; кандидату медицинских наук, старшему научному сотруднику, зам: директора по научной работе ЕНИИВИ Н.В. Пацук; кандидату медицинских наук, старшему научному сотруднику, ученому секретарю ЕНИ-ИВИ О.Ю. Гоголевой; кандидату биологических наук, старшему научному сотруднику лаборатории респираторных вирусных инфекций Ю.В. Григорьевой; кандидату медицинских наук, старшему научному сотруднику лаборатории трансмиссивных вирусных инфекций и клещевого энцефалита В.Д. Переверзеву; кандидату медицинских наук, старшему научному сотруднику, руководителю лаборатории патоморфологии Л.М. Тулакиной; старшему научному сотруднику лаборатории патоморфологии Н.Я. Пашниной за ценные теоретические и методические рекомендации.

КУЧКОВА Елена Вадимовна

Специфическая диагностика арбовирусных инфекций и анализ ее возможностей

Отпечатано в ИПЦ «Издательство УрГУ» 620083, г. Екатеринбург, ул. Тургенева, 4. Тираж 100 экз. Заказ 70.

» - ? 3.9 9

РНБ Русский фонд

2004-4 19984

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Кучкова, Елена Вадимовна

ВВЕДЕНИЕ.

ЧАСТЬ ПЕРВАЯ. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ К ДИАГНОСТИКЕ АРБОВИРУСНЫХ

ИНФЕКЦИЙ.

1.1. Арбовмрусы н их роль в патологии человека.

1.2. Методы диагностики арбовпруспых инфекций.

ГЛАВА 2. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА В ДИАГНОСТИКЕ АРБОВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ.

2.1. Принцип шнмуноферментного анализа.

2.2.Спсцпфнчность и чувствительность шшупоферментного анализа.'.

ЧАСТЬ ВТОРАЯ. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

ГЛАВА 4. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ В ДИАГНОСТИКЕ КЛЕЩЕВОГО

ЭНЦЕФАЛИТА.

4.1. Использование нммупоферментного анализа в диагностике клещевого энцефалита.

4.2 Диагностические возможности нммуноферментного анализа для оценки тяжести и прогнозирования клинического течения клещевого энцефалита.

ГЛАВА 5. БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИРУСА ТЯГИНЯ, ВЫДЕЛЕННОГО НА ТЕРРИТОРИИ СВЕРДЛОВСКОЙ ОБЛАСТИ

ГЛАВА 6. РАСПРОСТРАНЕНИЕ ВИРУСОВ КОМПЛЕКСА КАЛИФОРНИЙСКОГО ЭНЦЕФАЛИТА НА ТЕРРИТОРИИ

СВЕРДЛОВСКОЙ ОБЛАСТИ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Специфическая диагностика арбовирусных инфекций и анализ ее возможностей"

Актуальность проблемы

Арбовирусы - многочисленная группа вирусов, представители которой распространены практически повсеместно и выделены во всех климатических поясах, за исключением полярных широт. По крайней мере, для 100 из известных арбовирусов доказана способность вызывать заболевания у людей, и перечень вирусов, патогенных для человека и животных, продолжает увеличиваться [70, 71]. Широкомасштабные исследования по выявлению арбовирусов и их природных очагов показали, что эпидемическая обстановка в отношении арбовирусных инфекций изменилась. На территории России были зарегистрированы и расшифрованы вспышки новых арбовирусных инфекций -Карельская лихорадка, лихорадка Западного Нила, Крымская геморрагическая лихорадка [68, 69, 91, 112]. Расширились границы распространения японского энцефалита и лихорадки Денге [115,148]. Заболевания, ранее регистрировавшиеся как спорадические, приняли более массовый, и даже эпидемический характер (клещевой энцефалит, лихорадка долины Рифт, Росс Ривер).

Особое место занимают природноочаговые болезни вирусной этиологии в структуре инфекционной патологии населения Урала, Западной и Восточной Сибири. На этих территориях находятся самые обширные по своим масштабам и наиболее значимые по эпидемическому потенциалу природные очаги целого ряда инфекций, в частности: омской геморрагической лихорадки, калифорнийского энцефалита, геморрагической лихорадки с почечным синдромом [3, 8, 11, 16, 33, 39].

Формирование напряженных очагов арбовирусных инфекций и обострение эпидемической ситуации во многом обусловлено антропогенным преобразованием биосферы и изменением экологической ситуации [70]. Росту заболеваемости клещевым энцефалитом способствовало массовое сокращение акарицидных обработок природных очагов. Учитывая, что последние два года резко сократился объем профилактических прививок против клещевого энцефалита, значение этой инфекции в инфекционной патологии населения не уменьшится.

Широкое распространение и тяжесть клинического течения заболеваний, вызываемых арбовирусами, привлекают все большее внимание медицинской науки. Основные направления исследований на сегодняшний день определяются запросами практического здравоохранения, которые выдвигают на первый план вопросы совершенствования диагностики, профилактики и лечения клещевого энцефалита.

В сложившейся эпидемической обстановке важное значение имеет применение современных методов исследования с целью ранней диагностики арбовирусных инфекций, в том числе наиболее актуальных для Уральского региона - клещевого энцефалита и калифорнийского энцефалита, возбудитель которого - штамм вируса Тягиня был изолирован на территории Свердловской области [77, 94, 95].

В настоящее время в каждой диагностической лаборатории внедрен метод иммуноферментного анализа (ИФА). Иммуноферментный анализ является высокоспецифичным и чувствительным методом исследования. Однако при использовании ИФА для диагностики клещевого энцефалита не выработано еще единых подходов к интерпретации результатов исследований, не раскрыты диагностические возможности метода.

Вышеизложенные положения нашли отражение в планах НИР Екатеринбургского НИИ вирусных инфекций, отраслевых научно-исследовательских программах федерального значения и определили актуальность проведения настоящих исследований.

Цель исследований:

В связи с этим, задачи диссертационной работы определены следующим образом:

• Оценить возможности использования иммуноферментного анализа для диагностики острой формы клещевого энцефалита, определения тяжести клинического течения и прогнозирования исходов заболевания.

• Выявить динамику антителообразования у больных хронической формой клещевого энцефалита для оценки тяжести и прогнозирования клинического течения болезни.

• Изучить биологические свойства штамма вируса Тягиня комплекса калифорнийского энцефалита (ККалЭ), выделенного на территории Свердловской области.

• Определить широту распространения и роль в инфекционной патологии населения Свердловской области вирусов ККалЭ.

• Оценить возможности применения метода ИФА для проведения исследований с целью определения серий иммуноглобулина с высоким титром к вирусу Тягиня для перспективного использования в лечебных целях.

Научная новизна:

• Разработаны критерии оценки данных диагностических исследований в ИФА по определению уровня антител к вирусу КЭ у больных проживающих на территории природного очага клещевого энцефалита.

• Показана возможность использования ИФА для прогнозирования клинического течения клещевого энцефалита с учетом динамики антителообразования.

• Впервые описаны биологические свойства штамма вируса Тягиня ККалЭ, выделенного на территории Свердловской области, и определена широта его распространения среди населения г.Екатеринбурга.

• Показана целесообразность применения ИФА для проведения исследований с целью определения серий иммуноглобулина с высоким титром к данному вирусу для перспективного использования в лечебных целях.

Практическая значимость работы:

Подтверждена высокая диагностическая ценность метода иммуноферментного анализа, позволяющего проводить оценку тяжести инфекционного процесса, прогнозирование течения заболевания, определение терапевтической тактики и эффективности проводимого лечения у больных острой и хронической формами клещевого энцефалита.

Положения, выносимые на защиту

Сведения о внедрении

По результатам проведенных исследований оформлена аналитическая справка: «Калифорнийский энцефалит», представленная в Департамент Госсанэпиднадзора МЗ РФ и получившая положительную оценку.

Результаты исследования нашли отражение в пособии для врачей «Использование иммуноферментного анализа для оценки тяжести и прогнозирования клинического течения клещевого энцефалита», утвержденном в МЗ РФ.

По материалам диссертации опубликовано 9 статей.

ЧАСТЬ ПЕРВАЯ. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Кучкова, Елена Вадимовна

Выводы

4. Титр антител класса G к вирусу КЭ в пределах 1:160 -1:320 является фоновым для жителей Свердловской области, что должно учитываться при интерпретации результатов исследований.

5. Установлено, что высокой чувствительностью к выделенному на территории Свердловской области штамму 476 вируса Тягиня ККалЭ обладают беспородные белые мыши 2, 10, 14-дневного возраста и стандартизованные клеточные культуры СПЭВ и ВНК -21.

7. Показана целесообразность использования метода ИФА с целью отбора серий иммуноглобулина с высоким титром антител к вирусу Тягиня для перспективного использования в лечебных целях.

Автор выражает глубокую признательность доктору медицинских наук, Заслуженному деятелю науки Российской Федерации, профессору, директору ЕНИИВИ Н.П. Глинских; доктору медицинских наук, профессору, ведущему научному сотруднику, руководителю лаборатории трансмиссивных вирусных инфекций и клещевого энцефалита B.C. Кокореву; кандидату медицинских наук, старшему научному сотруднику, зам. директора по научной работе ЕНИИВИ Н.В. Пацук; кандидату медицинских наук, старшему научному сотруднику, ученому секретарю ЕНИИВИ О.Ю. Гоголевой; кандидату биологических наук, старшему научному сотруднику лаборатории респираторных вирусных инфекций Ю.В. Григорьевой; кандидату медицинских наук, старшему научному сотруднику лаборатории трансмиссивных вирусных инфекций и клещевого энцефалита В.Д. Переверзеву; кандидату медицинских наук, старшему научному сотруднику, руководителю лаборатории патоморфологии JI.M. Тулакиной; старшему научному сотруднику лаборатории патоморфологии Н.Я. Пашниной за ценные теоретические и методические рекомендации.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Арбовирусные инфекции составляют наиболее многочисленную группу среди заболеваний вирусной этиологии. Значимость проблемы арбовирусных инфекций определяется масштабами циркуляции вирусов этой группы, постоянной сохранностью возбудителя инфекции в природных очагах, широтой распространения переносчиков и, как следствие этого, опасностью возникновения весьма тяжелых заболеваний, нередко приводящих к инвалидизации и летальному исходу.

Это определило необходимость обследования территории Российской Федерации в отношении очагов арбовирусов, а также осуществления постоянного надзора за состоянием существующих и вновь выявляемых природных очагов. Эпидемическая обстановка в отношении арбовирусных инфекций за последние 10 лет изменилась. В результате проведенных исследований территории нашей страны были выявлены природные очаги вирусов Карельской лихорадки, комплекса калифорнийского энцефалита, лихорадки Западного Нила, Крымской геморрагической лихорадки. Такие заболевания как клещевой энцефалит, геморрагическая лихорадка с почечным синдромом, регистрировавшиеся ранее в виде спорадических случаев, приняли более массовый и даже эпидемический характер.

Уральский регион, в том числе территория Свердловской области, является природным очагом клещевого энцефалита (КЭ) с высоким уровнем заболеваемости, большим числом очаговых и хронических форм.

В сложившейся эпидемической ситуации большое значение имеет применение современных методов исследования с целью ранней диагностики арбовирусных инфекций, в том числе наиболее актуальных для Уральского региона - клещевого энцефалита и, как показали наши исследования, калифорнийского энцефалита, представитель которого - штамм вируса Тягиня был изолирован на территории Свердловской области

Метод иммуноферментного анализа, достаточно апробирован в мировой практике и в настоящее время внедрен в большинстве лабораторий. Однако существует необходимость выработки единого подхода к интерпретации результатов диагностических исследований, оценке динамики антителообразования специфических иммуноглобулинов классов М и G при острых и хронических формах КЭ.

Нами были изучены диагностические возможности иммуноферментного метода для оценки динамики иммуногенеза при острых и хронических формах инфекции и как возможного критерия прогнозирования тяжести течения заболевания, а также для определения степени эпиднапряженности природного очага калифорнийского энцефалита на территории Свердловской области.

Для решения поставленных задач был использован комплекс вирусологических и серологических методов. Основные исследования проводили на модели штамма 476 вируса Тягиня ККалЭ, выделенного на территории Свердловской области, а также с использованием штаммов вируса клещевого энцефалита: эталонного штамма "Софьин" и регионального штамма 54, выделенного в очагах КЭ сотрудниками ЕНИИВИ. В работе были использованы сыворотки крови больных с подозрением на арбовирусные инфекции, сыворотки крови доноров.

Исследования методами РТГА и ИФА сывороток крови больных на наличие антител к вирусу клещевого энцефалита доказали высокую информативность и чувствительность иммуноферментного анализа. ИФА позволяет выявить, примерно, на 11,69±0,01% положительных результатов больше в сравнении с РТГА. По нашим данным, титр антител 1:160 -1:320, который нами определен в качестве фонового для Свердловской области, имеет диагностическую значимость при наличии явных клинических признаков заболевания и положительных результатов других методов диагностики. В таких случаях необходимо повторное исследование сыворотки крови больного на наличие антител классов G и М к вирусу клещевого энцефалита методом ИФА спустя 5 — 7 дней после первого исследования. Прирост антител класса G и наличие антител класса М могут служить критериями, подтверждающими диагноз.

В ходе проводимых исследований были получены данные, свидетельствующие о том, что при клещевом энцефалите отмечается определенная взаимосвязь динамики антителообразования и тяжести клинического течения заболевания. Анализируя динамику выявления антител классов М и G при остром клещевом энцефалите, в первые дни болезни отмечали появление антител обоих классов. В дальнейшем к концу 1-го месяца заболевания выявляли превышение титра антител класса G над уровнем антител класса М в подавляющем большинстве случаев. В максимальных показателях уровень антител класса М при лихорадочных и менингеальных формах клещевого энцефалита регистрировался в сыворотке крови больного к концу второй недели болезни, при очаговых формах заболевания максимальный уровень антител класса М отмечался на первой неделе болезни. К концу второго месяца титр иммуноглобулинов М у больных лихорадочными и менингеальными формами клещевого энцефалита понижался. При очаговых формах заболевания уровень антител класса М, выявленный на первой неделе болезни, снижался медленно, сохраняя высокий уровень в поздние сроки болезни (31-90 день). У больных очаговой формой клещевого энцефалита превышение титров IgM над уровнем IgG отмечалось в течение 4 и более месяцев.

Как показали исследования, антитела класса G выявляются на первой неделе болезни в сыворотках крови 82 % больных острой формой клещевого энцефалита. К концу 1-го месяца от начала болезни антитела класса G обнаруживаются у 94-100 % заболевших. В этот период титр антител класса G нарастает и достигает максимальных значений и в дальнейшем медленно снижается до уровня, который может сохраняться в течение нескольких лет.

Обнаружение антител класса М, в сыворотке крови больного, перенесшего острый КЭ, в течение длительного времени без тенденции к снижению является неблагоприятным прогностическим признаком и указывает на циркуляцию вируса КЭ в организме больного. Это требует дальнейшего наблюдения по выявлению репродукции вируса, способной привести к развитию прогредиентного хронического течения заболевания.

Изучение уровня антител у больных с диагнозом «хронический клещевой энцефалит» позволило установить, что динамика антителообразования имеет различный характер и может свидетельствовать об активизации инфекционного процесса. Снижающаяся кривая уровня антител свидетельствует, что у больных в стадии обострения хронического процесса регистрировались высокие титры антител М и G в сыворотке крови, что указывало на репродукцию вируса в организме и активизацию инфекционного процесса, а затем наступала стадия стойкой ремиссии. Об этом свидетельствовали отсутствие антител класса М и низкий титр антител G.

Наиболее часто встречающийся волнообразный характер динамики антителообразования у больных с диагнозом «хронический клещевой энцефалит» указывал на то, что стадия стабилизации хронического процесса сменяется стадией его обострения, сопровождающегося репродукцией вируса.

У той группы больных, где уровень антител класса М и G в течение нескольких лет оставался относительно стабильным либо отличался небольшими колебаниями, инфекционный процесс развивался без заметных стадий ремиссии. При низким титре иммуноглобулинов класса G и постоянном повышении в сыворотке крови уровня иммуноглобулинов класса М можно прогнозировать утяжеление инфекционного процесса и неблагоприятный исход заболевания.

Следовательно, наличие IgM в сыворотке крови больного хронической формой клещевого энцефалита свидетельствует об активном инфекционном процессе с репродукцией вируса, что можно выявить, используя метод иммуноферментного анализа, и тем самым оценить тяжесть и прогнозировать течение острых и хронических форм заболевания.

В ходе следующего этапа исследований были получены данные о биологических свойствах штамма 476 вируса Тягиня ККалЭ, выделенного на территории Свердловской области. С помощью вирусологических методов были изучены чувствительность животных, клеточных культур к штамму 476 вируса Тягиня ККалЭ и его инфекционная активность. Восприимчивость к вирусу изучали на беспородных белых мышах разного возраста. Установлено, что беспородные белые мыши 2-дневного, 10-дневного (массой 5-6 г) и 14-дневного возраста (массой 7-9 г) обладают высокой чувствительностью к выделенному на территории Свердловской области штамму 476 вируса Тягиня ККалЭ, наиболее восприимчивы мыши-сосунки 2-дневного возраста. После инкубационного периода, длительность которого колебалась у животных разного возраста от 2 до 5 суток, у мышей наблюдали клиническую картину экспериментального энцефалита, что проявлялось в виде парезов и параличей передних и задних конечностей. Повышенная возбужденность с нарушением координации движений сменялась вялостью, атаксией. Гибель наступала через 2—4 часа после появления первых клинических признаков. Титр вируса при внутримозговом заражении сосунков белых мышей после проведенных пассажей составил 8,47±0,18 ^ЛД50 /0,02мл, мышей 10-дневного возраста - 8,05±0,39 lg ЛДзо /0,02мл, мышей 14-дневного возраста - 6,88±0,097 lg ЛД50 /0,02мл.

Патогистологическое исследование центральной нервной системы (ЦНС) мышей 10-дневного возраста, забитых на высоте клинических проявлений инфекции показало, что патологический процесс носил диффузный характер и выявил дистрофически- некробиотические изменения нервных клеток и тяжелые расстройства кровообращения, характерные для вирусного энцефалита.

В легких, почках, печени мышей наблюдали полнокровие сосудов, множественные кровоизлияния. В селезенке и поджелудочной железе -умеренно выраженный отек и полнокровие капилляров.

На основании проведенных исследований установлена различная степень восприимчивости к штамму 476 вируса Тягиня белых мышей разного возраста, проявляющаяся в развитии клинически выраженной инфекции с летальным исходом у мышей при интрацеребральном заражении.

При проведении исследований по выяснению чувствительности к штамму 476 вируса Тягиня ККалЭ линий клеточных культур СПЭВ, Vero, ВНК-12, L-41 KD/84, RH было показано, что высокой чувствительностью к изучаемому штамму обладают стандартизованные клеточные культуры СПЭВ и ВНК -21. Цитопатические изменения в культуре клеток ВНК -21 наблюдали спустя 72 часа после заражения, в культуре клеток СПЭВ - через 48 часов, что проявлялось в появлении большого числа увеличенных клеток округлой формы, нарушении межклеточных связей. Наблюдалось отслаивание клеток от стекла, что через 96 часов приводило к полному разрушению монослоя. Титр инфекционной активности вируса в культуре клеток СПЭВ составил 5,44±0,019 lg ТДДзо / 1 мл, в культуре клеток ВНК -21 - 4,16±0,33 lg ТЦЦ50 / 1 мл.

Результаты проведенных исследований позволили выбрать наиболее оптимальные биологические объекты для выделения и культивирования штамма 476 вируса Тягиня - новорожденных белых мышей, мышей 10 и 14-дневного возраста, клеточные культуры СПЭВ и ВНК -21.

Для того чтобы определить широту распространения вирусов ККалЭ на территории Свердловской области были проведены исследования сывороток крови здоровых людей - доноров сырья для производства иммунобиологических препаратов (нормальных иммуноглобулинов человека).

Оценивая результаты, полученные при исследовании сывороток крови доноров крови с помощью метода ИФА., можно сказать, что примерно 7% здорового населения имеют антитела класса G к вирусу Тягиня ККалЭ.

С целью установления роли вирусов ККалЭ в инфекционной заболеваемости населения Свердловской области были исследованы сыворотки крови больных с подозрением на клещевой энцефалит, не подтвержденным в серологических реакциях (РТГА и ИФА). При исследовании методом ИФА сывороток крови больных на наличие антител к вирусу Тягиня серопозитивными оказались 21,27±0,09% от числа обследованных. Нарастание титра антител класса G наблюдалось в сыворотках крови 4,2±0,03% больных. У 2,6±0,03% обследуемых выявлен 4-х кратный прирост антител в парных сыворотках крови, в 1,6±0,02% случаях регистрировался 2-кратный прирост IgG. При исследовании сывороток крови на наличие антител класса М к вирусу Тягиня IgM были обнаружены у 5,32±0,02% обследуемых больных.

Полученные данные являются подтверждением этиологической роли вируса Тягиня ККалЭ в заболевании калифорнийским энцефалитом на территории Свердловской области, по крайней мере, у 5,3 % обследованных, что диктует необходимость дифференциальной диагностики клещевого и калифорнийского энцефалита у больных, серонегативных при определении антител к вирусу клещевого энцефалита.

Учитывая широкую циркуляцию вирусов ККалЭ и роль этих вирусов в инфекционной патологии человека, нами были проведены исследования готового препарата крови — иммуноглобулина человека нормального донорского на наличие антител к вирусу Тягиня комплекса калифорнийского энцефалита. Метод иммуноферментного анализа позволил выявить 31 из 44 серий иммуноглобулина с высокими титрами антител класса G - 1:500 - 1:4000. Высокий процент положительных результатов (70,45±0,068%) при исследовании серий иммунного препарата при относительно невысоких показателях иммунной прослойки населения (7,23±0,01%) объясняется, технологией производства иммуноглобулина, при которой концентрация иммуноглобулинов в готовом препарате во много раз превышает концентрацию в исходное сырье - сыворотке крови доноров.

Полученные данные позволяют рекомендовать метод ИФА при проведении исследований с целью отбора серий иммуноглобулина с высоким титром к вирусу Тягиня для перспективного использования в лечебных целях при заболеваниях, вызываемых этим вирусом.

На основании проведенных исследований подтверждена высокая диагностическая ценность метода иммуноферментного анализа, позволяющего проводить оценку тяжести инфекционного процесса, прогнозирование течения заболевания, определение эффективности проводимого лечения у больных острой и хронической формами клещевого энцефалита.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Кучкова, Елена Вадимовна, Санкт-Петербург

1. Баррет Т., Берд П., Клегг Дж. и др. Вирусология. Методы// Пер. с англ./ под ред. Мейхи Б. М. «Мир», 1988.

2. Барыгина М.М., Логинова Н.В. Идентификация флавивирусов с помощью высокоспецифического иммуноферментного анализа// Вопр. вирусол. 1991.- Т.36. - №6. - С.526 -527.

3. Башкирцев В.Н., Иванов А.П., Ливанова Г.П. Разработка и применение иммуноферментного анализа при изучении клещевого энцефалита// Сб. Актуальные проблемы медицинской вирусологии. — Москва, 1985.- С. 43.

4. Болотин Е.И., Цициашвили Г.Ш., Голычева И.В., Бурухина И.Г. Возможности факторного прогнозирования заболеваемости клещевым энцефалитом в Приморском Крае// Паразитология.- 2002,- 30, №4.- С.280-285.

5. Борисов В.А., Ющук Н.Д., Малое КВ., Аитов К.А. Особенности клещевого энцефалита в различных регионах// Эпидемиология и инфекционные болезни. 2000.- №2. - С.43-47.

6. Бочкова Н.Г., Башкирцев В.Н., Левина JI.C. и др. Опыт применения иммуноферментного метода для индикации вируса клещевого энцефалита в различных очагах// Вопр. вирусол. 1990. -Т. 35. - №5.- С. 165-167.

7. Бутенко A.M., Ковтунов А.И., Хуторецкая Н.В., Галгтзянов Х.М., Ларичев В.Ф. и др. Выделение штамма Act 901 вируса Западного Нила из крови больного человека в Астраханской области в 2000 г.// Вопр. вирусол. 2001. -№6.-С. 31-32.

8. Владимирцева Е.А., Бакулина Е.А., Морозова Т.Н., Львов С.Д. Идентификация вирусов серогруппы калифорнийского энцефалита и выявление специфических антител к ним методом иммуноблота// Итоги науки и техники. Вирусология. М. - 1992. - т.28. - С. 36 -45.

9. Волкова ЛИ Клиническая характеристика больных клещевым энцефалитом в сезон 1991 г.// Сб. Эпидемиология, клиника и профилактика вирусных инфекций. Екатеринбург, 1992. - С.146 - 151.

10. Вышемирский О.И., Петров В.А., Бутенко A.M., Жуков А.Н., Щелканов М.Ю. и др. Выделение вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки от больного человека в Волгоградской области летом 2001 г.// Вопр. вирусол.-2001.-№4. с. 21-22.

11. Гайдамович С.Я. Арбовирусы: классификация и таксономия// Сб. Арбовирусы. Москва. - 1986. - С.5-15.

12. Гайдамович С.Я., Мельникова Е.Э., Хусаинова А.Д. и др. Реакция радиального гемолиза в диагностике клещевого энцефалита// Вопр. вирусол. -1981. -№3. С.347-350.

13. Галкина И.В., Бутенко A.M., Кузнецов А.А., Громашевский В.Л., Скворцова Т.М. Изучение циркуляции вирусов серогруппы калифорнийского1.lэнцефалита на территории Поволжья// Итоги науки и техники. Вирусология. -М., 1992.-Т.27. - С. 61 - 69.

14. Глинских Г.А. Эпидемиологические особенности клещевого энцефалита в республике Башкортостан// Материалы 8 Всероссийского съезда эпидемилогов, микробиологов и паразитологов, Москва, 26 28 марта, 2002. Т.1.- М.,2002.- С.306.

15. Глинских Н.П., Федотова Т.Т., Перескокова КГ. и др. Возможности комплексной диагностики вирусных энцефалитов в Свердловской области// Вопр. вирусол. 1994. - №4. - С. 190.

16. Гришанова А.П., Азарян А.Р., Галимзянов Х.М. Серологическая диагностика арбовирусных инфекций в астраханской области в 1999 году // Тр. Астрах, гос. мед. акад.- 2000.- 19.- С.205-207.

17. Громашевский В.Л. Методы изоляции арбовирусов// Сб. Арбовирусы. -Москва, 1986. С.90-93.

18. Деменев В.А., Логинова Н.В., Лебедева Г.А., Артеменко Н.Л., Гайдамович С.Я. Некоторые итоги изучения флавивирусных инфекций человека в Хабаровском крае// Итоги науки и техники. Вирусология. М., - 1992. — т.27. -С.22-25.

19. Дементьева Л.А., КовальИ.Л., Труханова Л.П., Черкес Н.Н. Клещевой энцефалит и иксодовый клещевой боррелиоз в Калининградской области// Здоровье населения и среда обитания: Ежемес. инф. бюл,- 2001.- №5.- С.26-27.

20. Демихов В.Г. Исходы и прогноз заболеваний, вызываемых вирусами Инко и Тягиня// Вопр. вирусол. 1995. - №2. - С.72-74.

21. Демихов В.Г., Чайцев В.Г., Бутенко A.M., Недялкова М.С. Изучение заболеваний, вызванных вирусами серогруппы калифорнийского энцефалита. // Итоги науки и техники. Вирусология. М., — 1992. - Т.27. - С. 112 — 119.

22. Дерябин П.Г., Лебедева Г.А., Логинова Н.В. Взаимосвязь некоторых биологических свойств флавивирусов в условиях персистенции// Сб. Арбовирусы. Москва, 1981. - С.68-72.

23. Ермаков A.M., Чиров П.А., Щербаков С.А. Комары (Diptera, Culicidae) как возможные переносчики некоторых арбовирусов в Саратовской области// Проблемы энтомологии в России. 1998. -№1. - С.137-138.

24. Ерман Б.А., Зайцева Л.Н., Образцова Р.Г. и др. К проблеме клещевого энцефалита на Среднем Урале// Материалы науч. конф., посвящ. 90-летию со дня рождения М.П.Чумакова. Актуальные проблемы медицинской вирусологии. -Москва, 1999. Т.2.- С.25.

25. Ерман Б.А., Конев В.П., Ройхелъ В.М. Вирусные инфекции центральной нервной системы (патологическая анатомия, патогенез, диагностика)// Екатеринбург, 1996.

26. Жданов В.М., Ершов Ф.И. Молекулярные основы биологии арбовирусов//М. «Медицина», 1973.

27. Жулев Н.М., Шафикова Э.Р. Лихорадочная форма клещевого энцефалита// Сб. Неврология иммунология. Мат. 10-й научно-практ. конф. неврологов. 28 - 31 мая 2001г. - Санкт-Петербург, 2001. - С.85 -87.

28. Заводчикова Е.Н., Лаврова Н.А., Коваленко В.А. Использование биотин-стрептавидинового комплекса в ИФА для индикации вируса клещевого энцефалита в переносчиках // Итоги науки и техники. Вирусология. М., — 1992. -т.28. - С.61 -65.

29. Иммунологические методы./ Под ред. Фримеля Г., Пер. с нем.// М. «Медицина», 1987.

30. Исачкова Л.М., Леонова Г.Н., Фисенко А.Ю. и др. Современные аспекты патологии клещевого энцефалита// Материалы науч. конф., посвящ. 90летаю со дня рождения М.П.Чумакова. Актуальные проблемы медицинской вирусологии. Москва, 1999. - Т.2.- С.26.

31. Караванов А.С., Ливанова Г.П., Баннова Г.Г. и др. Сопоставление чувствительности твердофазных иммуносорбентных методов диагностики клещевого энцефалита// Вопр. вирусол. 1990.- Т. 35. - №5. - С. 162-165

32. Кармышева В.Я. Поражение клеток при вирусных инфекциях. // М. «Медицина», 1981.

33. Каталог Российской коллекции клеточных культур II Санкт-Петербург, Омск: издательство ОмГПУ, 1999. -226 с.

34. Кветкова Э.А. Вирусологические и иммунологические аспекты патогенеза клещевого энцефалита// Автореф. дисс. доктор мед.наук. -Ленинград, 1984.

35. Клисенко Г.А. Лабораторная диагностика арбовирусных инфекций// Сб. Арбовирусы. Москва, 1986. - С.36-42.

36. Клисенко Г.А. Реакция непрямой гемагглютинации// Сб. Арбовирусы. -Москва, 1986. С.135-140.

37. Козлов Л.Б. К вопросу об этиологии прогредиентных форм клещевого энцефалита// Сб. Неврология иммунология. Мат. 10-й научно-практ. конф. неврологов. 28-31 мая 2001г. - Санкт-Петербург, 2001. - С.143 -145.

38. Козлов Л.Б., Гладышев С.П., Тилюхина Т.Х., Волков Е.В. Особенности патогенеза различных форм клещевого энцефалита// Сб. Неврология -иммунология. Мат. 10-й научно-практ. конф. неврологов. 28-31 мая 2001г. — Санкт-Петербург, 2001. С. 145 - 147.

39. Колобухина Л.В., Львов Д.К, Скворцова Т.М. и др. Заболевания в России, асоциированные с вирусами серогруппы калифорнийского энцефалита// Вопр. вирусол. 1998. -№1. - С. 14-17.

40. Конев В.П., Тулакина Л.Г., Полищук Т.Н., Кветкова Э.А., Лукьяненко Д.Ф., Рыкова А.А. Морфогенез инкубационного периода клещевого энцефалита: роль сосудов головного микроциркуляторного русла мозга, выделение вирусной

41. РНК// Сб. Эпидемиология, клиника и профилактика вирусных инфекций. -Екатеринбург, 1992.-С.151 158.

42. Коробейникова А.С., Нафеев А.А., Громашевский В.П., Скворцова Т.М. Специфические маркеры циркуляции вирусов Тягиня, Инко и Батаи в Ульяновской области// Эпидемиология и инфекционные болезни. 2003. - №2. -С.53-55.

43. Краснова Е.М., Львов Д.К, Жуков А.Н., Шторм Л.В., Русакова Н.В., Фролова Г.И. и др. Эпидемиологический мониторинг лихорадки Западного Нила в Волгоградской области// Вопр. вирусол. 2001. - №4. - С. 27-31.

44. Круглое КВ., Огиенко О.Л., Знойко О.О. и др. Исследование сероконверсии к различным антигенам вируса гепатита С у больных гепатитом С с различными исходами// Вопр. вирусол. 2003. - №3. - С. 36-40.

45. Кузяев Р.З. Совершенствование иммунологических методов исследования м их применение в клинико-лабораторной и эпидемиологической диагностике клещевого энцефалита// Автореф. дисс. доктор мед.наук. — Челябинск, 1997.

46. Ларичев В.Ф., Атанадзе С.Н. Кущ А.А., Бутенко A.M. Получение и использование моноклональных антител к вирусу Инко (Bunyaviridae, Bunyavirus) для дифференциации вирусов калифорнийской серогруппы// Вопр. вирусол. 1998. - №4. - С. 173-176.

47. Ларичев В.Ф., Бутенко A.M., Громашевский В.Л. и др. Идентификация штаммов вирусов калифорнийской серогруппы (Bunyaviridae, Bunyavirus) с использованием моноклональных антител к вирусу Инко// Вопр. вирусол. -1999.-№1.с.9-12.

48. Лебедева С.Д., Помелова В.Г., Быченкова Т.А. и др. Экспресс-индикация вирусов серогруппы калифорнийского энцефалита в суспензиях экспериметально-зараженных комаров методом ЛИФА и ИФА// Сб. научных трудов. Новороссийск, 1994-С. 312-313.

49. Леонова Г.Н. Исторические этапы изучения клещевого энцефалита на Дальнем Востоке// Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1997. - №5. - С. 91-93.

50. Литвин В.Ю. Природноочаговые инфекции: ключевые вопросы и новые позиции// Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. -1999. -№5.-С. 26-33.

51. Львов Д.К., Аристова В.А., Громашевский В.Л., Скворцова Т.М., Байко В.А. Новый вирус Кама (Flaviviridae, Flavivirus, антигенная группа Тюлений), изолированный из клещей Ixodes Zividus// Вопр. вирусол. 1998. - №2. - С.71-74.

52. Львов Д.К., Бутенко A.M., Вышемирский О.И., Гайдамович С.Я. и др. Выделение вируса лихорадки Западного Нила от больных людей в периодэпидемической вспышки в Волгоградской и Астраханской областях// Вопр. вирусол. 2000. - №3. - С. 9-13.

53. Львов Д.К., Бутенко A.M., Гайдамович С.Я. и др. Эпидемические вспышки менингита и менингоэнцефалита в Краснодарском крае и Волгоградской области, вызванные вирусом Западного Нила// Вопр. вирусол. -2000.-№1.-С. 37-39.

54. Львов Д.К., Клименко С.М., Гайдамович С.Я. и др. Арбовирусы и арбовирусные инфекции//М. «Медицина», 1989.- 336с.

55. Львов Д.К., Лебедев АД. Экология арбовирусов// М. «Медицина», 1974. 126с.

56. Львов С.Д., Громашевский В.Л., Морозова Т.Н. и др. Распространение вирусов серогруппы калифорнийского энцефалита Bunyaviridae, Bunyavirus) в северных широтах России// Вопр. вирусол. 1997. - №5. - С.229-235.

57. Львов С.Д., Громашевский В.Л., Скворцова Т.М. и др. Передаваемые комарами арбовирусы в Прибайкалье и Забайкалье// Вопр. вирусол. 1995. - №4. -С. 170- 172.

58. Мельников В.Г., Амосов М.Л., Андреева Е.А. и др. Динамика титров антител у больных при клещевом энцефалите и его сочетани с Лайм-боррелиозом// Материалы науч. конф., посвящ. 90-летию со дня рождения

59. М.П.Чумакова. Актуальные проблемы медицинской вирусологии. Москва, 1999.-Т.2.- С.35.

60. Мельников В.Г., Андреева Е.А., Власова JI.B. и др. Лабораторная диагностика вессенне-летних инфекций в Екатеринбурге в эпидемический сезон клещевого энцефалита// Клиническая лабораторная диагностика. -Екатеринбург, 1998. №7. - С. 21-23.

61. Мельников В.Г., Федотова Т.Т., Переверзев В.Д. Изоляция Тягиня-подобного вируса на севере Свердловской области// Сб. Эпидемиология, клиника и профилактика вирусных инфекций. Свердловск. - 1991. - С.93-95.

62. Мельникова А. П., Пирогова Н.П., Михайловна О.В., Карпова М.Р., Буров О.В. и др. Особенности фагоцитарной активности лейкоцитовпериферической крови у больных клещевым энцефалитом// Бюл. эксперим.биол. и мед. 2002. - Прил.1.- С.82- 84.

63. Мельникова Е.Э. Антигены арбовирусов для серологических реакций// Сб. Арбовирусы. Москва, 1986. - С.99-104.

64. Мельникова Е.Э. Иммунные сыворотки и асцитные жидкости к арбовирусам// Сб. Арбовирусы. Москва, 1986. - С. 104-107.

65. Мельникова Е.Э. Реакция гемагглютинации и торможения гемагглютинации// Сб. Арбовирусы. Москва, 1986. - С. 126-135.

66. Мельникова Е.Э. Реакция радиального гемолиза в геле// Сб. Арбовирусы. Москва, 1986. - С. 153-158.

67. Мельникова Е.Э. Реакция связывания комплемента в диагностике арбовирусных заболеваний// Сб. Арбовирусы. Москва, 1986. - С. 140-146.

68. Москвитина Э.А., Водяницкая С.Ю., Ломов Ю.М., Пичурина Н.Л. др. Крымская геморрагическая лихорадка в Ростовской области: эпидемиологическое районирование и активности природного очага// Ж. микробиол., эпидемиол. и иммунол.- 2002.- №6.- С.26-30.

69. Надеждина М.В., Полякова А.Ю. Клинико серологические особенности у больных с различными формами острого клещевого энцефалита при новом методе введения отечественного иммуноглобулина // Ж. инфекц. патол.- 2000.-7, №3-4.,-С. 13-18.

70. Общая и частная вирусология. Руководство. Том 1, 2J Под ред. Жданова В.М., Гайдамович С.Я. // М. «Медицина»., 1982.

71. Оганесян А. С. Циркуляции вируса клещевого энцефалита в Армении// Ж. микробиол., эпидемиол. и иммунол.- 2002.- №1.- С. 107-108.

72. Ошерович A.M., Калошина JI.A., Кюрегян А.А. Заболеваемость клещевым энцефалитом и геморрагической лихорадкой с почечным синдромом в России//Мед. паразитол. и паразитар. болезни.- 2001.- №3.- С.36-38.

73. Пеньевская Н.А., Наволокин О.В., Мансуров В.Г. и др. Иммуноферментный анализ при изучении содержания вируса клещевого энцефалита в отдельных особях членистоногих// Природноочаговые болезни человека. Омск, 1988. - С.65 -75.

74. Переверзев В.Д., Бубенщиков А.В., Федотова Т.Т. Комары в эпидпроцессе клещевого энцефалита// Сб. Эпидемиология, клиника и профилактика вирусных инфекций. Свердловск, 1991. - С.91-93.

75. Переверзев В.Д., Федотова Т.Т., Мельников В.Г., Тихомирова Л.Г. Комариные арбовирусы на Урале// Сб. Эпидемиология, клиника и профилактика вирусных инфекций. Екатеринбург, 1992. - С. 114 - 116.

76. Пиценко Н.Д., Кветкова Э.А, Илюшенко Л.П., Шаманин В.А., Плетнев А.Г. Способ диагностики клещевого энцефалита// А.с. 1778692 А1 СССР, МКИ 5 G 01 Т 33/48. № 4861877/14, Бюл. №44 (SU), - 30/11 - 1992.

77. Пичурина Н.Л., Прометной В.И., Баташев В.В., Иванидзе Э.А., Начетов В.Г., Мухурадзе Т.А., Подоляко М.П., Драное И.Ю. Изучение

78. ОшеровичА.М., Калошина Л.А., Кюрегян А.А. Заболеваемость клещевым энцефалитом и геморрагической лихорадкой с почечным синдромом в России//Мед. паразитол. и паразитар. болезни.- 2001.- №3.- С.36-38.

79. Пенъевская Н.А., Наволокин О.В., Мансуров В.Г. и др. Иммуноферментный анализ при изучении содержания вируса клещевого энцефалита в отдельных особях членистоногих// Природноочаговые болезни человека. Омск, 1988. - С.65 -75.

80. Переверзев В.Д., Бубенщиков А.В., Федотова Т.Т. Комары в эпидпроцессе клещевого энцефалита// Сб. Эпидемиология, клиника и профилактика вирусных инфекций. Свердловск, 1991. - С.91-93.

81. Переверзев В.Д., Федотова Т.Т., Мельников В.Г., Тихомирова Л.Г. Комариные арбовирусы на Урале// Сб. Эпидемиология, клиника и профилактика вирусных инфекций. Екатеринбург, 1992. - С. 114 - 116.

82. Пиценко Н.Д., Кветкова Э.А, Илюшенко Л.П., Шаманил В.А., Плетнев А.Г. Способ диагностики клещевого энцефалита// А.с. 1778692 А1 СССР, МКИ 5 G 01 Т 33/48. -№ 4861877/14, Бюл. №44 (SU), 30/11 - 1992.

83. Погодина В.В., Фролова М.П., Ерман Б.А. Хронический клещевой энцефалит (этиология, иммунология, патогенез) // Новосибирск, 1986.

84. Пуховская Н.М., Берета Л.А., Островская О.В. Индикация вируса клещевого энцефалита в клещах методом гибридизации нуклеиновых кислот// Медицинская паразитология и паразитарные болезни. 1989. - №3. - С. 11-14.

85. Ремезов П.И., Голубев Д.Б., Синицын В.А. Реакция гемагглютинации. //С.Петербург, 1964.

86. Рудаков Н.В., Матущенко А.А., Шпынов С.Н., Рудакова С.А. Новые и возвращающиеся природноочаговые инфекции// Материалы 8 Всероссийского съезда эпидемилогов, микробиологов и паразитологов, Москва, 26 — 28 марта, 2002. Т.1.- М.,2002.- С.385-386.

87. Руководство по лабораторной диагностике вирусных и риккетсиозных болезней / Под ред. Здродовского П.Ф., Соколова М.И. // М. «Медицина», 1965.

88. Румянцева Н.П. Реакция торможения гемагглютинации при клещевом энцефалите с использованием трипсинизированных эритроцитов 0-группы человека// Лабораторное дело. -М. «Медицина», 1987. №12.- С. 931932.

89. Рязанцева Г.А. Современные подходы к энтомологическому надзору за природными очагами клещевого энцефалита и иксодовых клещевых боррелиозов// Междунар. акад. наук экол. и безопас. жизнедеятельности.- 1999.-№11.- С.14-16.

90. Свешникова И. А. Реакция прямой и непрямой иммунофлуоресценции// Сб. Арбовирусы. Москва, 1986. - С.113-120.

91. Скворцова Т.М., Колобухина Л.В., Фаворов М.О. Клиническая характеристика некоторых арбовирусных инфекций и методы сбора материала от больных с подозрением на данные заболевания// Сб. Арбовирусы. Москва, 1986. - С.29-36.

92. Скворцова Т.М., Кондрашина Н.Г. Схема идентификации вновь выделенных арбовирусов// Сб. Арбовирусы. Москва, 1986. - С.93-96.

93. Смородинцев А.А., Дубов А.В. Клещевой энцефалит и его вакцинопрофилактика//М. «Медицина», 1986.

94. Тер-Багдасарян Л.В. Прогностическое значение иммунологических показателей в ранней дифференциальной диагностике клинических форм клещевого энцефалита // Автореф. Дис. на соиск. уч. степ. канд. мед. наук.-2002.

95. Тимофеев А.В. Вирус клещевого энцефалита: изучение основных иммуногенов и разработка вариантов новых вакцинных технологий// Дисс. в виде науч. доклада . .докт.мед.наук. Москва, 2000.

96. Устинова О.Ю., Волечова Г.М., Девятков М.И., Гусманова А.И. Клинико-эпидемиологические особенности клещевого энцефалита в Пермской области// Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1997. -№3. - С. 33-36.

97. Фролов А.Ф., Шевченко Л.Ф., Широбоков В.П. Практическая вирусология//Киев, 1989.

98. Холмогорова Г.Н. Вопросы клинической эпидемиологии и дифференциальной диагностики природноочаговых трансмиссивных клещевых инфекций юга Восточной Сибири// Автореф. Дис. на соиск. уч. степ. канд. мед. наук. -Иркутск, 2002.

99. Чапоргииа Е.А. Распространение арбовирусов в Прибайкалье// Автореф. Дис. на соиск. уч. степ. канд. мед. наук. -Иркутск, 1998.

100. Чапоргина Е.А., Горин О.З., Феоктистов А.З., Львов С.Д., Бутенко A.M., Скворцова Т.М. и др. Арбовирусы в Прибайкалье// Материалы 8 Всероссийского съезда эпидемилогов, микробиологов и паразитологов, Москва, 26-28 марта, 2002. Т.1.- М.2002.- С.423.

101. Чередниченко Ю.Н., Ванаг К.А. Биологические свойства персистирующих в клетках Hela слабопатогенных вариантов вируса японского энцефалита // Сб. Арбовирусы. Москва, 1981. - С.72-77.

102. Чунихин С.П., Леонова Г.Н. Экология и географическое распространение арбовирусов // М. «Медицина», 1985. 126с.

103. Allen R.M., Reds haw M.R. Comparison of the use of beta-scintillation counting and gamma-counting for the radioimmunoassay of steroids I I Liquid Sci.Count. -1978. Vol.5. - C. 70-75.

104. Bardos V., Pesko J. Biological and antigenic variants among Tahyna virus strains isolated in Czechoslovakia //Arch. Virol. 1981. - Suppl. №68. - C.65-71.

105. Bishop D.H.L., Calisher C.H., Casals J. et al. Bunyaviridae // Intervirology.- 1980.-Vol.14, ch.l.-C.125-143.

106. Burt F.J., Leman P.A., Abboth J.C., Swaneposi R. Serodiagnosis of Crimean-Congo haemorrhagis fever // Epidemiol, end Infec.- 1984. Vol. 3.ch.3. -C.551-562.

107. Calisher C.H. et al. Antigenic relationships between Flaviviruses as determined by cross-neutralization test with polyclonal antisera // J. gen. Virol. 1989. -Vol. 70.-C.37-43.

108. Calisher C.H. Taxonomy, classification and geographic distribation of California serogroup Bunyaviruses // California serogroup viruses. -New York: Publ. A.R. Liss inc., 1983. -C. 1-16.

109. Cardosa M.J., Hoor T.P., Shaari N.S. Development of a dot enzyme immunoassay for dengue 3: A sensitive method for the detection of antidengue antibodies // J. Virol. Meth. 1988. - Vol.22.ch.l. - C.81-88.

110. Cimons Marlene NIAID officials fast track West Nile virus vaccine efforts// ASM News.- 2000.-66, №11.- C. 656-657.

111. Clark G.G., Pretula H.L., Langkop C.W. et al. Occurense of La Crosse (California serogroup) encephalitis viral infection in Illinois (USA) // Am. J. Trop. Med. Hyg. 1983. - Vol. 32. - C.838-843

112. Clark M.F., BarbaraD.Y. A method for quantitative analysis of ELISA data // J. Virol. Method. 1987. - Vol. 12. - C. 213 - 222.

113. Clark R., Engvall E. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Theoretical and practical aspects. Enzyme-Immunoassay (E.T. Maggio ed.). Boca Raton, Florida, 1981.- C. 167-179.

114. Czegledi A., Ferenczi E., Toth E., Mezey I., Berencsi Gy. Serosurvey of tick-borne encephalitis virus (TBEV) in Hungary//Acta microbiol. Et immunol. hung. 2001.-48., № - C.230-231.

115. De Foliart G.R., Grimstad P.R., Watts D.M. Advansed in mosquito-borne arboviruses / Vector research // Ann. Rev. Entomol. 1987. - Vol.32. - C.479-505.

116. Denge surveillanse И WHO Weekly Epidem. Rec. 1995. -Vol.70.ch.17. - C.123-125.

117. Dropulic В., Masters C. Entry of neurotropic arboviruses into the cetral nerveus system: an in vitro study using mouse brain endotelium //The Journal of Infection Diseases. 1990. - Vol.161. - C.685-691.

118. Ed. Gilden Donald, Lipton Howard Clinical and Molecular Aspects of Neurotropic virus infection // Kluwer Acad. Publ. Boston, 1989. -XIV. - 543.

119. Ekins R. Assay design and quality control // Radioimmunology 79 / Ed. Ch. A. Bisolon. 1979. - C. 239 -255.

120. Girard Marc Les maladies in fectienses emergentes// M/S: Med. Sci.-2000.- 16, № 8-9.- C. 883-891.- Франц.

121. Grant L. Campbell, Hardy J.L., Eldridge B.F., Reeves W.C. Isolation of Northway serogroup and other Bunyamvera serogroup Bunyaviruses from California and Oregon mosquitoes, 1969 1985 //Am. J. Trop. Med. Hyg. - 1991. - Vol. 44.ch.6. -C.581-588.

122. Gresikova M., Kozuch O. A microtiter serum neutralization test with tick-borne encephalitis, West Nile and Tahyna viruses // Biologia. Bratislava, - 1983. -Vol. 38.-C. 1149-1152.

123. Han Xiugi, Aho Mika, Vene Sirrka, Peltomaa Miikka, Vaheri Antti, Vapalahti Olli Prevalense of tick-borne encephalitis virus in Ixodes ricinus tick in Finland//J. Med. Virol.- 2001.-64, №1.-C. 21-28.

124. Hofmann H., Frisch-Niggermeyer W., Heinz F. Et al. Immunoglobulins to tick-borne encephalitis in the cerebrospinal fluid in man // J. med. Virol. 1979. - Vol. 4.-C.241-245.

125. Isaacson Margaretha Viral hemorrhagic fever hazards fro travelers in Africa// Clin. Infec. Diseases.- 2001.-33, 310.-C.1707-1712.

126. Karabatsos N., Mathews J.H. Serological reactions of frationated Hamster immunoglobulins wiph California group viruses // Am. J. Trop. Med. Hyg. 1980. -Vol. 29.-C. 1420-1427.

127. Keane D.P., Parent J., Little P.B. California serogroup and Povassan virus infection of cats // Can. J. Microbiol.- 1987.- Vol.33.ch.8.- C.693-697.

128. Labuda M., Stunzner D., Kozuch O. et al. Tick-borne encephalitis virus activity in Styria Austria // Acta Virol. 1993. - Vol.37.ch.2. - C. 187-190.

129. Le Duck J. W. Epidemiology and ecology of the California serogroup viruses // Am. J. Trop. Med. Hyg. 1987. - Vol. 37. - C.60S -68S.

130. Lvov D.K., Avershin A., Andreev V. et al. Surveillance for arboviruses in the Soviet Union: relationships between ecologic zones and virus distribution //Arch. Virol. 1990. - Suppl. №1. - C.259-266.

131. Marfin Anthony A., Gubler Duane J. West nile encephalitis: An emerging in the United States // Clin. Infect. Diseases 2001.-33, №10.-C.1713-1719.

132. Meurers R. V. Zoonosen: Gefahrdung durch Zeckenbib. Fruhsommer -meningoenzephalitis FSME Zeckenbibkranheit // Wild und Hund. - 1992. -Vol.95.ch.12. - C.28-29.

133. Pfeffer M., Linssen В., Parker M.D., Kinney R.M. Specific detection of chikungunya virus using a RT-PCR/ nested PCR combination// J. Vet. Med. В.- 2002.49, №l.-C.49-54.

134. Pomelova V.G., Lavrova N.A., Gaidamovich S.Y. et al. Detection of tick-borne encephalitis virus in natural foci by time-resolved fluoroimmunoassay // Acta Virol.- 1992.- Vol.36.ch.3.- C.260-268.

135. Pugliese A., Gioannini P. Le encefaliti viral transinesse da atrropodi // Minervamed.- 1993.-Vol. 84.ch.9.-C.433-445.

136. R.Yalow, S.Berson Immunoassay of endogenous plasma insulin in man // J. Clin. Ivest. 1960. - Vol.39. - C.l 157 - 1165.

137. Rhillpots R.J., Stepenson J.R., Porterfield J.S. Passive immunization of mise with monoclonal antibodies raises against tick-borne encephalitis virus // Arch. Virol. 1987. - Suppl. №93. - C.295-301.

138. Schopen S., Labuda M., Beaty B. Vertical and venereal transmission of California group viruses by Aedes triseriatus and Culiseta inornata mosquitoes // Acta Virol. 1991. - Vol.35.ch.4. - C.373-382.

139. Taylor M.R., Carpenter D.E., Currier R.D. et al. California encephalitis virus cases subacute encephalomyelitis in an adult //Arch. Neurol. 1985. - Vol.42. -C.88-89.

140. Tick-borne encephalitis // WHO Weekly Epidem. Rec. 1995. -Vol.70.ch.17. - C.120-122.

141. Traavik Т., Mehl R., Wiger R. Mosquito-borne arboviruses in Norway; futher isolation and detection of antibodies to California encephalitis viruses in human, sheep and wildlife sera // J. Hyg. 1984. - Vol.93. - C.120-132.

142. Traavik Т., Wiger R., Mehl R. Evidens for Flavivirus (es) outsade of the distribution area for Ixodes risinus in Norway // J. Hyg. 1984. - Vol.83. - C.133-138.

143. Uvens D.L., Buffi E., Lewis A.L., Calder K.A. Arboviral surveillanse -Florida // Morbid, and Mortal Weekly Rept.: Rept. Nat. Cent. Infec. Diseases. 1990.

144. Vladimirtseva E.A., Bakulina E.A., Bystrova E.A. et al. Immuneblotting studies of California encephalitis antigenic complex viruses recently isolated in the USSR // Arch. Virol. 1990. - Suppl. №1. - C.347.

145. Yelloy fever. Investigation of on epidemic in Imo State // WHO Weekly Epidem. Rec. 1995. - Vol.70.ch.15. - C.107-110.

Информация о работе

Кучкова, Елена Вадимовна
кандидата медицинских наук
Санкт-Петербург, 2004
ВАК 03.00.06

Диссертация

Специфическая диагностика арбовирусных инфекций и анализ ее возможностей - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы