Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Теоретические и прикладные аспекты конструирования магнитоуправляемых твердофазных иммунохимических тест-систем для экспресс-диагностики вирусного гепатита A, Крымской геморрагической лихорадки и детекции их возбудителей
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология
Автореферат диссертации по теме "Теоретические и прикладные аспекты конструирования магнитоуправляемых твердофазных иммунохимических тест-систем для экспресс-диагностики вирусного гепатита A, Крымской геморрагической лихорадки и детекции их возбудителей"
На правах рукописи
ВАСИЛЕНКО НАДЕЖДА ФИЛИППОВНА
ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ И ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ КОНСТРУИРОВАНИЯ МАГНИТОУПРАВЛЯЕМЫХ
ТВЕРДОФАЗНЫХ ИММУНОХИМИЧЕСКИХ ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ
ВИРУСНОГО ГЕПАТИТА А, КРЫМСКОЙ ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКИ И ДЕТЕКЦИИ ИХ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ
03.00.23 -биотехнология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Ставрополь - 2004
Работа выполнена в Ставропольском научно-исследовательском противочумном институте
Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор
Тюменцева Ирина Степановна.
Официальные оппоненты: доктор сельскохозяйственных наук,
профессор, академик РАСХН Петрова Людмила Николаевна
доктор медицинских наук, профессор Пожарская Виктория Олеговна
доктор биологических наук Майский Виктор Григорьевич
Ведущая организация: Вирусологический Центр научно-исследовательского института микробиологии МО РФ
Защита диссертации состоится 22 декабря 2004 года в 10 часов на заседании регионального диссертационного совета ДМ 212.256.04 при Ставропольском государственном университете по адресу: 355009, г.Ставрополь, ул.Пушкина, д.1, корпус 2., аудитория 506.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ставропольского государственного университета по адресу: 355009, г.Ставрополь, ул.Пушкина, д.1, корпус 1.
Автореферат разослан 10 ноября 2004 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук
" Т. И. Джандарова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Охрана здоровья населения, как важнейший фактор национальной безопасности, является одним из основных приоритетов государственной политики. Несмотря на то, что в последние годы медицинской наукой и практикой достигнуты бесспорные успехи в борьбе с инфекционными заболеваниями, в целом санитарно-эпидемиологическая обстановка в Российской Федерации, по данным Комитета Госсанэпиднадзора РФ, оценивается как неблагоприятная (Онищенко Г.Г., 2001, 2002). Большой удельный вес среди заболеваемости занимают вирусные инфекции, среди которых особое место принадлежит гепатитам и геморрагическим лихорадкам. Одна из главных проблем здравоохранения - вирусный гепатит А (ВГА) - инфекция с фе-кально-оральным механизмом передачи. В последние годы значительно возросло количество водных вспышек ВГА (Онищенко Г.Г., 2002; Онищенко Г.Г., Грижебовский Г.М., Ефременко В.И., 2003; Онищенко Г.Г. с соавт., 2003; Кузин С.Н. с соавт., 2004,2004а).
В 1999 г. в РФ после 30- летнего отсутствия резко обострилась эпидемическая ситуация по заболеваемости Крымской геморрагической лихорадкой (КГЛ) (Василенко Н.Ф. с соавт., 2002, 2003; Вышемирский О.И. с соавт., 2001; Колобухина Л.В. с соавт., 2001; Онищенко Г.Г. с соавт., 2000, 2001; Платонов А.Е. с соавт., 2002,2003; Онищенко Г.Г., Ефременко В.И., 2004). Появление заболеваний людей КГЛ в южных регионах РФ оказалось неожиданным для медицинских работников и специалистов санитарно-эпидемиологической службы. Имеющийся на тот момент инструктивно-методический материал в значительной мере устарел и не давал исчерпывающих ответов на возникающие вопросы как со стороны врачей-инфекционистов, эпидемиологов, так и работников диагностических лабораторий. В октябре 2004 г. случаи заболевания КГЛ зарегистрированы в Республике Ингушетия, летальность при этом составила 75 %.
Своевременное выявление возбудителя инфекционного заболевания занимает ведущее место в системе противоэпидемических мероприятий и способствует локализации очага инфекции. Разработка технологий на основе использования иммобилизованных форм биологических объектов является одним из научных направлений современной биотехнологии. Перспективными для применения в методах иммуноанализа являются твердофазные носители, в том числе
нитными свойствами (Жарникова И.В., 1995; Тюменцева И.С., 1996; Ефременко В.И., 1997; Афанасьев Е.Н., 2000; Chemla Y.R. et al, 2000; Richardson J., Hawcins P., Luxton R., 2001; Tanaka Т., Matsunaga Т., 2001). Исследования по созданию и практическому использованию магнитных сорбентов применительно к вирусным инфекциям ранее не проводились. В связи с этим возникла необходимость в развитии и совершенствовании иммунобиологических методов, разработке новых экспрессных методов диагностики вирусных инфекций и индикации их возбудителей, направленных на сокращение времени проведения анализов и повышение их чувствительности и специфичности.
Цель исследования: конструирование твердофазных магнитоуправляе-мых иммунохимических тест-систем, отработка методических подходов к их применению, изучение диагностической ценности при лабораторной диагностике вирусного гепатита А, Крымской геморрагической лихорадки и детекции их возбудителей.
Основные задачи исследования:
-разработать методологические основы конструирования твердофазных магнитоуправляемых иммунохимических тест-систем для лабораторной диагностики вирусного гепатита А, Крымской геморрагической лихорадки и детекции их возбудителей;
- разработать технологию применения магноиммуносорбентов при проведении экспрессных анализов (ИФА и ПЦР);
- провести оценку эффективности различных способов выделения иммуноглобулинов класса G из антивирусных иммунных сывороток и мышиных иммунных асцитических жидкостей (ИАЖ) при конструировании диагностических тест-систем;
- изучить диагностическую ценность разработанных тест-систем и методических приемов на экспериментальном, клиническом и полевом материале;
- изучить диагностическую ценность иммуноферментного анализа и поли-меразной цепной реакции при диагностике КГЛ и разработать методологию комплексного применениия этих методов на различных стадиях заболевания;
- создать банк сывороток крови от больных людей Крымской геморрагической лихорадкой из природных очагов Юга России для его использования при оценке новых МИБП для диагностики КГЛ.
Научная новизна работы. Впервые применительно к вирусным инфекциям осуществлена научно-методическая разработка биотехнологии производства магнитоуправляемых твердофазных иммунохимических тест-систем (по-
лиакриламидных и композиционных), обладающих высокими сорбционной ёмкостью, стабильностью, чувствительностью, специфичностью.
Впервые разработаны методические приёмы по сочетанному применению селективного концентрирования вирусов на магноиммуносорбентах с последующим проведением экспрессных методов (ИФА и ГЩР), позволяющие исследовать материал от больных людей или животных, пробы из внешней среды неограниченного объёма с высокой степенью загрязнения, с низкой концентрацией вируса и чувствительностью, в несколько сот раз превышающей традиционные, что значительно повысило достоверность полученных результатов исследований.
Впервые в сравнительном аспекте проведен комплексный анализ различных способов выделения иммуноглобулинов из антивирусных иммунных сывороток и ИАЖ при конструировании диагностических тест-систем.
Разработаны эффективные методы подготовки проб клинического и полевого материала для лабораторного исследования, повышающие чувствительность и специфичность экспрессных анализов.
Впервые проведено изучение диагностической ценности иммунофер-ментного анализа и полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) при диагностике КГЛ и определена методология комплексного использования этих методов на различных стадиях заболевания.
Впервые на территории Ставропольского края в очаге КГЛ обнаружены антитела класса G к вирусу КГЛ в пробах крови ежей, землеройки-белозубки и мыши полевой; на территории Республики Ингушетия антиген и РНК вируса КГЛ выявлены у клещей ВвврНИтаппыШыз и НавшаркузаШо(орНИа.
Приоритетность выполненных исследований подтверждена патентом РФ на изобретение №2065164 от 10.08.1996 г. «Диагностическая тест-система для выявления вируса гепатита А».
Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты проведенных исследований по методологии конструирования магнитоуправляемых твердофазных аффинных тест-систем дополняют теоретическую основу и намечают направление научных изысканий в области усовершенствования экспресс-диагностики вирусного гепатита А, Крымской геморрагической лихорадки и детекции их возбудителей. Теоретический аспект исследований состоит и в анализе возможных способов минимизации неспецифических реакций, повы-
шения достоверности результатов лабораторного анализа на вирусный гепатит А и Крымскую геморрагическую лихорадку.
Разработка методов подготовки клинического материала для проведения лабораторных исследований, изучение диагностической ценности экспресс-анализов позволили предложить метод комплексного использования ИФА и ОТ-ПЦР при диагностике КГЛ.
Разработанные методические подходы и приёмы по извлечению антигенного материала из клинического и полевого материала, выделению иммуноглобулинов из иммунных сывороток и асцитических жидкостей, оптимизация параметров конъюгации лигандов и маркёров позволили унифицировать биотехнологию производства ряда МИБП для экспресс-диагностики инфекционных вирусных заболеваний и детекции их возбудителей. Эти биотехнологии позволили изготовить серии диагностикумов (иммуноферментных, магноимму-носорбентных: полиакриламидных, аэросильных и алюмосиликатных), стабильно отвечающих общим медико-биологическим требованиям, предъявляемым к индикационным препаратам.
Применение сконструированных магноиммуносорбентов в сочетании с экспрессными методами диагностики (ИФА и ПЦР) увеличивает их чувствительность, одновременно сокращая время проведения исследований за счёт ускорения манипуляций и исключения ряда этапов в ходе анализов, что повышает целенаправленность проведения эффективных противоэпидемических мероприятий.
На основе материала от больных и подозрительных на заболевание КГЛ, поступившего в 2000-2004 гг. из природных очагов Юга России, создан банк лиофилизированных сывороток крови, систематизированных по различным критериям. Эта коллекция дает возможность проводить как углублённые клинические испытания новых МИБП для диагностики КГЛ, так и изучать некоторые теоретические аспекты современной вирусологии.
По материалам диссертации написана монография Н.Ф.Василенко с соавторами «Вирусный гепатит А, Крымская геморрагическая лихорадка: современные аспекты эпидемиологии и лабораторной диагностики» (2004 г.). Кроме того, результаты наших исследований использованы при написании двух монографий: В.И.Ефременко «Магносорбенты в микробиологических исследова-
ниях» (1996 г.) и Г.Г.Онищенко с соавторами «Крымская геморрагическая лихорадка» (2004 г.).
Материалы научных разработок легли в основу следующих методических и нормативных документов: «Инструкция по изготовлению и контролю тест-системы диагностической для выявления вируса гепатита А иммунофермент-ным методом». Одобрена Ученым советом СтавНИПЧИ (протокол №2 от 26.02.1993 г.) и утверждена директором института; «Протокол медицинских испытаний опытного образца комплекта «Диамаг-100» при выявлении вируса гепатита А в объектах внешней среды и материале от больных иммунофер-ментным методом с использованием магноиммуносорбентов («полевые» испытания)». Утвержден главным врачом Ставропольского городского ЦГСЭН А.А.Герасименко от 12.10.93 г. и зам. главного врача РЦГСЭН Чеченской Республики В.Х.Муцаевым от 10.05.95 г.; Методические указания «Использование магноиммуносорбентов в иммунологических методах выявления корпускулярных и водорастворимых антигенов возбудителей инфекционных заболеваний (бактериологический, иммуноферментный, иммунофлуоресцентный)». Утверждены Комитетом Госсанэпиднадзора РФ 11.04. 1995 г; Методические рекомендации «Приготовление органокремнеземных магносорбентов с иммобилизованными лигандами белковой природы (иммуноглобулины, антигены, ферменты)». Утверждены Комитетом Госсанэпиднадзора РФ 15.05.1996 г.; Методические рекомендации «Организация и проведение мероприятий против Крымской геморрагической лихорадки на территории природных очагов России». Утверждены Первым заместителем Министра здравоохранения РФ, Главным государственным санитарным врачом РФ Г.Г.Онищенко 23.03.2001 г.; Методические рекомендации «Оценка клинических и лабораторных данных (ПЦР, ИФА) при диагностике Крымской геморрагической лихорадки», «Выявление вируса гепатита А в объектах внешней среды и материале от больных людей», «Применение магнитных иммунных сорбентов (МИС), ИФА и ПЦР для выявления возбудителя Крымской геморрагической лихорадки в природных очагах инфекции». Одобрены Ученым советом СтавНИПЧИ (протоколы №3 от 20.03.2002 г.; №4 от 29.04.2004 г.; №5 от 25.05.2004 г.) и утверждены директором института на региональном уровне.
Материалы диссертации используются в лекциях и практических занятиях на курсах по первичной специализации врачей по особо опасным инфекциям при СтавНИПЧИ и семинарах для практических врачей и научных работни-
ков МЗ РФ по экспресс-диагностике инфекционных заболеваний и применению магносорбентных препаратов в мониторинге инфекционных агентов.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Изучение диагностической ценности экспериментальных тест-систем для ИФА и ПЦР при проведении лабораторного анализа на вирусный гепатит А и Крымскую геморрагическую лихорадку.
2. Принципы комплексного использования иммуноферментного анализа и полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией при лабораторной диагностике Крымской геморрагической лихорадки на разных стадиях заболевания.
3. Методология конструирования иммуноферментных диагностикумов, обеспечивающих высокую эффективность обнаружения возбудителей опасных и особо опасных вирусных инфекций и их антигенов в экспериментальных и полевых условиях.
4. Методологические подходы и разработка биотехнологии изготовления твердофазных микрогранулированных композиционных аффинных магнито-управляемых сорбентов для избирательного концентрирования вирусов и использования в экспрессных методах диагностики (ИФА и ПЦР).
5. Результаты экспериментальных, клинических и полевых испытаний тест-систем для диагностики вирусного гепатита А, Крымской геморрагической лихорадки и детекции их возбудителей.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на Всесоюзной научно-практической конференции «Состояние и перспективы разработки препаратов для диагностики вирусных гепатитов и инфекций, управляемых специфическими средствами профилактики» (Пермь, 1993); Межгосударственной научно-практической конференции «Актуальные вопросы профилактики чумы и других инфекционных заболеваний», посвященной 100-летию открытия возбудителя чумы (Ставрополь, 1994); научной конференции Ставропольского отделения Российского научного общества микробиологов, эпидемиологов и паразитологов (Ставрополь, 1995); конференции «Эпидемиологические и клинико-иммунологические аспекты профилактики важнейших инфекционных заболеваний» (Астрахань, 1996); научно-практической конференции, посвященной 100-летию образования противочумной службы России (Саратов, 1997); VII съезде Всероссийского общества эпи-
демиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 1997); международной научно - практической конференции «Проблемы санитарно-эпидемиологической охраны территории стран Содружества Независимых Государств» (Саратов, 1998); межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные аспекты природно-очаговых болезней», посвященной 80-летию Омского НИИПИ (Омск, 2001); рабочем совещании по обсуждению проекта программы «Профилактика особо опасных и природно-очаговых инфекций и санитарная охрана территории Южного Федерального округа Российской Федерации от завоза и распространения инфекционных заболеваний (2003-2005гг.)» (Ставрополь, 2002); II Республиканской научной конференции «Экология, биоразнообразие и значение кровососущих насекомых и клещей экосистем России» (Великий Новгород, 2002); научно-практической конференции «Эпидемиологическая безопасность. Итоги и перспективы», посвященной 50-летию СтавНИПЧИ (Ставрополь, 2002); 4-й Межгосударственной научно-практической конференции государств - участников СНГ «Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней» (Саратов, 2003); VI Российском съезде врачей - инфекционистов (Санкт-Петербург, 2003); Международной конференции по вновь появляющимся инфекционным болезням (США, Атланта, 2004).
Публикации. Основное содержание диссертации, выполненной в рамках 5 НИР, отражено в 39 опубликованных работах (монография-1, в ведущих научных журналах, рекомендуемых ВАК - 6 статей, депонированых - 6 статей, в 1 патенте РФ на изобретение, в материалах международных, межгосударственных и всероссийских научных конференций - 7 публикаций, в иностранных журналах - 1; в материалах научно-практических конференций - 16), а также в 1 нормативном документе (Инструкция) и 6 методических рекомендациях и указаниях.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка использованной литературы. Она изложена на 271 странице, содержит 19 таблиц и 33 рисунка. Список литературы включает 365 отечественных и 173 зарубежных литературных источников.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследований. При выполнении работы был использован клинический и полевой материал, включающий 52845 проб, в том числе: 1263 сыворотки крови больных и подозрительных на заболевание
Крымской геморрагической лихорадкой; 280 сывороток крови доноров из районов, эндемичных по КГЛ; 296 проб фекалий от больных вирусным гепатитом А; 40 проб фекалий от больных вирусным гепатитом В; 57 проб фекалий от больных кишечными инфекциями; 1017 проб водопроводной воды, открытых водоемов, канализационных стоков и др.; 190 проб крови крупного рогатого скота; 295 проб крови мелкого рогатого скота; 519 проб крови мелких грызунов и насекомоядных; 526 проб крови птиц; 218 проб органов диких грызунов и птиц; 47855 особей 15 видов иксодовых клещей: Hyalomma marginatum, H.scupense, H.anatolicum, H.detritum, Haemaphysalispunctata, Haem.otophila, Demacentormarginatus, D.pictus, D.niveus, Rhipicephalusrossicus, Rh.sanguineus, Rh. schulzei, Ixodes ricinus, I.redikorzevi, Boophilus annulatus; 280 особей гама-зовых клещей (Gamasoidae); 9 особей аргасовых клещей (Argaspersicus).
Контроль титра специфических антител против вируса гепатита А в сыворотках крови осуществляли методом ИФА с помощью коммерческой иммуноферментной тест-системы фирмы «ДИАплюс» (Москва).
Контроль титра специфических антител против вируса КГЛ в мышиных иммунных асцитических жидкостях (ИАЖ) проводили в реакции связывания комплемента (РСК) на холоду по методу J.Casals (1967).
Для выделения иммуноглобулинов класса G использовали метод двойного осаждения сернокислым аммонием (Фримель Г., 1987) и метод фракционирования белковых смесей с использованием высокомолекулярного нейтрального водорастворимого полимера - полиэтиленгликоля (ПЭГ)-бООО по A. Poison etal. (1964).
Иммунопероксидазные конъюгаты получали методом перйодатного окисления по P.K.Nakane, A.Kawaoi (1974) в нашей модификации. Рабочий титр и специфическую активность конъюгатов определяли по методу M. Clark и A.Adams (1977) в «сэндвич»-варианте ИФА.
Количественное определение белка проводили по методу O.Warburg и W.Christian (1941) сравнением поглощения белков при 280 и 260 нм на спектрофотометре СФ-26 (Практическая химия белка, 1989).
Микроструктуру поверхности магносорбентов (МС) определяли по методу, описанному в работе Д.Фрайфелдера (1980). Удельную поверхность МС определяли по методу А.А.Клячко-Гурвича (1961), основанному на низкотемпературной адсорбции азота. Суммарный объем и радиус пор определяли по методу Н.В.Кельцева (1984). Концентрацию аминогрупп органокремнеземного сорбента определяли по методу О.И.Ворошиловой, АИ.Киселева (1980).
Для постановки реакции обратной транскрипции и амплификации к ДНК использовали амплификаторы ДНК Mastercycler 22331 (Eppendorf, Germany) и 2400 Gene Amp PCR System (Perkin — Elmer, USA); камеры для горизонтального электрофореза Sunrise (Life Technologies - Gibco BRL Horizontal Gel Elecrophoresis Apparatus, USA) и Gel Elecrophoresis Apparatus GNA-200 (Pharmacia Fine Chemicals, Sweden); ультрафиолетовый трансиллюминатор TFX-20 (Life Technologies - Gibco BRL UV Transilluminator, USA); систему регистрации изображений в геле Kodak Digital Sciense ED AS 120 System (Eastman Kodak, USA). После амплификации проводили электрофорез продуктов ПЦР в 1,5 % агарозном геле.
Лиофилизацию биологического материала и диагностических препаратов проводили в камерах TG-5 (Германия) и LZ-9c (Чехословакия).
Для подтверждения воспроизводимости и достоверности результатов, полученных при исследовании, применяли статистические методы (Тамбовцев Е.П., Ахметкалиев С.Г., Пятницкий Н.П., 1969; Скуч Д., Уэст Д., 1979).
Математическую обработку результатов экспериментов проводили на компьютере в программе Excel.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Разработка биотехнологии конструирования полиакриламидной магноиммуносорбентной тест-системы для диагностики вирусного гепатита А и детекции его возбудителя
Наиболее важными моментами в технологии получения магносорбентов являются проблема стабилизации дисперсий, выбор оптимальных стабилизаторов и их концентрации, хорошее смачивание раствором мономеров частиц капсулируемого продукта и адгезия капель олигомера к их поверхности, а также скорость полимеризации мономеров.
При выборе магнитного материала мы исходили из того, что он должен иметь механическую прочность, выраженные магнитные свойства, мелкодисперсное состояние, коррозийную устойчивость в жидких средах, хорошую включаемость в полимер микрогранул, обладать инертностью по отношению к биологическим препаратам. Таким требованиям отвечала окись железа.
С целью повышения уровня гидрофильных свойств магнитного порошка, для лучшего включения его в полиакриламидные гранулы нами разработана методика, включающая предварительную обработку магнитного порошка путем промывки его ацетоном, дистиллированной водой, с последующим фос-фатированием. Фосфатное покрытие, кроме повышения уровня гидрофильно-
сти порошка, достаточного для включения в полиакриламидный гель, дополнительно придавало коррозионную стойкость.
В качестве носителя был выбран полиакриламидный гель, представляющий продукт сополимеризации акриламида CH2=CH-CO-NH2 и сшивающего агента- N.N1-метиленбисакриламида-СН2=СН-СО->т-СН2^Н-СО-СН=СН2 НИТИ линейного полимера акриламида , сшитые N,N' - метиленбисакрилами-дом, образуют относительно жёсткую и химически инертную пространственную сетку геля, хорошо удерживающую воду. Пористость и жёсткость геля определяется процентным содержанием в нём полимера. Рабочий диапазон рН 3-8. Гель можно автоклавировать, он выдерживает контакт с различными органическими кислотами, детергентами. В результате исследований разработана технология получения магнитных сорбентов на основе полиакриламидно-го геля методом блочной и эмульсионной полимеризации геля. Иммобилизацию иммуноглобулинов осуществляли путём механического включения в структурную решётку геля или на его поверхности после предварительной активации глутаровым альдегидом. Блочная полимеризация проще, но при этом терялась часть включаемого материала, поэтому мы использовали второй тип полимеризации.
Таким образом, нами отработана технология получения полиакриламидных магносорбентов, позволяющая получать микрогранулы с равномерным включением магнитного материала размером 20-100 мкм, с ярко выраженными магнитными свойствами. При исследовании микроструктуры поверхности полиак-риламидных МС они имели однородную сплошную непористую структуру с небольшими по размерам выступами неправильной формы (рисунок 1 А).
Эффективность применения иммуноанализа зависит от чистоты и специфической активности биологических лигандов, иммобилизованных на инертных синтетических носителях. В связи с этим нами проведена оценка эффективности различных способов выделения IgG из иммунных сывороток и мышиных ИАЖ. Для выделения IgG из иммунной гепатитной сыворотки и мышиных ИАЖ использовали три метода с целью выбора оптимального способа: осаждение сульфатом аммония (Фримель Г., 1987), фракционирование полиэтиленгликолем - 6000 (Poison A. et al., 1964) и каприловой кислотой (Steibuch G., Andran R., 1969).
Сравнительный анализ этих методов показал, что общим их преимуществом является возможность выделения IgG при комнатной температуре, так как при этом не происходит денатурация белка. Важным преимуществом сульфат-
ного метода является возможность хранения в его растворе в течение нескольких лет без потери специфической активности.
Рисунок 1. Электронная микроскопия МС. Увеличение х 10 000
Обозначения А — полиакриламидный, Б — композиционный (на основе аэросипа), В — композиционный (на основе алюмосиликата)
Недостатками, на наш взгляд, являются использование высокотоксичной каприловой кислоты, а также длительное удаление ПЭГ из белковой фракции из-за его полимерной природы.
Для конструирования магноиммуносорбентов необходимы высокоактивные и специфичные иммунные сыворотки. В качестве основного биологического компонента для конструирования гепатитного магнитного иммуно-сорбента использовали иммунную сыворотку больного гепатитом А человека, полученную в стадии реконвалесценции. Лигандом служили ^в, выделенные методом двойного осаждения сернокислым аммонием (Фримель Г., 1987). Иммобилизацию иммуноглобулинов на магнитные полиакриламидные гранулы проводили путем их ковалентного присоединения после активации сорбента глутаровым альдегидом по методу В.И.Ефременко и соавт. (1989). Принципиальная технологическая схема получения микрогранулированных полиакрила-мидных магноиммуносорбентов представлена на рисунке 2.
Иммунопероксидазные конъюгаты получали по методу Р.К.№капе, АКэтат (1974) в нашей модификации, которая заключалась в том, что для
Рисунок 2. Принципиальная технологическая схема приготовления полиакриламидного аффинного магноиммуносорбента
конъюгации специфических ^О с переокисленной пероксидазой хрена их добавляли в концентрации по белку 5 мг/мл (вместо 10 мг/мл). После стабилизации препарата боргидридом натрия и последующего диализа против 0,1М раствора ФСБ рН 7,2-7,4 не использовали хроматографическую колонку, что сокращало длительность получения конъюгата и не давало неспецифического связывания при проведении ИФА, рабочая активность конъюгата увеличивалась на 2-3 порядка и составляла 1:400 — 1:1600. Иммуноферментный анализ с применением специальных технических устройств и методических приемов для работы с МИС длится 30-60 мин.
Полевые испытания тест-системы проведены в ряде городов Ставропольского края, в результате которых установлено, что сочетанным методом МИС + ИФА ВГА выявлялся в канализационных стоках инфекционных больниц, в сточных водах и некоторых других объектах. Высокая эффективность МИС была показана при обследовании контактных лиц во время вспышки гепатита А в детском коллективе. Обнаружение антигена ВГА сочетанным методом МИС + ИФА у детей в инкубационном периоде болезни позволило локализовать очаг инфекции и своевременно провести обследование и лечение заболевших.
На биотехнологию изготовления магносорбентной полиакриламидной тест-системы для выявления вируса гепатита А получен патент РФ № 2065164 от 10.08.1996 г. «Диагностическая тест-система для выявления вируса гепатита А».
Разработка биотехнологии конструирования органокремнеземных композиционных магноиммуносорбентов
Опыт экспериментально-производственного освоения магноиммуносор-бентных.диагностикумов на основе полиакриламида показал, что недостатками технологии являются длительность и многостадийность их получения, использование импортных дорогостоящих и высокотоксичных реактивов.
В связи с этим возникла необходимость создания дешевых, прочных и технологичных матриц, легко поддающихся модифицированию, обладающих минимальной неспецифической сорбцией, разработка методов надежной иммобилизации лиганда с магносорбентами, упрощение способа получения маг-ноиммуносорбента.
Композиционные органокремнеземные магносорбенты для конструирования магнитоуправляемых твердофазных иммунохимических тест-систем получали по способу, разработанному И.В.Жарниковой и соавт. (Жарникова И.В., Брыкалов А.В., Тюменцева И.С., 1994; Жарникова И.В., 1995). В качест-
ве структурных единиц, формирующих остов кремнезема, использовали пи-рогенную форму диоксида кремния (аэросил А-380) и магнитный порошок Модифицирование матрицы проводили декстраном с последующим ковалентным связыванием белкового лиганда методом окисления. На основе проведенных исследований определены оптимальные условия получения кремнеземных магносорбентов на основе аэросила (КМС): соотношение компонентов синтеза 1:2:5, соответственно декстран, аэросил А-380; время гелеобразования 1 час, значение рН гелеобразования 7,0.
Топография поверхности декстранокремнеземного композиционного магносорбента представлена сростками неправильной формы. В образце сочетаются обширные участки сплошной непористой массы с губчатой структурой (рисунок 1 Б).
Для химического активирования КМС разработан метод модифицирования твердофазного носителя бензохиноном, в результате которого на поверхности сорбента образуются олигогидрохинонные группы, преимущества которых перед альдегидными проявляются в способности ковалентного связывания с остатками различных аминокислот белкового лиганда, что повышает специфическую емкость иммуносорбента (Брыкалов А.В., Жарникова И.В., 1998). Лигандом служили ^в, выделенные из иммунных сывороток методом осаждения белка в растворе ПЭГ - 6000 по АРокоп й а1. (1964). Принципиальная технологическая схема приготовления органокремнеземного композиционного магноиммуносорбента представлена на рисунке 3.
Для проведения ИФА, кроме методики постановки реакции в полистироловых планшетах, нами апробирована и отработана методика проведения соче-танного метода МИС+ ИФА во флаконах (типа пенициллиновых). Продолжительность анализа при этом составляла 45-50 мин.
Диагностическая гепатитная магносорбентная тест-система на основе композиционных МИС была применена специализированными противоэпидемическими бригадами СтавНИПЧИ в Чеченской Республике (1995 и 2000 гг.), во время сезонных вспышек гепатита А в Ставропольском крае
А) Синтез композиционного магносорбента
Получение гидрогеля
Рисунок 3. Принципиальная технологическая схема приготовлении органокремнеземиого композиционного магноиммуносорбента
(1993-1996 гг.), а также во время землетрясения в 2003 г. в Республике Алтай и при крупной эпидемической вспышке гепатита А в ст. Зеленчукской Карачаево-Черкесской Республики в 2004 г.
Применение сочетанного метода МИС + ИФА во время вспышки гепатита А в 2004 г. в ст. Зеленчукской КЧР позволило выявить источник инфекции, своевременно его локализовать, провести эпидемиологическое расследование и определить водный характер вспышки вирусного гепатита А, на основании которых были оперативно приняты оптимальные решения и реализованы конкретные противоэпидемические мероприятия. Использование магнитоуправ-ляемых твердофазных иммунохимических тест-систем позволило повысить вы-являемость инфекционного агента из клинического и полевого материала на 17 и 15 % соответственно (рисунок 4).
Рисунок 4. Результаты сравнительного исследования биологического и полевого материала с целью детекции возбудителя гепатита А
Таким образом, нами впервые разработаны биотехнология изготовления гепатитного магноиммуносорбентного диагностикума на основе композиционного декстранокремнеземного носителя и сочетанный метод детекции
возбудителя ВГА из объектов внешней среды и в материале от больных людей (МИС+ИФА). Использование нетоксичных отечественных компонентов, их дешевизна, простота технологии изготовления, механическая и химическая прочность иммуносорбентов, возможность лиофилизации, значительное увеличение чувствительности метода детекции свидетельствуют о несомненном преимуществе композиционных МИС перед полиакриламидными, что подтверждено многочисленными лабораторными и полевыми испытаниями диагностикумов (Акты о внедрении от 20.12.91 г. Ставропольской инфекционной больницы; от 12.10.93 г. ЦГСЭН в Ставропольском крае; от 10.05.95 г. РЦГСЭН Чеченской Республики, от 17.05.2004 г. ФГУ ЦГСЭН в Карачаево-Черкесской Республике).
Изучение диагностической ценности ИФА и ПЦР при лабораторных исследованиях на Крымскую геморрагическую лихорадку клинического и полевого материала, разработка методологии их комплексного применения
Нами впервые применены на практике современные методы лабораторной диагностики КГЛ и детекции её возбудителя из полевого материала, собранного в природном очаге инфекции: иммуноферментный анализ и полиме-разная цепная реакция с обратной транскрипцией.
Обнаружение специфических IgM и IgG проводили методом ИФА с помощью экспериментальных диагностических иммуноферментных тест-систем для индикации антител классов М и G к возбудителю КГЛ, изготовленных в НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского.
Выявление РНК вируса КГЛ проводили методом ОТ-ПЦР, используя коммерческие диагностические тест-системы: «АмплиСенс-100 Крым-Конго-281» (производства ЦНИИ эпидемиологии, г.Москва) и «ВектоКрым-КГЛ-РНК-ампли-100» (производства ЗАО «Вектор-Бест», г.Новосибирск).
Проведено изучение диагностической ценности ОТ-ПЦР и ИФА при диагностике КГЛ и разработан метод их комплексного применения. Показано, что в первые три дня болезни, когда вирус циркулирует в крови, можно обнаружить РНК вируса КГЛ, но выявить специфические IgM и IgG в этот период не удается. С увеличением времени от начала заболевания в крови вырабатываются антитела, и с четвертого дня болезни можно использовать ИФА для диагностики КГЛ с целью обнаружения ранних IgM, а с пятого дня болезни -IgG. При высокой вирусной нагрузке анти-КГЛ появляются в более поздние сроки. Одновременное использование ОТ-ПЦР и ИФА позволяет получить более достоверные данные. На рисунке 5 представлены результаты выявления
РНК вируса КГЛ в сыворотках крови методом ОТ-ПЦР. Результаты комплексного исследования сывороток крови больных КГЛ методами ИФА и ОТ-ПЦР представлены в таблице 1.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 К- К+(ДНК)
Рисунок 5. Выявление РНК вируса КГЛ в сыворотках крови методом ОТ-ПЦР
Обозначения: К- контроль отрицательный;
К+ - контроль положительный;
1 - Ь.ё.100 — маркер молекулярной массы;
2,5,7,8,12- положительные пробы (РНК вируса КГЛ);
3,4,6,9,10,11,13 - отрицательные пробы
Исследованы иксодовые клещи, собранные в 27 административных районах Ставропольского края, а также на территориях Республик Дагестан, Калмыкия, Кабардино-Балкарской, Карачаево-Черкесской, Северная Осетия-Алания и Ингушетия, расположенных в полупустынной, степной, лесостепной и предгорной ландшафтно-географических зонах*.
Методом ИФА исследовано 48144 особи клещей, объединенных в 3067 пулов. Антиген вируса КГЛ обнаружен в 150 пробах суспензий клещей Н. таг-ginatum, и у них подтверждена возможность трансовариальной и трансфазовой передачи возбудителя. Положительными были также пробы клещей
* Полевой материал (клещи, пробы крови от животных и птиц, пробы органов животных) собран сотрудниками СтавНИПЧИ: завлабораторией медзоологии, кбн. Григорьевым МП., сне, к.м.н. Евченко Емельяновой И Н, Шапошниковой Л.И, Гудиевой А Ю. иГрубаА В.
Таблица 1. Результаты комплексного исследования сывороток крови больных КГЛ
Метод исследования
День болезни Количество ПЦР ИФА
исследован- кол-во полож. кол-во отр. IgM IgG
ных проб кол-во полож. кол-во отр. кол-во полож. кол-во отр.
1-й 4 4 0 0 4 0 4
2-й 9 9 0 0 9 0 9
3-й 6 5 1 0 6 0 6
4-й 4 4 0 2 2 0 4
5-й 12 11 1 8 4 3 9
6-й 5 5 0 5 0 4 1
7-й 2 2 0 1 1 0 2
8-й 2 2 0 2 0 L 2 0
9-й 1 1 0 1 0 0 1
10-й 1 1 0 1 0 1 0
H.anatolicum (1), H.scupense (5), D.marginatus (8), /. ricinus(1), Rh.rossicus (1), В. annulatus (3) и Haem. otophila (1). Установлена циркуляция вируса КГЛ в 17 административных районах Ставропольского края, Яшкульском и Черно-земельском районах Республики Калмыкия, Ногайском и Кизлярском районах Республики Дагестан, Прикубанском районе КЧР и Малгобекском районе Республики Ингушетии.
При исследовании сывороток крови крупного рогатого скота, доставленных из природного очага КГЛ Ставропольского края, на наличие антител показано, что у 18,8 % обследованных коров выявлены вирусспецифические IgG к возбудителю КГЛ. Все положительные пробы получены от коров, выпасающихся на общественных пастбищах.
Иммуноферментный анализ сывороток крови ежей позволил выявить IgG к возбудителю КГЛ в 10 пробах (19,2 %), доставленных из Нефтекумского района. Обнаружены специфические антитела и в сыворотках крови мелких млекопитающих: в двух пробах от землеройки-белозубки (14,3 %) (Андропов-ский район) и в одной пробе от полевой мыши (Граческий район). При исследовании сывороток крови птиц и мелкого рогатого скота положительных проб не выявлено.
Таким образом, результаты наших исследований свидетельствуют об интенсивности эпизоотического процесса в очаге КГЛ, о расширении видового
состава иксодовых клещей - переносчиков вируса КГЛ и о формировании стойкого природного очага инфекции на территориях Ставропольского края и некоторых других регионов Юга России.
На основании распоряжения Первого заместителя Министра здравоохранения РФ, Главного санитарного врача РФ ПГ.Онищенко, впервые создан пополняемый банк лиофилизированных сывороток крови от больных и подозрительных на заболевание КГЛ, содержащий 3809 образцов.
С целью сохранения исходных свойств биологического материала отработан метод «умеренного» режима лиофилизации сывороток крови. Эта коллекция позволит проводить дальнейшие углублённые испытания вновь создаваемых МИБП для диагностики КГЛ.
Разработка биотехнологии получения тест-системы магноиммуно-
сорбентной для экспресс-диагностики Крымской геморрагической лихорадки в ИФА \
В процессе исследования полевого материала, полученного из природных очагов с целью выявления антигена вируса КГЛ методом ИФА с помощью экспериментальных и коммерческих тест-систем, нами неоднократно были отмечены сомнительные результаты реакции, т.е. когда оптическая плотность (ОП) исследуемого образца была близка к удвоенному ОП отрицательного контроля. Учесть такой результат, как положительный, можно было только визуально (по интенсивности окрашивания лунок), что является субъективной оценкой. Согласно же прилагаемым инструкциям к тест-системам, результат реакции учитывается как положительный в том случае, если ОП исследуемого образца превышает ОП отрицательного контроля в 2 и более раз.
В связи с этим нами была поставлена задача разработать высокочувствительную тест-систему на основе МИС, способных селективно фиксировать на своей поверхности исследуемый патоген, проводить эффективную отмывку проб от загрязнений, мешающих проведению идентификационных реакций.
Поскольку аэросил А-380, ранее используемый при изготовлении КМИС, производится в Украине, мы провели подбор отечественных компонентов с аналогичными свойствами. Анализ имеющихся литературных данных показал, что элиминирование кремнезёма существенно увеличивает адсорбционную активность в отношении белков (Хохлова Т.Д., Гаркавенко Л.Г., Никитин Ю.С., 1991), а поверхностно-активные вещества оказывают стабилизирующее действие (Лунина М.А. с соавт., 1980), образуя на поверхности частиц мономолекулярный адсорбционный слой, препятствующий сближению и агрегированию
частиц (Матусевич Н.П., Рахуба В.К., 1980). Эти данные учтены нами при разработке биотехнологии органокремнезёмного магносорбента на основе алюмосиликата. Для оптимизации структурных характеристик МС проведены исследования по варьированию состава компонентов синтеза (декстран, Ре203, алюмосиликат), а также изучение влияния времени гелеобразования и рН среды на величину удельной поверхности сорбентов, объем и размер пор. Установлено, что увеличение количества магнитного порошка не приводит к резкому изменению структурных характеристик, удельной поверхности, сорб-ционному объему пор. Увеличение продолжительности времени гелеобразова-ния при синтезе МС повышает значение удельной поверхности и уменьшает размер пор. Наилучшим значением времени гелеобразования при синтезе сорбентов является 1-2 часа. Проведенные исследования позволили определить оптимальные условия получения алюмосиликатных МС: соотношение компонентов синтеза 2:2:1, соответственно Ре203, декстран, алюмосиликат; время гелеобразования 2 ч, значение рН гелеобразования 7,0. При электронной микроскопии алюмосиликатного магносорбента установлена губчатая структура (рисунок 1В).
Исследование удельной поверхности по методу А.А.Клячко-Гурвича (1961) показало, что органокремнеземный сорбент, содержащий в своём составе Ре203> имеет удельную поверхность 18 м2/г, объем пор -1,19 см3/г, радиус пор - 132,2 нм. Для химического активирования МС разработан метод модифицирования твердофазных носителей действием поверхностно- активного вещества (ПАВ) - вторичного алкилсульфата натрия. При активировании ПАВ прочность связи антител с магносорбентом повышается за счёт создания дополнительных связей, которые образуются между активными группами белка, полиглюкина и вторичного алкилсульфата натрия. При иммобилизации специфических ^О на сорбент исследовали ряд параметров: концентрацию белка для иммобилизации; время и температуру инкубации; влияние рН иммуноглобулинов на иммобилизацию. Изучена кинетика процесса иммобилизации и оценка связывания ^О с сорбентом. Установлено, что для полного насыщения МС антителами достаточно двух часов.
Концентрация белка иммуноглобулинов 2,5 мг/мл являлась оптимальной для полного насыщения антителами магносорбента в объеме 0,4 мл 10% взве-
си. Установлено, что изменение рН раствора иммуноглобулинов от 5 до 9,5 не оказывало влияния на специфическую активность и чувствительность МИС, а максимальная адсорбционная емкость сорбента наблюдалась при температуре (22 ±4) °С и (37±1) °С.
Биологическим сырьем при конструировании диагностических препаратов для детекции вируса КГЛ служили мышиные ПАЖ*, обработанные р-пропиолактоном в конечной концентрации 0,3 % (фирмы «Serva»). Титр специфических антител в РСК составил 1:640.
IgG из мышиных ИАЖ для конструирования МИС выделяли фракционированием ПЭГ-6000 по A.Polson et al. (1964), а для получения иммуноперокси-дазных конъюгатов - двойным осаждением сернокислым аммонием по Г.Фримелю (1987). Рабочий титр разработанных нами иммунопероксидазных конъюгатов для выявления вируса КГЛ составил 1:400-1:1600. Чувствительность конъюгатов по водорастворимым антигенам - 50-100 нг/мл. Время контакта комплекса антиген-антитело с иммуноферментным конъюгатом сокращено до 20 мин, при этом результат идентичен одночасовой инкубации при постановке «сэндвич»- варианта ИФА в полистироловых планшетах. Принципиальная технологическая схема приготовления органокремнеземного композиционного магноиммуносорбента представлена на рисунке 5. Аэросил А-380 заменен алюмосиликатом, активацию поверхности которого проводили вторичным алкилсульфатом натрия.
Методы получения алюмосиликатного магноиммуносорбента просты и технологичны, исключают применение токсичных веществ. Полученный маг-ноиммуносорбент характеризуется стандартностью структурных характеристик, механической и химической устойчивостью, не подвержен набуханию, равновесие между IgG и сорбентом наступает в течение 2 часов. Использование отечественных экологически чистых компонентов, их дешевизна,
*Мышиные ИАЖлюбезно предоставлены ведущим научным сотрудником Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор», к.м.н. О.И.Вышемирским.
простота технологии изготовления свидетельствуют о достоинствах алюмоси-ликатных МИС.
Полевые испытания алюмосиликатных КМИС к вирусу КГЛ были проведены на основе коллекции суспензий клещей, созданной в вирусологической лаборатории СтавНИПЧИ и хранящейся при минус 70 °С.
В результате полевых испытаний установлено, что за счет селективного концентрирования специфического антигена на поверхности КМИС те пробы клещей, которые показывали сомнительный результат в ИФА в полистироловых планшетах, в разработанном нами сочетанном методе МИС+ИФА были положительными. Наряду с этим выявлены положительные пробы среди тех пулов, которые давали отрицательный результат при исследовании в ИФА с помощью экспериментальных диагностических тест-систем. Результаты сравнительного анализа исследования суспензий клещей методом ИФА и МИС+ИФА представлены на рисунке 8.
Исследование свежеприготовленных суспензий клещей, собранных в Республике Ингушетия, где в октябре 2004 г. были зарегистрированы и лабо-раторно подтверждены случаи заболевания людей Крымской геморрагической лихорадкой, еще раз показало целесообразность применения МИС. При исследовании суспензий клещей методом ИФА положительных проб выявлено не было, после чего мы провели селективное концентрирование суспензий на магнитных иммуносорбентах с последующей постановкой ИФА в пенициллино-вых флаконах. В результате антиген вируса КГЛ обнаружен в трех пробах клещей В. annulatus и одной пробе Нает. otophila, что составило 20% от общего количества исследованных проб. Методом ОТ-ПЦР в этих суспензиях обнаружена РНК вируса КГЛ.
На территории ЮФО в клещах этих видов антиген вируса КГЛ не выявлялся. Согласно литературным данным клещи В. annulatus участвуют в поддержании циркуляции вируса КГЛ в Болгарии, Армении, Узбекистане, Казахстане, Киргизии (Аристова В.А с соавт., 2001). Данные, подтверждающие участие клещей Нает. otophila в циркуляции вируса КГЛ, нам неизвестны. Таким образом, нами впервые показано, что иксодовые клещи В. annulatus и Нает. otophila могут играть определенную роль в поддержании природного очага КГЛ на территории Юга России.
Эффективность применения магноиммуносорбентов показана также при исследовании проб крови, полученных от коров в этом очаге КГЛ. Поскольку пробы крови были сильно гемолизированы и непригодны для исследования в
ИФА, мы осуществили концентрирование проб на МИС с многократным отмыванием от форменных элементов и других примесей, мешающих проведению анализа. Иммуноферментный анализ этих проб позволил выявить антиген вируса КГЛ в трех пробах крови, что составило 42,8 %. При исследовании проб крови коров методом ОТ-ПЦР РНК вируса КГЛ также обнаружена в трех пробах.
При исследовании проб крови от двух трупов людей, умерших предположительно от Крымской геморрагической лихорадки, в одной из проб методом ИФА установлено наличие антигена вируса КГЛ (ОП пробы составила 0,528 при ОПкр(ГГ - 0,221). Затем проведено селективное концентрирование проб крови на МИС и постановка ИФА. В результате подтверждено наличие антигена в первой пробе: её ОП увеличилась в 2,6 раза (1,347), а также выявлен антиген вируса КГЛ во второй пробе (ОП - 0,596). Применение магнитоуправляе-мых твердофазных иммунохимических тест-систем позволило повысить выяв-ляемость вируса КГЛ в полевом и клиническом материале от 4 до 50 % (Акт о внедрении в практику результатов НИР Министерства здравоохранения Ставропольского края от 24 мая 2004 г.).
Таким образом, нами впервые разработана тест-система диагностическая магноиммуносорбентная для экспресс-диагностики Крымской геморрагической лихорадки и детекции её возбудителя, показаны её преимущества при исследовании клинического и полевого материала из природных очагов инфекции, определены оптимальные параметры постановки ИФА, чувствительность и специфичность метода, проведено сравнение модифицированного метода МИС+ИФА с методом постановки реакции в полистироловых планшетах.
Разработка сочетанного метода детекции вирусов путем селективного концентрирования на магноиммуносорбенте с последующей постановкой полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР)
В настоящее время одним из перспективных методов экспресс-анализа на наличие вируса в исследуемом объекте является полимеразная цепная реакция (Блохина Н.П., 2003; Карань Л.С. с соавт., 2003; Платонов А.Е. с соавт., 2003; Ющук Н.Д. с соавт., 2003; Кагап Ь.Б. ег а1., 2004).
При использовании в качестве проб клинического материала особых трудностей в подготовке образцов для постановки ПЦР не возникает. Более сложной задачей представляется обработка проб из объектов внешней среды (пробы из очистных сооружений и канализационных стоков, смывы с поверх-
ностей, почва, клещи, комары и т.д.), так как в этом случае необходимо использовать особые методические приемы, позволяющие избавиться от посторонних примесей и максимально сконцентрировать искомую РНК, кроме того, всевозможные примеси, находящиеся в объектах внешней среды, способны значительно снижать чувствительность данного метода ( Корсуков В.Н. с соавт., 1997; Тихвинский М.С. с соавт., 1997; Филиппов Н.И., 1998).
Для устранения этих негативных явлений мы объединили два метода: высокоэффективное избирательное концентрирование инфекционного агента на магноиммуносорбенте с последующей постановкой полимеразной цепной реакции, проведя ряд приемов для адаптации этих методов друг к другу.
В комплексе мер борьбы с ВГА одним из важнейших мероприятий является активное выявление больных в ранние сроки заболевания. Это обусловлено эпидемиологической опасностью больных в инкубационном и преджел-тушном периодах инфекции (Хохлов Д.Т. с соавт., 1985).
Решение этой задачи было достигнуто нами с помощью алюмосиликат-ных МИС. В экспресс-иммуноанализах МИС выступают в качестве твердой фазы, значительно увеличивая специфичность и чувствительность анализа за счет селективной концентрации, которую осуществляли следующим образом: в пенициллиновые флаконы вносили по 100 мкл 10 % взвеси гепатитных МИС и добавляли 200 мкл фекалий. Инкубировали в термостате при температуре 37 °С в течение 30 мин. МИС трижды промывали ФСБ, придерживая постоянным магнитом флакон с сорбентом и ресуспендировали в 100 мкл ФСБ. Для исследования отбирали 100 мкл суспензии.
Пробы, полученные из объектов внешней среды с помощью магнитных ловушек, на которые было нанесено 300 мкл гепатитного магноиммуносорбен-та, отмывали и отбирали 100 мкл МИС для проведения ПЦР. Оставшиеся 200 мкл МИС использовали для проведения сочетанного экспресс-анализа МИС + ИФА.
Для проведения ПЦР-анализа нами была использована коммерческая диагностическая тест-система «АмплиСенс НАУ-430», предназначенная для вы-
явления РНК вируса гепатита А в плазме периферической крови и фекальных экстрактах методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (производства ЦНИИЭ, Москва)*.
Выделенную РНК незамедлительно подвергали обратной транскрипции, используя набор «Реверта-RlOO». Полученную кДНК использовали для амплификации. Все манипуляции проводили в соответствии с инструкциями к наборам.
Исследование проб фекалий, полученных от контактных лиц декретированных профессий (работники кафе) во время вспышки вирусного гепатита А в ст.Зеленчукской Карачаевой-Черкесской Республики в январе-марте 2004 г., показало, что применение селективного концентрирования проб на магноим-муносорбентах повышало чувствительность ПЦР-анализа и способствовало выявлению РНК ВГА в фекалиях в конце инкубационного периода болезни (рисунок 4). Спустя несколько дней после обнаружения РНК ВГА, у больной развилась манифестная форма заболевания гепатитом А.
Параллельно все исследуемые пробы подвергали ПЦР-анализу без предварительного концентрирования вируса на магноиммуносорбенте, используя ту же тест-систему. На рисунке 6 (А, Б) представлены результаты ОТ-ПЦР при выявлении РНК ВГА до и после концентрирования на МИС.
Одним из молекулярно-генетических методов ранней диагностики, на шедшим широкое применение в лабораторной практике и выявляющим РНК вируса КГЛ в период вирусемии в клинических образцах ( сыворотке крови), биоптатах (мозге, печени, селезенке, лимфатических узлах, сердце, легких), клещах, является метод ОТ-ПЦР (Львов Д.К., 2002; Яшина Л.Н. с соавт., 2002; Меркулова О.В. с соавт., 2003; Петрова И.Д. с соавт., 2003; Hang С, Papa A., 2001; Drosten С. et al., 2002).
Целью наших разработок явилось применение ПЦР-анализа при работе с полевым материалом из природных очагов КГЛ и повышение его чувствительности за счет селективного концентрирования на МИС. Для проведения
Исследования выполнялись совместно со старшим научным сотрудником СтавНИПЧИ,км н ОИЦыганковой
Б
Рисунок 6. Детекция ВГА в пробах фекалий сочетанным методом МИС+ОТ-ПЦР
Обозначения: А-до концентрирования на МИС, Б-после концентрирования; К- - контроль отрицательный; К+ - контроль положительный; 1-6— исследуемые пробы; 2-положительная проба (РНКВГА)
ПЦР-анализа использовали унифицированную диагностическую тест-систему «АмплиСенс® ККГЛ» для выявления РНК вируса Крымско-Конголезской геморрагической лихорадки методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (производства ЦНИИЭ, Москва).
Из сформированных пулов клещей готовили суспензии согласно инструкции к диагностической тест-системе. Концентрирование суспензий для последующего проведения ОТ-ПЦР осуществляли в пенициллиновых флаконах, в которые вносили 50 мкл 10 % взвеси МИС и приготовленную суспензию клещей. Инкубировали 30 мин при 37 °С. МИС трижды промывали ФСБ, придерживая постоянным магнитом флакон с сорбентом и ресуспендировали в 150 мкл 0,15 М раствора хлорида натрия. Полученную суспензию использовали для выделения РНК.
Выделение РНК из суспензии клещей осуществляли в 2 этапа с помощью комплектов реагентов «Рибо-золь - С» для первого этапа выделения РНК из клещей и «Рибо-сорб» для второго этапа. При выделении РНК из проб, сконцентрированных на МИС, использовали только один этап выделения с помощью комплекта «Рибо-сорб», что исключало применение сильнодействующих веществ (фенол, хлороформ) и показывало дополнительное преимущество со-четанного метода детекции МИС+ПЦР.
Сравнительный анализ результатов, полученных при исследовании суспензий клещей с применением селективного концентрирования проб на магно-иммуносорбентах, показал, что сочетанный метод МИС + ПЦР значительно повышает чувствительность ПЦР-анализа. На рисунке 7 представлены 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 И 12 13 14 15 16 17
Рисунок 7. Результаты выявления РНК вируса КГЛ методом ОТ-ПЦР до и после селективного концентрирования проб суспензий клещей на МИС Обозначения: 1-6 - суспензии клещей до концентрирования на МИС;
7-12 - суспензии клещей после концентрирования на МИС;
13 - ОКО ВКО (к-) - выделения; 14 - ПКО (к+) - выделения; 15 - ОКО (к-) - амплификации; 16 - кДНК (к+); 17 - ЬАЮО -маркер молекулярной массы результаты выявления РНК вируса КГЛ методом ОТ-ПЦР до и после селективного концентрирования проб суспензий клещей на МИС. Применение магнито-управляемых твердофазных иммунохимических тест-систем позволило повысить выявляемость вируса КГЛ в суспензиях клещей от 4 до 20 % (рисунок 8) .
Полевые и клинические испытания, проведенные во время вспышек КГЛ на территории Ставропольского края в 2000-2004 гг., показали высокую эффективность, чувствительность и надежность «Тест-системы диагностической магноиммуносорбентной (органокремнеземной) для экспресс-диагностики Крымской геморрагической лихорадки и детекции её возбуди-
1071 179
Количество анализов
Рисунок 8. Сравнительное исследование суспензий клещей с целью детекции вируса КГЛ
теля (ИФА и ПЦР)» и возможность её успешного применения при мониторинге природных очагов на наличие вируса КГЛ (Акт о внедрении в практику результатов НИР Министерства здравоохранения Ставропольского края от 24 мая 2004 г.).
Полученные нами данные позволили разработать алгоритм лабораторного исследования на Крымскую геморрагическую лихорадку, представленный.на рисунке 9.
Таким образом, в итоге проведённых исследований разработаны основные методологические подходы к изучению и производству иммунобиологических препаратов для диагностики особо опасных инфекционных заболеваний вирусной этиологии и детекции их возбудителей, что подтверждено документами различных уровней внедрения.
ВЫВОДЫ
1. Разработана биотехнология изготовления аффинных сорбентов с магнитными свойствами на основе высокодисперсных органокремнеземов с целенаправленно модифицированной поверхностью, способствующей эффективному образованию иммунохимического комплекса антиген-антитело, обладающих стандартностью структурных характеристик, механической прочностью и устойчивостью в агрессивных средах, которая впервые позволила при-
менить их для конструирования МИБП нового поколения, пополняющих арсенал экспрессных лабораторных средств для выявления заболеваний и патогенов вирусной природы.
2. Впервые разработаны методологические основы конструирования твердофазных магнитоуправляемых иммунохимических тест-систем для экспресс-диагностики вирусного гепатита А, Крымской геморрагической лихорадки и детекции их возбудителей, имеющих высокую степень разрешения.
3. Проведена оценка эффективности различных способов выделения иммуноглобулинов класса G из антивирусных иммунных сывороток и асцитиче-ских жидкостей и определены оптимальные параметры биотехнологии производства иммуноферментных тест-систем (эффективный способ выделения иммуноглобулинов методом двойного осаждения сернокислым аммонием, значение рН реакционной смеси- 7,2-7,4, концентрация специфического белка иммуноглобулинов — 5 мг/мл, температура конъюгации - (22±4) °С, 2-х часовой контакт IgG с ферментом), позволяющие получать диагностикумы для детекции возбудителей вирусного гепатита А и Крымской геморрагической лихорадки, отвечающие ОМБТ, предъявляемым к индикационным препаратам.
4. Впервые проведено изучение диагностической ценности иммуно-ферментного анализа и полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией при диагностике Крымской геморрагической лихорадки и разработана методология комплексного их использования. Установлено, что на ранних стадиях заболевания для диагностики КГЛ наиболее целесообразно использовать ОТ-ПЦР для детекции РНК и ИФА для выявления ранних IgM. Для диагностики в более поздние сроки заболевания эффективен ИФА, направленный на выявление специфических IgG, в это время ПЦР, как правило, отрицательна. Комплексное применение ОТ-ПЦР и ИФА позволяет проводить более качественную лабораторную диагностику КГЛ.
5. Впервые разработаны методические приёмы по сочетанному применению селективного концентрирования вирусов и их антигенов на магноим-муносорбентах с последующим проведением экспрессных методов (ИФА и ПЦР), позволяющие исследовать материал от больных людей или животных, пробы из внешней среды неограниченного объема с высокой степенью загрязнения, с низкой концентрацией вирионов и чувствительностью, в несколько сот раз превышающей традиционные, что значительно повышает достоверНОСТЬ как положительных, так И птрипат»'"-'"-™' ррчупьтятрв исслелпяяний При
6. Диагностическая ценность и преимущество разработанных тест-систем подтверждены при исследовании на вирусный гепатит А и Крымскую геморрагическую лихорадку разнообразного экспериментального, клинического, полевого материала. Их применение позволило повысить выявляемость заболеваний и определение инфекционного агента от 3 до 50% при эпидемических вспышках и мониторинге объектов внешней среды.
7. На основе материала от больных и подозрительных на заболевание КГЛ, поступившего в 2000-2004 гг. из природных очагов Юга России, впервые создан банк лиофилизированных сывороток крови, систематизированных по различным критериям. Эта коллекция дает возможность проводить как углублённые клинические испытания новых МИБП для диагностики КГЛ, так и изучать некоторые теоретические аспекты современной вирусологии.
8. Применение магнитоуправляемых твердофазных иммунохимиче-ских тест-систем впервые позволило обнаружить вирус КГЛ в пробах иксодо-вых клещей ВооркИж аиииШш и ИагтаркузаНз otophila, собранных на территории Республики Ингушетия, что свидетельствует об интенсивности эпизоотического процесса в очаге КГЛ, расширении видового состава клещей -источника и резервуара вируса КГЛ, формировании стойкого природного очага КГЛ на территории Ставропольского края, некоторых других регионов Юга России и позволяет более обоснованно прогнозировать развитие эпидемиологической обстановки по этой инфекции.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. При конструировании магноиммуносорбентов для детекции возбудителей вирусных инфекционных заболеваний в качестве матрицы рекомендуем использовать алюмосиликат. Для прочной иммобилизации лиганда проводить активирование поверхности матрицы вторичным алкилсульфатом натрия.
2. При получении иммунопероксидазных конъюгатов рекомендуем использовать иммуноглобулины класса О, выделенные из иммунных сывороток реконвалесцентов или мышиных иммунных асцитических жидкостей методом двойного осаждения при 40-45% насыщении сульфата аммония, что существенно увеличивает выход ^О и позволяет хранить их в растворе соли без потери активности в течение нескольких лет.
3. Для повышения процента выявляемо возбудителей вирусного гепатита А и Крымской геморрагической лихорадки рекомендуем проводить селективное концентрирование исследуемого материала на магноиммуносор-бенте с последующей, постановкой ИФА и ОТ-ПЦР.
4. Для диагностики Крымской геморрагической лихорадки в остром периоде болезни (период вирусемии) рекомендуем применять ОТ-ПЦР для выявления специфической РНК вируса КГЛ (1-7-й дни). С четвертого дня болезни - использовать ИФА для обнаружения ранних антител класса М; с пятого дня -ИФА для выявления IgG в парных сыворотках крови. Одновременное использование ОТ-ПЦР и ИФА позволяет получать более достоверные результаты.
ЛИТЕРАТУРА
1. Василенко Н.Ф., Исаев В.П, Акопян А.А., Ефременко В.И., Лопаткин О.Н., Кронгауз И.В. Использование твердофазного иммунофермент-ного метода для определения титра антител в сыворотках у людей, больных вирусным гепатитом А // Современные аспекты профилактики зоонозных инфекций: Тез.докл. науч. конф., Ставрополь, 1991.-С.205-206.
2. Василенко Н.Ф., Ефременко В.И., Гнутов И.Н., Тюменцева И.С., Заревина Л.И., Жарникова И.В. Выявление вируса гепатита А в объектах внешней среды // Современные аспекты природной очаговости, эпидемиологии и профилактики особо опасных инфекционных заболеваний: Тез. докд. науч. конф. (Омск, окт., 1993).- Ставрополь, 1993. - С.24-26.
3. Василенко Н.Ф., Ефременко В.И., Гнутов И.Н., Тюменцева И.С., Заревина Л.И., Жарникова И.В. Эпидемиологический мониторинг вируса гепатита А с помощью магнитных сорбентов // Состояние и перспективы разработки препаратов для диагностики вирусных гепатитов и инфекций, управляемых специфическими средствами профилактики: Материалы докл. Всесоюз. науч.-практ. конф. - Пермь, 1993 — С.32.
4. Василенко Н.Ф., Ефременко В.И., Гнутов И.Н., Тюменцева И.С., Диагностическая тест-система для выявления вируса гепатита А //Ставрополь, 1994. - 10 с. - Деп. в ВИНИТИ 15.07.94, №1799^94.
5. Василенко Н.Ф., Ефременко А.И.,Черноусова Л.Д., Безроднова СМ. Новые возможности клинико-иммунологической диагностики вирусного гепатита А // Актуальные вопросы профилактики чумы и других инфекционных заболеваний: Материалы межгос. науч.-практ. конф., посвящ. 100-летию открытия возбудителя чумы. - Ставрополь, 1994 - С.220-221.
6. Василенко Н.Ф., Ефременко А.И., Черноусова Л.Д., Безроднова СМ. Новые возможности клинико-иммунологической диагностики вирусного гепатита А //Ставрополь, 1995. - 7 с. - Деп. в ВИНИТИ 25.01.95, № 221-В95.
7. Василенко Н.Ф., Ефременко ВИ., Гарбуз М.А., Безроднова СМ., Рогова С.Ш., Голембовский В.А. Перспективы использования иммунофермент-ной тест-системы для раннего выявления возбудителя вирусного гепатита А // Актуальные вопросы профилактики особо опасных и др. инфекционных заболеваний: Материалы науч.- практ. конф., посвящ. 60-летию противочум. службы Кавказа. - Ставрополь, 1995. - С.220-221.
8. Василенко Н.Ф., Ефременко В.И., Гнутов Н.И.Тест-система диагностическая для выявления вируса гепатита А // Патент РФ на изобретение № 2065164; Бюл. №22 от 10.08.96.
9. Афанасьев Е.Н., Василенко Н.Ф. Тюменцева И.С., Ефременко В.И., Жарникова И.В. Опыт использования диагностической магносорбентной тест-системы для выявления вируса гепатита А иммуноферментным анализом //Эпидемиологические клинико-иммунологические аспекты профилактики важнейших инфекционных заболеваний: Материалы конф. - Астрахань, 1996. -С.108.
10. Безроднова СМ., Зубков Ю.П, Гарбуз МА, Шапорюк СМ., Василенко Н.Ф., Игнатьев Е.И. Выявление вирусного гепатита А в очаге инфекции // Сб. науч. работ 4-ой итоговой науч.конф. молодых ученых и студентов. -Ставрополь, 1996. - С.38-39.
11. Жарникова И.В., Тюменцева И.С, Ефременко В.И., Василенко Н.Ф. Разработка магноиммуносорбентов для экспресс-диагностики возбудителей ООИ путем различных методов иммобилизации // Эпидемиологические, кли-нико-иммунологические аспекты профилактики важнейших инфекционных заболеваний: Материалы конф. - Астрахань, 1996. - С.115-116.
12. Василенко Н.Ф., Ефременко В.И., Захаренков А.В. Магнитные им-муносорбенты в эпиднадзоре за гепатитом А // Материалы VII съезда Все-росс.общ-ва эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. -М., 1997. —Т.1. — С106.
13. Василенко Н.Ф., Тюменцева И.С, Ефременко В.И., Кальной СМ. Биотехнология получения тест-системы для диагностики вирусного гепатита А // Материалы науч.- практ.конф., посвящ. 100-летию образования противочумной службы России (16-18 сент. 1997). - Саратов,1997. - Т.2. - С.249.
14. Ефременко В.И., Тюменцева И.С, Жарникова И.В., Афанасьев Е.Н., Василенко Н.Ф., Бинатова В.В., Сун Чжичжоу. К вопросу о совершенст-
вовании лабораторной диагностики особо опасных инфекций //Проблемы санитарно-эпидемиологической охраны территории стран Содружества Независимых Государств: Тез. докл. Междунар. науч.-практ. конф., 15-18 сент. 1998 г. -Саратов, 1998.-С.137-139.
15. Василенко Н.Ф., Афанасьев Е.Н., Тюменцева И.С., Ефременко В.И., Вышемирский О.И., Марков В.И., Евченко Ю.М., Бейер А.П. Лабораторная диагностика вспышки Крымской геморрагической лихорадки на юге России //Журн. микробиол. - 2001. - № 6 (приложение). - С.95-97.
16. Василенко Н.Ф., Афанасьев Е.Н., Тюменцева И.С., Ефременко В.И., Вышемирский О.И., Евченко Ю.М., Бейер А.П. Опыт применения иммунофер-ментного анализа для диагностики Крымской геморрагической лихорадки //Акутальные аспекты природно-очаговых болезней: Материалы межрегион, науч.-практ. конф. 16-17 окт. 2002 г., посвящ. 80-летию Омского НИИПИ. -Омск, 2001.- С. 77-78.
17. Василенко Н.Ф., Ефременко В.И., Тюменцева И.С., Афанасьев Е.Н. Получение и применение препаратов для диагностики и индикации возбудителя гепатита А в объектах внешней среды // Проблемы развития биологии и химии на Северном Кавказе: Материалы науч. конф., посвящ. 70-летию биол. -хим. факультета СГУ . - Ставрополь, 2001. - С. 19-20.
18. Ефременко В.И., Тюменцева И.С., Афанасьев Е.Н., Жарникова И.В., Василенко Н.Ф., Еременко Е.И., Жилченко Е.Б. Новые препараты для экспресс-диагностики опасных инфекционных заболеваний и их применение в чрезвычайных ситуациях //Журн. микробиол. - 2001. - №6 (Приложение). -С.55-58.
19. Онищенко Г.Г., Ефременко В.И., Ковалев Н.Г., Шибков НА, Федоров Ю.М., Жилина Н.Я., Федосова Г.Н., Сысолятина Г.В., Евченко Ю.М., Бейер А.П. и др. (всего 15 авторов). Эпидемиологические особенности Крымской геморрагической лихорадки в Ставропольском крае в 1999-2000 гг. //Журн. микробиол. - 2001. - №6 (Приложение). - С.86-89.
20. Онищенко Г.Г., Федоров Ю.М., Жилина НЛ., Ефременко В.И., Евченко Ю.М., Бейер А.П., Шенетц К.В., Афанасьев Е.Н., Василенко Н.Ф., Попов В.А. и др. (всего 50 авторов) Организация и проведение мероприятий против Крымской геморрагической лихорадки на территории природных очагов России: Методические рекомендации. — М., 2001.- 64 с.
21. Василенко Н.Ф. О зараженности клещей Hyalomma marginatum Koch 1844 вирусом Крымской геморрагической лихорадки в Ставропольском крае //Экология, биоразнообразие и значение кровососущих насекомых и клещей экосистем России : Сб. науч. работ по материалам II Республиканской науч. конф., 27-29 мая 2002 г. - Великий Новгород, 2002. - С. 13.
22. Василенко Н.Ф. Лабораторная диагностика Крымской геморрагической лихорадки на территории Ставропольского края в эпидемический сезон 2001 г. // Пробл. особо опасных инфекций. - Саратов, 2002. - Вып. 1(83). -С.120-124.
23. Василенко Н.Ф. Состояние и перспективы лабораторной диагностики Крымской геморрагической лихорадки в Ставропольском крае //Университетская наука- региону: Материалы 47 науч.-метод. конф. преподавателей и студентов.- Ставрополь, 2002. - С. 12-14.
24. Василенко Н.Ф., Афанасьев Е.Н., Ефременко В.И., Тюменцева И.С. Совершенствование эпиднадзора за вирусным гепатитом А //Актуальные проблемы эпидемиологической безопасности: Материалы юбил. науч.-практ. конф., посвящ. 50-летию СтавНИПЧИ (15-16 окт. 2002 г.). - Ставрополь, 2002. -С. 65-67.
25. Василенко Н.Ф., Афанасьев Е.Н., Тюменцева И.С, Ефременко В.И., Горобец Е.А., Еременко Е.И., Евченко Ю.М., Бейер А.П. Обеспечение лабораторной диагностики Крымской-Конго геморрагической лихорадки //Актуальные проблемы эпидемиологической безопасности: Материалы юбил. науч.-практ. конф., посвящ. 50-летию СтавНИПЧИ (15-16 окт. 2002 г.). - Ставрополь, 2002 - С. 67-69.
26. Василенко Н.Ф., Емельянова И.Н., Афанасьев Е.Н., Горобец Е.А., Емельянов С.А., Шенетц К.В. Зараженность клещей Hyalomma marginatum вирусом Крымской геморрагической лихорадки на юге России в 2001 г. //Пробл. особо опасных инфекций. - Саратов, 2002. -Вып. 1(83). - С. 124-128.
27. Василенко Н.Ф., Емельянова И.Н., Афанасьев Е.Н, Горобец Е.А., Емельянов С.А., Бейер А.П. Результаты исследования крови млекопитающих и птиц на Крымскую-Конго геморрагическую лихорадку //Актуальные проблемы эпидемиологической безопасности: Материалы юбил. науч.-практ. конф., посвящ. 50-летию СтавНИПЧИ (15-16 окт. 2002 г.). - Ставрополь, 2002- С.69-70.
28. Брюханова Г.Д., Ефременко В.И., Бейер А.П., Чумакова И.В., Евченко Ю.М., Грижебовский Г.М., Григорьев М.П., Марчукова Л.Н., Санни-кова И.В., Тихенко Н.И., Еременко Е.И., Афанасьев Е.Н., Василенко Н.Ф. Обстановка и прогноз по Крымской-Конго геморрагической лихорадке на территории Ставропольского края // Актуальные проблемы эпидемиологической безопасности: Материалы юбил. науч.-практ. конф., посвящ. 50-летию СтавНИПЧИ (15-16 окт. 2002 г.). - Ставрополь, 2002 - С. 67-69.
29. Василенко Н.Ф., Афанасьев Е.Н., Санникова И.В., Емельянова И.Н. Крымская- Конго геморрагическая лихорадка в Ставропольском крае в 2002 г : лабораторная диагностика //Пробл. особо опасных инфекций. - Саратов, 2003. -Вып. 86.-С.139-148.
30. Василенко Н.Ф., Афанасьев Е.Н., Тюменцева И.С. Серологические методы исследования при Крымской-Конго геморрагической лихорадке //Ставрополь, 2003. - 40 с. -Деп. в ВИНИТИ 26.12.2003 г., № 2289-В2003.
31. Платонов А.Е., Карань Л.С., Родионова Е.Н., Шипулина О.Ю., Миронов К.П. и др. (всего 33 автора) Дифференциальная ПЦР-диагностика арбовирусных инфекций //Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней: Материалы 4-й Межгос. науч.-практ. конф. государств - участников СНГ (30 сент. - 2 окт. 2003 г., Саратов). - Саратов, 2003. -С. 144-146.
32. Платонов А.Е., Санникова И.В., Карань Н.С., Еременко Е.И., Василенко Н.Ф., Солодовников Б.В., Афанасьев Е.Н., Горобец ЕА, Вышемир-ский О.И., Шипулин Г.А., Малеев В.В. Клиническое значение определения вирусной нагрузки при Крымской геморрагической лихорадке //Материалы VI Российского съезда врачей-инфекционистов, 29-30 окт. 2003 г. - Санкт-Петербург, 2003. - С. 229.
33. Василенко Н.Ф. Разработка биотехнологии получения тест-системы магносорбентной гепатитной для экспресс-диагностики в ИФА //Ставрополь, 2004. - 56 с. -Деп. в ВИНИТИ 26.02.2004 г., № 345-В2004.
34. Василенко Н.Ф. Характеристика Крымской-Конго геморрагической лихорадки, лабораторное обеспечение диагностики и индикации её возбудителя (обзор литературы) // Ставрополь, 2004. - 52 с. - Деп. в ВИНИТИ 14.04.2004 г., № 626-В2004.
35. Василенко Н.Ф. Проблема вирусного гепатита А и его лабораторная диагностика (обзор литературы) // Ставрополь, 2004. - 36 с. - Деп. в ВИНИТИ 14.04.2004 г., № 624-В2004.
36. Василенко Н.Ф., Афанасьев Е.Н., Ефременко В.И., Горобец Е.А., Емельянова И.Н., Евченко Ю.М., Григорьев М.П., Борздова И.Ю. Изучение циркуляции вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки на территории Ставропольского края // Актуальные проблемы зашиты от возбудителей опасных и особо опасных инфекционных заболеваний: Материалы науч.-практ. конф. - Сергиев Посад, 2004. - С.47-48.
37. Василенко Н.Ф., Афанасьев Е.Н., Ефременко В.И., Горобец Е.А., Емельянова И.Н., Евченко Ю.М., Бейер А.П., Григорьев М.П. К вопросу изучения экологии вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки // Актуальные проблемы зашиты от возбудителей опасных и особо опасных инфекционных заболеваний: Материалы науч.-практ. конф. - Сергиев Посад, 2004. -С.49-50.
38. Karan L.S., Sannikova I.V., Platonov A.E., Eremenko E.I., Vasilenko N.F. et al. Viral Load at Crimean-Congo Hemorrhagic Fever and Its Clinical Significance /Ant. Conf on Emerging Infect. Dis, Feb. 29- March 3, 2004. -Atlanta, 2004.-P.125.
39. Василенко Н.Ф., Тюменцева И.С., Ефременко В.И., Афанасьев Е.Н. Вирусный гепатит А, Крымская геморрагическая лихорадка: современные аспекты эпидемиологии и лабораторной диагностики (Монография). - Ставрополь: Типография «ЧПЗерновО.В.», 2004.- 160 с.
Печать офсетная. Бумага офсетная. Формат 60x84/16 Физ. печ. л. - 2,5 Усл. печ. л. - 2,3 Заказ 444 Тираж-100 Отпечатано в цехе оперативной полиграфии краевого комитета государственной статистики г. Ставрополь, ул. Пушкина,4
Содержание диссертации, доктора биологических наук, Василенко, Надежда Филипповна
ВВЕДЕНИЕ.
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1. Проблема вирусного гепатита А и его лабораторная диагностика.
1.2. Анализ лабораторной диагностики Крымской геморрагической лихорадки и детекции её возбудителя.
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Объекты исследования, взятые в работу.
2.2. Биологическое сырье и основные химические реактивы.
2.3. Аппаратное оснащение исследований.
2.4. Экспериментальные и коммерческие тест-системы для диагностики вирусного гепатита А и Крымской геморрагической лихорадки и детекции их возбудителей.
2.5. Характеристика основных реагентов, используемых для получения магноиммуносорбентов
2.6. Методы контроля антигенов и сывороток.
2.7. Методы выделения иммуноглобулинов.
2.8. Получение иммуноферментных конъюгатов и контроль их активности.
2.9. Физико-химические методы.
2.10. Лиофилизация биологического материала.
2.11. Методы математической и статистической обработки полученных результатов.
Глава 3. РАЗРАБОТКА БИОТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ТЕСТ-СИСТЕМЫ МАГНОИММУНОСОРБЕНТНОЙ ГЕПАТИТНОЙ ДЛЯ ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ В
3.1. Разработка биотехнологии получения полиакрила-мидного магнитного сорбента.
3.1.1. Подбор методов выделения иммуноглобулинов класса G
3.1.2. Получение полиакриламидных гепатитных магноим-муносорбентов.
3.1.3. Технические устройства и методические приемы для работы с МИС.
3.1.4. Проведение иммуноферментного анализа.
3.1.5. Применение гепатитной магноиммуносорбентной полиакриламидной тест-системы.
3.2. Получение и применение гепатитных композиционных магноиммуносорбентов (ГКМИС).
3.2.1. Разработка биотехнологии получения гепатитных композиционных магноиммуносорбентов.
3.2.2. Характеристика гепатитного диагностикума на основе композиционных магноиммуносорбентов и его применение.
Глава 4. ИЗУЧЕНИЕ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ЦЕННОСТИ ИФА И ПЦР ПРИ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЯХ НА КРЫМСКУЮ ГЕМОРРАГИЧЕСКУЮ ЛИХОРАДКУ КЛИНИЧЕСКОГО И ПОЛЕВОГО МАТЕРИАЛА, РАЗРАБОТКА МЕТОДОЛОГИИ ИХ КОМПЛЕКСНОГО ПРИМЕНЕНИЯ.
4.1. Разработка методов подготовки клинического и полевого материала для проведения исследований.
4.2. Разработка методологии комплексного использования
ИФА и ОТ-ПЦР при диагностике Крымской геморрагической лихорадки.
4.3. Разработка методов детекции вируса Крымской геморрагической лихорадки в полевом материале, полученном из природных очагов некоторых регионов Юга России.
4.4. Серологическое исследование крови и органов млекопитающих и птиц в природном очаге КГЛ Ставропольского края.
Глава 5. РАЗРАБОТКА БИОТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ТЕСТ- СИСТЕМЫ МАГНОИММУНОСОРБЕНТ-НОЙ ДЛЯ ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ КРЫМСКОЙ ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКИ В ИФА
5.1. Разработка композиционного магноиммуносорбента на основе алюмосиликата.
5.2. Разработка метода селективного концентрирования на магноиммуносорбенте с последующей постановкой иммуноферментного анализа.
Глава 6. РАЗРАБОТКА СОЧЕТАННОГО МЕТОДА ДЕТЕКЦИИ ВИРУСОВ ПУТЕМ СЕЛЕКТИВНОГО КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ НА МАГНОИММУНОСОРБЕНТЕ С ПОСЛЕДУЮЩЕЙ ПОСТАНОВКОЙ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ С ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИЕЙ (ОТ-ПЦР)
6.1. Разработка и проведение сочетанного метода
МИС + ПЦР для детекции вируса гепатита А.
6.2. Разработка и проведение сочетанного метода МИС + ПЦР для детекции вируса Крымской геморрагической лихорадки.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Теоретические и прикладные аспекты конструирования магнитоуправляемых твердофазных иммунохимических тест-систем для экспресс-диагностики вирусного гепатита A, Крымской геморрагической лихорадки и детекции их возбудителей"
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ
Охрана здоровья населения, как важнейший фактор национальной безопасности, является одним из основных приоритетов государственной политики. В настоящее время очевидны бесспорные успехи, достигнутые медицинской наукой и практикой в борьбе с инфекционными заболеваниями. Наряду с этим, вирусные гепатиты (ВГ) продолжают оставаться одной из главных проблем здравоохранения в большинстве стран мира. Заболеваемость ВГ имеет чрезвычайный характер, так как по темпам прироста и масштабам распространенности на земном шаре она значительно превосходит заболеваемость СПИДом (Онищенко Г.Г., 2002). По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), ежегодно от патологии, связанной с вирусными гепатитами, включая цирроз печени и первичную клеточную карциному, умирают более 1 млн человек, из них около 100 тыс. от молниеносной формы заболевания.
Особое место среди вирусных гепатитов занимает гепатит А (ГА) -инфекция с фекально-оральным механизмом передачи. Для вирусного гепатита А характерны выраженные периодические подъемы и спады заболеваемости. Наибольшее распространение ГА имеет в регионах, где есть серьезные недостатки в обеспечении населения питьевой водой. В последние годы количество проб воды водоемов первой категории, не соответствующих стандартам, превышает 20 %. В местах водозаборов в 2-5% проб воды обнаруживаются возбудители кишечных инфекций и антиген вируса гепатита А (ВГА). Практически не сокращается количество водопроводов, не имеющих полного комплекса очистных сооружений (35%) и обеззараживающих установок (17%). Возрастает количество водных вспышек вирусного ГА (Онищенко Г.Г., 2002, 2002а). Примером является водная вспышка ГА в Карачаево-Черкесской Республике в январе-марте 2004 г. , когда заболело 180 человек. Уровень заболеваемости ГА в детском возрасте в Российской Федерации в несколько раз превышает соответствующие показатели в развитых странах мира (Каретный Ю.В., Каганов Б.С., Добротворский И.Л., 2002).
Впервые 13 февраля 2001 г. Государственная Дума России провела парламентские чтения «О государственной политике по предупреждению распространения в Российской Федерации заболеваемости инфекционным гепатитом», на которых было подчеркнуто, что проблема вирусных гепатитов переросла из медицинской в общегосударственную, инфекции приобрели катастрофические масштабы и представляют реальную угрозу для здоровья нации («Мир вирусных гепатитов», 2001).
В 1999 г. в Российской Федерации резко осложнилась эпидемическая ситуация по заболеваемости Крымской геморрагической лихорадкой (КГЛ) (Онищенко Г.Г., Ефременко В.И., 2004). Заболевания КГЛ на территории Предкавказья известны с конца 40-х годов (Чумаков М.П., 1945,1946, 1974; Бутенко А.М. с соавт., 1970; Кучин В.В., Бутенко А.М., 1970; Кондратенко В.Ф. с соавт., 1973). После длительного перерыва природный очаг КГЛ активизировался. Тяжелые вспышки с высокой летальностью имели место в 1999 г. в Обливском районе Ростовской области (26 случаев) (Онищенко Г.Г. с соавт., 2000), в Нефтекумском и Ипатовском районах Ставропольского края (10 случаев), а в 2000 г. в Ставропольском крае на 13 административных территориях были выявлены 48 больных (Василенко Н.Ф. с соавт., 2001; Онищенко Г.Г. с соавт., 2001). За шесть лет эпидемические проявления КГЛ зарегистрированы в 7 из 13 субъектов Южного Федерального округа России. За эти годы здесь заболели КГЛ 432 человека, из них 36 умерли. В октябре 2004 г. эта опасная инфекция зарегистрирована в Республике Ингушетия, летальность при этом составила 75 %.
По мнению Л.В.Колобухиной и соавт. (2001), непосредственной причиной обострения эпидемиологической обстановки по КГЛ является рост численности клещей Hyalomma marginatum в результате сочетания природных (потепление) и социальных факторов (отсутствие противоклещевой обработки скота). В последние годы также резко снижен объем работ по борьбе с грызунами в поле (Онищенко Г.Г., Грижебовский Г.М., Ефременко В.И., 2003).
В этой связи особую важность приобретает своевременное выявление возбудителей опасных вирусных инфекций в биотических и абиотических объектах и оперативное уведомление соответствующих служб об эпидемиологической обстановке. Поэтому необходимо повысить требования к качеству средств и методов лабораторной диагностики, применяемых при эпидемиологическом надзоре, реализации мер по санитарной охране территорий (Онищенко Г.Г., 2002). Это нашло отражение в Программе «Профилактика особо опасных и природно-очаговых инфекций и санитарная охрана территории Южного Федерального округа Российской Федерации от завоза и распространения инфекционных заболеваний (2003-2005 гг.)», принятой на рабочем совещании 13-14 февраля 2002 г. в СтавНИПЧИ.
Ранняя лабораторная диагностика, своевременное выявление возбудителя инфекционного заболевания занимают основное место в системе противоэпидемических мероприятий и способствуют локализации очага инфекции. Разработка технологий на основе использования иммобилизованных форм биологических объектов является одним из научных направлений современной биотехнологии. Иммобилизация лигандов путём присоединения их к инертной и нерастворимой матрице -это та область научных исследований, которая в настоящее время вызывает большой интерес, благодаря повышению стабильности лигандов в несколько сот раз путём создания специальных условий и применения метода химического модифицирования, активирования матрицы. Перспективными для применения в методах иммуноанализа являются твёрдофазные носители, в том числе различные гранулированные сорбенты (Шаханина К. Л., Клеев Б.В., Фёдоров Ю.М., 1976; Camargo Z., Guesdon J.L., Drouhet E., 1984), а в последнее время - сорбенты с магнитными свойствами (Жарникова И.В., 1995; Тюменцева И.С., 1996; Ефременко В.И., 1997; Афанасьев Е.Н., 2000; Chemla Y.R. et al, 2000; Richardson J., Hawcins P., Luxton R., 2001; Tanaka T., Matsunaga T., 2001).
Исследования по созданию и практическому использованию магнитных сорбентов применительно к вирусным инфекциям ранее не проводились. В связи с этим возникла необходимость в развитии и совершенствовании иммунобиологических методов, разработке новых экспрессных методов диагностики вирусных инфекций и индикации их возбудителей, направленных на сокращение времени проведения анализов и повышения их чувствительности и специфичности.
Цель исследования - конструирование твердофазных магнитоуправляемых иммунохимических тест-систем, отработка методических подходов к их применению, изучение диагностической ценности при лабораторной диагностике вирусного гепатита А, Крымской геморрагической лихорадки и детекции их возбудителей. Задачи исследования:
-разработать методологические основы конструирования твердофазных магнитоуправляемых иммунохимических тест-систем для лабораторной диагностики вирусного гепатита А, Крымской геморрагической лихорадки и детекции их возбудителей;
- разработать технологию применения магноиммуносорбентов при проведении экспрессных анализов (ИФА и ПЦР);
- провести оценку эффективности различных способов выделения иммуноглобулинов класса G из антивирусных иммунных сывороток и мышиных иммунных асцитических жидкостей (ИАЖ) при конструировании диагностических тест-систем;
- изучить диагностическую ценность разработанных тест-систем и методических приемов на экспериментальном, клиническом и полевом материале;
- изучить диагностическую ценность иммуноферментного анализа и полимеразной цепной реакции при диагностике КГЛ и разработать методологию комплексного применениия этих методов на различных стадиях заболевания;
- создать банк сывороток крови от больных людей Крымской геморрагической лихорадкой из природных очагов Юга России для его использования при оценке новых МИБП для диагностики КГЛ.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ
Впервые применительно к вирусным инфекциям осуществлена научно-методическая разработка биотехнологии производства магнитоуправляемых твердофазных иммунохимических тест-систем (полиакриламидных и композиционных), обладающих высокими сорбционной ёмкостью, стабильностью, чувствительностью, специфичностью.
Впервые разработаны методические приёмы по сочетанному применению селективного концентрирования вирусов на магноиммуносорбентах с последующим проведением экспрессных методов (ИФА и ПЦР), позволяющие исследовать материал от больных людей или животных, пробы из внешней среды неограниченного объёма с высокой степенью загрязнения, с низкой концентрацией вируса и чувствительностью, в несколько сот раз превышающей традиционные, что значительно повысило достоверность полученных результатов исследований.
Впервые в сравнительном аспекте проведен комплексный анализ различных способов выделения иммуноглобулинов из антивирусных иммунных сывороток и ИАЖ при конструировании диагностических тест-систем.
Разработаны эффективные методы подготовки проб клинического и полевого материала для лабораторного исследования, повышающие чувствительность и специфичность экспрессных анализов.
Впервые проведено изучение диагностической ценности иммуноферментного анализа и полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) при диагностике КГЛ и определена методология комплексного использования этих методов на различных стадиях заболевания.
Впервые на территории Ставропольского края в очаге КГЛ обнаружены антитела класса G к вирусу КГЛ в пробах крови ежей, землеройки-белозубки и мыши полевой; на территории Республики Ингушетия антиген и РНК вируса КГЛ выявлены у клещей Boophilus annulatus и Haemaphysalis otophila.
Приоритетность выполненных исследований подтверждена патентом РФ на изобретение №2065164 от 10.08.1996 г. «Диагностическая тест-система для выявления вируса гепатита А».
Теоретическая и практическая значимость работы
Результаты проведенных исследований по методологии конструирования магнитоуправляемых твердофазных аффинных тест-систем дополняют теоретическую основу и намечают направление научных изысканий в области усовершенствования экспресс-диагностики вирусного гепатита А, Крымской геморрагической лихорадки и детекции их возбудителей. Теоретический аспект исследований состоит и в анализе возможных способов минимизации неспецифических реакций, повышения достоверности результатов лабораторного анализа на вирусный гепатит А и Крымскую геморрагическую лихорадку.
Разработка методов подготовки клинического материала для проведения лабораторных исследований, изучение диагностической ценности экспресс-анализов позволили предложить метод комплексного использования ИФА и ОТ-ПЦР при диагностике КГЛ.
Разработанные методические подходы и приёмы по извлечению антигенного материала из клинического и полевого материалов, выделению иммуноглобулинов из иммунных сывороток и асцитических жидкостей, оптимизация параметров конъюгации лигандов и маркёров позволили унифицировать биотехнологию производства ряда МИБП для экспресс-диагностики инфекционных вирусных заболеваний и детекции их возбудителей. Эти биотехнологии позволили изготовить серии диагностикумов (иммуноферментных, магноиммуносорбентных: полиакриламидных, аэросильных и алюмосиликатных), стабильно отвечающих общим медико-биологическим требованиям, предъявляемым к индикационным препаратам.
Применение сконструированных магноиммуносорбентов в сочетании с экспрессными методами диагностики (ИФА и ПЦР) увеличивает их чувствительность, одновременно сокращая время проведения исследований за счёт ускорения манипуляций и исключения ряда этапов в ходе анализов, что повышает целенаправленность проведения эффективных противоэпидемических мероприятий.
На основе материала от больных и подозрительных на заболевание КГЛ, поступившего в 2000-2004 гг. из природных очагов Юга России, создан банк лиофилизированных сывороток крови, систематизированных по различным критериям. Эта коллекция дает возможность проводить как углублённые клинические испытания новых МИБП для диагностики КГЛ, так и изучать некоторые теоретические аспекты современной вирусологии.
По материалам диссертации написана монография Н. Ф. Василенко с соавторами «Вирусный гепатит А, Крымская геморрагическая лихорадка: современные аспекты эпидемиологии и лабораторной диагностики» (2004 г.). Кроме того, результаты наших исследований использованы при написании двух монографий: В.И.Ефременко «Магносорбенты в микробиологических исследованиях» (1996 г.) и Г.Г.Онищенко с соавторами «Крымская геморрагическая лихорадка» (2004 г.).
Материалы научных разработок легли в основу следующих методических и нормативных документов:
1. «Инструкция по изготовлению и контролю тест-системы диагностической для выявления вируса гепатита А иммуноферментным методом». Одобрена Ученым советом СтавНИПЧИ (протокол №2 от 26.02.1993 г.) и утверждена директором института.
2. «Протокол медицинских испытаний опытного образца комплекта «Диамаг-100» при выявлении вируса гепатита А в объектах внешней среды и материале от больных иммуноферментным методом с использованием магноиммуносорбентов («полевые» испытания)». Утвержден главным врачом Ставропольского городского ЦГСЭН А.А.Герасименко от 12.10.93 г. и зам. главного врача РЦГСЭН Чеченской Республики В.Х.Муцаевым от 10.05.95 г.
3. Методические указания «Использование магноиммуносорбентов в иммунологических методах выявления корпускулярных и водорастворимых антигенов возбудителей инфекционных заболеваний (бактериологический, иммуноферментный, иммунофлуоресцентный)». Утверждены Комитетом Госсанэпиднадзора РФ 11.04. 1995 г.
4. Методические рекомендации «Приготовление органокремнеземных магносорбентов с иммобилизованными лигандами белковой природы (иммуноглобулины, антигены, ферменты)». Утверждены Комитетом Госсанэпиднадзора РФ 15.05.1996 г.
5. Методические рекомендации «Организация и проведение мероприятий против Крымской геморрагической лихорадки на территории природных очагов России». Утверждены Первым заместителем Министра здравоохранения РФ, Главным государственным санитарным врачом РФ Г.Г.Онищенко 23.03.2001 г.
6. Методические рекомендации «Оценка клинических и лабораторных данных (ПЦР, ИФА) при диагностике Крымской геморрагической лихорадки». Одобрены Ученым советом СтавНИПЧИ (протокол №3 от 20.03.2002 г.) и утверждены директором института.
7. Методические рекомендации «Выявление вируса гепатита А в объектах внешней среды и материале от больных людей». Одобрены Ученым советом СтавНИПЧИ (протокол №4 от 29.04.2004 г.) и утверждены директором института.
8. Методические рекомендации «Применение магнитных иммунных сорбентов (МИС), ИФА и ПЦР для выявления возбудителя Крымской геморрагической лихорадки в природных очагах инфекции». Одобрены Ученым советом СтавНИПЧИ (протокол №5 от 25.05.2004 г.) и утверждены директором института.
Материалы диссертации используются в лекциях и практических занятиях на курсах по первичной специализации врачей по особо опасным инфекциям при СтавНИПЧИ и семинарах для практических врачей и научных работников МЗ РФ по экспресс-диагностике инфекционных заболеваний и применению магносорбентных препаратов в мониторинге инфекционных агентов.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Изучение диагностической ценности экспериментальных тест-систем для ИФА и ПЦР при проведении лабораторного анализа на вирусный гепатит А и Крымскую геморрагическую лихорадку.
2. Принципы комплексного использования иммуноферментного анализа и полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией при лабораторной диагностике Крымской геморрагической лихорадки на разных стадиях заболевания.
3. Методология конструирования иммуноферментных диагностикумов, обеспечивающих высокую эффективность обнаружения возбудителей опасных и особо опасных вирусных инфекций и их антигенов в экспериментальных и полевых условиях.
4. Методологические подходы и разработка биотехнологии изготовления твёрдофазных микрогранулированных композиционных аффинных магнитоуправляемых сорбентов для избирательного концентрирования вирусов и использования в экспрессных методах диагностики (ИФА и ПЦР).
5. Результаты экспериментальных, клинических и полевых испытаний тест-систем для диагностики вирусного гепатита А, Крымской геморрагической лихорадки и детекции их возбудителей.
Публикации
Основное содержание диссертации, выполненной в рамках 5 НИР, отражено в 39 опубликованных работах (монография - 1, в ведущих научных журналах, рекомендуемых ВАК - 6 статей, депонированых - 6 статей, в 1 патенте РФ на изобретение, в материалах международных, межгосударственных и всероссийских научных конференций - 7 публикаций, в иностранных журналах - 1; в материалах научнопрактических конференций - 16), а также в 1 нормативном документе (Инструкция) и 6 методических рекомендациях и указаниях.
Апробация работы
Основные результаты диссертационной работы были представлены на научной конференции « Современные аспекты профилактики зоонозных инфекций» (Ставрополь, 1991); научной конференции «Современные аспекты природной очаговости, эпидемиологии и профилактики особо опасных инфекционных заболеваний» (Омск, 1993); Всесоюзной научно-практической конференции «Состояние и перспективы разработки препаратов для диагностики вирусных гепатитов и инфекций, управляемых специфическими средствами профилактики» (Пермь, 1993); Межгосударственной научно-практической конференции «Актуальные вопросы профилактики чумы и других инфекционных заболеваний», посвященной 100-летию открытия возбудителя чумы (Ставрополь, 1994); научно-практической конференции «Актуальные вопросы профилактики особо опасных и других инфекционных заболеваний», посвященной 60-летию противочумной службы Кавказа (Ставрополь, 1995); научной конференции Ставропольского отделения Российского научного общества микробиологов, эпидемиологов и паразитологов (Ставрополь, 1995); конференции «Эпидемиологические и клинико-иммунологические аспекты профилактики важнейших инфекционных заболеваний» (Астрахань, 1996); 4-й итоговой научной конференции молодых ученых и студентов (Ставрополь, 1996); научно-практической конференции, посвященной 100-летию образования противочумной службы России (Саратов, 1997); VII съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 1997); международной научно - практической конференции «Проблемы санитарно-эпидемиологической охраны территории стран Содружества Независимых Государств» (Саратов, 1998); научной конференции, посвящённой 70 - летию биолого-химического факультета "Проблемы развития биологии и химии на Северном Кавказе» (Ставрополь, 2001 г.); межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные аспекты природно-очаговых болезней», посвященной 80-летию Омского НИИПИ (Омск, 2001); рабочем совещании по обсуждению проекта программы «Профилактика особо опасных и природно-очаговых инфекций и санитарная охрана территории Южного Федерального округа Российской Федерации от завоза и распространения инфекционных заболеваний (20032005гг.)» (Ставрополь, февраль, 2002); 47-й научно-методической конференции преподавателей и студентов «Университетская наука -региону» (Ставрополь, апрель, 2002); II Республиканской научной конференции «Экология, биоразнообразие и значение кровососущих насекомых и клещей экосистем России» (Великий Новгород, май, 2002); научно-практической конференции «Эпидемиологическая безопасность. Итоги и перспективы», посвящённой 50-летию СтавНИПЧИ (Ставрополь, октябрь 2002); 4-й Межгосударственной научно-практической конференции государств - участников СНГ «Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней» (Саратов, сентябрь, 2003); VI Российском съезде врачей - инфекционистов (Санкт-Петербург, октябрь, 2003); Международной конференции по вновь появляющимся инфекционным болезням (США, Атланта, 2004).
Структура и объем работы
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка использованной литературы. Она изложена на 271 странице, содержит 19 таблиц и 33 рисунка. Список литературы включает 365 отечественных и 173 зарубежных литературных источников.
Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Василенко, Надежда Филипповна
ВЫВОДЫ
1. Разработана биотехнология изготовления аффинных сорбентов с магнитными свойствами на основе высокодисперсных органокремнеземов с целенаправленно модифицированной поверхностью, способствующей эффективному образованию иммунохимического комплекса антиген-антитело, обладающих стандартностью структурных характеристик, механической прочностью и устойчивостью в агрессивных средах, которая впервые позволила применить их для конструирования МИБП нового поколения, пополняющих арсенал экспрессных лабораторных средств для выявления заболеваний и патогенов вирусной природы.
2. Впервые разработаны методологические основы конструирования твердофазных магнитоуправляемых иммунохимических тест-систем для экспресс-диагностики вирусного гепатита А, Крымской геморрагической лихорадки и детекции их возбудителей, имеющих высокую степень разрешения.
3. Проведена оценка эффективности различных способов выделения иммуноглобулинов класса G из антивирусных иммунных сывороток и асцитических жидкостей и определены оптимальные параметры биотехнологии производства иммуноферментных тест-систем (эффективный способ выделения IgG методом двойного осаждения сернокислым аммонием, значение рН реакционной смеси- 7,2-7,4, концентрация специфического белка иммуноглобулинов - 5 мг/мл, температура конъюгации - (22±4) иС, 2-х часовой контакт IgG с ферментом), позволяющие получать диагностикумы для детекции возбудителей вирусного гепатита А и Крымской геморрагической лихорадки, отвечающие ОМБТ, предъявляемым к индикационным препаратам.
4. Впервые проведено изучение диагностической ценности иммуноферментного анализа и полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией при диагностике Крымской геморрагической лихорадки и разработана методология комплексного их использования. Установлено, что на ранних стадиях заболевания для диагностики КГЛ наиболее целесообразно использовать ОТ-ПЦР для детекции РНК и ИФА для выявления ранних IgM. Для диагностики в более поздние сроки заболевания эффективен ИФА, направленный на выявление специфических IgG, в это время ПЦР, как правило, отрицательна. Комплексное применение ОТ-ПЦР и ИФА позволяет проводить более качественную лабораторную диагностику КГЛ.
5. Впервые разработаны методические приёмы по сочетанному применению селективного концентрирования вирусов и их антигенов на магноиммуносорбентах с последующим проведением экспрессных методов (ИФА и ПЦР), позволяющие исследовать материал от больных людей или животных, пробы из внешней среды неограниченного объема с высокой степенью загрязнения, с низкой концентрацией вирионов и чувствительностью, в несколько сот раз превышающей традиционные, что значительно повышает достоверность как положительных, так и отрицательных результатов исследований. При этом сокращается время проведения анализов до 1-3 часов.
6. Диагностическая ценность и преимущество разработанных тест-систем подтверждены при исследовании на вирусный гепатит А и Крымскую геморрагическую лихорадку разнообразного экспериментального, клинического, полевого материала. Их применение позволило повысить выявляемость заболеваний и определение инфекционного агента от 3 до 50% при эпидемических вспышках и мониторинге объектов внешней среды.
7. На основе материала от больных и подозрительных на заболевание КГЛ, поступившего в 2000-2004 гг. из природных очагов Юга России, впервые создан банк лиофилизированных сывороток крови, систематизированных по различным критериям. Эта коллекция дает возможность проводить как углублённые клинические испытания новых МИБП для диагностики КГЛ, так и изучать некоторые теоретические аспекты современной вирусологии.
8. Применение магнитоуправляемых твердофазных иммунохимических тест-систем впервые позволило обнаружить вирус КГЛ в пробах иксодовых клещей Boophilus annulatus и Haemaphysalis otophila, собранных на территории Республики Ингушетия, что свидетельствует об интенсивности эпизоотического процесса в очаге КГЛ, расширении видового состава клещей -источника и резервуара вируса КГЛ, формировании стойкого природного очага КГЛ на территории Ставропольского края, некоторых других регионов Юга России и позволяет более обоснованно прогнозировать развитие эпидемиологической обстановки по этой инфекции.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. При конструировании магноиммуносорбентов для детекции возбудителей вирусных инфекционных заболеваний в качестве матрицы рекомендуем использовать алюмосиликат. Для прочной иммобилизации лиганда проводить активирование поверхности матрицы вторичным алкилсульфатом натрия.
2. При получении иммунопероксидазных конъюгатов рекомендуем использовать иммуноглобулины класса G, выделенные из иммунных сывороток реконвалесцентов или мышиных иммунных асцитических жидкостей методом двойного осаждения при 40-45% насыщении сульфата аммония, что существенно увеличивает выход IgG и позволяет хранить их в растворе соли без потери активности в течение нескольких лет.
3. Для повышения процента выявляемости возбудителей вирусного гепатита А и Крымской геморрагической лихорадки рекомендуем проводить селективное концентрирование исследуемого материала на магноиммуносорбенте с последующей постановкой ИФА и ОТ-ПЦР.
4. Для диагностики Крымской геморрагической лихорадки в остром периоде болезни (период вирусемии) рекомендуем применять ОТ-ПЦР для выявления специфической РНК вируса КГЛ (1-7-й дни). С четвертого дня болезни - использовать ИФА для обнаружения ранних антител класса М; с пятого дня - ИФА для выявления IgG в парных сыворотках крови. Одновременное использование ОТ-ПЦР и ИФА позволяет получать более достоверные результаты.
Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Василенко, Надежда Филипповна, Ставрополь
1. Авакян А.А., Башкиров Т. А. Геморрагические лихорадки //Руководство по лабораторной диагностике вирусных и риккетсиозных болезней /Под ред. П.Ф. Здродовского и М.И. Соколова -М.:Медицина,1965. С.432-440.
2. Алейник М.Д., Блохин К.В., Чиковитова Н.М. и др. Роль пищевого фактора передачи в возникновении двух вспышек гепатита А //Журн. микробиол. 1992. - №1. - С.19-22.
3. Алейник М. Г., Быстрова Т. М., Чиковитова Н. М. Пути совершенствования системы эпиднадзора за вирусным гепатитом А //Материалы VII съезда Всерос. общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. М., 1997. - Т.2. - С.205-206.
4. Алюшин М.Т., Астахова М.Н. Аэросил и его применение в фармацевтической практике //Фармация. 1971 - №6. - С.73-77.
5. Амвросьева Т.В., Дьяконова О.В., Гудков В.Н. и др. Активный оксид алюминия новый адсорбент для концентрирования кишечных вирусов из воды //Вопр. вирусол. - 1999. - №2. - С. 92-95.
6. Анджапаридзе А.Г., Тольская Е.А., Колесникова М.С. и др. //Acta Virol. 1984. - Vol. 28, N 1. - P.53-55.
7. Андросова С.В., Рогаткин А.К., Козлова Т.А. и др. Изучение распространения арбовирусов на территории Астраханской области //Сб. науч. тр. Новороссийск, 1994. -Вып.1. - С.307-310.
8. Антоненко А. Д., Таран И.Ф., Лямкин Г.И. и др. Эпидемиологическая ситуация по инфекционным болезням в Ставропольском крае //Эпидемиол. и инфекционные болезни. 1999. - №5. -С.8-11.
9. Аристова В.А., Колобухина Л.В., Щелканов М.Ю., Львов Д.К. Экология вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки и особенности её клиники на территории России и сопредельных стран //Вопр. вирусол. 2001. - № 4. - С.7-15.
10. Асваров Б.М., Хасаев С.М., Бацына Т.Ф. и др. Численность и стациальное распределение имаго иксодового клеща Hyalomma marginatum -переносчика Крымской геморрагической лихорадки в Дагестане // Журн. микрбиол. 2001. - № 6 (Приложение). - С.100-102.
11. Асратян А.А., Павлова И.П., Рейзис А.Р. и др. Маркеры вирусных гепатитов в образцах слюны больных острыми гепатитами А, В и С //Журн. микробиол. 1997. - №6. - С.43-47.
12. Атшабар Б.Б., Айкимбаев А.М., Матаков М.И. и др. Экологические аспекты существования эндемии Конго-Крымской геморрагической лихорадки на юге Республики Казахстан //Пробл. особо опасных инфекций. Саратов, 2002. - Вып. 84. - С.48-51.
13. Афанасьев Е.Н. Научно-методические аспекты экспресс-диагностики возбудителей особо опасных зоонозных инфекций (чума, бруцеллез, сибирская язва): Автореф. дис. . докт. мед. наук.- Ростов, 2000.- 45 с.
14. Афанасьев Е.Н., Василенко Н.Ф. Тюменцева И.С. и др. Опыт использования диагностической магносорбентной тест-системы для выявления вируса гепатита А иммуноферментным анализом
15. Эпидемиологические клинико-иммунологические аспекты профилактики важнейших инфекционных заболеваний: Материалы конф. Астрахань,1996. - С.108.
16. Багдасарьян Г. А., Мышляева Л. А., Доскина Т.В. и др. Закономерности взаимодействия вирусов с естественными сорбентами //Научное обоснование гигиенических мероприятий по оздоровлению объектов окружающей среды. М., 1983. - С. 106-109.
17. Бадалов М.Е., Лазарев В.Н., Коимчиди Е.К. и др. К вопросу о внутрибольничных и лабораторных заражениях КГЛ //Крымская геморрагическая лихорадка: Материалы III обл.науч.-практ. конф., Ростов-на-Дону, май, 1970 г. Ростов-на-Дону, 1970. - С.90-92.
18. Балаян М.С. Вирусный гепатит А (научный обзор) М.: ВНИИМИ, 1983. - №4. - 69 с.
19. Балаян М.С., Анджапаридзе А.Г., Тольская Е.А. и др. О возможности воспроизведения инфекции вируса гепатита А в клеточных системах //Вопр. вирусол. 1979. - № 6. - С.675-676.
20. Балаян М.С., Кусов Ю.Ю., Флеер Г.П. и др. //Вирусные гепатиты. М., 1984. - С.29-36.
21. Балаян М.С., Михайлов М.И. / Энциклопедический словарь -вирусные гепатиты. М., 1999. - 304 с.
22. Батырова Б. А., Юсупова С.М., Омарова Б.К. и др. Сравнительная оценка специфичности методов иммунологической диагностики Крымской геморрагической лихорадки //Сб. науч. тр. Махачкала, 2002. - С.159-160.
23. Безроднова С.М., Зубков Ю.П, Гарбуз М.А. и др. Выявление вирусного гепатита А в очаге инфекции // Сб. науч. работ 4-й итоговой науч. конф. молодых ученых и студентов. Ставрополь, 1996. - С.38-39.
24. Бендикене В.Г., Юодка Б.А. Казлаускас Р.М. и др. Иммобилизация ферментов на носителях, обладающих магнитнымисвойствами. Получение и характеристика магнитных производных хитина //Прикладная биохимия и микробиология. 1995. - Т.31. - № 4. - С.393-400.
25. Бердыев А., Курбанов М.М. Экологический анализ иксодовых клещей аридных районов в связи с изучением природных очагов арбовирусных инфекций //Экология вирусов Казахстана и Средней Азии. -Алма-Ата, 1980. С.81-85.
26. Березин В.В. Роль птиц в экологии арбовирусной инфекции в дельте Волги: Автореф. дис. . канд. мед. наук. М., 1967.
27. Березин И.В., Антонов В.К., Мартинек К. Иммобилизованные ферменты. М.: Изд-во МГУ, 1979. - Т.1-2.
28. Березин В.В., Бутенко А.М., Чумаков М.П., Столбов Д.Н. К вопросу о естественных хозяевах вируса КГЛ в Астраханской области //Вирусные геморрагические лихорадки: Тр. ИПВЭ АМН СССР. М., 1971. -Т.19. - С.210-216.
29. Березин В.В., Чумаков М.П. К экологии вируса Крымской геморрагической лихорадки в Нижнем Поволжье // Материалы XVI науч. сессии ИПВЭ АМН СССР. М., 1969. - С. 86-92.
30. Билибин А.Ф. Геморрагические лихорадки // Вирусные болезни человека. М.:Медицина, 1967. - С. 380-389.
31. Бируля Н.Б., Залуцкая Л.И., Перелатов В.Д. Ареал природых очагов КГЛ // Вирусные геморрагические лихорадки: Тр.ИПВЭ АМН СССР. М., 1971. - Т.19. - С.180-185.
32. Благовещенская Н.М., Кондратенко В.Ф., Зарубина Л.В. и др. Диагностика и изучение природных очагов Крымской геморрагической лихорадки. Мет. рек. - Ростов-на-Дону, 1975.- 30 с.
33. Блохина Н.П. Клинические аспекты ПЦР-диагностики при вирусных гепатитах //Материалы VI Рос. съезда врачей-инфекционистов, 2931 окт. 2003 г. СПб.,2003. - С.38-39.
34. Бляхер И.А., Пак Т.П., Ясинский В.В. О внутрибольничной вспышке КГЛ в Таджикистане // Вирусные геморрагические лихорадки: Тр. ИПВЭ АМН СССР. М., 1971. - Т.19. - С.130-133.
35. Богомолов Л. И. Крымская геморрагическая лихорадка //Опыт советской медицины в Великой Отечественной войне 1941-1945 гг. М., 1955. - Т.31. - С.245-261.
36. Бондарев Л.С., Туйнов В.А., Домашенко О.Н. Диагностическая значимость разных методов лабораторной диагностики вирусных гепатитов А и В // Клин. лаб. диагностика. 1992. - №7-8. - С.55-56.
37. Борисевич Г.В., Лебедев В.Н., Пащенко Ю.И. и др. Использование моноклональных антител в исследовании возбудителей вирусных геморрагических лихорадок // Вопр. вирусол. 2003. - №5. - С.4-8.
38. Брыкалов А.В. Сорбенты на основе кремнеземов и активированных углей в биотехнологии и медицине //Матер. конф. химиков Сев .Кавказа. Нальчик, 1991. - С. 185-186.
39. Брыкалов А.В. Получение биопрепаратов на основе методоваффинной сорбции и иммобилизации.- Дисс.доктора хим.наук.- СПб.,1993.- 330 с.
40. Брыкалов А.В., Жарникова И.В. Способ получения иммуносорбента. Патент РФ № 2102134, Бюл. №2 от 20.01.98.
41. Брыкалов А.В., Ковальков В.И., Тельбух В.П. и др. Способ получения иммобилизованных протеолитических ферментов // Описание изобретения к авторскому свидетельству № 1084300 от 07.04.84. Бюлл. №3.
42. Быстрова Т.Н., Блохин К.В., Макарова Т.Г. и др. Динамика клинического течения гепатита А в зависимости от интенсивности эпидемического процесса //Материалы VI Рос. съезда врачей-инфекционистов, 29-31 окт. 2003 г. СПб., 2003. - С.59.
43. Быстрова Т.Н., Коршунова Г.С., Березина М.И. и др. Вспышка гепатита А с водным путем передачи инфекции // Материалы VIII съезда Всерос. общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. М., 2002. - Т.3. - С.11-12.
44. Варгина С. Т., Брейнингер И. Т. Мониторинг природных очагов арбовирусов в Киргизии //ВИНИТИ. Итоги науки и техники. Сер. Вирусология. - М., 1991. - Т.24. - С.15-16.
45. Василенко Н.Ф. Лабораторная диагностика Крымской геморрагической лихорадки на территории Ставропольского края в эпидемический сезон 2001 г. // Пробл. особо опасных инфекций. Саратов, 2002. - В.1(83). - С. 120-124.
46. Василенко Н.Ф., Афанасьев Е.Н., Тюменцева И.С. и др. Лабораторная диагностика вспышки Крымской геморрагической лихорадки на юге России //Журн. микробиол. 2001. - № 6 (приложение). - С.95-97.
47. Василенко Н.Ф., Афанасьев Е.Н., Санникова И.В. и др. Крымская- Конго геморрагическая лихорадка в Ставропольском крае в 2002 г : лабораторная диагностика //Пробл. особо опасных инфекций. Саратов, 2003. - В. 86. - С.139-148.
48. Василенко Н.Ф., Емельянова И.Н., Афанасьев Е.Н. и др. Зараженность клещей Hyalomma marginatum вирусом Крымской геморрагической лихорадки на юге России в 2001 г. // Пробл. особо опасных инфекций. Саратов, 2002. - В.1(83). - С.124-128.
49. Василенко Н.Ф., Ефременко В.И., Гнутов И.Н. и др. Диагностическая тест-система для выявления вируса гепатита А. -Ставрополь, 94. 10 с. - Деп. в ВИНИТИ 15.07.94 г., №1799-D94.
50. Василенко Н.Ф., Ефременко В.И., Черноусова Л.Д. и др. Новые возможности клинико-иммунологической диагностики вирусного гепатита А. Ставрополь, 95. - 7 с. - Деп. в ВИНИТИ 25.01.1995 г., № 221-В95.
51. Василенко Н.Ф., Ефременко В.И.,Гнутов Н.И.Тест-система диагностическая для выявления вируса гепатита А // Патент РФ на изобретение № 2065164; G 01 №33/53, Бюл. №22 от 10.08.96.
52. Василенко Н.Ф., Ефременко В.И., Захаренков А.В. Магнитные иммуносорбенты в эпиднадзоре за гепатитом А // Материалы VII съезда Всеросс.об-ва эпидемиологов, микробиологов и паразитологов.- М., 1997. -Т.1. С.106.
53. Вафакулов Б.Х., Кожинская Э.М., Кононов В.М. и др. Сравнительное изучение диагностикума для выявления антигена вируса гепатита А эритроцитарного иммуноглобулинового сухого // Журн. микробиол. 1988. - №3. - С.54-57.
54. Возжаева А.Р., Аваков А. Д., Жигульская И.Ф., Соловьева Л. А. О случаях геморрагической лихорадки в Астраханскрой области // Тез. докл. 32-й науч. сессии Астраханского мед. ин-та. Астрахань, 1955. - С.28.
55. Ворошилова О.И., Киселев А.В., Никитин Ю.С. Синтез и исследование кремнеземистых носителей с поверхностью, модифицированной гамма-аминопропильными группами // Колоидный журн. 1980. - Т.42. - N 2. - С. 223-229.
56. Вышемирский О.И. Анализ антигенной структуры штаммов Крымской-Конго геморрагической лихорадки: Дис. . канд. мед. наук. М., 1993.
57. Вышемирский О.И., Громашевский В.Л., Москвина Т.М. и др. Применение культуры клеток SW-13 для выделения вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки из полевого материала // Вопр. вирусол. 2001. -№4. - С.47-49.
58. Вышемирский О.И., Петров В.А., Бутенко А.М. и др. Выделение вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки от больного человека в Волгоградской области летом 2000 г. // Вопр. вирусол. 2001. - №4. - С. 2122.
59. Гайдамович С.Я., Кирющенко Т.В. Микрокапельный метод постановки РСК с арбовирусами // Вопр. вирусол. 1972. - №3. - С.358-360.
60. Гайдамович С.Я., Мельникова Е.Э., Шуткова Т.М. и др. Характеристика моноклональных антител, индуцированных вирусом Крымской геморрагической лихорадки // Вопр. вирусол. 1989. - № 2. - С. 201-204.
61. Гайдамович С.Я.,Клисенко Г.А., Шаноян Н.К. и др. Реакция непрямой гемагглютинации с вирусами группы КГЛ-Конго //Вопр. вирусол. 1974. - №6. - С.705-708.
62. Гендон Ю.З. Современные достижения в изучении вируса гепатита А и в разработке вакцин против этой инфекции //Вопр. вирусол. -1989. №3. - С.261-267.
63. Гинцбург А.Л., Нестеренко Н.Л. Молекулярно-биологические методы диагностики инфекционных заболеваний //Материалы VIII съезда Всерос. общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. М., 2002. - Т.3. - С.242-243.
64. Гладышев П.П., Шаповалов Ю.А., Квасова В.П. Реконструированные оксидоредуктазные системы. Алма-Ата, 1987. -С.192-198.
65. Глухов А.И., Гордеев С.А., Альтшулер М.Л. и др. Разработка и испытание ПЦР тест-системы для детекции РНК вируса гепатита А //Журн. микробиол. 2004. - №4. - С.50-54.
66. Гмыль Л.В., Карганова Г.Г., Смирнова С.Е., Лашкевич В.А. Вирусспецифические белки вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки // Вопр. вирусол. 2001. - №3. - С.16-21.
67. Гмыль Л.В., Смирнова С.Е., Карганова Г.Г. Выявление РНК вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки с помощью полимеразной цепной реакции //Материалы VIII съезда Всерос. общества эпидемиол., микробиол. и паразитол. М., 2002. - Т.3. - С.243-244.
68. Говорун В.М. Новое направление в ДНК-диагностике //Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний. М., 1998. - С.12-13.
69. Горбунов М.А., Никитюк Н.М., Соловьев Ю.Ф. и др. Результаты полевого контролируемого испытания диагностикума эритроцитарного иммуноглобулинового сухого для выявления антигена вируса гепатита А //Журн. микробиол. 1991. - №11. - С.43-45.
70. Григорьев М.П., Евченко Ю.М., Шапошникова Л.И. и др. Роль некоторых диких птиц и млекопитающих в природной очаговости Крымской геморрагической лихорадки в Ставропольском крае //Журн. микробиол. -2001. №6 (Приложение). - С.92-95.
71. Гудков В.Г., Томаль Л.С., Рытик П.Г. и др. Состояние коллективного иммунитета к вирусному гепатиту А у городского населения Белоруссии // Журн. микробиол. 1992. - №3. - С.60-62.
72. Давлетшина П.К., Нигматулина Г.Щ., Мавзютова Г.А. и др. Ретроспективный анализ этиологической структуры вирусных гепатитов // Материалы VIII съезда Всерос. общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. М., 2002. - Т.3. - С.17-18.
73. Дзантиев Б.Б., Егоров А.М. Современное состояние и перспективы развития иммуноферментного анализа // Журн. ВХО им. Д.И. Менделеева.- 1982.- Т.27, №4.- C.442-449.
74. Димов Г.К. К патологической анатомии геморрагической лихорадки в Болгарии //Арх. пат. 1959. - №6. - С.24-35.
75. Доклад Комитета экспертов ВОЗ. Вирусные геморрагические лихорадки. - Женева, 1986. - С. 42-47, 84-99.
76. Дорошенко Г.В., Алексеева И.Л., Заиров Г.К. и др. Определение вируса гепатита А в фекалиях больных в динамике инфекционного процесса // Вопр. вирусол. 1982. - №3. - С.52-55.
77. Дранкин Д.И., Заяц Н.А., Крылов Б. А. и др. Водная вспышка гепатита А среди учащихся, работавших на сельскохозяйственных работах в овощеводческом хозяйстве // Журн. микробиол. 1995. - №6. - С.33-34.
78. Евстратов Ю.В., Маркешин Р.Я. Изучение природных очагов вирусных инфекций в ряде районов Украины //ВИНИТИ. Итоги науки и техники. Сер.: Вирусология. М., 1991. - Т.24. - С.29-30.
79. Евченко Ю.М., Львов Д.К., Сысолятина Г.В. и др. Зараженность клещей Hyalomma marginatum Koch. 1844 вирусом Крымской-Конго геморрагической лихорадки в Ставропольском крае в эпидемический сезон 2000 г. // Вопр. вирусол. 2001. - №4. - С.18-19.
80. Емельянова И.Н., Шапошникова Л.И., Емельянов С.А. Роль птиц и млекопитающих в прокормлении преимагинальных фаз Hyalomma marginatum (Ixodidae) //Сб. науч. тр. Махачкала, 2002. - С.153-157.
81. Ефременко В.И. Магнитоуправляемые иммобилизованные системы в микробиологическом мониторинге природных очагов и объектов внешней среды на наличие возбудителей опасных инфекционных болезней //Журн. микробиол. 1991. - № 2. - С.102-106.
82. Ефременко В.И. Магносорбенты в микробиологических исследованиях. Ставрополь: «Ставрополье», 1996. - 131 с.
83. Ефременко В.И. Магнитоуправляемые иммобилизованные системы в микробиологическом мониторинге природных очагов и объектоввнешней среды на наличие возбудителей опасных инфекционных болезней //Журн. микробиол. 1997. - №2. - С.102-106.
84. Ефременко В.И., Тюменцева И.С. Магносорбенты в микробиологических исследования. Применение магнитных сорбентов в иммуноферментном и радиоиммунном анализах (Обзор литературы). -Ставрополь, 1995. 23 с. - Деп. в ВИНИТИ 28.12.95, № 3445-В95.
85. Ефременко В.И., Черченко И.И., Климова И.М. и др. Способ получения магнитных полиакриламидных микрогранул. //АС N1228489, СССР, МКИ А 61 К 47/00. Бюл. , 1986. № 16.
86. Ефременко В.И., Пушкарь В.Г., Трофимов Е.Н и др. Получение и применение магнитных сорбентов в методах иммуноанализа микроорганизмов //Журн. микроиол. 1989.- №12.-С.100-106.
87. Ефременко В.И., Тюменцева И.С., Василенко Н.Ф. и др. Разработка технологии производства магносорбентов, применяемых в методах иммуноанализа микроорганизмов (Заключительный отчет о НИР). -№Гос.регистрации 01930009323. Ставрополь, 1996. - 96 с.
88. Ефременко В.И., Тюменцева И.С., Афанасьев Е. и др. Новые препараты для экспресс-диагностики опасных инфекционных заболеваний иих применение в чрезвычайных ситуациях //Журн. Микробиол. 2001. - №6 (Приложение). - С.55-58.
89. Жарникова И.В. Разработка технологии композиционных магноиммуносорбентов и конструирование на их основе диагностических тест-систем для иммуноанализа возбудителей чумы и туляремии . Автореф. дис. . канд. биол. наук. - Ставрополь, 1995. - 24 с.
90. Жарникова И.В., Брыкалов А.В., Тюменцева И.С. Использование композиционных иммуносорбентов в иммуноферментном анализе (ИФА) для экспресс-диагностики возбудителей ООИ //Там же. -Ставрополь, 1994 а. С.41.
91. Жарникова И.В., Мирошниченко А.И., Брыкалов А.В. м др. Стабилизация композиционных магноиммуносорбентов (КМИС) методом лиофилизации // Там же. Ставрополь,1995 б. -С.89.
92. Закревский В.И. Иммуносорбенты и их применение в иммунологии микроорганизмов //Журн. микробиол. 1980. - № 4. - С.9-15.
93. Злобина Л.В., Ветлугина Т.В., Далечин Н.Б. Изучение роли водного фактора передачи в распространении вирусного гепатита А и дизентерии в условиях промышленного города // Журн. микробиол. 1992. -№6. - С.45-46.
94. Змушко Е.И., Белозеров Е.С., Иоанниди Е.А. Вирусный гепатит. Москва-Элиста, 2002. - 157 с.
95. Зыкова Т.А., Говорухина М.В., Асмолова Н.Ю. и др. Некоторые подходы к организации вирусологического контроля за объектами водоснабжения // Материалы VIII съезда Всерос. общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. М., 2002. - Т.3. - С.25-26.
96. Иванова О.Е., Еремеева Т.П., Конторович В.Б. Метод сбора и концентрирования кишечных вирусов из воды с помощью водопроницаемых пакетов с адсорбентом: Мет. рек. 1999. - 4 с.
97. Иовлев В.И. Реакция торможения гемагглютинации // Современные методы иммунологической диагностики вирусных инфекцийнаучный обзор) /Под ред. А. А Смородинцева. и Н.А Чайки. М., ВНИИМИ, 1981. - №4. - С. 9-13.
98. Кавина Т.В., Русанова А.К., Иванова Т.Г. и др. Эпидемиологические особенности вирусного гепатита А в Московском районе // Достижения отечественной эпидемиологии в ХХ веке. Взгляд в будущее: Тр. конф., (15-16 ноября 2001 г). СПб., 2001. - С.109-110.
99. Казанцев А.П., Матковский В.С. Справочник по инфекционным болезням. М.: Медицина, 1985. - С.35-46.
100. Каира А.Н., Ильясова Т.Н. Вакцинация против вирусного гепатита во время вспышки в закрытом детском учреждении // Материалы VIII съезда Всерос. общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. М., 2002. - Т.3. - С.29-30.
101. Калашникова Т.В., Карпович Л.Г., Никитюк Н.М. и др. Сравнительное изучение чувствительности и специфической активности иммуноферментной тест-системы для определения антител класса М к вирусу гепатита А // Журн. микробиол. 1991. - №5. - С.36-38.
102. Карань Л.С., Шипулин Г.А., Платонов А.Е. Лабораторная диагностика КГЛ методом полимеразной цепной реакции // Клиническая лабораторная диагностика. 2003. - №10. - С.50-54.
103. Карась Ф.Р. Арбовирусы в Киргиии //Арбовирусы: Тр. НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского АМН СССР. М., 1978. - С.40-44.
104. Карась Ф.П. Герштейн В.И., Чиров П.А., Варгина С.Т. Материалы изучения кровососущих клещей как переносчиков и хранителей арбовирусов в природных очагах Киргизии //Экология вирусов Казахстана и Средней Азии. Алма-Ата, 1980. - С.10-14.
105. Каретный Ю.В., Каганов Б.С., Добротворский И.Л. Вирусный гепатит А: состояние проблемы // Вопр. современной педиатрии. 2002. -Т.1, №1. - С.83-92.
106. Каримов С.К. Выявление и характеристика очагов арбовирусных инфекций Казахского региона //Журн. микробиол. 1982. - № 6. - С. 29-33.
107. Каримов С.К., Кирющенко Т.В., Реформацкая А.Ф. Случай лабораторного заражения Крымской геморрагической лихорадкой //Журн. микробиол. 1975. - №5. - С.135-137.
108. Каримов С.К., Львов Д.К., Кирющенко Т.В. Ареал арбовирусов в Казахстане //Проблемы медицинской географии Казахастана. Алма-Ата, 1981. - С.64-66.
109. Каримов С.К., Львов Д.К., Кирющенко Т.В. и др. //Актуальные вопросы гигиены и борьбы с инфекционными заболеваниями. Алма-Ата, 1980. - С.280-284.
110. Каринская Г.А., Бадалов М.Е., Примаков С.В. Выявление новых очагов Крымской геморрагической лихорадки (КГЛ) в Ростовской и
111. Луганской областях //Крымская геморрагическая лихорадка: Материалы III обл. науч.-практ. конф., Ростов-на-Дону, май, 1970 г. Ростов-на-Дону, 1970. - С.108-110.
112. Каринская Г.А., Чумаков М.П., Бутенко А.М. и др. Некоторые данные серологического обследования переболевших КГЛ в Ростовской области //Там же. 1970а. - С.45-50.
113. Каринская Г.А., Чумаков М.П., Бутенко А.М. и др. Обследование крови животных в Ростовской области к вирусу Крымской геморрагической лихорадки //Там же. 1970б. - С.55-61.
114. Каталог химических реактивов и высокочистых химических веществ. М.: Изд-во «Химия», 1971. - 648 с.
115. Кельцев Н.В. Основы адсорбционной техники. М.: Химия, 1984. - С.280.
116. Керимзаде К.Г. Вирусные гепатиты в Азербайджанской ССР. -Баку, 1986. С.175.
117. Кетиладзе Е.С., Алексеева И.Л., Шахгильдян И.Ф., Мейнард Д.Е. Специфические иммуноглобулины класса М у больных вируснымгепатитом А (диагностическое и прогностическое значение) // Вопр. вирусол. 1982. - №3. - С.49-52.
118. Киселев А.В., Лукьянович В.М., Никитин О.С. Влияние температуры гидротермальной обработки на изменение пор и скелета промышленного силикагеля //Коллоидн.журн. 1969. - Т.31, №3. - С.388-393.
119. Климова И.М., Ефременко В.И., Пушкарь В.Г. Магнитный иммуноферментный анализ антигенов Yersinia pestis //Журн. микробиол.-1989. -№7. С.62-66.
120. Климова И.М., Пушкарь В.Г., Ротов К.А. и др. Совершенствование методов диагностики особо опасных инфекций с использованием различных иммобилизованных систем (Заключительный отчет по НИР). № Госрегистрации 01.90.0.008098. - Волгоград, 1993. -43 с.
121. Климова Л.И., Казакова Т.И., Газиев Г-М. и др. Размещение и численности иксодовых клещей Hyalomma marginatum на территории Республики Дагестан в 2001 г. //Сб. науч. тр. Махачкала, 2002. - С.162-166.
122. Климова Л.И., Казакова Т.И., Газиев Г-М. и др. Сезонная динамика активности Hyalomma marginatum в разных ландшафтно-экологических зонах Республики Дагестан //Сб. науч. тр. Махачкала, 2002а. - С.167-170.
123. Клюева Е.В., Щербаков С.А., Головинская О.Н. и др. Изучение циркуляции вирусов Западного Нила и Крымской геморрагической лихорадки в южных районах Саратовской области // Материалы VIII съезда
124. Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. -М., 2002. Т.1. - С. 236-237.
125. Клячко-Гурвич А.А. Методы определения удельной поверхности //Изд. АН СССР. 1961. - № 10. - С. 1885.
126. Ковалев Н.Г. Государственный доклад «О санитарно-эпидемиологической обстановке в Ставропольском крае в 2002 г.». -Ставрополь, 2003. 154 с.
127. Ковальский Г.Н., Рыбкина Л.Г. Заболевания из группы геморрагических лихорадок в Степном районе Краснодарского края //Тр .Кубанского медицинского ин-та. Краснодар, 1957. - Т.15. - С.18-21.
128. Колобухина Л.В., Евченко Ю.М., Вышемирский О.И. и др. Изоляция трех штаммов вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки от больных в Ставропольском крае во время эпидемической вспышки в 2000 г. //Вопр. вирусол. 2001. - № 4. - С.15-18.
129. Компаниец А.А., Дорошенко Н.В., Стаханова М.В. и др. Закономерности эпидемического процесса при вирусных гепатитах А и В с различным уровнем заболеваемости. Сообщение I. Гепатит А. // Журн. микробиол. 1984. - №5. - С.70-74.
130. Кондратенко В.Ф. Значение иксодовых клещей в переносе и хранении возбудителя Крымской геморрагической лихорадки в очагах инфекции // Паразитол. 1976. -Т. Х, №4. - С.297-302.
131. Кондратенко В.Ф. Факторы определяющие численность клещей Hyalomma plumbeum Panz, и влияние последней на уровень заболеваемости Крымской геморрагической лихорадкой //Мед. паразитол. и паразитарные болезни. 1978. - Т. XLVII, №1. - С. 15-19.
132. Конторович В.Б., Иванова О.Е., Еремеева Т.П. и др. Метод концентрирования вирусов в водных объектах окружающей среды //Вопр. вирусол. 1996. - №1. - С.40-42.
133. Котти Б.К., Шапошникова Л.И., Евченко Ю.М. и др. К изучению Hyalomma marginatum в Ставропольском крае // Журн. микробиол. 2001. - №6 (Приложение). - С. 105-108.
134. Красильников И.В., Казанцева В.А., Иванова О.Е.и др. Выделение вирусов из воды с использованием пористых кремнеземов //Вопр. вирусол. 1985. - №5. - С.608-610.
135. Кузин С.Н., Павлов Н.Н., Семенов С.И. и др. Широта распространения вирусных гепатитов среди различных групп населения на территории Республики Саха (Якутия) //Журн. микробиол. 2004. - №1. -С.18-22.
136. Кузин С.Н., Павлов Н.Н., Семенов С.И. и др. Оценка заболеваемости и этиологической структуры острых и хронических вирусных гепатитов на территории Республики Саха (Якутия) //Вопр. вирусол. 2004.- №1. - С.20-23.
137. Куйма А.У., Пак Т.П.Биоценотические взаимоотношения вируса КГЛ, иксодовых клещей и их прокормителей //Мед. вирусология: Тр. ИПВЭ АМН СССР. М., 1975. - Т.22. - Вып.3. - С.107-113.
138. Курбанов М.М., Громашевский В.Л., Скворцова Т.М. и др. Выделение арбовирусов из клещей в зоне Каракумского канала // Экология вирусов: Тр. НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского АМН СССР. М., 1974а. - С.109-113.
139. Кусов Ю.Ю., Казачков Ю.А., Грабко В.И. и др. Обнаружение РНК вируса гепатита А методом молекулярной гибридизации //Вопр. вирусол. 1988. - № 5. - С.548-554.
140. Кучин В.В. Изучение экологии вируса КГЛ в Ростовской области по серологическим данным: Автореф. дис. . канд. биол. наук.- М., 1972.
141. Кучин В.В. Эколого-эпидемиологические аспекты Крымской геморрагической лихорадки //Сб. науч. тр. Новороссийск, 1994. -Вып.1. -С.310-311.
142. Кучин В.В. Крымская геморрагическая лихорадка в Ростовской области //Вопр. риккетсиологии и вирусологии. Астрахань-Москва, 1996. -С.93-95.
143. Кучин В.В., Каринская Г.А., Бадалов М.Е. Об антигенной взаимосвязи штаммов вируса Крымской геморрагической лихорадки, выделенных в разные годы. //Там же. С.37-41.
144. Кучин В.В., Янович Т.Д., Бутенко А.М. и др. Серологическое обследование сельскохозяйственных животных в Ростовской области на антитела к вирусу КГЛ //Там же. 1970а. - С.61-64.
145. Лаврова Н.А., Наволокин О.В. Твердофазный иммуноферментный метод для выявления арбовирусов и антител к ним //Арбовирусы. М., 1986. - С. 146-153.
146. Лазарев В.Н. Клиника Крымской-Конго геморрагической лихорадки //Российский медицинский журнал. 1997. - №3. - С.33-38.
147. Лазарев В.Н. Некоторые особенности клиники Крымской геморрагической лихорадки в Ростовской области // Советская медицина. -1978. №5. - С.132-136.
148. Лазарев Л.Н. Крымская геморрагическая лихорадка в Ростовской области: Автореф. дис. . д-ра мед. наук. М., 1978.
149. Лебедев А.Д. Современное состояние проблемы геморрагических лихорадок// Тез. докл. науч. конф., посвящ. 20-летию изучения клещевого энцефалита на Дальнем Востоке. Хабаровск, 1958.- С.37-39.
150. Лебедев А.Д., Пак Т.П., Бируля Н.Б. Экологическая география вирусов Крымской геморрагической лихорадки // ВИНИТИ. Итоги науки и техники. Сер.: Мед. география. М., 1977. - Т.8. - С.122-169.
151. Литвин В.Ю. Организация паразитарных систем природно-очаговых инфекций //Арбовирусы и арбовирусные инфекции: Тез. докл. инта вирусологии им. Д.И.Ивановского АМН СССР. М., 1989. - С.6-7.
152. Лобзин Ю.В., Жданов К.В., Волжанин В.И., Гусев Д.А. Вирусные гепатиты: клиника, диагностика, лечение. СПб., 2003. - 183 с.
153. Лунина М.А., Хачатурян А.А., Ромина Н.Н. и др. Колоидно-химические основы получения устойчивых золей ферромагнетитов в различных средах // Гидродинамика и теплофизика магнитных жидкостей: Всесоюз. симпозиум. Юрмала. ,1980. - С.13-20.
154. Львов Д.К. Вирусные гепатиты от А до G и далее //Журн. микробиол. 1997. - №1. - С.70-77.
155. Львов Д.К. Вирусные гепатиты // Вопр. вирусол. 2002. - №6. -С.44-46.
156. Львов Д.К. Значение вновь возвращающихся инфекций в биобезопасности //Вопр. вирусол. 2002. - №5. - С.4-7.
157. Львов Д.К., Ильичев В.Д. Крымская геморрагическая лихорадка //Миграции птиц и пере возбудителей инфекций ( Эколого-географические связи птиц с возбудителями инфекции). М., 1979. - С.68-71.
158. Мазрухо Т.В., Громашевский В.Л., Говорухина М.Ю. и др. Зараженность клещей Hyalomma marginatum Koch. 1844 вирусом Крымской-Конго геморрагической лихорадки в Ростовской области в эпидемический сезон 2000 г. //Вопр. вирусол. 2001. - №4. - С.20-21.
159. Макарова Т.Г., Быстрова Т.Н., Романова Т.В. и др. Эпидемиологические аспекты гепатита А в городе Нижнем Новгороде //Материалы VIII съезда Всерос. общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. М., 2002. - Т.3. - С.43-44.
160. Малеев В.В., Галимзянов Х.М., Бутенко А.М., Черенов И.В. Крымская геморрагическая лихорадка.- Москва-Астрахань, 2003.- 118 с.
161. Малышев В.В., Семена А.В. Вирусный гепатит А и другие актуальные вирусные кишечные антропонозы (этиология и клиникоэпидемиологическая характеристика) //Материалы VI Рос. съезда врачей-инфекционистов, 29-31 окт. 2003 г. СПб.,2003. - С231-232.
162. Мальков П.М., Журавлев В.И., Рогаткин А.К. и др. Природно-очаговые особо опасные инфекции на юге России, их профилактика и лабораторная диагностика: Сб. науч. тр. Астрахань, 2001. - С.319-320.
163. Мамедов М.К., Анджапаридзе А.Г., Балаян М.С. //Вирусные гепатиты. М., 1983. - С. 17-22.
164. Мамедов М.К., Балаян М.С., Анджапаридзе А.Г. Способ обнаружения вируса гепатита А и антител к нему. А. С. № 1076121. - Бюл. №8 от 28.02.84 г.
165. Маркешин С.Я., Евстафьев И.Л., Ковин В.В., Евстратов Ю.В. Иксодовые клещи в горной части Крыма // Мед. паразитол. и паразитарные болезни. 1992. - №4. - С. 34-37.
166. Маркешин С.Я., Смирнова С.Е., Евстафьев И.Л. Оценка состояния природных очагов Крымской-Конго геморрагической лихорадки в Крыму // Журн. микрбиол. 1991. - №9. - С. 47-50.
167. Маркин В.А., Махлай А.А., Ющук Н.Д. Вирусные геморрагические лихорадки: проблемы и размышления //Эпидемиология и инфекционные болезни. 1999. - №6. - С.4-6.
168. Маркин В. А., Марков В.И. Вирусные геморрагические лихорадки эволюция эпидемического потенциала // Журн. микробиол. - 2002. - №1. -С.01-98.
169. Матевосян К.Ш., Семашко И.В., Марутян Е.М. и др. Обнаружение в Армянской ССР вируса КГЛ в клещах Hyalomma plumbeum plumbeum //Мед. вирусология: Тр. ИПВЭ АМН СССР. М., 1974. - Т.22. -Вып. 2. - С.169-172.
170. Матевосян К.Ш., Семашко И.В, Рубин С.Г., Чумаков М.П. Антитела к вирусу КГЛ в сыворотках крови людей и крупного рогатого скота в Армянской ССР //Мед. вирусология: Тр. ИПВЭ АМН СССР. М., 1974а. -Т.22. - Вып. 1. - С.173-175.
171. Матусевич Н.П., Рахуба В.К. Получение ферромагнитных жидкостей методом пептизации. // Гидродинамика и теплофизика магнитных жидкостей: Всесоюз. симпозиум.- Юрмала, 1980.- С.21-28.
172. Мелиев А., Шермухамедова Д.А., Максумов С.С. и др. Изучение Крымской геморрагической лихорадки в Кашкадарьинской области Узбекской ССР // Экология вирусов Казахстана и Средней Азии. Алма-Ата, 1980. -С.30-35.
173. Меньшикова М.Г., Исаева Н.В., Асратян А.А. Сероэпидемиологическая диагностика гепатита А в детских учреждениях открытого и закрытого типа во время вспышек //Материалы VII съезда
174. Всерос. общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. М., 1997. - Т.2. - С.235-236.
175. Меньшикова М.Г., Сергевнин В.И., Новгородова С. Д. Особенности эпидемиологической диагностики при вирусном гепатите А //Материалы VI Российского съезда врачей-инфекционистов, 29-31 окт. 2003 г. СПб.,2003. - С. 248.
176. Мир вирусных гепатитов. 2001. - №4. - С.2-10.
177. Мирзоева Н.М. Итоги изучения арбовирусных инфекций в Азербайджане// Арбовирусы: Тр. НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского АМН СССР. М., 1978. - С.27-31.
178. Мукомолов С.Л., Шляхтенко Л.И., Valle M. и др. Характеристика манифестного и скрытого компонентов эпидемического процесса гепатита А в городах России //Журн. микробиол. 2001. - №3. -С.35-39.
179. Муромец В.И., Наградова Н.К. Иммобилизованные олигомерные сорбенты. М.: Наука, 1984. - С. 10.
180. Мышляева Л.А., Веселинова Стоянова Ц.Б., Багдасарьян Г.А. Метод индикации энтеровирусов в воде различных водных объектов с использованием природных сорбентов //Гиг. и сан. - 1985. - №2. - С.47-49.
181. Незлин Р.С. Строение биосинтеза антител. М., 1972. -210 с.
182. Неймарк Н.Е. Синтетические минеральные адсорбенты и носители катализаторов. Киев: Наукова Дума, 1982. - С.15-19.
183. Носков Ф.С., Жебрун А.Б. Реакция непрямой гемагглютинации //Современные методы иммунологической диагностики вирусных инфекций (научный обзор) /Под ред. А. А. Смородинцева и Н.А.Чайки. М.: ВНИИМИ, 1981. - №4. - С. 14-22.
184. Овчинников Ю.А., Свердлов Е.Д., Царев С.А. и др. Последовательность 3372 нуклеотидных звеньев РНК вируса гепатита А, кодирующая капсидные VP4-VP1 и некоторые неструктурные белки //Докл. АН СССР. 1985. - Т.285, №4. - С.1014-1018.
185. Оганесян А.С. Экология и географическое распространение арбовирусов в Армении // Достижения отечественной эпидемиологии в ХХ веке. Взгляд в будущее: Тр. конф. (15-16 нояб. 2001 г.). СПб., 2001. -С.150.
186. Омарова Б.К., Юсупова С.М., Батырова Б.А., Фараджева А.З. Применение иммуноферментного метода при ранней диагностике Крымской геморрагической лихорадки //Сб. науч. тр. Махачкала, 2002. - С.157-159.
187. Онищенко Г.Г. Распространение вирусных природно-очаговых инфекций в Российской Федерации и меры по их профилактике //Эпидемиология и инфекционные болезни. 2000. - №4. - С.4-8.
188. Онищенко Г.Г. Об эпидемиологической ситуации и заболеваемости природно-очаговыми инфекциями в Российской Федерации и мерах по их профилактике // Журн. микробиол. 2001.- № 3.- С. 22-28.
189. Онищенко Г.Г. О состоянии инфекционной заболеваемости в Российской Федерации в 2000 г. и принимаемых мерах по её стабилизации //Журн. микробиол. 2001. - №5. - С.3-7.
190. Онищенко Г.Г. О государственных мерах по предупреждению распространения в Российской Федерации заболеваемости инфекционными гепатитами //Эпидемиол. и инфекционные болезни. 2002. - №3. - С.4-8.
191. Онищенко Г.Г. Контроль и ликвидация инфекционных заболеваний стратегическое направление здравоохранения // Журн. микробиол. - 2002а. - №4. - С.3-16.
192. Онищенко Г.Г., Айдинов Г.Т., Москвитина Э.А. и др. Крымская-Конго геморрагическая лихорадка в Ростовской области: эпидемиологические особенности // Журн. микрбиол. 2000. - № 2. - С.36-41.
193. Онищенко Г.Г., Грижебовский Г.М., Ефременко В.И. Проблемы эпидемиологической безопасности в регионе Южного Федерального округа России. М., 2003. - С.25-32.
194. Онищенко Г.Г., Ефременко В.И. Крымская-Конго геморрагическая лихорадка на Юге России //Журн. микробиол. 2004. - №4. - С.86-90.
195. Онищенко Г.Г., Ефременко В.И., Ковалев Н.Г. и др. Эпидемиологические особенности Крымской геморрагической лихорадки в Ставропольском крае в 1999-2000 гг. //Журн. микробиол. 2001. - №6 (Приложение). - С.86-89.
196. Онищенко Г.Г., Марков В.И., Меркулов В. А. и др. Выделение и идентификация вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки в Ставропольском крае // Журн. микрбиол. 2001. - №6. - С. 7-11.
197. Онищенко Г.Г., Монисов А.А., Наркевич М.И. Заболеваемость вирусными гепатитами в стране и меры по её снижению // Журн. микробиол. 1999. - №5. - С.8-11.
198. Онищенко Г.Г., Москвитина Э.А., Ломов Ю.М. и др. Крымская-Конго геморрагическая лихорадка в Ростовской области: эпидемиологические особенности вспышки 1999 г. // Пробл. особо опасных инфекций. Саратов, 2000б. - Вып.80. - С. 3-18.
199. Онищенко Г.Г., Семенов, Чернявский В.П. и др. Клинико-лабораторная характеристика вспышечной заболеваемости вирусным гепатитом А в г.Олекминск //Журн. микробиол. 2003. - №2. - С.76-79.
200. Онищенко Г.Г., Федоров Ю.М., Жилина Н.Я. и др. Организация и проведение мероприятий против Крымской геморрагической лихорадки на территории природных очагов России: Метод. реком. М., 2001.-64 с.
201. Пак Т.П. О методике серологического исследования малых количеств крови с целью выявления Крымской геморрагической лихорадки //Вопр. вирусол. 1974. - №5. - С.627-628.
202. Пак Т.П. К 30-летию открытия и изучения Крымской геморрагической лихорадки // Журн. микрбиол. 1975. - № 7. - С. 142-146.
203. Пак Т.П. О роли сельскохозяйственных животных в экологии КГЛ //Экология вирусов: 10-й симпозиум. Баку, 1976. - С.95-100.
204. Пак Т.П. Проблемы сохранения арбовирусов в межэпидемический период //Арбовирусы: Труды НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского АМН СССР. М., 1978. - С.118-120.
205. Пак Т.П. Обзор контактных заражений Крымской геморрагической лихорадкой и лихорадкой Конго // Экология вирусов Казахстана и Средней Азии. Алма-Ата, 1980. - С.26-29.
206. Пак Т.П., Костюков М.А., Данияров О.А. и др. Арбовирусные инфекции в Таджикистане // Арбовирусы: Тр. НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского АМН СССР. М., 1978. - С.35-40
207. Пак Т.П., Михайлова Л.И. Крымская геморрагическая лихорадка в Таджикистане. Душанбе: Изд-во «Ирфон», 1973. -153 с.
208. Пашанина Т.П., Смирнова С.Е., Рыбкина Р.А. и др. Случай геморрагической лихорадки в Волгограде // Материалы науч.- практ. конф., посвящ. 100-летию образования противочумной службы России (16-18 сент. 1997 г.). Саратов, 1997. - Т.1. - С.120.
209. Перелатов В.Д., Востокова К.К. Эпидемиология КГЛ в Ростовской области //Вирусные геморрагические лихорадки: Тр. ИПВЭ АМН СССР. М., 1971. - Т.19. - С.174-179.
210. Петрова И.Д., Серегин С.В., Петров В.С. и др. Генетическая характеристика S- сегмента РНК двух штаммов вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки, изолированных на юге России и в Узбекистане //Вопр. вирусол. 2003. - №2. - С.8-12.
211. Платонов А.Е., Санникова И.В., Карань Н.С. и др. Клиническое значение определения вирусной нагрузки при Крымской геморрагическойлихорадке //Материалы VI Российского съезда врачей-инфекционистов, 2930 окт. 2003 г. Санкт-Петербург, 2003а. - С. 229.
212. Практическая химия белка. М.: Мир, 1989. - С.300-301.
213. Примаков С.В. Случай Крымской геморрагической лихорадки в Ворошиловградской области //Врачебное дело. 1971. - №12. - С.130-131.
214. Прометной В.И., Пичурина Н.Л., Налетов В.Г. и др. Активизация очага Крымской геморрагической лихорадки в Ростовской области //Сб. науч. тр. -Новороссийск, 1994. Вып. 1. - С.305-307.
215. Пушкарь В.Г., Климова И.М., Ефременко В.И. и др. Приготовление и применение магнитных сорбентов для изучения антигенов микроорганизмов : Мет. рек. Волгоград, 1984.-15с.
216. Пушкарь В.Г., Ефременко В.И. Климова И.М. и др. Приготовление и применение магнитных сорбентов для изучения антигенов микроорганизмов //Журн.микробиол. 1985. - №12. - С.30-34.
217. Савилов Е.Д., Мамонтова Л.М., Астафьев В.А. и др. Вирусное загрязнение источников водоснабжения и питьевой воды в городах Приангарья //Материалы VIII съезда Всерос. об-ва микробиологов, эпидемиологов и паразитологов. М., 2002. - Т.1. - С.95-96.
218. Савинская С.С., Анджапаридзе А.Г., Балаян М.С. и др. Опыт обследования больных инфекционным гепатитом с применением метода обнаружения вируса // Журн. микробиол. 1979. - №7. - С.96-100.
219. Савинская С.С., Тольская Е.А., Балаян М.С. Антитела к вирусу гепатита А у здорового населения Москвы // Журн. микробиол. 1982. - №5. - С.34-37.
220. Санитарные правила (СП. 1.2.011-94) «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности». М., 1994.
221. Санникова И.В., Клюшников Ю.И., Попов П.Н. и др. Клинико-эпидемиологическая характеристика Крымской геморрагической лихорадки в Ставропольском крае //Журн. микробиол. 2001. - №6 (Приложение). -С.89-92.
222. Сербезов В., Александров Э., Демичев И. и др. Приготовление иммуносорбентов к вирусам и риккетсиям с помощью глутаральдегида (ГА) и этилхлорфармиата (ЭХ) // Журн. микробиол. -1973. № 1. - С.54-56.
223. Сидорова Г.А, Андреев В.П. Некоторые черты экологии новых арбовирусов, выделенных в Узбекистане и Туркмении //Арбовирусы: Тр. НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского АМН СССР. М., 1978. - С.108-113.
224. Скуч Д., Уэст Д. Основы аналитической химии. М: Мир, 1979. - Т.1. - С.71-73.
225. Смирнова С.Е., Караванов А.С., Зимина Ю.В., Седова А.Г. Изучение вирусофорности клещей переносчиков возбудителя Крымской геморрагической лихорадки //Мед. паразитол. и паразитарные болезни. -1991. - №1- С.32-34.
226. Смирнова С.Е., Карганова Г.Г., Гмыль Л.В. Адаптация вируса Крымской-Конголезской лихорадки в культуре клеток Vero-E6 //Вопр. вирусол. 1997. - №1. - С.280-283.
227. Смирнова С.Е., Мамаев В.И., Непесова Н.М. и др. Изучение циркуляции вируса Крымской геморрагической лихорадки в Туркменской ССР //Журн. микрбиол. 1978. - № 1. - С.92-96.
228. Смирнова С.Е., Седова А.Г., Зимина Ю.В., Караванов А.С. Индикация антигена вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки в клещах переносчиках твердофазным иммуноферментным методом //Мед.паразитол. и паразитарные болезни. - 1989. - №1. - С.69-71.
229. Смирнова С.Е., Седова А.Г., Зимина Ю.В., Караванов А.С. О случаях Крымской-Конго геморрагической лихорадки в Астраханской области // Вопр. вирусол. 1990. - №3. - С. 228-231.
230. Смородинцев А. А. Реакция нейтрализации//Современные методы иммунологической диагностики вирусных инфекций (научный обзор) /Под ред. А.А. Смородинцева и Н.А Чайки. М.:ВНИИМИ, 1981. - №4. - С.3-7.
231. Смородинцев А.А., Казбинцев Л.И., Чудаков В.Г. Крымская геморрагическая лихорадка //Вирусные геморрагические лихорадки. Л., 1963. - С.172-197.
232. Соколов А.Е. Новое инфекционное заболевание. Крымская геморрагическая лихорадка (острый инфекционный капилляротоксикоз) //Крымская геморрагическая лихорадка. Симферополь, 1945. - С.5-12.
233. Соловьева С.В., Черкес Н.Н. Проявление эпидемического процесса в многолетней динамике вирусного гепатита А в Калининградскойобласти // Материалы VIII съезда Всерос. общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. М., 2002. - Т.3. - С.64-66.
234. Солодовников Ю.П. Марков В.Ю., Минаев В.А. и др. Эпидемиологические детерминанты неравномерного территориального распространения энтеральных вирусных гепатитов // Журн. микробиол. -1994. №6. - С.45-46.
235. Соринсон С.Н. Вирусные гепатиты. М., 1987. - 263 с.
236. Соринсон С.Н. Вирусные гепатиты. СПб.: Теза, 1997. - 2-е изд. - 325 с.
237. Сумароков А.А., Балаян М.С., Горбунов М.А., Наркевич М.И. Научные и практические задачи борьбы с вирусными гепатитами //Журн. микробиол. 1984. - №7. - С.16-21.
238. Тамбовцев Е.П., Ахметкалиев С.Г., Пятницкий Н.П. Методы статистической обработки результатов серологических реакций // Журн. микробиол. 1969.- №10.-С.26-31.
239. Тевеленок О.Г., Дранишникова М.Н., Ваняйкина Г.А. Эпидемиологические особенности заболеваемости гепатитом А в Красноярском крае //Материалы VIII съезда Всерос. общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. М., 2002. - Т.3. - С.73-74.
240. Тефанова В.Т., Тало Т.Г., Приймяги Л.С. Эпидемиологические аспекты вирусных гепатитов в Эстонии // Журн. микробиол. 1999. - №2. -С.39-42.
241. Тохов Ю.М. Иксодовые клещи Ставропольского края (распространение, особенности паразитизма, меры борьбы): Автореф. дис. . канд. биол. наук. Махачкала, 2004. - 26 с.
242. Тохов Ю.М., Сысолятина Г.В., Чумакова И.В., Попова Е.В. Особенности паразитарной системы Крымской геморрагической лихорадки на территории Ставропольского края в эпидсезон 2000 г. //Журн. микробиол. 2001. - №6 (Приложение). - С.98-99.
243. Тюменцева И.С. Научно-методические основы конструирования и усовершенствования производства диагностических тест-систем для выявления возбудителей ОО и других инфекций: Автореф. дис. . доктора мед. наук. -Саратов, 1996. -57 с.
244. Уйбо Р.М., Каск М.О. Антитела к специфическому липопротеиду печени при вирусных гепатитах А и В у детей // Вопр. вирусол. 1988. - №1. - С.27-29.
245. Уйбо Р.М., Крун К.Ю.Э. Определение антител к специфическому мембранному липопротеину печени // Иммунология. 1982. - №4. - С.80-82.
246. Учайкин В.Ф., Нисевич Н.И., Чередниченко Т.В. Вирусные гепатиты от А до TTV у детей. М.: Новая Волна, 2003. - 432 с.
247. Фрайфельдер Д. Физическая биохимия. М.:Мир, 1980. -С.73.
248. Хохлов Д. Т., Очарков П. И., Малышева В. В. Об организации раннего выявления больных вирусным гепатитом А // Воен. мед. журн. -1985. - №12. - С.37-40.
249. Хохлова Т.Д., Гаркавенко Л.Г., Никитин Ю.С. Адсорбция белков и ДНК на дегидроксилированных и алюминированных силохромах// Прикладная биохимия и микробиология.- М.: Наука, 1991. Т. 27, №5. - С. 720-724.
250. Чайка Н. А. Реакция иммунодиффузии в геле //Современные методы иммунологической диагностики вирусных инфекций (научный обзор) /Под ред. А.А. Смородинцева и Н.А. Чайки.- М.: ВНИИМИ, 1981.-№4. -С. 37-55.
251. Черенов И.В., Галимзянов Х.М., Оганесян Ю.В. и др. Геморрагический синдром при Крымской геморрагической лихорадке //Материалы VI Рос. съезда врачей-инфекционистов, 29-31 окт. 2003 г. -СПб.,2003. С.427-428.
252. Черенов И.В., Малеев В.В., Галимзянов Х.М. и др. Первичный аффект при Крымской геморрагической лихорадке //Материалы VI Рос. съезда врачей-инфекционистов, 29-31 окт. 2003 г. СПб.,2003. - С.428.
253. Чиковитова Н.М., Алейник М.Д., Сивухина Н.И. Оценка возможности использования слюны как субстрата для специфической диагностики гепатита А //Журн. микробиол. 1993. - №6. - С.109-110.
254. Чуйко А.А. Химия поверхности SiO2, природа и роль активных центров кремнезема в адсорбционных и химосорбционных процессах. Автореф. дис. . доктора хим. наук. - Киев, 1971. - 28 с.
255. Чуйко А. А., Горлов Ю.И. Строение поверхности пирогенного кремнезема, природа его активных центров и механизмы сорбционных процессов //Кремнеземы в медицине и биологии: Сб. науч. трудов. Киев-Ставрополь, 1993. - С.4-41.
256. Чумаков М.П. К 30-летию изучения в СССР КГЛ //Мед. вирусология: Тр. ИПВЭ АМН СССР. М., 1974. - Т.22, вып.3. - С.5-18.
257. Чумаков М.П. Крымская геморрагическая лихорадка. Обзорная информация // Медицина и здравоохранение. Эпидемиология. 1979. - Т.3. -С.10-33.
258. Чумаков М.П. Новая вирусная клещевая болезнь -геморрагическая лихорадка в Крыму (острый инфекционный капилляро-токсикоз) //Крымская геморрагическая лихорадка. Симферополь, 1945. -С.13-43.
259. Чумаков М.П. Новая вирусная клещевая болезнь -геморрагическая лихорадка в Крыму // Крымская геморрагическая лихорадка. Ставрополь, 1945. - С.1-13.
260. Чумаков М.П. Новое вирусное заболевание геморрагическая лихорадка в Крыму //Тез докл. и выступлений 1-й науч. сессии Ин-та неврологии АМН СССР. - М., 1946. - С.36-39.
261. Чумаков М.П., Бутенко А.М., Шалунова Н.В и др. Новые данные о вирусе возбудителе Крымской геморрагической лихорадки // Вопр. вирусол. - 1968. - №3. - С.377.
262. Шаханина К. Л., Гольдин Р. Б., Прусакова З. М. и др. Избирательное концентрирование бактерий и риккетсий при помощиполиконденсационных иммуносорбентов //Журн. микробиол.- 1969. № 9. -С.140-144.
263. Шаханина К.Л., Клеев Б.В., Фёдоров Ю.М. Приготовление различных иммуносорбентов и их использование для выделения антигенов и антител // Журн.Вопр.мед.химии. 1976. - Т.ХУП. - Вып.1.-С.127-136.
264. Шахгильдян И.В., Онищенко Г.Г., Счастный Э.И. и др. Актуальные вопросы эпидемиологии и профилактики энтеральных вирусных гепатитов в России //Журн. микробиол. 1994. - №5. - С.20-24.
265. Шевцова З.В., Бертрам Флемиг, Лапин Б.А. и др. Испытание культуральной инактивированной вакцины гепатита А на макаках резусах //Журн. микробиол. 1995. - №2. - С.55-59.
266. Шевцова З.В., Крылова Р.И., Лапин Б.А. и др. Хроническое течение спонтанного и экспериментального гепатита А у макак резусов с персистенцией вируса //Журн. микробиол. 1991. - №6. - С.68-73.
267. Шляхтенко Л.И. Вирусные гепатиты в Российской Федерации и проблемы их контроля //Идеи Пастера в борьбе с инфекциями: Материалы третьей междунар. конф., посвящ. 80-летию ин-та им. Пастера, СПб., 4-5 сент. 2003 г. СПб., 2003. - С.73-74.
268. Шувалова Е.П. Инфекционные болезни. М., 1990. - 560 с.
269. Шульдяков А.А., Лефтерова О.А., Еремин В.И. Иммунологическая структура населения в очаге гепатита А после вспышки инфекции и экстренной активной профилактики //Материалы VI Рос. съезда врачей-инфекционистов, 29-31 окт. 2003 г. СПб.,2003. - С.443-444.
270. Цукерман А.Дж. Три типа вирусного гепатита человека //Бюл. ВОЗ. 1978. - Т.56, №1. - С.3-18.
271. Юсупова С.М., Батырова Б.А., Омарова Б.К. и др. Изучение циркуляции вируса Крымской геморрагической лихорадки на территории Республики Дагестан //Сб. науч. тр. Махачкала, 2002. - С.161-162.
272. Ющук Н.Д., Блохина Н.П., Знойко О.О. и др. Вирусные гепатиты. Клиника, диагностика, лечение: Мет. рек. М.: ВУНМЦ МЗ РФ, 2000. - 44 с.
273. Ющук Н.Д., Гаджикулиева М.М., Знойко О.О. и др. Современные методы лабораторной диагностики острых вирусных гепатитов //Материалы
274. VI Рос. съезда врачей-инфекционистов, 29-31 окт. 2003 г. СПб.,2003. -С.449.
275. Ющук Н.Д., Знойко О.О., Климова Е.А. и др. Диагностическая значимость метода ПЦР при обследовании больных с HCV инфекции //Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний. М., 1998. - С.70-79.
276. Яровая О.П., Яровой Л.В. Эпидемиология и клиника клещевой геморрагической лихорадки в Ставропольском крае //Актуальные вопросы инфекционной патологии. Ставрополь, 1971. - С.174-177.
277. Яровой Л.В. К вопросу о геморрагической лихорадке в Ставропольском крае // Тр. Ставропольского краевого науч. об-ва микробиологов, эпидемиологов и инфекционистов, 1950-1956. Ставрополь, 1956. - С.48-50.
278. Яровой Л.В. О геморрагической лихорадке в Ставропольском крае //Врачебное дело (приложение). 1957. - С.74-80.
279. Яровой Л.В. Клинико-эпидемиологическая характеристика геморрагической лихорадки в Ставропольском крае //Тр. ИПВЭ АМН СССР. М., 1965. - Т.7. - С.31-34.
280. Яровой Л.В. Ставропольская геморрагическая лихорадка //Зоонозы (бруцеллез, лептоспироз и другие): Материалы конф., окт., 1966. -Ставрополь-на-Кавказе, 1966. С.277-283.
281. Яшина Л.Н., Петров В.С., Вышемирский О.И. и др. Характеристика вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки,циркулирующего в России и республиках Средней Азии // Вопр. вирусол. -2002. №3. - С.11-15.
282. Ajdukiewicz A., Mosley J.W. //Lancet. 1980.- Vol.2.- P.695.
283. Anderson C.R. Recent advances in arthropod-borne virus research in India //Bull. Natl. Inst. Sci. India. 1963. - Vol. 24. - P.205-216.
284. Andrew R. Epidemic hemorrhagic fever (40 cases from Korea) //Brit. Med. J. 1953. - Vol. 4819. - P. 1063- 1068.
285. Arauz-Ruiz P., Sundquist I., Garcia Z. et al. Presumed common sourse outbreaks of hepatitis A in a endemic area confirmed by limited sequencing within the VP1 region //J. Med. Virol. 2001.- Vol. 65, №3. - P.449-456.
286. Avrameas S.M., Guesdon J.L. Magnetic gel suitable to immunoenzimatic determination //Patent 4241176 (USA). -23.12.1980. -Int.Cl. C12Q1/66, CO7 G7/00.
287. Bardas V., Rosicky B. Природная очаговость некоторых вирусных инфекций человека в Словакии //Гиг., эпид., микроб., иммунол. 1959. - №1. - С.16-28.
288. Baroudy D.W.,Ticehurst J.R., Miele T.A. et al. Sequence analysis of hepatitis A virus cDNA coding for capsid protein and RNA polymerase //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. - Vol.82.- P.2143-2147.
289. Begum F., Wisseman C.L., Casals J. //Am. J. Epidem. 1970. -Vol.92. - P.197.
290. Benjiang M.A., Changshou H., Papa A. et al.Sequencing and comparative analysis of the complete glycoprotein gene of three Crimean Congo hemorrhagic fever virus Chinese isolates // Chin.J. Exp.Clin. Virol. - 2001. -Vol.15. - P.105-111.
291. Bing D., Wewand J., Stavitski A. //Proc. Soc. Exp. Biol. (N.Y.). -1967. Vol.124. - P.1166.
292. Blackburn N.K., Besseloar T.G., Shepherd A.J. et al. Preparation and use of monoclonal antibodies for identifying Crimean Congo hemorrhagic fever virus //Am. J.Trop.Med. Hyg. - 1987. - Vol.37. -P.392-398.
293. Bochm Y., Schneider M. Uber die Hydroxylgruppen an der Oberflachen des amprphen Siliciumdioxyds "Aerosil" und ihre Reactionen //Zahargah und allem. Chem. 1959. - 301. № 5-6. - S.326-335.
294. Boyden S.B. // J.Exp. Med. 1951. - Vol. 93. - P. 107.
295. Bradley D.W., Fields H.A., McCaustland K.A. et al. Biochemical and biophysical characterization of light and heavy density hepatitis A virus particles: evidence that HAV is an RNA virus // J.Med. Virol. 1978. - Vol.2. -P.175-187.
296. Bradley D.W., Maynard J.E., Hindman S.H. et al. //J. clin.Microbiol. 1977 - Vol.5. - P.521-530.
297. Bradley D.W., McCaustland K.A., Schreeder M.T. et al. Multype buoyant densities of hepatitis A virus in cesium chloride gradients //J.Med. Virol. -1977. Vol.1. - P.219-226.
298. Burt F.J., Leman P.A., Abbott J.C., Swanepoel R. Serodiagnosis of Crimean-Congo hemorrhagic fever //Epidemiol. Infect. 1994. - Vol.113. -P.551-562.
299. Burt F.J., Swanepoel R., Braack L.E. Enzyme-linked immunosorbent assays for the detection of antibody to Crimean-Congo hemorrhagic fever virus in the sera of livestock and wild vertebrates // Epidemiol. Infect. -1993.-Vol.111.-P.547-557.
300. Calisher C.H. Family Bunyaviridae //Classification and nomenclature of Viruses /Eds. Francki R.I.B. et al. //Arch. Virol. Suppl. 1991. - Vol.2.- P.273-283.
301. Camargo Z., Guesdon J.L., Drouhet E. Magnetic enzyme-linked immunosorbent assay (Melisa) for determination of specific IgG in paracoccidiodomycosis //Sabouraudia.- 1984. V.22, N 4. - P.291-299.
302. Casals J. Methods in Virology /Eds. Maramorosh K., Koproswki H. -New York, 1967. Vol.3. - P. 161-181.
303. Casals J. Antigenic similarity between the virus causing Crimean hemorrhagic fever and Congo virus // Proc. Soc. Exp. Biol. (N.Y.) 1969. - Vol. 131. - P.233-236.
304. Causey O.R., Kemp G.E., Madbouly M.H. et al. // Am. J. Trop. Med. Hyg. 1970. - Vol.19. - P.846.
305. Chapman L.E., Wilson M.L., Hall D.B. et al. Risk factors for Crimean-Congo hemorrhagic fever in rural northern Senegal //J. Infect. Dis. -1991.-Vol.164.-P.686-692.391. (Chard T.) Чард Т. Радиоиммунологические методы. Пер. с англ. М., 1981. - 247 с.
306. Chemla Y.R., Grossman H.L., Poon Y. et al. Ultrasensetive magnetic biosensor for gomogeneous immunoassay // Proc. Nat.Acad Sci. USA, 2000. -V. 97 (26). -Р.72.
307. Clark M.F., Adams A.N. Characteristics of the microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant virus // J. Gen. Virol. 1977. - V.36, №3. - P.475-483.
308. Clarke D.H., Casals J. // Am. J. Trop. Med. Hyg. 1958. - Vol.7. -P.561-573.
309. Clement G. Concept and desigh of an automated radioimmunoassay system using contanious flowand magnetic separation //J. Clin. Chem. Clin Biochem. 1977. - V. 15. - P.148.
310. Clerx J.P.M., Bishop D.H.L. Structural characteristics of Nairoviruses (genus Nairovirus, Bunyaviridae) //J.Gen. Virol. 1981. - Vol.55. - P.165-178.
311. Cook E.H., Bradley D.W., Gravelle C.R., Maynard J.E. Ultrastrutural studies of hepatitis A virus by electron microscopy // J. Virol. 1976. - Vol. 20. -P.687-689.
312. Coulepis A.G., Locarnini S.A., Westaway E.G. et al. //Intervirology. -1982. Vol.18. - P.107-127.
313. Daemer R.J., Feinstone S.M., Gust I.D., Purcell R.H. Propagation of human hepatitis A virus in African green monkey kidney cell culture: primary isolation and serial passage // Infect. Immun. 1981. - Vol.32. - P.388-393.
314. De Chastonay J., Siegl G. Effect of tree known antiviral substances on hepatitis A virus replication. In: Zuckerman A.J. ed. Viral hepatitis and liver disease //New York: Alan R. Liss. 1988. - P.956-960.
315. Deinhardt F., Holmes A.W., Capps E.B. Popper H. Stadies on the transmission of human viral hepatitis to marmoset monkeys. I. Transmission of disease, serial passages, and description of liver lesions //J.Exp. Med. 1967. -Vol.125. - P.673-688.
316. Deinhardt F., Gust J.D. Viral hepatitis // Bul. WHO. 1982. -Vol.60, №5. -P. 661-691.
317. Dienstag J.L. //Hum. Pathol. 1981. - Vol.12.- P. 1097-1106.
318. Dienstag J.L, Alling D.W., Purcell R.H. // Infect. Immunity. 1976. -Vol.13. - P.1209-1213.
319. Divizia M., Gnesivo C., Amore B. et al. Hepatitis A virus identification in an outbreak by enzymatic amplification // Eur. J. Epidemiol. -1993. Vol. 9, №2. - P.203-208.
320. Duermeyer W. Application of ELISA for the diagnosis and epidemiology of hepatitis A. Amsterdam, 1980. - P.45-120.
321. Duermeyer W., Van der Veen J. //Lancet. 1978. - Vol. 2. - P.684685.
322. Eisen H.N. //In: Microbiol. (Davis B.D. et al., eds). 1973. - P. 352.410. elAzazy O.M., Scrimgeour E.M. Crimean-Congo hemorrhagic fever virus infection in the western province of Saudi Arabia //Trans. R.Soc. Trop. Med. Hyg. 1977. -Vol.91. - P.275-278.
323. Elliot R.M. Molecular biology of the Bunyaviridae //Ibid. 1990. -Vol. 71. - P.501-522.
324. Feinstone S.M., Kapikian A.Z., Purcell R.H. Hepatitis A: detection by immune electron microscopy of a viruslike antigen associated with acute illness // Science, 1973. Vol. 182. - P.1026-1028.
325. Feinstone S.M., Moritsugu Y., Shih J.W.-K. et al. //In: Viral Hepatitis Franklin Institute Press. Philadelphia, 1978. - P.41-48.
326. Flick R, Flick K., Feldmann H., Elgh P. Reverse genetics for Crimean-Congo hemorrhagic fever virus //J.Virol. 2003. - Vol. 77, N10. -P.5997-6006.
327. Fody E.P. //J. med. Texnol. 1987. - Vol.4, №2. - P.54-58.
328. Foulke R.S., Rosato R.R., French G.R.Structural polypeptides of Hazara virus //Ibid . 1981. - Vol. 53. - P.169-172.
329. Фримель Г. (Friemel H.) Иммунологические методы. Пер. с нем.-М., 1987. С.390-395.
330. Gear J.H. Clinical aspects of African viral hemorrhagic fevers //Rev. Infect. Dis.- 1989. -.Vol.11,N 4. P.777-782.
331. Gear J.H., Thomson P.D., Hopp M. et al. //S. Afr. Med. J. 1982. -Vol. 52. - P.576-580.
332. Ghyka G., Pascaru A. Inhibition of passive hemagglutination a sensitive test for host antigen detection and evaluation of virus purity //Rev. Roum. Med. Ser. Virol. - 1976. - Vol. 27, N3. - P.167-172.
333. Gonzalez J.P., Camicas J.L., Cornet J.P. et al. Sexual and transovarian transmission of Crimean-Congo hemorrhagic fever virus in Hyalomma truncatum ticks //Res. Virol.- 1992.- Vol.143.- P.23-28.
334. Gonzalez J.P., Camicas J.L., Cornet J.P., Wilson M.L. Biological and clinical responses of west African sheep to Crimean- Congo hemorrhagic fever virus experimental infection //Res. Virol.- 1998.- Vol.149. P.445-455.
335. Gonzalez J.P., Cornet J.P., Wilson M.L., Camicas J.L. Crimean-Congo hemorrhagic fever virus replication in adult Hyalomma truncatum and Amblyomma variegatum ticks // Res. Virol. 1991. - Vol.142. - P.483-498.
336. Gonzalez J.P., Josse R., Johnson E.D. et al. Antibody prevalence against haemorrhagic fever viruses in randomized representative Central African populations //Res. Virol. 1989. - Vol. 140. - P.319-331.
337. Gordon S.W., Linthicum K.J., Moulton J.R. Transmission of Crimean-Congo hemorrhagic fever virus in two species of Hyalomma ticks from infected adults to cofeeding immature forms //Am. J. Trop. Med. Hyg. -1993. -Vol. 48. P.576-580.
338. Graff J., Normann A., Feinstone S.M., Flehmig B. Nucleotide sequence of wild type hepatitis A virus GBM in comparison with two cell culture - adapted variants // J. Virol. - 1994. - Vol.68. - P.548-554.
339. Gravell C.K., Hornbeck C.L., Maynard J.E. et al. // J. infect. Dis. -1975. Vol.131. - P.167-171.
340. Guesdon J.L., Avrameas S. Solid-phase enzyme immunoassay //Appl. Biochem. and Bioeng. 1981. - Vol. 3. - P.207-232.
341. Gupta H., Tandon B.N., Sriramachari S. et al. Animal transmission of enteric non A, non -B hepatitis infection to Macaca mulatta by fecal-oral route //Indian Med. Res. - 1990. - Vol.91. - P.87-90.
342. Gust I.D.,Dienstag J.L., Purcell R.H., Lucas C.R. //Brit. Med. J. -1977. Vol.1. - P.193-195.
343. Gust I.D., Lehmann N.I., Dimitrakakis M. A seroepidemiologic study of infection with HAV and HBV in five Pacific Islands //Amer. J. Epidemiol. -1979. Vol. 110. - P.237-242.
344. Hall W.T., Bradley D.W. //Proc. Soc. exp. Biol. (N.Y.). 1977. -Vol.155. - P.193-198.
345. Hilleman M., Provost P., Miller W. et al. //Am. J. med. Sci. 1975. -Vol. 270. - P.93-98.
346. Hollinger F.B., Bradley D.W., Dreesman G.R., Melnick J.L. //Amer. J. Clin. Path. 1976. - Vol.65. - P. 854-865.
347. Hollinger F.B., Bradley D.W., Maynard J.E. et al. //J.Immunol. -1975. Vol.115. - P.1464- 1466.
348. Hollinger F.B., Ticehurst J.R. Hepatitis A virus/ In: Fields B.N., Knippe D.M., Howley P.M, et al. //Ed. Virology.3-d edition. Lippin cott-Raven Rublishers, Philadelphia. - 1996. - P.2831-2843.
349. Hoogstraal H. The epidemiology of tick borne Crimean-Congo hemorrhagic fever in Asia, Europa and Africa // J.Med. Entomol. - 1979. - Vol.15. - P.307-417.
350. International Catalogue of Arboviruses. San-Antonio, 1985.
351. Jansen R.W., Siegl G., Lemon S.M. Molecular epidemiology of human hepatitis A virus defined by an antigen-capture polymerase chain reaction method //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1990. - Vol.87. - P.2867-2871.
352. Jaton J.-C., Brandt D.Ch., Vassalli P. (Жатон Ж.-К.,Брандт Д.Ч., Вассалли П.) Выделение и характеристика иммуноглобулинов, антител и их полипептидных цепей //Методы исследований в иммунологии. -М.: Мир, 1981. С.58-60.
353. Jiang S.C., Chu W. PCR detection of pathogenic viruses in southern California urban rivers //J. Appl. Microbiol. 2004. - Vol. 96, N 1. - P.17-28.
354. Jonsson V. Immobilization of immunoglobulins on selica surfaces stability //Biochem J.- 1985. apr.15. - V. 227.- № 2.- P.363-371.
355. Kapikian A.Z., Feinstone S.M., Purcell R.H. et al. //In: Perspectives in Virology. New York. - 1975. - Vol.9. - P.9-45.
356. Karan L.S., Sannikova I.V., Platonov A.E. et al. Viral Load at Crimean-Congo Hemorrhagic Fever and Its Clinical Significance //Int. Conf. on Emerging Infect. Dis, Feb. 29- March 3, 2004. Atlanta, 2004. - P.125.
357. Kaul H.N., Shetty P.S., Ghalsasi G.R., Dhanda V. Survey of ticks (Acarina: Ixodidae) for Crimean hemorrhagic fever virus activity in Jammu Kashmir state, India //Indian. J. Med. Res.- 1990. Vol.91. - P.5-8.
358. Keckwick R.A. //J. Biochem. 1940. - Vol. 34. - P. 1248.
359. Khan A.S., Maupin G.O., Rollin P.E. et al. An outbreak of Crimean-Congo hemorrhagic fever in the United Arab Emirates, 1994-1995 // Am. J.Trop. Med. Hyg. 1997. - Vol. 57, N5. - P.519-525.
360. Krawczynski K.K., Bradley D.W., Murphy B.L. et al. // Amer. J. clin. Path. 1981. - Vol.76. - P.698-706.
361. Kronick P.L., Campbell G.L., Joseph K. Magnetic microspheres prepared by redox polymerization used in a cell scparation based on gangliosides //Science. 1978. - Vol. 200. - P.1074-1076.
362. Krugman S., Friedman H., Lattimer C. //New Engl. J. Med. 1975. -Vol. 292. - P.1141-1143.
363. Landon J., Gilliland J., Wye L. et al. The develop of magnetic particle solid phase radioimmunoassay for tgyroxine (T 44 0) //Clin.Chem. 1976.- Vol.22. P.1165.
364. Lange W., Kohler H., Apodaca J. Der Nachweis von Hepatitis B (Surface) Antigen mit den Hepatest //Dtsch. med. Wschr. 1976. - Vol.101, N 35.- P. 1273-1276.
365. Lea T., Vartdal F., Davies C. Magnetic monosized polymer for fast and specific fractionation of humen mononuclear celles //Scand. J. Immunol. -1985. Vol.22. - N 2. - P.207-216.
366. Leduc J.W. Epidemiology of hemorrhagic fever viruses //Rev. Infect. Dis. 1989. - Vol.11, N4. - P.730-735.
367. Lemon S.M. // Abstr. 9th Int. Symp. Viral. Hep. and Liver Dis. -Rome, 1996. P.5.
368. Lemon S.M., Binn L.N. Antigenic relatedness of two strains of hepatitis A virus determined by cross neutralization //Infect. Immun. 1983. -Vol.42. - P.418-420.
369. Lemon S.M., Binn L.N., Marchwincki R.H. // J. clin. Microbiol. -1983. Vol. 17. - P.834-839.
370. Linemeyer D.L., Menke J.G., Martin-Gallardo A. et al. //J.Virol. -1985. Vol. 54. - P.247-255.
371. Locarnini S.A., Ferris A.A., Stott A.C., Gust I.D. //Intervirology. -1974. Vol.4. - P.110-118.
372. Locarnini S.A., Gurland S.M., Lehmann N.I. et al. // J. clin. Microbiol. 1978. - Vol.8. - P.277-282.
373. Logan T.M., Linthicum K.J., Bailey C.L. Replication of Crimean-Congo hemorrhagic fever virus in four species of ixodid ticks (Acari) infected experimentally //J. Med. Entomol.- 1990. Vol. 27. - P.537-542.
374. Logan T.M., Linthicum K.J., Moulton J.R., Ksiazek T.G. Antigen-capture enzyme-linked immunosorbent assay for detection and quantification ofvirus in the tick, Hyalomma truncatum //J. Virol. Methods.-1993.-Vol.42.-P.33-44.
375. Lucore Liza, Cullison Marc A., Jaykus Lee Ann //Appl. Fnd Environ. Microbiol. - 2000.- Vol. 66, N 5. Р. 1766 - 1769.
376. Ma B., Hang C., Papa A. Sequencing and comparative analysis of the complete glycoprotein gene of three Crimean-Congo hemorrhagic fever virus Chinese isolates. //Zhonghua Shi., Yan. He., Lin. Chuang. Bing. et al. 2001. -Vol. 15. - P. 105-111.
377. Marriott A.C., Nuttall P.A. Comparison of the S RNA segments and nucleoprotein sequences of Crimean-Congo hemorrhagic fever, Hazara, and Dugbe viruses //Virology. 1992. - Vol. 189, N2. - P.795-799.
378. Marriott A.C., Polyzoni T., Antoniadis A., Nuttall P.A. Detection of human antibodies to Crimean-Congo hemorrhagic fever virus using expressed viral nucleocapsid protein //J. Gen.Virol. -1994. Vol. 75 , N 9. - P.2157-2161.
379. Mathiesen L.R., Drucker J., Lorens D. et al. //J.infect. Dis. 1978. -Vol. 138. - P. 369-377.
380. Mathiesen L.R., Feinstone S.M., Purcell R.H., Wagner J. //Infect. Immunity. 1977. - Vol. 18. - P. 524-530.
381. Mathiesen L.R., Feinstone S.M., Wong D.C. et al. //J. clin. Microbiol. 1978. - Vol. 7. - P.184-193.
382. Maurer H. (Маурер Г.) Диск-электрофорез. Теория и практика электрофореза в полиакриламидном геле. М.:Мир, 1971. - 248 с.
383. Melnick J.L. // Intervirology. 1982. - Vol.18. - P. 105-106.
384. Miller W.J., Provost P.J., McAller W.J. et al. //Proc. Soc. exp. Biol.(N.Y.). 1975. - Vol. 149. -P.254-261.
385. Molday R.S., Gen S.P.S., Rembaum A. Application of magnetic microspheres in labeling and separation of cells //Nature. 1977. - Vol.268. -P.437-438.
386. Морган Капнер П., Паттисон Дж. Методы клинической вирусологии //Вирусология. Методы /Под ред. Б. Мейхи - М., 1988. - С.304-331.
387. Moritsugu Y., Dienstag J.L., Valdesuso J. et al. // Infect. Immunity. -1976. Vol.13. - P.898-908.
388. Muller J., Pfleiderer G. Factors affecting the activity of immobilized enzymes. I. Diffusional limitation //Hoppe-Seylers Ztschr.physiol. Chem 1980. -Vol. 361, N5. - P. 675-680.
389. Murphy B.L., Maynard J.E., Bradley D.W. et al. // Infect. Immunity.- 1978. Vol.21. - P.663-665.
390. Najarian R., Caput D., Gee W. et al. //Ptoc. nat. Acad. Sci. USA. -1985. Vol. 82. - P.2627-2630.
391. Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase-labelled antibody -a new method of conjugation //J.Histochem. Cytochem. 1974. - V.22, № 4. - P.1084-1091.
392. Okorie T.G. Comparative studies on the vector capacity of the different stages of Amblyomma variegatum Fabricius and Hyalomma rufipes Koch for Congo virus, after intracoelomic inoculation //Vet.Parasitol. 1991. - Vol. 38.- P.215-223.
393. Ouchterlony O. Antigen-antibody reactions in gel. // Arkiv for Kemi. Mineral. Ged. 1949. - Vol.261, N 14. - P.1-9.
394. Papa A., Bozovi B., Pavlidou V. et al. Genetic detection and isolation of crimean-congo hemorrhagic fever virus. Kosovo, Yugoslavia //Emerg. Infect. Dis. 2002. - Vol. 8 . - P. 852- 954.
395. Parry J.V., Perry K.R., Mortimer P.P. // Lancet. 1987. - Vol.11. - P.72.75.
396. Петров П.И., Агопян К. Един случай от кърлежна вирусна хеморагична треска //Съвременна мед. 1952. - №11. - С.96-103.
397. Polson A., Potgieter G.M., Largier J.E. et al/ The fractionation of protein mixtures by linear polymers of higth molecular weigh // Biochem. Biophis. Acta. 1964. - Vol.82. - P.463-475.
398. Provost P.J., Hilleman M.R. // Proc. Soc. exp. Biol. Med. 1979. -Vol.160. - P.213-221.
399. Provost P.J., Ittensohn O.L., Villarejos V.M. et al. //Proc. Soc. exp. Biol. Med. 1975. - Vol.148. - P.962-969.
400. Provost P.J., Miller W.H., Wolanski B.S. et al. //In: Viral Hepatitis. Philadelphia: Franklin Institute Press. 1978. - P.49-62.
401. Provost P.J., Wolanski B.S., Miller W.H. et al. // Proc. Soc. exp. Biol. Med. 1975. - Vol. 148. - P.532-539.
402. Purcell R.H., Dienstag J.L., Feinstone S.M , Kapikian A.Z. //Amer. J. med. Sci. 1975. - Vol. 270. - P.61-71.
403. Purcell R.H., Wong D.C., Moritsugu Y. et al. // J.Immunol. 1976. -Vol.116. - P.349-353.
404. Rakela J., Stevenson D., Edwards V.M. et al. // J. clin. Microbiol. -1977. Vol. 5. -P.110-114.
405. Rechav Y. Seasonal activity and hosts of the vectors of Crimean-Congo haemorrhagic fever in South Africa //S. Afr. Med. J. 1986. -Vol. 69.-P.364-368.
406. Richardson J., Hawcins P., Luxton R. The use of coated paramagnetic particles as a physical labels for use in magetj-immunossays. Biosens Bioelectron.- 2001. Vol. 16. - Р. 989.
407. Robertson B.H., Jansen R.W., Khanna B. et al. Genetic relatedness of hepatitis A virus strains recovered from different geographical regions //J.Gen. Virol. 1992. - Vol.73, №6. - P.1365-1377.
408. Robertson B.H.// Abstr. 9th Intern. Sympos. on Viral. Hepatitis and Liver Dis. Rome, 1996. - P.10.
409. Rodriguez L.L., Maupin G.O., Ksiazek T.G. et al. Molecular investigation of a multisource outbreak of Crimean-Congo hemorrhagic fever in the United Arab Emirates //Am. J. Trop. Med. Hyg. 1997. - Vol.57, N5. - P.512-518
410. Русев Л.Р. Заболевания от хеморагична треска в Свищов //Съвременна мед. 1954. - №2. - С.110-113.
411. Rychlik W., Rhoads R.E. A computer program for choosing optimal oligonucleotides for filter hybridization, sequencing and in vitro amplification of DNA//Nucl. Acids. Res. 1989. - Vol.17. - P. 8543.
412. Saluzzo J.F., Le Guenno B. Rapid diagnosis of human Crimean-Congo hemorrhagic fever and detection of the virus in naturally infected ticks //J.Clin.Microbiol.-1987.-Vol.25.-P.922-924.
413. Schwarz T.F., Nsanze H., Longson M. et al. Polymerase chain reaction for diagnosis and identification of distinct variants of Crimean-Congo hemorrhagic fever in the United Arab Emirates //Am. J. Trop. Med. Hyg. 1996. -Vol.66, N2. - P.190-196.
414. Shepherd A. J., Swanepoel R., Shepherd S.P. et al. Antibody to Crimean-Congo hemorrhagic fever virus in wild mammals from southern Africa //Am. J. Trop. Med. Hyg. 1987a. - Vol. 36. - P. 133-142.
415. Shepherd A.J., Leman P.A., Swanepoel R. Viremia and antibody response of small African and laboratory animals to Crimean-Congo hemorrhagic fever virus infection //Am. J. Trop. Med. Hyg. 1989. - Vol. 40. -P.541-547.
416. Shepherd A.J., Swanepoel R., Gill D.E. Evaluation of enzyme-linked immunosorbent assay and reversed passive hemagglutination for detection of Crimean-Congo hemorrhagic fever virus antigen //J. Clin. Microbiol. -1988.-Vol.26.-P.347-353.
417. Shepherd A.J., Swanepoel R., Cornel A.J. et al. Experimental studies on the replication and transmission of Crimean- Congo hemorrhagic fever virus in some African tick species //Am. J. Trop. Med. Hyg. 1989.-Vol.40.-326-331.
418. Shepherd A.J., Swanepoel R., Leman P.A. Antibody response in Crimean-Congo hemorrhagic fever //Rev. Infect. Dis. 1989. - Vol.11, N4. - P. 801-806.
419. Shepherd A.J., Swanepoel R., Leman P.A., Shepherd S.P Comparison of methods for isolation and titration of Crimean-Congo hemorrhagic fever virus //J.Clin. Microbiol. 1986. - Vol.24. - P.654-656.
420. Shepherd A.J., Swanepoel R., Leman P.A., Shepherd S.P. Field and laboratory investigation of Crimean-Congo hemorrhagic fever virus (Nairovirus, family Bunyaviridae) infection in birds //Trans. R. Soc. Trop. Med.Hyg.-1987.-Vol.81.-P.1004-1007.
421. Sicot C. //Concours. med. 1986. - Vol. 108, №32. - P.2633-2634/
422. Siegl G. //Hepatitis A / Ed. R. Gerety. Orlando, 1984. - P. 9-39.
423. Siegl G., Frosner G.G. // Virol. 1978. - Vol.26. - P.48-53.
424. Simpson D.I.H., Knight E.M., Courtois J. et al. //E.Afr. med. J. -1967. Vol.44. - P.87.
425. Скоупс Р. Методы очистки белков. Пер. с англ. В.К.Антонова. -М.: Мир. 1985. - С.56-90.
426. Smith K.O., Gehl W.D. Magnetic transfer devices for use in solid-phase radioimmunoassays and enzyme-linked immunosorbent assays //J. Infect. Diss. 1977. - Vol.136. - P.5329-5336.
427. Steibuch G., Andran R. The isolation of IgG from imanalion serra with the acid of caprilic // Arch. Of Biochem. Stray and Biophys. 1969. -Vol.139. - P. 279-284.
428. Suleiman M.N.H., Muscat-Baron J.M., Harries J.K. // Lancet. 1980. - Vol.2. - P.939-941.
429. Swanepoel R., Shepherd A.J., Leman P.A. et al. Epidemiologic and clinical features of Crimean-Congo hemorrhagic fever in southern Africa //Am. J. Trop.Med.Hyg.-1987.-Vol.36.-P.120-132.
430. Szmuness W., Dienstag J., Purcell R. et al. //New Engl. J. Med. -1976. Vol. 295. - P. 755-759.
431. Tanaka T., Matsunaga T. Detection of HbA (Ic) by boronate affinity immunoassay using bacterial magnetic particles // Biosens Bioelectron .- 2001. -Р. 1089.
432. Ticehurst J.R., Cohen J.I., Purcell R.H. Analyses of molecular sequences demonstrates than hepatitis A virus (HAV) is a unique picornavirus //In: Zuckerman A.J. ed Viral hepatitis and liver disease. New York: Alan R. Liss.-1988. P.33-35.
433. Tijssen P., Kurstak E. // Analyt. Biochem. 1984. - Vol.136. - P.451457.
434. Tikhonov S.N., Antonov V.A., Tkatchenko G.A. et al. Detection of Crimran-Congo hemorrhagic fever virus by PCR // «Natural Infectious Diseases»: Abctracts of scientific conference, 6 December 2002. Ulanbaator, 2001. - P.66-68.
435. Tomanovic S., Obradovic M., Gligic A. Serologic diagnosis of Crimean hemorrhagic fever in Kosovo and Metohia. // Vojnosanit. Pregl. 1996.-Vol.53.-P.477-481.
436. Warburg O., Christian W. Isolierung und Kristallisation des Garugsterments Enolase //Biochem. Z. 1941. - Vol.310. - P.384-421.
437. Weber D., Rutala W. Risks and prevention of nosocomial transmission of rare zoonotic diseases //Clin. Infect. Dis. -2001. Vol. 32. -P.446-456.
438. Williams R.J. AlBusaidy S., Mehta F.R. et al. Crimean-congo hemorrhagic fever: a seroepidemiological and tick survey in the Sultanate of Oman // Trop. Med. Int. Health. 2000. - Vol.5. - P. 99-106.
439. Wilson M.L., Gonzalez J.P., Cornet J.P., Camicas J.L. Transmission of Crimean-Congo hemorrhagic fever virus from experimentally infected sheep to Hyalomma truncatum ticks //Res. Virol. 1991. -Vol.142. - P.395-404.
440. Wilson M.L., LeGuenno B., Guillaud M. et al. Distribution of Crimean-Congo hemorrhagic fever viral antibody in Senegal: environmental and vectorial correlates //Am. J. Trop. Med. Hyg. 1990. - Vol. 43. - P.557-566.
441. Woodall J.P., Williams M.C., Simpsom D.I.H. //Ibid. 1967. -Vol.44. - P.93.
442. Yen Y.C., Kong L.X., Lee L. et al. Characteristics of Crimean-Congo hemorrhagic fever virus (Xinjiang strain) in China //Am. J. Trop. Med. Hyg. -1985.-Vol.34.-P.1179-1182.
443. Yotsuyanagi H., Lino S., Koike K. et al. Duration of viremia in human hepatitis A viral infection as determinated by polymerase chain reaction //J. Med. Virol. 1993. - Vol.40, №1. - P. 35-38.
444. Yu H. Comparative studies of magnetic particle-based solid phase fluorogenic and electrochemiluminescent immunoassay // J. Immunol. Methods.-1998.- Vol.218 (1-2).- P.1-8.
445. Zeller H.G., Cornet J.P., Camicas J.L. Crimean-Congo hemorrhagic fever virus infection in birds: field investigations in Senegal //Res. Virol. 1994. - Vol.145. -P.105-109.
446. Zeller H.G., Cornet J.P., Camicas J.L. Experimental transmission of Crimean-Congo hemorrhagic fever virus by west African wild ground-feeding birds to Hyalomma marginatum rufipes ticks //Am. J. Trop. Med. Hyg. -1994a. -Vol. 50. -P.676-81.
447. Zuckerman A.J. //Bul. WHO. 1970. - Vol. 42. -P.945-978.
448. А) Синтез композиционного магносорбента1. Получение гидрогеля
449. Рисунок 13. Принципиальная технологическая схема приготовления органокремнеземного композиционного магноиммуносорбента
-
Василенко, Надежда Филипповна
-
доктора биологических наук
-
Ставрополь, 2004
-
ВАК 03.00.23
- Усовершенствование методов индикации Francisella tularensis и leptospira interrogans с применением иммобилизованных систем
- Создание искусственного белка-антигена оболочки хантавирусов
- Совершенствование методов выявления вируса гриппа птиц А/Н5N1 путем создания высокочувствительных диагностических систем
- Разработка тест-системы для выявления вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции
- Разработка биотехнологии получения органокремнеземного аффинного сорбента для диагностики лихорадки Западного Нила
