Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-вирусологическое исследование вируса иммунодефицита человека на ранней фазе эпидемии ВИЧ/СПИД
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология
Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-вирусологическое исследование вируса иммунодефицита человека на ранней фазе эпидемии ВИЧ/СПИД"
,Б ОД - 8 ДЕК «98
На правах рукописи
КОЗЛОВ АНДРЕЙ ПЕТРОВИЧ
МОЛЕКУЛЯРНО-ВИРУСОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА НА РАННЕЙ ФАЗЕ ЭПИДЕМИИ ВИЧ/СПИД
03.00.03 - молекулярная биология 03.00.06-вирусология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук
Санкт-Петербург—1998
Работа выполнена в ГНЦ ГосНИИ особо чистых биопрепаратов (Санкт-Петербург)
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, академик РАМН A.A. Воробьев доктор медицинских наук, профессор И. Г. Сидорович доктор биологических наук, профессор С. Н. Щелкунов
Ведущая организация: Санкт-Петербургский государственный университет, биолого-почвенный факультет
Защита состоится «Ж \993r. в часов на заседа-
нии Специа лизированногсйовета Д 074.20.01 по присуждению ученой степени доктора биологических наук в Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» (633159, п. Кольцове Новосибирской обл.).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ ВБ «Вектор».
Автореферат разослан «. » 1998 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета 6----Т.Н. Шубина
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
1.1. Актуальность проблемы
Эпидемия ВИЧ/СПИД широко распространилась в мире. По различным оценкам, к концу столетия на Земном шаре будет насчитываться от 40 до 100 млн. ВИЧ-инфицированных, в том числе больных СПИДом. В некоторых странах Восточной и Южной Африки (т. н. страны «СПИДового пояса») число инфицированных уже достигло 25% населения. Высокая смертность заболевших СПИДом, передача инфекции половым путем, поражение иммунной системы и интеграция возбудителя заболевания, вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), в геном хозяина, отсутствие вакцины и (до самого последнего времени) эффективных средств терапии, pacnpocrpai шние заболевания среди гомосексуалистов и в самых низших слоях общества, в т. ч. у проституток и наркоманов, социальный характер проблемы—все это вместе взятое является причиной глубокой озабоченности самых широких кругов мировой общественности, включая ученых и специалистов, властные структуры, политические и общественные организации, которая возникла сразу по обнаружении этого нового заболевания, получившего название синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД).
В начале 80-х годов, когда был обнаружен ВИЧ [Barre-Sinoussi et а!., 1984; Gallo et al., 1984; Levy et al., 1984; Popovic et al., 1984] и созданы первые тест-системы для его выявления [Samgadharanet al., 1984], стало очевидным, что количество ВИЧ-инфицированных значительно превышает количество больных СПИДом, срок до появления первых видимых признаков заболевания составляет несколько лет, а СПИД является заключительной стадией развития ВИЧ-инфекции. Единственным способом описания развитияэпидемии ВИЧ-инфекции поэтому является лабораторная диагностика в сочетании с эпидемиологическими подходами.
Осознание этих обстоятельств обусловило необходимость в самые короткие сроки выяснить вопрос о распространенности ВИЧ-инфекции в России, чтобы определить размеры грозящей опасности. К моменту начала наших исследований этот вопрос был совершенно не изучен. После выявления нами и другими отечественными исследователями первых случаев ВИЧ-инфекции в С.-Петербурге и в России стало очевидно, что в нашей стране имеет место самая ранняя фаза проникновения ВИЧ, пропущенная для изучения в большинстве других стран мира, располагавших необходимыми для этого возможностями. Нам представилась уникальная возможность изучить закономерности развития эпидемии ВИЧ/СПИД на ее самой рашгей стадии.
Обнаружение первых случаев ВИЧ-инфекции в С.-Петербурге и в России обусловило необходимость развертывания противоэпидемических мероприятий и создания системы эпидемиологического надзора за ВИЧ-инфекцией, в первую очередь—лабораторной диагностики. Дело осложнялось тем, что к этому времени иммуноферментный анализ (ИФА), на основе которого создавались тест-системы на антитела к ВИЧ, не использовался в отечественном
практическом здравоохранении. Предстояло внедрить ИФА, а также методы подтверждающей лабораторной диагностики и контроля качества лабораторной диагностики, чтобы выиграть первый раунд борьбы с надвигавшейся эпидемией ВИЧ/СПИД.
1.2. Цели и задачи исследования
Целями данной работы были выявление ВИЧ-инфекции в С.-Петербурге, выделение первых изолятов ВИЧ, описание молекулярно-эпидемиологичес-ких и молекулярно-вирусологических закономерностей ранней фазы эпидемии ВИЧ/СПИД, а также внедрение в практическое здравоохранение методов иммуноферментного анализа, подтверждающей лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции и контроля качества лабораторнойдиагносгики ВИЧ-инфекции. Выбранный подход предусматривал использование широкого набора иммунохимических, вирусологических, молекулярно-биологических методов в сочетании с крупномасштабными мероприятиями практического характера, направленными на предотвращение распространения ВИЧ-инфекции. В связи с этим работа предусматривала решение следующих задач:
1) организовать работу по выявлению ВИЧ-инфекции в С.-Петербурге;
2) внедрить метод иммуноферментного анализа в практическое здравоохранение, создать систему лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции в городе;
3) внедрить методы подтверждающей диагностики и мониторинга ВИЧ-инфекции, создать и внедрить программу контроля качества лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции;
4) описать эпидемиологию ВИЧ/СПИД в С.-Петербурге;
5) выделить и охарактеризовать с.-петербургские изоляты вируса иммунодефицита человека;
6) используя метод ИФА со специфическими пептидами из области вершины УЗ-петли белка gp 120 ВИЧ-1, соответствующими различным субтипам ВИЧ-1, провести серотипирование ВИЧ-1, присутствующих в С.-Петербурге, Москве и на Украине;
7) определить первичную последовательность и провести структурный анализ участков генома, кодирующих область основного нейтрализуемого домена с.-петербургских изолятов ВИЧ-1;
8) применяя различные молекулярно-филогенетические методы, осуществить генотипирование ВИЧ-1;
9) при помощи молекулярно-филогенетических методов провести анализ взаимоотношений между вариантами ВИЧ-1 и изучить возможные взаимосвязи между генетическим разнообразием вирусов и фазой развития эпидемии;
10) сопоставить данные серотипирования и молекулярно-биологического анализа с эпидемиологическими и вирусологическими данными для выяснения молекулярно-эпидемиологических и молекулярно-вирусологических закономерностей.
1.3. Основные положения, выносимые на защиту
1. В1987-1988 гг. были впервые выявлены случаи инфицирования ВИЧ в Ленинграде. Первоначально основную группу лиц, инфицированных ВИЧ, составили студенты вузов, приехавшие из стран центральноафриканского региона, а также женщины, имевшие сексуальные контакты с африканцами.
Было выявлено большинство возможных путей передачи вируса, причем передача от матери ребенку—впервые в стране. Были зарегистрированы первый в стране ВИЧ-инфицированный донор и первая смерть от СПИДа.
2. Качество лабораторной диагностики на ВИЧ-инфекцию в С.-Петербурге и в России в целом находится на достаточно высоком уровне, поэтому низ-кос число ВИЧ-инфицированных, зарегистрированных в 1987-1996 гг., отражало реальную эпидемиологическую ситуацию, а не являлось артефактом, связа! шым с плохой лабораторной практикой.
3. В С.-Петербурге в 1986-1996 гг. имела место ранняя фаза эпидемии ВИЧ/СПИД, которая, в отличие от общей ситуации в мире, протекала с приблизительно равной представленностью гомо- и гетеросексуальных путей передачи и без существенного участия так называемых «шприцевых» наркоманов (вводящих наркотики внутривенно).
4. В С.-Петербурге представлены ВИЧ-1 серотипа В и (не-В)-серотипов, вероятно, соответствующих африканским субтипам ВИЧ-1. До 1996 г. наиболее распространенной в С.-Петербурге была инфекция серотипом В ВИЧ-1, которая характеризовалась выраженной положительной динамикой. Имело место проникновение серотипа В ВИЧ-1 в среду гомосексуалистов. (Не-В)-серотипами ВИЧ-1 до 1996 г. были инфицированы преимущественно женщины с беспорядочными половыми связями. Вместе с данными о присутствии африканских студентов в С.-Петербурге с начала с 60-х годов относительно более низкая представленность (не-В)-серотипов может свидетельствовать о неодинаковой чувствительности популяции жителей С.-Петербурга к разным серотипам ВИЧ-1, об относительно более низкой инфекционности ВИЧ-инфицированных африканцев и/или о более позднем, чем принято думать, распространении ВИЧ в Африке.
5. Нынешний этап развития эпидемии ВИЧ/СПИД на Украине, характеризующийся быстрым ростом инфицирования шприцевых наркоманов, связан с проникновением в разные регионы разных серотипов ВИЧ-1: в Николаеве это серотип В, а в Одессе, Крыму и Донецке — (не-В)-серотипы. В Киеве присутствуют и те, и другие серотипы. Полученные данные свидетельствуют о независимых путях проникновения ВИЧ-1 в популяции наркоманов различных регионов Украины.
6. В Москве 80% ВИЧ-инфицированных гомосексуалистов являются носителями ВИЧ-1, относящегося к серотипу В. 75% ВИЧ-инфицированных шприцевых наркоманов инфицированы не-В серотипами. Таким образом, в г. Москве имеет место дифференцированное распределение различных серотипов по разным группам риска (которые определяются по не зависимым от серотигшрования критериям).
7. Ранняя фаза эпидемии ВИЧ/СПИД в России и ближнем зарубежье связана с проникновением разных серотипов ВИЧ и примерно равной представленностью В-серотипов и (не-В)-серотипов. Разные серотипы проникают в разные регионы и группы риска. Это обстоятельство является важным при выработке стратегии создания и применения отечественной вакцины против ВИЧ.
8. Из клеток серопозитивных лиц выделен и охарактеризован вирус иммунодефицита человека (ВИЧ-1). Результаты вирусологических и молекуляр-но-биологических исследований свидетельствуют о том, что с.-петербургские изоляты являются макрофаготропными вариантами ВИЧ-1, не индуцирующими образование синцитиев, и относятся к так называемым «slow/low» вариантам вируса, которые характеризуются низкой скоростью репликации.
9. С.-петербургские изоляты ВИЧ-1, полученные от гомосексуалистов и некоторых лиц нормальной сексуальной ориентации, относятся к генетическому субтипу В. Их высокое генетическое разнообразие и широкое распределение по филогенетическому древу изолятов субтипа В ВИЧ-1 различного географического происхождения свидетельствуют о множественном и независимом проникновении различных вариантов субтипа В ВИЧ-1 в Санкт-Петербург. Это позволяет сформулировать гипотезу о различном происхождении разнообразия субтипа ВИЧ-1 на ранней и развитой стадиях эпидемии ВИЧ/ СПИД.
10. Разнообразие найденных в Санкт-Петербурге изолятов ВИЧ-1 на уровне нуклеотидных и аминокислотных последовательностей характеризуется наличием как общих закономерностей с уже описанными в литературе, так и некоторых отличий, к которым относятся впервые обнаруженные нами последовательности вершины V3-петли—APGS (изолят Sp88), APGG (изолят Sp72) и HMGPGGTF (изолят Sp42)—ранее не описанные в литературе ни для одного из известных изолятов ВИЧ-1.
11. Впервые обнаружен вирус размером 125-160 нм с характерной для Herpesviridae морфологией, однако отличающийся от всех описанных до этого герпесвирусов. Этот новый герпесвирус может играть роль в патогенезе ВИЧ/ СПИД, в т. ч. в патогенезе саркомы Капоши.
12. Принятый в России эпидемиологический подход к проблеме ВИЧ/ СПИД, существенной частью которого является широкое направленное лабораторное тестирование в сочетании с оказанием помощи ВИЧ-инфицированным и их консультированием, был эффективным для борьбы с эпидемией ВИЧ/СПИД на ее ранней стадии и в соответствующих социально-экономических условиях.
Вместе с тем, имеющиеся данные заставляют сформулировать негативный прогноз развития эпидемии ВИЧ/СПИД в С.-Петербурге и в России [Kozlov et al., 1994] в случае, если не будут приняты дополнительные превентивные меры, в первую очередь—разработка вакцины.
1.4. Научная новизна работы
В 1987-1988 гт. нами были выявлены первые случаи инфицирования ВИЧ в Ленинграде. Было выявлено болылш гство возможных путей передачи вируса, причем передача от матери ребенку—впервые в стране. Были зарегистрированы первый в стране ВИЧ-инфицированный донор и первая смерть от СПИДа.
Первоначально основную группу лиц, инфицированных ВИЧ, составили студенты-африканцы, при этом впервые были получены данные о высокой ВИЧ-инфицированности в Эфиопии.
Впервые установлено, что качество лабораторной диагностики на ВИЧ-инфекцию в России находится на достаточно высоком уровне. Таким образом, впервые получены объективные данные в пользу того, что система эпидемиологического надзора за ВИЧ-инфекцией в России точна, а низкое число ВИЧ-инфицированных отражает реальную эпидемическую ситуацию, а не является лабораторным артефактом. На основе имеющихся данных впервые сделан вывод о том, что профессиональный подход к проблеме ВИЧ/СПИД в России, существенной частью которого является широкое направленное лабораторное тестирование в сочетании с оказанием помощи ВИЧ-инфицированным и их консультированием, является эффективным д ля борьбы с эпидемией ВИЧ/СП ИД на ее ранней стадии и в соответствующих социально-экономических условиях.
Впервые установлено, что до 1996 г. в С.-Петербурге имела место ранняя фаза эпидемии ВИЧ-инфекции, характеризующаяся проникновением различных серотипов ВИЧ. Наиболее распространенной в С.-Петербурге была инфекция серотипом В ВИЧ-1, имевшая выраженную положительную динамику. Происходило проникновение субтипа В ВИЧ-1 в среду гомосексуалистов. (Не-В)-серотипами ВИЧ-1, предположительно африка1 гскими, были инфицированы преимущественно женщины, имевшие беспорядочные половые связи.
Сопоставление результатов, полученных в Санкт-Петербурге, в Москве и на Украине, показывает, что ранняя фаза эпидемии ВИЧ/СПИД в России и ближнем зарубежье связана с проникновением разных серотипов ВИЧ и примерно равной представленностью В серотипов и (не-В)-серотипов. Разные серотипы проникают в разные регионы и группы риска. Это обстоятельство является важным при выработке стратегии создания и применения отечественной вакцины против ВИЧ.
Выделены и охарактеризованы одни из первых отечественных изолятов ВИЧ. Молекулярно-биологические подходы подтверждают, что в С.-Петербурге на ранней фазе эпидемии ВИЧ/СПИД присутствует ВИЧ-1 субтипа В. Установленное с помощью молекулярно-филогенетического анализа высокое генетическое разнообразие изолятов ВИЧ-1 субтипа В, выделенных от ВИЧ-инфицированных в С.-Петербурге, предполагает множественное и независимое проникновение различных изолятов ВИЧ-1 субтипа В.
Разнообразие найденных в Санкт-Петербурге изолятов ВИЧ-1 на уровне нуклеотидных и аминокислотных последовательностей характеризуется наличием как общих закономерностей с уже описанными в литературе, так и некоторых отличий, к которым относятся впервые обнаруженные нами последовательности вершины УЗ-петли—АРОБ (изолят Бр88), АРСО (изолят Бр72) и НМСРСОТР (изолят Бр42), —ранее не описанные в литературе ни для одного из известных изолятов ВИЧ-1.
Впервые обнаружен вирус размером 125-160 нм с характерной для НегреБУшске морфологией, однако отличающийся от всех описанных до этого герпесвирусов. Этот новый герпесвирус может играть роль в патогенезе ВИЧ/ СПИД, в т. ч. в патогенезе саркомы Капоши.
1.5. Практическая ценность
Исследование относится к разряду научно-практических работ.
Обнаружение первых случаев ВИЧ-инфекции в С.-Петербурге и первой смерти от СПИДа в России в значительной степени повлияло на развитие всей программы противоэпидемических мероприятий и научных исследований.
Метод иммунофермекгного анализа внедрен в практическое здравоохранение С.-Петербурга, создана система лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции в С.-Петербурге. Внедрены методы подтверждающей диагностики и мониторинга ВИЧ-инфекции, включающие иммуноблоттинг, полимеразную цепную реакцию, выделение вируса и определение иммунного статуса. Это позволило получить достаточно полные характеристики клинического материала и убедительные данные о ходе развития эпидемического процесса в городе.
Установлено, что качество лабораторной диагностики на ВИЧ-инфекцию в С.-Петербурге и в России находится на достаточно высоком уровне. Предпринятое нами в инициативном порядке исследование качества работы скри-нинговых лабораторий превратилось по существу в национальную программу контроля качества лабораторной диагностики на ВИЧ-инфекцию, в которой в 1992-1996 гг. приняло участие 248 лабораторий. Наши данные свидетельствуют о том, что эта программа во взаимодействии с усилиями скрининго-вых лабораторий и производственников тест-систем способствовала повышению качества работы лабораторий и совершенствованию тест-систем.
Полученные нами данные о серотипах и субтипах ВИЧ-1, присутствующих в С.-Петербурге, в Москве и на Украине, важны дня разработки вакцины против ВИЧ.
На основе имеющихся данных сделан вывод, что принятый в России профессиональный подход к проблеме ВИЧ/СПИД, существенной частью которого является широкое направленное лабораторное тестирование в сочетании с лечением и консультированием ВИЧ-инфицированных, эффективен для борьбы с эпидемией ВИЧ/СПИД на ее ранней стадии и в соответствующих социально-экономических условиях.
Вместе с тем сформулирован негативный прогноз развития эпидемии ВИЧ/ СПИД в С.-Петербурге и в России в случае, если не будет реализована стратегия активного профилак тического вмешательства, предусматривающая разработку вакцины против ВИЧ [Козлов 1995,1998; КогЫ й а1., 1994].
1.6. Личный вклад соискателя
Работа выполнена лично автором на базе ГИЦ ГосНИИ особо чистых биопрепаратов Министерства здравоохранения РФ (ГНЦ ГосНИИ ОЧБ) и Межведомстве! и гой лаборатории по изу че! шю СПИД. Вклад автора состоит в организации и проведении экспериме! ггальных исследований,теоретическом обобщении полученных результатов и формулировке выводов. Отдельные разделы выполнены совместно с сотрудниками ГНЦ ГосНИИ ОЧБ А. В. Емельяновым, Т. В. Курбатовой, А. Г. Малых, С. В. Веревочкиным, А. В. Глебовым, М. Н. Трауготт, Н. М. Калининой, А. А. Набатовым, А. Э. Машарским и другими. Работа по выявлению первых случаев ВИЧ-инфекции в С.-Петербурге, по организации системы лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции в городе проводилась в тесном взаимодействии с Главным управлением здравоохранения г. Ленинграда (ГУЗЛ)—Комитетом по здравоохранению (А. В. Борисова, Б. М. Тайцидр.),ГорСЭС(Г. В. Волкова и сотр.), городской инфекционной больницей А'-' 30 им.С. П. Боткина (Ю. К. Чернышев и др.), городского центра по профилактике и борьбе со СПИД (Г. В. Богоявленский и сотр.). Работы по выделению изолятов ВИЧ проводились на базе противочумной станции (Г. И. Ващенок, В. В. Касаткин, П. В. Колотвина). Работы по эпидемиологии ВИЧ/ СПИД в С-Петербурге проводились совместно с сотрудниками отдела особо опасных инфекций ГорСЭС(Г. В. Волкова, Г. С. Степанова, Т. Б. Кутасова), на Украине — совместно с сотрудниками Национального комитета по СПИДу (Ю. В. Кобыща)иЦе1прапопрофшюктикеСПИД,г. Киев(Н. П. Ченцова, А. М. Щербинская); в Москве — совместно с сотрудниками 2-й Московской ин-фекцио1 а Ю11 болы (ицы и Московского городского I (И 1тра СПИД (В. А. Голиков и др.). Отдельные этапы работы проводились совместно с Э. В. Карамо-вым (Институт вирусологии им. Д. И. Ивановского), М. Райцем (Национальный раковый институт, США) и X. Фарзадеганом (Университет им. Дж.Гопкинса, США). По всем полученным совместно результатам имеются совместные публикации. Соискатель приносит своим соавторам искреннюю благодарность. Соискатель признателен С. В. Веревочкину, А. Г. Голубеву, А. В. Емельянову, А. Ю. Лянгузову, А. А. Набатову и А. Э. Машарскому за помощь в оформлении работы.
1.7. Форма выполнения диссертационной работы
Работа была выполнена в рамках финансирования по договорам С-8188, С-7389, ФПС-5189, ФПС-7089, ФПС-0590, ФПС-0690, ФПС-5390, ФПС-5791, ФПС-8091, ФПС-8291, ФПС-7491, ФПС-0492, ФПС-4893, ФПЗ-0991, ФПЗ-45926 и по грантам № Н113000 от Международного Научного Фонда
(International Science Foundation) и № 5D43TW00010 от Международного
Центра Фогерти (Fogarty International Center).
1.8. Апробация работы
Материалы, представленные в диссертации, докладывались на следующих
конференциях:
- VI International Conference on AIDS, San-Francisco, 1990.
- Frontiers in Human Retrovirology and Related Topics. The laboratory of tumor cell biology. National Cancer Institute, Bethesda, Maryland, USA, 1990.
- VIII International Congress of Virology. Berlin, August 26-31,1990.
- Сессия общего собрания Академии медицинских наук СССР 19-23 марта 1991 г.
- Annual Meeting Sponsored by the Laboratory of Tumor Cell Biology, Bethesda, USA, 1991.
- International Conference of Medical Biotechnology, Immunization and AIDS, Leningrad, USSR, 1991.
- VII International Conference on AIDS, Florence 16-21 June 1991.
- International Conference on AIDS, Cancer and Human Retroviruses, St.Petersburg, Russia, 1992.
- International Symposium «100 Years of Virology», St.Petersburg, September 21-25, 1992.
- VII Meeting «Actual Problems of Allergology, Immunology and AIDS», Kaunas, Lithuania, 1992.
- VIII International Conference on AIDS, IISTD World Congress, Amsterdam, The Netherlands, 19-24 July 1992.
- IX International Conference on AIDS, IV-th STS World Congress Berlin, 1993.
- 2"d International Conference on AIDS, Cancer and Human Retroviruses, St.Petersburg, Russia, 1993
- X International Conference on AIDS, Yokohama, Japan, 1994.
- Annual Meeting Sponsored by the Laboratory of Tumor Cell Biology, Bethesda, USA, 1994.
- 3«1 International Conference on AIDS, Cancer and Related Problems, St. Petersburg, Russia, 1995.
- Annual Meeting Sponsored by the Laboratory of Tumor Cell Biology, Bethesda, USA, 1995.
- 4'h International Conference «AIDS, Cancer and Related Problems», St.Petersburg, 1996.
- X International Congress of Virology, Jerusalem, Israel, 11-16 August, 1996.
- Региональное научное совещание «Генофонд населения Санкт-Петербурга и прогнозирование его динамики», Санкт-Петербург, 3-4 декабря 1996 г.
- 5«h International Conference «AIDS, Cancer and Related Problems», St.Petersburg, Russia, May 25-30,1997.
- 2nd European Conference on Experimental AIDS Research, Stockholm, Sweden, May 31—June 3,1997.
- 3rd European Conference on Experimental AIDS Research, Munich, Germany, February 28 — March 3, 1998.
- 6l!i International Conference on «AIDS, Cancer and Related Problems», St. Petersburg, Russia, May 18-22,1998.
- 12ih World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, June 28—July 3,1998.
- CIS Congress of Immunological and Allergological Societies, IV International Congress on Immunorehabilitation, 1 Conference "Vaccines ofNew Generation and Medical Diagnostic Systems of the Future", Sochi, Russia, July 5-9,1998.
1.9. Публикации
По материалам диссертации опубликовано 88 научных работ, из них 18 журнальных статей.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
С кровью и сыворотками ВИЧ-инфицированных пациентов работали в отдельном помещении с соблюдением правил, изложенных во «Временной Инструкции о противоэпидемическом режиме работы с материалом, зараженным ВИЧ, больными СПИД и при обследовании населения и доноров», утвержденной Минздравом СССР 12.03.86 г.
Сыворотки анализировали на наличие антител к белкам ВИЧ-1 с помощью коммерческих тест-систем по инструкциям, прилагаемым к наборам. Положительные результаты, получен! ibie в ИФА, подтверждали иммуноблотгм troM. Образцы сывороток, давшие положительный результат в иммуноблоттингс, использовалидлядальиейшего изучения.
Исслсдова! ше качества лабораторной диагностики на ВИЧ/СПИД включало: 1) приготовление зашифрованных контрольных панелей сывороток; 2) распространение панелей среди скршшнговых лабораторий; 3) сбор и обработку результатов работы лабораторий. Контрольные панели распространяли среди скрининговых лабораторий через представителей территориальных центров СПИД, посещавших С.-Петербург. Для обработки данных вычисляли отношение величины оптической плотности (ОП) образца к величине критерия (ОП/cut-ofí) для каждого отдельного анализа. Затем для каждой из сывороток контрольной панели определялась выявляемость — отношение числа правильных определений к общему числу анализов во всех лабораториях.
СеротипироваЕше ВИЧ-1 проводили, используя метод ИФА. В качестве антигенов брали синтетические пептиды, соответствующие вершине V3-neT-ли белка gpl20 различных субтипов ВИЧ-1. Применяли либо линейные пептиды как таковые, либо октамеры пептидов, ковалентно связанные с разветв-ле1 шой полилизиновой основой (Multiple Antigen Presentation Systems, МАП-пептиды).
Пептиды или МАП-пептиды (1,0 мкг/мл в фосфатно-солевом буфере (ФСБ), pH 7,4) сорбировали па поверхность поливинилхлоридных планшетов (Greiner, Германия) в течение 16-18 ч при4°С. Места неспецифической сор-
бцли блокировали раствором 2%-ного БСА в ФСБ/О, 1 % Tween-20 в течение 1 ч при 37°С. Планшеты промывали и использовали для тигшрования сывороток методом твердофазного ИФА.
Совокупности полученных в ИФА результатов обрабатывались методами анализа многомерных данных, позволяющих обнаружить в пространстве использованных для анализа пептидов кластеры точек, соответствующие группам близких по иммунореактивиости сывороток.
Выделение ВИЧ осуществляли в боксах максимальной биологической защиты на базе Ленинградской противочумной станции. Мононуклеарные клетки (МНК) пациентов выделяли по [Boyum, 1964]. Индукцию вируса проводили по методу [Levy et al., 1984] с модификациями. Активность обратной транс-криптазы в культуральной жидкости определяли, как описано в работе [Monroe et al., 1987]. Наличие вирусного антигена в культуральной жидкости определяли с помощью коммерческих тест-систем по инструкциям, прилагавшимся к наборам. Наличие вирусных частиц в культуре определяли электронномик-роскопичсски на ультратонких срезах [Быковский и др., 1973].
Определение (CD4+)-, (CD8+)- и (С020+)-лимфоцитов у пациентов проводили с помощью лимфоцит отоксического теста в микроварианте [Исхаков ссоавт., 1988] с использованием моноклональных антител к этим субпопуляциям лимфоцитов BMA 081,041 и 020(Behringer, Германия).
Выделение высокомолекулярной ДНК из клеток ВИЧ-инфицированных пациентов проводили, как описано в нашей работе [Евтушенко с соавт., 1984]. Экстрахромосомную ДНК из зараженных культивируемых клеток выделяли по методу [Hirt, 1967]. РНК из инфицированных ВИЧ клеток выделяли методом фенольной экстракции, как описано в нашей работе [Евтушенко с соавт., 1979].
Амплификацию ВИЧ-специфичных фрагментов ДНК, кодирующих V3-область gpl 20, проводили методом «гнездовой» (nested) полимеразной цепной реакции (ПЦР) [Albert and Fenyo, 1990]. Анализ продуктов ПЦР методом электрофореза в 0,8-1,2%-ных агарозных г елях, перенос ДНК из агарозного геля на нейлоновые мембраны по методу Саузерна и молекулярную гибридизацию проводили, как описано в наших работах [Евтушенко с соавт., 1984; Козлов ссоавт., 1988]. Нозерн-гибридизацию глиоксилированной РНК после электрофореза в 1,4%-ном агарозном геле проводили, как описано ранее [Евтушенко с соавт., 1984]. Клонирование амплифицированных ВИЧ-специфичны х фрагментов проводили, как описано в наших предыдущих работах [Ко-тенко с соавт., 1989 а,б] с модификациями. В качестве векторов для клонирования амплифицированных ВИЧ-специфичных фрагментов были выбраны плаз-миды pBluescriptSK(+) (Stratagene, США) npZero-l (Invitrogene, США). Рес-трикционный анализ рекомбинантных плазмид проводили, как описано в работе [Козлов ссоавт., 1988).
Секвенирование клонированных амплифицированных фрагментов ДНК проводили с помощью набора «Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing kit» (USB/ Amersham, США) по инструкции, прилагаемой к набору, с небольшими моди-
фикациями. Результаты обрабатывали, используя программу MICROGENE (Beckman, США). Первичные последовательное™ определяли для обоих цепей амплифицированной ДНК. Для каждого фрагмента было секвенировано от 2 до 6 индивидуальных клонов.
Компьютерный анализ первичных последова тельностей амплифицирован-ных фрагментов ДНК и реконструированных полипептидных последовательностей проводили с использова! тем пакета программ GCG (Wisconsin Package program, США). Нуклеотидные посцедоватеяы юегги амплифицированных фрагментов были выровнены с помощью программы CLUSTAL W по способности образовывать гомологичные пары с учетом минимизации образования мутаций типа вставок/делеций (gaps) между образовавшимися парами. Консеи-сусные последовательности амплифицированных фрагментов были определены с помощью программы PRETTY. Консенсусные аминокислотные последовательности в рамке считывания белка gpl20 для отдельных пациентов были получены из соответствующих нуклеотидных последовательностей с помощью программы MAP. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей проводили относителыюконсенсусной аминокислотной последовательности, которая была определена с помощью компьютер! юй программы PRETTY для полипептидных последователь! гостей. Анализ значимости нуклеотидных и синонимичности аминокислот) пых замен определяли с помощью программы PEPSTRUCTURE.
Молекулярно-филогенегический анализ первичных последовательностей амплифицированных фрагментов ДНК проводили с использованием пакета программ PH YLIP (Phytogeny Inference Package) [Felsenstein, 1991 ]. Матрицу генетических расстояний между последовательностями вычисляли с использованием двухпарамстрического метода Кимуры [Kimura, 1980] с помощью программы DNADIST. Затем с помощью программ FITCH и NEIGHBOR [Saitou and Nei, 1987] строили филогенетические древа. Филогенетический анализ также проводили с использованием метода максимальной экономии (parsimony [Fitch and Margoliasb, 1967], программа DNAPARS) и метода максимального правдоподобия (maximum likelihood [Felsenslein, 1981], программа DNAML). Топологию полученных древ проверяли при помощи статистического ресемплинга (bootstrap) [Felsenstein, 1985,1988] с использованием программ SEQBOOT (100 повторов), DNAPARS, DNADIST, FITCH, NEIG11BOR и CONSENSE. Первичные последовательности различных изо-лятов ВИЧ-1 и SIV для филогенетического анализа были выбраны из базы GeneBank HIV Sequence Database (Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, США) [Myers, 1994].
3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Создание системы лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции и внедрение методов подтверждающей диагностики в Ленинграде/ С.-Петербурге
Первые тесты на антитела к ВИЧ в Ленинграде были поставлены в Лаборатории молекулярной вирусологии ГосНИИ ОЧБ в 1986 г. В1987 г. в соответствии с решением Ленгорисполкома № 254 от 30.03.87 г. совместными усилиями Главного управления здравоохранения г. Ленинграда, ГосНИИ ОЧБ и городской инфекционной больницы № 30 им. С. П. Боткина была организована Межведомственная лаборатория по изучению СПИД, основу которой составила Лаборатория молекулярной вирусологии ГосНИИ ОЧБ. В апреле 1987 года было издано указание № 25 Городского Управления Здравоохранения г. Ленинграда «О порядке выявления, обследования, регистрации и дис-па11сер1 юго наблюдения за лицами, инфицирова1 и илми ВИЧ», в соответствии с которым кровь для анализа на антитела к ВИЧ начала поступать в Межведомственную лабораторию.
По мере развертывания противоэпидемических мероприятий встала необходимость организовать новые специализированные лаборатории по скринингу на ВИЧ-инфекцию. Первая из I мх была создана на базе больницы им. Боткина иод нашим руководством в сентябре 1987 года (приказ ГУЗЛ № 567 от 3.09.87 г.). К середине 1992 г. в городе была открыта 21 лаборатория. Сотрудники всех лаборатории проходили подготовку в Межведомственной лаборатории. Она же осуществляла методический контроль работы всех лабораторий. Таким образом реализовывалось единство подходов в рамках лабораторных служб, занимающихся проблемой СПИД в городе. Всего за десять лет работы в скрининговых лабораториях города было поставлено 8 033 409 анализов наантителакВИЧ.
Внедрив тестирование на антитела к ВИЧ с помощью иммуноферментно-го анализа в практическое здравоохранение, Межведомственная лаборатория приняла функции городской подтверждающей лаборатории, используя для этой цели иммуноблоттинг, исследование показателей клеточного иммунитета, полимеразную цепную реакцию и выделение вируса.
В 1989 году на основании письма Министерства здравоохранения СССР 06-6/137-6 от08.08.89 Межведомственной лаборатории первой в стране после Всесоюзного центра по профилактике и борьбе со СПИД было выдано разрешение на постановку окончательного лабораторного диагноза на ВИЧ/ СПИД. В 1993 году в связи с созданием Городской иммунологической лаборатории Межведомственная лаборатория передала работу по подтверждающей лаборатор1 юй диап юстике ВИЧ/СПИД новой лаборатории, окончательно внедрив таким образом подтверждающую лабораторную диагностику ВИЧ/ СПИД в городское практическое здравоохранение.
3.2. Изучение качества тестирования на ВИЧ в лабораториях С.-Петербурга и России
Несмотря на значительный объем скрининга, число ВИЧ-инфицированных, выявлявшихся в С.-Петербурге и в России, с самого начала было сравнительно невысоким. Это могло быть связано как с ранней фазой распространения ВИЧ/СПИД, так и с недостатками системы выявления ВИЧ-инфекции. Для определения реального положения дел в этой области и с целью оценить истинный уровень ВИЧ-инфицированности мы провели исследование качества первичного тестирования на антитела к ВИЧ в лабораториях Ленинграда/С.Петербурга и России.
В течение 1992-1996 гг. было подготовлено три типа контрольных панелей (Qualitest 4,5 и 6, соответственно), которые распространялись 3-4 раза в год в С.-Петербурге и 1 -2 раза в год среди лабораторий России и СНГ. Всего было распространено более 1100 панелей, получено и подвергнуто обработке 930 ответов, что соответствует анализу около 6000 сывороток. В работе по контролю качества принято участие 248 лабораторий из 32 территориальных центров России. В большинстве лабораторий использовались отечественные тест-системы для диагностики ВИЧ. По результатам 1992-1996 гг., вы-являемость положительных контрольных сывороток составила 90,4 %, а отрицательных —98,2 %. Абсолютно точный ответ по контрольным панелям дали 80 % лабораторий. Таким образом, качество лабораторной диагностики на ВИЧ в стране в период 1992-1996 г. можно считать высоким.
Чрезвычайно важный вывод из этой части работы состоит в том, что относительно низкая выявляемость ВИЧ-инфицированных в России в 1987-1996 гг. отражала реальную эпидемическую ситуацию, а не была обусловлена низким качеством лабораторной диагностики.
3.3. Выявление первых случаев ВИЧ-инфекции и описание ранней фазы эпидемии ВИЧ-инфекции в Ленинграде/Санкт-Петербурге
Уже в начале мая 1987 года при постановке 448-го анализа в Межведомственной лаборатории по изучению СПИД был выявлен первый ВИЧ-инфицированный в Ленинграде. Это был студент из Бурунди- Ему был присвоен кодовый номер 448. В этом же месяце были выявлены еще два ВИЧ-инфицированных: № 649 (гражданин Буркина Фассо) и № 1784 (гражданка России, Spl).
К 31 мая 1988 г. было обследовано 105 830 человек. Число выявленных ВИЧ-инфицированных составило 23, из них 16—иностранные граждане, в основном студенты ленинградских ВУЗов. Было выявлено также 7 советских граждан, инфицированных ВИЧ, из них 1 мужчина (гомосексуалист, находившийся на излечении от сифилиса), 5 женщин и 1 ребенок (девочка 5 лет). Все женщины имели половые контакты с иностранными гражданами, преимуществен! ю с африканцами.
В январе 1988 г. в Ленинградском институте переливания крови был выявлен донор, давший положительную реакцию в ИФА. Женщина 30 лет впервые сдала кровь. Ее сыворотку (Sp4) направили на подтверждение в межведомственную лабораторию, где она была проверена в иммуноблоггш ire. При этом были выявлены антитела ко всем вирусным белкам. Это был первый зарегистрированный в стране ВИЧ-серопози гивiшш донор.
С момента начала скрининга на ВИЧ в 1987 г. по 31.12.96 г. в С.-Петербурге было выявлено 205 ВИЧ-инфицированных, из них 161 житель города и 44 иностранца.
Низкое число выявляемых в России ВИЧ-инфицированных могло быть связано с несовершенством лабораторной диагностики и/или невозможностью достигать группы риска, среди которых находится oci iobi roe число ВИЧ-инфицированных. Как было показано выше, специально проведенные нами исследования опровергли первую из этих гипотез. Гипотеза недостижимости групп риска опровергается следующими фактами.
Одной из основных групп ВИЧ-инфицированных в С.-Петербурге были гомосексуалисты Однако эта группа никогда не изучалась как таковая. Данные о принадлежности к гомосексуалистам получали при интервьюировании ВИЧ-инфицированных уже после их выявления. Таким образом, принятая в России система эпидемиологического надзора за ВИЧ-инфекцией позволяет достигать эту группу риска. Долгое время отсутствие зарегистрированных ВИЧ-инфицированных наркоманов приводили в качестве примера невозможности достигать путем скрининга этой группы риска. Однако, когда ВИЧ-инфицированные наркоманы появились, они были немедленно выявлены — ив Петербурге (1996 г.), и в других регионах России [Bobkov et al., 1997], и на Украш ie [Kobyshchaet al., 1996]. Все вместе это свидетельствует об эффективности принятой в России системы наблюдения за развитием эпидемии ВИЧ/СПИД.
В целом приведенные выше данные свидетельствуют о том, что в С.-Петербурге в 1987-1996 гг. имела место ранняя фаза эпидемии ВИЧ-инфекции. Первые случаи ВИЧ-инфекции в Ле! шнграде были выявлены только в 1987 году, но ВИЧ присутствовал в городе уже в 1982 году, когда родилась ВИЧ-инфицированная девочка. Первоначально основную группу ВИЧ-инфицированных в Ленинграде составили студенты из стран центральноафриканского региона и женщины, имевшие половые контакты с иностранцами, преимущественно с африканцами. Начш 1ая с 1990 года, на первое место по числу инфицированных выдвинулись гомосексуалисты, которые лидировали в этом отношении до 1992 г. До 1996 г. они составляли значительную часть ВИЧ-ин-фицирова! шых мужчш I.
Наши данные свидетельствуют о том, что ВИЧ мог проникнуть в С.-Петербург непосредственно из Африки, а также из США и Западной Европы. С африканскими странами осуществлялся интенсивный обмен студентами и специалистами, начиная с конца 50-х годов. Установлено, что ВИЧ появился в Африке в 50-х годах [Zhu et al., 1998]. Поэтому африканские субтипы ВИЧ должны были проникнуть в С.-Петербург раньше американских/западноевро-
псйских. Отсутствие до самог о последнего времени широкомасштабной эпидемии ВИЧ/СГШД в России может свидетельствовать о наличии сдерживающих факторов как социальных, так и биологических, в особенности в от ношении африканских субтипов ВИЧ, о более низкой инфекционное™ ВИЧ-инфицированных африканцев и/или о более позд| 1ем, чем принято думать, распространении ВИЧ в Африке.
3.4. Серотипирование ВИЧ
3.4.1. Серотипирование сывороток ВНЧ-иифицировапных пациентов с известным генотипом ВИЧ-1
Сыворотки пациентов, у которых было выполнено гаютипирование ВИЧ, были проанализированы методом ИФА на панелях линейных и МАП-пептидов, соответствующих верхушечному фрагменту УЗ-петли белка §р120 ВИЧ. При этом было установлено, что серотипирование на МАП-пептидах дает лучшее соответствие с результатами генотипирования. Расхождение результатов серотипирования на линейных пептидах с результатами генотипирования может быть связано с тем, что апексы УЗ-петли, по результатам реконструкции амш юкислотных последовательностей, в таких случаях имели нетипичную для В-субтипа структуру. Тем не менее, серотипирование на МАП-пептидах позволяет надежно определить В-серотип и в таких случаях. Те сыворотки, которые по результатам серотипирования не определяются как принадлежащие к В-серотипу, с другими конкретными субтипами, по имеющимся на сегодняшний день данным, в точности не соотносятся. Таким образом, наиболее корректной классификацией сывороток по результатам ИФА представляется отнесение их либо к В-серотипу, либо к (не-В)-серотипам. К такому же заключению пришли другие исследователи [МигрЬу е1 а1., 1998]. Для целей нашего исследования такой уровень разрешения оказался вполне достаточным.
3.4.2. Исследование иммунореактивности сывороток отдельных ВИЧ-инфицированных пациентов на разных сроках ВИЧ-инфекции
Разрешающая способность серотипирования на МАП-пептидах позволяет группировать сыворотки, полученные ог одного пациента в разные сроки, и различать эти группы между собой, как это следует из результатов кластерного анализа по Уорду. У каждого паций 1та, за исключением 8р15, сыворотки, полученные в пределах разных промежутков времени (до 6 лет у пациента Бр7), кластрируются вместе. Это подтверждено и методом факторного анализа.
В методическом плане важно, что из этих данных следует независимость результатов серотипирования на МАП-системах от случайных факторов, связанных с тем, что сыворотки могут браться 11а разных, как правило, неизвестных сроках ВИЧ-инфекции. Сохраняются такие серологические особенности сывороток, как, например, высокая специфическая реактивность сыворотки Бр102 с аутологичным пептидом В8РЬ и высокая реактивность с пептидом
Группа II
А у сывороток пациентов 8р72, Бр74 и Бр89, имеющих необычные, нехарактерные для субтипа В ВИЧ-1 апексы УЗ-петли.
3.4.3. Серотипирование ВИЧ-1 в Санкт-Петербурге
Сыворотки 66 пациентов, собранные в Санкт-Петербурге до 1994 г., были проанализированы в ИФА на панели из 12 МАП-пептидов. Полученные результаты были обработаны методами кластерного и факторного анализа. На
рис. 1 представлена дендрограмма, построенная методом иерархического кластерного анализа Уорда. Видно, что проанализированные сыворотки образуют два кластера. Результаты кластерного анализа подтверждаются факторным анализом (метод главных компоне1гг). На факторной плоскости сыворотки разных групп располагаются обособленно.
При анализе средних спектров иммунореактивнос-ти сывороток для каждой группы были определены их основные характеристики. В группе 1 (41 сыворотка) сыворотки преимущественно реагируют с пептидами, соответствующими консенсусной пос-
„ , „ ледовательности
Рис. 1. Дендрограмма результатов кластерного анализа _ ,,
(метод Уорда) спектров иммуно-рсактивиости сыворо- д^-пстли суотипа о
ток санкт-петербургских ВИЧ-инфицированных панн- ВИЧ-1 и последо-
ентов. вательности севе-
SP1 SP74 SP2 SP72 SP7S SP89 SP3 SP9 SP4? SP64 SP6 SP35 SP77 SP4 SP57 SPS SP102 SP5 SP12 SP37 SP94 SP22 SP14 SP45 SP4B SPIO SPI1 SP114 SP23 SP29 SP15 SP84 SP23 SP25 SP1I0 SP23 SP34 SP124 SP30 SP43 SP67 SP7 SPSS SP90 SP103 SP17 SPi9 SP101 SP42 SP86 SP16 SP20 SP63 SP117 SP38 SP18 SP21 SP121 SP24 SP39 SP41 SP33 SP40 SP55 SPSS SP71
Группа 1
ро-амернканского изолята ВИЧ-1 MN субтипа В. В группе II (25 сывороток) сыворотки обладают перекрестной реактивностью с пептидами, соответствующими разным субтипам ВИЧ-1, либо преимущественно реагируют с пептидами (не-В)-субтипов: А, С, F. Таким образом, обнаруженные группы имму-нореактивности I и II можно отнести к серотипу В и (не-В)-серотипам ВИЧ-1, соответственно.
Распределение В- и (не-В) серотипов по разным группам ВИЧ-инфицированных жителей С.-Петербурга различно: 29 из 31 сыворотки от гомосексуалистов содержат антитела, соответствующие В-серотипу, тогда как у женщин большинство сывороток (19 из 26) соответствуют (не-В)-серотипу. У мужчин гетеросексуальной ориентации оба серотипа представлены примерно поровну. (Не-В)-серотипы присутствовали в городе раньше серотипа В, но распространение последнего в представленный на рисунке период времени оказалось более быстрым.
Итак, в С.-Петербурге в период до 1994 г. распространение ВИЧ фактически включало два процесса: один—вызванный серотипом В ВИЧ-1, другой — (не-В)-серотипами, по-видимому, соответствующими африканским субтипам ВИЧ-1. Серотип В ВИЧ-1 до 1994 г. распространялся быстрее африканских субтипов, хотя проник в город позже. Вместес данными о присутствии африканских студентов в С.-Петербурге с начала 60-х годов относи-тели ю более i гизкая представленность африканских серотипов поднимает важ-j )ые вопросы о месте и времени происхождения различных серотипов ВИЧ и о различ1 гой чувствительности популяции жителей С.-Петербурга к различным серотипам ВИЧ-1. Не исключено, что ВИЧ распространился в Африке позднее, чем принято думать [Caldwell and Caldwell, 1996J. Не исключено также, что население С.-Петербурга относительно более устойчиво к африканским субтипам ВИЧ-1 [Kozlov et al., 1993] или что ВИЧ-инфицированные африканцы менее инфекционны.
3.4.4. Серотипировапис ВИЧ-1 в Москве
Ситуация с эпидемией ВИЧ-инфекции в Москве аналогична картине, наблюдаемой в С.-Петербурге. Основной вклад в распространение эпидемии до 1995 года вносили гомо-и гетеросексуальные контакты. Начиная с 1996 года, большой вклад в распространение ВИЧ-эпидемии стали вносить внутривенные наркоманы.
Нами в ИФА на панели из 12 МАП-пептидов были проанализированы сыворотки 120 ВИЧ-инфицированных жителей города Москвы, выявленных в период 1996-1997 годов. Результаты были обработаны методами кластерного и факторного анализа, при этом были выявлены две группы иммунореак-тивности, аналогичные найденным в С.-Петербурге со сходными дендрограм-мой, результатами факторного анализа и средними спектрами иммунореактив-носги.
Сопоставление эпидемиологических данных о ВИЧ-инфицированных пациентах с группами иммунореактивности показало значительные различия в распределении серотипов ВИЧ-1 по группам риска: 75% сывороток от внутривенных наркоманов вошли в группу II, а у гомосексуалистов 80% сывороток относятся к группе I.
В целом полученные данные подтвердили сходство развития эпидемии среди гомосексуалистов в Москве и в С.-Петербурге с преимущественным распространением в этой группе серотипа В. Данные о значительном присутствии (не-В)-ссротипа среди внутривенных наркоманов хорошо согласуются с работами других авторов. В то же время сравнительно высокий процент серотипа В среди наркоманов свидетельствует о заносе различных серотипов из разных географических регионов России, Беларуси и Украины.
3.4.5. Серотипирование ВИЧ-1 па Украине
119 ВИЧ-положительных сывороток из различных регионов Украины были проанализированы нами в ИФА на панели из 12 МАП-пептидов. Полученные результаты были обработаны различными методами анализа многомер! 1ых данных. На рис. 2 представлена дендрограмма, построенная методом иерархического кластерного анализа Уорда. Таким способом сыворотки разбиваются на три группы (обозначенные как I, II и III), соответствующие трем крупным ветвям дерева. В двумерном образе пространства пептидов, полученном методом факторного анализа (метод главных компонент), сыворотки группы II в основном локализуются в верхней части рисунка, сыворотки группы 1—в нижней части рисунка, а сыворотки группы III—посередине. Эти результаты были дополнены кластрированием сывороток методом «^-средних» с разбиением на три группы, и таким образом была введена итоговая классификация сывороток по всем трем методам (табл. 1). Сыворотки POLT_5, DON ET 23, DONETJ24, NIKOL_9, KR_ROG 1 (на рис. 2 они обведены), по результатам кластерного анализа методом Уорда попадают в группу I, а по результатам двух других методов классификации—в группу III. Поэтому в итоговой классификации сывороток они были отнеса 1Ы нами в группу III. Характеристики групп даны в табл. 1.
Из сравнения иммунореактивности сывороток и эпидемиологических данных следует вывод об относительной гомогенности эпидемии ВИЧ-инфекции в Николаеве, г де 85% проанализированных сывороток относится к группе иммунореактивности I, и в Одессе, где такая же доля сывороток относится к группе II. Эпидемия ВИЧ-инфекции в Донецке характеризуется присутствием серотипов групп II и III. С другой стороны, в Киеве наблюдается такая же гетерогенность по спектрам иммунореактивности сывороток, как и на Украине в целом. Поэтому можно заключить, что вспышки ВИЧ-инфекции в Донецке и Одессе, с одной стороны, и в Николаеве, с другой, были вызваны разными серотипами ВИЧ-1. В то же время в Киеве имеет место проникновение вариантов ВИЧ-1 разных серотипов.
спектров иммунореактнвностн украинских сывороток. Представлена итоговая классификация сывороток.
Таблица 1. Группы сывороток, выявленные на Украине на основании анализа спектров шшуиореактивности
Груши иммунореак-тивности Количество сывороток в группе Иммунореактивность сывороток
Группа 1 45 Максимум реактивности ириходится на пептиды субтипа В
Группа II 34 Максимум реактивности приходится па пептиды субтипов С > Л и Р
Группа III 40 Сыворотки с перекрестной реактивностью с пептидами разных субтипов
Таким образом, мож1 ю видеть, что на даш юм этапе на У 1фаине развиваются независимые друг от друга процессы инфицирования различными сероти-пами ВИЧ-1 в одной и той же группе риска (среди внутривенных наркоманов), но в разных географических регионах. Это — уникальный случай в мировой практике наблюдений, свидетельствующий о независимых источниках проникновения ВИЧ-инфекции в популяцию наркоманов на Украине.
3.5. Вирусологические исследования
3.5.1. Выделение вируса иммунодефицита человека из лимфоидных клеток
Первые успешные эксперименты по выделению ВИЧ были проведены с клетками пациента № 448, гражданина Бурунди, и пациента Бр4, гражданки СССР.
На рис. 3 представлена электронная микрофотография культивируемых лимфоцитов пациента 8р4, продуцирующих ВИЧ-1.
На рисунке видна часть лимфоцита, продуцирующего вирусные частицы с характерной морфологией. Отчетливо видны модифицированная мембрана и почкование вируса. Модифицирование захватывает практически всю клеточную мембрану, а образующаяся серповидная почка сильно выражена, что отличает действие ВИЧ на клетку от действия других регровирусов [Се1с1сгЫот е1а1., 1987; Квиток) е1а1., 1987; Ророуюе! а1., 1984].
При культивировании лимфоцитов пациента № 448 активность обратной транскриптазы в культуральной жидкости достигала максимума на 15 и 21-й дни и соответствовала 1,6-106 имп/мин/мл радиоактивности, тогда как активность клеточной полимеразы в процессе культивирования не превышала 4,2 • 104 имп/мин/мл. Характер изменения активности обратной транскриптазы в культуре клеток незначительно отличался от описанного другими авторами [Вагге-Зтоизэ! е! а1., 1983].
Максимальный уровень вирусного антигена в культуральной жидкости достигался на 21 -й день культивирования. Методом нозерн-гибридизации с РНК, получе! той из культивированных клеток пациента № 448, было показано при-
сутствие основных вирусных РНК, экспрес-сирующихся в инфицированных ВИЧ-1 клетках: 9, 4,5 и 2,0 тысяч пар оснований. Элект-ронно-микроскопичес-кое исследование культуры лимфоцитов пациента № 448 выявило наличие ВИЧ-1-специфичных частив культуре. Все эти данныесвидетельствовали о том, что и в этом случае в
культуральной жидкости „ ^ ,
содержался вирус. Р,,с- Х Электронные микрофотографии лимфоцитов, M i w yjj продуцирующих ВИЧ-1.
Кулыуральную жид- А - х 80 ООО; В — х 200 ООО кость, содержащую вирусный антиген, использовали для заражения пермиссивной линии клеток U-937. Активность клеточной полимеразы в процессе культивирования достигала 1,2-10S имп/мин/мл, тогда как активность обратной транскриптазы в точке своего максимума достигала 1,6-1,8-106 имп/мин/мл. Активность обратной транскриптазы после 30 дней культивирования начинала падать, а при подсеве свежих клеток вновь возрастала. Наличие вирусного антигена обнаружили лишь па 20-й день культивирования. Уровень оптической плотносги в точке максимума всего в 2 раза превышал уровень оптической плотности контроля, что свидетельствовало о низкой продукции вируса.
При Саузерн-гибридизации сэкстрахромосомной ДНК, выделенной на 8 и 15-й дни культивирования из клеток U-937, зараженных содержащей вирус средой, выявлялись полосы в районе 6,7-7,8 и 4,0-4,2 тыс. пар оснований, что соответствует релаксированной и суперскрученной формам кольцевой ковале! гшо-замкнутой ДНК ВИЧ-1. Наши данные совпадают срезультагами, полученными другими авторами [Monroe et al,, 1987] в отношении электрофо-ретической подвижности полос и сроков максимального уровня репликации экстрахромосомной ДНК ВИЧ-1.
Таким образом, вся совокупность данных свидетельствует о том, что в наших опытах из клеток пациентов № 448 и Sp4 был выделен ВИЧ.
В дальнейшем мы с успехом выделяли вирус из клеток многих пациентов. Частота выделения ВИЧ-1 в кратковременных переживающих культурах моно-нукпеарных клеток периферической крови составила около 70 %. В большинстве культур длительность продукции вируса не превышала 2 недель, а сама продукция отличалась низкимуровнем образования вирусного антигена р24 в культуральной жидкости (15-100 лкг/мл), что характерно для медленно репли-
цируюицихся штаммов ВИЧ-1. Нами был обнаружен также быстро реплицирующийся штамм ВИЧ-1 у пациента 8р47, который характеризовался высоким уровнем продукции вирусного антигена (до 12 нг/мл культуралыюй среды).
3.3.2. Обнаружение нового герпесвируса в клетках ВИЧ-инфицированного пациента
При культивирован™ мононуклсар! их клеток пациента Бр17, взяшх на ранней стадии ВИЧ-инфекции, нам не удавалось обнаружить ВИЧ ни по присутствию антигена, ни электронно-микроскопически. Однако с помощью электронной микроскопии Ь ;'Г был обнаружен вирус
" & . . . . - 1 (рис. 4) с характерной
для Негре8Ушс1ае морфологией, но отличавшийся от всех герпес-вирусов, описанных прежде.
Вирионы обнаруженного нами вируса имеют округлую фор-V, ^ му и часто содержат
своеобразные «хвосты» (рис. 5, рис. 7). Рис. 4. Электронные микрофотографии клеток, ироду- размер вирионов был
S. -*
1 vi у • vTLvJ-i1;.
пирующих новый герпесвирус.
А—х 14 ООО Б —х 85 ООО. ВЧ -
- вирусные частицы
Рис. 5. Структура вирноиа нового герпесвируса.
Н — нуклеоид, К — капсид, АВ — аморфное вещество ВО — оболочка вириона, V — У-образные отростки Хр—хромосома, Хв — «хвост»
определен в 125— 160 нм. Структура вириона содержит компоненты, характерные для герпесвирусов: нуклеоид диаметром 60-80 им; икосаэдри-ческий (на срезе — правильный шести-уголы шк) капсид диаметром 130 нм; слой аморфного вещества; оболочку толщиной около 5 нм, на которой локализуются V-образные отростки длиной около 10 нм. Для морфологии обнаруженного нами вируса характерна свое-
Рис. 6. Морфогенез нового герпесвируся.
Л—формирование нуклеоидов в ядре клетки; Б—созревание иуклеокапсидов в цитоплазме; В — почкование вируса в цитоплазматичсскую вакуоль.
Рис. 7. Выход нового герпесвируса во внеклеточное пространство.
А—остатки экзоцитозных пузырьков (ЭП); Б—наличие «хвостов» у только ч то освободившихся из клетки вириоиов. ЭП — остатки экзоцитозных пузырьков; ВЧ—вирус»ые частицы; Хв—«хвосты»; М—клеточная мембрана
образная структура нуклеопда, характеризующаяся наличием оси симметрии и присутствием спиралевидных электронно-плотных структур, соответствующих хромосоме вируса (рис. 5).
Морфогенез вируса включает несколько стадий. На рис. 6,А представлена самая ранняя стадия формирования нуклеоида вируса в ядре клетки. Отчетливо видна хромосома вируса в различных проекциях. Формирование нуклео-капсидов также происходит в ядре клетки (данные не представлены). По-видимому, окончательное созревание нуклео-капсидов происходит в цитоплазме (рис. 6,Б). Почкование вируса происходит в вакуоли цитоплазмы (рис. 6,В). Освобождение вирусных частиц во внеклеточное пространство происходит, по-видимому, за счетэкзоцитоза. На рис. 7, А хорошо видны остатки экзоцитозных пузырьков после освобождения вирусов. Только что освободившиеся внеклеточные вирионы характеризуются наличием своеобразных «хвостов» (рис. 7,Б), которые явля-
ются остатками удлиненной «ножки», образующейся в процессе почкования вируса в вакуоли (рис. 6,В). Клетки, продуцирующие вирус, имеют морфологию макрофагов. Лежащие рядом в поле микроскопа лимфоциты обнаруженный герпесвирус не продуцировали.
В нашем сообщении на VII международной конференции по СПИДу во Флоренции мы высказали предположение, что этот новый герпесвирус может играть роль в патогенезе ВИЧ/СПИД [Kozlov ct al., 1991].
3.4. Молекулярно-биологические исследования
3.4.1. Амплификация и клонирование епг-специфичиых фрагментов ДНК прав пруса ВИЧ
Для получения фрагментов провируеного генома, содержащих участок V3, мы применили метод ПЦР с использованием двух пар праймеров, внешних и внутренних, который получил название «гнездовой-ПЦР» [Albert, Fenyo, 1990, Zazzi et al., 1992]. Использовались комбинации различных пар внутренних и внешних праймеров для амплификации ВИЧ-специфичных фрагментов на матрице ДНК ВИЧ-инфицированных пациентов. Такой подход получил название «PCR-fingerprinting» [McCutchan ctal., 1992].
В нашем исследовании ни одна из комбинаций праймеров не обладала реакционной способностью выше 65,5 %. Тем не менее, с использованием всех комбинаций праймеров удалось детектировать провирусную ДНК ВИЧ-1 у 29 из 35 пациентов (83 %).
В результате амплификации провирусных env-специфичных последовательностей в образцах ДНК от 29 ВИЧ-инфицированных пациентов было получено 86 различных фрагментов. Для дальнейшего клонирования амплифициро-ванные env-специфичные фрагменты очищались с помощью препаративного электрофореза в легкоплавкой агарозе и кло! шровал ись, как описа1 ю в Материалах и методах. Для создания клонотеки env-специфичных амплифициро-вапных фрагментов были отобраны нлазмиды, содержащие вставки искомой величины.
Для каждого пациента было отобрано от 2 до 7 рекомбинантных клонов, содержавших полноразмер! геле вставки. Эти рекомбинантные плазмцды в дальнейшем были использованы для определения нуклеогидных последовательностей env-специфичных фрагментов.
С использованием различных внутренних праймеров были получены фрагменты длиной от 283 до 469 нуклеотидов. Для определения первичной последовательности амплифицированных фрагментов было секвенировано от 2 до 6 индивидуальных кло! юв, получено 50 нуклеотвдных последовательностей. Построение консенсусных последовательностей и алайнментов (выровненных последовательносгей) проводилось компьютерным методом.
Полученные консенсусные нуклеотидные последовательности были депонированы в GeneBank HIV Sequence Database (Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, США) под номерами U40283 — U40285 и U40319 — U40329.
3.4.2. Молекулярно-филогенетический анализ разнообразия консенсусных последовательностей ДНК провируса ВИЧ
Полученные нуклеотидные последовательности были модифицированы так, чтобы они полностью перекрывались, а количество мутаций типа деле-ция/вставка было минимальным. Длина полученных таким образом нуклео-тидных алайнментов для различных способов анализа (см. Материалы и мего-
SS
7<M
100
"H
.Sp84 .Sp36 _Sp26
»Sp90
_Sp80 _Sp83
-Sp72 -Sp42
— Sp1S ■Sp88
i
•RF
_Sp102 ~Sp103 ■MM
........ ■■ МЫ
Цг-^CZ
I .............SF2
...... JRSCF
. Sp9J ■ Sp74
100
88,2 i
»»
9},8
9«, 9
-JRSCF
—...........NDK
........ EU
"' SM703
...........■■— U456
TN243 ———. TH4 —— IND757 —— NOF ■B216J •BZ16S
В
ды) составила от 198 до 265 нуклеотидов. Они полностью включали последовательности, кодирующие УЗ-петлю белка gpl 20.
С целью определения принадлежности этих последовательностей к определенному субтипу ВИЧ-1 нами были выбраны из банка данных LosAlamos HIV Database (Mayers et al., 1994) нуклео-тидные последовательности различных субтипов ВИЧ-1.
На рис. 8 представлено филогенетическое древо
Рис. 8. Копсенсусное филогенетическое древо с.-нетербургс- С.-петер-ких изолятов ВИЧ-1, построенное методом наибольшей эко- бургских и выб-номии (Parsimony). ранныхизбанка
Числа в узлах показывают частоту возникновения данной ipynnnpoB- данных изоля-ки при бутстрэп—анализе (100 повторений). тов ВИЧ-1, по-
строенное методом максимальной экономии. Видно, что нуклеотидные последовательности с.-петербургских изолятов образуют группу с последовательностями ВИЧ-1 субтипа В (MN, SF2, RF и JRCSF). Аналогичные результаты были получены методами правдоподобия и матриц генетических расстояштй. Таким образом, исследованные нуклеотидные последовательности с.-петербургских изолятов ВИЧ-1 относятся к субтипу В. Эти результаты подтверждают данные, полученные с помощью серотипирования.
] ] ] ]
D А
Е С F
.S1V
Средняя генетическая дистанция между с.-петербургскими изолятами ВИЧ-1 равна 12,4 %. Она сопоставима с аналогичной величинойвСША (1011%) при очевидном отличии в степени развития эпидемии. Можно предположить, что такая ситуация в С.-Петербурге может быть связана с независимым проникновением нескольких вариантов субтипа В ВИЧ-1.
Чтобы подтвердить это, мы провели филогенетический анализ нуклеотид-ных последовательностей с.-пстербургских изолятов ВИЧ-1 и различных изо-лятов ВИЧ-1 субтипа В, полученных в различных регионах, из банка данных LosAlamos HIV Database [Myers et al., 1994]. На рис. 9 представлено филогенетическое древо всех этих последовательностей ВИЧ-1, построенное методом правдоподобия (maximum likelihood).
На представленном филогенетическом древе последовательности с.-петербургских изолятов ВИЧ-1 образуют две основные группы. Одна включает последовательности Sp26, Sp88, Sp90, Sp80 и Sp83. Эти изоляты были выделены от гомосексуалистов и группируются с изолятами, также выделенными от гомосексуалистов (из Бразилии и Гаити). Другая ipynna—Sp93, Sp74, Sp84, Sp86 и Spl02 — включает изоляты, полученные от женщин (Sp74 и Sp93), и класфируется с изолятами субтипа В африканского происхождения (Rw023, OYI), и другими (Bz028, Bz004, NLK36, ThN750, Th7787), полученными от гетсросексуалов. Кроме того, отдельную группу образуют последовательности Sp42n Sp72. Последовательности Spl5 nSpl03 не группируются с другими с.-петербургскими последовательностями.
Таким образом, по нуклеотидным последовательностям с.-петербурские изоляты ВИЧ-1 образуют группы с ВИЧ-1 субтипа В из различных регионов мира, в том числе из Северной Америки и Африки, и широко распределены по филогенетическому древу. Такое широкое распределение свидетельствует о множественном и независимом проникновении различных вариантов субтипа В ВИЧ-1 в С.-Петербург.
3.4.3. Молекулярная характеристика генетического разнообразия ВИЧ-1
Полученные нами консенсусные нуклеотидные последовательности различных пациентов в значительной мере перекрываются, что позволяет сравнивать их между собой и с построенной нами консенсусной последовательностью для всех с.-петербургских изолятов (SpCons).
В результа те такого анализа было выявлено, что наиболее вариабельными аминокислотными остатками УЗ-петли являются аргинин в позиции 18 относительно первого цистеинового остатка УЗ-петли (8 замен) и аспарагиновая кислота в позициях 25 (7 замен) и 29 (4 замены) (рис. 10).
Наши результаты отличаются о полученных в работах [LaRosa et al., 1990; Milich et al., 1993], в которых при анализе последовательностей УЗ-петли 258 изолятов ВИЧ-1 было установлено, что самыми вариабельными являются аминокислоты в позициях 11,13,19,23,24 и 32 относительно первого цистеинового остатка УЗ-петли. Эти отличия могут быть связаны с различиями стадий эпидемии ВИЧ/СПИД, на которых ВИЧ-1 был исследован указанными
BZ026 BZ004
Nucleic acid sequence Maximum Likelihood method, version 3.572c Eirpirical Base Frequencies: A 0.45722C 0.14290 G 0.17249T(U} 0.22739
Transition/transversion ratio = 2.000000 (Transition/transversion parameter = 1.666680) Ln Likelihood = -2776.84819 Examined 1581 trees
Рис. 9 Филогенетическое древо нуклеотидных последовательностей субтина В ВИЧ-1, построенное методом максисмального правдоподобия.
исследователями и нами и при которых разным могут быть селективное давление на ВИЧ или источники разнообразия ВИЧ.
Замены аминокислот в положениях 13,21 и 25 определяют тропизм вируса, а замены в положениях 11 и 25 отражаются на способности ВИЧ-1 образовывать синцитии [Milich et al., 1993; Innocenti-Francillard et al., 1994]. Т-лим-
С-2 регионО'Ъ Л/З-петля V3-V4 область
Нумерация V3-neTjm
16 16 26 35
Апекс УЗ-петли G PGR
SpCons NE SVQINCTRPN NNTRKSIHIG PGRAFYATGD IICDIRQAHC NLSRAQMNNT LKQIV?KLRE
Sp74 . .V........ .....VP. . . . . . .Е . .......Т. . . . . . АК. ■ Е.
Sd93 .....V. . . . Я
Ер84 Т.К......G . . . ,R...... . .К. . .-. .Е . ........Е. • К. .G...S.
Sp8 6
Sp8 3 Sp8 0 .1......... , .к.. я .....Т.
.1......... .....Т.
£p2 6 .1......... ..Н... .....Т.
Sp88 . .S. .
Sp90 Sp4 2 TK .1......... ... .I. G. . . .....Т.
. . . .Е . ... .I..R. . • IKV.A.
Sp72 . . . . Е . . . . .1. .Т. .
Spl5 Т.К...А.. . . ■ ЕК. .К.
Spl02 я -G. .АК.
Spl03 к ■ П •R...1. К
Рис. 10. Коисснсусные иолинеитидиые последовательности УЗ-петли с-петср-бургских пзолятов ВИЧ.
фотропность ВИЧ-1 определяется потерей кислой аминокислоты в положении 25 [Milich et al., 1993]. Однако во всех просеквенированных с.-петербургских изолягах, за исключением изолята Spl02, в этом положении стоит кислая аминокислота (аспарагиновая или глутаминовая). В изоляте Spl02 в этом положении стоит нейтральная полярная аминокислота—глутамин. Глутамин в данном положении обнаруживается у макрофаг отропных вирусов [Milich et al., 1993]. Таким образом, можно полагать, что все просеквенировапные нами изоляты ВИЧ-1 относя тся к макрофаготропным вариантам.
Серии в положении 11 и глутаминовая кислота в положении 25 определяют неспособность вируса индуцировать образование синцитиев [Innocenti-Francillard ct al., 1994]. Нами были обнаружены несинонимичиыезамены в положении 11 и 25 (изоляты Spl02 и Spl03). Было показано [Milich et al., 1993; DeWolf et al., 1994; Zhang et al., 1995], что такого типа замены аминокислот не приводят к изменению фенотипа ВИЧ-1. Таким образом, молеку-лярно-биологические данные свидетельствуют о том, что с.-петербургские изоляты являются макрофаготропными вариантами ВИЧ-1, не индуцирующими образование синцития.
В ряде работ отмечено, что увеличение общего заряда УЗ-петли, как правило, сопряжено с появлением в крови инфицированных более вирулентных (так называемых «rapid/high») вариантов ВИЧ-1. Это увеличение происходит в основном при появлении основных аминокислот в положениях 21 и 25 [Tersmetteetal., 1989; Oka etal., 1994;Zhongetal„ 1995]. Однако в этих положениях нами не были обнаружены основные аминокислоты ни в одном из просеквенированных с.-петербургских изоля гов. Это свидетельствует в пользу того, что исследованные в с.-петербурге изоляты ВИЧ-1 относятся к так называемым «slow/low»-BapnanTaM вирусов, характеризующимся низкой скоростью репликации [Groenink et al., 1991]. Таким образом, молекулярно-биоло-гические данные находятся в соответст вии с полученными нами вирусологическими данными.
Консенсусный тетрапептид вершины УЗ-петли, полученный для всех нук-леотдных последовательностей с.-петербургских изолятов, представляет собой аминокислотную последовательность глицин-пролин-глицшьаргинин. Эта последовательность является консенсусной для субтипа В ВИЧ-1 [Albert et al., 1992]. В изолятах Sp84, Sp86, Sp83 и Sp80 была обнаружена тстрапептид-ная последовательность глицин-пролин-глицин-лизин, которая также чаще всего встречается среди изолятов ВИЧ-1 субтипа В [Myers et al., 1994]. В изолятах Sp42 и Sp 102 тетрапст идная последовательность вершины УЗ-пет-ли была представла ia амш юкислотами глицин-нролин-глицш ь-глицин. Да1 шый тетрапептид ранее был обнаружен лишь для двух изолятов ВИЧ-1 — HIVHT.H6022 (Гаити) и HI VBR. 10591 (Бразилия) [Myers et al., 1994]. Кроме того, были обнаружены две тетраиептидные последовательности — аланин-пролин-глицин-серин (roojmSpBS) и алашш иролин -глицин глицин (изоляг Sp72)—ранее не описанные в литературе ни для одного из известных изолятов ВИЧ-1.
Анализ октамеров вершины УЗ-петли с.-петербургских изолятов ВИЧ-1 показал, что в них чаще всего обнаруживается аминокислотная последовательность H(P)IGPGR(K)AF. Такой окгапептид наиболее часто обнаруживается также среди изолятов ВИЧ-1 субтипа В [Myers et al., 1994]. Октапептид HMGPGGTF (изолят Sp42) ранее не был описан, тогда как октапептид HIGPGG AF (Sp 102) полностью совпадает с соответствующей последовательностью изолятов из Гаити и Бразилии [Myers et al., 1994].
ВЫВОДЫ
1. Молекулярно-вирусологические исследования, включавшие иммуно-ферментный анализ, иммуноблоттинг, полимеразную цепную реакцию, секве-нирование ДНК и выделение вируса позволили выявить и охарактеризовать первые случаи ВИЧ-инфекции в Ленинграде/С.-Петербурге.
2. Д ля исследованных нами изолятов ВИЧ характера i низкий уровень продукции вирусного антигена, что свойственно «slow/loww-вариантам вируса. Анализ аминокислотных последовательностей УЗ-иетли белка gpl 20 также относит с.-петербургские изоляты ВИЧ к вариантам, для которых характерны низкая скорость репликации, макрофаготропность и неспособность индуцировать образова! шс синцитиев.
3. Разнообразие найденных в Санкт-Петербурге изоля тов ВИЧ-1 на уровне нуклеотидных и аминокислотных последовательностей характеризуется наличием как общих закономерностей с уже описанными в литературе, так и некоторых отличий, к которым относятся впервые обнаруженные нами последовательности вершины УЗ-петли—APGS (изолят Sp88), APGG (изоляг Sp72) и HMGPGGTF (изолят Sp42),—ранее не описанные в литературе ни для одного из известных изолятов ВИЧ-1.
4. При культивировании мононуклеарных клеток пациента Sp 17 с помощью электронной микроскопии нами впервые был обнаружен вирус размером 125-160 нм с характерной для семейства Herpesviridae морфологией,
однако отличающийся от всех описанных до этого герпесвирусов. Этот новый герпесвирус может играть роль в развитии ВИЧ-инфекции и СПИДа, в т. ч. в патогенезе саркомы Калоши.
5. В период 1987-1996 гг. в Ленинграде/С.-Петербурге имела место ранняя фаза эпидемии ВИЧ/СПИД, что следует из полученных нами данных о низком числе выявленных случаев инфекции в Ленинграде/С.-Петербурге и о высоком уровне лабораторной диагностики ВИЧ в Российской Федерации.
6. Серотипирование с использованием синтетических пептидов показало, что в С.-Петербурге представлены серотип В ВИЧ-1 и отличные от В се-ротипы ВИЧ-1. Серотипом В оказалось инфицировано подавляющее большинство гомосексуалистов, а (не-В)-серотипами—в основном женщины с беспорядочными половыми связями.
7. Серотипирование сывороток московских ВИЧ-инфицированных показало, что большинство ВИЧ-инфицированных гомосексуалистов инфицировано серотипом В ВИЧ-1, в то время как большинство ВИЧ-инфицированных наркоманов инфицировано (не-В)-серотипами ВИЧ-1.
8. Развитие эпидемии ВИЧ/СПИД на Украине связано с распространением серотипа В, а также (не-В)-серотипов ВИЧ-1 среди шприцевых наркоманов. Наркоманы различных регионов инфицируются разнымисеротипами ВИЧ-1, что свидетельствует о независимых путях проникновения ВИЧ-1.
9. Общей закономерностью ранней фазы эпидемии ВИЧ/СПИД в России и ближнем зарубежье является множественное и независимое проникновение различных серотипов ВИЧ в различные группы риска и географические регионы. При этом в целом В- и (не-В)-серотипы ВИЧ-1 представлены в сопоставимых пропорциях. Это обстоятельство является чрезвычайно важным для разработки стратегии создания отечественной вакцины против ВИЧ.
10. Молекулярно-филогенетический анализ позволяет сделать вывод, что исследованные нами нуклеотидные последовательности с.-петербургских изо-лятов ВИЧ-1, полученных в основном от гомосексуалистов, соответствуют субтипу В, что согласуется с результатами серотипирования. Средняя величина генетической дистанции между нуклеотидными последовательностями сопоставима с аналогичной величиной в США при очевидном отличии в степени развития эпидемии. Исстедовапные нами последовательности образуют группы с нуклеотидными последовательностями субтипа В ВИЧ-1 из различных регионов мира и широко распределены по филогенетическому древу. В совокупности это свидетельствует о множественном и независимом проникновении различных вариа! ггов субтипа В ВИЧ-1 в С.-Петербург.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Евтушенко В.И.,Плюотин А.З, .Козлов А. П., СейцИ.Ф.Изучешесубклеггочной локализации и прочности связи с клеточными структурами низкомолекулярных РНК // Цитология -1979. — Т.21,№10.-0175-1180.
2. ЕвтушенкоВ.И.,КурбатоваТ.В., Козлов.А.П.Гибрвдизацвднизкомолекулярныхядерных РНК с ядерной РНК и рестрикционными фрагментами ДНК// Молекулярная биология -1984. — Т. 18, №5.-С. 1424-1431.
3. Козлов А. П., Решетников В. Л., Корж В. П., Нейфах А. А. Чужеродная ДНК в развивающихся зародышах вьюна Misgurnusfossilis//Молекулярная биология. -1988.-Т.22,№6.-С. 16141622.
4. В. И. Евтушенко, К. П.Хансон,0. В. Барабицкая,А. В. Емельянов, В. Л. Решетников, Козлов А. П. Определение верхнего предела величины экспрессии генома // Молекулярная биология. — 1989.—Т.23, №3.—С.663-675
5. Kara ко C.B., Буленков М. Т., Вейко В. П., Епишин С. М., Ломакин И. Б., Емельянов А. В., Козлов А. П., Конусова В. Г., Котов А. Ю. КлонированиекДНК, кодирующих проинтерлейкин 1аи проинтерлейкин 1 [} человека //ДАН СССР-1989.-Т. 309,№4.-С. 1005-1008.
6. КогенкоС. В.,Буле11КовМ.Т.,ВспкоВ.П.,Епи1ШнС. М.,Ломакш И. Б., Емельянов А. В., Козлов А. П., Конусова В. Г., Котов А. Ю. Клонирование и структурный анализ кДНК, кодирующих проинтерлейкин 1 a и проинтерлейкин 1 [3 человека // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. -1989. - № 12. - С. 13-17.
7. Козлов А. П., Емельянов А. В., Малых А. Г., Касаткин В. В.,МессорошВ. Г., Волкова Г. В., Колмаков А. Ю., Исаков В. А., Калинина H. М., Рахманова А. Г., Пасечник В. А. Выявление первых случаев инфицирования вирусом иммунодефицита человека в Ленинграде II Иммунология.— 1990. —№ 5. —С. 9-12.
8. РахмановаА. Г. .Кетлинский С. А., Исаков В. Л., Калинина I 1. М.,КозловА.П.Клинико-имму-нологическая характеристика лиц, инфицированных вирусом иммунодефицита человека II Иммунология. —1990. —№4.—С. 24-27.
9. KozlovA. P.,Emeljanov А. V., MalykhA. G.,KurbatovaT. V.,Traugott M. N„ А. V. Glebov, L. Gavrilenkova, P. V. Kolotvina, G. V. Volkova First cases of HIV-1 infections in Leningrad// Abstract Vl-th International Conference on AIDS, San-Francisco, 1990.
10. KozlovA., Malykh A., Levchenko T., KurbatovaT., Glebov A., Kolmakov A., Gavrilenkova L., Kolotvina P. E,, Volkova G. Epidemiology of HIVInfection in Leningrad: lackofseropositivesamong IVDUs // Abstract: Frontiers in Human Retrovirology and Related Topics. The laboratory of tumor cell biology; National Cancer Institute, Bethesda, Maryland, USA,20892,1990.
11. Malykh A., Levchenko T., Traugott M., Gavrilenkova L., Glebov A., Kozlov A. An Experience of confirmatory laboratory testing of HIV-infection //Abstracts: VIHth International Congress of Virology. Berlin, August 26-31,1990.—P. 314.
12 Козлов А.П. Емапьянов А. В., Трауг отт M. H., Курбатова T. В., Малых A. Г., Колотвина П. В., Переслени И. В.,СмирноваТ. Д., Касаткин В. В., Симбирцев А. С. Выявление антигена вируса иммунодефицита человека в лнмфоидных клетках серопозитивных лиц II Вопросы вирусологии. — 1991.—Т.36, №3.
13. Kozlov А., Volkova G., Malykh A. Epidemiology of HI V-infection in Leningrad: possible early entry of HIV //Abstract Annual Meeting Sponsored by the Laboratory of Tumor Cell Biology, Bethesda, USA, 1991.
14. Kozlov A. P., Glebov A. V., Malykh A., Kolotvina P., Volkova G. Epidemiology and virology of HIV infection in Leningrad// Abstract International Conference of Medical Biotechnology, Immunization and AIDS, Leningrad, USSR, 1991.
15. KozlovA.P.,GlebovA. V.,TraugottM.N.,NikolaevaE. V.,SkadovaV. M., Malykh A.G.,Kurbatova T. V. Virus Isolation from Lymphocytes of Anti-HI V(+) Persons: Identification of a Virus with Unusual Morphology. Abstr. VII International Conference on AIDS, Florence 16-21 June 1991.—P.l 11. — MA.1077.
16. Glebov A. V., Levchenko T. V.,GagarinaS. Yu.,VerevochkinS. V., Kozlov A. P. The Quality control program of HIV screening in St. Petersburg//Abstract International Conference on AIDS, Cancer and Human Retroviruses, St. Petersburg, Russia, 1992.
17. KozlovA. P.,Glebov A. V., Malykh A. G.,LevchenkoN. V., GagarinaS. Yu., Rakhmanova A.G., Volkova G.V. Epidemiology of HIVinfectioninSt. Petersburg//Abstract International Conference on AIDS,Cancer and Human Retroviruses, St. Petersburg, Russia, 1992.
18. Glebov A. V., VcrevochkinS. V.,GagarinaS. Yu„ Prusakov A. N., Aphonin V. G., Kaurov О. Л., Kozlov A. P. Testing of sera panels from patients of différents study groups in peptide immunoenzy me testsystem II Abstract International Conference on AIDS, Cancer and Human Retroviruses, St. Petersburg, Russia, 1992.
19. Kalinina N., Bubnova L., Kellinsky S., Tsvetkova S., Haldeeva N., RakhmanovaA., Kozlov A. P. Endogenous TNF-a Production and HLA Phenotypes in HIV Patients //Abstract International Conference on AIDS, Cancer and Human Retroviruses, St.Petersburg, Russia, 1992.
20. Rakhmanova A. G., Kozlov A. P., Volkova G. V., Chernyshov Yu., Chaika N. Multidisciplinary approach to AIDS prophylaxis in a big city // Abstract International Conference on AIDS, Cancer and Human Retroviruses, St. Petersburg, Russia, 1992.
21. Kozlov A. P.,Glebov A. V., Matykh A. G., Kurbatova Т. V., Krukovskaja L. L., Emeljanov A. V., Volkova G. V. Epidemiology and virology of HIV infection in St. Petersburg II Abstract International Symposium «100 Years of Virology»,St. Petersburg,September21-25,1992.
22. Козлов А. П., Глебов А. В., ВеревочкинС. В., Левченко Т. В., Гагарина С.Ю.,СкадоваВ.М., Волкова Г. В. Эпидемиология и вирусология ВИЧ-инфекции в Санкт-Петербурге// Abstract VII Meeting «Actual Problems of Allergology, Immunology and AIDS», Kaunas, Lithuania, 1992.
23. Рахманова А. Г., Козлов А. П., Волкова Г. В., Кетлинский С. А., Чернышов Ю. К., Чайка Н. А. Мультвдисциплинарный подход к организации службы СПИДа в крупном городе // Abstract VII Meeting «Actual Problems of Allergology, Immunology and AIDS», Kaunas, Lithuania, 1992.
24. Kozlov A. P. Glebov A. V., Malykh A. G„ Levchencko Т. V., Volkova G. V. Epidemiology of HI V Infection in St. Petersburg: a Distinctive Pattern of Spread? II Abstract VIII International Conference on AIDS / IISTD World Congress, Amsterdam, The Netherlands, 19-24 July 1992.
25. Kozlov A. P., Volkova G. V., Malykh A. G., Stepanova G. S., Glebov A. V. Epidemiology of HIV infection in St.Petersburg, Russia// J. AIDS—1993. — V.6, №2.—P. 208-212.
26. Kozlov A.P.,Glebov A. V., Levchenko Т. V., Verevochkin S. V., Gagarina S. Yu., VolkovaG. V.The Quality Control Program of HI V Screening in CIS Countries. IX-th International Conference on AIDS, I V-th STS World Congress, Berlin, 1993. Abstract Book, V.2.—P. 764.—PO-C31 -3289.
27. P. Hartsok, A. Kozlov, Glebov A., Malykh. A. HIV Infection in St. Petersburg, Russia: Substance Abuse and Related Questions// Abstract IX-th International Conference on AIDS, IV-th STS Word Congress Berlin, 1993.
28. Козлов А. П. Глебов А. В., Веревочкин С. В., Левченко Т. В., Воробьева М. С.Программа конг-роля качества скрининга на ВИЧ в странах Содружества //Тезисы 2-й Международной конференции «СП ИД, рак и ретровирусы человека», Санкт-Петербург, 1993.
29. Глебов А. В., Веревочкин С. В., Козлов А. П. Реактивность сывороток контрольной панели Qualitest в различных лабораториях России //Тезисы 2-й Международной конферс! щии «СПИД, рак и ретровирусы человека», Санкт-Петербург, 1993.
30. Глебов А. В., Скадова В. М., Веревочкин С. В., Николаева Е. В., Волкова Г. В., КозловА. П.Под-i верждающая диагностика ВИЧ-инфекции в С.-Петербурге в 1987-1993 годах //Тезисы 2-й Международной конференции «СПИД, рак и ретровирусы человека», Санкт-Петербург, 1993.
31. Глебов А. В., Скадова В. М., Веревочкин С. В., Николаева Е. В., Козлов А. П.Выявление ВИЧ в культуре лимфоцитов периферической крови серопозитнвных пациентов // Тезисы 2-й Международной конференции «СПИД, рак и ретровирусы человека», Санкт-Петербург, 1993.
32. Калинина Н. М., Прокопьева Е. Д., Пигарева Н. В., Хаддеева Н. А., Кетлинский С. А., Козлов А. П., Рахманова А. Г.Продукция цитокинов мононуклеарнымиклетками ВИЧ-ннфицированных больных // Тезисы 2-й Международной конференции «СПИД, рак и ретровирусы человека», Санкт-Петербург, 1993.
33. Г. В. Волкова, А. В. Глебов, С. В. Веревочкин, Козлов А. П.Увеличение распространения ВИЧ через гетеросексуальные контакты в Санкт-Петербурге // Тезисы 2-й Международной конференции «СПИД, рак и ретровирусы человека», Санкт-Петербург, 1993.
34. Козлов А. П., Глебов А. В. О качестве скрининга на антитела к вирусу иммунодефищгга человека // Вопросы вирусологии. — 1993.—№ 4.—С. 186-187.
35. Kozlov А.Р., Emeljanov А. V., Volkova G. V., Verevochkin S. V., Malykh A. G., Reitz M., Farzadegan H. New features of HIV/AIDS epidemic in Russia //Abstract X-th International Conference on AIDS, Yokohama, Japan, 1994—P. 38,—Abstr. I26C.
36. Kozlov A.P., Emeljanov A. V., Volkova G. V., Verevochkin S. V., Malykh A. G., Reitz M., Farzadegan H. New features of HIV/AIDS epidemic in Russia//AIDS Research and Human Retroviruses. — 1994. —V.10,Supl.l.—P.S143.
37. Малых А., БарабитскаяО., Емельянов А., Курбатова Т.,Ярославцева Н.,КарамовЭ., РайцМ., Фарзадеган X., Козлов А. Молекулярная эпидемиология ВИЧ-1 в С.-Петербурге // 3-я международная конференция «СПИД, рак и родственные проблемы", С.-Петербург, 22-26 мая 1995 г. — С. 29.
38. Verevochkin S. V., Skadova V. М., Kurbatova Т. V., Kozlova О. S., Kozlov А. P. Quality control program of HI Vscreening in Russia: two years ofexperience//Abstract 3rd International Conference on AIDS, Cancer and Related Problems, St. Petersburg, Russia, 1995.—P. 51.
39. VolkovaG.V.,Skadova V.M.,VerevocWcinS.V.,StepanovaG.S.,KutasovaT.B.,KurbatovaT. V., Kozlov A. P. Epidemiology of HI V-infection in St.Petersburg //Abstract 3rd International Conference on AIDS, Cancer and Related Problems, St.Petersburg, Russia, 1995. — P. 62.
40. BarabitskayaO.,MalykhA.,ErneljanovA.,KurbatovaT.,Yaroslav1sevaN.,KaramovE.,Far2adcgan H., Reitz M.S., Kozlov A. Molecular epidemiology of HIV-l in St. Petersburg, Russia //AIDS Res. Hum. Retroviruses. -1995. - V. И, Suppl. J.-P.S145.
41. Kozlova A. V., Pashkova T. A., Abelian A. V.,KomilaevaG. V., Yolov A. A., Kozlov A. P.,Karamov E. V. Assessment of HIV-inhibitors combination upon AZT-resistant HIV-l strains replication by quantitative PCR // Abstract 4th International Conference «AIDS, Cancer and Related Problems», St. Petersburg, 1996.
42. EmeljanovA. V., Malykh A., Barabitskaya O., Verevochkin S.,FarzadeganH., ReitzM. C., KozlovA. P. HIV-subtype «В» diversity in St. Petersburg, Russia II Abstract 4th International Conference «AIDS, Cancer and Related Problems», St. Petersburg, 1996.
43. Nabatov A. A., Mashaisky A. E.,Eme!janovA. V., KozlovA. P. The using HMA forHIV-1 genotyping in St. Petersburg II Abstract 4th international Conference «AIDS, Cancer and Related Problems», St. Petersburg, 1996.
44. Volkova G. V., StepanovaG. S., KutasovaT. V., Emeljanov A. V., Verevochkin S. V., Kozlov A. P. Characteristics of HI V/AIDS epidemic in St. Petersburg during 10 years of follow up II Abstract 4th International Conference «AIDS, Cancer and Related Problems», St. Petersburg, 1996.
45. VerevochkinS. V., Skadova V.M., Kozlov A. P. An external quality control program ofHIV screening// Abstract 4th International Conference «AIDS, Cancer and Related Problems», St. Petersburg, 1996. — P. 33.
46. Verevochkin S. V„ Skadova V. M., Kozlov A. P. The reactivity of Qualitest panel sera in different diagnostic kits //Abstract 4th International Conference «AIDS, Cancer and Related Problems», St.Petersburg, 1996,—P. 38.
47. Karamov E. V..YaroslavtsevaN. G., ShchelkanovM. Yu.,MurtovitskiD. V.,Lukashov V. V., KozlovA. P., Papuashvili M. N., Goudsmit J., Khaitov R. M. Antigenic and genetic relations between different HIV-l subtypes in Russia // Immunology & Infectious Diseases. —1996.—Vol. 6. — P. 15-24.
48. Karamov E., Yaroslavtseva N. G., Lukashov V. V., Rytik P. G., Kozlov A. P., Shelkanov M. Yu., Martovitskii D. V., Eremin V. F., Chaplinskas S. A., Goudsmit J. Natural history of HlV-infection in the former USSR// Abstract Xth International Congress ofVirology, Jerusalem, Israel, 11-16 August, 1996.
49. Emeljanov A., Malykh A., Barabitskaya O., Farzadegan H., Reitz M. C., Kozlov A. P.The V3 region of HIV-l isolates in St.Petersburg, Russia contains a unique signature patterns to В subtype sequence // Abstract Xth International Congress of Virology, Jerusalem, Israel, 11-16 August, 1996.
50. Kozlov A., Emeljanov A., Malykh A., Barabitskaya O., Verevotchkin S., Farzadegan H., Reitz M. C. Molecular epidemiology of HI V/AIDS in St. Petersburg, Russia II Abstract Xth International Congress of Virology, Jerusalem, Israel, 11-16 August, 1996.
51. Козлов А. П., Емельянов А. В., Веревочкин С. В. СПИД и другие новые инфекционные заболевания в изменяющемся мире II Тезисы Регионального научного совещания «Генофонд насе-ленняСанкгТ1стср6ур[аи11ро1нозировш1 1996 г.
52. Verevochkin S.., Skadova V., Kozlova О., KozlovA. P. HIV screening in Russia: four years of an external quality control program //Abstract 2nd European Conference on Experimental AIDS Research, Stockholm, Sweden, May 31 — June 3,1997,77—PI.
53. Kozlov A. P.,Emclyanov A., VolkovaG., VerevochkinS.,ShchelkanovM.,YaroslavtsevaN., Karamov E. Molecular epidemiology and molecular virology of HIV/AIDS in Russia //Abstract 2" J European Conference on Experimental AIDS Research, Stockholm, Sweden, May 31—June 3,1997,75—PI.
54. Karamov E., YaroslavtsevaN. G.,Shelkanov M. Yu., YudinA. N.,Lukashov V. P., Eremin V. F., Rytik P.G., KozlovA. P., Chaplinskas S. A., Goudsmit J. Natural history of HIV-infection in the former USSR //Abstract 2nd European Conference on Experimental AIDS Research, Stockholm, Sweden, May 31 — June 3,1997,65-P1
55. Козлов А. П. Новая стадия эпидемии ВИЧ/СПИД в России: новые задачи // Материалы С.Петербург ского медико-биологического конгресса, С.-Петербург, 25-30 мая 1997 г.—С. 18-25.
56. Козлов А. П., Емельянов А. В., Веревочкин С. В., Карамов Э. В. Закономерности ранней фазы эпидемии ВИЧ/СПИД//Рус.журнал «ВИЧ/СПИД и родственные проблемы». —1997.—Т. 1, №.1.—С.5-28.
57. Козлов А. П., Емельянов А. В., Веревочкин С. В., Трауготг М. Н., Николаева Е. В. Выделение вирусов из мопонуклеарных клеток ВИЧ-инфицированных пациентов: обнаружение нового герпесвируса //Рус.журнал «ВИЧ/СПИД и родственные проблемы». —1997. —Т. 1., №.1. — С.29-37.
58. Козлов Л. П.,ВеревочкинС. В. Итоги програм мы внешнего контроля качества лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции в России (1992-1996)//Рус. журнал «ВИЧ/СПИД и родственные проблемы». —1997.—Т.1.,№1.—С.61-68.
59. Kozlov А. P. New stage of HIV/AIDS epidemic in Russia //Abstract 5th International Conference «AIDS, Cancer and Related Problems», St.Petersburg, May 25-30,1997. Russian Journal of HIV/ AIDS and Related Problems.—1997.—V.l ,N. 1.—P.222.
60. Kozlov A. P. Towards Russian HIV vaccine R&D project II Abstract 5* International Conference «AIDS, Cancer and Related Problems», St. Petersburg, May 25-30,1997. Russian Journal of HIV/ AIDS and Related Problems.—1997.—V. 1, N. 1.—P. 225.
61. Kozlov A. P., Emeljanov A. V., Verevochkin S. V., Karamov E. V. Characteristics of the early phase of HIV/AIDS epidemic //Abstract 5th International Conference «AIDS, Cancer and Related Problems», St. Petersburg, May 25-30,1997. Russian Journal of HIV/AIDS and Related Problems. —1997. — V.l,N.l — P.225.
62. Verevochkin S. V., Kozlov A. P. The results of an external quality control program of HI V screening in Russia//Abstract 5th International Conference «AIDS,Cancer and Related Problems», St.Petersburg, May 25-30,1997. Russian Journal ofHIV/AIDS and Related Problems. —1997,—V.I, N.I .—P. 243.
63. Kozlov A. P., Emeljanov A. V., VerevochkinS. V.,Traugott M. N.,Nikolaeva E. V. Virus isolation from peripheral mononuclear blood cells of HIV-infected persons: discovery of a new herpesvirus // Abstract 5ft International Conference «AIDS, Cancer and Related Problems», St. Petersburg, May 25-30,1997. Russian Journal of HIV/AIDS and Related Problems.—1997. — V.l, N.I.—P.253.
64. Nabatov A. A., Masharsky A. E., Emeljanov A. V., VerevochkinS. V.,Tchentsova N. P., Kruglov Yu. V., Kobyscha Yu. V., Kozlov A. P. HIV/AIDS epidemic among IVDUs in Ukraine: different HIV-1 subtypes in different cities // Abstract 5th International Conference «AIDS, Cancer and Related Problems», St.Petersburg, May 25-30,1997. Russian Journal of HIV/AIDS and Related Problems. — 1997.—V.l,N.I.—P.253.
65. Yaroslavtseva N.G.,ShchelkanovM.Yu., Emeljanov A.V.,YudinA.N.,VerevochkinS.V.,Kozlov A. P., Karamov E.V. Analysis of the relationship between GP120 V3 region sequences and the character of interaction of autological serum with V3-derived peptides //Abstract 5th International Conference «AIDS, Cancer and Related Problems», St. Petersburg, May 25-30,1997. Russian Journal ofHIV/ AIDS and Related Problems. —1997.—V. 1 ,N. 1.—P.256.
66. Yaroslavtseva N. G., ShchelkanovN. G,YudinA. N., Papuashvili M. N., Verevochkin S. V., Emeljanov A. V., Kozlov A. P., Eremin V. P., Rytik P. G.,Titov L. P., Gorbacheva E. S., Golikov V. A.,Chaplinskas S. A., Karamov E. V. Atlas of immunoreactivity profiles of HI V-positive sera from the territory of the former USSR //Abstract 5th International Conference «AIDS, Cancer and Related Problems», St. Petersburg, May 25-30,1997. Russian Journal of HIV/AIDS and Related Problems. —1997.—V.l, N.l.—P.257.
67. Kalinina N. M., Ketlinsky S. A., Kozlov A. P., Ischenko A.M. Immunological and immunogenetic criteria ofHIV infection prognosis//Abstract 5th International Conference «AIDS, Cancer and Related Problems», St. Petersburg, May 25-30,1997. Russian Journal ofHIV/AIDS andRelated Problems. — 1997.—V.!, N. 1.—P.259.
68. Nabatov A., Masharsky A., Verevochkin S., Tchentsova N., Maksimenok E., Kobyscha Yu., Kozlov A. P. HIV-1 serotyping of Ukraine seropositive IVDUs using multiple antigen peptides: different HIV-1 subtypes in different cities//Abstract 3rd European Conference on Experimental AIDS Research, Munich, Germany, February 28—March 3,1998,59-P1.
69. Nabatov A, Masharsky A., Verevochkin S.,01shansky A., Golikov V., Kozlov A. P. Prevalence of different HIVserotypes in different high risk groups at the early phase ofHIV/AIDS epidemic // Abstract 3rd European Conference on Experimental AIDS Research, Munich, Germany, February 28 — March3,1998,61-Pl.
70. Yaroslavtseva N. G.,Shchelkanov M. Yu., Yudin A.N., Mirskov Yu., Nabatov A., Masharsky A., Eremin V. P.,TitovL. P., Kozlov A. P., Karamov E. V. Serotypingpeculiarities of HIV-1 epidemic in IVDU cohort from Byelarus and Ukrain// Abstract 3rd European Conference on Experimental AIDS Research, Munich, Germany, February 28—March 3,1998,59-P I.
71. Козлов А. П. Активное профилактическое вмешательство—стратегия борьбы с эпидемией ВИЧ/СПИД на новом этапе ее развития в России // Рус.журнал «ВИЧ/СП ИД и родственные проблемы». — 1998. —Т.2, №. 1.—С.3-10.
72. Набатов А. А., Машарский А. Э., Веревочкин С. В., Максименок Е. Н., Ченцова Н. П., Студзинс-кийВ.Р., Попова Л. Н.,ГлушковаЕ. И., Козлов А. П. Изучение антигенного разнообразия ВИЧ-1 в различных регионах Украины: разные субтипы в разных городах // Рус. журнал «ВИЧ/ СПИД и родственные проблемы». —1997.—Т.2,№1.—С. 11-18.
73. Kozlov A. P. The policy of active preventive intervention. // Abstracter International Conference «AIDS, Cancer and Related Problems», St.Petersburg, May 18-22,1998. Russian Journal of HI V/ AIDS and Related Problems.—1998.—V.2,N.2. —P.75.
74. Kozlov A. P. Russian HIV vaccine project II Abstract 6* International Conference «AIDS, Canccr and Related Problems», St.Petersburg, May 18-22,1998. Russian Journal of HIV/AIDS and Related Problems.—1998. —V.2.N.2.—P.76.
75. YeroshkinA. M., Yeroshkina G.A., Kashentseva Ye.A., DjachkovaL. В., IgnatyevG. M., Bondarenko, V. N., Konstantinov A. P., Bazhan S. I., Pavlova Т. V., Schelkanov M. Yu., Burunova V. V., Abelian A. V., Karamov E.V., Klimov N. A., Verevochkin S.V., Koiov A. Yu., Pigareva N. V., Simbirtsev A. S., Kozlov A. P. A study of different candidate immunizing agents for the developing of an anti-HI V vaccine//Abstract6th International Conference «AIDS, Cancer and Related Problems», St.Petersburg, May 18-22,1998. Russian Journal off II V/AIDS and Related Problems. —1998.—V.2, N .2.—P.79.
76. Titareva G. V.,Shingarova L. N., Bahtceva I. V., Kozlov A. P.,Noskov A. N. Construction of a fused protein env-LFn for the induction of specific CTL response against HIV-1 //Abstract 6th International Conference «AIDS, Cancer and Related Problems», St. Petersburg, May 18-22,1998. Russian Journal of HIV/AIDS and Related Problems.—1998.—V.2, N.2.—P.82.
77. Pavlova Т. V., Shchelkanov M. Yu., Burunova V. V., Abelian A. V., Eroshkin A. M., Kozlov A. P., Karamov E. V. Immunological properties of sera from macaques immunized by TBI (candidate anti-HIV vaccine) // Abstract 6th International Conference «AIDS, Cancer and Related Problems», St. Petersburg, May 18-22,1998. Russian Journal of HI V/AIDS and Related Problems. —1998. — V2,N.2.—P.8I.
78. NabatovA. A., MasharskyA. E.,VerevochkinS. V., Maximenok E. N., Studzinsky V. R.,Popova L. N., Glushkova E. I.,TcUaitsovaN. P.,ScherbinskayaA. M.,Kobyscha Yu. V.,Kozlov A. P.Serotyping of Ukrainian HIV-infected IDUs using MAPs confirms thepersisting situation of different HIV-1 subtype presence in different cities// Abstract 6th International Conference «AIDS, Cancer and Related Problems»,St. Petersburg, May 18-22,1998. Russian Journal of HIV/AIDS and Related Problems. — 1998.—V.2, N.2.—P. 81.
79. NabatovA.A.,MasharskyA.E.,VerevochkinS.V.,EmeljanovA.V.,KrukovskayaL.L.,KozIovA. P. Individuality of humoral immune response to HIV-1 infection // Abstract 6th International Conference «AIDS, Cancer and Related Problems», St. Petersburg, May 18-22,1998. Russian Journal of HI V/AIDS and Related Problems. —1998.—V.2, N.2.—P.80.
80. Verevochkin S., MasharskyA..NabatovA., Kozlov A. P. Variability of HIV-1 serotypes in Moscow and Ukrainian populations II Abstract 6th International Conference «AIDS, Cancer and Related Problems», St-Petersburg, May 18-22,1998. Russian Journal of HI V/AIDS and Related Problems. — 1998,—V.2,N.2.—P.84.
81. Verevochkin S., NabatovA., Masharsky A., OlshanskyA., Pankova G., Yakovets R., Golikov V., Kozlov A. P. Diversity of HI V serotypes in different risk groups in Moscow II Abstract 6th International Conference «AIDS, Cancer and Related Problems», St. Petersburg, May 18-22,1998. Russian Journal of HIV/AIDS and Related Problems. —1998.—V.2, N.2.—P.83.
82. YarosIavtsevaN.G.,ShchelkanovM.Yu.,YudinA.N.,PapuashviliM.N.,VerevochkinS.V.,Nabatov A.N., Kozlov A. P., EreminV.Ph.,RytikP.G,TitovL. P., Olshansky A. Ya., Golikov B. A., Chaplinskas S. A., Karamov E. V. Atlas of immunoreactivity profiles of HI V-positive sera collected in the territory of former USSR: the update on 1998II Abstract 6th International Conference «AIDS, Cancer and Related Problems», St.Petersburg, May 18-22,1998. Russian Journal of HIV/AIDS and Related Problems. —1998.—V.2,N.2.—P.109.
83. НабатовА.А.,МашарскийА.Э.,ВеревочкинС.В.,ЕмельяновА. В.,КруковскаяЛ.Л.,Козлов А.П. Индивидуальность гуморального иммунного ответа при ВИЧ-инфекции//Тезисы научной конференции «Вакцины нового поколения и медицинские диагностические системы будущего», Сочи, 5-9 июля, 1998. International Journal on Immunorehabilitation.—July 1998. — N.8.—P. 198.
84. Karamov E. V., Shekanuv M. Yu., YaroslavtsevaN. G., Verevochkin S.V., Kozlov A. P., Eremin V. Ph., Titov L. P. Sero- and genotyping of HI V-1 variants circulating on the territory of the former USSR // Abstract 12th World AIDS Conference, Geneva, June 28-July3 1998,13205.
85. HIV-1 Sero- and Genotypingof HI V/AIDS Outbreak in Ukraine IVDUs Population: Different Subtypes in Different Cities//Abstract 12th World AIDS Conference, Geneva, June 28-July 31998,13209. NabatovA. A., MasharskyA. E., VerevochkinS. V., Maksimenok E. V.,Tchentsova N. P.,Kobvscha Y.V.,KozlovA.P.
86. Verevochkin S. V., NabatovA. A., MasharskyA. E., Olshansky A. Ya., Pankova G. Ya., Golikov V. A., Kozlov A. P. Prevalence of Different HIV Subtypes in Moscow II Abstract 12th World AIDS Conference,Geneva,June28-July3 1998,13211.
87. Набатов А. А., Машарский А. Э., Веревочкин С. В., Емельянов А. В., КруковскаяЛ. Л., Козлов А. П. Сравнение результатов серотипирования ВИЧ-1 на панелях мономерных и октамерных УЗ-пептидов // Тезисы научной конференции «Вакцины нового поколения и медицинские диагностические системы будущего», Сочи, 5-9 июля, 1998. International Journal on Immunorehabilitation. —July 199B.—N.8.—P. 199.
88. Щелканов M. Ю., Ярославцева H. Г., Набатов A.A., МашарскииА. Э., Юдин А. Н., Мирсков Ю. А., Ченцова Н. П., Кобыща Ю. В., Козлов А. П., Карамов Э. В. Серотапическая стратификация ВИЧ-1 в популяции внутривенных наркоманов на югс/юго-востоке Украины // Вопр. виру-
Подписано к печати 19.11.96 г. Формат бумаги 60X90 1/16. Бумага офсетная. Печать ризографическая. Усл.-печ. л. 2,0. Тираж 150 экз. Заказ 566. •
НИИ химии СПбГУ. Отпечатано в отделе оперативной полиграфии НИИ химии СПбГУ. 198904, Санкт-Петербург, Старый Петергоф, Университетский пр. 2.
сол. —1998,—№4, — С. 176-182.
Лицензия ЛР № 040815 от 22.05.97.
-
Козлов, Андрей Петрович
-
кандидата биологических наук
-
Санкт-Петербург, 1998
-
ВАК 03.00.03
- Биологические свойства изолятов ВИЧ-1, выделенных от пациентов с территорий СНГ
- Серологические свойства V3-петли GP 120 вариантов ВИЧ-1, циркулирующих на территории бывшего СССР
- Изучение нуклеотидных последовательностей и серологических свойств V 3 петли ВИЧ-I на материале из Санкт-Петербурга и Украины
- Биологические свойства штаммов ВИЧ-1, циркулирующих на территории Москвы и Московской области
- Консервация вирусов иммунодефицита человека и чувствительность к антивирусным препаратам
