Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Создание искусственного белка-антигена оболочки хантавирусов

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Создание искусственного белка-антигена оболочки хантавирусов"

На правах рукописи

Смирнова Мария Сергеевна

Создание искусственного белка-антигена оболочки хантавирусов

03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнология)

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва-2013

1 4 НОЯ ¿013

005537865

005537865

Работа выполнена в отделе геморрагических лихорадок и поисковых исследований Федерального государственного бюджетного учреждения «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П. Чумакова» Российской академии медицинских наук (г. Москва).

Научные руководители:

Шевелев Алексей Борисович, доктор биологических наук Дзагурова Тамара Казбековна, кандидат медицинских наук

Официальные оппоненты:

Лунин Владимир Глебович, доктор биологических наук, заведующий лабораторией биологически активных наноструктур ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи» Минздрава Россий

Филатов Феликс Петрович, доктор биологических наук, главный консультант научно-клинического отдела вирусной диагностики ФГБУ ГНЦ «Гематологический научный центр МЗ РФ»

Ведущая организация:

ФГУ «Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского МЗ РФ (г. Москва)

Защита состоится «_» _ 2013 г. в _ часов на заседании

диссертационного совета Д.006.027.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной биотехнологии по адресу: 127550, Москва, ул. Тимирязевская 42. Тел.(499) 976-65-44, факс: (499) 977-09-47, e-mail: iab@iab.ac.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной биотехнологии.

Автореферат разослан 9 ноября 2013 г., размещен на Интернет-сайте www.vniisb.ru « »_2013г.

Учёный секретарь диссертационного совета, » </ /

Кандидат биологических наук Вобликова В.Д.

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Получение рекомбинантных белков является типовой задачей, лежащей в основе многих биотехнологических проектов. Со времен появления модели лактозного оперона Жакоба и Моно молекулярные биологи и биотехнологи исходят из представления, что регуляции экспрессии гена осуществляется на уровне промотора и не зависит от структуры кодируемого белка. Эта модель вполне удовлетворительно описывает механизм регуляции работы генов в естественном окружении, но мало пригодна для создания продуцентов гетерологичных и, особенно, искусственно сконструированных белков. Общеизвестно, что использование даже самых современных и мощных бинарных промоторных систем, например, на основе промотора Т7, не дает гарантии детектируемого выхода продуктов слитых или укороченных производных природных генов. Еще реже удается добиться экспрессии iti vivo полностью синтетических искусственных генов. Мы предполагаем, что трансляционные системы tn vivo способны на стадии, предшествующей релизингу пептидил-тРНК, оценивать способность продукта к формированию компактной глобулярной структуры. Пептидные цепи, не способные к этому, подвергаются немедленной деградации. В рамках этой гипотезы универсальным подходом к конструированию эффективных продуцентов гетерологичных белков является обеспечение их способности к формированию устойчивой глобулярной структуры непосредственно в процессе трансляции.

Проблемы с конструированием рекомбинантных продуцентов часто возникают при работе с мембранными белками и белками с большим числом дисульфидных связей. Эти проблемы особенно часто встречаются при попытках получения в гетерологичных системах вирусных антигенов, как структурных так и неструктурных. Помимо низкого уровня накопления белка сложность составляет высокая токсичность многих вирусных антигенов для клеток рекомбинантных продуцентов. По-видимому, эта особенность структурных и части неструктурных вирусных белков связана с наличием у них способности образовывать мультимолекулярные сети в составе вирусной частицы. Многоцентровые взаимодействия вирусных белков друг с другом и с элементами клетки хозяина при гетерологичной экспрессии способны вносить хаос в передачу сигналов внутри цитоплазмы и с участием мембран. Таким образом, универсальным подходом к снижению токсичности вирусных антигенов могло бы стать их расчленение на отдельные домены, не способные образовывать сети.

Решение задачи по вычленению доменов в составе белков, структура которых неизвестна по причине их недоступности в очищенном состоянии, может быть решена тремя принципиально разными способами:

1. Предсказание доменной организации за счет поиска лучше охарактеризованных гомологов и аналогов;

2. Разработка мультиэпитопных синтетических белков на основе иммунодоминантных пептидов, идентифицированных в структуре белка с помощью пептидного эпитопного картирования;

3. Скрининговый подход, основанный на конструировании случайных двусторонних банков делеционных производных генов вирусных антигенов с отбором из него делеционных производных, обладающих способностью к хорошей экспрессии в клетках бактерий.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является на примере производных оболочечного белка Ge хантавирусов отработать универсальную методологию препаративного получения рекомбинантных вирусных антигенов, используя комбинацию различных методов.

В соответствии с целью поставлены следующие задачи:

1. Апробировать подход к конструированию эффективных продуцентов делеционных вариантов белка Ge хантавируеа Добрава, основанный на предсказании доменной организации этого белка по аналогии с оболочечными белками флавивирусов.

2. На основе анализа опубликованных данных пептидного эпитопного картирования белка Ge хантавируеа Добрава предложить структуру короткого иммунодоминантного пептида, добиться его высокоэффективной экспрессии в растворимой форме в составе би- и три-функциональных слитых белков.

3. На модели неструктурного белка NS5a ВГС отработать систему конструирования банков делеционных производных in vitro с помощью ПЦР со случайной затравкой и скрининга этого банка путём отбора клонов, обеспечивающих высокий уровень экспрессии трансгена.

4. С использованием скринингового метода получить набор делеционных производных белка Ge хантавируеа Пуумала, обладающих способностью к высокоэффективной экспрессии в Е. coli. Отобрать среди них иммуноположительные варианты.

5. Изучить и сопоставить технологические и иммунохимические свойства полученных рекомбинантных антигенов. Сконструировать на их основе лабораторные тест-системы для иммунохимической детекции специфических антител больных ГЛПС.

Научная новизна работы. Впервые в мире получены бактериальные продуценты рекомбинантных белков - производных поверхностного антигена Ge хантавируеа Добрава, обладающие нормальной жизнеспособностью и обеспечивающие возможность очистки продукта. Полученный результат впервые экспериментально подтвердил теоретическую модель доменной организации белка Ge, в том числе, предположение о необходимости удаления из структуры рекомбинантного белка петли слияния, обладающей кинетизмом и склонной к взаимодействия с мембранами. Отработана система оценки выхода рекомбинантных белковых продуктов в растворимой форме in vivo на основе цветных флуоресцентных белков. Создана и апробирована полностью оригинальная система конструирования банков делеционных производных на основе ПЦР с вырожденным праймером и векторная система для скрининга этих банков на способность к экспрессии in vivo. С помощью новой системы получены делеционные производные неструктурного белка NS5a вируса гепатита С и поверхностного белка Ge хантавируеа Добрава, не токсичные для клеток продуцента и обладающие способностью к высокоэффективной продукции в бактериях с образованием растворимого продукта.

Прастическая ценность работы. Наибольшей практической ценностью среди результатов работы обладает новая Система для конструирования и скрининга банков делеционных производных. Она позволяет в короткие сроки получать производные генов любых вирусных и других белков с оптимальными биотехнологическими характеристиками продукта: отсутствие токсичности, высокая растворимость и эффективность биосинтеза. В дальнейшем за счет иммуноскрининга таких белков могут быть отобраны варианты, обладающие наилучшими иммунохимическими характеристиками. Практической ценностью для конструирования серодиагностических тест-систем обладают белок NC-Dob на основе поверхностного антигена Ge хантавируеа Добрава, лишенный трансмембранного участка и петли слияния и белок S3 - производное неструктурного антигена NS5a вируса гепатита С, а также, возможно, производные поверхностного антигена Ge хантавируеа Пуумала, отобранные в результате скрининга. Практическую ценность для создания искусственных слитых белков с оптимальными биотехнологическими свойствами, в частности, пептидных антигенов без устойчивой собственной вторичной структуры, могут представлять плазмидные конструкции на основе цветных белков, фолдона фибритина фага JS98C3 и легкой цепи протеазного ингибитора PKPI-B1.

Апробация материалов диссертации. Основные материалы диссертационной работы доложены, обсуждены и одобрены на следующих научных конференциях: Bari Intern. Symposium on «Mitochondrial, physiology and pathology» IUDMB Sympos. SI Satellite events of the 33th FEBS Congress and 1 Ith IUBMB Athens; научной конференции «Фундаментальные исследования» Пунта Кана 13-22 апреля 2012 гг.

Публикации. По результатам выполненных исследований опубликовано 10 научных работ, в том числе 4 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ. Имеется один зарегистрированный патент РФ.

Объем и структура работы. Материалы диссертации изложены на_страницах

компьютерного текста и включают следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения, список использованной

литературы, приложения. Работа иллюстрирована_таблицами и_рисунками. Список

использованной литературы содержит_библиографических источников.

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1. Биологические материалы 2.1.1. Бактериальные штаммы и векторы

В работе для проведения генно-инженерных работ и наработки плазмидной ДНК использовался штамм Е. coli TGI (thi, proAB, ALacZ, F'[pro AB, ALacZ-M15]). Дня создания экспрессионных штаммов на основе промотора фага Т7 использовались штаммы C41(DE3, thi, proAB, ALacZ, F'[proAB, ALacZM15]) и JM109 (el4- (McrA-) recAl endAl gyrA96 thi-1 hsdR17(rK' mK+) supE44 relAl (lac-proAB) [F' traD36 proAB lacIqZM15] (Promega)). Векторами для получения экспрессионных конструкций служили pQE30 на основе промотора фага Т5 (Invitrogen) и рЕТ23а на основе промотора фага Т7 (Novagen). Необходимо отметить, что индукция промотора Т7 в клетках Е. coli требует РНК-полимеразы фага Т7, ген которой под контролем промотора Lac-UV обычно доставляется с помощью интегративной конструкции DE3. Эта особенность конструкции DE3 позволяет индуцировать ее экспрессию с помощью лактозы или IPTG. Промотор Т5 в составе pQE30 содержит лактозный оператор LacO, что также допускает его индукцию с помощью IPTG. Однако, на практике индукция pQE30 как правило слабо сказывается на уровне продукции рекомбинантных белков, кодируемых производными pQE30. В случае векторов серии рЕТ23 этот эффект выражен сильнее. Конструкция pQE30-GFP с геном зеленого флуоресцентного белка на основе pQE30 предоставлена Т.В. Кузнецовой (национальный институт здравоохранения, Таллинн). Конструкции pQE-YFP и pQE-RFP, содержащие гены желтого и красного флуоресцентного белка с добавленным 6His-TaroM на N-конце соответственно, были предоставлены Е.С. Маракасовой (университет им. Дж. Мэйсона, Вирджиния, США). Зелёный белок имеет максимум возбуждения 483 нм, и эмиссии 506 нм. Его ген получен от компании ЗАО «Евроген» (Москва) в составе конструкции pTagGFP2-C (кат. номер FP191). Красный белок TagRFP имеет максимум возбуждения 553 нм, и эмиссии - 574 нм. Его ген получен от компании ЗАО «Евроген» (Москва) в составе конструкции pTurboRFP-C (кат. номер FP231). Желтый белок TagYFP имеет максимум возбуждения 508 нм, и эмиссии - 524 нм. Его ген получен от компании ЗАО «Евроген» (Москва) в составе конструкции pTagYFP-C (кат. номер FP131). Конструкция pQ-Knl с геном ингибитора Кунитца PKPI-B1 из клубней картофеля предоставлена A.C. Сперанской (институт молекулярной биологии им. А.Н. Энгельгардта РАН). Конструкция pET-cd-32, содержащая ген фолдона фибритина фага JS98C3, была предоставлена О.Р.Латыповым (институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН).

2.1.2. Вирусный материал

Для клонирования гена Ос использовался вирусный материал штаммов Добрава Аа1854Ялре1зк и Пуумала К-27 из коллекции лаборатории геморрагических лихорадок ФГБУ «ИПВЭ им.М.П.Чумакова» РАМН.

2.1.3. Сыворотки больных

В работе использовались сыворотки больных ГЛПС из коллекции лаборатории геморрагических лихорадок ФГБУ «ИПВЭ им.М.П.Чумакова» РАМН, собранные и серотипированные H.A. Коротиной в 2007-2012 г.

Сыворотки больных гепатитом С из коллекции лаборатории этиологии, диагностики, эпидемиологии и профилактики вирусных гепатитов ФГБУ «ИПВЭ им.М.П.Чумакова» РАМН, собранные и серотипированные И.В. Гордейчуком.

2.2. Лабораторные реактивы

В работе использовались ферменты обмена ДНК, молекулярно-массовые стандарты ДНК и белка производства MBI Fermentas, обратная транскриптаза AMV (MBI Fermentas), термостабильная полимераза SmartTaq (Диалат, Москва). Для выделения фрагментов ДНК из агарозного геля использовался набор DNA Extraction kit (MBI Fermentas, каталожный номер #KÖ513) и Wizard PCR Preps DNA Purification System (Promega, каталожный номер #A2I80). Для выявления связывания иммуноглобулинов человека использовался меченный пероксидазой конъюгат против у-цепей IgG (Sigma, каталожный номер А8419). Для выявления связывания кроличьих антител использовался конъюгат козьих антител против суммарных иммуноглобулинов кролика с пероксидазой P-GAR-Iss (Имтек, Москва).

2.2.1. Олигонуклеотиды

В работе были использованы олигонуклеотиды, производства «ЗАО Синтол», следующего состава:

Dob-G2N GGGGTACCATGGAAGGATGTCTTTA(A/G)GTTTAACCTAGGAT Dob4 GGGGATCCATAACACCTCAATCAACTAGC Dob-G2CL ttc ccg gga ACTGCATGTGGGTTATATCTTGAC Dob2 GGGTCGACccAGTTCCCATTAAAGATACCCTT HS3 CAGGAAGAAATGCAACTTTGC HS4 GAAGGTTATCAAAGTCAATGT Lil CTAGCGGGGGCGCCGGAGGAATT Li2 AATTAATTCCTCCGGCGCCCCC Li4 GGAGATCTCTAGCGGGGGCGCCGGAGGAATT HT12 GGACTAGTATCAAAGTCAAGTGCCTT ECFP1 GGGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA ECFP2 GGAGATCTCTTGTACAGCTCGTCCATGCC Li3 GGAGATCTGCTAGCGGGGGCGCCGGAGGAATTAATTCGAG Lac-forl GGGTCGACACCATGATTACGGATTCACTG Lac-rev 1 GGAAGCTTATTTTTGACACCAGACCAACTG lb_6117_S L TCCCCCACGCACTATGTGCC lb_7780_AS_L CGGTARTGGTCGTCCAGGAC supt GGATCCGCAGCATCCGGAGCNNNNNN

supl-11 GGATCCGCAGCATCCGGAGCNNNNNNNNNNN supl-17 GGATCCGCAGCATCCGGAGCNNNNNNNNNNNNNNNNN ESI GGGGATCCGCAGCATCCGGAGC

ES3 GGGGATCCGCAGCATCCG PUU2 GCAAAACTTAGGGCTTATGTTCT PUU4 GTGAAAAGAGAGTACCAGAAAACA

2.3. Методы

2.3.1. Ферментация рекомбинантного продуцента

Для экспрессии конструкций на базе вектора pQE-ЗО и производных векторов с промотором гена 10 фага Т7 использовали штаммы C41(DE3) и JM109 (Promega). Для получения инокулята, в ходе ферментации использовали смыв биомассы рекомбинантного штамма со свежих чашек, имеющих возраст не более 30 ч с момента высева трансформантов на агаризованную селективную среду. Селективная среда представляла собой LB агар с 0,4% глюкозой и 100 мг/л ампициллина. Культивирование рекомбинантных штаммов на агаризованной среде происходило при температуре не более 30°С. Образовавшиеся колонии смывали с чашки диаметром 90 мм свежей средой LB объемом 6 мл и использовали полученный смыв для засева колб Эрленмейера объемом 750 мл, содержащих по 30 мл соответствующей жидкой среды с 100 мг/л ампициллина.

2.3.2. Подготовка образцов к электрофорезу

Биомассу собирали центрифугированием в 40 мл флаконах (8000 об/мин, 30 мин, центрифуга «Beckman» model J-21C). Биомассу промывали дистиллированной водой или физраствором, переосаждали и ресуспендировали в буфере (0,005М ЭДТА, 0,05 М Tris-HCl, рН=8,0), содержащим лизоцим (1 мг/мл). Клетки инкубировали в течение 1-2 ч при температуре 30°С. Затем клетки разрушали при помощи стеклянных шариков в течение 10 мин. Полученную клеточную суспензию разделяли на растворимую и нерастворимые фракции при помощи центрифугирования (8000 об/мин, 60 мин, центрифуга «Beckman» model J-21C). Нерастворимую фракцию ресуспендировали в буфере для обработки лизоцимом.

Для каждого образца отбирали по 20 мкл растворимой и нерастворимой фракции. Нерастворимую фракцию осаждали центрифугированием при 10000 об/мин в течение 10 мин на настольной центрифуге Eppendorf D5424, промывали последовательно 100 мкл воды и 100 мкл 50% ацетона, полученный осадок подсушивали при комнатной температуре в течение 20 мин., затем добавляли 20 мкл буфера Лэммли, содержащего 0,8 М мочевину и 0,1 М ß-меркаптоэтанола, тщательно суспендировали. Для проведения электрофореза в денатурирующих условиях образец прогревали при 99°С в течение 5 мин (термостат «Гном», ДНК-технология). Для проведения электрофореза в квазинативных условиях образец после суспендирования в буфере Лэммли сразу, без прогревания, наносили в лунки полиакриламидного геля. Растворимую фракцию осаждали добавлением 20 мкл 100% ацетона и последующим центрифугированием на настольной центрифуге, полученный осадок промывали 50% ацетоном, подсушивали при комнатной температуре в течение 20 мин., затем добавляли 20 мкл буфера Лэммли, содержащего 0,8 М мочевину и 0,1 М ß-меркаптоэтанол, тщательно суспендировали. Для проведения электрофореза в денатурирующих условиях образец прогревали при 99°С в течение 5 мин (термостат «Гном», ДНК-технология). Пробы наносили на форез из расчета 4 мкл на трек.

2.3.3. Выделение тотальной вирусной РНК из инфицированных клеток

1. Конфлюентный монослой клеток Vero-Еб в пластиковых матрасах с площадью поверхности 25 см2 заражали вирусом и культвировали в инкубаторе при +37°С в течение 4-6 дней после заражения.

2. Из матраса с клетками декантировали культуральную жидкость, промывали 4 мл физиологического раствора.

3. Добавляли 1 мл TRI reagent (Sigma) на матрас, вызывая лизис клеток. Время обработки не превышало 1 мин.

4. Клеточный гомогенат переносили в полипропиленовые пробирки объемом 1,5 мл.

5. В каждую пробирку с гомогенатом добавляли 500 мкл хлороформа и суспендировали на ручном встряхивателе. Центрифугировали на настольной центрифуге при 10000 об/мин без охлаждения.

6. Отбирали верхнюю (водную) фазу в чистую пробирку и добавляли равный объем хлороформа. Центрифугировали при 10000 об/мин на настольной центрифуге в течение 1 мин, получая разделение эмульсии на две фазы. Отбирали верхнюю фазу.

7. Для осаждения РНК добавляли к водному экстракту изопропанол в объемном соотношении1:1 к отобранной жидкости.

8. Для обессоливания осадка добавляли к нему 100 мкл 70% водного этанола, который затем удаляли с помощью водоструйного насоса. Осадок высушивали при +37°С.

9. Выделенную суммарную РНК растворяли в 50 мкл воды и визуализировали при помощи электрофореза в 1,3% агарозном геле.

2.3.4. Обратная транскрипция

Реакцию проводили в лабораторном термостате «Гном» (ДНК-Технология).

JVsJV» Реагент Конечная концентрация

1 Суммарная клеточная РНК 5-10 нг

2 смесь dNTP (2 мМ каждого) 0,2 мМ каждого dNTP

3 Случайная затравка, 100 пМ

4 5х буфер AMV Г

5 Фермент AMV Reverse Transcriptase 0,5 ед

5" буфер AMV: 250 мМ Трис-HCl (pH 8,5), 40 мМ MgCl2, 150 мМ KCl, 5 мМ ДГТ Режим реакции был следующим: 10 мин при +25°С, затем 60 мин при +50°С. Реакцию останавливали прогревание до +85 С в течение 5 мин.

2.3.5. Иммуноферментный анализ

Планшеты активировали белком-антигеном, внося по 100 мкл раствора с содержанием общего белка 10 мкг/мл в каждую лунку. Антиген разводили в карбонат-бикарбонатном буфере (КГБ), рН=9,6. После инкубации в течение 18 ч при 4°С плашки блокировали 0,1% раствором бычьего сывороточного альбумина по 100 мкл на лунку, инкубируя плашки в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем лунки отмывали и вносили по 50 мкл сывороток больных ГЛПС (вирусы Добрава, Пуумала), здоровых доноров или животных в серии разведений от 20 до 1280 раз в буфере для ИФА (PBS, 0,1% БСА, 0,01% твин-20) и оставляли на 2 часа при 37°С. После отмывки в лунки вносили меченные пероксидазой хрена IgG антивидовые антитела (Sigma) и инкубировали 1 ч при 37°С. Конъюгат удалали и промывали лунки на вошере или в ручную.

Для проведения ферментативной реакции вносили в лунки субстратно-индикаторную смеси (ТМБ 10 мкг/мл, пероксид водорода 0,01% в цитрат-фосфатном буфере). Через 20 минут реакцию останавливали, добавляя в каждую лунку 50 мкл 10% серной кислоты. Измерение поглощения при 492 нм проводили после отмывки и на спектрофотометре «Эфос 9305» (ОАО МЗ «Сапфир»),

2.3.6. Измерение р-галактозидазной активности

В лунках планшета смешивали по 20 мкл образца (растворимой или нерастворимой фракции грубого клеточного лизата) и 50 мкл ферментной смеси (Трис-глициновый буфер рН 8,6, содержащий 0,02% X-gal). Планшеты с реакционной смесью инкубировали при 37°С в течение 15 ч. Измерение оптической плотности проводили при 620 нм на спектрофотометре «Microplate Reader» Model 680, BioRad.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Необходимой предпосылкой для получения рекомбинантных производных поверхностных антигенов хантавирусов в бактериях является выявление в его структуре доменов, обладающих автономной структурной стабильностью (Cong, 2012). Для решения этой задачи возможно использование одного из двух возможных методов: рационального дизайна или скрининга. Современные принципы предсказания доменной структуры и рационального дизайна искусственных белков на этой основе, включающие общедоступные компьютеризованные сервисы, описаны в работе (Huang, 2013). Современные методы скрининга описаны в работе (Listwan, 2009). В нашей работе для получения антигенов поверхностных белков хантавирусов использованы оба способа.

3.1. Конструирование продуцентов антигенов вируса Добрава с использованием принципа рационального дизайна

3.1.1. Белки, моделирующие N- и С-концевые домены белка Gc хантавируса Добрава

Сопоставление данных анализа аминокислотной последовательности белков внешней оболочки Буньявирусов (хантавирусы, RVFV и UUKV) и других оболочечных вирусов, прежде всего, вируса Леса Семлики (SFV) (Hepojoki et a!., 2010) позволило сделать некоторые выводы о распределении функциональных детерминант в первичной структуре белка Gc. Этот белок, подобно антигену Е1 флавивирусов, а также буньявирусов RVFV и UUKV, принадлежит к белкам слияния II класса, а следовательно, в его составе имеется участок, выполняющий функцию так называемой «петли слияния», ответственной за проникновение нуклеокапсида из вторичной фагосомы в цитоплазму (Рис. 1). Этот участок достаточно консервативен для различных видов хантавирусов. У вируса Добрава он имеет последовательность CYGACTKYEYPWHTARCHFERDFEYENSWSCNPADCPGIGTGC. В составе вириона петля слияния находится во внутренней части глобулы Gc, но при закислении рН, вызванного попаданием вирусной частицы во вторичную фагосому, она перемещается на поверхность белка, где вступает в контакт с рецепторами и мембраной инфицируемой клетки. Таким образом, петля слияния не обладает автономно устойчивой вторичной структурой, а конфигурируется определенным образом только в присутствии мембраны. Кроме того, петля слияния обогащена заряженными и ароматическими остатками, имея в целом отрицательный заряд. Эта особенность придает ей склонность к агрегации, снижает растворимость белка.

Рис. 1. Схема доменной организации поверхностных гликопротеинов Gn и Gc, хантавирусов, образующихся при созревании продукта трансляции М-сегмента генома

В работе Hepojoki 2010 г путем сопоставления последовательности белка Gc с последовательностями и расшифрованными третичными структурами интегральных трансмембранных белков III класса был сделан расчёт, позволяющий предсказать расположение в ней петли слияния, ответственной за распознавание вирусом рецептора на клеточной поверхности в момент инфекции и выход нуклеокапсида из первичной фагосомы в цитоплазму инфицированной клетки. По аналогии с белками слияния флавивирусов, расчеты показали наличие в структуре белка Gc автономно стабильных доменов к N- (один) и С-концу (два). На основании этих выводов появилась возможность сконструировать мутантный вариант белка Gc, лишенный петли слияния и не способный неспецифически интегрироваться в мембраны. Можно ожидать что токсичность такого белка к клеткам продуцента будет существенно снижена, а иммуногенность не изменится, поскольку петля слияния является внутренним компонентом глобулы и не может участвовать в реакции нейтрализации вируса.

Эксперименты с белком вируса Добрава Lipetsk Аа были выполнены методами рационального дизайна. Три конструкции были предназначены для получения изолированных N- и С-концевых доменов, предсказанных в работе (Hepojoki et al, 2010). Анализ свойств продуцентов, несущих описанные конструкции, позволил подтвердить предположение о том, что токсичность белка Gc в значительной мере обусловлена наличием в его структуре петли слияния, трансмембранной и цитоплазматической части. Вместе с тем, ß-слойный домен, лежащий к N-концу от петли слияния также обладает повышенной склонностью к агрегации, что отрицательно сказывается на его выходе и снижает эффективность трансформации Е. coli соответствующей конструкцией. Искусственный вариант белка pQYNC-Dob, в котором N- и С-концевые домены вместо петли слияния сочленены через искусственный глицин-сериновый пептидный линкер, позволило получить штамм, обладающий высокой жизнеспособностью и продуктивностью (Рис. 2). Более того, такой белок с некоторым выходом принимал нативную конформацию в клетках продуцента, что проявлялось и в наличии у него способности к флуоресценции при возбуждении длинноволновым УФ светом.

N-Dob Km 1(0

Рис. 2. Схема конструкции рОУЫС-ОоЬ, кодирующей слитой белок в составе ЕУРР и делетированного производного белка вс хантавируса Добрава, лишенного петли слияния, трансмембранной и цитоплазматической частей.

3.1.2. Антигены, моделирующие шарнирный район на стыке двух С-концевых доменов хантавируса Добрава

В работе (Koch and Liang, 2003) методом эпитопного картирования с использованием синтетических пептидов в пределах белка Gc хантавируса Добрава выделена область, предположительно участвующая в формировании конформационно-зависимых эпитопов антител человека. Согласно данным работы (Hepojoki et al, 2010) эта область находится на границе двух С-концевых доменов белка Gc, один из которых отвечает за димеризацию этого белка. С учётом данных обеих работ нами впервые предложена последовательность фрагмента белка Gc, не проявляющая токсичности по отношению к клеткам продуцента и пригодная для высокоэффективной экспрессии в Е. coli. Этот пептид длиной 72 а.о получил рабочее название НТ.

В результате экспериментов по конструированию продуцентов антигенов хантавируса Добрава с использованием принципа рационального дизайна был получен набор конструкций, сведения о которых представлены в Таблице 1.

Таблица 1. Свойства конструкций, предназначенных для получения антигенов хантавируса Добрава____

Название конструкции N-концевой адаптер Описание антигена хантавируса Добрава С-концевой адаптер Масса продукта, кДа

1. pQYN-Dob 6His-EYFP Ы-концевой домен Ос нет 40

2. pQRC-Dob 6His-RFP С-концевые домены С с нет 60

3. pYNC-Dob 6His-EYFP Ы- и С-концевые домены йс, соединенные через пептидный линкер взамен петли слияния нет 72

4. рЕТ-НТ-Д12 Gly-Ser линкер Пептид НТ (шарнир между С-концевыми Продукт трансляции 7,3

доменами Gc) полилинкера рЕТ23а

5. рНК.6 6His-GFP Пептид HT Gly-Ser линкер, легкая цепь ингибитора Кунитца PKPI-B1 40

6. pGHF 6His-GFP, Gly-Ser линкер Пептид HT Фолдон фибритина фага JS98C3 47

7. pQL-HT 6His Пептид НТ Полноразмерная ß-галактозидаза Е. coli (LacZ) 107

Полученные конструкции исследовали по следующей схеме:

1. Оценка выхода и растворимости белковых продуктов;

2. Очистка и характеристика продуктов, включая антигенные свойства;

3. Исследования иммуногенности продуктов;

4. Разработка тест-систем для выявления антител против хантавирусов с использованием полученных рекомбинантных антигенов.

Первым этапом испытания эффективности и технологической пригодности созданных экспрессионных конструкций для получения производных белка Gc хантавируса Добрава стало исследование выхода целевого продукта при использовании различных штаммов Е. coli, оптимизация условий культивирования штамма и установление доли белка, остающегося в растворимой клеточной фракции после отделения агрегатов денатурированного белка (телец включения). При этом принимали в расчет возможность использования двух альтернативных технологических схем очистки продукта:

1. Получение продукта непосредственно в нативной (водорастворимой) форме с очисткой белка методом метаплохелатной хроматографии HaNi-NTA-агарозе;

2. Получение продукта в виде телец включения с последующей солюбилизацией, очисткой в денатурирующих условиях и (при необходимости) ренатурации.

Поскольку для вирусных антигенов, в целом, и для белка Gc хантавирусов, в частности, характерно токсическое воздействие на клетки бактериальных продуцентов, прежде всего, был проведен тест на эффективность трансформации Е. coli штаммов TG1, С41 (DE3) и JM109.

Затем проводилось исследование выхода белка при использовании различных штаммов. Выход белка оценивали с помощью денатурирующего электрофореза белков с последующей окраской геля Кумасси R-250 или Понсо-S после элекгропереноса белков на нитроцеллюлозную мембрану и денситометрией красителя, связанного с полосой белка с ожидаемого молекулярной массой. В качестве критерия нативности целевого белка использовали распределение продукта между водорастворимой и нерастворимой клеточными фракциями. Необходимо учитывать, что результаты этого теста во многом искажаются недостаточной стандартизируемостью процедуры гомогенизации клеточной культуры, которая не всегда приближается к 100% и с трудом может быть оценена. Кроме того, эффективность разделения клеточных фракций при центрифугировании также во многом определяется размерами мембранных липосом и фрагментов клеточной стенки, образующихся при гомогенизации биомассы. Таким образом, результаты тестов на растворимость белка всегда должны восприниматься с осторожностью. В качестве дополнительного критерия использовали флуоресцентную активность цветных белков, которая проявляется только при накоплении продукта в нативной форме.

Таблица 2. Характеристика свойств продуцентов на основе конструкций, предназначенных для получения антигенов хантавируса Добрава

Название Выход Выход продукта, Доля Масса

конструкции трансформации, мг/л растворимого продукта,

к.о.е. на 0,01 мкг продукта, % кДа

плазмидной ДНК

TG1 C41 JM109 TG1 C41 JM109 TG1 С41 JM109

1 pQYN-Dob 430 235 11 12 8 16 0 0 0 40

2 pQRC-Dob 10J 10J 56 22 19 12 0 0 0 60

3 pYNC-Dob 10J 10J 89 93 76 66 12 8 8 72

4 рЕТ-НТ-Д12 10J 10^ 120 12 17 9 0 0 0 7,3

5 рНКб 10J 10J 54 68 59 51 0 0 2 40

6 pGHF 560 210 42 67 43 52 2 5 5 47

7 pQL-HT 10J 10J 22 2 4 13 36 27 21 107

Результаты испытаний показали, что продукты большинства конструкций, включая изолированный пептид НТ - продукт конструкции рЕТ-НТ-Д12, накапливаются в нерастворимой клеточной фракции с выходом от 8 до 93 мг/л культуры. При этом пептид НТ и изолированный N-концевой домен белка Gc (продукт конструкции pQYN-Dob) накапливаются с наименьшим выходом.

Продукт конструкции pQRC-Dob образуется с несколько более высоким выходом (до 22 мг/л), причем на этом показателе, возможно, отрицательно сказываются свойства белка-носителя RFP, склонного к агрегации, и дающего меньший выход при экспрессии в Е. coli по сравнению с EYFP. На этом основании можно предположить, что именно N-концевой домен белка Gc хантавируса Добрава негативно влияет на жизнеспособность продуцентов полноразмерного Gc наряду с петлей слияния. Это предположение дополнительно подтверждается пониженным выходом трансформации Е. coli ДНК конструкции pQYN-Dob.

Наибольшей технологической эффективностью обладает продукт конструкции pYNC-Dob, представляющей собой полноразмерный белок Gc, лишенный петли слияния, трансмембранного и цитоплазматического доменов и слитый с белком-носителем 6His-EYFP. Этот белок накапливается в штамме-продуценте с выходом до 93 г/л, причем доля растворимого продукта достигает 10%. Этот продукт флуоресцирует в полиакриламидном геле при использовании «квазиденатурирующего» метода обработки образцов, подразумевающего обработку биомассы буфером Лэммли с SDS при комнатной температуре, без тепловой денатурации. Известно, что цветные флуоресцентные белки в этих условиях солюбилизируются, но сохраняют способность к флуоресценции, утрачивающуюся при кипячении образцов. Это результат показывает целесообразность решения удалить из состава Gc петлю слияния, дестабилизирующую структуру белка за счет склонности к информационной перестройке и обладающую высоким сродством к мембранам. Не исключено, что улучшение технологических свойств продукта конструкции pYNC-Dob может быть достигнуто за счет дополнительной оптимизации структуры глицин-серинового линкера, соединяющего N-концевой и С-концевые домены.

Характеризуя свойства конструкций, предназначенных для получения производных пептида НТ (шарнирный район на границе двух С-концевых доменов белка Gc) необходимо отметить эффективность решения по его размещению в центре трифункционального слитого белка. Конструкции рНКб и pGHF, созданные по этому принципу, позволяют в три раза повысить выход белка по сравнению с конструкцией рЕТ-НТ-Д12. Правда, при этом необходимо учитывать, что пептид НТ по массе составляет лишь 1/6 часть белков искусственных белков НК6 и GHF, таким образом, молярный выход продукта при использовании продуцентов на основе рНКб и pGHF не превышает выхода для рЕТ-НТ-Д12. Кроме того, использование конструкции pGHF, кодирующей пептид НТ в слиянии с внутримолекулярным шапероном - фолдоном фибритина фага JS98C3 и дополнительным

пептидным линкером на С-концевой границе GFP, позволяет добиться частичного перехода целевого продукта в растворимую фазу (с выходом <5% от общей массы целевого белка в культуре). В совокупности эти данные позволяют утверждать, что нами разработан эффективный метод получения пептида НТ. Этот подход, вероятно, может быть применим и для создания продуцентов других пептидов-антигенов, имеющих технологическую ценность.

Характеризуя особенности белка, в котором носителем пептида НТ выступает LacZ, необходимо отметить низкий уровень его продукции и растворимости, неожиданные для собственного белка Е. coli. Однако, необходимо отметить, что эти особенности присущи ß-галактозидазе и при естественной экспрессии в штаммах дикого типа. В то же время, наличие у белка HT-LacZ ферментативной активности, выявляемой с помощью хромогенного субстрата X-gal, резко повышает чувствительность и специфичность его детекции как в цельных клетках, так и во фракциях клеточного лизата. Благодаря этому удалось достоверно обнаружить и количественно оценить уровень накопления растворимого белка. Более того, белок HT-LacZ в дальнейшем был использован для создания тест-системы твердофазного иммуноферментного анализа «обратный сэндвич», в котором выполнял функцию антивидового конъюгата для выявления иммунных комплексов антител человека, сформированных на поверхности планшета. Таким образом, белок HT-LacZ оказался ценным исследовательским инструментом, позволившим охарактеризовать биотехнологические и иммунологические свойства пептида НТ.

В заключение необходимо отметить роль штамма Е. coli в повышении выхода продукта. Для большинства конструкций наилучшие результаты были достигнуты при использовании наиболее быстро растущего штамма TG1. Однако, в случае конструкции рЕТ-НТ-Д12 наилучшие результаты дал штамм C41(DE3). Этот результат, вероятно, объясняется наличием в штамме C41(DE3) эписомы DE3, несущей ген РНК-полимеразы фага Т7, которая, в свою очередь, запускает работу промотора Т7 в составе вектора рЕТ23а, на базе которого получена конструкция рЕТ-НТ-Д12. Все прочие конструкции, описанные в настоящей главе, получены на базе вектора pQE30 с промотором фага Т5, который не зависит от активности полимеразы фага Т7. Кроме того, согласно утверждениям разработчиков С41, этот штамм обладает повышенной устойчивостью к токсичным гидрофобным рекомбинантным продуктам. В то же время, конструкции pQYN-Dob и pGHF, проявляющие явные признаки токсичности для всех штаммов, оказались менее совместимы со штаммом C41(DE3), чем с более традиционным TG1. Это позволяет считать наиболее принципиальным эффект наличия в штамме эписомы DE3.

В случае конструкции pQL-HT наилучшие результаты были получены при использовании медленно растущего штамма JM109, имеющего ноль-мутацию в гене reck. С учётом сделанных наблюдений, в дальнейших экспериментах по препаративной наработке белка для конструкции рЕТ-НТ-Д12 в качестве штамма-хозяина использовался C41(DE3), для pQL-HT - JM109, для прочих конструкций -TG1.

3.1.2.1. Исследования иммуногенности белка НТ-Д12

Полученный препарат белка НТ-Д12 был использован для выработки поликлональных антител путем иммунизации кроликов. В эксперименте участвовало два беспородных кролика, которые подвергались четырехкратной иммунизации. Интервал между первой и второй иммунизацией составил 4 недели, в дальнейшем иммунизацию проводили 1 раз в 2 недели. Кровь отбирали из ушной вены дважды от каждого животного через две и три недели по окончании последней иммунизации. Сыворотку получали путем декантирования со сгустка после инкубации цельной крови при +4°С в течение 4 часов. Всего было получено 50 мл сыворотки от каждого животного.

Наличие специфических антител в иммунных сыворотках кроликов исследовали методом иммуноблотгинга с применением в качестве антигена белка НТ-Д12 и хроматографически очишенного лизата вируса Добрава.

Проведенный электрофоретический анализ показал высокую специфичность реакции антител, выработанных обоими кроликами, по отношению к гомологичному антигену. Сыворотки не снижали реакционной способности при разведении до 4000 раз и не реагировали с примесными белками Е. соИ, содержащимися в препарате НТ-Д12 в концентрации до 15% от общего белка. Преимунная сыворотка кролика №1 не обнаружила какой-либо реакции с использованным антигеном.

Убедившись в высокой активности антител, накопившихся в сыворотках кроликов по отношению к антигену НТ-Д12, мы приступили к изучению реакционной способности этих антител в отношении белков вируса Добрава. Эксперимент проводили также методом иммуноблотганга, используя в качестве антигена хроматографически очищенный лизат вируса Добрава.

кДа * ,

120 (

97

45

I

30 ' Г

18

14 ! I

1 2 3

Рис. 3 Изучение иммунологической реакции антител иммунной сыворотки кролика №1, полученной при иммунизации белком НТ-Д12, с антигенным материалом лизата хантавируса Добрава. Белки концентрированного лизата вируса Добрава разделены в денатурирующем 12,5% ПААГ, перенесены на нитроцеллюлозную мембрану и окрашены: (1) преимунной сывороткой кролика №1; (2) иммунной сывороткой кролика (визуализация связывания - с помощью антивидового конъюгата козьих антител против суммарных иммуноглобулинов кролика с пероксидазой хрена; (3) сывороткой крови больного ГЛПС (инфицирован вирусом Добрава): визуализация связывания - с помощью антивидового конъюгата козьих антител против суммарных иммуноглобулинов человека с пероксидазой хрена. Стрелкой отмечено расположение белка вс (~50 кДа).

Анализ данных Рис. 3 показывает, что иммунная сыворотка кролика №1, в отличие от его же преимунной сыворотки, выявляет единственную полосу белка, соответствующую -50 кДа. Эта же полоса окрашивается антителами больного ГЛПС, инфицированного вирусом Добрава. Эта полоса соответствует индивидуальному белку внешней оболочки вс, наиболее иммуногенному в составе вируса, хотя другие антигены (йп и К) с учётом гликозилирования практически не отличаются от него по подвижности.

3.1.2.2. Тест-система на основе белка НК6

Анализ проводился методом тИФА с сорбцией рекомбинантного белка-антигена НК6 на поверхность планшета (Рис. 4). Использовался очищенный белок НК6 в денатурированной форме. Реакция демонстрирует специфичность созданного прототипа диагностикума к виду хантавируса: антитела всех обследованных пациентов, инфицированных вирусом Добрава или близким вирусом Хантаан, показывают реакцию, отличную от нормы. При обследовании двух пациентов, инфицированных вирусом

Пуумала, только один обнаружил реакцию с антигеном НК6, а второй не отличался по уровню сигнала от здоровых доноров. При использовании в качестве диагностического антигена Ы-белка отличий в реакционной способности антител больных, инфицированных вирусами Пуумала и Добрава, практически не наблюдается. Созданный прототип тест-системы на основе белка НК6 обладает более высокой способностью к идентификации вида хантавируса, чем существующие диагностикумы на основе Ы-белка.

—Хантэан (3} Добрэаэ(В) -«—Пуумала (2) ——Здоровые (4)

Рис. 4 Изучение антигенной активности белка НК6 методом твердофазного

иммуноферментного анализа. Планшеты активированы

белком-антигеном НК6 и заблокированы нормальной сывороткой кролика в разведении 100 раз. Сыворотки больных ГЛПС (вирусы Добрава, Пуумала) и здоровых доноров раститровывали в серии разведений от 20 до 1280 раз с шагом 2 раза. На оси ординат указана величина А492 каждой точки за вычетом фона (контроль без добавления сыворотки человека).

А492 при разведении сыворотки в 160 раз

3.1.2.3. Тест-система на основе белка СНГ

В качестве формата проведения анализа был выбран вариант тИФА с непосредственной сорбцией рекомбинантного белка-антигена ОНИ на поверхность иммунологического планшета (Рис. 5). Препаратом для сравнения служил белок-антиген НК6.

А492

разведение разведение, раз

а) б)

Рис. 5. Изучение антигенной активности белка вНР методом твердофазного иммуноферментного анализа. Планшеты активированы белками-антигенами СОТ (а) и НК6 (б). Пулы сывороток крови больных ГЛПС (вирусы Добрава, Пуумала, Хантаан) и здоровых доноров использовали в разведении от 50 до 3200 раз с шагом 2 раза. На оси ординат указана величина А492 каждой точки за вычетом фона (контроль без добавления сыворотки человека). На графиках представлены реакции белков-антигенов с сыворотками крови больных ГЛПС (1) и с сыворотками крови здоровых доноров (2).

3.1.2,4. Тест-система типа «обратный сэндвич» на основе белка НТ-Ьасг в качестве визуализирующего антивидового конъюгата

Ранее проведенный эксперимент по использованию в качестве антигена для выявления специфических антител человека к вирусу Добрава белка НК6 показало его принципиальную пригодность для решения этой задачи. Несомненно, в крови больных ГЛПС присутствуют антитела к пептиду НТ. Однако, соотношение уровня неспецифического сигнала с нормальными антителами и специфического сигнала оказалось неблагоприятным и не позволило рекомендовать традиционно построенную систему непрямого тИФА на основе НК6 в качестве прототипа диагностикума для клинического применения. С целью повышения уровня специфичности реакции было принято решение заменить систему идентификации иммунных комплексов НК6 и специфических антител из сыворотки больных: взамен традиционного антивидового конъюгата против суммарных иммуноглобулинов человека в этом качестве был использован белок U^-LacZ. Принцип его использования основан на двух- или поливалентности антител любых классов. Таким образом, в составе иммунных комплексов всегда остаются незанятые антиген-связывающие центры антител, способные реагировать с антигеном, идентичным уже использованному. Реакционная способность этих центров нередко снижена из-за стерических ограничений, обусловленных низкой подвижностью главного шарнира иммуноглобулинов и их большими размерами. Однако, часть таких центров все же остаётся доступной для связывания.

Очевидно, что структура и иммунохимические свойства пептида НТ в составе белков НК6 и HT-LacZ идентичны, поэтому НТ-Ьас2 способен выявлять комплексы антител, сорбированных на подложке за счет связывания нанесенного НК6.

Рис. 6. Испытания системы «обратный сэндвич» с использованием белка НК.6 в качестве антигена для активации планшета и белка НТ-Ьас2 в качестве замены вторичных антител (антивидового конъюгата). А) связанные на подложке антитела визуализированы антивидовым конъюгатом против человека; Б) связанные на подложке антитела визуализированы белком НТ-Ьасг.

Полученные данные (Рис. 6) свидетельствуют о принципиальной возможности использования предлагаемой системы. Результаты с использованием белка НТ-Ьасг в качестве средства выявления иммунных комплексов полностью совпадали с аналогичными результатами, полученными при использовании традиционного антивидового конъюгата.

Эти данные дополнительно подтвердили существование в сыворотке больных ГЛПС антител к пептиду НТ (шарнир на границе двух С-концевых доменов белка Ge). Однако, чувствительность и разрешающая способность системы «обратный сэндвич» оказалась недостаточной для её практического применения в клинической диагностике ГЛПС.

3.2. Оптимизация технологических свойств антигенов с помощью конструирования и скрининга банков делеционных производных

Наряду с рациональным дизайном антигенов - производных белка Ge в рамках нашей работы был теоретически предложен и апробирован скрининговый метод решения той же задачи путём изготовления банка делеционных производных этого гена и отбора наиболее хорошо экспрессирующихся производных, среди которых затем методом иммуноскрининга отбираются иммунопозитивные варианты.

Ключевым элементом нового подхода к конструированию банка является использование ПЦР со случайной затравкой в качестве способа наработки необходимого количества материала для конструирования банка. Главной технической проблемой, успешно решенной в рамках эксперимента, является устранение принципиального ограничения метода ПЦР со случайной затравкой, заключающегося в способности случайной затравки образовывать в растворе дуплексы, самопроизвольно размножающиеся при проведении ПЦР в отсутствие специфической ДНК-матрицы.

На первой стадии конструирования банка in vitro были последовательно выполнены следующие операции:

(1) в случайные сайты целевого гена, находящегося в форме линейного фрагмента ДНК, внесли однонитевые разрывы с помощью ограниченного гидролиза панкреатической дезоксирибонуклеазой 1 (ДНКазой);

(2) провели расширение полученных брешей в сторону 5'-конца с помощью ДНК-полимеразы I Е. coli в отсутствие дезоксирибонуклеотидтрифосфатов;

(3) провели отжиг на ДНК с брешами синтетических олигонуклеотидов, имеющих на 3'-конце 6-, //-или /7-членную случайную последовательность, а на 5'-конце - константный участок (20 нуклеотидов). Константная часть предназначена для отжига адаптерного праймера («случайные» праймеры); ковалентно присоединили случайные праймеры, соединившиеся с ДНК-матрицей за счет комплементарных взаимодействий, путем лигирования ДНК-лигазой фага Т4;

(4) удалили избыток несвязанного с матричной ДНК случайного праймера путем батч-хроматографии на микропористом стеклянном сорбенте;

(5) провели реакцию ПЦР с адаптерным праймером («однопраймерная» ПЦР).

Для оптимизации концентрации реагентов, нуждающихся в точных стехиометрических соотношениях с целью подбора желательной средней длины фрагментов делеционных производных, были приготовлены серийные разведения панкреатической дезоксирибонуклеазы 1 и случайного праймера, продукты реакций, полученные в разных условиях, объединялись. Для отбора делеционных производных, пригодных для экспрессии in vivo, полученные in vitro фрагменты (очищенные продукты ПЦР) клонировали в вектор прямой селекции pQL30, содержащий ген ß-галактозидазы Е. coli со встроенным полилинкером с мутацией смещения трансляционной рамки считывания. Встройка делеционных производных целевого гена в полилинкер с определенной вероятностью приводила к восстановлению рамки, что позволило визуально контролировать экспрессию белка в полученных клонах. Существенной особенностью предлагаемого метода является возможность отбора только тех фрагментов исходного гена, которые не только в силу восстановления непрерывности открытой рамки считывания, но и в силу своей последовательности, вторичной и третичной структуры кодируемого продукта обладают способностью к высокоэффективной экспрессии в бактериальных клетках.

3.2.1. Отработка методики конструирования и скрининга банков делеционных производных на примере неструктурного антигена N858 вируса гепатита С

В качестве модельного объекта для отработки метода получения и скрининга банков делеционных производных был использован ген неструктурного белка Ы85а вируса гепатита С серотипа 1Ь. В результате ручного отбора клонов, обладающих Р-галактозидазной активностью, по размеру было получено 37 клонов со вставками от 300 до 1000 п.н. Доля этих клонов среди всех синих колоний составила около 60%. Оставшиеся 40% приходились на клоны с микроскопическими вставками существенно менее 100 п.н. Клоны с размером вставок от 100 до 300 п.н. и более 1000 п.н. представлены не были. Таким образом, эффективность отбора вставок оптимального размера скрининговым методом оказалась достаточно высокой.

Оценку выхода целевого продукта осуществляли при помощи электрофоретического разделения белков по Лэммли с последующим вестерн-блоттингом на нитроцеллюлозной мембране и детекцией целевого белка с использованием антител сыворотки крови больных, инфицированных НСУ генотипа 1Ь.

Поскольку мы считали наиболее удобным для иммунохимического применения растворимую форму белка, особое внимание при анализе банка было обращено на растворимость рекомбинантного продукта клонов. Было установлено, что активность (5-галактозидазы во фракциях клеточного лизата (растворимой и нерастворимой) сама по себе не является информативным параметром, характеризующим свойства клонов, так как чрезмерно зависит от условий культивирования. Напротив, информативным параметром оказалось отношение активности в водорастворимой и нерастворимой фракции. Именно максимизация этого параметра позволила отобрать клон с наивысшим уровнем продукции, получивший наименование 83. На Рис. 7 видно, что этот клон проявил максимальную реакционную способность с антителами от больных гепатитом С, отличную от уровня фона^______________

1,5

Отношение активности р-галактозидазы в водорастворимой и нерастворимой клеточной фракциях

0,0

ПЗ

Г* п02

П°.оП

пп Г -К-

яЗ 84 а5 «б а? >9 й 63 ев 89 «1(ЫЗб14б16 п4 п5 пб п7 п9 п10п14п15п1б гб г9 г10 г11 г12 г13 г14 г16 Г18 г19 г20121 г22

510 $13 в14 Э16

\кДа

шш

135 ш

■Б)

Рис. 7. Характеристики клонов банка делеционных производных гена Ш5а в векторе р<ЗЬ30.

А) Определение удельной активности Ьасг (нормированной на объем фракции) в растворимой (темные столбцы) и нерастворимой (светлые столбцы) клеточных фракциях и их относительное соотношение. На оси ординат указана величина Ащо-Б) Электрофоретический анализ (а-б) и вестерн-блотгинг (в) белков. Белки разделены в денатурирующем 15% ПААГ, с последующим окрашиванием сыворотками крови людей, инфицированных гепатитом С

3.2.2. Создание продуцентов антигенов на основе белка Сс вируса Пуумала с использованием метода конструирования и скрининга банков

Отработанную на модельном объекте методику получения и скрининга банков делеционных производных применили для создания продуцентов укороченных производных поверхностного белка-антигена вс хантавируса Пуумала К-27. кДНК целевого гена в форме линейного фрагмента длиной 1800 п.н. получали с помощью ПЦР с праймерами РШ2 и Рии4:

Из колоний с восстановленной активностью р-галактозидазы была выделена плазмидная ДНК. Наличие соответствующей вставки в клонах по сравнению с нерекомбинантным вектором рОЬЗО выявлялось с помощью ПЦР со стандартными праймерами р()Е-/ог и р1/С(М13)/ог.

Оценку выхода целевого продукта осуществляли при помощи электрофоретического разделения белков по Лэммли с последующим Вестерн-блотгингом на нитроцеллюлозной мембране и детекцией целевого белка с использованием антител пула высокоавидных сывороток крови больных, инфицированных вирусом Пуумала (2 пациента, переболевших в 2010 году); идентификация вида вируса проведена с использованием набора дня МФА производства ПИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН).

Рии-2

Рис. 8. Положение делеционных производных гена Gc вируса Пуумала, представленных в клонах Puu-1 и Puu-2, на общей ресгрикционной схеме M сегмента.

Детекция целевого белка на мембране включала в себя: а) блокирование неспецифических связей путем инкубации мембраны с 1% BSA, б) взаимодействие с антителами, специфическими к целевому белку; в) взаимодействие с вторичными антителами, коньюгированными с пероксидазой хрена; г) окрашивание с N,N'-

Л7ю1 (2)

TSpromoter /T5start

'BuiiHl (146) .__Puu-2

ft/1 (675) Ч ВанШ (860 к \Splii870)

Ц ¿'«Л (888)

ColEori,

диаминобензидином (ДАВ) в присутствии 1% пероксида водорода. После окрашивания с ДАБ наблюдают полосу, соответствующую расчетной массе белка (~114 кДа).

Из двух отобранных иммуноположительных клонов (Рис. 8) была выделена плазмидная ДНК. Наличие соответствующей вставки в клонах по сравнению с нерекомбинантным вектором pQL30 выявлялось с помощью ПЦР со стандартными праймерами pQE-for иpUC(M13)for. Продукт ПЦР очищали с помощью Silica bead DNA gel extraction kit (MBI Fermentas) и использовали для автоматического секвенирования на капиллярном секвенаторе Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer с помощью набора BigDye Terminator v.3.1 Cycle Sequencing Kit.

4. ВЫВОДЫ

1. Впервые применен метод рационального дизайна для конструирования производных поверхностных антигенов хантавирусов, что позволило подтвердить теоретические предсказания доменной организации белка Ge, устранить его токсичность для бактериального продуцента и обеспечить фолдинг фрагментов in vivo.

2. Разработана оригинальная технология получения предложенного ранее пептидного антигена из состава белка Ge хантавируса Добрава, неспособного к автономному фолдингу. Показано существование в сыворотках крови больных ГЛПС антител, связывающихся с рекомбинантным пептидным антигеном.

3. Разработан новый метод конструирования и скрининга банков делеционных производных генов на модели белка NS5a вируса гепатита С, включающий оригинальную методику ПЦР со случайным праймером и скрининг in vivo с использованием нового вектора pQL30.

4. С использованием нового скринингового подхода получены делеционные производные гена Ge хантавируса Пуумала, пригодные для экспрессии в Е. coli с образованием иммуноположительных продуктов.

5. Разработаны прототипы тест-систем с использованием рекомбинантных производных белка Ge хантавируса Добрава: слитых пептидных антигенов, в том числе, ферментативно меченных. Показана их способность выявлять специфические антитела в сыворотке больных.

5. СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Смирнова М.С.. Баловнева М.В., Гусева М.А., Леонович O.A., Елагина Е.М., Папуниди К.Х., Ворович М.Ф., Терехина И.Л., ДзагуроваТ.К., Шевелев А.Б. Метод определения остаточной ДНК клеток хозяина в вирусных препаратах вакцинного назначения с помощью ПЦР в реальном времен. Ветеринарный врач. 2010г. №5. Казань. С.45-48.

2. Ткаченко Е.А., Дзагурова Т.К., Бернштейн А.Д., Окулова Н.М., Коротана H.A., Транквилевский Д.В., Морозов В.Г., Юничева Ю.В., Завора Д.Л., Баловнева М.В., Соцкова С.Е., Мутных Е.С., Смирнова М.С.. Леонович O.A., Шевелев А.Б., Малкин Г.А. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом в России - проблема XXI века. Вестник российской академии естественных наук - 2012- №1 - С. 48-54

3. Варгин В.В., Дзагурова Т.К., Сапожников A.M., Иванов А.П., Коротина H.A., Николаева Т.Н., Ляпустин В.Н., Смирнова М.С. Особенности иммуномодулирующего воздействия белка теплового шока на формирование иммунитета к инактивироваиным противовирусным вакцинам - Инфекция и иммунитет материалы 10 съезда. Том 2, №1-2, С.94.

4. Смирнова М.С. Способ получения рекомбинантного антигена Ge хантавирусов в клетках E.coli. Фундаментальные исследования. -2013 - №7-С. 1102-1106

5. Смирнова М.С.. Леонович O.A., Шибаева A.B., Лебедева A.A., Шевелев А.Б. Искусственные белки, моделирующие изолированные домены поверхностного

гликопротенна хантавируса Добрава. Проблемы биологии продуктивных животных. -2013 - №3 -С.5-15

6. Смирнова М.С.. Леонович O.A., Шибаева A.B., Кудыкина Ю.К., Шевелев А.Б. Сенсор на основе слитого белка LacZ с плексин-семафориновым доменом ß3 интегрина -маркера эндотелноцитов капилляров сетчатки и потенциального рецептора хантавирусов. Здоровье населения и среда обитания. - 2013 - № 7 - С.31-34

7. Ковалева М.В., ЭповаЕ.Ю., Бауботько М.С.. Дзагурова Т.К., Коротана H.A., Лопатина Т.К., Шевелев А.Б. Подходы к созданию рекомбинантного антигена хантавируса Добрава - Москва. Ноябрь 2009 г. - Медицинская вирусология. Том XXVI. Материалы научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицинской вирусологии», посвященной столетию со дня рождения основателя Института М.П. Чумакова-С. 170-172

8. Гусева М.А., Смирнова М.С.. Баловнева М.В., Осипенкова О.В., Малышева Е.В. Зарипова P.C. Новый метод количественного определения остаточной ДНК клеток VERO в препаратах хантавируса Пуумала и вируса клещевого энцефалита -Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине. Сборник трудов, Спб, 2010, Том 3 С. 216-217

9. Ткаченко Е.А., Дзагурова Т.К., Берншгейн А.Д., Окулова Н.М., Коротана H.A., Транквилевский Д.В., Морозов В.Г., Юничева Ю.В., Завора Д.Л., Баловнева М.В., Соцкова С.Е., Мутных Е.С., Смирнова М.С.. Леонович O.A., Шевелёв А.Б., Малкин Г.А. Современное состояние проблемы геморрагической лихорадки с почечным синдромом в России. Национальные приоритеты России. Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Современные аспекты природной очаговости болезней", Омск, ноябрь 2011, №2 (5), С. 18-22

10. Патент № 2011152996. Способ получения рекомбинантного антигена G2 хантавирусов с увеличенным выходом в клетках Е. coli. Смирнова М.С.. Леонович O.A., Баловнева М.В., Казеева Т.Н., Белякова A.B., Дзагурова Т. К., Филимонова Н. А., Ткаченко Е.А., Шевелев А.Б.

11. Патентная заявка № 2010141819. Способ получения рекомбинантного антигена G2 хантавирусов в клетках Е. coli. Шевелев А.Б., Бауботько М.С.. Баловнева М.В., Эпова Е.Ю., Леонович O.A., Дзагурова Т.К., Ткаченко Е.А. С 26.12.2011 находится на рассмотрении экспертизы по существу.

12. Патентная заявка № 2012114473. Способ повышения качественных характеристик рекомбинантного антигена G2 хантавирусов для использования в иммунологических тестах при диагностике ГЛПС. Смирнова М.С.. Леонович O.A., Казеева Т.Н., Мутных Е.С., Папуниди К.Х., Маракасова Е.С., Филимонова H.A., Осипенкова О.В., Белякова A.B., Зылькова М.В., Шевелев А.Б. С 22.06.2012 находится на рассмотрении экспертизы по существу

13. Патентная заявка № 2012114472. Способ получения рекомбинантного ферментативно-меченного антигена G2 хантавируса в клетках Е. coli с целью его применения в иммуноферментном анализе при диагностике ГЛПС. Смирнова М.С.. Леонович O.A., Белякова A.B., Казеева Т.Н., Кузьмин В.А., Дурандин H.A., Шибаева A.B., Гра O.A., Елагина Е.М., Маракасова Е.С., Белякова A.B., Зылькова М.В., Шевелев А.Б. С 25.03.2013 находится на рассмотрении экспертизы по существу

14. Патентная заявка № 2012131897. Метод получения библиотек серийных двухсторонних делеций с помощью ПЦР с вырожденным праймером. Смирнова М.С.. Кузнецова Т.В., Леонович O.A., Гордейчук И.В., Шевелев А.Б. С 12.12.2012 находится на рассмотрении экспертизы по существу.

Подписано в печать: 07.11.2013 Объем: 1,5 п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 216 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, пр-т Вернадского, д. 39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Смирнова, Мария Сергеевна, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «ИНСТИТУТ ПОЛИОМИЕЛИТА И ВИРУСНЫХ ЭНЦЕФАЛИТОВ ИМЕНИ М.П.ЧУМАКОВА» РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

На правах рукописи

04201450033 СМИРНОВА МАРИЯ СЕРГЕЕВНА

СОЗДАНИЕ ИСКУССТВЕННОГО БЕЛКА-АНТИГЕНА ОБОЛОЧКИ

ХАНТАВИРУСОВ

Специальность: 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнология)

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: д.б.н. Шевелев А.Б. к.м.н. Дзагурова Т.К.

Москва 2013

Оглавление

Список использованных сокращений 5

1. Введение 7

2. Обзор литературы 10 2.1. Введение 10 2.2 Строение хантавирусов 10

2.2.1. N белок 11

2.2.2. Белок N8 12

2.2.3. Белок-предшественник ОРС и его производные: гликопротеины Оп и Ос

12

2.2.4. Формирование пространственной структуры и созревание Оп и Ос 13

2.2.5. Эндоплазматический (внутривирионный) домен СТ гликопротеинов Оп и Ос 16

2.2.6. РНК-зависимая РНК-полимераза 17

2.2.7. Проникновение хантавирусов в клетку 17

2.2.8. Предполагаемая роль интегринов в проникновении хантавирусов в клетку 18

2.2.9. Взаимодействия между структурными элементами хантавирусов в процессе транскрипции и репликации. Олигомеризация N белка и упаковка РНК 19

2.2.10. Взаимодействие с РНК и формирование комплекса КИР 19

2.2.11. Структура нековалентного комплекса Оп-Ос 20

2.2.12. Исследования кинетики образования шипикового комплекса 23

2.2.13. Взаимодействие шипиков с нуклеокапсидом в процессе сборки частиц

26

2.3. Классификация хантавирусов 28

2.4. Гуморальный иммунный ответ против хантавирусов 33

2.4.1. Методы изучения гуморального иммунного ответа: эпитопное картирование 35

2.4.3. Ответ против белков внешней оболочки хантавирусов 38

2.5. Вакцины для специфической профилактики хантавирусной инфекции 44

2.6 Диагностика хантавирусной инфекции 49

3. Материалы и методы 55

3.1. Материалы 5 5

3.1.1. Биологические материалы 5 5

3.1.2. Лабораторные реактивы 56

3.1.3. Олигонуклеотиды 5 7

3.2. Методы 57

3.2.1. Выделение плазмидной ДНК из жидкой среды 57

3.2.2. Приготовление компетентных клеток Escherichia coli 58

3.2.3. Трансформация Escherichia coli 58

3.2.4. Электрофорез в агарозном геле 58

3.2.5. Ферментация рекомбинантного продуцента 58

3.2.6. Подготовка проб 59

3.2.7. Денатурирующий белковый электрофорез в ПААГ 59

3.2.8. Иммуноблоттинг 60

3.2.9. Амплификация ДНК методом ПЦР 61

3.2.10. Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля 61

3.2.11. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции 61

3.2.12. Лигирование 62

3.2.13. Выделение тотальной вирусной РНК 62

3.2.14. Обратная транскрипция 62

3.2.15. Иммуноферментный анализ 63

3.2.16. Измерение Р-галактозидазной активности 6 3

4. Результаты 64

4.1. Конструирование продуцентов антигенов вируса Добрава с

использованием принципа рационального дизайна 65

4.1.1 Белки, моделирующие Ы- и С-концевые домены белка вс хантавируса Добрава 65

4.1.2 Антигены, моделирующие шарнирный район на стыке двух С-концевых доменов хантавируса Добрава 69

4.1.3 Испытания рекомбинантных штаммов-продуцентов на основе созданных конструкций 75

4.2. Разработка метода оптимизации технологических свойств антигенов с помощью конструирования и скрининга банков делеционных производных 103

4.2.1 Отработка методики конструирования и скрининга банков делеционных производных на примере неструктурного антигена Ы85а вируса гепатита С 105

4.2.2. Создание продуцентов антигенов на основе белка вс вируса Пуумала с использованием метода конструирования и скрининга банков 114

5. Заключение 119

6. Выводы 124

7. Благодарности 124

8. Список литературы 126

Приложение 153

Список использованных сокращений

ANDV - Andes virus, вирус Анды

СНО - Chinese hamster ovary, линия клеток яичников китайских хомячков dNTP - deoxynucleoside triphosphate, дезоксинуклеотидтрифосфат DOBV - Dobrava virus, вирус Добрава

Fab - fragment antigen binding, антиген-связывающий фрагмент; Fc - fragment crystallizable region, константный фрагмент; GFP - green fluorescent protein (зеленый флуоресцентный белок) HCPS - Hantavirus Cardiopulmonary Syndrome, хантавирусный сердечно-легочный синдром

HFRS, ГЛПС - hemorrhagic fever with renal syndrome, геморрагическая лихорадка с почечным синдромом

HTNV - Hantaan virus, вирус Хантаан

ICTV - International Committee on Taxonomy of Viruses, международный комитет по таксономии вирусов

IgG - иммуноглобулины класса G

INF - интерферон

mAbs - моноклональные антитела

NCBI - The National Center for Biotechnology Information

PBS - Phosphate buffered saline, фосфатно-солевой буфер

PBST - фосфатно-солевой буфер с добавлением Tween-20

PKPI - картофельные ингибиторы протеиназ типа Кунитца (potato Kunitz proteinase

inhibitors) PUUV - Puumala virus, вирус Пуумала

RdRp - RNA-dependent RNA polymerase, РНК-зависимая РНК-полимераза

RVFV - Rift Valley Fever Virus, вирус лихорадки долины Рифт

SDS - sodium dodecylsulfate (додецилсульфат натрия)

SDS-ПААГ - полиакриламидный гель с SDS

SNV - Sin Nombre virus, вирус Син Номбре

Vero - линия клеток почки африканской зеленой мартышки

VH - вариабельный домен тяжелой цепи Ig

VL - вариабельный домен легкой цепи Ig

а.к. - аминокислота

а.о. - аминокислотный остаток

БСА, BSA - бычий сывороточный альбумин ДАБ - диаминобензидин ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ИПТГ, IPTG - изопропил-Р-1)-тиогалактозид КГБ - карбонат-гидрокарбонатный буфер

МФА, IFA - Immunofluorescence assay, метод иммунофлуоресценции

нт - нуклеогид

п.н. - пар нуклеотидов

ПААГ - полиакриламидный гель

ПЦР, PCR - polymerase chain reaction, полимеразная цепная реакция

ПЭГ - полиэтиленгликоль

РНК - рибонуклеиновая кислота

РТГА - реакция торможения гемагглютинации

ТАЕ - трис-ацетат-ЭДТА

тИФА, ELISA - enzyme-linked immunosorbent assay (твердофазный

иммуноферментный анализ) ТХУ - трихлоруксусная кислота Ф.о.е. - фокусобразущие единицы ЭДТА - этилендиаминтетраацетат ЭПР - эндоплазматический ретикулум

1. Введение

Хантавирусы являются возбудителем геморрагической лихорадки с почечным синдромом - по данным Роспотребнадзора, одного из наиболее распространённых вирусных природноочаговых заболеваний на территории нашей страны. Аргументируя значимость разработки средств диагностики хантавирусной инфекции, необходимо сослаться на решение коллегии Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека от 10 августа 2012 года. В этом официальном документе сообщается, что в Российской Федерации за последние 10 лет заболеваемость ГЛПС составляет от 3,2 до 6,6 на 100 тысяч населения; 98,3% заболевших приходится на Европейскую часть страны. Наиболее активные природные очаги находятся на территории Поволжья. В последние годы выявлены новые природные очаги в Центральном Федеральном округе, что привело к росту показателей в 3,2 раза. В течение последнего десятилетия наблюдается снижение числа регистрируемых случаев на Дальнем Востоке, Урале и Сибири. Обнаружен уникальный природный очаг ГЛПС в субтропической зоне Краснодарского края на территории Большого Сочи с новым вариантом вируса и новым носителем в конкретном природном биотопе. В многолетней динамике заболеваемости ГЛПС в России отмечается слабо выраженная тенденция к росту со средним приростом 1,7% ежегодно, что связано как с улучшением клинической и лабораторной диагностики, так и с объективным ростом заболеваемости.

Усовершенствование методов серодиагностики ГЛПС, а также разработка системы контроля качества перспективных вакцин, остро востребованных в России, ставит вопрос о разработке технологически эффективного метода получения оболочечных антигенов хантавирусов, прежде всего, белка Gc. Эта задача не решена до настоящего времени нигде в мире.

Получение рекомбинантных белков является типовой задачей, лежащей в основе

многих биотехнологических проектов. Со времен появления модели лактозного оперона

Жакоба и Моно молекулярные биологи и биотехнологи исходят из представления, что

регуляция экспрессии гена осуществляется на уровне промотора и не зависит от

структуры кодируемого белка. Эта модель вполне удовлетворительно описывает

механизм регуляции работы генов в естественном окружении, но мало пригодна для

создания продуцентов гетерологичных и, особенно, искусственно сконструированных

белков. Общеизвестно, что использование даже самых современных и мощных бинарных

промоторных систем, например, на основе промотора Т7, не дает гарантии

детектируемого выхода продуктов слитых или укороченных производных природных

7

генов. Еще реже удается добиться экспрессии in vivo полностью синтетических искусственных генов. Мы предполагаем, что трансляционные системы in vivo способны на стадии, предшествующей релизингу пептидил-тРНК, оценивать способность продукта к формированию компактной глобулярной структуры. Пептидные цепи, не способные к этому, подвергаются немедленной деградации. В рамках этой гипотезы универсальным подходом к конструированию эффективных продуцентов гетерологичных белков является обеспечение их способности к формированию устойчивой глобулярной структуры непосредственно в процессе трансляции.

Проблемы с конструированием рекомбинантных продуцентов часто возникают при работе с мембранными белками и белками с большим числом дисульфидных связей. Эти проблемы особенно характерны при попытках получения в гетерологичных системах вирусных антигенов, как структурных так и неструктурных. Помимо низкого уровня накопления белка сложность составляет высокая токсичность многих вирусных антигенов для клеток рекомбинантных продуцентов. По-видимому, эта особенность структурных и части неструктурных вирусных белков связана с наличием у них способности образовывать мультимолекулярные сети в составе вирусной частицы. Многоцентровые взаимодействия вирусных белков друг с другом и с элементами клетки хозяина при гетерологичной экспрессии способны вносить хаос в передачу сигналов внутри цитоплазмы и с участием мембран. Таким образом, универсальным подходом к снижению токсичности вирусных антигенов могло бы стать их расчленение па отдельные домены, не способные образовывать сети.

Решение задачи по вычленению доменов в составе белков, структура которых неизвестна по причине их недоступности в очищенном состоянии, может быть решена тремя принципиально разными способами:

1. На основе предсказания доменной организации за счёт поиска лучше охарактеризованных гомологов и аналогов;

2. На основе разработки мультиэпитопных синтетических белков, включающих иммунодоминантные пептиды, идентифицированные в структуре белка в результате эпитопного картирования;

3. На основе скринингового подхода, заключающегося в конструировании случайных двусторонних банков делеционных производных генов вирусных антигенов с последующим отбором из него хорошо экспрессирующихся делеционных производных.

В качестве основной модели для решения задачи мы использовали оболочечный белок-антиген Gc хантавирусов Пуумала и Добрава. Кроме того, часть экспериментов по отработке нового метода конструирования и скрининга делеционных банков была выполнена на модели неструктурного белка NS5a вируса гепатита С.

Цель работы:

Целыо настоящей работы является на примере производных оболочечного белка Gc хантавирусов отработать универсальную методологию препаративного получения рекомбинантных вирусных антигенов, используя комбинацию различных методов

Задачи работы:

1. Апробировать подход к конструированию эффективных продуцентов делеционных вариантов белка Gc хантавируса Добрава, основанный на предсказании доменной организации этого белка по аналогии с оболочечными белками других вирусов.

2. На основе анализа опубликованных данных пептидного эпитопного картирования белка Gc хантавирусов предложить структуру короткого иммунодоминантного пептида, добиться его высокоэффективной экспрессии в растворимой форме в составе би- и три-функциональных слитых белков.

3. На модели неструктурного белка NS5a ВГС отработать систему конструирования банков делеционных производных in vitro с помощью ПЦР со случайной затравкой и скрининга этого банка путём отбора клонов, обеспечивающих высокий уровень экспрессии трансгена.

4. С использованием скринингового метода получить набор делеционных производных белка Gc хантавируса Пуумала, обладающих способностью к высокоэффективной экспрессии в Е. coli. Отобрать среди них иммуноположительные варианты.

5. Изучить и сопоставить технологические и иммунохимические свойства полученных рекомбинантных антигенов. Сконструировать на их основе лабораторные тест-системы для иммунохимической детекции специфических антител больных ГЛПС.

2. Обзор литературы

2.1. Введение

Хантавирусы представляют собой покрытые липидной оболочкой сферические вирионы размером 80-140 им. Это сравнительно недавно открытая группа вирусов человека: типовой штамм хантавируса был впервые получен только в 1978 г. {Lee, 1978). Подобно другим членам семейства Bunyaviridae, они имеют трехсегментный геном, состоящий из одноиитевих РНК отрицательной полярности. Большой сегмент генома кодирует РНК-зависимую РНК-полимеразу (репликазу), средний - два гликопротеина внешней мембраны вируса, а малый - N белок, образующий комплекс с вирусным геномом. В Европе и Азии хантавирусная инфекция у человека проявляется в форме геморрагической лихорадки с почечным синдромом (HFRS, ГЛПС). Течение заболевания при этом, как правило, достаточно лёгкое, хотя в последние годы появился ряд сообщений о летальных исходах у пациентов, инфицированных хантавирусом Добрава.

В настоящем обзоре литературных данных мы приводим современные сведения о клинической картине хантавирусной инфекции в России, подходах к классификации хантавирусов (с учетом молекулярно-генетических данных), иммунном ответе на хантавирусы у человека и состоянии дел в области создания вакцин против хантавирусных инфекций. На наш взгляд, такая компоновка позволяет в максимальной степени оценить обоснованность выбранных нами экспериментальных подходов к решению экспериментальной задачи исследования.

2.2 Строение хантавирусов

Хантавирусы представляют собой покрытые липидной оболочкой сферические вирионы размером 80-140 нм. Подобно другим членам семейства Bunyaviridae, они имеют трехсоставный фрагментированный геном. Три сегмента генома - большой (L), средний (М) и малый (S) - кодируют вирусную РНК-зависимую РНК-полимеразу RdRp, поверхностные гликопротеины Gn и Gc и нуклеокапсидный белок N, соответственно. Вирусные белки - RdRp, Gn, Gc и N - имеют молекулярные массы 200, 72, 56 и 45 кДа. Все три сегмента хантавирусной РНК имеют на З'-концах одну и ту же характерную короткую последовательность - 3'-AUCAUCAUCUG-...-5', отличающую их от других буньявирусов. В результате 3' и 5'-концы образуют нековалентную водородную связь, формируя структуру типа «ручка сковороды». Терминальные последовательности РНК сегментов (NCR- не кодирующая область) выполняют ряд важных функций. Они необходимы для узнавания РНК-полимеразы и захвата вирусной РНК нуклеокапсидным N белком

{Severson et al., 1999). Каждый сегмент генома непосредственно ассоциирован с N белком (2100 молекул на каждую частицу) и RdRp (250 молекул на каждую частицу) (под ред. Филдс и др., 1989; Elliot, 1990).

Рис. 1. Модель строения хантавируса

2.2.1. N белок

Кодируемый S сегментом N белок не подвергается гликозилированию в процессе созревания. Его молекулярная масса составляет ~50 кДа (Hussein et al, 2011). N белок наряду с RdRp абсолютно необходим для репликации (Flick et al., 2003). Инициации репликации должна предшествовать транскрипция и трансляция М-сегмента (Patterson & Kolakofsky, 1984), причем, потребность репликации хантавирусов в высоких концентрациях N белка приводит к тому, что свободный N белок, необходимый для формирования капсидов, высвобождается только после окончания репликации (Jonsson & Schmaljohn, 2001). Тримеры N белка связывают консервативную последовательность «ручки сковороды», присутствующую только в комплементарной РНК (кРНК) и вРНК, но отсутствующую в матричных РНК (Hussein et al., 2011). Последние исследования показали, что N белок отвечает за предохранение РНК-праймеров, несущих 5'-кэп (необходимый элемент трансляции в эукариотических клетках) от деградации клеточными Р-тельцами (Mir et al., 2008). Эта функция также существенна для репликации вируса. Иммунофлуоресцентное окрашивание зараженных хантавирусом клеток антителами против N белка или сывороткой пациента с ГЛПС в острой фазе приводит к визуализации характерной зернистой структуры цитоплазмы (Kallio-Kokko et al., 2001; Lee et al., 1978; Yanagihara et al., 1985). Такое окрашивание может быть обусловлено агрегацией N белка

0Goldsmith el al, 1995) или его связыванием с Р-тельцами {Mir et al., 2008). При этом характерно, что N белок имеет тенденцию концентрироваться в перинуклеарной области, и связан с мембраной, хотя лишён трансмембранных доменов {Ravkov & Compatis, 2001).

2.2.2. Белок NS

S сегмент хантавирусов, переносимых грызунами Arvicolinae и Sigmodontinae, содержит дополнительную открытую рамку считывания, перекрывающуюся с рамкой N белка, но транслирующуюся в фазе +1. Возникающий в результате этого гипотетический продукт трансляции получил название NS {Plyusnin & Morzunov, 2001). Экспериментальные исследования с использованием антител, полученных против химически синтезированного фрагме