Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Совершенствование средств и методов диагностики ВИЧ-инфекции

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Совершенствование средств и методов диагностики ВИЧ-инфекции"

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ СТАНДАРТИЗАЦИИ И КОНТРОЛЯ МЕДИЦИНСКИХ БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ им. Л.А. ТАРАСЕВИЧА

:-ГЗ од

¿ " ' "> Л *7

УС и "•::(

На правах рукописи ■ УДК 616.98:578.828.61-078.33

ЛОМАНОВА Галина Александровна

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ СРЕДСТВ И МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ

(03.00. 06 - вирусология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 1996

Работа выполнена в Государственном научно-исследовательском институте стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. J1.A. Тарасевича.

Научный консультант - член-корр. РАЕН, доктор медицинских

наук, профессор Бектимиров Т.А. Официальные , оппоненты:доктор биологических наук, профессор

A.A. Кущ.

доктор медицинских наук, Г.Р. Мацевич, доктор медицинских наук, профессор Е.А. Ткаченко,

Ведущая организация - Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН.

Защита диссертации состоится «. М- _ » <р>?£>ЬД Л А_199 ^ г.

в /О часов на заседании Диссертационного Ученого совета Д 001.27.01 при Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова Российской АМН по адресу: 142782, Московская обл., п/о Институт полиомиелита. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН.

Автореферат разослан «ZO» JH&ühß 199-7 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета O.A. Медоедкина

Актуальность проблемы. Пандемия СПИДа охватывает в настоящее время все континенты, поражая людей независимо от пола и возраста и даже детей в неонатальном периоде, требуя на профилактику и лечение огромных средств.

Вместе с тем, разработка специфических средств профилактики и лечения этого заболевания связана с большими трудностями, обусловленными биологическими особенностями возбудителя. Необычайно высокая изменчивость ВИЧ, выявленная не только в популяции людей, но и на уровне индивидуума, позволяет им длительно персистировать, маскируясь от элиминирующих механизмов макроорганизма.

Одним из основных средств ограничения распространения СПИДа в данный период является эффективная диагностика ВИЧ-инфекции. Эффективность диагностики ВИЧ-инфекции в значительной степени зависит от стратегии тестирования, адекватности методов и качества, применяющихся в лабораторной практике препаратов.

С целью выявления ВИЧ-инфекции применяют различные методы обнаружения вируса, его генетического материала, структурных белков , антигенов и антител к ВИЧ. Серологическое исследование, направленное для выявления антител к ВИЧ в крови, либо других биологических жидкостях является основным методом диагностики ВИЧ-инфекции, применяемым в практическом здравоохранении. Наиболее широко используются иммуноферментные тест-системы различных модификаций с последующим подтверждением результатов методом иммунного блота, иммунофлюоресцентного анализа и радиоиммунопреципитации.

Получение препаратов, обладающих высокой диагностической ценностью, обеспечивается разработкой и внедрением в производство современных технологий, применением высококачественного сырья, материалов, оборудования, а также объективным контролем за их качеством на этапах выпуска и применения. Основой совершенствования диагностикумов ВИЧ является биологическая стандартизация, включающая разработку требований ко всем компонентам, используемым для конструирования

препаратов, стандартов и методов их оценки.

К началу выполнения данной работы в нашей стране не было охарактеризованных высокопродуктивных штаммов ВИЧ, пригодных для производственных целей. Вирусный лизат закупался за рубежом. Отсутствовали нормативы, определяющие технологию получения и качество вирусных антигенов, не были разработаны стандарты и критерии оценки основных компонентов, используемых при получении диагностических препаратов для выявления маркеров ВИЧ. Все это не позволяло обеспечить выпуск отечественных эффективных диагностикумов ВИЧ и осуществлять в полной мере контроль за их производством и применением.

В связи с этим при проведении данных исследований основными объектами стандартизации диагностикумов ВИЧ являлись производственные штаммы ВИЧ и клеточные субстраты, антигены, полученные различными технологиями, ингредиенты, необходимые для проведения анализа, а также методы учета, интерпретации и регистрации результатов.

Цели и задачи исследования.

Целью работы являлось: научная разработка основных принципе! стандартизации средств и методов диагностики ВИЧ-инфекции I совершенствования систем и методов их контроля.

Для выполнения цели исследования были определены основные задачи

1. Изучение, отбор и создание банков охарактеризованных высокопродуктивны; производственных штаммов ВИЧ и клеточных линий, свободных о' контаминирующих агентов.

2. Изучение и стандартизация антигенов ВИЧ, полученных на основе различны: технологий и используемых в производстве диагностических препаратов.

3. Разработка научно-обоснованных требований к основным компонентам используемым для конструирования диагностикумов ВИЧ.

4. Получение и изучение национальных стандартов, используемых в качеств препаратов сравнения при оценке качества диагностикумов ВИЧ.

!равнителыгое изучение диагностической эффективности препаратов ественного и импортного производства, применяемых для скрининга и верждения ВИЧ-инфекции.

зработка и совершенствование системы и методов контроля диапюстикумов [ при выпуске, внедрении и применении.

зучение пригодности клинического материала, полученного различными »дами для выявления антител к ВИЧ.

Работа выполнялась в соответствии с планом научных исследований :К им.Л.А.Тарасевича и по Государственным научно-техническим раммам: "Борьба с наиболее распространенными заболеваниями" б.Об [ИД", проект 4 и "Национальные приоритеты в медицине и воохранении".

чиая новизна.

рвые научно обоснованы подходы к стандартизации вирусных и клеточных ммов, пригодных для производства вирусного лизата. Являются эритетными сравнительные данные по изучению и репродукции новых ммов ВИЧ типа I, выделенных на территории СНГ в системах острой и шческой инфекций в пермиссивных клеточных линиях.

Экспериментально-обоснованы и впервые сформулированы критерии эра штаммов ВИЧ, рекомендуемых для получения вирусных лизатов. еделены параметры технологии и требования внутреннего контроля при изводстве вирусных лизатов ВИЧ.

Впервые в России разработаны требования, определены критерии и эды оценки антигенов ВИЧ, получаемых методами рекомбинантной юлогии и химического синтеза.

Впервые разработаны научно-обоснованные требования к банкам фоидных клеток, используемых для производства диагностикумов ВИЧ.

Научные основы получения и формирования панелей сывороток, (аботашше впервые в России позволили повысить диагностическую ценность

иммуноферментных тест-систем, предназначенных для выявления антител к ВИЧ. Доказано, что наиболее надежным методом определения качества диагностических препаратов по основным параметрам чувствительности и специфичности является применение стандартных панелей сывороток с заданной концентрацией антител к ВИЧ, что достигалось при учете теоретического распределения уровня антител поданным оптической плотности и их титра.

Впервые разработаны национальные стандарты (стандартные панели сывороток, содержащие и не содержащие антитела к ВИЧ, и пероксидазные конъюгаты), позволяющие обеспечивать надзор за качеством серийно выпускаемых диагностикумов ВИЧ.

Новый, оригинальный метод оценки чувствительности и специфичности ИФА тест-систем, разработанный на основе экспериментальных данных и контроля коммерческих серий, позволяет более эффективно дифференцировать препараты для диагностики ВИЧ-инфекции по качеству.

Разработанная система апробации новых препаратов для выявления маркеров ВИЧ, дает возможность определять их диагностическую ценность и место в процессе серологической диагностики ВИЧ-инфекции.

Приоритетность исследований защищена 2 патентами Российской Федерации.

Практическая ценность работы. На основе изучения новых штаммов ВИЧ-] отобраны наиболее продуктивные штаммы для получения вирусного антигена Эти штаммы одобрены Ученым Советом ГИСК им.Л.А.Тарасевича г зарегистрированы в качестве производственных для приготовленш диагностикумов ВИЧ.

Аттестация штаммов ВИЧ, создание посевного банка, выбор условш культивирования в клеточных линиях, определение оптимальных методо] накопления, концентрирования и очистки вирусных антигенов послужил! основой для разработки технологии промышленного получения вирусны:

нтигенов. Технология получения антигена ВИЧ типа I на основе отобранного [тамма изложена в экспериментально-производственном регламенте (ЭПР N 74-94) "Антиген ВИЧ, очищенный инактивированный для производства тест-истем, выявляющих антитела к ВИЧ".

Требования к качеству, методы контроля и критерии оценки оммерческого антигена ВИЧ сформулированы в утвержденных Минздравом оссии Временных фармакопейных статьях "Антиген вируса иммунодефицита еловека I типа (ВИЧ-1), инактивированный" ВФС 42-423-93 и ВФС 42-4334. Качество антигенов, полученных по разработанной нами технологии, не ступали зарубежным аналогам по диагностической эффективности.

Применение стандартных панелей сывороток, приготовленных по сработанной нами технологии ОСО 42-28-212-93 и ОС О 42-28-214-94, несенных в реестр национальных стандартов, позволило повысить лимиты [увствителыгости и специфичности ИФА тест-систем с 95% до 98%. Эти тандартьг являются в настоящее время основным инструментом контроля :ачества при выпуске ИФА тест-систем и наборов иммуноблота на всех >течественных предприятиях и в ГИСК им.Л.А.Тарасевича, а также (спользуются в диагностических лабораториях Центров по профилактике и юрьбе со СПИД при приемке наборов, поступающих от учреждений иготовителей. ОСО 42-28-191-91 и ОСО 42-28-192-91 пероксидазных сонъюгатов позволяют оценивать качество иммуносорбентов, используемых различными фирмами для изготовления диагностикумов ВИЧ. Разработаны и утверждены следующие нормативные документы. Методические указания, утвержденные Минздравом СССР:

1."Аттестация перевиваемых клеточных линий - субстратов производства медицинских биологических препаратов " РД 42-28-10-89, 1989 г.;

2. "Требования к стандартизации и аттестации штаммов клеток-продуцентов ВИЧ, предназначенных для производства диагностических препаратов" N 28 б/д, 1988 г.;

Методические рекомендации, утвержденные Ученым советом ГИСК

им.Л.А.Тарасевича:

1. "Принципы отбора и аттестации сывороток, предназначенных для формирования стандартных панелей сывороток, положительных и отрицательных на антитела к ВИЧ", 1993 г.;

2. "Контроль сорбционной способности планшетов, применяемых в качестве твердой фазы при производстве диагностических иммуноферментных тест-систем", 1993 г.;

3. "Требования к стандартизации и аттестации синтетических пептидов, применяемых при производстве диагностических препаратов для выявления антител к ВИЧ", 1993 г.;

4. "Требования к стандартизации и аттестации синтезируемых клетками Е.соН рекомбинантных антигенов, применяемых при производстве препаратов для серодиагностики ВИЧ-инфекции, 1995 г;

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Система и методы стандартизации вирусных и клеточных штаммов, пригодных для производства вирусного лизата.

2. Сравнительная характеристика острой и хронической инфекции четырех новых штаммов ВИЧ типа 1, выделенных на территории СНГ, их репродуктивные, культуральные и антигенные характеристики.

Система аттестации штаммов ВИЧ-1 для производства диагностикумов.

3. Технология получения вирусного антигена для приготовления иммуноферментных тест-систем для выявления антител к ВИЧ.

4. Перечень требований к рекомбинантным белкам и синтетическим пептидам, используемым для приготовления диагностических препаратов ВИЧ-инфекции.

5.Критерии и методы оценки основных компонентов, используемых при конструировании диагностикумов ВИЧ (антигенов, полистироловых планшет, конъюгатов), а также основных параметров, определяющих качество наборов ИФА (чувствительности и специфичности).

6. Технология приготовления, а также принципы комплектования и методы оценки стандартных панелей сывороток, используемых для контроля

разрабатываемых и коммерческих препаратов для диагностики ВИЧ-инфекции.

7. Система апробации и внедрения новых диагностических препаратов для выявления маркеров ВИЧ.

8. Применение альтернативного метода забора крови на фильтровальную бумагу для выявления антител к ВИЧ в ИФА тест-системах различных конструкций.

Апробация работы. Основные экспериментальные материалы и положения диссертационной работы доложены и обсуждены на:

Всесоюзной научно-практической конференции по СПИД, Ленинград, 1990 г.; Международной конференции "Медицинская биотехнология, иммунизация и СПИД " , Ленинград , 1991 г.; У1 Всероссийском съезде ВИОМЭП, Нижний Новгород 1991 г.; 1 и 2-ой Международных конферепциях"СПИД, рак и ретровирусы человека", Санкт-Петербург, 1992 - 1993 гг.; 1-ой Международной региональной конференции по ВИЧ инфекции "Балтика против СПИДа", Санкт-Петербург, 1994 г.; Научной конференции по проблемам "СПИД" по завершенным проектам ГНТНР "Национальные приоритеты в медицине и здравоохранении", Москва, РАМН, 1995 и др.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 375 страницах и состоит из введения, обзора литературы (три главы), собственных исследований (семь глав), обсуждения, выводов и списка литературы. Диссертация содержит 20 рисунков, 60 таблиц, библиографический указатель, включающий 505 источников литературы.

Основные положения диссертации отражены в 30 опубликованных научных статьях.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы.

Клеточные культуры. Лимфобластоидные линии клеток: Н9/ЕСАСС - клон линии Hut 78, СЕМ 4. Линии представлены Национальным институтом стандартизации и контроля (Великобритания). Клоны линии МТ-4 получены из НИИЭМ им.Н.И.Гамалеи, НПО Вектор, ФАО Ферейн.

Вирусы. Штаммы ВИЧ-1 были представлены в ГИСК им.Л.А.Тарасевича в качестве кандидатов для производства диагностических препаратов по выявлению маркеров ВИЧ. Штамм N 4005 был получен группой авторов института вирусологии им. Д.И. Ивановского (Руднева И.А. и др., 1993). Штамм N 4046 выделен из мононуклеарных клеток периферической крови пациента с диагнозом лимфоаденопатия (Черных А.И. и др., 1993). Штамм N 4122 получен Г.Г. Миллер (1989). Штамм ZMB выделен группой исследователей в 1989 году в НИИЭМ, республика Беларусь (Рытик П.Г. и др., 1990). Сыворотки. Исследовано свыше 30 ООО образцов сывороток. Сыворотки здоровых доноров, пациентов с заболеваниями различной этиологии получены из различных учреждений России. Сыворотки ВИЧ-инфицированных лиц и больных СПИД были представлены ЦНИИЭ ГКСЭН России, Городским центром по профилактике и борьбе со СПИД (г.Москва), Северо-западным региональным центром по борьбе со СПИД (г.Санкт-Петербург), Центром по СПИД (Республика Куба), Вирусной референс-лабораторией (Великобритания). Панели сывороток, содержащие антитела к ВИЧ 1,2 поступили из регионального центра ВОЗ по борьбе со СПИД (Великобритания), а также FDA, США.

Диагностикумы ВИЧ. Эксперименты проводили, используя наборы диагностических препаратов для выявления маркеров ВИЧ отечественного и импортного производства (28 наименований), выпускаемые на коммерческом уровне, разрабатываемые препараты на этапах лабораторных и экспериментально-производственных серий.

Методы культивирования и оценки клеточных линий. Использовали стационарный и роллерно-суспензионный методы культивирования клеточных линий. Для длительного хранения клетки криоконсервировали и помещали в емкости с жидким азотом при минус 196 °С. При аттестации клеточных линий использовали микробиологические, вирусологические, цитогенетические, молекулярно-биологические методы исследования (МУ, 1989).

Серологические методы. Для анализа образцов сывороток использовали метод непрямой иммунофлюоресценции, иммуноферментного анализа для выявления антител и антигена ВИЧ, иммунного блота, реакцию агглютинации. Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку результатов проводили общепринятыми методами (Стрелков Р.Б., 1966; Гублер Е.В., Генкин A.B. 1969; Рокицкий П.Ф., 1973; Иванов Ю.И., Погорелюк О.Н., 1990). Все расчеты проводили для вероятностной достоверности Р=0,05. Статистический материал, полученный в результате испытаний панелей сывороток в различных диагностикумах ВИЧ обрабатывали на ЭВМ но разработанной стандартной программе (Канев А.Н. и др., 1992). Стандартизация антигенов, полученных на основе различных технологий, используемых в производстве диагностических препаратов для выявления маркеров ВИЧ.

Диагностическая ценность препаратов для выявления маркеров ВИЧ в основном определяется антигенами, используемыми для конструирования иммуноферментных тест-систем. Выпускаемые в настоящее время диагностикумы ВИЧ основаны на антигенах, получаемых различными технологиями: выделением вирусных белков из культивируемых клеточных линий, инфицированных ВИЧ; генно-инженерным методом; химическим синтезом.

Антигены, полученные из вирусного лизата более полноценны, т.к. содержат все иммунореактивные детерминанты. Однако большое значение при получении вирусных антигенов имеет выбор штаммов ВИЧ. В настоящее время в различных географических районах мира от ВИЧ-инфицированных лиц и больных СПИДом на разных стадиях заболевания выделено свыше 3000 изолятов ВИЧ типов 1 и 2 (Бектимиров Т.А., 1990; Носик Д.Н., 1992; Покровский А.Г., 1994; Gallo R. et al, 1983; Vilmer E. et al„ 1984; Chiodi F. et al., 1990; Kuhnel et al., 1990), которые отличаются по антигенным характеристикам. Учитывая высокую штаммовую вариабельность изолятов ВИЧ и особенности размножения вируса в клеточных культурах важной задачей

является изучение выделенных изолятов с целью отбора наиболее продуктивных, циркулирующих на территории России.

Для получения вирусного антигена применяют различные линии лимфоидных клеток, обеспечивающих максимальный выход вируса.

Антигены, полученные методами химического синтеза или рекомбинантной технологии отличаются более высокой стандартностью, не высокой стоимостью и относительной безопасностью при получении и использовании.

Однако препараты, сконструированные на основе таких антигенов, включают аналоги отдельных структурных белков ВИЧ, которые не перекрывают весь спектр антител, вырабатываемых при инфицировании, что требует их тщательного контроля.

В связи с этим, выделение, аттестация и внедрение высокопродуктивных штаммов ВИЧ, отбор пермиссивных клеточных линий для получения вирусного материала, разработка технологии приготовления очищенных стандартных антигенов имеет большое значение в совершенствовании диагностики ВИЧ-инфекции.

Изучение и отбор линий лимфоидных клеток, оптимальных для размножения ВИЧ.

Исследования, проведенные нами по получению и изучению биологических свойств диплоидных и гетероплоидных клеточных линий человеческого и животного происхождения позволили определить основные положения, обеспечивающие стабильность характеристик этих линий.

Используя полученные данные, анализ научной литературы и рекомендации ВОЗ по характеристике клеточных линий, рекомендуемых для производственных целей, нами совместно с Шалуновой Н.В. были разработаны требования и подготовлены Методические указания "Аттестация перевиваемых клеточных линий-субстратов производства и контроля иммунобиологических препаратов" (1989) и проведена аттестация ряда банков посевных клеток.

Наиболее широко для размножения ретровирусов используются

лимфобластондные клеточные линии. Исследования культуральных свойств линий Н9, СЕМ, МТ-4, проведенные нами, показали, что наиболее высокими показателями пролиферативной активности обладала линия МТ-4. Индекс пролиферации линий Н-9, СЕМ, МТ-4 составлял в среднем 1,8; 2,2; 3,9, соответственно. Нами были изучены биологические свойства трех штаммов линии клеток МТ-4. При изучении и отборе лимфовдных клеток для получения антигена ВИЧ были использованы положения и критерии оценки Методических указаний РД 42-28-10-89. Результаты изучения клеток МТ-4 позволили отобрать штамм, пригодный для получения клеточной биомассы. Характеристика штамма МТ-4 представлена в табл.1. По разработанным нами требованиям к технологии получения был подготовлен банк лимфобластоидной линии клеток в количестве 200 ампул, заложенный на длительное хранение. Было показано, что клетки сохраняют стабильность биологических свойств в течение 30 серийных пассажей (срок наблюдения). Высокое накопление вирусного антигена и отсутствие контаминирующих агентов позволило рекомендовать эту линию для производства диагностикумов ВИЧ. Изучение и отбор штаммов БИЧ. перспективных для производства диагностических препаратов.

Нами были изучены четыре новых отечественных штамма ВИЧ типа 1, представленные различными учреждениями нашей страны. Штаммы 4005 и 4122 продуцировались хронически инфицированными линиями клеток, а штаммы 4046 и 2МВ хранились в виде замороженных суспензий вирусных частиц. Было установлено, что они различаются по культуральным свойствам, инфекционной активности в клеточных культурах, накоплению вирусного антигена и антигенным характеристикам (Табл.2).

Штамм 4005 характеризовался нестабильной репродуктивной активностью и невысоким накоплением вирусного антигена. Для получения препаративных количеств вирусного антигена необходимо было проведение 20-25 серийных пассажей клеточной линии. Титр вирусного антигена составлял 1:64, а количество антигенсодержащих клеток колебалось от 10 до 35% в

различные сроки культивирования.

Штамм 4122 имел более стабильные характеристики. Титр внеклеточного антигена при определении в иммуноферментном анализе и количество антигенсодержащих клеток оставались постоянными в различные сроки культивирования и составляли 1:500 и 100%, соответственно. На линии клеток МТ-4 штаммы 4046 и гМВ обладали более высокой репродуктивной активностью (10" ТЦД50 /мл) по сравнению со штаммами 4005 и 4122 (105 ТЦД50 /мл) . Накопление вирусного антигена у штаммов 4046 и ЪМВ в клетках МТ-4 выявляли в более ранние сроки после инфицирования: на 3-4 с. после заражения 85-100% клеток содержали вирусный антиген. При инфицировании клеток МТ-4 штаммами 4005 и 4122 на 4-5 с. было выявлено 65-75% антигенсодержащих клеток.

При изучении антигенных характеристик штаммов ВИЧ было установлено, что все они имели основные белки оболочки, ядра и полимеразного комплекса ВИЧ-1. Однако выявление высокомолекулярных гликопротеидов у разных штаммов варьировало. При получении вирусных лизатов из штаммов 4005 и 4122 в ряде случаев не удавалось обнаружить белки оболочки gp 160 и 120, что может быть связано как с особенностями самих штаммов, так и с тсХиолошей получения и очистки вирусных антигенов.

Проведенные исследования позволили отобрать три наиболее продуктивных штамма ВИЧ-1 4046, 4122 и ХМВ. Подготовлен рабочий банк клеток хронически инфицированной ВИЧ-1 (штамм 4122) линии в количестве 100 ампул, который заложен на длительное хранение.

Результаты исследований по изучению, аттестации и стандартизации новых штаммов ВИЧ и клеток МТ-4 позволили экспериментально обосновать и определить критерии отбора клеточных и вирусных штаммов, рекомендуемых в качестве производственных для получения диагностикумов. По этим критериям впервые в России были отобраны, аттестованы и внедрены в практику здравоохранения два штамма ВИЧ-1 4046 и 4122 для приготовления ИФА тест-систем и наборов иммуноблота.

Таблица I

Основные характеристики лимфобластоидной линии клеток МТ-4, штамм N 3 КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА

СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

СООТНОШЕНИЕ ЖИДКОЙ И

ГАЗОВОЙ ФАЗ

ЧАСТОТА ПАССИРОВАНИЯ

ПОСЕВНАЯ ДОЗА

ИНДЕКС ПРОЛИФЕРАЦИИ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ СРЕДА ЗАМОРАЖИВАНИЯ

ВИДОВАЯ ПРИНАДЛЕЖНОСТЬ МОРФОЛОГИЯ

КОНТРОЛЬ КОНТАМИНАЦИИ

ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ К ВИРУСАМ

СТАБИЛЬНОСТЬ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

роллерно-суспензионный Среда ЯРМ1-1640; 15% эмбриональной сыворотки плода коров; 0,06% глутамина; 200 ед/мл инсулина; 50-100 ед. гептамицииа 1:4

2 раза в неделю

5х105кл/мл

3,97 ± 1,15 90-100%

эмбриональная сыворотка плода коровы 90%, 0М50-Ю% клетки человека Т-клеточные лимфобласты бактериальная микрофлора, грибы, простейшие не обнаружены, в цистернах эндоплазмотического ретикулюма и вне клеток обнаружен онкорновирус С-типа клетки чувствительны к заражению ВИЧ-1: антиген обнаруживается в 75-100% клеток при определении методом непрямой иммунофлюоресценции. Титр внеклеточного антигена на 3-4 сутки после инфицирования ВИЧ-1 достигает 1:3200 сохраняется в течение 30 последовательных пассажей (срок наблюдения)

Таблица 2

Результаты изучения штаммов ВИЧ, предложенных для производства диагностических препаратов.

Критерии оценки

NN штаммов ВИЧ

4005 4122

Накопление антигена при хронической инфекции:

титр в ИФА 64

количество антиген-содержащих клеток 35% Острая инфекция клеток МТ-4 инфекционная активность Накопление антигена титр в ИФА 128 800

количество антиген-

содержащих клеток 60-75% 80-100% Антигенная характеристика методом ИБ епу

4046

500 100%

105ТЦЦ,П 105ТЦЦ,„ Ю3ТЦЦ50

3200 85-100%

ЯР 160.41 еп 120.41

оп16П 17П

----

41

гмв

ю8тцц50

3200 90-100%

„Г. 1 ОГ\ Л I

ро1

Наличие

контаминирующих

агентов

бактерий

микоплазм

вирусов

р 55,24,17 р 55,24,17 р 55,24,17 р 55,24,17 р 65,51,31 р 65,51,31 р 65,51,31 р 66,51,31

+ +

Стандартизация вирусного антигена, предназначенного для иммобилизации планшет.

Разработка оптимальных режимов накопления, вьщеления и очистки вирусного антигена являются необходимыми условиями получения полноценного антигена ВИЧ. Продукция вирусного антигена зависит от ряда факторов: способа и условий культивирования, возраста и состояния культуры, посевной дозы клеток, инфекционности вируса, применяемых питательных сред и сывороток и т.д. Предварительные исследования, проведенными нами, показали, что накопление вирусного антигена ВИЧ-1 (штамм 4122) в высоких титрах происходит при использовании острой инфекции клеток МТ-4. Была выбрана посевная доза клеток МТ-4, среда и способ культивирования, метод инфицирования. При сокультивировании клеток МТ-4 и клеток, хронически инфицированных штаммом ВИЧ-1 4122 в соотношениях от 1:1 до 1:10 не было установлено существенных различий в накоплении вирусного антигена. Титр антигена на 5-6 с. после инфицирования составлял 1:1600 - 1:3200. Заражение клеток МТ-4 сконцентрированным вирусным материалом увеличивало титр вируса в 30-80 раз.

При получении вирусного антигена была проведена серия экспериментов по концентрации, очистке и изучению белкового спектра полученных лизатов. Концентрирование и очистку проводили по двум технологиям: технологии предусматривающей концентрирование вирусного антигена на оборудовании фирмы МПНроге и очистки с помощью ультрацентрифугирования в ступенчатом градиенте плотности сахарозы, и по методике, предложенной Зайдесом В. с соавт. (Клюшник С.Ю., 1993). По этой методике предварительная очистка и концентрирование велись с помощью диафильтрации на отечественных "ядерных фильтрах" с окончательной очисткой антигена при ультрацентрифугировании в линейном градиенте плотности сахарозы. Уровень очистки лизатов по белку не отличался при получении обеими технологиями. Набор вирусспецифических белков в лизатах при определении методом иммуноблота был представлен полипептидами:

р 66, р 53, gp 4L, р 34, р 24, р 17. Мажорные белки оболочки gp 160 и 120 в данных экспериментах обнаружить не удавалось.

Отработка оптимальных условий культивирования и накопления вирусного антигена штаммов ВИЧ, эксперименты по концентрированию и очистке вирусиых лизатов послужили основой для разработки промышленного получения вирусного антигена ВИЧ (ЭПР N 474-94).

Впервые в нашей стране были сформулированные требования к коммерческому препарату - антигену ВИЧ, оформленное в виде двух Фармакопейных статей и определены методы его контроля. Технология получения антигена ВИЧ-1 при использовании острой инфекции клеток МТ-4 штаммом ВИЧ 4122 внедрена в производство ИФА тест-систем для диагностики ВИЧ-инфекции на предприятии ФАО "Ферейн". При сравнительном изучении серий ИФА тест-систем, приготовленных на антигенах из отечественных штаммов ВИЧ-1, было установлено, что по основным показателям (чувствительности и специфичности) они не уступали зарубежному аналогу (табл.3).

Таблица 3

Антигенная активность штаммов ВИЧ-1 при изучении методом ИФА в тест-системе "Антиген".

NN штаммов Количество Показатели

ВИЧ исследованных серий чувствительности специфичности

4005 9 94,9% 97,9%

4122 19 98,09% 99,2%

4046 19 99,5% 99,54%

ZMB 13 99,07% 98,25%

Вирусный лизат

фирмы Du Pont 14 99,7% 99,85%

США

Разработка требований к стандартизации и аттестации антигенов, полученных методами рекомбинантной технологии.

Тест-системы ИФА, основанные на рекомбинантных антигенах выпускаются в нашей стране несколькими предприятиями и широко используются в лабораторной практике для скрининга сывороток крови населения на антитела к ВИЧ. Нестандартность условий производства, низкая оснащенность современным оборудованием и отсуствие четких критериев оценки рекомбинантных белков не давали возможности получать стандартные антигены, что отражалось на качестве диагностикумов ВИЧ, выпускаемых в России.

Нами было проведено изучение иммуносорбентов, используемых в наборах "Рекомбинант-ВИЧ", выпускаемых различными учреждениями в России по одной технологии. Результаты этого изучения представлены в табл.4. В качестве препарата сравнения использовали ИФА тест-систему: "Rec-HIV" (Куба). Антигенную активность иммуносорбентов исследовали, используя ОСО пероксидазного коныогата белка А и ВИЧ положительную референс сыворотку. Была установлена различная активность иммуносорбентов в коммерческих сериях тест-системы "Рекомбинант-ВИЧ". Титр сыворотки колебался от 1:6400 до 1:25000 в наборах "Рекомбинант-ВИЧ", тогда как в тест-системе "Rec-HIV" он достигал 1:100000. Были также отмечены различия показателей ОП эталонной ВИЧ-положительной сыворотки в исследуемых наборах "Рекомбинант-ВИЧ" от 1,0 до 2,3.

Для получения наборов ИФА тест-систем предприятия используют планшеты различных фирм, что может быть одной из причин расхождения результатов. Был проведен анализ наборов "Рекомбинант-ВИЧ", приготовленных с использованием планшет фирм Dynatech, Nunc и "Енисей" Красноярского объединения. В качестве антигена использовали рекомбинантные белки производства ТОО БТК Биосервис. Исследовали антигенную активность и стандартность сорбции антигена на планшеты. При использовании планшет фирмы Nunc для сорбирования рекомбинантных

антигенов бьии выявлены наиболее высокие показатели ОП эталонной ВИЧ-положительной сыворотки (2,059), тогда как при использовании планшет "Енисей" ОП колебалось от 0,888 до 1,266. Изучение стандартности сорбции антигена на планшеты также выявило разброс показателей ОП на планшетах "Енисей" от 5,3 до 8,3 (табл.5). Эти исследования подтвердили нестандартность рекомбинантных белков и твердого носителя и обусловили необходимость разработки требований к стандартизации этих компонентов.

На основе рекомендаций ВОЗ, анализа данных литературы, а также опыта работы ТОО БТК Биосервис по получению рекомбинантных белков нами совместно с ТОО БТК Биосервис были разработаны требования, оформленные в виде методических рекомендаций ("Требования к стандартизации и аттестации синтезируемых клетками Е.соН рекомбинантных антигенов, применяемых при производстве препаратов для серодиагностики ВИЧ-инфекции", 1995).

Результаты изучения активности иммуносорбентов в ИФА тест-системах, при использовании стандартов пероксидазного коныогата белка А и положительной сыворотки.

Таблица 4

тест-системы, предприятие-изготовитель

Наименование Природа антигена

ВИЧ- положительная сыворотка

титр *

ОП

Рекомбинант-ВИЧ (ФАО Ферейн)

рекомбинантные

белки рекомбинантные

белки рекомбинантные а) белки рекомбинантные белки

25 600 1,579

Рекомбинант-ВИЧ (НПО Вектор)

12 800 1,238

Рекомбинант-ВИЧ р* (НИИЭМ им.Пастера)

6 400 1,064

Иес - Н1У (р.Куба)

100 000

2,3

* Дана обратная величина разведения

20

Таблица 5

Изучение активности иммуносорбента тест-системы "Рекомбинаит-ВИЧ" при использовании планшетов различного типа.

Тип планшет Предприятие, Антигенная активность

выпускающее иммуносорбента

тест-систему (ОП) К+ (М±ш) S ОП %

Dynatech НПО Вектор 1,398+0,066 4,73

ФАО Ферейн 1,056+0,042 3,97

НИИЭМ 1,801+0,047 5,79

им.Пастера

Nunc Одесское предприятие бакпрепаратов 2,059+0,059 3,22

Енисей НПО Вектор 0,808+0,089 8,32

Московское 1,266+0.055 5,32

бакпредприятие

Изучение и стандартизация антигенов, приготовленных методом химического синтеза.

Большое значение при конструировании диагностикумов ВИЧ на синтетических антигенах имеет их выбор, что было подтверждено нами при сравнительном изучении ИФА тест-систем, приготовленных различными фирмами (Табл.6). Использование синтетических пептидов представляющих участки константной области регионов трансмембранного белка gp 41 с пептидами белка gp 120 позволяет получать наборы, имеющие высокую диагностическую ценность. Чувствительность и специфичность ИФА тест-системы "Пептоскрин-2" (РКНЦ РАМН) и "Enzygnost anti HIV 1+2" (Behring werke), приготовленных на композиции антигенов gpl20 и 41 ВИЧ-1 и gp 34 ВИЧ-2 составляли 98-100% и 99,0-100%, соответственно.

Антигенная активность синтетических пептидов зависит также от их качества и сорбционной способности. Применение синтетических антигенов,

состоящих из более мелких фрагментов (11-12 аминокислот), приводило, по-видимому, к десорбции их с планшетов и потере чувствительности. Так, при выпуске наборов "СПИД-диагностика" их чувствительность определялась как 100%, а спустя месяц эти показатели снизились до 92%. В табл.7 представлены результаты изучения антигенной активности пептидов, полученных из СП "Константа", РКНЦ РАМН, НПО "Вектор", сорбированных на полистироловые планшеты фирм Nunc, Costar, "Енисей", ВНИИ медполимер. В этих опытах применяли различные условия и режимы сорбции. Было установлено, что высокой специфичностью и антигенной активностью обладали образцы пептидов СП "Константа" при сорбции их на планшеты фирмы Nunc (чувствительность и специфичность - 100%) и пептиды из РНКЦ РАМН при режиме сорбирования 4 °С - 72 ч. на планшеты фирмы Costar.

Проведенные нами исследования подтвердили мнение ряда исследователей, что иммунореактивность антигенов ВИЧ, полученных методом химического синтеза, обусловлена композицией пептидов и выбором условий сорбирования на специально отобранные планшеты (Хаитов P.M., 1989; Николаева И.А., 1995). Синтетические антигены все более широко используются для конструирования диагностикумов ВИЧ, а надзор за их качеством не осуществлялся в полной мере, в связи с отсутствием в нашей стране документации, регламентирующей их получение и оценку. В связи с этим нами были разработаны требования по стандартизации и аттестации синтетических пептидов, применяемых при производстве диагностических препаратов для выявления антител к ВИЧ.

Разработка стандартов для оценки качества диагностикумов ВИЧ.

качества тест-систем для определения антител к ВИЧ.

Для формирования оценочных панелей нами было собрано и охарактеризовано свыше 200 ВИЧ положительных сывороток и более 2000 сывороток не содержащих антитела к ВИЧ. Изучены условия хранения, стабилизации и инактивации сывороток крови людей. Установлено, что

Таблица 6

Характеристика тест-систем доя выявления ВИЧ-антител, основанных на синтетических пептидах.

Наименование Композиция Чувствительность Специфичность

тест-систем синтетических

пептидов

СПИД- * ВИЧ-1 gp 41 92-94% 100%

диагностика ВИЧ-2 gp 34

Эпитоп ВИЧ-1 gp 41 94-100% 96-100%

ВИЧ-2 gp 41

ВИЧ-тест ВИЧ-1 gp 41 94-96% 100%

ВИЧ-2 gp 41

Пептоскрин-2 ВИЧ-1 gp 41,120 98-100% 98-100%

ВИЧ-2 gp 34

Enzygnost HIV ВИЧ-1 gp 120,41 99,1% 100%

1+2 ВИЧ-2 gp 41

* При выпуске препарата чувствительность составляла 100%

Таблица 7

Изучение иммунореактивности синтетических пептидов, полученных из СП "Константа".

Условия сорбции пептидов

37 °С-46 ч

37 °С-46 ч

Планшеты Чувствительность и специфичность фирм пептидов

PI Р2 РЗ Р1.Р2.РЗ

Nunc 92/89,4 22/100 98/100 100/100

Енисей 90/86,8 н.и. 94/92,1 98/100

37 °С-46 ч

4 °С - 21 ч Nunc 94/92,1 64/100 92/100 100/100 в числителе приведены показатели чувствительности, в знаменателе показатели специфичности в %

специфическая активность ВИЧ положительных сывороток сохраняется при инактивации их прогреванием при 56 °С в течение трех часов. Исследования активности сывороток с низким содержанием антител после многократного замораживания и оттаивания не выявило значимых изменений их оптической плотности. Срок хранения ВИЧ-положительных сывороток при минус 20 °С составлял более трех лет (срок наблюдения).

Анализ положительных сывороток в различных тест-системах отечественного и импортного производства показал, что 70% из них были высокоположительными, имели высокую ОП и титры антител свыше 1:3200 ко всем белкам ВИЧ. Использование высокоположительных сывороток при контроле ИФА тест-систем может приводить к необъективной оценке их качества по показателю чувствительности. Основную нагрузку при определении качества тест-систем несут сыворотки с низким содержанием антител. Получение таких сывороток в достаточном количестве представляет большие трудности, т.к. их можно получить на ранних стадиях инфицирования, когда диагностика затруднена, либо в терминальной стадии СПИДа. Для повышения надежности оценки качества диапюстикумов ВИЧ была разработана технология получения стандартной панели "нового поколения", содержащей антитела в низких концентрациях. Панель была получена методом кратных разведений высокоположительных сывороток нормальной сывороткой здорового донора в соответствии с теоретическим распределением ОП полученных сывороток (Рис.1). Титр антител к ВИЧ, включенных в панель сывороток составлял в среднем 1:800. Методом иммунного блота было установлено, что все они содержали антитела ко всем белкам ВИЧ-1. Эти характеристики сохранились и после лиофилизации сывороток. Физико-химические параметры, высушенной панели соответствовали требованиям ВОЗ для стандартных образцов биопрепаратов. Величина относительной погрешности массы раствора при розливе составляла 1,8%, остаточная влажность менее 1,0%, все флаконы были герметичны. Стабильность характеристик сывороток, изученная в тесте термодеградации позволила установить срок годности стандартной панели

при хранении при 4 °С 5 лет.

Панель сывороток с низким содержанием антител к ВИЧ была аттестована в качестве стандартного образца и зарегистрирована ГИСК им.Тарасевича под № 42 28-212-93 ОСО. Этот ОСО был внедрен для оценки качества диагностикумов ВИЧ на всех предприятиях России, что позволило получать сравнимые результаты при производстве и контроле диагностических препаратов. Применение этого стандарта дало возможность более достоверно оценивать качество диагностикумов ВИЧ. На первом этапе использования панели ОСО 42-28-212-93 было выявлено 39,5% серий не соответствующих допустимому уровню чувствительности при контроле ИФА тест-систем, в то время как при использовании нативных высокоположнтельпых сывороток ВИЧ этот процент составлял всего 2,2.

Технология стабилизации и лиофилизации сывороток и принципы аттестации были применены также для получения ОСО панели сывороток не содержащих антител к ВИЧ. Для формирования отрицательной панели были отобраны сыворотки здоровых доноров, взрослых и детей, беременных женщин, пациентов с диагнозом гепатит в анамнезе, лиц с ревматоидным фактором, от больных с почечной патологией. Сыворотки исследовали в различно сконструированных ИФА тест-системах, иммунном блоте. Сыворотки не содержали антител к ВИЧ-1 и ВИЧ-2, вируса гепатита В, были отрицательными на НВз - антиген. Масса сухого вещества 20 мг; рН-7,0; остаточная влажность - 2,1%; точность розлива 1,5%. Эта панель была рекомендована для оценки специфичности готовых препаратов. О СО 42 28-214-94 отрицательных сывороток был рекомендован ГИСК им.Л.А.Тарасевича к применению на предприятиях различных ведомств, выпускающих диагностикумы ВИЧ. Стандартизация пероксидазных конъюгатов. используемых для оценки качества диагностикумов ВИЧ.

Качество пероксидазных конъюгатов, применяемых в иммуноферментном анализе играет важную роль, т.к. этот ингредиент участвует в выявлении иммунных комплексов при проведении серологического

ОП 2

Характеристика панели сывороток, содержащей антитела к ВИЧ в низких концентрациях

ю о\

Ш Антиген ИФА ткт-снстемы: ■ Скрин-ВИЧ

□ Е1ат1а АЬ-Ас-АК-1

тестирования клинических образцов. В настоящее время в ИФА тест-системах ^пользуются конъюгаты, основанные на белке А, полученном из Streptococcus alba и на антивидовых иммуноглобулинах, вьщеленных из сыворотки кивотных, иммунизированных IgG и IgM человека. В качестве фермента iame всего применяется пероксидаза хрена, которая связывается этими белками.

При подготовке стандартных образцов коныогатов были изучены лараметры качества исходного сырья (белка А, IgG иммуноглобулинов, тероксидазы хрена) и готовых серий пероксидазных коныогатов белка А и штивидовых иммуноглобулинов, вьщеленных различными методами. Изучение нескольких партий пероксидазы хрена обнаружило, что все они кроматографически гомогенны, имеют молекулярную массу 40 кД, но не эбладают стандартностью по пероксидазной активности (Rz), которая колебалась в пределах 1,86-2,22.

Протеин А различных серий и производств анализировали по следующим критериям: хроматографической гомогенности, способности связывания с IgG, которая характеризовалась значениями эффективности константы связывания. Серии белка были гомогенны и имели высокое сродство к IgG человека. Для приготовления стандарта пероксидазного конъюгата белка А были выбраны следующие критерии: Rz - не менее 1,2; удельная активность - не менее 500 ед/мг; IgG - связывающая способность не менее 10 мг на мг белка. В соответствии с этими критериями НПО "Вектор" были приготовлены цве экспериментальные серии пероксидазного конъюгата белка №2 (жидкая форма) и №1 (лиофилизованная). При изучении коныогатов использовали рабочий эталон положительной на ВИЧ-1 антитела сыворотки крови человека и иммуноферментные тест-системы. Результаты изучения пероксидазных конъюгатов представлены в таблице 8. Молекулярная масса пероксидазных коныогатов белка А составляла 80 кД, выход основного вещества 56,8%, число молекул пероксидазы на молекулу белка 0,14-0,15. Однако константа равновесия у конъюгата в жидкой форме была почти в два раза выше, чем у сухого препарата, что, по-видимому, может быть связано с тем, что

Таблица й

Характеристика пероксидазных конъюгатов по биохимическим показателям и активности в иммуноферментных тест-

системах.

Наименование конъюгата Биохимические показатели Титр в иммуноферментных тест-системах при применении рабочего эталона положительной контрольной сыворотки

Молек. массеа в кД Выход основного.вещества Число молекул ПХ на молекулу белка Константа равновесия Рекомбинзнт ВИЧ Лепгтоскрин-2 Vironosiika Органон

Протеин А-пероюсидаза, сухой, серия 1 80 56,3 0,14 0,3 х 10 1:1280 1:160 н/и

Протеин А-пероксидаза, жидкий,серия 2 80 56,8 0,15 1,4 х 10'' 1:1280 1:160 1:6400

Монокпонапь-ныв антитела к 1д в чеповека-пероксидаза, серия 1 480 64,8 0,74 0.75 х 10 1:6400 1:3200 1:6400

Афинно выделенные антитела к 1д в человека-лерокотд., серия 1 500 62,6 0,46 3,2 X 10 1:64000 1:8000 н/и

Афинно выделенные антитола к 1д С чело-века-пероксид., серия 2 700 84,3 1,5 1,1 х 10"° 1:50000 1:10000 1:200000

ггаофилизация снижает силу связывания пероксидазы с иммуноглобулином.

Иммуноферментная активность жидкого и сухого препарата при титровании

в ИФА тест-системах была одинаковой. Результаты этих исследований

позволили выбрать в качестве стандартного образца пероксидазного коныогата

белка А жидкую форму препарата.

Стандарт антивидового иммуноглобулинового конъюгата был

приготовлен методом афинновыделенных поликлональных антител к

человека (Ыакапе-Ка\уао1, 1974). Конъюгат получен из гипериммунной

сыворотки кролика. Константа связывания с пероксидазой хрена составляла 8 1

10 хМ~ , количество связанной пероксидазы - 70%, титр с иммуноглобулинами человека - 125000 (ОП450 - 0,5). Титр коныогата в ИФА тест-системах составлял в среднем 1:100000.

Стабильность основных свойств ОСО пероксидазных коныогатов, определенная в тесте термодеградации, позволила установить их срок годности 2 года при хранении при 4 °С.

Пероксидазный конъюгат белка А был рекомендован в качестве стандарта для контроля иммуноферментной активности и точности сорбции антигенов, применяемых в ИФА тест-системах (Свидетельство на ОСО 42 28192-91). Конъюгат афинновыделенных антител к человека предназначен для выбора и контроля планшет для иммунологических реакций в производстве диагностикумов ВИЧ (Свидетельство на ОСО 42 28-191-91). Усовершенствование критериев оценки иммуноферментных тест-систем для выявления антител к ВИЧ.

Совершенствование методов оценки чувствительности и специфичности ИФА тест-систем.

При оценке качества ИФА тест-систем большое значение имеют адекватные методы определения основных показателей диагностической ценности этих препаратов: чувствительности и специфичности. Для оценки этих параметров нами была разработана система учета результатов. Экспериментальные исследования, проведенные нами на большом объеме

положительных и отрицательных на ВИЧ антитела сывороток, показали, что оптическая плотность ОПкрит., по которой сыворотка с равной вероятностью может быть отнесена к положительной либо отрицательной лежит в интервале ОП от 0,2 до 0,4. Для описания алгоритма распределения сывороток использовали среднее значение оптической плотности и стандартное отклонение. Стандартную обработку результатов проводили, применяя закон нормального распределения Ы+ ОП) с использованием третьего и четвертого моментов нормального распределения: эксцесса и асимметрии. Расчеты проводили на ЭВМ по разработанной программе совместно с лабораторией стандартных образцов НПО "Вектор" (Канев А.Н. и др.,1992). Был предложен метод расчета ОПкрит., основанный на использовании среднего значения ОП всех отрицательных сывороток, входящих в стандартную панель, вместо случайного значения ОП одной контрольной сыворотки набора. Для расчета показателей чувствительности и специфичности на стандартных панелях был использован метод построения гистограмм, включающий не только качественные характеристики сывороток по принципу (+) или (-), но и показатели ОП каждой сыворотки (рис. 2). Метод изложен в Инструкциях по применению ОСО 42 28-212-93 и ОСО 42 28-214-94. Информативность метода была проанализирована при контроле серий коммерческих тест-систем различных конструкций, выпускаемых в нашей стране. Внедрение стандартных панелей сывороток и методов оценки чувствительности и специфичности ИФА наборов позволили повысить требования к этим параметрам, установив лимиты 98%.

Разработка рекомендаиий по оценке планшетов, применяемых в качестве твердой фазы при производстве диагностических иммуноферментных наборов.

Для приготовления диагностических тест-систем используются планшеты, полученные из различных материалов, способных сорбировать белковые молекулы. Основными параметрами, характеризующими пригодность этого твердого носителя для конструирования ИФА тест-систем, является их

Рисунок 2

Сравнительная оценка расчета чувствительности ИФА тест-систем методом построения гистограмм (Ч) и по % содержанию ложноотрицательных сывороток (Чх).

N/№1 опк? Скрин- ВЫЧ

I г шша ч _ П А%

Чх - 96,ой

Ш1П

шах оп

Рис. а

Ри с.б

Рскомбннянт - ВИЧ Ы/Игп ОГЬф

Ч - 95,3% Чх - 93,7%

гшп

шах

N/N¡11

Антиген

Ч * 96,5!

шах

Рис. в

Рис. г

На риаа и б представлен анализ панели сывороток, состоящий из 50 образцов, на рис. виг - панели, состоящей из 16 образцов.

ОП, однородность оптических свойств и сорбционная емкость. Нами были изучены основные характеристики планшетов, приготовленных различными фирмами (Linbro, Dynatech, Nunc, Costar, Kohinoor, "Енисей", ВНИИ медполимер) при использовании эталонной сыворотки крови человека и ОСО пероксидазного конъюгата, а также проведены эксперименты по сорбированию антигенов ВИЧ, полученные различными технологиями. Сорбционную способность планшетов учитывали по ОП эталонной сыворотки, распределяющихся в определенных диапазонах. Было показано, что высокой сорбционной способностью (ОП 0,8 и более) обладали планшеты фирм Nunc, Costar, "Енисей", которые предпочтительно использовать для иммобилизации антигенов ВИЧ, полученных химическим синтезом. Низкой способностью сорбировать белки имели планшеты фирм Linbro, Dynatech, Kohinoor, ВНИИ медполимер (ОП сыворотки от 0,2 до 0,4), которые, на наш взгляд, могут применяться для сорбирования антигенов ВИЧ-продуктов рекомбинантной технологии.

Эти исследования послужили основой для разработки Методических рекомендаций по контролю планшетов, применяемых в качестве твердой фазы при производстве ИФА тест-систем.

Апробания новых диагностических препаратов для выявления маркеров ВИЧ отечественного и импортного производства.

Внедрение в практическое здравоохранение новых препаратов для диагностики ВИЧ-инфекции является важным и сложным процессом и предусматривает систему регистрации их национальными контрольными органами. Нами были изучены новые препараты, предлагаемые для скрининга ВИЧ антител, основанные на ИФА: "Скрин-ВИЧ", "Комби-ВИЧ" (АО Д.Мазай), "ВИЧ-тест" (НПО Вектор), "Umelisa recombinant HIV 1+2" (P. Куба); препараты подтверждения и тесты экспресс-диагностки ВИЧ-инфекции: "Блот-ВИЧ" (ТОО БТК Биосервис), "ВИЧ-экспресс" (НПО Вектор),"Immunocomb" (Израиль), "HIV 1+2 Dotscreen " (Швейцария).

Определение диагностической эффективности препаратов проводили

Таблица 9

Показатели диагностической эффективности ИФА гест-систем, полученные при Государственных испытаниях новых препаратов.

Новые препараты Чувствительность Специфичность Воспроизводим ОСТЬ результатов Лимиты НТД

Скрин-ВИЧ Э8,15±0,75В 96,44*1,034 100,0/97,6 98/98

Комби-ВИЧ 93,0910,772 99,5910,361 06,27/97,77 38/98

ВИЧ-тест 92,5±1,4 98,7=0,3 80,10/98,10 95/95

итс11&а гесстЬ. 100,0 97,5 100,0/99,47 98/93

Коммерческие препараты

Антиген 98,11 ±0,764 96,4311,04 97,22/98,42 95/95

Рекомбинант-ВИЧ 96,86+0,975 96,83-Л,381 97,22/99,2 95/95

Пептоскрин-2 97,8712,106 35,1213,143 83,00/98,10 95/95

Результаты приведены в (%)

В числителе - лимиты чувствительности, в знаменателе лимиты специфичности

в контролируемых опытах, используя стандартные панели сывороток, полученные из ВОЗ, FDA, сыворотки ВИЧ инфицированных и больных СПИДом, здоровых доноров, пациентов с заболеваниями различной этиологии, детей, беременных женщин, наркоманов. Методика проведения испытаний била разработана нами совместно с сотрудниками эпидемиологического отдела ГИСК им. Тарасевича. Применение разработанной нами системы апробации новых препаратов и паспортизованного сывороточного материала позволило установить различные показатели диагностической эффективности испытуемых диагностикумов (Табл.10) Тест-система ИФА "Скрин-ВИЧ" и "Комби-ВИЧ", "Umelisa recombinant HIV 1+2, основанные на рекомбинантных антигенах обладали высокой диагностической ценностью, что позволило рекомендовать их для скрининга ВИЧ-антител. Конструкция наборов "Комби-ВИЧ", обеспечивающая раздельную сорбцию антигенов ВИЧ-1 и ВИЧ-2, дает возможность использовать их для серологической дифференциации антител к этим вирусам. ИФА тест-система "ВИЧ-тест", сконструированная на синтетических пептидах имела невысокие показатели чувствительности (92,5%) и воспроизводимости положительного ответа (80,1%) при проведении клинических испытаний, что не дало возможности рекомендовать этот препарат для внедрения в лабораторную практику для серодиагностики ВИЧ-инфекции.

Использование подтверждающих тестов в системе диагностики ВИЧ инфекции связано с возможным получением неспецифических реакций при проведении ИФА. При повторном изучении образцов методом иммуноблота количество неспецифических реакций снижается до 0,3%. Качество применяемых диагностикумов и критерии интерпретации результатов, полученных методом иммуноблота, играют существенную роль при подтверждении серологического диагноза ВИЧ-инфекции. Исследуя образцы сывороток вирусоносителей с подтвержденным диагнозом, нами были получены неоднозначные результаты для одного и того же образца при тестировании его в наборах иммуноблота различных фирм (Du Pont, Diagnostics Pasteur, Organon Teknika, ФАО Ферейн, НПО Вектор ). Одни и те же сыворотки

определялись в ряде случаев как "положительные", имея полный набор антител ко всем белкам ВИЧ, либо как "неопределенные", с антителами к отдельным белкам ВИЧ. Это могло быть связано не только с качеством самого набора, но и с различием антигенных характеристик вирусных штаммов ВИЧ, применяемых для приготовления наборов, а также с критериями учета и интерпретации, предлагаемыми этими фирмами.

Альтернативные методы диагностики ВИЧ-инфекции, основанные на мембранной технологии, по мнению некоторых исследователей способны заменить вестерн блот (WEP, 1992; Tamashiro Hiko, 1993; World AIDS, 1994; Кислых E. и др., 1996). Апробация препаратов, основанных на мембранной технологии "Immunocomb", "HIV 1+2 Dotscreen", "Блот-ВИЧ", "ВИЧ-экспресс", проведенная нами, подтвердила их высокую чувствительность и специфичность (98-100%) табл.10. Наборы дот-блота "HIV1+2 Dotscreen" и линейного рекомбинантного блота "Блот-ВИЧ" были рекомендованы в качестве повторного уточняющего теста при серологическом обследовании сывороток на антитела к ВИЧ. Применение таких диагностикумов ВИЧ, на наш взгляд, значительно сократит объем исследований на этапе подтверждения результатов методом иммуноблота.

Результаты апробации наборов, основанных на мембранной технологии, для выявления антител к ВИЧ.

Таблица 10

Наименование

Сыворотки:

Количество образцов, подтвержденных в иммуноблоте

тест-системы

HIV-Dotscreen ВИЧ-экспресс Immunocomb

Блот-ВИЧ

ВИЧ-1 ВИЧ-2 доноров

96/97 6/6 0/45

99/99 3/3 0/6

26/28 1/1 3/28

28/28 2/3 н.и.

103 102 29 31

В числителе - количество реактивных образцов В знаменателе - количество исследованных образцов

Изучение пригодности сухон капли крови на фильтровальной бумаге для выявления антител к ВИЧ.

При обследовании населения на антитела к ВИЧ широко используются сыворотки крови, полученные методом венопункции. Этот метод требует специальных условий забора крови, оборудования для получения и хранения сывороток, а также связан с определенным риском для пациента и медицинского персонала. Альтернативный метод забора крови из пальца, высушенной на фильтровальной бумаге, представляет значительный интерес. Нами были проведены исследования по отработке этого метода для использования при скрининге населения на ВИЧ антитела. В исследованиях использовали образцы сывороток и капель крови, высушенных на фильтровальной бумаге, либо £ лунках планшетов доя иммунологических реакции, взятых от одного и тоге же пациента.

Таким образом было обследовано 18008 образцов от ВИЧ-инфицированных лиц, больных СПИДом, беременных женщин, наркоманов больных с различными соматическими заболеваниями, а также здоровы) доноров взрослых и детей. Использовали ИФА тест-систему, приготовленнун на вирусном лизате. Все образцы сывороток и высушенных капель крови о' ВИЧ инфицированных лиц регистрировались как положительные Неспецифические реакции были выявлены как в образцах сывороток, так I при исследовании высушенных капель крови, что составляло 4,5%, 6,3% 5,5%, соответственно (Табл.11). Использование капель крови, высушенных лунках планшетов было менее удобным, т.к. при транспортировании образцо происходило разрушение материала, что могло приводить к технически! ошибкам при анализе. В результате этих исследований было также устаиоалепс что образцы крови, высушенные на фильтровальной бумаге не теряю активности в течение 2-х недель при 37 °С, 2 мес. при 4 °С и 6 мес. при ( 20 °С. Изучение образцов высушенной крови в ИФА тест-системах, основа на синтетических пептидах и рекомбинантных белках выявило большое коли1 (65%) неспецифических реакций в наборах "Рекомбинант-В1

Таблица 11

Изучение образцов сывороток и крови на фильтровальной бумаге на антитела к

ВИЧ в тест-системе ИФА "Антиген"

Обследованные группы Количество неелэ-доааных образцов % ложноположительных результатов при анализе Количест во подтвержден ных результа -TOS

сывороток сухой капли крови в планшете сухой капли крови на фильтра вальной бумаге

1.ВИЧ инфицированные и больные СПИДом 15 0 0 15

2.Больные венерическими заболеваниями 530 3,7 4,5 4,9 0

ЗЛица, с беспорядочными ПОЛОВЫМИ связями 202 10,3 15,0 6,0 0

4.Беременные женщины 232 13,0 5,6 6,7 0

б.Лица, обследуемые по клинич&с-ким показаниям 619 3.2 5,3 2,9 0

6. Лица, прибывшие из-за рубежа 13 745 5,2 н.и, 6,6 0

7-Гмнекологическ, больные 21 0 н.и. 0 0

8.Дети ссоматичес кими забалеван. 144 0 н.и. 3,8 0

Э.Пациенты нарколог. больницы N17 2500 0

Всего обследовано 18008 4,5 6,3 5,5 15

Таблица 12

Сравнительное изучеиив оариггов сывороток и сухой капли крови на фильтрокаш.ной бушге ВИЧ-инфицировагтых лагтсптоБ я здоровых

ДОнО хш в ИФА тест-системах

Наименование тест систем Образцы сывороток Образцы сухих капелт. крови Количество образцов, иодтвержд&тншх в имшпоблотс Примечание

БИЧ-ипфиц. Доноров ВИЧ-инфиц. Доноров

Антиген 12/12 0/348 12/12 0/348 12 МР МЗ СССР. 1988

11ептоскрш1-2 н.и. 1/85 И.И. 0/85 0 МР МЗ СССР, 1988

Рекомбинакг-ВИЧ 12/12 5/348 12/12 И 0У348 12 МР МЗ РСФСР, 1989

Ре комбипапт- вич 12/12 5/348 К/12 4/348 12 Ин-т им. ГТасгера 1991

Скрин-ВИЧ 46/46 1/235 46/46 0/235 46 Ин-т им. Пастора 1994

Скрич-ВИЧ 35/35 1/194 35/35 0/194 35 фирма Тсхносума

11тсШа гссотЬ. 3.1/35 14/194 35/35 7/194 35 фирма 'Гехпосуш.

В чиелнтеле - количество реакшвныгх обралпов В млмсна гиие - количество исследованных образцов

Для снижения количества неспецифических реакций были использованы бумажные фильтры, предложенные фирмой Техносума (Р.Куба), различные методы подготовки исследуемого материала и условий проведения ИФА (Табл. 12).

Эти исследования позволили установить, что комплект фирмы Техносума, предложенный для сбора крови на выявление антител к ВИЧ пригоден для индивидуального использования, удобен и безопасен при применении. Количество неспецифических реакций при исследовании клинического материала от здоровых доноров составляло: 3,7-7,2 и 1,0-0,5% в ИФА тест-системах. "Umelisa recombinant HIV 1+2" и "Скрин-ВИЧ", соответственно. Показано, что эти неспецифические реакции были связаны с присутствием в исследуемом материале антител Е. coli.

Таким образом, была показана возможность использования, для серодиагностики ВИЧ капель крови из пальца пациента, высушенных на фильтровальной бумаге. Этот метод облегчает сбор и транспортирование клинического материала при массовом обследовании населения.

выводы

1. Впервые разработана комплексная система стандартизации препаратов для диагностики ВИЧ-инфекции, включающая разработку требований по оптимизации технологии производства, контроля препаратов на различных этапах изготовления и надзора за качеством.

2. Изучены биологические свойства новых штаммов ВИЧ типа 1 (ГКВ №№ 4005, 4046, 4122 и 7МВ), выделенных на территории СНГ. Установлено, что они различаются по культуральным свойствам, инфекционной и репродуктивной активности в клеточных культурах, накоплению вирусного антигена и антигенным характеристикам. Отобраны, аттестованы и внедрены в практику здравоохранения в качестве производственных штаммы ВИЧ № 4046, 4122.

3. Показано, что наиболее перспективной для получения антигена ВИЧ типа 1 является линия МТ-4, обладающая высокой пролиферативной, антигенпродуцирующей активностью и чувствительностью к заражению различными штаммами ВИЧ. Подготовлен банк клеток МТ-4, охарактеризованный в соответствии с требованиями, предъявляемыми к клеточным субстратам, применяемым для производства биопрепаратов.

4. Разработана технология промышленного получения вирусного антигена на основе нового отечественного штамма ВИЧ, изложенная в утвержденном экспериментально-производственном регламенте (ЭПР №474-94).

ИФА тест-системы для выявления антител к ВИЧ, приготовленные на вирусных лизатах из новых штаммов обладали высокой диагностической эффективностью (чувствительностью и специфичностью-99,0%).

5. Впервые разработаны принципы формирования и аттестации стандартных панелей сывороток крови человека для оценки качества диагностических препаратов, применяемых для выявления маркеров ВИЧ. Разработана технология получения стандартных панелей сывороток с заданными характеристиками.

6. Получены и зарегистрированы в качестве национальных стандартов панели сывороток, содержащих и не содержащих антитела к ВИЧ-1 (ОСО 42 28-21-

93 и ОСО 42 28-214-94), пероксидазные конъюгаты (ОСО 42 28-191-91 и ОСО 42 28-192-91), позволяющие обеспечивать надзор за качеством диагностических тест-систем для выявления антител к ВИЧ.

7. Разработана система апробации новых препаратов для выявления маркеров ВИЧ, позволяющая эффективно дифференцировать их по диагностической ценности при внедрении в лабораторную практику.

8. Впервые разработаны и экспериментально обоснованы национальные требования, критерии стандартизации и отбора вирусных и клеточных штаммов и методы оценки антигенов ВИЧ, полученных различными технологиями, для использования в качестве иммуносорбентов при конструировании диагностикумов ВИЧ.

9. Требования, критерии и методы оценки основных компонентов ИФА тест-систем для выявления маркеров ВИЧ, обеспечивающие получение препаратов с высокой диагностической эффективностью, введены в действующие НТД и оформлены в виде новых ВФС, ЭПР, МУ и МР, утвержденных в установленном порядке.

10. Показано, что капли крови, высушенные на фильтровальной бумаге, могут быть использованы для выявления антител к ВИЧ в ИФА тест-системах различных конструкций. Метод являясь более простым и доступным сокращает риск заражения ВИЧ при получении, хранении и транспортировании клинического материала.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

КШалунова Н.В.,Ломанова Г.А.Принципы стандартизации клеточных линий,применяемых в биотехнологии.Сб."Актуальные проблемы медицинской вирусологии".М., 1985,с.223-224.

2.Степанова Л.Г.,Алексеев С.Б.,Згурский А.А.,Шалунова Н.В.,Ломанова Г.А. Получение и характеристика нового штамма диплоидных клеток из эмбриональной ткани легкого человека.Цитология,1986,т.28,Ы12, с 1373.

3.Миронова Л.Л.,Шалунова Н.В.,Ломанова Г.А.,Грачев В.П..Николаева М.А.,Хапчаев Ю.Х.,Стобецкий В.И.,Кармышева В.Я.Характеристика банка линии гетероплоидных клеток почки зеленой мартышки 4647.Вопросы вирусологии, 1987, N6, с.740-743.

4.Ломанова Г.А.;Ладыженская И.П..Степанова Л.Г.Оценка чувствительности вновь установленных линий к заражению вирусами различных таксономических групп.Сб."Стандарты,штаммы и методы контроля бактерийных и вирусных препаратов ".,М.,1987,с.13-18.

5Ломанова Г.А.Перспективы использования клеточных культур в производстве и контроле медицинских иммунобиологических препаратов.Вопросы медицинской биотехнологии иммунопрепаратов. Уфа,1988,с. 101-103.

6.Ломанова Г.А.,Шалунова Н.В ..Николаева М.А.,Омельченко Т.Н.Характеристика посевного банка линии диплоидных клеток эмбриона человека.Сб.Стандарты,штаммы и методы контроля бактерийных и вирусных препаратов.М.,1989,с.11-15.

7.Воробьева М.С.,Ломанова Г.А.,Борсук Э.А.,Чевердюк Л.Н.Качество отечественных иммуноферментных тест-систем для определения антител к ВИЧ.Сб.Профилактика и борьба со СПИДом в СССР.,Л.,1990,с.79-80.

8.Веревкина К.Н.,Ломанова Г.А..Шульгина Е.О..Волкова И.П.,Хомичева С.Я..Шалаев Е.Ю.,Канев А.Н.,Воробьева М.С.Разработка стандартных образцов конъюгатов белка А и иммуноглобулинов с пероксидазой хрена.Сб.Современные направления создания медицинских диагностикумов.М.,1990,с.89.

9.Воробьева М.С..Федорова Г.В.,Ломанова Г.А.,Опочинский Э.Ф..Палей О.С..Ясинский А.А.Способ отбора пальцевых проб крови для массовых исследований на содержание антител к вирусу иммунодефицита человека.Сб. VI Всероссийский съезд МЭП,Н.Новгород,1991,с.146.

Ю.Канев А.Н..Воробьева М.С.,Загребельный С.Н..Широких Е.Н.,Горбатов А.Ф.,УсоваС.В.,Ломанова Г.А.Принципы стандартизации панелей сывороток, предназначенных для оценки качества диагностических тест-систем.Вопросы, вирусологии, 1992,N2,с. 122-124.

П.Канев А.Н.,Гутова Е.А.,Ломанова Г.А..Воробьева М.С..Шалаев Е.Ю.,Загребельный В.Н.Принципы создания стандартных панелей сывороток с низкой концентрацией антител к ВИЧ-1 для контроля качества коммерческих иммуноферментных тест-систем.Вопросы вирусологии, 1993,N2,с.86-89. 12.Ломанова ПА.Диагностические тест-системы на основе изолятов вируса

иммунодефицита человека.Актуальные проблемы создания и применения иммунобиологических препаратов для диагностики и профилактики инфекционных болезней.Пермь,1993,т.З,с; 126-143.

13.Ломанова Г.А.,Воробьева М.С.,Бектимиров Т.А.,Покровский А.Г.Получение отечественных штаммов ВИЧ для производства диагностических препаратов.Сб.Актуальные проблемы инфекционной патологии. Ст.-Петербург,1993,с.157.

Н.Воробьева М.С.,Ломанова Г.А.,Гутова Е.А.,Разгуляева А.В.Новый стандарт для оценки качества диагностических ИФА тест-систем для выявления антител к ВИЧ.Сб. Актуальные проблемы инфекционной патологии. Ст.-Петербург, 1993,с. 137.

15.Ломанова Г.А..Воробьева М.С.,Бектимиров Т.А.,Разгуляева А.В.Апробация новых тест-систем для выявления ВИЧ-инфекции.Диапюстика и профилактика ВИЧ-инфекции и вирусных гепатитов.Хабровск,1993,с. 58-60.

16.Ломанова Г.А.,Воробьева М.С.,Елекоев К.А.Исследование пальцевых проб крови при скрининге на антитела к вирусу иммунодефицита человека.Диагностика и профилактика ВИЧ-инфекции и вирусных гепатитов .Хабаровск, 1993, с.61-63.

17.Ломанова Г.А.,Карен Елин.Франсиско Вонг, Воробьева М.С.Атгестация тест-системы "Умелиса ВИЧ 1+2 рекомбинантная ".производства республики Куба.Социальные и медицинские проблемы СПИДа. 1-ая Международная региональная конференция по ВИЧ инфекции,Ст.-Петербург,1994,с.20.

18.Воробьева М.С.,Ломанова Г.А.,Буровцова Е.В.Данилова Т.И.,Малахов

B.Н.Принципы организации системы внешней оценки качества исследований в лабораториях диагностики ВИЧ-инфекции.V Российский съезд специалистов по лабораторной диагностике.М.,1995,т. 1,с.58-59.

19.Воробьева М.С.,Ломанова Г.А.,Гольцов В.А.,Саркисян К.А.,Разгуляева А.В.Новые препараты для экспресс-диагностики ВИЧ-инфекции.4-ая Международная конференция "СПИД,рак и родственные проблемы ",,Ст.-Петербург, 1996,с. 160.

20.Канев А.Н.,Воробьева М.С.,Максютов А.З.,Смердова М.А.,Усова

C.В.,Ломанова Г.А..Конструирование стандартного иммунопланшета с иммобилизованными рекомбинантными антигенами ВИЧ-1,2. 4-ая Международная конференция "СПИД,рак и родственные проблемы".Ст,-Петербург,1996,с.105.

21.Kanev A.,Iaroslavtsev V.,LomanovaG.,Elekoev K.,Vorobyeva M.Improvoment of the standard panel of HIV antibody positive and negative sera.Intern.conference on medical .biotechnology.immunization and AIDS.L.USSR,1991,p.25.

22.Lomanova G.,Vorobyeva M. A new membrane-based test-system for diagnosing HIV-infection.Intern.conference on molecular biology aspects of diagnostics and therapy of AIDS.N.,1991,p.24.

23.Lomanova G.,Vorobyeva M.,Bektimirov T.,Razgulyaeva A.Preparation for diagnosis of HIV infection based on the membrane technology.Intern.conference on AIDS,cancer and human retroviruses.St.-Petersburg,1992,p. 69.

4.Kanev A.,Gutova E.,Lomanova G.,Shalaev E. Approaches to the creation of andartl panel of sera with low HIV antibodies concentration for qualitative esti-íation of enzyme immunoassay diagnostic kits.Intern.conferece on AIDS, cancer nd human retroviruses.St.-Petersburg.,1992,p.41.

5.Vorobyeva M.,Bektimirov T.,Lomanova G.Diagnostic efficacy of HIV antigen f different origins used in ELISA test system for specify antibodies greening.Intern.conferece on AIDS ,cancer and human retroviruses.St.-etersburg, 1992,p.39.

ó.Lomanova G.,Vorobyeva M.,Bektimirov T.Estimation of HIV strains used for reduction of diagnostic test systems.2-nd Intern.conference " AIDS ,cancer and luman retroviruses ".St.-Petersburg.,1993,p.l7.

:7.Vorobyeva M.,Lomanova G.,Elecoev K.,Razgulyaeva A.Quality of commer-ial diagnostic test kits used for HIV screening in Russia.2-nd intern.conferece" VIDS,cancer and human retroviruses ".St.-Petersburg,1993,p.l7. :8.Kanev A.,Gutova E ..Vorobyeva M.,Shalaev E.,Lomanova G.,Usova S.Quality stimation of diagnostic kits by using standard plate of sera containing and not ontaining antibodies to HIV by histograms method.2-nd. Intern, conferece AIDS.cancer and human retroviruses ".St.- Petersburg,1993,p.17. !9.Lomanova G..Vorobyeva M.,Bektimirov T.The comparision of test systems or HIV diagnostics based on luminescent detection .Intern. Journal of mmunorehabilitation, 1994,N 1 ,p.210.

iO.Vorobyeva M.,Lomanova G.,Bektimirov T.,Elekoev K.,Gutova E.,Kanev ^.Standards for quality evaluation of diagnostic kits used to reveal HIV intibodies.Intern.Journal of Immunorehabilitation , 1994,N1,p.377.