Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка биотехнологии получения органокремнеземного аффинного сорбента для диагностики лихорадки Западного Нила

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка биотехнологии получения органокремнеземного аффинного сорбента для диагностики лихорадки Западного Нила"

На правах рукописи

АФАНАСЬЕВА Екатерина Евгеньевна

РАЗРАБОТКА БИОТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ОРГАНОКРЕМНЕЗЕМНОГО АФФИННОГО СОРБЕНТА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ЛИХОРАДКИ ЗАПАДНОГО НИЛА

03.00. 23 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2008

003450018

Работа выполнена в ФГУЗ Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный руководитель:

доктор медицинских наук,

профессор Ефременко Виталий Иванович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор Степанов Алексей Вячеславович

доктор биологических наук,

профессор Владимцева Ирина Владимировна

Ведущая организация: Государственный научный центр

Российской Федерации - Институт медико-биологических проблем Российской Академии Наук

Защита состоится «_»_2008 г в_часов на заседании

Диссертационного совета Д 208 046 01 в ФГУН «Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им Г Н Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу 125212, г Москва, ул Адмирала Макарова, д 10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им Г Н Габричевского

Автореферат разослан «РУ » 008 г

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук С Ю Комбарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В современном мире неуклонно растет понимание чрезвычайной социально-экономической значимости глобального распространения различных инфекционных болезней Особенностью сложившейся эпидемиологической ситуации является не только повсеместная активизация практически всех известных инфекционных заболеваний, которые традиционно находятся под контролем санитарно-эпидемиологических служб, но и возникновение очагов новых и возвращающихся инфекций бактериальной и вирусной природы (Онищенко Г Г, Кутырев В В , Кривуля С Д и соавт, 2006, Локтев В Б, 2007)

Важной задачей в борьбе с инфекционными заболеваниями является обнаружение и идентификация возбудителей, решение этой проблемы обеспечивается широким арсеналом методических приемов от классических методик микробиологического и вирусологического тестирования до современных им-мунохимических и генетических методов

Достижения последних десятилетий в области химии, биохимии, биотехнологии способствовали к разработке принципиально новых материалов - сорбентов для разделения и очистки биополимеров, матриц для их иммобилизации и т п (Брыкалов А В , 1993, Кузнецов С И , Барашкова Л Н , Носикова и соавт , 1998, Коваленко Г А , Комова О В , Симаков А В и соавт, 2002, Кунижев С М , Воробьева О В , Денисова Е В и соавт, 2002, Лисецкий В И, Лисецкая Т А , Меркушева Л И и соавт, 2004 и др) Внедрение таких материалов в практику лабораторной диагностики инфекционных заболеваний привело к значительному повышению качества лабораторного анализа, выражающегося как в увеличении чувствительности и специфичности методов, так и достоверности результатов (положительных и отрицательных) Перспективными для применения в диагностике и идентификации патогенов являются различные гранулированные иммуносорбенты, в том числе с магнитными свойствами, так называемые магноиммуносорбенты (МИС) (Ефременко В И, 1996, Тюменцева ИС, 1996, Жарникова И В , 2004, Василенко Н Ф 2004 и др )

Их внедрение в лабораторную практику может существенно помочь в реализации задач, изложенных в Программе «Предупреждение чрезвычайных ситуаций эпидемического характера и санитарная охрана территории Южного Федерального округа Российской Федерации от заноса и распространения инфекционных болезней (2007-2011 гг)», принятой Советом Глав субъектов РФ ЮФО (протокол №А52-7801-34ДК от 29 11 2006 г) Это связано не только с

\

риском заноса заболеваний, но и наличием многих природных очагов особо опасных инфекций (чумы, бруцеллеза, сибирской язвы, туляремии, Крымской геморрагической лихорадки, лихорадки Западного Нила (ЛЗН) и др )

Ставропольский край в силу своих природных условий (жаркий засушливый климат, обилие водоемов, комаров и клещей, большая масса перелетных птиц и др) представляют большой интерес в отношении изучения циркуляции вируса лихорадки Западного Нила и его роли в патологии человека Такие исследования на территории Ставропольского края ранее никогда не велись

В связи со сказанным, совершенствование методов лабораторной диагностики ЛЗН и мониторинга природных очагов этой инфекции является актуальной задачей (Онищенко Г Г, 2000, Онищенко Г Г, Кутырев В В , Кривуля С Д с соавт, 2006)

Цель исследования: разработка биотехнологии нового аффинного сорбента на основе высокодисперсного кремнезема, изучение возможности его применения в экспресс-диагностике лихорадки Западного Нила

Основные задачи исследования:

1 Изучить возможность использования природного кремнезема в качестве твердофазной матрицы при получении сорбционного материала и охарактеризовать его химический состав

2 Провести модификацию поверхности сорбента с целью образования на ней активных функциональных групп, способных к иммобилизации белковых лигандов

3 Установить оптимальные параметры и условия синтеза магноим-муносорбента, его физико-химические и иммунохимические свойства

4 Разработать условия постановки сочетанных методов МИС + ИФА, МИС + ПЦР в эксперименте

5 Определить диагностическую ценность разработанного магноим-муносорбента при исследовании на ЛЗН полевого и клинического материала, собранного на территории Ставропольского края

Научная новизна работы.

Впервые предложен отечественный природный кремнезем для получения твердофазной матрицы сорбента, изучен его химический состав

Для образования функционально-активных групп на поверхности кремнезема, способных к ковалентному связыванию с остатками аминокислот бел-

ковых лигандов, разработан метод химической модификации его поверхности карбоксиметилированным лигнином и карбодиимидом (1-Циклогексил-3 (2-морфолинил-4-этил) карбодиимидметил-п-толуолсульфонатом)

Разработанная новая биотехнология позволяет получать аффинный сорбент с магнитными свойствами, обладающий высокой сорбционной емкостью, стабильностью структурных характеристик, высокой чувствительностью и специфичностью, для выявления возбудителя лихорадки Западного Нила

Результаты проведенных исследований дополняют новыми научными данными сведения о твердофазных носителях и химической модификации их поверхности с целью использования в биотехнологии получения аффинных сорбентов, тем самым пополняя и намечая направления изысканий в области усовершенствования иммунодиагностики инфекционных заболеваний, в том числе и лихорадки Западного Нила

Практическая значимость работы.

Впервые на территории Ставропольского края при исследовании объектов внешней среды с использованием аффинного сорбента выявлена циркуляция вируса J13H и определен его основной переносчик - комары рода Aedes

Установление факта циркуляции возбудителя ЛЗН на территории Ставропольского края диктует необходимость проведения дальнейшего расширенного, углубленного эпидемиологического и эпизоотологического мониторинга для изучения природного очага этой вирусной инфекции

Применение сконструированного аффинного сорбента в сочетании с экспрессными методами лабораторной диагностики (ИФА и ПЦР) позволяет увеличить их чувствительность и специфичность, тем самым повышая выявляе-мость инфекционного патогена в 2,5 раза в ИФА и в 1,8 раза в ОТ-ПЦР, одновременно сокращает время проведения исследования с 20-21 часа до 1-3 часов за счет ускорения манипуляций и исключения ряда этапов в ходе анализов, что повышает их экспрессность, информативность и достоверность

По результатам выполненных исследований получен патент РФ № 2290641 от 27 12 2006 г «Способ проведения иммуноферментного анализа (ИФА)»

Внедрение результатов в практику.

Материалы научных разработок легли в основу методических рекомендаций «Магноиммуносорбенты в микробиологических и клинических исследованиях», утвержденных директором СтавНИПЧИ (протокол Ученого совета СтавНИПЧИ

№9 от 27 10 2005 г), «Применение органокремнеземного аффинного сорбента для селективного концентрирования возбудителя ЛЗН и последующего проведения экспресс-анализов (ИФА и ПЦР)», утвержденных директором СтавНИПЧИ (протокол Ученого совета СтавНИПЧИ №2 от 28 февраля 2007 г)

Положения, выносимые на защиту:

1 Предложенный метод химической модификации поверхности природного кремнезема обеспечивает образование функционально-активных групп для прочного присоединения белкового лиганда, что придает сорбенту биоспецифические свойства

2 Созданная биотехнология изготовления аффинного твердофазного микрогранулированного лигнинсодержащего композиционного сорбента позволяет использовать его для избирательного концентрирования вируса лихорадки Западного Нила при проведении экспрессных методов лабораторной диагностики, что повышает их чувствительность и специфичность

3 Высокая эффективность разработанного ЛЗН-сорбента позволила впервые установить циркуляцию вируса ЛЗН на территории Ставропольского края

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были обсуждены на расширенной научной конференции лабораторий и отделов Ставропольского научно-исследовательского противочумного института Роспотреб-надзора (Ставрополь, 14 июня, 2007) и представлены на научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург, 2006), VII Межгосударственной научно-практической конференции государств - участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств - участников содружества Независимых Государств (Оболенск, 35 октября, 2006), Втором съезде военных врачей медико-профилактического профиля Вооруженных сил Российской Федерации «Современные проблемы военной профилактической медицины, пути их решения и перспективы развития» (Санкт-Петербург, 15-17 ноября, 2006), расширенном пленуме проблемной комиссии «Арбовирусы» РАМН и научно-практической конференции «Арбовирусы и арбо-вирусные инфекции» (Астрахань, 17-20 октября, 2006)

Публикации. Основное содержание диссертации отражено в 21 опубликованной научной работе

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 3-х глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованной литературы Она изложена на 130 страницах, содержит 7 таблиц и 11 рисунков Список литературы включает 269 источников, из них 218 отечественных и 51 зарубежный

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы. При выполнении работы использован клинический и полевой материал, собранный нами в 9 районах Ставропольского края и г Ставрополя 268 сывороток крови лихорадящих больных и 946 сывороток крови доноров, 3729 объектов внешней среды, в том числе 772 имаго орнито-фильных комаров (83 пула) родов Culex, Aedes, Anopheles, Coquillettidia, 2957 особей иксодовых клещей (88 пулов) - Hyalomma marginatum, Dermacen-ter margmatus, Ixodes ricinus, Rhipicephalus rossicus, Boophilus anmdatus

В работе применяли метод фракционирования белков с использованием высокомолекулярного нейтрального водорастворимого полимера - полиэти-ленгликоля (ПЭГ)- 6000 (Poison А, Potgieter G М , Largier IЕ , 1964)

Иммунопероксидазный конъюгат получали методом перйодатного окисления по PKNakane, A Kawaoi (1974) Очистку иммунопероксидазного конъ-югата от несвязавшихся иммуноглобулинов и фермента проводили на хрома-тографической системе ЛКБ (Швеция), используя сефадекс G-100 Рабочий титр и специфическую активность конъюгата определяли по методу М Clark и A Adams (1977) в «сэндвич»-варианте ИФА

Количественное определение белка проводили по методу О Warburg и W Christian (1941) сравнением поглощения белков при 280 и 260 нм на спектрофотометре СФ-46 (Практическая химия белка, 1989), измерения pH - на рН-метре милливольтметре рН-150 МА (Белоруссия)

Микроструктуру сорбентов исследовали на сканирующем электронном устройстве IMZ-T3000 (Япония) как описано в работе Я Фрайфельдер (1980) ИК-спектры сорбентов исследовали на спектрофотометре «Specord» - 75IR (Германия) в диапазоне волновых чисел 500-4000 см"' (Киселев А В, 1972) Удельную поверхность MC определяли по методу А А Клячко-Гурвича (1961), основанному на низкотемпературной адсорбции азота Суммарный объем и диаметр пор определяли методом ртутной порометрии на приборе AYTO PORE - 9200 (Кельцев Н В, 1984) Идентификацию поверхностных

функциональных групп проводили по методу А В Киселева (1972) Концентрацию аминогрупп органокремнеземного сорбента определяли по методу О И Ворошиловой, А И Киселева (1980) Рентгенофазный анализ осуществляли на рентгенодифрактометре «Дифрей» (Россия)

Выявление РНК вируса ЛЗН в пробах проводили методом ОТ-ПЦР, используя экспериментальную тест-систему Российского НИПЧИ «Микроб» (Саратов) Амплификацию проводили на термоциклере Mastercycler 22331 (Eppendorf, Germany) Постановка ПЦР включала два этапа На первом этапе в работе были задействованы внешние праймеры Wn 10149, Wn 10249, Wn 10588 Для повышения чувствительности и специфичности проводили второй этап амплификации с внутренними праймерами Wn 10213 и Wn 10318, имеющими комплементарные участки на фрагментах ДНК, полученных после первого этапа

Детекцию продуктов амплификации осуществляли методом гель-электрофореза в 1,5-2% агарозном геле в камере Sunrise (Life Technologies -Gibco BRL Honzontal Gel Electrophoresis Apparatus, USA) Визуальзацию результатов ЭФ после окраски геля бромистым этидием осуществляли на УФ-трансиллюминаторе ТЕХ-20 (Life Technologies -Gibco BRL UV Transilluminator, USA) и системе регистрации изображений в геле Kodak Sciense EDAS 120 System (Eastman Kodak, USA)

Лиофилизацию биологического материала проводили на установке TG-5 (Германия)

Экспериментальные данные обработаны методами вариационной статистики, изложенными в работах И П Ашмарина и А А Воробьева (1962), ТН Зайцева (1991)

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Разработка биотехнологии получения лигнинсодержащего алюмоси-ликатного магноиммуносорбента и его характеристика

Эффективность ряда методов индикации и выделения возбудителей инфекционных заболеваний и их антигенов может быть значительно увеличена после предварительного концентрирования вирусов и их антигенов с отделением их от контаминирующей микрофлоры и примесей Эта цель может быть достигнута путем применения методов иммуносорбции, особое место среди которых занимают методы с использованием сорбентов с магнитными свойства-

ми Магносорбенты служат твердой фазой при селективном концентрировании на их поверхности патогенов (Брыкапов А В , Жарникова И В , 1995, Еф-ременко В И , Тюменцева И С , 1995, Жарникова И В , 1995, Тюменцева И С , 1996, Ефременко В И , 1997, Афанасьев Е Н , 2000, Василенко Н Ф , 2004)

Нами впервые для синтеза твердофазной матрицы сорбента использован природный алюмосиликат из Астраханского месторождения, представляющий собой продукт, содержащий в своем составе, по данным проведенного нами химического анализа, двуокись кремния (массовая доля) - 78%, насыпная плотность - 320 кг/м2, влажность при температуре 110°С (массовая доля) - 2,7%, влагоемкость - 71% По данным химического анализа, в его состав входят АЬОз - 21%, Ре20, - 0,8%, магний - 44 мг/кг, марганец - 9,4 мг/кг, медь -6,5 мг/кг, цинк - 10 мг/кг, кобальт - 0,4 мг/кг, кальций - 0,9 мг/кг

Химическое модифицирование сорбента осуществляли в присутствии кар-боксиметилированного лигнина и карбодиимида (1-Циклогексил-3(2-морфолинил^-этил) карбодиимидметил-п-толуолсульфонатом) В качестве магнитного компонента при синтезе применяли магнетит (Ре304) При обработке носителя органическим полимером - карбоксиметилированным лигнином, содержащим карбоксильные группы, происходит активирование его поверхности При последующем модифицировании сорбента карбодиимидом полученный продукт активируется функциональными группами, способными к взаимодействию с лигандами белковой природы*

На основе проведенных исследований определены оптимальные параметры получения лигнинсодержащего алюмосиликатного магносорбента соотношение компонентов синтеза 1,5 1 1, соответственно БЮ^, , карбоксимети-лированный лигнин, время гелеобразования - 2 часа, значение рН гелеобразо-вания - 7,0 (таблица 1)

Микроструктура полученного МС, исследованная на сканирующем электронном микроскопе (1М2-Т 3000, Япония), представлена губчатой, пористой поверхностью, при этом магнитный порошок способствует усилению срастания глобул в участки аморфной массы за счет дегитратационных процессов с участием силанольных групп- 81 - ОН Удельная поверхность сорбента- 64 м2/г, обьем пор - 1,24 м3/г, радиус пор - 30 нм

* Исследования проведены при содействии доктора химических наук, профессора Л В Брыкалова

Таблица 1. Структурные характеристики магносорбента при различных условиях его синтеза

№ п/п Массовое соотношение компонентов синтеза Время, ч Удельная поверхность, м2/г Объем, см3/г Радиус, нм

БЮг Ре304 карбо-ксимети-лированный лигнин

1 А 1,5 0,5 1 2 64,5±0,74 1,22±0,005 25,6±0,12

Б 1,5 1 1 2 63,6±0,49 1,23±0,008 29,6±0,49

2 А 1,5 1 1 2 64,5±0,74 1,22±0,005 29,7±0,29

Б 1,5 1 1 4 65,9±0,66 1,23±0,008 25,6±0,49

3 А 1,5 1,5 1 2 55,4±0,83 1,25±0,009 30,6±0,49

Б 1,5 1 1 8 69,7±0,65 1,22±0,005 23,7±0,45

4 А 1,5 2,5 1 2 54,6±0,47 1,29±0,038 32,2±0,60

Б 1,5 1 1 16 71,4±0,52 1,22±0,005 21,6±0,49

Обозначения 1А-4А - показатели при изменении количества магнетита, 1Б - 4Б - показатели при изменении времени гелеобразования

В ИК-спектрах алюмосиликатного сорбента, исследованных на спектрофотометре «5ресогс1»-45111, полосы поглощения в области 3750см и 3680 см " соответственно, отвечали свободным и связанным гидроксильным группам После химического модифицирования алюмосиликатного носителя карбокси-метилированным лигнином в ИК-спектре наблюдалось уменьшение интенсивности поглощения в области полосы 3750см 1 Одновременно обнаруживалось появление покоя поглощения в области 1650 смвалентных колебаний - СН -групп, карбоксильных групп (-СООН), аминогрупп (-ЫН2), при 900 см -ароматических колец, кроме того, полученный сорбент обнаруживал в своем спектре интенсивные полосы поглощения в области 2900 см - СН - связей, которые соответствовали метиленовым группам Результаты рентгенофазного анализа, проведенного на рентгенодифрактометре «Дифрей», показали, что в алюмосиликатном сорбенте обнаруживаются фазы неокисленного металла (Си) и оксидов (А1203, СиО, гпО), при этом отмечено большее содержание оксида алюминия, что согласуется с данными химического анализа образцов алюмосиликатных сорбентов

Для получения магноиммуносорбента (МИС) проводили иммобилизацию МС специфическими лигандами, которыми служили иммуноглобулины класса в, выделенные из мышиной иммунной асцитической жидкости против вируса ЛЗН* фракционированием полиэтиленгликолем-6000

При изучении кинетики процесса иммобилизации и эффективности связывания белкового лиганда с сорбентом установлено, что для полного насыщения

*Мышиные иммунные асцитические жидкости любезно предоставлены НИИ вирусологии им Д И Ивановского РАМН (г Москва)

магносорбента белком с концентрацией 2 мг/мл достаточно 2 часов при значении рН раствора 6-7 и температуры от 22 до 37°С.

Таким образом, методом формирования пористой структуры природного алюмосипикатного сорбента в присутствии полимеров получены композиционные магносорбенты, имеющие высокую адсорбционную емкость за счет стандартности структурных характеристик, таких как удельная поверхность, объем и размер пор, механическую прочность носителя, химическую стабильность в условиях активирования органическими функциональными группами, наличие в составе сорбента магнетита, обеспечивающего упрощение манипуляций с сорбентами Кроме этого, с применением природного материала отпадает необходимость лабораторного синтеза самой твердофазной матрицы, что существенно сказывается на себестоимости конечного продукта (рисунок 1)

Рисунок 1. Принципиальная схема получения МИС

Изучение диагностической ценности экспериментальных тест-систем для ИФА и ПЦР

Нами проведено исследование сывороток крови людей методом ИФА на наличие в них специфических антител класса G к вирусу ЛЗН, а также комплексное исследование методами ИФА и ОТ-ПЦР полевого материала (имаго комаров и клещей) с целью выявления антигена и РНК вируса ЛЗН с использованием экспериментальных тест-систем Отработаны оптимальные параметры подготовки проб клинического и полевого материала, повышающие чувствительность и специфичность этих методов Исследование 268 сывороток крови лихорадящих больных с диагнозами «Серозный менингит», «Крымская геморрагическая лихорадка9», «ОРЗ, лихорадка неясного генеза» и 946 сывороток крови доноров, доставленных из районов Ставропольского края, с помощью иммуноферментной тест-системы «ВекгоНил-JgG» (ЗАО «Вектор-Бесг», г Новосибирск) позволило выявить IgG к вирусу ЛЗН в девяти пробах больных и в 12 пробах доноров

Сбор имаго клещей проводили со скота в Благодарненском, Новоселицком, Нефтекумском, Курском, Ипатовском, Грачевском, Советском, Предгорном, Минераловодском районах Ставропольского края Методом ИФА исследовано 2957 особей иксодовых клещей, объединенных в 88 пулов, при этом учитывали видовую принадлежность, фазу развития, место сбора, вид хозяина клеща Антиген вируса ЛЗН в суспензиях клещей выявляли с помощью экспериментальной иммуноферментной тест-системы для индикации антигена вируса ЛЗН, изготовленной в НИИ вирусологии им Д И Ивановского РАМН (Москва)

Положительных находок антигена вируса ЛЗН при исследовании клещей Н marginatum, D margmatus, Rh rosswus, Ix nanus не было Среди 26 пулов имаго однохозяинного клеща В annulatus (353 экземпляра), собранных с крупного рогатого скота в Курском районе, выявлен 1 (3,8 %) положительный Можно предположить, что в данном случае заражение В annulatus произошло при питании кровью крупного рогатого скота в период вирусемии В имеющейся литературе отсутствуют сведения о значении клещей в качестве переносчиков вируса ЛЗН человеку Однако, известно, что клещи являются эффективными «накопителями», или «аккумуляторами», многих арбовирусов, в том числе передающихся комарами и другими кровососущими насекомыми (Краснова Е М, 2001)

На наличие антигена вируса ЛЗН исследовано 772 имаго комаров, объединенных в 83 пула Сбор комаров осуществляли в июне - июле 2005 и 2006 гг в Изобильненском, Шпаковском, Грачевском, Благодарненском, Нефтекум-

ском, Курском, Советском, Петровском, Георгиевском районах Ставропольского края и окрестностях г Ставрополя Антиген вируса ЛЗН в суспензиях комаров выявляли с помощью экспериментальной иммуноферментной тест-системы «ЭКОлаб-ЗН-Антиген» (г Электрогорск Московской области)

Выделение РНК и ОТ-ПЦР проводили в соответствии с инструкциями, прилагаемыми к тест-системам Оценку результатов реакции амплификации проводили путем сравнения положения полосы, соответствующей полученным в результате ПЦР ампликонам, с полосой специфичного фрагмента ДНК положительного контрольного образца. В треке, соответствующем положительному контролю, выявлялся фрагмент ДНК размером 106 п н В треках, соответствующих анализируемым пробам, наличие полосы строго на уровне положительного контроля указывало на присутствие РНК вируса ЛЗН в исследуемом материале

В результате исследования 772 особей комаров (83 пула) антиген вируса ЛЗН в ИФА обнаружен в четырех пробах суспензий комаров Ае carttans, что составило 9,3 % от всего количества проб Ае cantons и 4,8 % от общего количества исследованных проб (таблица 2)

При анализе результатов исследования кровососущих комаров обращает на себя внимание высокая зараженность вирусом ЛЗН орнитофильного вида Ае cantons, обитающего, главным образом, во влажной лесопарковой зоне Таким образом, орнитофильные комары Ае cantons,широко распространенные по краю, могут быть одним из переносчиков этого опасного вирусного заболевания

Методом ПЦР РНК вируса ЛЗН обнаружена в пяти пробах суспензий комаров рода Aedes, что составило 6,0 % от общего количества исследованных проб и 11,6 % от количества проб Aedes (таблица 2)

Полученные результаты свидетельствовали о достаточной эффективности использованных нами экспериментальных тест-систем, с помощью которых удалось выявить антиген вируса ЛЗН в ИФА в четырех пробах комаров Aedes cantons (4,8 %), одной пробе иксодовых клещей В annulatus (3,8 %), определить РНК вируса ЛЗН в пяти пробах суспензий комаров рода Aedes (6,0 %), а также выявить JgG к вирусу ЛЗН в девяти сыворотках крови лихорадящих больных (3,4 %) от общего количества проб) и в шести пробах сывороток крови доноров (1,3 %) Это позволяет сделать вывод о том, что Ставропольский край не является свободным от ЛЗН, что требует расширенных исследований с применением новых современных, информативных экспресс-методов для проведения эпидемиологического надзора за этой инфекцией

Таблица 2. Зараженность орнитофильных комаров вирусом ЛЗН в Ставропольском крае (2005-2006 гг.)

Территориальная единица Род комаров Всего

Culex Aedes Anopheles Coquillettidia обследовано, экз (проб), абс положительный результат вИФА и ОТ-ПЦР

обследовано, экз. (проб), абс положит результат вИФА нОТ-ПЦР обследовано, экз (проб), абс. положит результат вИФА и ОТ-ПЦР обследовано, экз. (проб), абс. положит, результат вИФА и ОТ-ПЦР обследовано, экз. (проб), абс положит результат вИФА и ОТ-ПЦР

Изобильнеиский район 21(1) 0 41(4) 1 0 0 0 0 62(5) 1

Шпаковский район 0 0 29(4) 2 0 0 0 0 29(4) 2

Грачевскнй район 0 0 20(2) 1 0 0 0 0 20(2) 1

г Ставрополь 100(5) 0 148(17) 4 0 0 0 0 248(22) 4

Благодарненский район 6(1) 0 7(4) 0 84(16) 0 14(4) 0 111(25) 0

Нефтекумский район 30(6) 0 123(6) 1 18(2) 0 22(2) 0 193(16) 1

Курский район 6(1) 0 67(3) 0 1(1) 0 0 0 74(5) 0

Советский район 0 0 10(1) 0 0 0 0 0 10(1) 0

Петровский район 0 0 3(1) 0 9(1) 0 0 0 12(2) 0

Георгиевский район 0 0 13(1) 0 0 0 0 0 13(1) 0

Итого 163(14) 0 461(43) 9 112(20) 0 36(6) 0 772(83) 9

Разработка сочетанных методов диагностики лихорадки Западного Нила

Одним из основных факторов повышения чувствительности иммуно-ферментного анализа является твердая фаза С целью упрощения и удешевления постановки иммуноферментного анализа, повышения его специфичности и чувствительности в качестве твердой фазы мы применили разработанные нами МИС при постановке «сэндвич» - варианта этого метода для обнаружения вируса ЛЗН При этом были определены оптимальные параметры постановки ИФА, чувствительность и специфичность метода, проведено сравнение модифицированного метода МИС+ИФА с методом постановки реакции в полистироловых планшетах (рисунок 2)

Подготовка материала (растирание, центрвфугнроваше)

/

Контакт с МИС-ЛЗН, 30 мшц температура 3? С

ИФА

Огмьожа от загрязнений (ингибиторов ИЦР)

ПЦР

/С

Блокировка свободных центров иммуноне-роксндашого коныогата БСА (10 мг на 1 мл коныогата)

/

Выделение РНК

/

Адсорбция иммунопероксндазного коньюга-та 26 мин, температура (37±1> аС

Постановка ОТ-ИЦР (получате кДНК на матрице РНК)

Отмывка от неси взявшегося иммунопе-роксидюного коиьюгата 0,1 М ФСБ с твин-20 (не менее «нести раз)

V

Амплификация ДНК

V

Добавление субстрат-индикаторного раствора; экспозиции 1-5 минут. Остановка реакции с добавлением стон-реагента

Перенос реакционного субстрата я микрокяаишет. Количественный учет реакции (тмерение оптической плотности на Мультискане)

71

Элеюрофорв продуктов ами.жфикацнн в 1,5-2 % агарошом геае

Рисунок 2. Схема проведения сочетанных методов МИС + ИФА, МИС + ОТ-ПЦР при выявлении антигена и РНК вируса ЛЗН

Лабораторные испытания полученных нами трех серий алюмосиликатных лигнинсодержащих МИС к вирусу ЛЗН проводили с инактивированными антигенами, полученными в НИИ вирусологии им Д И Ивановского РАМН Для получения иммуноферментного конъюгата использовали иммуноглобулины, фракционированные из мышиных асцитических жидкостей против вируса ЛЗН поли-этиленгликолем - 6000 (Poison А, Potgieter G M, Largier IE , 1964), которые кова-лентно связывали с индикаторным ферментом - пероксидазой хрена (тип VI, RZ-3,0 («Serva») с активностью 500ед) методом перйодатного окисления (Nakane РК,, Kawaoi А, 1974) Рабочий титр иммунопероксидазного конъюгата составил 1 600 Чувствительность конъюгата по ЛЗН-ангигену —15 мкг/мл (по белку)

Результаты исследований счидетельствовали, что сочетание метода предварительного концентрирования искомого инфекционного патогена на разработанном МИС с последующей детекцией его в ИФА приводило к целому ряду положительных моментов Так, например, для ИФА не требовалось применение полистироловых микропланшет, чувствительность ИФА повышалась более чем на 2 порядка (с 15 мкг/мл до 50-100 нг/мл), сокращалось время проведения анализа, включая сенсибилизацию твердой фазы, в 7 раз

Полевые испытания разработанных МИС были проведены при исследовании 772 имаго комаров (83 пула) Результаты исследований показали, что за счет селективного концентрирования специфического антигена на поверхности МИС те пробы комаров, которые показывали сомнительный результат в ИФА в полистироловых планшетах, в разработанном нами сочетанном методе МИС+ ИФА были положительными

Наряду с этим выявлены положительные пробы и среди тех пулов, которые давали отрицательный результат при исследовании в ИФА с помощью экспериментальной тест-системы

Использование селективного концентрирования на магноиммуносорбенте дало возможность обнаружить антиген вируса ЛЗН в десяти пробах, в то время как в ИФА без применения МИС выявлено четыре антигенсодержащих пробы Таким образом, нами подтверждено наличие антигена вируса ЛЗН в четырех суспензиях комаров и дополнительно выявлено шесть положительных проб комаров Ае cantons Применение МИС позволило повысить выявляемость инфекционного агента в 2,5 раза

Таким образом, разработан сочетанный метод детекции вируса ЛЗН путем избирательного концентрирования на МИС с последующей постановкой ОТ-ПЦР

Для проведения сочетанного метода МИС+ ОТ-ПЦР в пенициллиновые флаконы вносили 50 мкл 10 % взвеси МИС и приготовленную суспензию комаров. Инкубировали 30 мин при 37 °С. МИС с пробой трижды промывали ФСБ, придерживая постоянным магнитом флакон с сорбентом, и ресуспендировали в 150 мкл 0,15 М раствора хлорида натрия. Полученную суспензию использовали для выделения РНК (рисунок 2).

Результаты исследований показали, что применение магноиммуносор-бентов при проведении полимеразной цепной реакции позволяет на этапе подготовки пробы путем многократных промываний сорбента с фиксированным на нем вирусом освобождаться от всевозможных примесей, тем самым исключая их отрицательное влияние на реакцию, максимально концентрируя искомый патоген, что повышает чувствительность ПЦР-анализа и выявляемость антигена JI3H в 1.8 раза (рисунок 3).

Рисунок 3. Выявление РНК вируса ЛЗН методом ОТ-ПЦР до и после селективного концентрирования проб суспензий комаров на МИС

Таким образом, разработанная биотехнология получения лигнинсодержа-щего сорбента с магнитными свойствами на основе алюмосиликатного отечественного природного кремнезема, позволила изготовить аффинный сорбент, применение которого в сочетании с экспрессными методами лабораторной диагностики (ИФА, ПЦР) при исследовании полевого и клинического материала впервые на территории Ставропольского края дало возможность установить циркуляцию вируса лихорадки Западного Нила. Это подтверждает диагностическую ценность разработанного ЛЗН-сорбента, перспективу его применения в экспрессных методах исследований, что открывает новые возможности для изучения природной очаговости этой опасной инфекции.

18

ВЫВОДЫ

1 Впервые для получения аффинного сорбента использован отечественный природный кремнезем, содержащий в своем составе, по данным химического и рент-генофазного анализов, Si02 - 78 %, А1203 - 21 %, 1 % других окисленных и неокис-ленных металлов - Fe203, CuO, ZnO, Mg, Mn, Zn, Co, Cu, Ca (по массовой доле)

2 Разработана методика химической модификации поверхности твердофазной матрицы карбоксиметилированным лигнином и карбодиимидом (1-Циклогексил-З (2-морфолинил4-этил) карбодиимидметил-п-толуолсульфона-том), которая, по данным ИК-спеюгроскопии, обеспечивает образование функционально-активных групп (карбоксильных и метиленовых), способных к ковалентно-му связыванию с остатками аминокислот белковых лигандов

3 Стабильность структурных характеристик и состава сорбента достигнуты варьированием компонентами и условиями синтеза соотношение алюмосиликата, магнетита, карбоксиметилированного лигнина - 1,5 1 1 (соответственно), время гелеобразования - 2 часа, значение pH гелеобразования - 7,0 Получен аффинный сорбент для экспресс-диагностики лихорадки Западного Нила на основе апюмосиликатной лигнинсодержащей матрицы, ковалентно связанной с IgG из мышиной иммунной асцитической жидкости против вируса ЛЗН

4 Впервые на территории Ставропольского края при исследовании полевого и клинического материала с применением разработанного аффинного магносорбента установлена циркуляция вируса лихорадки Западного Нила, при этом его основным переносчиком являются комары рода Aedes

5 Применение ЛЗН-сорбента в сочетании с иммуноферментным анализом повышает его чувствительность более чем на 2 порядка (с 15 мкг/мл до 50 - 100 нг/мл), сокращает время проведения анализа, включая сенсибилизацию твердой фазы, в 7 раз, а также увеличивает выявляемость инфекционного агента в пробах из объектов внешней среды в 2,5 раза

6 Проведение ПЦР-анализа с привлечением сорбционной технологии позволяет на этапе подготовки пробы освобождаться от всевозможных примесей, оказывающих отрицательное влияние на реакцию, максимально сконцентрировать вирус лихорадки Западного Нила, что повышает число положительных находок в 1,8 раза

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Василенко, Н Ф Изучение циркуляции вируса лихорадки Западного Нила в Ставропольском крае / Н Ф Василенко, Е Е Афанасьева, Д А Грядских, Е А Горобец, Т В Марьева, Л В Дягтерева // Опыт работы учреждений Роспот-ребнадзора в Ставропольском крае по обеспечению санэпидблагополучия и защите прав потребителей 9-я Ежегодная Неделя Медицины Ставрополья Материалы науч-практ конф - Ставрополь, 2005 -С 173-177

2 Афанасьева, Е Е Эпидемиологический мониторинг ЛЗН на территори

3 и Ставропольского края /Е Е Афанасьева, Н Ф Василенко, Т В Марьева, И В Чумакова//Деп в ВИНИТИ 13 04 2006г -№477В-206

4 Чумакова, ИВ Орнитофильные комары (Díptera, Culicidae) Ставропольского края /ИВ Чумакова, Н Ф Василенко, Т В Марьева, Е Е Афанасьева, И Э Ляпин // Проблемы энтомологии Северо-Кавказского региона Материалы 1-й Всероссийской науч-практ интернет- конференции - Вып2 -Ставрополь «Агрус», 2006 - С 33-35

5 Афанасьева, Е Е Эпидемиологический надзор за лихорадкой Западного Нила в Ставропольском крае /Е Е Афанасьева, Н Ф Василенко, Т В Марьева //Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины Сб тезисов науч -практ конф молодых ученых - С - Пб Издательский дом СПбМАПО, 2006 - С 289-290

6 Ефременко, В И О значении птиц в заносе и циркуляции патогенных для человека вирусов в природных и антропогенных биоценозах Юга России /В И Ефременко, Г М Грижебовский, А П Бейер, И В Чумакова, Н В Ефременко, и др , Н Ф Василенко, Т Н Орлова, Е Е Афанасьева //Ставрополь, 2006 - 15с - Деп в ВИНИТИ 26 07 2006, №1008 В 2006

7 Чумакова, И В Освоение комарами урбаценозов городов Ставропольского края /ИВ Чумакова, С А Сироткина, Н Ф Василенко, Т В Марьева, Е Е Афанасьева //Актуальные вопросы эпидемиологии инфекционных болезней Сб науч трудов (вып 8) - М, 2006 - С 676-678

8 Афанасьева, ЕЕ Разработка метода селективного концентрирования на магноиммуносорбенте с последующей постановкой ИФА для детекции возбудителя лихорадки Западного Нила /Е Е Афанасьева //Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников содружества Независимых Государств Материалы УП Межгосударственной науч-пракг конф государств-участников СНГ (3-5 октября 2006, Оболенск, Московская область, Россия) - Оболенск, 2006 - С 178-179

9 Афанасьева, Е Е Разработка биотехнологии получения магноиммуно-сорбентов для экспресс-диагностики лихорадки Западного Нила / Е Е Афанасьева, Д А Грядских //Там же - С 179-180

10 Алиева, ЕВ Унификация и разработка тест-систем диагностических для мониторинга возбудителей бактериальной (кампилобактериоз, туляремия, лептоспироз) и вирусной (лихорадка Западного Нила) природы /Е В Алиева, А В Таран, Е Е Афанасьева, С А Курчева, Т В Жарникова, И С Тюменцева,

И В Жарникова, И В Самарина // Вестник Ставропольского государственного университета - Вып 47 - Ч 2 - Ставрополь, 2006 - С 292-298

11 Афанасьева, Е Е Разработка сочетанного метода детекции вируса лихорадки Западного Нила (JI3H) путем избирательного концентрирования на магноиммуносорбенте с последующей постановкой полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией /ЕЕ Афанасьева // Вестник «Российской военно-медицинской академии Второй съезд военных врачей медико-профилактического профиля Вооруженных сил Российской Федерации «Современные проблемы военной профилактической медицины, пути их решения и перспективы развития» Труды съезда 15-17 ноября 2006 г Санкт-Петербург

- 2006, приложение 1(15) - С 486

12 Патент РФ № 2290641 G01N 33/551, C12G 1/04 Способ проведения иммуноферментного анализа (ИФА) / Ефременко Д И , Жарникова И В , Юрки-на И В , Алиева Е В , Афанасьева ЕЕ- Зарегистр в Гос реестре изобретений РФ 27 12 2006 Бюл № 36

13 Афанасьева, Е Е Разработка биотехнологии получения магноимму-носорбентных тест-систем для экспресс-диагностики лихорадки Западного Нила и детекции ее возбудителя /ЕЕ Афанасьева, В И Ефременко, И С Тюмен-цева, Н Ф Василенко//Ставрополь, 2007 -20 с - Деп в ВИНИТИ 23 01 2007

- №66-В2007

14 Афанасьева, Е Е Совершенствование экспресс-диагностики лихорадки Западного Нила /Е Е Афанасьева //Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на Юге России Материалы науч-практ конф (21-22 марта 2007 г, г Ставрополь) - Ставрополь, 2007 -С 29-31

15 Василенко, НФ Эпидемиологическая обстановка по лихорадке Западного Нила в Южном Федеральном округе в 2006 г /НФ Василенко, О В Малецкая, А П Бейер, И В Чумакова, Е Е Афанасьева // Там же - С 64-67

16 Афанасьева, Е Е Опыт применения аффинного сорбента для экспресс-диагностики лихорадки Западного Нила /ЕЕ Афанасьева, Н Ф Василенко, В И Ефременко, И В Чумакова, Т В Марьева, А М Бутенко, Т Ю Крассовская, С А Щербакова, И Н Шарова //Материалы IX съезда Всерос науч -практ общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов 26 -27 апреля, 2007 - М Санэпидмедиа, 2007 - Т 3 - С 9-10

17 Ефременко, В И Применение тест-систем магноиммуносорбентных для выявления возбудителей инфекционных заболеваний /В И Ефременко, А А Зуенко, О И Коготкова, Н В Чурикова, И С.Тюменцева, И В Жарникова, Е С Шиянова, В.Д Майская, Е Е Афанасьева, Т В Жарникова, С А Курчева // Ставрополь, 2007 -28 с - Деп в ВИНИТИ 18 07 07 -№741-В2007

18 Василенко, НФ Цируляция некоторых арбовирусов на территории Ставропольского края /Н Ф Василенко, А П Бейер, И В Чумакова, В И Ефременко, О В Малецкая, М П Григорьев, Е Е Афанасьева, Т В Марьева, В М Мезенцев //Научно-практическийжурнал«РЭТ-ИНФО» - Москва,2007 -№1 -С 15-18

19 Василенко, Н Ф Распространение некоторых арбовирусов на территории Ставропольского края /Н Ф Василенко, А П Бейер, И В Чумакова, В И Ефременко, О В Малецкая, М П Григорьев, Е Е Афанасьева, Т В Марьева, В М Мезенцев //Арбовирусы и арбовирусные инфекции Материалы расширенного пленума

проблемной комиссии «Арбовирусы» и науч -пракг конф <(Арбовирусы и арбови-русныеинфекции», Астрахань, 17-20окт 2006 -Москва,2007 - С 165-168

20 Орлова, Т Н Получение ферромагнитного кремнезема, модифицированного карбонизированным лигнином и карбодиимидом, и его характеристика /Т Н Орлова, Е Е Афанасьева, Е Н Афанасьев, И.С Тюменцева, Н Ф Василенко //Вестник Московского ун-та Серия 2 - Химия, 2008 -Т49, №3 - С 213-216

21 Алиева, ЕВ Аффинные сорбенты для экспресс-диагностики различных заболеваний /Е В Алиева, И С Тюменцева, Е Н Афанасьев, Н Е Афанасьев, М П Лаврешин, Е Е Афанасьева, Т Н Орлова //Курский научно-практический вестник «Человек и его здоровье» -2008 -№1 -С 5-9

22 Жарникова, И В Разработка и применение иммобилизованных систем для экспресс-диагностики различных заболеваний /И В Жарникова, И С Тюменцева, Е Н Афанасьев, В И Ефременко, Е В Жданова, Т В Жарникова, Е Е Афанасьева, Т Н Орлова, Д В Ефременко, Н Е Афанасьев, М П Лаврешин, Н В Левченко, А А Семирчева, С А Курчева, А М Бабий //Вестник Российской военно-медицинской академии - Санкт-Петербург, 2008 - Приложение №2(22) - Ч 1 -С 180-181

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ, ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ

г - грамм

ед - единиц

ИФА - иммуноферментный анализ

кг - килограмм

ЛЗН - лихорадка Западного Нила

М - молярный

м - метр

мг - миллиграмм

МИС - магноиммуносорбент

мкг - микрограмм

мкл - микролитр

мл - миллилитр

нг - нанограмм

нм - нанометр

ОТ - обратная транскрипция

ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией

ПААГ - полиакриламидный гель

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЭГ - полиэтиленгликоль

РНК - рибонуклеиновая кислота

см - сантиметр

ФСБ - фосфатно-солевой буфер

°С - градус Цельсия

180 - иммуноглобулины класса в

рН - отрицательный логарифм концентрации водородных ионов

Печать офсетная Бумага офсетная Формат 60x84/16 Физ печ л - 1,3 Уел печ л - 1,2 Заказ - 455 Тираж -100

Отпечатано в оперативной полиграфии отдела информации и региональной статистики Ставропольстата г Ставрополь, ул Пушкина,4