Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка и апробация тест-системы для выявления РНК вируса Западного Нила методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Разработка и апробация тест-системы для выявления РНК вируса Западного Нила методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции"

На правах рукописи

Красовская Татьяна Юрьевна

РАЗРАБОТКА И АПРОБАЦИЯ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ РНК ВИРУСА ЗАПАДНОГО НИЛА МЕТОДОМ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ И ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ

03 00 06 - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

0031^3813

Кольцово - 2007

003173813

Работа выполнена в ФГУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный руководитель

кандидат биологических наук Щербакова Свешана Анатольевна Официальные оппоненты

доктор медицинских наук, профессор Евстропов Александр Николаевич кандидат химических наук Туманов Юрий Васильевич

Ведущая организация

Иркутский ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока

Защита состоится «13» ноября 2007 г в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 208 020 01 при ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора по адресу ГНЦ ВБ «Вектор», Кольцове Новосибирской области, 630559, тел (8-383) 336-74-28, E-mail chaldina@.vector nsc ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Автореферат разослан « 9_» октября 2007 г Ученый секретарь

диссертационного совета

ЭГ Малыгин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы В настоящее время в мире сохраняется нестабильная ситуация по лихорадке Западного Нила (ЛЗН) Начиная с 90-х годов XX века вспышки этого заболевания регистрировались в странах как Восточного, так и Западного полушарий и характеризовались большой долей менингитов и менингоэнцефалитов (более 50 %), высокой летальностью (до 10 %) (Венгеров Ю-Я и др , 2000, Львов Д К и др , 2000, Онищенко Г Г и др , 2000, Петров В А и др , 2001,Tsai TF et al, 1998, Han L L et al, 1999, Hubalek Z et al, 1999, Lvov D К et al, 2000, Chowers MY et al, 2001)

В Западном полушарии впервые ЛЗН была зарегистрирована в 1999 г (Briese Т et al, 1999, Lanciotti RS et al, 1999, Weiss D et al, 2001) С момента интродукции на американский континент, вирус Западного Нила (ЗН) распространился практически на всю территорию США (44 штата), южные районы Канады, Латинскую Америку и Южную Америку (Andreadis TG et al, 2001, Kulasekera V L et al, 2001, Marfin A A et al, 2001, Nosal В et al 2004)

Начиная с 1999 г заболевания ЛЗН отмечаются ежегодно и на территории

Российской Федерации в Астраханской, Волгоградской, Ростовской областях,

Краснодарском крае (Львов Д К и др , 2000, Онищенко Г Г и др , 2000, Стриханов

С Н и др, 2000, Ковтунов А И и др, 2001, Петров В А и др, 2001, Соловьев М Ю

и др, 2007) За период с 2001 по 2006 гг выявлено 293 случая этой инфекции в

Южном федеральном округе (письмо Роспотребнадзора № 0100/8969-07-32 от

04 09 2007 г «Об усилении надзора за лихорадкой Западного Нила и мерах по ее

профилактике») Впервые в 2004 г случаи заболевания ЛЗН зарегистрированы в

Новосибирской облаете (Кононова Ю В и др , 2007)

Вследствие вышеперечисленных событий ЛЗН рассматривается как

классический пример возникающего и вновь возвращающегося (emerging-

reemerging) инфекционного заболевания (Львов Д К, 2002, Локтев В Б, 2007,

Нетесов С В , 2007, Hubalek Z et al, 1999) Глобальное потепление климата,

естественная миграция животных, особенно птиц, повышение интенсивности

грузовых и пассажирских потоков, антропогенное вмешательство в дикую природу,

ослабление эпизоотологического и эпидемиологического надзора за природными

очагами арбовирусных заболеваний способствуют ухудшению эпидемиологической

3 ~ <

ситуации по этим инфекциям, приводят к расширению их ареалов, в том числе ареала ЛЗН (Онищенко Г Г, 2000, Львов Д К и др, 2004, Сергиев В П и др, 2004, НиЪа1ек Ъ е1а1,1999)

В связи с этим актуальной задачей является совершенствование методов лабораторной диагностики ЛЗН и мониторинга природных очагов этой инфекции (Онищенко Г Г и др, 2000, Локтев В Б, 2007, письмо Роспотребнадзора № 0100/8969-07-32 от 04 09 2007 г )

Вирусологический метод, основанный на выделении вируса на чувствительной биологической модели, является «золотым стандартом» диагностики вирусных инфекций, однако может осуществляться только в специализированных лабораториях и требует больших экономических и временных затрат, что значительно ограничивает его практическое применение Низкий уровень содержания вируса в крови или ликворе больных ЛЗН людей и непродолжительный период вирусемии обусловливают недостаточную диагностическую ценность иммуноферментного анализа (ИФА), направленного на выявление антигена вируса, а наиболее широко используемый для диагностики инфекции ИФА с целью выявления специфических антител часто требует исследования парных сывороток, что отдаляет постановку диагноза

Внедрение в схему ггабораторной диагностики и мониторинга природных очагов ЛЗН метода подимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), обладающего высокой чувствительностью и специфичностью, будет способствовать быстрой детекции возбудителя в биологическом материале и ранней постановке диагноза, что позволит своевременно организовать и провести адекватные противоэпидемические мероприятия

Несмотря на то, что с пособы обнаружения вируса ЗН, основанные на методе ОТ-ПЦР, разработаны рядом авторов (Прилипов А Г и др , 2003, Альховский С В и др, 2004, Петров АЛ и др , 2004, Терновой ВА и др , 2004, Карань Л С и др, 2006, ЬапсюШ Я 8 й а1, 2000), сертифицированный диагностический препарат, разрешенный к применению и производству в Российской Федерации, включающий комплекты ]>еагентов для всех этапов ПДР-анализа, до настоящего времени отсутствует

Цель работы - конструирование и апробация тест-системы для выявления РНК вируса Западного Нила в биологическом материале методом ОТ-ПЦР

Основные задачи исследования:

1 Провести анализ нуклеотидных последовательностей генома вируса ЗН различных генетических вариантов, представленных в базе данных ОепВапк, с целью подбора специфичных праймеров

2 Оценить специфичность и чувствительность ПЦР с использованием выбранных праймеров на панели гомологичных и гетерологичных штаммов микроорганизмов и сконструировать ПЦР-тест-систему, позволяющую выявлять РНК вируса ЗН в биологическом материале

3 Для обеспечения биологической безопасности при работе с диагностическим препаратом создать к тест-системе рекомбинантный положительный контрольный образец и стандартный образец предприятия

4 Разработать нормативную документацию на созданную тест-систему и представить в ГИСК им Л А Тарасевича три экспериментально-производственные серии диагностического препарата для проведения Государственных испытаний

5 Провести апробацию сконструированной тест-системы при исследовании клинического и полевого материала

6 Оценить возможность использования ПЦР-анализа с разработанной тест-системой при изучении особенностей циркуляции вируса ЗН на примере Саратовской области

Научная новизна работы

Впервые разработана тест-система для выявления РНК вируса ЗН методом ОТ-ПЦР - «ГенНил», включающая комплекты реагентов для всех этапов ПЦР-анализа (выделения РНК, проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР, учета результатов) Доказано, что чувствительность тест-системы составляет 1 хЮ3 ГЭ/мл, специфичность - 98,3 %, воспроизводимость результатов - 100 %

Оценена диагностическая информативность тест-системы при исследовании клинического и полевого материала

Показана возможность использования ПЦР-анализа в ходе эпизоотологического обследования природных очагов ЛЗН

Изучены особенности циркуляции вируса ЗН на территории Саратовской области с применением с» онструированной тест-системы

Практическая значимость работы.

На созданную тест-систему для выявления РНК вируса ЗН методом ОТ-ПЦР разработан пакет нормативной документации (фармакопейная статья предприятия, пояснительная записка, инструкция по применению тест-системы, отчет о лабораторно-экспериментальном изучении препарата, внутренняя и внешняя маркировки, проект паспорта, пояснительная записка о получении положительного контрольного образца для диагностического препарата «ГенНил», инструкция по применению Стандартного образца предприятия (СОПк+ ЗН), свидетельство на СОПк+ ЗН, проект паспорт на СОПк+ ЗН)

Сконструирован и депонирован в Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» (Саратов) 2 мая 2007 г под номером Escherichia colt KM 201 генетически модифицированный штамм Е coli TGI pWN ApR На основе этого штамма был создан положительный контрольный образец к разработанной ПЦР-тест-системе и стандартный образец предприятия (СОПк+ ЗН) СОПк+ ЗН может быть использован для стандартизации процедуры контроля чувствительности и специфичности диагностического препарата «ГенНил» в условиях производства

Проведены Государственные испытания разработанной тест-системы для выявления РНК вируса ЗН методом ОТ-ПЦР в ГИСК им JIA Тарасевича Тест-система рекомендована Ученым советом ГИСК им JIА Тарасевича и Комитетом МИБП к регистрации в Российской Федерации, а нормативная документация на нее - к утверждению в установленном порядке (протокол № 1 от 17 01 Об г заседания Ученого совета ГИСК им J1А Тарасевича, протокол № 1 от 09 02 06 г заседания Комитета МИБП)

Тест-система «ГенНил» была использована при эпизоотологическом

обследовании территорий Саратовской области, Ставропольского края и

Республики Калмыкия с целью выявления и изучения особенностей циркуляции

6

вируса ЗН, а также при мониторинге природного очага ЛЗН в Астраханской области

Материалы диссертации использованы при составлении практического руководства «Специфическая индикация патогенных биологических агентов» (утверждено Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г Г Онищенко 11 07 2006 г), применяются при чтении лекций на курсах подготовки и усовершенствования специалистов по особо опасным инфекциям в РосНИПЧИ «Микроб» и на курсах повышения квалификации «ПЦР в диагностике инфекционных болезней и индикации патогенных микроорганизмов»

Работа выполнена в рамках Федеральной целевой научно-технической программы - «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники» на 2002-2006 годы и договоров с ГУ НИИ вирусологии им Д И Ивановского РАМН (Москва) «Выявление и анализ специфичных участков геномов вирусов Западного Нила и Конго-Крымской геморрагической лихорадки, создание ПЦР-тест-систем, разработка нормативной документации» и «Сертификация ОТ-ПЦР-тест-систем для выявления РНК вирусов Крымской-Конго геморрагической лихорадки и лихорадки Западного Нила Разработка сиквенс-систем и алгоритма комплексной лабораторной диагностики Крымской геморрагической лихорадки и лихорадки Западного Нила», а также плановой НИР «Мониторинг очагов арбовирусных инфекций на территории юго-востока европейской части России и разработка системы специфической диагностики и профилактики» (№ Государственной регистрации 01 200 111496)

Основные положения, выносимые на защиту

1 Праймеры \¥п 10149, Шп 10149 (1), 10588, 10213, Шп 10318, комплементарные З'-концу нуклеотидной последовательности РНК вируса ЗН, включая участок, кодирующий неструктурный белок N85, обеспечивают специфическую детекцию штаммов вируса ЗН

2 Разработанная тест-система для выявления РНК вируса ЗН методом ОТ-ПЦР «ГенНил» характеризуется чувствительностью 1><103ГЭ/мл, специфичностью - 98,3 %, воспроизводимостью результатов - 100 % и позволяет детектировать возбудитель ЛЗН в биологическом материале сыворотке (плазме)

крови, суспензиях клещей, комаров, суспензиях органов животных (мозг, селезенка)

3 Положительный контрольный образец и стандартный образец предприятия (СОПк+ ЗН), разработанные на основе сконструированной рекомбинантной плазмиды pWN штамма Е colt TGI pWN ApR, позволяют стандартизировать процедуру контроля чувствительности и специфичности тест-системы

4 ПЦР-анализ с применением тест-системы «ГенНил» может быть использован в ходе мониторинга природных очагов JI3H, при эпизоотологическом обследовании территорий с целью выявления и изучения циркуляции возбудителя, а также для лабораторной диагностики заболевания

Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены и обсуждены на ежегодных научно-практических конференциях в ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб» (Саратов) «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте «Микроб» в 2004 - 2007 гг, а также на Всероссийской научно-практической конференции «Медицинская микробиология-XXI век» (Саратов, 2004), VI Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Санитарная охрана территорий государств участников содружества независимых государств проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях» (Волгоград, 2005), IV Российском конгрессе детских инфекционистов «Актуальные вопросы инфекционной патологии и вакцинопрофилактики у детей» (Москва, 2005), VH Межгосударственной научно-практической конференции «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербуржского саммита «Группа восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых государств» (Оболенск, 2006), VII Российском съезде нфекционистов «Новые технологии в диагностике и лечении инфекционных болезней» (Н Новгород, 2006), научно-практической конференции «Арбовирусы и арбовирусные инфекции» (Астрахань, 2006), IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007)

Публикации

Основные положения диссертации отражены в 11 опубликованных научных работах, в том числе 2 - в изданиях, рекомендованных ВАК Российской Федерации и 9 - в сборниках материалов Межгосударственных и Всероссийских конференций

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованной литературы, включающего 125 отечественных и 72 зарубежных источника Общий объем работы составляет 140 страниц компьютерного текста, иллюстрированного 23 таблицами и 13 рисунками

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Материалы и методы. В работе использовали 8 штаммов вируса ЗН, относящихся к различным генетическим вариантам (Ast901, Ast986, Нр-94, Azerb 1628, EglOl, Ig22886, Ig2266, Krd-190), 21 пггамм различных арбовирусов, принадлежащих к семействам Flavi-, Toga-, Bunya-, Reo- и Orthomyxovmdae (вирусные штаммы, использованные в работе, получены из Государственной Коллекции вирусов Российской Федерации ГУ НИИ вирусологии им ДИ Ивановского РАМН, Москва), 9 штаммов бактерий семейств Enterobacteriaceae, Streptococcaceae, Micrococcaceae, а также рода Francisella (бактериальные штаммы были получены из Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб», Саратов), геномные ДНК человека и мыши Исследовали 8270 экземпляров комаров (290 проб) 14 видов, принадлежащих к роцам Aedes (9 видов), Anopheles (3 вида), Culex (1 вид), Coquillettidia (1 вид) и 4338 экземпляров клещей (442 пробы) 9 видов, принадлежащих к родам Hyalomma (2 вида), Dermacentor (2 вида), Rhipicephalus (3 вида), Ixodes (1 вид), Argas (1 вид), 2934 экземпляра мелких млекопитающих (1064 пробы) 14 видов, принадлежащих к отрядам грызунов и насекомоядных, 179 экземпляров диких пищ 49 видов, принадлежащих к 12 отрядам, и сыворотки крови КРС (231 проба) Полевой материал был собран на эндемичных и неэндемичных по JI3H территориях Российской Федерации В ходе Государственных испытаний исследовали 60 сывороток крови людей с заболеваниями неарбовирусной этиологии и 25 сывороток крови здоровых доноров

г Москвы и Московской области Кроме того, тестировали сыворотки крови людей (1174 пробы), обратившихся в медицинские учреждения городов Саратова и Астрахани по поводу заболеваний, не имеющих арбовирусную этиологию, 21 образец ликвора и 91 образец крови от больных с подозрением на арбовирусную природу заболевания На проведение клинических исследований получено одобрение комитета по этике ГОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет» (протокол № 3 от 02 10 07)

Исследование материала проводили с использованием вирусологического метода (выделение вируса на культуре клеток Vero Е6), ИФА, направленного на выявление антигена вируса ЗН, антител класса IgM и IgG к нему (с помощью тест-систем производства ГУ НИИ вирусологии им ДИ Ивановского РАМН, Москва) и ПЦР-анализа

Препаративное количество плазмидной ДНК получали с применением набора для выделения «Wizard Plus SV DNA Purification System» («Promega», США)

Вирусную РНК выделяли тремя способами 1) методом нуклеосорбции на силикагеле в присутствии 6М раствора гуанидинтиоцианата (Boom R et al, 1990), модифицированным Гараниной СБ (1996) 2) методом нуклеосорбции на силикагеле в присутствии 6М раствора гуанидинтиоцианата и N-лаурилсаркозина натрия и 3) методом фенол-хлороформовой экстракции с последующим переосаждением РНК этанолом Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием ревертазы M-MLV 20 ед/мкл («Promega», США) и буферного раствора, содержащего случайные гексануклеотиды («Sigma», США), кроме этого использовали специфичный праймер Wn 10588 Двухэтапную ПЦР проводили в термоциклерах «Терцик МТС410» («ДНК-Технология», Россия) или «ТСР-100» («MJ Research», США) Детекцию продуктов амплификации осуществляли методом горизонтального электрофореза в 2 %-ном агарозном геле

Положительный контрольный образец для тест-системы «ГенНил» и стандартный образец предприятия (СОПк+ ЗН) сконструировали генно-инженерным методом путем клонирования фрагмента ДНК размером 981 п н, гомологичного 3-концу нуклеотидной последовательности РНК вируса ЗН, включая участок кодирующий белок NS5, в вектор pGEM-T («Promega», США) с последующей

трансформацией штамма Е coli TGI созданной рекомбинантной плазмидой pWN, определяющей его резистентность к ампициллину в концентрации 50 мкг/мл

Статистическую обработку полученных при исследовании полевого и клинического материала данных проводили по методике Урбаха В Ю (1963) Для компьютерной обработки результатов анализа геномов изолятов вируса ЗН использовали авторские программы, разработанные на MS Office Excel ХР

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Анализ результатов выравнивания имеющихся в базе данных NCBI GenBank секвенированных геномных нуклеотидных последовательностей вируса ЗН показал их высокую гетерогенность Для подбора праймеров выбрали один из наиболее консервативных участков РНК вируса ЗН - З'-конец нуклеотидной последовательности РНК вируса ЗН, включая участок, кодирующий неструктурный белок NS5 В связи с высокой вариабельностью РНК вируса ЗН, для обеспечения специфичности ПНР было принято решение проводить реакцию в два этапа (nested-ПЦР) С использованием программы Gene Runner подобрали праймеры Wn 10149, Wn 10149(1), Wn 10588, Wn 10213 и Wn 10318 (таблица 1)

Таблица 1 Характеристика праймеров, использованных для детекции вируса Западного Нила методом ОТ-ПЦР

Праймер Длина (HO) Нуклеотадная последовательность 5'-3'

1 этап

Wn 10149 (F) 25 agaggagaatgaatggatggaagac

Wn 10149 (1)(F) 25 agaagaaaatgaatggatggaagac

Wn 10588 (R) 21 tttggtcacccagtcctcctg

2 этап

Wn 10213 (F) 23 gggaaacgtgaagacatctggtg

Wn 10318 (R) 23 ctatgattgctcggacctggttg

Для осуществления первого этапа реакции использовали два прямых праймера

- Wn 10149, Wn 10149 (1) и один обратный - Wn 10588 Праймер Wn 10149 (1)

отличается от Wn 10149 двумя нуклеотидными заменами, характерными для

вирусов II - V генетических вариантов В ПЦР с этими праймерами

амплифицировались фрагменты ДНК различных размеров от 400 до 440 пн в

зависимости от штамма вируса ЗН Для второго этапа ПЦР использовали пару

11

праймеров Wn 10213 - Wn 10318, обеспечивающих образование вторичных ампликонов размером 106 п н для всех штаммов вируса ЗН

Подбор праймеров проводился с учетом минимизации вероятности образования термодинамически значимых вторичных структур (димеры, внутренние петли, шпильки) Специфичность набора олигонуклеотидных затравок была проверена по базе данных NCBI GenBank с использованием алгоритма BLAST Установлено специфическое соответствие праймеров нуклеотидным последовательностям различных генетических вариантов вируса ЗН и отсутствие их гомологии с геномами других микроорганизмов, в частности остальных представителей флавивирусов

Специфичность подобранных праймеров определяли в экспериментах с образцами кДНК изолятов вируса ЗН и гетерологичных вирусов, принадлежащих к семействам Flaviviridae Японского энцефалита (1 штамм), клещевого энцефалита (1 штамм), Лангат (1 штамм), желтой лихорадки (1 штамм), Денге (4 штамма), Bunyavmdae (9 штаммов), Togavmdae (2 штамма), Reovindae (1 штамм) и Orthomyxoviridae (1 штамм), а также с геномными ДНК человека и мыши Кроме того, для изучения специфичности праймеров использовали ДНК возбудителей бактериальных инфекций, вызывающих, как и вирус ЗН, лихорадку, или наиболее часто выявляемых в биологическом материале, исследование которого планировалось проводить с помощью конструируемого диагностического препарата (кровь человека, органы млекопитающих и птиц, суспензии эктопаразитов) Протестировали 9 препаратов ДНК бактерий Со всеми штаммами вируса ЗН в ПЦР получен положительный результат При тестировании кДНК гетерологичных вирусов, ДНК бактерий, геномных ДНК человека и мыши образование специфического ПЦР-продукта не наблюдали

В серии экспериментов с кДНК вируса ЗН штаммов Ast901 и Ast986 был подобран оптимальный способ выделения РНК, состав реакционной смеси для ПЦР (концентрация ионов магния, праймеров, фермента), температурные и временные параметры реакции Определение чувствительности ориентировочно проводили на десятикратных разведениях в 0,9%-ном растворе натрия хлорида мозговой суспензии мышат-сосунков, зараженных вирусом ЗН штамм Ast'JO]

В соответствии с данными компьютерного анализа расчетная температура отжига праймеров первого этапа составила 56°С, а второго - 57°С В связи с гетерогенностью РНК штаммов вируса ЗН более точное определение этого параметра проводили эмпирически Снижение температуры отжига на первом этапе до 47°С, на втором - до 52°С, позволило повысить специфичность реакции при сохранении чувствительности

С целью сокращения времени анализа уменьшили количество циклов на первом этапе с 35 до 25, продолжительность денатурации на первом этапе и каждого шага реакции на втором этапе с 40 с до 30 с Это позволило сократить время проведения ПЦР в 1,5 раза

При использовании для проведения реакции каждого из праймеров в количестве 12 пмоль, на этапе детекции продуктов ПЦР в окрашенном агарозном геле кроме специфической полосы на уровне 106 п н при высокой концентрации РНК в исследуемой пробе регистрировалась менее интенсивная по окраске полоса, соответствующая уровню ампликонов первого этапа (400-440 п н ) Для решения данной проблемы нами была проведена работа по определению минимально достаточной концентрации праймеров на каждом этапе реакции Установлено, что уменьшение содержания в реакционной смеси прямых праймеров на первом этапе амплификации с 12 пмоль до 2 пмоль, а обратного - до 4 пмоль, при сохранении концентрации праймеров на втором этапе 12 пмоль не повлияло на чувствительность реакции, но повысило ее специфичность, и полоса, соответствующая по размеру ампликонам первого этапа, не регистрировалась

Чувствительность ПЦР, проводимой по описанным условиям, соответствовала 10"5 разведению мозговой суспензии мышат-сосунков, зараженных вирусом ЗН штамм .4.51901 (6,5 ^ ТЦД50/0,1 мл) Повысить чувствительность реакции на два порядка (до разведения 10"7) удалось путем введения в реакционную смесь для обратной транскрипции к случайным гексануклеотидам специфичного праймера У/п 10588 в количестве 75 пмоль

Чувствительность ПЦР во многом зависит от эффективности используемого для выделения нуклеиновых кислот методического приема Результаты, полученные при сравнении эффективности различных методов экстракции РНК, показали, что более высокая степень очистки нуклеиновых кислот достигалась при

использовании метода фенол-хлороформовой экстракции и метода нуклеосорбции в присутствии высокомотарного раствора гуанидинтаоцианата с добавлением Ы-лаурилсаркозина натрия Для практического использования был выбран второй способ, поскольку он лишен таких недостатков, как трудоемкость, продолжительность и высокая контаминационная опасность, присущим фенол-хлороформовой экстракции

В результате проведенной работы создана тест-система для выявления РНК вируса Западного Нила методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции, обеспечивающая выявление РНК вируса ЗН в сыворотке (плазме) крови, суспензиях клещей, комаров, суспензиях органов животных (мозг, селезенка), включающая четыре комплекта реагентов для выделения РНК, для постановки реакции обратной транскрипции, для постановки ПЦР, для электрофоретической детекции продуктов ПЦР Тест-система сохраняет свою специфическую активность в течение 6 месяцев при температуре хранения не выше минус 18°С Время проведения анализа 5-6 часов

С целью обеспечения биологической безопасности при производстве и работе с тест-системой генно-инженерным методом был создан стандартный образец предприятия (СОПк+ЗН), представляющий собой рекомбинантную плазмиду (р'^Ы), содержащую фрагмент ДНК, гомологичный нуклеотадной последовательности РНК вируса ЗН Готовый препарат имел концентрацию - 0,03 нг/мкл, что соответствует 1 хЮ7 молекулам плазмидной ДНК или 1 хЮ10 ГЭ/мл, был стабилен в течение 12 месяцев при температуре хранения не выше минус 18°С, что позволило использовать его для получения положительного контрольного образца к диагностической тест-системе (препарат СОПк+ЗН разводили ТЕ-буфером (рН 8,0) до концентрации 1х10б ГЭ/мл) Тестируя с помощью диагностического препарата «ГенНил» десятикратные разведения стандартного образца предприятия в ТЕ-буфере (рН 8,0) установили, что чувствительность ПЦР с тест-системой составляет 1 х ю3 ГЭ/мл

Для стандартизации процедуры контроля чувствительности и специфичности сконструированной тест-системы при ее производстве был разработан методический подход, основанный на тестировании десятикратных разведений СОПк+ЗН в четырех жидкостях сыворотке крови доноров, суспензии клещей и

14

суспензии комаров, проверенных на отсутствие РНК вируса Западного Нила, и 0,9%-ном растворе натрия хлорида С учетом этого составлена «Инструкция по применению стандартного образца предприятия СОПк+ ЗН» На созданную тест-систему разработали пакет нормативной документации

Определение диагностической ценности препарата «ГенНил» с целью решения вопроса о регистрации его в Российской Федерации осуществляли в ходе Государственных комиссионных испытаний Работа проводилась по Программе, утвержденной Комитетом МИБП, на базе лаборатории биологии и индикации арбовирусов ГУ НИИ вирусологии им ДИ Ивановского РАМН (Москва) с участием сотрудников лаборатории стандартизации и контроля медицинских иммунобиологических препаратов против арбовирусных инфекций, риккетсиозов и СПИДа ГИСК им Л А Тарасевича

Референс-препарат не был включен в Программу испытаний из-за отсутствия на тот момент аналогичных лицензированных ПЦР-тест-систем как отечественного, так и зарубежного производства В качестве методов сравнения использовали ИФА, направленный на выявление антигена вируса ЗН (с тест-системой производства НИИ вирусологии), и вирусологический метод

Разработанную тест-систему оценивали по следующим показателям чувствительность, специфичность, продолжительность анализа, воспроизводимость результатов

Лабораторный контроль трех экспериментально-производственных серий препарата с применением стандартного образца предприятия СОПк+ ЗН подтвердил заявленную чувствительность препарата - 1х 103 ГЭ/мл

Дальнейшее изучение специфической активности и чувствительности тест-системы провели при тестировании в ОТ-ПЦР десятикратных разведений вируса ЗН Ast 901 (от 10'3 до 10"13) в различном биологическом материале сыворотке крови здорового донора, суспензии комаров, суспензии клещей Одновременно пробы исследовали в ИФА с тест-системой для выявления антигена вируса ЗН и определяли титр инфекционной активности вируса в культуре клеток Vero Е6 В ИФА антиген вируса ЗН выявили в пробах с разведением вируса до 10"6 Титр инфекционной активности вируса в культуре клеток Vero Е6 составил 8,5 lg ТЦД50/0,1 мл (ЦПД регистрировалось до разведения 109) В ПЦР с испытуемой

тест-системой РНК вируса детектировали в пробах с разведением вируса до Ю-8 -Ю"10 в зависимости от среды для титрования (таблица 2)

Сравнение различных методов детекции вируса ЗН показало, что ПЦР-анализ с предложенной нами тест-системой превышает по чувствительности ИФА на 2-4 порядка, не уступает по чувствительности методу выделения вируса в культуре клеток, а по скорости получения конечного результата значительно превосходит его

Таблица 2 Изучение специфической активности и чувствительности тест-

системы «ГенНил»

Разведение вируса ЗН (.Ast901) Инфекционная активность вируса в культуре клеток Vero Е6 Выявление антигена вируса в ИФА Выявление РНК методом ОТ-ПЦР

Используемая среда для разведения

0,9 % р-р натрия хлорида Сыворотка крови доноров Суспензия клещей Суспензия комаров

103 + + + + + +

ю4 + + + + + +

ю5 + + + + + +

ю-6 + + + + + +

ю-' + - + + + +

ю-8 + - + + + +

Ю-9 + - + + + -

10-lü - - - + - -

10"11-Ю-13 - - - - - -

В дальнейшем специфичность разработанной ОТ-ПЦР-тест-системы проверили с использованием 7 штаммов вируса ЗН и 16 штаммов различных арбовирусов, принадлежащих к семействам Flavi-, Bunya-, Toga-, Reo- и Orthomyxoviridae, в соответствии с утвержденной Комитетом МИБП Программой Государственных испытаний В исследование были включены образцы с разведением вируса 10'5 Было установлено, что испытуемая тест-система выявляет весь спектр представленных штаммов вируса ЗН Ни в одном случае использования в качестве матрицы РНК (кДНК) гетерологичных вирусов образование специфического ПЦР-лродукта не наблюдали (таблица 3)

Таблица 3 Изучение специфичности тест-системы «ГенНил»

Исследованный возбудитель Кол-во Резуль-

Семейство, род Комплекс Вирус, штамм проб тат ПЦР

Flaviviridae, Японского Западного Нила

Flavivirus энцефалита Ast986 3 +

Нр-94 3 +

Azerb 1628 3 +

EglOl 3 +

Ig22886 3 +

Ig2266 3 +

Krd-190 3 +

Денге Денге-1 (Hawaii) 1 -

Денге-2 (P-23085) 1 -

Денге-3 (11-87) 1 -

Денге-4 (H-241) 1 -

Клещевого Лангат (ТР-21) 1 -

энцефалита

Желтой Желтой лихорадки

лихорадки (Дакар) 1 -

Bunyaviridae, Калифорнийского Тягиня (Бардош) 1 -

Bunyavirus энцефалита Инко (KN 3641) 1 -

Bunyaviridae, Крымской-Конго Крымской-Конго

Nairovirus геморрагическои геморрагической

лихорадки лихорадки

шт 3010-Уганда 1 -

Bunyaviridae, Москитной Москитной лихорадки

Phlebovirus лихорадки Сицилия

Сицилия (Сэбин) 1 -

Москитной Москитной лихорадки

лихорадки Неаполь

Неаполь (Сэбин) 1 -

Bunyaviridae, Бханджа Бханджа (Ig 690) 1 -

неклассифициро-

ванные

Togaviridae, Западного Синдбис (Аз 574) 1 -

Alphavirus энцефаломиелита

лошадей

Венесуэльского Венесуэльского энцефа- 1 -

энцефаломиелита ломиелита лошадей

лошадей (230)

Reoviridae, Кемерово Кемерово (К-10) 1 -

Orbivirus

Orthomyxoviridae Дхори Дхори (Ig 611313) 1

На следующем этапе Государственных испытаний в исследование был включен полевой и клинический материал 12 образцов органов птиц (смешанный пул головного мозга и селезенки) и 12 образцов суспензии комаров, собранных на территории Астраханской области, эндемичной по ЛЗН, а также 60 образцов сывороток крови больных вирусными гепатитами, инфекциями герпесвирусной группы, ВИЧ-инфекцией и др и 25 образцов сывороток крови здоровых доноров

При исследовании с помощью сконструированной тест-системы полевого материала РНК вируса ЗН выявили в двух образцах органов птиц, что коррелировало с результатами вирусологического исследования этого же материала в культуре клеток Vero Е6 При тестировании сывороток крови зарегистрировано два положительных результата

Воспроизводимость результатов ПЦР с разработанной тест-системой оценивали путем десятикратной постановки 3-х положительных проб, полученных при внесении в сыворотки крови здоровых доноров СОПк+ ЗН в концентрации 1*107ГЭ/мл, и десятикратной постановки 3-х отрицательных проб - сывороток крови здоровых доноров Ложноотрицательных и ложноположительных ответов не получено

Таким образом, в ходе проведенных Государственных испытаний установлено, что чувствительность тест-системы «ГенНил» составила 1х103ГЭ/мл (соответствует заявленной чувствительности препарата), специфичность - 98,3 %, воспроизводимость результатов - 100 %, продолжительность анализа - 6 часов Тест-система рекомендована Ученым советом ГПСК им Л А Тарасевича и Комитетом МИБП к регистрации в Российской Федерации, нормативная документация на нее - к утверждению в установленном порядке (протокол № 1 от 17 01 06 г заседания Ученого совета ГИСК им Л А Тарасевича, протокол № 1 от 09 02 06 г заседания Комитета МИБП)

На следующем этапе работы проведена апробация тест-системы при исследовании полевого материала, собранного при мониторинге природных очагов ЛЗН и при обследовании неэндемичных территорий В ходе эпизоотолошческого обследования территорий Астраханской области и Республики Калмыкия при тестировании в ОТ-ПЦР 1857 экземпляров комаров (72 пробы) РНК вируса

обнаружили в двух пробах (2,8±2,0 %), при исследовании суспензий органов мелких млекопитающих от 201 животного (48 проб) - в трех (6,3±3,5 %), а при тестировании 16 образцов суспензий мозга птиц - в одном (6Д5±6,25 %) При исследовании 516 экземпляров комаров (38 проб), отловленных на территории Ставропольского края, 8 проб содержали РНК вируса ЗН (21,1 ±6,7 %) Исследование 144 проб органов птиц, добытых на территории Саратовской области, выявило наличие РНК вируса в 2-х пробах (1,4±1,0 %), а исследование 329 образцов органов мелких млекопитающих - в 7 (2,1±0,8 %)

Совпадение результатов ПЦР и ИФА, направленного на выявление антигена вируса ЗН, составило 96,0-99,6 %, что свидетельствует об эффективности использования ПЦР-анализа с предложенной тест-системой в ходе эпизоотологического мониторинга территорий Применение двух методов позволило получить более достоверные результаты

Для решения вопроса о целесообразности использования сконструированной тест-системы «ГенНил» при исследовании клинического материала было протестировано 90 образцов крови жителей Астраханской области, с заболеваниями, не исключающими арбовирусную этиологию, и 21 образец ликвора больных, проживающих в Саратовской области На основании обнаружения в клиническом материале антител класса ^М к возбудителю ЛЗН, эта инфекция установлена у 12 больных С помощью ОТ-ПЦР диагноз ЛЗН подтвержден у 4-х лиц (на 4-7 дни болезни) Дополнительно РНК вируса выявлена у 5 больных В первые три дня болезни положительные результаты получены с использованием ПЦР, а с шестого дня наиболее эффективными были методы диагностики заболевания, основанные на выявлении специфических антител Антиген вируса ЗН в ИФА выявили только в двух пробах, взятых на второй и третий дни заболевания Полученные данные свидетельствуют о целесообразности применения тест-системы «ГенНил» при лабораторной диагностике ЛЗН в ранний период заболевания (первые 6 дней болезни) Наибольшая эффективность отмечена при комплексном использовании двух подходов ПЦР-анализа с разработанным диагностическим препаратом и ИФА, направленным на выявление специфических антител класса ^М к возбудителю ЛЗН

Проведенное ранее с помощью ИФА обследование территории Саратовской области позволило установить циркуляцию вируса ЗН в этом регионе (Ляпин М Н и др, 1996, Щербакова CA и др, 2002, Щербакова С А и др, 2005) С созданием тест-системы «ГенНил» работа была продолжена с применением ОТ-ПЦР Сбор полевого и клинического материала осуществляли на территории 36 районов области (из 38), расположенных в трех природно-климатических зонах лесостепной, степной и полупустынной С помощью ИФА и/или ПЦР исследовали 5471 экземпляров комаров 12 видов, объединенных в 166 проб, 2536 экземпляров имаго клещей 8 видов, объединенных в 260 проб, органы 2707 мелких млекопитающих 13 видов, объединенные в 990 проб, 144 птицы 47 видов, относящихся к 12 отрядам При использовании двух методов выявлено 8 положительных образцов суспензий комаров (4,8±1,7%), 10 положительных проб суспензий клещей (3,8±1,2 %), 26 положительных образцов суспензий органов мелких млекопитающих (2,6±0,5 %) и 2 положительные пробы, состоящие из органов птиц Положительные результаты были зафиксированы в пробах, скомплектованных из комаров Ле vexans, Ае cataphylla и С pipiens, клещей D marginatus, D reticulatus и Rh rossicus, органов мышевидных грызунов (лесной мыши, домовой мыши, рыжей полевки), органов птиц (горихвостки, грача, совы ушастой) Таким образом, исследования показали, что основными переносчиками вируса являются комары родов Aedes и Culex, клещи родов Dermacentor и Rhipicephalus, носителями - мышевидные грызуны, шицы Анализ полученных результатов и данных о местах сбора полевого материала показал, что распространение возбудителя происходит выше 50° северной широты, преимущественно на территории районов, расположенных в степной и полупустынной природно-климатических зонах

Эти данные послужили основанием для изучения уровня иммунной прослойки к вирусу ЗН среди сельскохозяйственных животных и населения региона Исследовали 231 образец сыворотки крови КРС и 1174 пробы сывороток крови жителей г Саратова и Саратовской области на наличие антител класса IgG к возбудителю JI3H В среднем уровень иммунной прослойки КРС к вирусу составил (3,5±1,2) %, иммунная прослойка населения области зарегистрирована на уровне

(3,7±0,6) %, что также подтверждает циркуляцию вируса ЗН на территории области

Полученные результаты свидетельствуют об эффективности использования наряду с ИФА полимеразной цепной реакции для изучения особенностей циркуляции вируса ЗН

ВЫВОДЫ

1 Выбраны праймеры Wn 10149, Wn 10149 (1), Wn 10588, Wn 10213, Wn 10318, комплементарные З'-концу нуклеотадной последовательности РНК вируса ЗН, включая участок, кодирующий неструктурный белок NS5 Для данных праймеров оптимизированы параметры реакций обратной транскрипции и амплификации нуклеиновых кислот, подобран метод выделения РНК, обеспечивающие высокую чувствительность и специфичность ПЦР при детекции возбудителя ЛЗН

2 Разработана тест-система для выявления РНК вируса ЗН в биологическом материале методом двухстадийной ПЦР, состоящая из четырех комплектов реагентов Диагностическая ценность препарата (чувствительность -1х103ГЭ/мл, специфичность - 98,3 %, воспроизводимость результатов - 100 %) подтверждена Государственными комиссионными испытаниями ПЦР-тест-система сохраняет свою специфическую активность в течение 6 месяцев хранения при температуре не выше минус 18 °С

3 Сконструирован и депонирован в Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» (Саратов) генетически модифицированный штамм Е coli TGI pWN ApR, несущий рекомбинантную плазмиду, содержащую фрагмент ДНК, гомологичный участку нуклеотадной последовательности РНК вируса ЗН На основе рекомбинантной плазмиды создан стандартный образец предприятия (СОПк+ ЗН) и положительный контрольный образец к тест-системе Разработана стандартная процедура контроля чувствительности и специфичности диагностического препарата «ГенНил» в условиях производства

4 Разработан пакет нормативной документации на тест-систему для

выявления РНК вируса ЗН методом ОТ-ПЦР фармакопейная статья предприятия,

пояснительная записка, инструкция по применению тест-системы, отчет о

21

лабораторно-экспериментальном изучении препарата, внутренняя и внешняя маркировки, проект паспорта, пояснительная записка о получении положительного контрольного образца для диагностического препарата «ГенНил», инструкция по применению Стандартного образца предприятия (СОПк+ ЗН), свидетельство на СОПк+ ЗН, проект паспорта на СОПк+ ЗН

5 Показано, что ПЦР-анализ с применением тест-системы «ГенНил» может быть использован в ходе мониторинга природных очагов, при эпизоотологическом обследовании территорий с целью выявления циркуляции вируса ЗН, а также для лабораторной диагностики заболевания

6 С помощью ПЦР-тест-системы «ГенНил» изучены особенности распространения вируса ЗН на территории Саратовской области Основными переносчиками вируса являются комары родов Aedes и Culex, клещи родов Dermacentor и Rhipicephalus, носителями - мышевидные грызуны, птицы Циркуляция вируса наиболее интенсивно осуществляется в районах области, относящихся к степной и полупустынной природно-климатическим зонам

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Билько ЕА, Щербакова CA, Красовская ТЮ, Клюева ЕВ, Куличенко А Н Изучение иммунной прослойки к арбовирусам у жителей Саратова // Медицинская микробиология-XXI век мат Всероссийской научно-практ конф (28-30 сентября 2004 г, Саратов)-Саратов, 2004 -С 35-36

2 Красовская Т Ю, Билько Е А , Данилов А Н, Матвеева Т Ф , Моисеенко О Г, Щербакова С А , Куличенко А Н Результаты исследования сывороток крови населения Пугачевского и Балаковского районов Саратовской области на антитела к арбовирусам//ЗНиСО -2004 -№12(141) -С 25-27

3 Красовская Т Ю , Еремеева И Г , Корженевич А В , Щербакова CA , Михайлова Е В, Куличенко А Н Опыт лабораторной диагностики сезонных серозных менингитов энтеровирусной и арбовирусной этиологии // Санитарная охрана территорий государств участников содружества независимых государств проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях мат VI Межгосударственной научно-практической конф

государств-участников СНГ (13-14 сентября 2005 г , Волгоград) - Волгоград, 2005 -С 250-251

4 Михайлова Е В , Еремеева И Г, Красовская Т Ю , Корженевич А В Клинические особенности и вирусологическая диагностика серозных менингитов у детей // Актуальные вопросы инфекционной патологии и вакцинопрофилактики у детей мат IV российского конгресса детских инфекционистов (14-16 декабря 2005, Москва)-М,2005 -С 125

5 Красовская Т Ю , Шарова И Н, Щербакова С А, Яшечкин Ю И, Ларичев В Ф , Хуторецкая Н В , Бутенко А М, Куличенко А Н Тест-система для выявления РНК вируса Западного Нила методом ПЦР // Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербуржского саммита «Группа восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых государств мат VII Межгосуд научно-практ конф - Оболенск, 2006 - С 212

6 Красовская Т Ю, Шарова И Н, Щербакова С А , Яшечкин Ю И, Ларичев В Ф , Хуторецкая Н В , Бутенко А М, Куличенко А Н Разработка тест-системы для выявления РНК вируса Западного Нила методом ОТ-ПЦР // Новые технологии в диагностике и лечении инфекционных болезней сб тезисов VII Российского съезда нфекционистов (25-27 октября 2006 г, Н Новгород) -Н Новгород, 2006 - С 159

7 Афанасьева Е Е , Василенко Н Ф, Ефременко В И, Чумакова И В , Марьева Т В , Бутенко А М, Красовская Т Ю , Щербакова С А , Шарова И Н Опыт применения аффинного сорбента доя экспресс-диагностики лихорадки Западного Нила // Мат IX съезда Всероссийского научно-практ общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (26-27 апреля 2007, Москва) - М, 2007 - Том 3 -С 9-10

8 Матросов А Н , Щербакова С А , Слудский А А , Чекашов В Н, Фирстов Е Н , Князева Т В , Красовская Т Ю, Тарасов М А , Кузнецов А А , Шилов М М, Удовиков А И , Яковлев С А Эпизоотологический мониторинг в природных очагах зоонозных инфекций в Саратовской области // Мат IX съезда

Всероссийского научно-практ общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов(26-27апреля2007,Москва)-М,2007 -ТомЗ -С 201

9 Красовская Т Ю, Найденова Е В , Шарова И Н , Яшечкин Ю И , Щербакова С А , Ларичев В Ф, Хуторецкая Н В , Саркисян К А , Воробьева М С , Бутенко А М, Куличенко А Н , Львов Д К, Кутырев В В Разработка и внедрение ПЦР-тест-систем для детекции вирусов Западного Нила и Крымской-Конго геморрагической лихорадки // Арбовирусы и арбовирусные инфекции мат расширенного пленума проблемной комиссии «Арбовирусы» РАМН и научно-практической конференции «Арбовирусы и арбовирусные инфекции» (Астрахань, 17-20 октября 2006 г) -Тула ЗАО «Гриф и К0», 2007 - С 97-100

10 Щербакова СА, Билько ЕА, Найденова ЕВ, Красовская ТЮ, Шарова И Н, Пионтковский С А , Уткин Д В , Чекашов В Н, Слудский А А , Попов Н В , Куклев Е В , Фирстов Е Н, Потемина Л Н, Логунова Т Е , Во дина Е А , Куличенко А Н, Кутырев В В Экологические и эпидемиологические аспекты циркуляции арбовирусов на территории Саратовской области // Арбовирусы и арбовирусные инфекции мат расширенного пленума проблемной комиссии «Арбовирусы» РАМН и научно-практической конференции «Арбовирусы и арбовирусные инфекции» (Астрахань, 17-20 октября 2006 г) - Тула ЗАО «Гриф и К0», 2007 -С 150-152

11 Красовская Т Ю , Шарова И Н , Щербакова С А , Яшечкин Ю И , Хуторецкая Н В , Ларичев В Ф , Бутенко А М, Куличенко А Н Разработка и внедрение тест-системы для лабораторной диагностики лихорадки Западного Нила методом ПЦР//ЗНиСО -2007 - №6(171) - С 42-46

Подписано к печати 08 10 2007 г Формат 60x84/16 Бумага офсетная Печать офсетная Гарнитура «Тайме» Усл-печ л 1 Тираж 100 Заказ № 227

Отпечатано с оригинал-макета в ООО «Принт-Клуб» 410026, г Саратов, ул Московская, 160 Тел (845-2)507-888