Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка и применение экспериментальных и промышленных иммуноферментных тест-систем для лабораторной диагностики вирусных инфекций

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Разработка и применение экспериментальных и промышленных иммуноферментных тест-систем для лабораторной диагностики вирусных инфекций"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ИНСТИТУТ ПОЛИОМИЕЛИТА И ВИРУСНЫХ ЭНЦЕФАЛИТОВ ИМЕНИ М.11. ЧУМАКОВА РАМН

На правах рукописи УДК 616.98:578.833.26-07

ИВАНОВ АЛЕКСАНДР ПЕТРОВИЧ

РАЗРАБОТКА И ПРИМЕНЕНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ И ПРОМЫШЛЕННЫХ ИММУНОФЕРМЕНТНЫХ ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ

03.00.06 - вирусология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора медицинских наук

Москва - 1998 г.

Работа выполнена в Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН

Научный консультант - доктор медицинских наук, профессор Е.А. Ткаченко

Официальные оппоненты: Заслуженный деятель науки России, Почётный академик РАЕН, доктор медицинских наук, профессор С.Я. Гайдамович; член-корреспондент РАЕН, доктор медицинских наук, профессор В.В. Погодина; член-корреспондент РАЕН, доктор медицинских наук, профессор М.С. Воробьёва

Ведущая организация: Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН

Защита состоится " /3 " 1998 года в /¿7 часов на

заседании диссертационного совета Д.001.27.01 при Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН по адресу: 142782, Московская обл., п/о Институт полиомиелита

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН

Автореферат разослан " 1998 года

Учёный секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук О.А. Медведкина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Совершенствование лабораторной диагностики вирусных инфекций - одна из основных методических проблем вирусологии, представляющая собой самостоятельную область исследовательской практики. В представительном арсенале методов, используемых в вирусологии, иммунофер-ментный анализ (ИФА) занимает особое место. Несмотря на то, что его история насчитывает уже более 20 лет, интерес к данной проблеме не убывает. Об этом свидетельствует стабильный поток публикаций, руководств, монографий и т. д., посвященных разработкам ИФА-тест-систем для биомедицинских исследований, включая вирусологические. Согласно современной статистики (США и Европа), на долю ИФА приходится 60 % всех проводимых иммуноанализов; на радиоиммунный метод - 25 %, на иммунофлуоресцентный и прочие методы - 15 %. (S.S. Deshpande, 1996).

Поскольку иммуноанапиз - это "применение реакции антигена с антителом для определения концентрации одного из этих реагентов в растворе", то, очевидно, что разнообразие антигенов и антител определяет и разнообразие систем иммукоанализа. Это предполагает единственно возможный путь - создание конкретных систем регистрации вирусспецифических антигенов и антител, отсутствующих в методическом арсенале. При этом каждая новая ИФА-система является не просто очередной реализацией хорошо известного принципа (принципа ИФА). Для реализации общего принципа при конструировании определённой тест-системы необходам конкретный подход с учётом специфических особенностей её активных компонентов (антигенов или антител), области и способов её применения. Каждый вариант ИФА требует основательного экспериментального анализа и разработки определенных алгоритмов, на базе которых уже можно конструи-

ровать конкретные тест-системы. Все это - реальные проблемы, от решения которых зависит эффективность (специфичность, чувствительность, информативность и т.д.) лабораторной диагностики вирусных инфекций.

К началу нашей работы (к концу 70-х годов) ИФА только входил в практику вирусологических исследований, и фактически мы имели в своём распоряжении лишь принцип и ограниченное количество вариантов метода. На протяжении ряда лет возможности, заложенные в принципе ИФА, использовали^ Л,гтек0 не пол" ностью. Спектр вирусных инфекций, в лабораторной диагностике которых применялся ИФА, был невелик, и в него не входили вирусы, имеющие актуальную значимость в патологии человека (например, некоторые арена- и буниавирусы, такие как вирусы Ласса, Мачупо, Хунин, лимфоцитарного хориомепингита - ЛХМ, Крымской-Конго геморрагической лихорадки - КГЛ-Коиго, хантавирусы). Не были разработаны более эффективные подходы адаптации ИФА для эпидемиологических и серологических исследований, а в эпизоотологических исследованиях ИФА вообше не применялся. Все это существенно ограничивало дальнейшие исследования в актуальнейших областях инфекционной патологии человека. К началу данной работы в ещё редких публикациях, посвященных применению ИФА в медицинской вирусологии, вопросы разработки оптимальных параметров метода освещались очень скупо, либо вообще не были представлены. Поэтому реально существовала проблема оптимизации, стандартизации и адаптации ИФА с целью создания эффективной методической основы для решения широкого круга актуальных исследовательских задач. Кроме того, объективная необходимость требовала качественно нового уровня исследований, который был невозможен на традиционной методической основе (прежде всего, определение вирусспецифических антигенов в грубых суспензиях органов диких животных при изучении вирусных зоонозных инфекций - широкий эпизоотологический скрининг). Особую значи-

мость представляло использование ИФА для лабораторной диагностики инфекций, вызываемых высокопатогенными вирусами семейств Агепаушйае и ВипуауМае. Разработка новой методической основы позволила бы решать не только прикладные задачи (собственно лабораторная диагностика вирусных инфекций, например, серологическая диагностика), но и задачи более фундаментальные - как-то выяснение вопросов механизма циркуляции и распространения ряда вирусов-возбудителей инфекций человека в природных очагах. Разработка и успешная апробация нового лабораторного метода (комплекса методов) предполагает логическое завершение - внедрение метода в исследовательскую и диагностическую практику, то есть, чтобы метод стал доступным для пользователей различного уровня.

Цель и задачи исследований. Исходя из вышеизложенного, целью исследований является создание ИФА-тест-систем для лабораторной диагностики вирусных инфекций, имеющих актуальную значимость в патологии человека, и внедрение их в исследовательскую практику и в практику здравоохранения как более эффективной методической основы. Достижение этих целей предусматривает решение следующих задач:

1. Разработка принципов и оптимизация различных вариантов ИФА для определения вирусных антигенов и противовирусных антител.

2. Разработка экспериментальных ИФА-тест-систем, применение и оценка их эффективности в конкретных исследованиях.

3. Разработка технологии промышленного производства ИФА-тест-систем, пригодных для широкого крута пользователей.

Научная новизна работы. Впервые в вирусологической практике разработан комплекс вариантоп ИФА для лабораторной диагностики инфекций, вызываемых вирусами семейств Агепа\'1П(1ае : высокопатогенные вирусы Ласса, Мачупо, Ху-

нин, а также вирусы лимфоцитарного хориоменингита (ЛХМ), Аманари, Такари-бе, Тамиами, и Bunyaviridae: вирус Крымской - Конго геморрагической лихорадки (КГЛ-Коиго) и хантавирусы - возбудители геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС). Разработка и применение ИФА для определения вирусных антигенов и антител подняли исследования на новый уровень и создали основы нетрадиционных подходов к изучению этих патогенов. На основе ИФА создан качественно новый методический подход к изучению вирусных инфекций - система ИФА-скрининга природных образцов (определение вирусных антигенов в суспензиях органов диких животных), позволившая проводить широкие и информативные исследования (разведка и мониторинг природных очагов, определение видового состава животных-носителей зоонозных вирусных инфекций, изучение эпизоотических процессов в природных очагах, а также контроль лабораторных животных в питомниках). С помощью ИФА-скрининга впервые получены прямые доказательства наличия природных очагов лихорадки Ласса на территории Гвинейской Республики, а также очагов ЛХМ на территории Краснодарского края и Грузии. Впервые на основе ИФА разработана серологическая диагностика нейро-инфекций, ассоциированных с вирусом ЛХМ. Впервые получены данные о распространении ряда патогенных вирусов ка территории Гвинеи (вирусы гепатитов А и В, Чикунгунья). На основе поликлонального ^С к нуклсокапсидному белку хантавируса Пумала (ГЧ-беяок - иммунодоминантный антиген хангавирусов) впервые сконструирована родоспецифическая ИФА-система для определения антигенов известных хантавирусов (минимум 10-ти, включая патогенные - Пумала, Хан-тан, Сеул, Добрава, Син Номбрэ). С помощью этой системы проведены широкие зпизоотологические исследования, впервые позволившие определить 1раницы ареала хангавирусов на территории бывшего СССР (в странах бывшего СССР, Бельгии, Германии, Словакии, Чехии, Швеции). Разработанная типоспецифиче-

ская ИФА-система для определения хантавируса Пумала (на основе моноклональ-ных антител) впервые позволила проводить типирование хантавирусных антигенов в ИФА-позитивных образцах, что расширило возможности ИФА-скршшнга. Разработаны первые ИФА-системы для определения антител (^М и IgG) к ханта-вирусам (серологическая диагностика ГЛПС), позволившие изучить вопросы формирования гуморального иммунитета у больных ГЛПС. Наряду с этими системами разработана принципиально новая система определения 1§М к вирусу Пумала с использованием в качестве биозонда биотинилированного рекомбинантного антигена (Ы-белка) вируса Пумала. Впервые для лабораторной диагностики хантавирусных инфекций (определение антигенов и антител) разработаны альтернативные варианты ИФА с использованием в качестве твёрдой фазы мембранных фильтров (дот-блот ИФА), предназначенные для неспециализированных лабораторий и для экспедиционных условий (скрининг диких животных).

Практическая значимость работы . На основе полученных данных разработаны технологии экспериментального изготовления иммуноферментных тест-систем для лабораторной диагностики арена- и буниавирусных инфекций (вирус КГЛ-Конго и хантавирусы) и промышленного производства коммерческой им-муноферментной тсст-системы "ХАНТАПЮСТ" для определения антигенов хан-тавирусов - возбудителей ГЛПС. Широкое практическое применение ИФА для определения инфицированности мелких млекопитающих хантавирусами открыло возможность оценки степени активности природных очагов (мониторинга) и своевременного проведения соответствующих противоэпидемических мероприятий. Применение ИФА для определения антител к вирусу ЛХМ и хантавирусам в сыворотках крови больных людей значительно повысило эффективность клинической диагностики. Результаты обследования в ИФА материалов от лабораторных животных из питомников свидетельствуют о возможности эффективного использо-

вания разработанных нами ИФА-систем для контроля контаминации вирусом ЛХМ и хантавирусами лабораторных животных и проведения соответствующих мероприятий, направленных на предотвращение распространения инфекций в питомниках.

Разработаны и утверждены следующие нормативно-технические документы:

1. Инструкция по изготовлению, контролю и применению диагностикума лимфо-цитарного хориоменингита, иммуноглобулинового перокендазного сухого (протоколы 1 заседанияКВС МЗ СССР от 9. 02. 1983 г.).

2. Инструкция по изготовлению, контролю и применению диагностикума геморрагической лихорадки с почечным синдромом, иммуноглобулинового перокендазного сухого (протокол N 1 заседания КВС МЗ СССР от 9. 02. 1983 г.).

3. Инструкция по изготовлению, контролю и применению диагностикума Крым-ской-Конго геморрагической лихорадки, иммуноглобулинового пероксидазного сухого (протокол N 1 заседания КВС МЗ СССР от 9.02. 1983 г.)

4. Фармакопейная статья на тест-систему пммуноферменгную для определения антигена вируса ГЛПС (ФС 42/Д055 ВС-95, утверждена Госкомитетом санэпид-надзора Росии 27. 11. 1995 г.).

5. Экспериментально-производственный регламент N 542-95 на тест-систему им-муноферментную "ХАНТАГИОСТ" для определения антигена вируса ГЛПС (согласовано с ГИСК им. Л. А. Тарасевича от 10. 11. 1995 г.).

6. Инструкция по применению иммуноферментпой тест-системы "ХАНТАГИОСТ" дня определения антигена вируса ГЛПС (утверждена Госкомитетом санэпиднадзора России от 27. 11. 1995 г.).

Получено авторское свидетельство N 1639245 от 1. 12. 1990 г. "Диагностикум геморрагической лихорадки с почечным синдромом для детекции

антигенов всех известных серотипов этого вируса прямым иммупофермснтным методом".

Товарный знак "ХАНТАГНОСТ" зарегистрирован в Государственном реестре товарных знаков СССР, свидетельство N 91221 от 8. 10. 1990 г. Опубликованы следующие методические рекомендации:

1. Применение твердофазных иммуносорбентных методов (энзимного и радиоиммунологического анализа) для лабораторной диагностики аренавирусных инфекций, КГЛ-Конго и ГЛПС. Методические рекомендации. МЗ РСФСР, М., 1982 г.

2. Методы лабораторной диагностики ГЛПС. Методические рекомендации. МЗ РСФСР, М., 1982 г.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработка и оптимизация б вариантов ИФА для определения вируссие-цифических антигенов и антител. Стандартизация подходов при конструировании пероксидазных диагностик-умов.

2. Разработка ИФА-систем для лабораторной диагностики инфекций, вызываемых вирусами семейств Агепаушёае, Випуаушёае, К1аутпс1ае, Нерас1паутс1ае, РкопитгЫае, То§ау1п<1ас. Системы для определения аренавирусных и буниавирусных (вирус КГЛ-Конго, хантавирусы) антигенов и антител предложены впервые.

3. Экспериментальные доказательства эффективности (чувствительность и специфичность) поликлональных ИФА-систем скрининга (определение антигенов) при их сравнительной оценке с моноклональными системами, а также с методами анализа нуклеиновой кислоты вируса (полимеразной цепной реакции).

4. Разработка и внедрение в исследовательскую практику и в практику здравоохранения нового подхода в эпизоотологических исследованиях: системы ИФА-скрининга (определение вирусных антигенов в грубых суспензиях органов

диких животных) как базисного метода разведки, изучения и мониторинга природных очагов вирусных инфекций.

5. Разработка ИФА-системы на основе моноклональных антител для типи-рования антигенов хантавирусов в природных образцах.

6. Разработка метода ИФА-скрининга диких животных (определение ханта-вирусных антигенов и антител ) на основе более доступного варианта ИФА - дот-блот анализа.

7. Приоритетные результаты обширных исследований (с вирусами-представителями перечисленных семейств) с применением разработанных ИФА-тест-систем, позволяющие говорить об эффективной системе лабораторной диагностики вирусных инфекций на основе ИФА.

8. Разработка и внедрение в производство коммерческих ИФА-диагностикумов на основе разработанных экспериментальных тест-систем.

Апробация работы. Материалы диссертации представлялись на 19 и 20 итоговых сессиях Института полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР (Москва, 1981, 1985); пленуме Всесоюзной проблемной комиссии "Арбовирусы" (Таллин, 1984); II Всесоюзной конференции по природной очаговости болезней (Тюмень, 1984); 10 и 11 международных конгрессах по тропической медицине и малярии (Манила, 1980, Калгари, 1984); 5 международном конгрессе по вирусологии (Страсбург, 1981); рабочем совещании экспертов ВОЗ по вирусным геморрагическим лихорадкам (Москва, 1985); 29 международном коллоквиуме по хантавиру-сам (Антверпен, 1987); международном симпозиуме по ГЛ11С (Ленинград, 1991); 3 международном симпозиуме по арбовирусам и хантавирусам в странах Средиземноморья (Кортина д'Ампеццо, 1992); 2, 3 и 4 международных конференциях по

ГЛПС и хантавирусам (Пекин, 1992; Хельсинки, 1995; Атланта, 1998); ежегодной конференции германского вирусологического общества (Гамбург, 1997).

Публикации. Основное содержание диссертации представлено в 40 публикациях.

Объём и структура диссертации. Диссертация написана в форме монографии и представляет собой рукопись объёмом в 207 страниц с 67 таблицами, 16 рисунками, списком цитируемой литературы (171 отечественный и зарубежный источник) и состоит из введения, собственных исследований (3 главы), обсуждения и выводов. Диссертация снабжена приложением (отдельный том из 158 страниц -нормативно-техническая документация на ИФА-тест-системы).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

I. Разработка и оптимизация методов ИФА для определения вирусных антигенов и противовирусных антител

Для создания системы лабораторной диагностики различных вирусных инфекций на основе ИФА мы разработали и оптимизировали следующие варианты метода: 1) прямой вариант для определения антигенов; 2) блок прямого варианта для определения антител; 3) непрямой вариант для определения антигенов или антител с сенсибилизацией твёрдой фазы специфическими антителами; 4) непрямой вариант для определения антител с сорбцией стандартного антигена на твёрдую фазу; 5) вариант "мю-захвата" для определения IgM с использованием рекомбинантного антигена, меченного биотином; 6) точечный ИФА (дот-блот анализ) для определения антигенов и антител на нитро- и ацетатцеллюлоэных фильтрах (для иследований в неспециализированных лабораториях гаи в экспедиционных условиях). Прототипным вариантом, на основе которого разрабатывались друг ие варианты ИФА, был прямой вариант для определения антигенов.

Прямой вариант для определения антигенов. Данный вариант предусматривает иммуноаффинную очистку искомого антигена in situ (с помощью иммуносор-бента) с последующей регистрацией связанного антигена специфическим биозондом (конъюгатом). Основополагающим моментом разработки прямого варианта было определение чётких критериев качества иммунных препаратов как источников специфических IgG для приготовления иммуносорбентов и специфических конъюгатов. К началу нашей работы в литературе не было представлено исчерпывающей информации по этому вопросу. Мы использовали преимущественно по-ликлональные IgG, источниками которых служили: гипериммунные сыворотки лабораторных животных, иммунные асцигные жидкости (ИАЖ) белых мышей, приготовленные согласно известным схемам иммунизации, а также сыворотки реконвалесцентов. Моноклональные антитела применялись при оценке специфичности родоспецифического ИФА-диапюстикума для определения антигенов хантавирусов, а также для типировация антигенов хантавирусов (типоспецифичсская ИФА-система). Для иммунных препаратов были экспериментально определены следующие критерии. Специфическая активность (выраженная в титрах антител) иммунных сывороток и ИАЖ должна быть не ниже 1:128 в реакции связывания комплемента (РСК) или, соответвственно, 1:32 в реакции диффузионной преципитации в геле агара (РДПА), или 1:16000 в непрямом методе иммунофлуоресценции (МФА). Поскольку поликлональные сыворотки представляют собой смеси антител различной аффинности, и измерение константы их аффинитета дает лишь усреднённое значение, то ориентация на величину титров антител как показатель специфической активности поликлональ-ных сывороток является единственно возможной и адекватней. IgG, полученные из иммунных препаратов с более низкими титрами специфических антител, были непригодны ни для сенсибилизации твердой фазы, ни для приготовления перокси-

дазных конъюгатов: в том и другом случае отмечалось резкое падение чувствительности и специфичности (ложноположительные результаты, высокий неспецифический фон в контроля* и т.д.)- Этот критерий (предложенный впервые, судя по литературным источникам), оправдавший себя при разработке прямого ИФА для лабораторной диагностики различных вирусных инфекций, лег в основу стандарта, обеспечивающего высокую активность пероксидазных диагностикумов. Очевидно, что чем выше специфическая активность (титры антител) иммунных препаратов, тем выше чувствительность и специфичность тест-систем, приготовленных на основе такого сырья. Использование иммунных сывороток (ИАЖ) с комплементсвязывающими титрами 1:128 - 1:256 и сывороток реконвалесцентов ГЛПС с титрами 1:32000 - 1:64000 по непрямому МФА обеспечивало чувствительность не ниже 10 нанограмм (нг)/мл вирусспецифического белка или примерно 3 ^ БОЕ/мл (минимальный титр вируса, при котором определяется вирусспе-цифический антиген). То, что в эпоху гибридомной технологии при конструировании ИФА-диагностикумов для определения антигенов мы отдаём предпочтение поликлональным сывороткам как источникам специфических глобулинов, имеет серьёзные основания. Первое - получение препаративных количеств очищенных высокоаффинных моноклональных антител к широкому спектру вирусов и на сегоднящний день представляет собой сложную задачу . Кроме того, концентрация в гибридомной жидкости - не более 50 мкг/мл, в сыворотке - 8-16 мг/мл; компромиссный вариант - использование моноклональных антител в виде асцита (до 10 мг/мл) - требует, однако, очистки аналогичной для поликлональных иммунных препаратов. Второе - использование моноклональных антител в системах регистрации сложных антигенов (какими являются вирусспецифические белки) сопряжено с рядом известных ограничений. К ним относятся: фиксированная и нередко низкая аффинность, узкая эпитопная специфичность и связанная с

этим относительно низкая чувствительность по сравнению с иоликлональными системами. И ещё два (неспецифических) ограничения: нестабильность при изменении рН или концентрации солей и трудность мечения (Cambell, 1991; Deshpande, 1996). Поскольку поликлональная антисьшоротка может содержать огромное количество различных типов молекул IgG (к соответствующим эпитопам антигена), то ее авидность ("функциональная аффинность") значительно выше авидности мо-ноклональных антител, что обеспечивает более полноценную (близкую к естественному процессу) связь с антигеном (его эпитопами). Таким образом, гетерогенность поликлональных антител, несомненно, положительный момент, способствующий получению более сильного сигнала при регистрации антигена. Наконец, отметим, что многие авторы для сенсибилизации твёрдой фазы используют "коктейль" из антивирусных моноклональных антител (к различным эпитопам вирусспецифических белков), таким образом, как бы моделируя поликлональную систему. Очевидно, что использование природного "коктейля" из высокоаффинных антител разнообразной эпитоиной специфичности (поликлональных IgG из гипериммунных сывороток и сывороток реконвалесцентов) не менее оправдано.

Очистка специфических IgG. Из методов очистки IgG (рекомендованных для поликлональных сывороток) были апробированы три наиболее доступных: гель-фильтрация на колонках с Sephadex G-200, Sephacryl S-200 - S-300, ионообменная хроматография на колонке с DEAE-Sephadex А-50, аффинная хроматография на колонке с Protein A/G Sepharose CL-4B (Pharmacia). Аффинная хроматография использовалась для очистки IgG из ИАЖ и сывороток реконвалесцентов ГЛПС. Несмотря на то, что степень чистоты препаратов IgG, полученных тремя методами, различна (самая грубая очистка - гель-фильтрацией, и самая тонкая -аффинной хроматографией), нами показано, что это не оказывает выраженного влияния на качество пероксидазных диагностикумов. Высокий уровень специфиче-

ских антител в исходной сыворотке нивелирует разницу между гель-фильтрацией и аффинной хроматографией и, таким образом, дает возможность достаточно широкого выбора метода очистки ^О. Известные преимущества аффинной хроматографии (большая ёмкость сефарозы с белком А/С/ - до 20 мг/мл 1ёО, высокий выход простота и скорость исполнения) делают этот метод

наиблее предпочтительным.

Конъюгацию 1еО с пероксидазой хрена проводили согласно №капе-Ка\уао1 (1974) в модификации МаИйезеп е1 а1. (1978) с собственными модификациями.

Оптимизация метода: выбор твёрдой фазы и статистическая оценка результатов анализа. Оценка качества иммунопанелей была одним из важнейших элементов оптимизации метода. При работе с 11 типами иммунопанелей из полистирола и поливинилхлорида (5 отечественных и б импортных типов) показано, что использование панелей с сорбционной ёмкостью не менее 0,2-0,25 мкг на лунку обеспечивает максимальную чувствительность ИФА. При проверке панелей с различной сорбционной ёмкостью (от 0,1 мкг белка и выше) показано, что изменение концентрации для сенсибилизации твёрдой фазы от 1,5 до 100 мкг/мл не увеличивает чувствительность ИФА. Концентрация ^О (для любых панелей) более 20 мкг/мл нецелесообразна. По уровню разброса результатов по лункам (высчитывался коэффициент вариации - V) панели разделены на 3 категории: 1) с V. до 10 %, 2) с V до 20 % и 3) с V более 20 %. Для ИФА пригодны панели 1 и 2 категорий; панели 3 категории требуют многократных (5-6) повторов исследуемого образца антигена. Предложены статистические методы определения достоверной разницы между значениями оп-пгческой плотности (при 492 нм) опытных образцов (искомый антиген, инкубированный со специфическим ^О, сорбированным на твердой фазе - Р) и контрольных образцов (искомый антиген, инкубированный с "нормальным" сорбированным в параллельных лунках - Ы) и установлены

критерии положительного результата для различных категорий иммунопанелей. Для первой категории панелей положительный результат соответствует P/N ä 1,6; для второй категории - P/N >2,1. Тот и другой критерий рассчитан на однократный анализ антигена. Для определения антигенов прямым ИФА наиболее строгим и адекватным контролем нами предложен контроль в виде "нормального" IgG (выделенный из сыворотки неиммунного донора того же вида), которым сенсибилизировали лунки параллельно специфическому IgG. Таким образом, каждый исследуемый антигенный абразец оценивался по степени связывания со специфическим и "нормальным" IgG. Такой подход практически исключает ложноположи-тельные результаты, что особенно важно при массовом обследован™ сложных белковых смесей, которыми являются грубые суспензии органов диких животных (предложенная нами система эпизоотологического скрининга на основе прямого ИФА). Чувствительность разработанных нами ИФА-систем для определения антигенов на основе прямого варианта в среднем не ниже 10 нг/мл вирусспецифическо-го белка (например, нуклеокапсидные белки арена- и хантавирусов), или примерно 3 lg БОЕ/мл, что в 128-256 превышает чувствительность РСК.

Блок прямого варианта для определения суммарных антител (IgMHgG). Данный вариант является простой и удобной модификацией прямого ИФА, рассчитанной на определение антител заданной специфичности (в рамках конкретной системы прямого ИФА). В этом варианте исследуемый антиген заменяется стандартным антигеном, после чего добавляется исследуемая сыворотка и специфический конъюгат. Если в исследуемой сыворотке присутствуют гомологичные стандартному антигену антитела, то они связываются с эпитопами антигена и, таким образом, блокируют их взаимодействие с конъюгатом, в результате чего оптическая плотность (в сравнении с контролем - неиммунной сывороткой или буфером)

снижается. При уменьшении оптической плотности на 50 и более процентов сыворотка считается положительной. Основным моментом разработки этого варианта был выбор оптимальной дозы стандартного антигена (согласно нашим разработкам - 4-8 единиц от его титра в прямом ИФА). Чувствительность блока прямого ИФА для определения антител относительно невысока и превосходит чувствительность РСК в среднем в 32 раза, МФА - до 8 раз, значительно уступая чувствительности непрямого ИФА. Это обусловлено тем, что антитела исследуемой сыворотки (как правило, низкой авидности) конкурируют с высокоавидными IgG конъюгата за связь с эпитопами стандартного антигена. По этой же причине блок неэффективен при обследовании ранних сывороток - до 1 месяца от начала заболевания, в частности, у больных ГЛПС. Поэтому адекватная область применения блока - сероэпидемиологические исследования, при проведении которых нет возможности использовать непрямой вариант (глава 2). Важное преимущество варианта блока состоит в том, что этим методом можно анализировать иммунные препараты (сыворотки, ИАЖ, глобулины и т.д., за исключением моноклональных антител, если в системе используется специфический конъюгат на основе по-ликлонального IgG) независимо от их видовой принадлежности. Блок также является эффективным методом контроля специфичности результатов определения антигенов (прямым ИФА).

Непрямой вариант для определения антигенов и антител (IgM/IgG) с сенсибилизацией твёрдой Фазы специфическими антителами. Непрямые варианты ИФА основаны на использовании меченых антивидовых антител, которые выявляют связь (по видовому соответствию) исследуемой сыворотки (или стандартной - при определении антигена) со стандартным (или определяемым) антигеном. Стандартный (определяемый) антиген связан с сенсибилизированной гомологичным IgG твёрдой фазой, поэтому данный вариант ИФА для определения антител не требует

очистки стандартного антигена. Для сенсибилизации твёрдой фазы использовали специфические поли- и моноклональные IgG. При разработке и оптимизации данного варианта ИФА нами установлено, что диапазон доз стандартной сыворотки для определения антигенов узок (16-32 единицы), а диапазон доз стандартного антигена при определении антител достаточно широк (4-32 единицы). Предложенные нами системы на основе данного варианта ИФА превосходили чуствительность РСК при определении антигенов в 256-512 раз, при определении антител - в 5122048 раз (примерно 1-10 нг/мл глобулина).

Непрямой вариант для определения антител (IeM/IgG') с сорбцией стандартного антигена на твёрдую фазу. В этом варианте используется наиболее простой "сэндвич": стандартный антиген - исследуемая сыворотка - антивидовой конъюгат. На модели хантавируса Пумала (штамм CG-1820) нами предложен простой способ частичной очистки стандартного антигена: гель-фильтрация лизата инфицированных клеток Vero Е6 на колонке с Sepharose 4-6В. Аналогичным образом готовили контрольный антиген (из лизата неинфицированных клеток Vero Е6). Максимальные титры антител получали при использовании стандартного антигена в концентрации 15-60 мкг/мл. Чувствительность анализа - не ниже 0,1 нг/мл аффинно-очищенного иоликлонального IgG.

Вариант "мю-захвата" для определения специфических IgM с использованием рекомбинантного антигена, меченного биотином. Нами разработан оригинальный вариант "мю-захвата" для ранней серодиагностики ГЛПС с использованием очищенного рекомбинантного антигена (нуклеокапсидный белок хантавируса Пумала, штамм Sotkamo, экспрессированный в бакуловирусе), конъюгиро-ванного с биотином. Препарат рекомбинантного антигена предоставлен д-ром Vapalahti (Haartman Institute, Helsinki University). Рекомбинантный антиген представлял собой экстракт клеток Sf9 (овариальпая ткань куколки мотылька

Spodoptera frugiperda), инфицированных бакуловирусом, содержащим рекомби-нантный ген; экспрессированный N-белок вируса Пумала очищен ионообменной хроматографией. Биотинилирование антигена (0,1 мг/мл) проводили по методике, используемой дм антител. По чувствительности данный вариант не уступает классическому методу |i-capture (по Duermeyer, 1979) и даже превышает его в 1-2 разведения.

Точечный ИФА (дот-блот) для определения антигенов и антител. Дот-блот анализ (ДВА), как альтернативный микровариант ИФА с использованием в качестве твёрдой фазы нитро- и ацетатцеллголозных фильтров, для лабораторной диагностики хантавирусных инфекций был предложен нами впервые. Основанием для этого служили: более высокая сорбционная ёмкость фильтров, микроколичества используемых иммуносорбентов, простота исполнения (все инкубации можно проводить при комнатной температуре), визуальный учёт результата (контрастные пятна от 1+ до 4+ по степени интенсивности). ДБА для определения антигенов был разработан на основе прямого ИФА (аналогичный протокол) и по чувствительности не отличался от прототипа. ДБА для определения антител (IgM и IgG) основан на непрямом ИФА с сорбцией стандартного антигена на твёрдую фазу. Чувствительность - 5 нг/мл глобулина (например, аффинно-очищенного мо-ноклонального IgG к хантавирусу Пумала).

Таким образом, разработанные варианты ИФА представляли собой основу конструирования конретных ИФА-систем для проведения разнообразных исследований с вирусами различных семейств.

П. Применение иммуноферментпого анализа в лабораторной диагностике вирусных инфекций

Экспериментальные ИФА-системы были разработаны нами для лабораторной диагностики следующих вирусных инфекции (табл. 1). Пероксидазные диагно-

стикумы к данным арена- и буниавирусам были приготовлены и применялись впервые в исследовательской практике. ИФА-системы для лабораторной диагностики гепатитов А и В, клещевого энцефалита (КЭ) и лихорадки Чикупгупья были разработаны и применялись ранее другими авторами, однако мы готовили аналогичные системы, исходя из наших принципов конструирования, то есть в контексте данной работы. Кроме того, сероэпидемиологические исследования в Гви-

Таблица1

Вирусы - объекты исследований на основе ИФА

Семейство Вирусы Применение

АгепаУ1П(]ае Ласса, ЛХМ, Мачупо, Хунин, Такарибе Амапари, Тамиами Эпизоотологические, серологические, сероклинические исследования

Випуауитс1ае КГЛ-Конго (ККГЛ) Эпизоотологические, серологические исследования

Хантавирусы (Пумала, Хантан, Сеул, Добрава, Син Номбрэ, П. Хилл, Таиланд, Хабаровск, Тоттапалайамл др.) Эпизоотологические, серологические, сероклинические исследования, эпизоотологи-ческий мониторинг

Р1сопиплпс1ае Гепатита А Сероэпидемиологические исследования

Нера<1паУ1Пс1ае Гепатита В Сероэпидемиологические исследования

То£аутс1ае Чикунгунья Сероэпидемиологические исследования

Па\чушс1ае Клещевого энцефалита Эпизоотологические, серологические исследования

4

нейской Республике по этим инфекциям (за исключением КЭ) были проведены нами впервые (с использованием сконструированных на базе гвинейской лаборатории соответствующих ИФА-систем). Исследования в Гвинее, представленные в

данной работе, впервые продемонстрировали ещё одно важное преимущество ИФА: возможность быстрого конструирования ИФА-диагностикумов для проведения "срочных" (незапланированных) исследований, когда доставка, например, тысяч образцов крови местного населения из гвинейской лаборатории (Научно-исследовательская микробиологическая и вирусологическая лаборатория МЗ СССР - НИМВЛ) в базовую лабораторию (в ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН) была просто невозможной. Разработка той или иной тест-системы преследовала конкретную цель и была связана с определёнными направлениями исследований (эпизоотологическими, сероэпидемиолошческими и т.д.)

Аренавирусы. Необходимость создания эффективных диагностических систем для идентификации патогенных аренавирусов диктовалась высокой контаги-озностью и летальностью инфекций, вызываемых вирусами Ласса, Мачупо, Хунин в случае их завоза из-за границы. Кроме того, на территории бывшего СССР распространен еще один патогенный представитель аренавирусов - вирус ЛХМ. К началу данных исследований основными методами определения антигенов аренавирусов и специфических антител являлись РСК, МФА, реакция нейтрализации, РДПА, РНГА, иммуноэлектрофорез. Известные недостатки перечисленных методов не позволяли использовать их для прямой регистрации вирусспецифических антигенов в природных образцах и для массового экспресс-анализа сывороток.

Система эпизоотологического ИФА-скрининга. Возможность прямого обнаружения (в прямом и непрямом ИФА) вирусспецифического антигена в крови и гомогенатах органов инфицированных животных была продемонстрирована на модели вирусов ЛХМ и Хунин. Эта результаты легли в основу системы ИФА-скрининга диких и лабораторных животных при проведении эпизоотологических исследований. К началу нашей работы природные очаги ЛХМ, по крайней мере на территории СССР, были практически не изучены, а систематический котроль

контаминации лабораторных животных вирусом ЛХМ не проводился (вопреки рекомендациям ВОЗ). При обследовании в прямом ИФА 10 % суспензий мозга мелких млекопитающих 7 видов, отловленных в 18 районах Краснодарского края (1919 животных), и 15 видов, отловленных в 5 физико-географических зонах Грузии (16595 животных), антиген вируса ЛХМ обнаружен у 4 и 7 видов, соответственно. Результаты ИФА-скрининга по выявлению инфицированности вирусом ЛХМ серых и черных крыс и домовых мышей подтверждают полученные ранее в различных регионах мира данные о циркуляции этого вируса среди синан-тропных видов грызунов. Сведения об инфицированности вирусом ЛХМ четырёх видов мелких млекопитающих (обыкновенная, кустарниковая, водяная полёвки и обыкновенная бурозубка), обитающих в открытых стациях, получены нами впервые. Случаи изоляции вируса ЛХМ от лесных и желтогорлых мышей описаны ранее. Результаты ИФА-скрининга (в Грузии) были подтверждены выделением и идентификацией четырёх штаммов вируса ЛХМ от антиген-позитивных грызунов -двух серых крыс, домовой и лесной мышей (Иванидзе, 1990).

Контроль контаминации лабораторных животных. При систематическом обследовании в прямом ИФА суспензий органов (головной мозг, селезёнка, печень - всего 1755 проб от 524 животных) линейных и нелинейных лабораторных мышей и крыс питомников лабораторных животных РАМН ("Центральный", Столбовая", "Белый мох", Коллекционный фонд НИЛ биомоделей РАМН) антиген вируса ЛХМ в низких титрах выявлен у 3-х мышей линии ВАЬВ/с и у нелинейной крысы.

ИФА в лабораторной диагностике нейроинфскций, ассоциированных с вирусом ЛХМ. В структуре нейроинфскций заболевания, вызываемые вирусом ЛХМ, составляют около 10%. С помощью непрямого ИФА обследовано 425 больных (1041 проба крови и спинномозговой жидкости - СМЖ). Основными группами

заболеваний с предполагаемым участием вируса ЛХМ были серозные менингиты, энцефалиты и энцефалитоподобные заболевания, церебральные арахноидиты, лихорадочные заболевания неясной этиологии. Антитела (^О) к вирусу ЛХМ обнаружены в сыворотках у 26 больных (13 больных с серозным менингитом, 1 с энцефалитом, 1 с церебральным арахноидитом, 1 с лихорадочным заболеванием неясной этиологии, 3 с боковым амиотрофическим склерозом - БАС) , из них у 8 антитела найдены и в СМЖ. Титры антител по данным непрямого ИФА в крови колебались от 1:8 до 1:4096, в СМЖ - от 1:4 до 1:128. Нарастание титров антител наблюдалось, как правило, до 3-4 недель (в ряде случаев - до года) от начала заболевания, затем наступала их стабилизация и постепенное снижение. У больных менингитами титры антител были в целом выше, чем у больных энцефалитами. Корреляция между уровнем титров антител и тяжестью заболевания не обнаружена. Исследование динамики сероконверсии (^в) у больных с клиническим диагнозом серозный менингит (обследовано 24 парных и 34 единичных сыворотки от 46 пациентов) показало существенную разницу в результатах МФА и ИФА. По данным непрямого ИФА нарастание титров может длиться до 1 года, сменяясь затем постепешшм снижением (до 6 лет), в то время как пик антителообра-зования по результатам МФА приходится на месяц от начала заболевания.

Следующий раздел исследований касался вопроса этиологической роли вируса ЛХМ в пренаталыюй невропатологии человека - в развитии тератогенных процессов плода : гидроцефалии, микроцефалии, хориоретинита. В непрямом ИФА (и параллельно в МФА) проведено обследование 14 детей с врожденной инфекцией вирусом ЛХМ (клинический днагноз: гидроцефалия, хориоретинит, микроцефалия). Сыворотки детей обследовали параллельно с сыворотками матерей, перенесших инфекцию вирусом ЛХМ во второй половине беременности. В непрямом ИФА наличие антител (^О) к вирусу ЛХМ подтверждено во всех 14

случаях (мать-ребенок). В МФА титры антител у детей и матерей варьировали от 1:2 до 1:512, в непрямом ИФА - от 1:8 до 1:4096 (средняя арифметическая величина титров в МФА 1:47,8, в ИФА - 1:952,2).

ИФА в лабораторной диагностике лихорадки JIacca: эпизоотологические и серологические исследования в Гвинейской Республике (ГР). Вирус JIacca экологически связан с многососковой крысой Mastomys natalensis, широко распространенной в Африке к югу от Сахары. К началу нашей работы единственным (косвенным) свидетельством наличия природных очагов лихорадки Ласса на территории ГР были данные ограниченных серологических исследований сывороток миссионеров-европейцев из Телекоро (Лесная Гвинея, Henderson et al.,I972). Для получения прямых доказательств циркуляции вируса Ласса на территории ГР нами были проведены эпизоотологические исследования с использованием ИФА-скрининга - определение антигена вируса Ласса в гомогенатах органов мелких млекопитающих. Такой методический подход был разработан и применён впервые. Определение антигена вируса Ласса проводили непрямым и прямым ИФА. В непрямом ИФА обследовано 153 животных (10 % суспензии мозга, печени, селезенки, почек, инактивированные формалином) 10 видов (из них 129 - Mastomys natalensis), отловленных в префектуре Киндиа (Средняя Гвинея, граничащая со Сьерра-Леоне). Антиген вируса Ласса обнаружен у 3-х Mastomys natalensis; в непрямом ИФА антиген был дифференцирован от антигена вируса ЛХМ. В прямом ИФА обследовано 874 суспензии печени животных 16 видов отряда Rodentia и 1 вида отряда Insectivora (Mastomys natalensis - 48 %, Myomys daltoni 23 %, Mus musculus - 7 % и 22 % - другие виды), также отловленных на территории префектуры Киндиа. Выявлено 4 положительных и 5 сомнительных образцов (следы антигена) от Mastomys natalensis, отловленных в окрестностях г. Киндиа. Положительные образцы были также обследованы в прямом ИФА на наличие антигена

вируса ЛХМ с отрицательными результатами. Представленные данные являются прямым доказательством наличия природных очагов вируса Ласса в Гвинее, по крайней мере на территории префектуры Киндиа. Достоверные сведения о манифестациях лихорадки Ласса среди населения этой префектуры, как и в целом по Гвинее, отсутствуют. Собственные серологические исследования проводились в ограниченном объёме: в непрямом ИФА со стандартным антигеном вируса Ласса, штамм .^¡аЬ, обследованы 12 сывороток жителей префектуры Киндиа (здоровые доноры), в одной сыворотке (И 7851) обнаружены антитела ОйО) к вирусу Ласса в титре 1:256 при отсутствии антител к вирусу ЛХМ (по результатам непрямого ИФА). Это первые данные по обнаружению антител к вирусу Ласса у коренного населения ГР. Позднее результаты наших исследований, свидетельствующие о наличии природных очагов вируса Ласса на территории ГР, получили подтверждение (серологические исследования Лукашевича, 1992; генетические исследования учёных института тропической медицины Бернхарда Нохта в Гамбурге, 1997).

Буниавирусы. ИФА в лабораторной диагностике КГЛ-Конго. К началу нашей работы лабораторная диагностика КГЛ-Конго основывалась на традиционных методах : РСК, РДПА, МФА, РНГА, нейтрализации, РГА, РТГА, РТНГА. Разработанные нами ИФА-системы использовались в эпизоотологических и серологических исследованиях. При скрининге (прямой ИФА) 10 видов млекопитающих, отловленных в 5 районах Краснодарского края, антиген вируса КГЛ-Конго обнаружен в суспензиях мозга обыкновенной полёвки, лесной, полевой, домовой мыши. При обследовании суспензий пулов иксодовых и гамазовых клещей, собранных с крупного рогатого скота в тех же районах, антиген вируса КГЛ-Конго обнаружен у клещей ОегтасепЮг таг^паЩз. Аналогичный скрининг, проведённый в Грузии (обследовано 16595 млекопитающих 15 видов, отловленных на территории 5 физико-географических зон), не дал положительных результатов.

При обследовании 9 видов клещей антиген вируса КГЛ-Конго обнаружен у иксо-довых (Hyalomma plumbeum) и аргасовых (Ornitodorus asperus) клещей. При скрининге 10 видов млекопитающих ГР антиген вируса КГЛ-Конго не обнаружен. В непрямом ИФА при обследовании 548 сывороток здорового населения различных префектур ГР антитела (IgG) к вирусу КГЛ-Конго обнаружены у 8,8% обследованных лиц. Факты определения антигена вируса КГЛ-Конго с помощью ИФА-скрининга в суспензиях клещей (виды, из которых выделены штаммы этого вируса) говорят об эффективности такого подхода в изучении эпидемиологии и экологии КГЛ-Конго. Обнаружение вирусспецифического антигена при ИФА-скрининге мелких млекопитающих (Краснодарский край) - еще одно доказательства их роли в экологии этого вируса.

ИФА в лабораторной диагностике хантавирусных инфекций. К началу данных исследований лабораторная диагностика хантавирусных инфекций (ГЛПС) основывалась на МФА, иммуносорбентная техника (ИФА, РИА) не была разработана. Предложенная нами система эпизоотолошческого ИФА-скрининга получила наиболее полное развитие и была методической основой в широкомасштабных исследованиях по изучению циркуляции и распространения хантавирусов на территории бывшего СССР и за его пределами. К началу наших исследований в качестве природного резервуара хантавирусов рассматривались только 4 вида мелких млекопитающих: рыжая и красная полёвки (в европейских очагах) и полевая мышь и дальневосточная полёвка (в азиатских очагах). Для определения антигенов хантавирусов в суспензиях органов (преимущественно в лёгочной ткани) диких млекопитающих нами была разработана родоспецифическая ИФА-система (прямой вариант) на основе сывороток реконвалесцентов с высоким уровнем антител к хантавирусу Пумала (согласно нашим критериям оценки поликлональных сывороток). Родоспецифичность данной системы основана на доказанном нами

одностороннем серологическом перекресте между вирусом Пумала и остальными хантавирусами: анти-Пумала IgG взаимодействует с иммунодоминантным антигеном хантавирусов- нуклеокапсидным белком (N-белком), который кодируется S-сегмеитом РНК хантавирусов. Таким образом, анти-Пумала IgG, аффинно очищенный из сыворотки реконвалесцента, является универсальным иммунным препаратом, на основе которого была сконструирована родоспецифическая ИФА-система для детекции N-белка хантав1фусов (из них патогенные: Пумала, Хантан, Сеул, Добрава, Син Номбрэ). Для дополнительной оценки специфичности данной системы мы имели возможность использовать моноклональные антитела (МКА) и полимеразную цепную реакцию. Для этого были разработаны родоспецифическая и типоспецифическая моноклональные ИФА-системы для определения антигенов хантавирусов. Родоспецифическая система была приготовлена на основе МКА к N-белку вируса Пумала и выявляла антигены перечисленных хантавирусов (аналогично полнклональной системе, но в меньших титрах). Типоспецифическая система была приготовлена из родоспецифического МКА (иммуносорбент), регистрация связанного антигена проводилась типоспецифическими МКА к вирусу Пумала, меченных биотином, и выявляла только антиген этого вируса. Данная система также является оригинальной и использовалась при типировании (на уровне Пумала-не Пумала) хантавирусных антигенов в лёгочных суспензиях диких 1рызунов, выявленных в результате родоспецифического ИФА-скрининга. Результаты ПЦР и секвенирования (использовалась обратно-транскриптазная ПЦР по Nichol et al., 1993, а также "гнездовая" ПЦР и реамплификация), то есть анализа препаратов РНК, выделенных из антиген-позитивных лёгочных суспензий (по данным ИФА-скрининга), показали, что все анткгенсодсржащис образцы (проверено несколько десятков таких образцов) были положительными в ПЦР и все антиген-отрицательные образцы (также несколько десятков) были отрицательными в ПЦР.

Таким образом, специфичность поликлональной системы ИФА-скриниига получила исчерпывающие подтверждение; сама же система дополнена типированием и генетическим анализом. Очевидно, что наличие хантавирусного антигена у грызунов является наиболее адекватным маркёром естественной инфекции. Ориентация на другой маркёр (антитела у зверьков) может дать менее чёткое представление об эпизоотическом процессе, поскольку имеется немало несовпадений по определению антител (с одной стороны) и антигена и РНК - с другой. "Антительный" скрининг, тем не менее, важен, поскольку в совокупности с "антиг енным" скринингом даёт дополнительную информацию об эпизоотическом процессе. Для определения антител (1^) к вирусу Пумала у зверьков нами предложен (впервые) вариант дот-блот анализа с использованием нативного или рекомбинантного антигенов в качестве стандартных, который эффективнее МФА и может использоваться в экспедиционных условиях. Дот-блот также разработан и для скрининга антигенов (вариант родоспецифической поликлональной ИФА-системы, не уступающий ей . по чувствительности и специфичности).

Разработанная нами система ИФА-скрининга на протяжении ряда лет является базовым методом разведки природных очагов ГЛПС, определения видового состава млекопитающих-носителей хантавирусов, а также эпизоотологического мониторинга. С её помощью была получена основополагающая информация о географическом распространении хантавирусов, о неизвестных ранее природных очагах ГЛПС и о видовом составе млекопитающих-носителях хантавирусов не только на территории бывшего СССР, но также в Бельгии, Германии, Словакии, Чехии, Швеции. Начиная с 1981 г., на присутствие антигенов хантавирусов в прямом ИФА обследовано более 300000 мелких млекопитающих (10-20 % грубые суспензии лёгочной ткани) 74 видов, принадлежащих к 14-ти семействам, входящих в 5 отрядов. Животные были отловлены на 62-х административных территориях

сотозных и автономных республик, краев и областей, расположенных практически во всех ландшафтных зонах (кроме тундры) СССР: таежной, смешанных и широколиственных лесов, лесостепной, степной, полупустынной, пустынной и горной Европейской части, Западной и Восточной Сибири, Средней Азии и Казахстана, Дальнего Востока. Антигены хантавирусов обнаружены у 52-х видов, принадлежащих к 10-ти семействам 5-ти отрядов. С помощью ИФА-скрининга антигены хантавирусов обнаружены также в лёгочных суспензиях 13 видов птиц, отловленных на Дальнем Востоке; из одного антигенпозитивного образца выделен штамм, идентифицированный как вирус Хантан (вЬпоуа е1 а1., 1992).

ИФА-системы в серологической диагностике хантавирусных инфекций. Впервые для серологической диагностики ГЛПС нами разработаны 5 ИФА-систем для определения специфических ^М и [^в. Из них отметим следующие. Системы (непрямой вариант) с использованием моноклональных и поликлональных антител к вирусам Пумала и Хантан (для сенсибилизации твёрдой фазы) и неочищенного стандартного антигена. С помощью этих систем получены первые результаты по определению динамики формирования 1{>М у больных ГЛПС. Принципиально новая система определения ^М к вирусу Пумала с использованием биотинилиро-ванного рекомбинантного антигена (К-белка вируса Пумала), эксперессированно-го в бакуловирусе. На сегодняшний день это наиболее эффективная система определения 1§М, поскольку последний непосредственно связывается с меченым стандартным антигеном. В качестве альтернативного варианта нами предложен дот-блот ИФА для определения ^М и к вирусу Пумала с сорбцией частично очищенного нативного или рекомбинантного антигена вируса Пумала на ацетат-нитроцеллюлозные фильтры.

Пикорна- и гепадпавирусы. Полное отсутствие информации о распространении вирусных гепатитов А и В в Гвинейской Республике явилось основанием для

проведения масштабных исследований, целью которых было определение серологических маркёров этих инфекций в сыворотках крови гвинейского населения -суммарных антител к вирусу гепатита А (анти-ВГА) и поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg). Анти-ВГА определяли методом блока. Обследовано 812 сывороток здорового населения 4-х префектур ГР, анти-ВГА обнаружены у 67% обследованных лиц. Частота обнаружения анти-ВГА у детей (77 ± 4 %) достоверно выше (р < 0,05), чем у взрослых (65 ± 2 %). Наиболее часто (до 84 %) анти-ВГА определялись в возрастных группах до 31 года. Частота обнаружения ан-ти-ВГА у жителей города (75 %) выше, чем у жителей сельской местности (40 %). Определение титров анти-ВГА подтвердило раннее приобретение анти-ВГА с последующим спадом: титры анти-ВГА у детей (7,9 ± 0,35 ^2) выше (р < 0,05), чем у взрослых (6,2 ± 0,26 log2). Титры анти-ВГА в сыворотках юродского населения (6,9 ± 0,28 log2) выше (р <• 0,05), чем в сыворотках сельского населения (6,3 ± 0,45 1оц2). В прямом ИФА также обследовано около 900 мангровых устриц (на наличие антигена ВГА), обитающих в прибрежных водах Атлантического океана; выявлены положительные образцы, что указывает на возможную роль съедобных моллюсков в распространении ВГА среди населения ГР. Определение HBsAg. В прямом ИФА обследовано 1199 проб сывороток. Частота HBsAg-нocитeльcтвa - 16%. Достоверных различий частоты обнаружения HBsAg у детей и взрослых, сельских и городских жителей, мужчин и женщин не установлено. Результаты определения данных маркёров близки к результатам, полученным при аналогичных исследованиях в других странах Западной Африки.

Тогавирусы (вирус Чикунгунья). В непрямом ИФА и блоке проведены исследования по определению иммунной прослойки населени ГР по отношению к данному вирусу (подобные исследования в ГР ранее не проводились). Обследованы

-311093 сыворотки здорового населения 9 префектур Верхней, Средней и Нижней Гвинеи. Общее количество серопозитивных лиц составило 51,7% (наличие специфического IgG). Отмечено достоверное различие в проценте серопозитивных лиц между возрастными группами до 20 лет и старше. Также отмечена достоверная разница в серологической прослойке между указанными префектурами.

Флавивирусы (вирус клещевого энцефалита). К началу нашей работы ИФА-системы определения вирусспепифического антигена и антител были уже предложены, однако комплексный анализ лабораторной диагностики КЭ на основе различных вариантов ИФА проведен нами впервые. Это касается детекции антигена в природных образцах (эпизоотологический ИФЛ-скрининг) и серологических исследований. При скрининге 6 видов мелких млекопитающих (Краснодарский край) антиген вируса КЭ обнаружен у обыкновенной полёвки, лесной и домовой мышей. Антиген обнаружен также в пулах клещей Dermacentor marginatus и Ixodes ricinus. Обширный скрининг 15 видов млекопитающих, отловленных в 5 географических зонах Грузии, не дал положительных результатов, однако антиген был обнаружен в пулах Dermacentor marginatus. ИФА-системы для определения антител продемонстрировали высокую эффективность как для серологической диагностики КЭ, так и для оценки поствакциналького иммунитета у вакцинированных лиц.

ПТ. Разработка и внедрение в производство коммерческих иммуноферментных тест-систем.

Положительный опыт применения лабораторных ИФА-систем позволил перейти к заключительному этапу - созданию полных диагностических наборов, пригодных для использования как в специализированных вирусологических лабораториях, так и в учреждениях практического здравоохранения (центрах санэпид-надзора, противочумных станциях и т.д.). Объективная потребность в таких наборах существует.

Иммунофермснтная тест-система для определения антигенов хантавирусов -ХАЫТАГНОСТ. ХАНТАГЫОСТ (товарный знак, диашосгакум защищен авторским свидетельством) рассчитан прежде всего для определения антигенов большинства известных хантавирусов в грубых суспензиях органов диких животных (мониторинг эндемичных территорий, разведка природных очагов ГЛПС и т.д.). Тест-система обеспечивает быстрый скрининг (в течение 24 часов) сотен образцов. Учет результатов проводится фотометрически, либо визуально. Чувствительность - не ниже 10 нг/мл вирусспецифического белка ( 1Ч-белка). ХАЫТАГНОСТ представляет собой полный диагностический набор для прямого варианта ИФА (12-ти компонентный), состоящий из специфических компонентов (специфический и "нормальный" ^О для сенсибилизации иммунопанели, перокси-дазный специфический коньюгат, контрольный антиген) и неспецифичсских - концентраты буферов, ферментный субстрат, иммунопанель и т.д.). Один комплект рассчитан на обследование 47 образцов. Принцин конструирования данной тест-системы соответствует её лабораторной модели (иоликлональная родоспецифиче-ская ИФА-система для определения антигенов хантавирусов). Детальное описание технологического цикла изготовления, стандартизации и контроля тест-системы представлено в разработанной и утверждённой нормативно-технической документации (приложение к диссертации).

С 1992 г. ЭПП ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН выпущено и реализовано 25 коммерческих серий (по 100-200 комплектов в серии) тест-системы. Потребители (более 30 организаций) - центры санэпиднадзора, противочумные станции, вирусологические лаборатории НИИ.

Перспективные иммунофермгцтные тест-системы: для определения 1аМ и 1еО к хантавирусам и для определения антигена вируса ЛХМ. ИФА-система для определения ^М и 1еО непрямым ИФА к хантавирусам предназначена для ранней

серологической диагностики ГЛПС (определение IgM ) и для сероэпидемиологи-ческих исследований (определение IgG). Тест-система основана на использовании частично очищенного антигена хантавируса, сорбированного на твердую фазу. Источник антигена - лизат инфицированных хантавирусом клеток Vero Е6, инактивированный формалином. Метод очистки антигена - гель-фильтрация на колонке большого объема (до 300 мл) с Sepharose 4В (6В) для получения препаративного количества антигена. Аналогичным способом готовится "нормальный" антиген (из лизата неинфицированных клеток Vero Е6) для параллельной сорбции на твердую фазу. Таким образом, каждое разнедение исследуемой сыворотки оценивается по степени связывания со специфическим и "нормальным" антигеном. Предусмотрено использование поливалентного антигена - смеси антигенов минимум двух хантавирусных серотипов (Пумала и Хантан) для определения антител различной типоспецифичности. Для селективной детекции специфических антител классов М и G используют пероксидазные коиъюгаты против IgM и IgG человека. Тест-система также может использоваться для определения антител к хан-тавирусу в сыворотках животных, для этого необходимы только пероксидазные конъгогаты против иммуноглобулинов соответствующих видов животных. Тест-система комплектуется референс-сывороткой и всеми необходимыми неспецифическими компонентами для ИФА. Чувствительность тест-системы - не ниже 0,1нг/мл IgG. Стартовое разведение исследуемых сывороток - 1:64- 1:256. Возможен вариант тест-системы на основе дот-блот анализа.

Иммуноферментная тест-система для определения антигена вируса ЛХМ основана, как и ХАНТАГПОСТ, на прямом варианте ИФА. Тест-система предназначена для определения антигена вируса ЛХМ в грубых суспензиях органов лабораторных животных (грызунов) как метод контроля контаминации этим вирусом, а также для эпизоотологичсских исследований. Источником специфиче-

ского IgG служат гипериммунные сыворотки лабораторных животных и ИАЖ. Технология изготовления и параметры тест-системы полностью соответствуют ХАНТАГНОС'Г. Многолетнее интенсивное использование лабораторной модели тест-системы показали ее высокую эффективность. Инструкция но изготовлению и контролю и инструкция по применению тест-системы утверждены, а сам диагно-стикум рекомендован к внедрению в медицинскую практику (протокол N I заседания КВС МЗ СССР от 9.09.1983 г., приложение к диссертации). Также возможен вариант тест-системы на основе дот-блот анализа.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны стандарты, принципы конструирования и оптимизации тест-систем на основе 6 вариантов ИФА для определения вирусспсцифических антигенов и антител.

2. Разработаны ИФА-системы для лабораторной диагностики инфекций, вызываемых вирусами 6 семейств: Arenaviridae, Bimyaviridae, Flaviviridae, Hepadnaviridae, Picomaviridae, Togaviridae. Из них системы для лабораторной диагностики арена- и буниавирусных инфекций (КГЛ-Конго, хантавирусы) предложены впервые.

3. На примере поликлоиальной ИФА-системы для определения антигенов хантавирусов эксперименально доказана равнозначность поликлональных и моно-клопальных скрининговых ИФА-систем. С помошью полимеразной цепной реакции продемонстрирована высокая специфичность поликлональных ИФА-систем дегекции антигенов, сконструированных согласно разработанным принципам.

4. Разработан и внедрён в исследовательскую практику и в практику здравоохранения принципиально новый методический подход в эпизоотологических исследованиях: система ИФА-скрининга природных образцов (определение вирус-

специфических антигенов в грубых суспензиях органов диких животных), впервые позвол1гвшая проводить широкомасштабные эпизоотологические исследования (разведка природных очагов зоонозных вирусных инфекций, изучение эпизоотических и эпидемических процессов) и осуществлять постоянный мониторинг эндемичных территорий. Данная система является основным элементом эпизоотологи-ческих исследований в рамках изучения хантавирусных инфекций в России.

5. На основе моноклональных антител разработана ИФА-система типиро-лания антигенов хантавирусов непосредственно в природных образцах, что является дополнительным элементом системы эпизоотологического ИФА-скрининга.

6. Разработана система ИФА-скрининга диких животных (определение хантавирусных антигенов и антител) с использованием более доступного варианта ИФА - дот-блот анализа. Таким образом, проведение эпизоотологического ИФА-скрининга возможно в двух взаимодополняющих вариантах: определение антигенов и антител.

7. Анализ представительного экспериментального материала по результатам применения ИФА в конкретных исследованиях с вирусами семейств Агепаутёае, Випуаут'Лае, Р1а\'тпс!ае, НерасЬча'Лт^ае, Р1согпаушсЗае, Togaviridae показал высокую эффективность метода. С помощью разработанных ИФА-систем получены приоритетные данные, касающиеся различных аспектов изучения вирусов, играющих важную роль в инфекционной патологии человека. Результаты проведенных исследований позволяют говорить о создании системы лабораторной диагностики вирусных инфекций на основе ИФА. В этот комплекс входят как рутинная диагностика (например, серологическая), так и методы чисто поисковых исследований (эпизоотологических, сероэпидемиологических, серологических и т.д.).

-368. На основе положительного опыта применения экспериментальных ИФА-систем предложены подходы к конструированию серийных (коммерческих) диаг-ностикумов. Разработана и утверждена нормативно-техническая документация для серийного выпуска поликлональной универсальной тест-системы определения антигенов известных хантавирусов (минимум 10-ти), представляющая собой практическую реализацию системы эпизоотологического ИФА-скршшнга. Освоен серийный выпуск данной тест-системы (ХАНТАГНОСТ, авторское свидетельство, товарный знак).

9. Предложены разработки перспективных ИФА-тест-систем для серийного выпуска: для определения антител классов М и G к хантавирусам (серологическая диагностика ГЛПС, сероэпидемиологические исследования) и для определения антигена вируса JIXM (зпизоото логический скрининг).

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Tka.chenko Е.А., Rezapkin G.V., Ivanov А.P., Dzagurova Т.К., Drozdov S G. Further development of laboratory technique for the detection of arenaviruses. - In Abstr. 10th Intern. Congr. Trop. Med. Malaria, Manila, 1980, p. 49.

2. Tkachenko E.A., Ivanov A.P., Rezapkin G.V., Donets M.A., Dzagurova Т.К., Drozdov S.G. Immunosorbent assays for rapid diagnosis of viral haemorrhagic fevers. -In Abstr. 5th Intern. Congr. Virol., Strasbourg. 1981, p. 203.

3. Ivanov A.P., Bashkirtsev V.N., and 'ITcachenko E.A. Enzyme-linked immunosorbent assay for detection of arenaviruses. - Arch. Virol., 1981, v. 67, p. 71-74.

4. Tkachcnko E.A., Ivanov A.P., Dzagurova Т.К., Donets M.A., Rezapkin G.V., Leshchinskaya E.V., Zagidulin U.M., Ivanova A.A., Stadukhin О. V., Mustafm N.M., Savinova T.I. Immunosorbent assays for diagnosis of HFRS. - The Lancet, 1981, August l,p. 257-259.

-375. Иванов Л.П., Башкирцев В.Н., Ткаченко Е.А. Разработка и применение имму-ноферментативного метода для диагностики аренавирусных инфекций. - Вопр. вирусов, 1981, No. 2, с. 200-203.

6. Резапкин Г.В., Ткаченко Е.А., Иванов А.П., Башкирцев В Н., Дзагурова Т.К. Определение аренавирусных антигенов и антител методом твердофазного радиоиммунологического анализа. - Вопр. вирусол., 1981, No. 4 с. 4-3^-463.

7. Ткаченко Е.А., Донец М.А., Дзагурова Т.К., Иванов А.П., Резапкин Г.В., Ле-щинская Е.В., Иванова А.А., Стадухин О.В., Мустафин Н.М., Степаненко А.Г., Савинова i.m. **C""7"",HcrB0Ija!;;'s лабораторной диагностики ГЛПС. - Вопр. вирусол., 1981, No. 5, с. 618-621.

8. Donets М.А., Rezapkin G.V., Ivanov А.P., and Tkachenko Е.А. Immunosorbent assays for diagnosis ofCCHF. - Am. J. Trop. Med.Hyg., 1982, 31 (l),p. 156-162.

9. Tkachenko E.A., Donets M.A., Rezapkin G.V., Dzagurova Т.К., Ivanov A.P., Leshchinskaya E.V., Reshetnikov I., Drozdov S.G., Slonova R.A., Somov G.P. Serotypes of IIFRS virus in east european and far eastern U S.S R. - The Lancet, 1982, April 10, p. 863.

10. Ткаченко E.A., Дзагурова Т.К., Иванов А.П., Резапкин Г.В., Башкирцев В.Н., Деконенко Е.П., Королев М.Б. Усовершенствование лабораторных методов диагностики аренавирусных инфекций. - Вопр. вирусол., 1983, No. 2, с. 211-215.

И. Рыльцева Е.В., Ткаченко Е.А., Донец М.А., Иванов А.II., Дзагурова Т.К., Мустафин Н.М., Степаненко А.Г. Некоторые характеристики эпизоотического процесса у мелких млекопитающих в природных очагах ГЛПС, отловленных в окрестностях Уфы. - Мед. паразитол. и паразитар. болезни, 1983, No. 3, с.' 15-8. 12. Van der Groen G., Tkachenko E.A., Ivanov A.P., Verhagen R. Haemorrhagic fever with renal syndrome related virus in indigenous wild rodents in Belgium. - The Lancet, 1983, July 9, p. 110-111.

-3813. Tkachenko E.A., Ivanov A.P., Donets M.A., Miasnikov Y.A., Ryltseva E.V., Gaponova L.K., Bashkirtsev V.N., Okulova N.M., Drozdov S.G. Potential reservoir and vectors of HFRS in the U.S.S.R. - Ann. Soc. beige Med. trop., 1983, 63, p. 267-269.

14. Ivanov A.P., Rezapkin G.V., Dzagurova Т.К., Tkachenko Е.Л. Indirect solid-phase immunosorbent assays for detection of arenavirus antigens and antibodies. - Acta virol., 1984,28. p. 240-245.

15. Tkachenko E.A., Butenko A.M., Leshchinskaya E.V., Boiro I., Ivanov A.P., Dzagurova Т.К., Sochinski. Serological investigation of population from the People's Revolutionary Republic of Guinea for antibodies to viral haemorrhage ^CVers. - In Abstr. 11 th Intern Гопст- Trcp. Mcu. Malaria, Calgary, 1984,p. 222.

16. Ткаченко E.A., Деконенко Е.П., Иванов А.П., Королев М.Б., Резатсин Г.В. Результаты серологического обследования больных боковым амиотрофическим склерозом. - Вопр. вирусод., 1984, No. 2, с. 191-195.

17. Тинкер Ю.А., Дранов И.Ю., Иванов А.П., Резапкин Г.В., Башкирцев В.Н., Брудный Р.А., Ткаченко Е.А. Изучение природной очаговости КГЛ, КЭ, JIXM на территории Краснодарского и Ставропольского краев. - "Особоопасные инфекции на Кавказе", тез. докл., Ставрополь, 1984, с. 73.

18. Dekonenko Е.Р., Ivanov А.Р., Andreeva L.S., and Tkachenko Е.А. Appearance of antibodies to two viruses in cerebrospinal fluid of patients with aseptic meningitis. - Acta Neurol. Scand., 1985, 71, p. 146-149.

19. Башкирцев B.H., Иванов А.И., Деконенко E.II., Пиванова Г.П., Воробьева М.С., Ладыженская И.П. Иммуноферментный метод в диагностике клещевого энцефалита. Вопр. вирусол., 1986, No. 1, с. 96 - 100.

-3920. Danes L., Tkachenko E.A., Ivanov A.P., Lim D., Rezapkin G.V., Dzagurova Т.К. HFRS in Czechoslovakia: detection of antigen in small terrestrial mammals and specific serum antibodies in man. - J. Ilyg. Epidemiol. Microbiol. Immnuol., 1986, 30, p. 79-85.

21. Verhagen R., van dcr Groen G., Ivanov A.P., van Rompaey J., Leirs H., Verheyen W. Occurrence and distribution of hantavirus in wild living mammals in Belgium. - Acta virol., 1986, 31, p. 43-52.

22. Деконенко Е.Г1., Ткаченко E.A., Уманский К.Г., Иванов А.П., Рсзапкин Г.В., Дзагурова Т.К., Куприянова JI.B., Рудометов Ю.П. Частота и особенности нейро-инфекций, вызываемых вирусом лимфоцитарного хориоменингита. - Журн. невропатологии и психиатрии им. Корсакова., 1986, т. 136 (2), с. 171-175.

23. Иванов А.П., Ткаченко Е.А., ван дер Грун Г., Бутенко A.M., Константинов O.K. Непрямой иммуноферментный метод для лабораторной диагностики геморрагических лихорадок Ласса иЭбола. - Вопр. вирусол.,1986, No. 2, с. 186-190.

24. Резапкин Г.В., Иванов А.П., Ткаченко Е.А., ван дер Грун Г. Оценка результатов прямого твердофазного ИФМ для определения антигенов. - Воир. вирусол., 1986, No. 5, с. 573-577.

25. Ткаченко Е.А., Рыльцева Е.В., Мясников Ю.А., Иванов А.П., Резапкин Г.В., Татьянченко Л.А., Пашков А.Я. Изучение циркуляции вируса ГЛПС среди мелких млекопитающих на территории СССР. - Вопр. вирусол., 1987, No. 6, с. 709-716.

26. Ivanov А.P., Labzin V.V., Ivanova О.Е., Tkachenko Е.А. Investigations on Hantaan virus in the Republic of Guinea. - In Abstr. 29th Intern. Colloquium "Hantaviruses", Antwerpen, 1987.

27. Ivanov A.P., Ivanova O.E., Pozdnyakov S.V. HBsAg carriers in the Republic of Guinea. - Ann. Soc. beige Med. trop., 1987, 67, p. 301.

28. Ivanov A.P., Tkachenko E.A., Petrov V.A., Pashkov A.J., Dzagurova., Vladimirova T.P., Voronkova G.M., van der Groen G. Enzyme immunoassay for the detection of

virus specific IgG and IgM antibody in patients with HFRS. - Arch. Virol., 1988, 100, p. 1-7.

29. Tkachenko E.A., Ivanov A.P., Rezapkin G.V., Drozdov S.G. Immunosorbent methods for the detection of HFRS antigens and antibodies. In "Manual of HFRS", WHO Coll. Center for Virus Ref. Research, Korea University (Seoul), 1989, p. 88-93.

30. Иванов А.П., Иванова O.E., Поздняков С.В., Анджапаридзе А.Г., Кусов Ю.Ю., Допец М.А. Результаты серологических исследований по определению маркеров гепатитов А и В в сыворотках крови населения Гвинейской Республики. - Вопр. вирусол., 1990, No. 5, с. 382-384.

31. Niklasson В., Tkachenko Е.А., Ivanov A.F., van der Groen G., Wiger D., Andersen H.K., LeDuc D., Kjelsson Т., Nystrom K. HFRS: evaluation of ELISA for detection of Puumala-virus-specific IgG and IgM. - Res. Virol., 1990,141, p. 637-648.

32. Ivanov A.I\, Ivanova O.E., Lomonosov N.N., Pozdnyakov S.V., Konstantinov O.K., Mamadou Alpha Bah. Serological investigations on Chikungunya virus in the Republic of Guinea. - Ann. Soc. beige Med. trop., 1992, 72, p. 73-74.

33. Ivanov A.P., Dzagurova Т.К., Rezapkin G.V., Tkachenko E.A. Laboratory techniques for detection of hantavirus antigen and antibodies. - Abstr. 3rd Intern. Symp. on Arboviruses and Hantaviruses in Mediterranian Countries, Italy, 1992, p. 56-57.

34. Ivanov A., Dzagurova 'Г., Tkachenko E. Dot-ELISA techniques for laboratory diagnosis of Puumala virus infection. - Abstr. 3rd Intern. Conf. on HFRS and Hantaviruses, Finland, 1995, p. 83.

35. Иванов А.П., Дзагурова Т.К., Ткаченко E.A. Дот-блот анализ в лабораторной диагностике геморрагической лихорадки с почечным синдромом. - Вопр. вирусол., 1996, No. 1, с. 6-8.

36. Деконенко А.Е., Ткаченко Е.А., Липская Г.Ю., Дзагурова Т.К., Иванов А.П., Иванов Л.И., Слонова P.A., Маркешин С.А., Иванидзе Э.А., Шуткова Т.М., Яки-