Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Консервация вирусов иммунодефицита человека и чувствительность к антивирусным препаратам

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Консервация вирусов иммунодефицита человека и чувствительность к антивирусным препаратам"

р Г Б Ой

' российская. акадвпя мезшшнских наук ;шспггут вРусалптя имени д. к. ивановского

На правах- рукописи •

КУЗНЕЦОВА Наталия Владимировна

консервация -вирусов ишунсцейицита человека и чувствительность к антивирусным препаратам

Специальность - 03.00.06 - вирусология

Автореферат .диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководителя

- профеЪсор, доктор медицинских наук Л. Л. Фадеева

- доктор медицинских

. наук ., - -Л.Н.Нссж

москва - 1994 Г

fsfiois выполнена в Научно-исследовательском пкотптугё ви- -русааогкк ш. 'Д. II. Ивановского рдын. - ......

йаунзые руководители - профессор,, доктор медицинских.наук Фадеева Л.1.

- доктор медицинских наук Носик Д.К..

Официальные оппоненты - профессор, доктор медицинских наук Новохатский A.C.

- профессор,доктор биологических наук Кузнецов В.П.

Еедуцее учреждение - Московский НШ Еирусных прензратов РАМН

Зашита диссертации состоится

ih w 3tiu

_ __________ ._____ 1994 Г.

bÜL часов на заседании Специализированного Совета Д.,001.20.02. при НИК вирусологии им. Д.И. Ивановского РАШ (Москва, 1230S8, ул.Гамалеи. 16).

диссертацией можно ознакомиться в библиотеке HP® вирусо-згик км. Д.И. Ивановского" РАМН.

I п I .TT- ¿1 \

1994 г.

к юд.д.и..1шанавакого"РАМН. Автореферат'.разослан _

Ученый • секретарь .....

Специализированного Совета, '

кандидат медицинских наук А.М.Жуковский

2ЕЕЗЗИЕ '

' "Актуальность проблемы " ' ......• -..■•

СПИД является глобально:"! проблемой здравоохранения всего ми- ■ ps, а борьба с вирусом, еызывзвшм это заболевание - одной из наиболее актуальных задач, стоящих перед современными учеными. Катастрофическая быстрота распространения вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) привела к тему, что это- заболевание приняло размеры глобальной пандемии XX Еека (Нданов Е.М. ,1938; ПокровсгаЗГВ'.'И. Покровский В.В. 11988). К концу 1993 года Всемирной Организацией Здравоохранения (ВОЗ) зарегистрировано около 14 миллионов человек, инфицированных ЕИЧ. Из них: е-странах Африки - В млн человек, в Америке - 2,5 млн, Е Юго-Вооточной Азии -1,5 шга, в Западной Европе - 500 тысяч человек. В России с 1 января 1987 г. по 1 июля 1994 г. .число инфицированных ВИЧ составляло: всего - 771 человек, из них детей - 277, 17 детей, родившихся от ВИЧ-инфицированных матерей; больны:-: СПИДом: всего - 128 человек, ;:г них "детей - 90 (Покровский В.Е. .1994).

Резкое увеличение, числа инфицированных и больных СПИДом активизировало исследовательскую работу ученых всех стран, что привело к быстрому открыт!® этиологического возбудителя СПИДа и накоплению, знаний о нем. Со времени обнаружения вируса иммунодефицита учеными многих стран была проделана гигантская ра5ста по исследованию биологических, генетических сеойств вируса, -его жизненного цикла. (Montagnier L.,1983; Gallo R.,1934; Levy J., 1989). Полные нуклео-тидные последовательности генома ряда изолятое ВИЧ были определены е первые полтора' года после выделения ■ ВИЧ • (Haseltirie- W.A., Wong-Staal F.,1938).

wO времени открытия ВКЧ успешна выделяются к накапливаются

многочисленные иголаты ЕИЧ,. различающиеся по своим антигенным и молекулярно'-бислсгпческЕМ свойствам." Sro привадит -к создании -коллекций пеолятое БИЧ и решению сопутствующих- иы задач сохранения индивидуальных- свойств- изолатов в течение4 длительного периода.

N

Изучение условий хранения и консервации выделенных изолятое ВИЧ и разработка новейших способов их хранения способствует выполнению этих целей.

Нейтральное место в проблеме СПИДа- занимает Еопрос о лечении ВИЧ-инфекции. Со времени открытия вируса, вызывающего СПИД, сделаны огромные шаги по изучении и испытанию многих лекарственных препаратов. Но ка данный момент наиболее эффективное применение з клинике имеет практически только один препарат - азидотимидин. Однако. этот препарат очень токсичен и время его применения ограничено несколькими месяцами. Поэтому остается актуальным поиск новых противовирусных ср'ЕСТВ, эффективных в отношении ВИЧ. 'но менее токсичных. Гребу е- своего изучения также проблема комбинированного применения различных противовирусных, препаратов , что позволило бы обеспечить - комплексное воздействие ка различные этапы репродукции ВИЧ и-снизить общую токсичность препаратов.

Настоящая работа выполнена в плане научно-исследовательских разработок Института вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН и является частью заданий, выполненных в рамках Государственной научно-технической программы "Борьба с наиболее распространенными болезнями" по проблеме ОВД теш "И 116, '365.

Дели и задачи исследования ■ ■ Целью настоящего исследования было изучение консервации вирусов иммунодефицита человекз, выделенных на территории России и определение чувствительности к антгсжрусЕж препаратам.

Б соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

- разработать способы длительной.консервации пзолятов ВИЧ;

- исследовать стабильность кзолятов ВИЧ при различных уело- •

виях;

- изучить условия инактивации ВИЧ;

- изучить противовирусный эффект ряда антивирусных препаратов в отношении игслятов ВИЧ.

Научная новизна работы

При выполнении настоящей работы был подучен ряд ноеых данных, имеющих как теоретическое, так и практическое значение.

Разработан, впервые; .способ консервации изолятое ВИЧ методом лиофилигации. Установлено, что лиофшшзирозакные кзоляты ВИЧ-1 и ЕИЧ-2 способны в течение длительного времени сохранять сеой инфек- • ционный потенциал и молекулярно-биологические свойства.

Установлено,что для изолятов ВИЧ, выделенных от ВИЧ-инфицированных лиц из различных эпидемических районов России.характерно чередование начального этапа ускоренной инактивзции с последующим периодом длительного сохранения остаточной инфекционной активности.

Впервые показано, что облучение ВИЧ-1 светом, соответствующим электронным переходам в атомах магния в течение 40-90 мин заметно . снижает уровень репродукции ВИЧ.

Показан вирулицидный эффект хлопчатобумажных тканей, обработанных специальными составами, содержащим ионы меди и растЕор сангвиритрина, и перспективность их применения в качестве средств зашиты медицинского персонала.

Установлено, что индукторы интерферона: ркдостин, ' ларифан, камедон обладает выраженным противовирусным действием в отношении вирусов иммунодефицита ччалозека.

Обнаружен:! резистентность к азидотимщику и снижение чувствительности к действию ряда противовирусных 'препаратов у изолятов БИЧ-1. выделенных от больны;-; СПИДом ;; И1Ч-инфицированных лиц с выраженными симнгсзмаак заболевания, получавши:'га^рс терапии азидоти-мидкном более 3 месяцев.

Практическая ценность работы

3 соответствии с задачами проведенных исследовании были раз-работанк эффективные методы диофшшаации изолятоз вирусов иммунодефицита человека типов-1 и 2, выделенных на территории России от ЗлЧ-зшфшшрованных лиц и больных СПИДом, и эталонных штаммов, выб-сана■защитная среда с оптимальным наполнятелем, установлены режимы . длофилизацнк и длительного хранения ВИЧ.

Подготовлены:

"Каталог перевиваемых клеточных линий, чувствительных к инфицированию вкрусг.«:! -иммунодефицита человека.'! .(Д, Н. Носик, М. Н.Код-кеевз, А.А.Кущ, Л.&.Урываев, Б.Е.Гущин, Р.В.Свирска, И.А.Киселева, Н.З.Кузнецова, Д.А.Глукова, Л.В.Калвина, Е.В.Зорин, Е.М.Стаханова, Л.л.Фадеева. П.М.Клименко) Утвержден Ученым Советом Института ви^ русологии им. Д.И.Ивановского 20.11.1939.

"Методические рекомендации по выделешао вирусов иммунодефицита человека от ВИЧ-инфицированных лиц и больны-; СПИД." (Д.Н.Носик, Л.Б.Калнина, А.Ю.Злобин, Н.В.Кузнецова, И.А.Киселева, М.С.Петрова, Е.А.Гущина, В.В.Покровский, Е.А.Клещпнова, М.С.Бочкова) Утверждены Ученым Советом Института вирусологии од. Д. И. Ивановского 17.06.1931, апробированы и используется в Институте мшфобиологии им. А. Кирсенштетша АН'Латвйи, в Республиканском Центре особоопас-ньк вирусных инфекций Грузии.

Получены:

Авторское свидетельство Но 5003251/14 (071247) "Актпсептпчео-кое средство'для 'прсфалакгюш зшфицйроЕажк БИЧ/СПИД" ЧМиляноесккй А.Г., Фадеева Л.Л., Халепкая Э.В., Носик Д.Н., .Кузнецова Н.В.) Приоритетное решение от 10.06.92г.

Авторское свидетельство N0 5006477/15 (071288) "Средство профилактики гриппа сельскохозяйственных животных" (Мкляновский А.Г., Фадеева Л.Л., Хаяецкая Э.В., Носик Д.Н., р;узнецозз Н.В.) Приоритетное решение от 17.07.92г.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Предложенный способ консервации изолятое вирусов иммунодефицита человека 1 к 2 типа методом лпофильного высушивания обеспечивает длительную сохранность свойсте вирусов.

2. Для изолятое ВИЧ?!, выделенных от ВИЧ-инфицированных лиц на территории Российской Федерации, характерна 2-х фазовая кривая инактивации: с начальным этапом ускоренной инактивации г течение первых 12 часов и последующим периодом сохранения ' остаточной инфекционной активности в течение 10-14 суток.

2. Индукторы интерферона (.ридостин, ларифан, камедон) обладают выраженным противовирусным действием в отношении вирусов иммунодефицита человека..

4. У изолятов ВИЧ-1, выделенных от ВИЧ-инфицированных лиц и больных СГВДом, получавших курс терапии азидотимидином более 3 месяцев, обнаружена резистентность к действию азидотймидина и снижение чувствительности к ряду других противовирусных препаратов.

Апробация работы

Результаты' исследований были доложены и обоуэкдены на Юбилейной научно-практической конференции, посвященной 70-летию Института им. Ластера в мае^ЭЭЗг. в' г. Санкт-Петербург; на IX Меядународ-

ной конференции по СПИДу в июне 1993г. ъ Берлине. Диссертация апробирована 7.07.94г.' ка заседании-экспертного совета по медищшс-коп вирусологи» при НИИ Епрусолоиш им. «.И.Ивановского-РАМН.

Публикация результатов исследований

Основные положения диссертационной работы отражены в 7 опубликованных научных работах и 2 авторских свидетельствах.

Работа выполнена в плане научно-исследовательских работ Ин- • статута вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН (директор Института -акад. РАМН Д.К.Львов) на базе лаборатории музейных штаммов и лаборатории вирусов иммунодефицита человека. Исследования были выполнены в соаЕторстве-с сотрудниками Института вирусологии проф. H.H. Носиком, Л.Б.Калниной, И. А.Киселевой, О.А.Лобач, Ы.С.Петровой, Е.А.Гущиной, Е.В.БезыолиТЕенной, 0.С.Скворцовой, Е.Шумай, которым выражаю глубокую благодарность. Отдельные материалы били получены совместно с сотрудниками: Российского Центра СШЩз (руководитель -проф. В.В.Покровский) М.С.Бочковой, О.Г.Юриным, которым выражаю искреннюю признательность.

Объем и структура -работы

Диссертация изложена на ... стр. машинописного текста и состоит из 2-х частей, вкдючаших следующие разделы: введение, часть 1 - литературный обзор (4 главы), часть 2 - собственные исследования {5 глав), выводи, список литературы. Список литературы включает 150 источников, из которых 20 отечественных и 130 зарубежных."

Обзор литературы

В соответствии с основными задачами диссертационной работы литературный сбзор вкличаег А главы.1 В 1-ой глазе ■даны общие, характеристики вирусов иммунодефицита человека - крзткая история открытия вируса, морфология вирпонси, геко*: ВИЧ, пеке репликации к

генетическая изменчивость вируса. Во й-ой глазе представлены данные о стабильности 'ВИН зо внешней среде, вне организма ' человека. Третья глава посвял1еяа вопросу консервации вирусов иммунодефицита человека, в чзстносги. подробно описывается метод лпофпяьксго высушивания, который успешно применяется для большинства вирусов многих семейстЕ, но в отношении ВИЧ практически не изучен. В 4-ой главе представлено современное положение лротявовнрусноз] терапии при' СПИД с краткими характеристиками осноеных классов соединений и препаратов, используемых, в этих целях.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 1. .Материалы и методы

Клетки. Исследование проводили на перевиваемых человеческих лимфобластовднах клеточных линиях - МТ-4, СЕМ, КЭ, Hut.-78, СЕМ-SS, Molt-4, шноцитарной клеточной линии U-937 и клеточной линии Jur-kgt, трансформированной геном tat, лолучеяньк. иг коллекции Инстк-_ тута вирусологии им. £.11.Ивановского РАМН.

Вирусы. В работе использовали штамм ВНЧ-1/8В9А , лжбезно предоставленный докторам Л.Гертлером ( Институт им. М.Пегенкофера, Германия ), человеческую перевиваемую линию клеток H9/IIIB, штамм ЕИЧ-1/BRU, а также иволяты ВИЧ -1 и ВИН-2, полученные из музея еи-русных штаммов Института вирусологии им. Д.И.ЙЕаноЕского РАМН.

Химиопрепасаты■ Применяли азидотимидиа ("Wellcome",Великобритания) , индукторы интерферона - ларйфан (получен из Института микробиологии им.А.Кирхенштейна, г.Рига), ридостин (получен из Научно-исследовательского конструкторско- технического института биологически активных-, веществ НПО "Вектор", г.Новосибирск), камедон ч

(получен в Научно-исследовательском технологическом институте ан-

tiiSiioteküe и ферментов, г.Санкт-Петербург). В работе по изучение противовирусного действия были использованы текстильные материалы, содержание' бактерицидные' препараты: ткань х/б с' ионами меди 3,3/«, ' марля с. 1% санггиритр11на(разраСотаны Институтом^биофизики МЗ России).

В работе использовали широко .распространенные культуралъкые, вирусологические и иммунологические методы, которые подробно представлены в соответствующих раздела;': работы.

Выделение и пассирование изодятов ВИЧ. Выделение изолятов ВИЧ из лимфоцитов периферической крови (ЛПК) проводили по методу Ваг-ге-Sinoussi F. et al.(1983) в модификации.

Кококонсерваши и дешнеервашга клеточных культур и изолягов ЗИЧ. Осуществляли по стандартным методикам, в качестве кркопоотек-тора используя глицерин или диметшгсульфоксид, "Serva".

Лиоймлизашя. Лиофильное высушивание ВИЧ из замороженного - состояния-проводи.", rva-коллекторной сублимационной установке в ам- . пулах типа ВЦЕ-6 пед вакуумом 100-10 мк. Процесс лиофнлизации про-

о

додадлся 22-24 часа: 14-16 часов при температуре -20 С и 6-3 часов при комнатной температуре.

Исследование антивирусной активности препаратов проводили по методу Monteíiori В.С.(1989). Результаты учитывали на 4-7-14 сутки по цитопатическому действию вируса, методами иммуноферментного анализа, непрямой иммунофлюоресданции и др. Степень защиты клеток от цитодеструктивного действия вируса определяли по формуле А - В

Т. защиты =------х 100 ,

К -В .....

где А - число жизнеспособных клеток в опытной группе,

В - то же в инфад;ро-Еа;:кой куиь«го'. (кстрсзь яьруса) -

К - та ле з контрольной неинфнцнроганной кугьтуре.

Иммуноберментныи анализ.' В прямом июлуюфгрментной'анализе (К ЭА) использовали коммерческий диагностику« фирмы "Ей Роль", а также тест-систему по определению антигенов ВИЧ-1 (разработана группой СПИД совместно с лабораторией диагностики вирусных инфекций Института вирусологии им.Д.И.Ивановского), где на твердой фазе адсорбировали антитела к ВИЧ-1, полученные из сыеспоток крови больных СПИДом. Положительными в ИФА считали образцы, СШ92 которых превышала значение отрицательного контроля более чем в 2,5 раза.

Иммуноблюоресиеншщ. Определение количества клеток, зкспрес-сирукших на поверхности антигены ВИЧ, проводили по стандартной методике с использованием сыворотки больного СПИДом, содержащей антитела к ВИЧ-1.

Электронное микроскопкоовдние проводили по общепринятым методикам.

Глава 2. Коиокшсервадия и лкоФллпзация вирусов иммунодефицита. . " "

2.1. Введение. Б экспериментах по исследовании методов консервации и оптимальных условий хранения были использованы вирусы иммунодефицита человека 1 и 2 типа. В группу вирусов входили иго-ляты, выделенные на территории России от больных СПИДом и ВИЧ-инфицированных лиц. Данные изоляты различались по своим биологическим свойствэл - способностью реплицироваться на различных клеточных линиях, вызывать синцитиеобразование иди цитолиз клеток, .продукцией антигенов. Среди них было 18 высокоинфекшганных изолятов и .33 низкоикфэкционйых. Были также использованы'эталонные зарубежные ■штаммы (ВИЧ-1/Ши, ЕИЧ-1/899А, ВИЧ-1/Ш2, НКЧ-1/3?2, ВИЧ-^'ЯЧ, ЗИЧ-2/Е00, ВИЧ-2/ЗТ>.ВИЧ-2/22Ь6999).

Рис. 1Исследование- инфекционной активности криоконсерви-. рс г>этак„ изолятов ш и»г в процессе хране-ш.

По оси ординат - инфекционный титр (1^ ТЦЦ/ЕО/мл). По осп абсцисс - время хранения (годы). Изолдты: БИЧ-1/899-А, ВЙЧ-1/ИВ1, ЕИЧ-1/ИЕ2, БИЧ-1/ИЕЗ, ВШ-2/Ш).

2.5. Исследование криоконсервалии. восстановления и ддитедь-ного хранения вирусов иммунодефицита. По указанной выше методике проводили закладку ВИЧ-1-и ВИЧ-2 в дзух видах: 1) инфицированные клетки и 2) кульгурадьная жидкость, содержащая вирусный материал.

Хранение при низких температурах до 6 лет (срок наблюдения) "показало, что инфекционная активность ЕИЧ в среднем снижалась на' 0,5 ТЦД/50/1АЕ за гсд, что в целом характерно для семенстЕа рет-ровкрусоз (рис.1). Изменение п..^жцлони.со дателгаала гзолятоз ЕКЧ

при длительном храненнз: было напрямую связано с уровне//, инфекционного титра изолята при его закладке.Та:-; штамм БИЧ-1/899-А с высс-ким инфекционным титром при восстановлении его из замороженного состояния на чувствительных клетках МТ-4 через Б лет хранения при

о

-20 С практически не снизил своей инрекционнои активности.

При исследовании изолятов ВИЧ иммуноферментным анализом после деконсервации на первых пассажах значительно снижались уровни продукции антигенов и- увеличивались лишь после нескольких пассажей

при ведении на модели чувствительных клеток. Так, в частности, вес

ли себя штаммы ВЙЧ-2 после 5 лет хранения при температуре -20 С.

Замораживание зируссодержзщего мзгериала в.виде клеток, инфицированных ВИЧ, проводимое без добавления защитных протекторов, увеличивало эффективность этого метода. При восстановлен™ такой материал показывал больную инфекционную активность.

2.3. Изучение влияния процесса лиойидизаши к длительного хранения на взгоусы з-тымунодефигита. Целью данного исследования было .. изучить возможности применения метода лиофшшзации для -консервации вирусов иммунодефицита с последующим анализом инфекционных и морфологически/: свойств ЕИЧ при длительном его хранении.

Режим высушивания особоопасного материала из загороженного состояния в вакууме, который ранее успешно применялся для консервации многих вирусов в Институте вирусологии (Л.Л.Фадеева, 1937), оказался оптимальным для высушивания вирусов иммунодефицита, В качестве защитной среды использовали среду культивирования КРМ1 1640, содержащую 15£ телячьей сыворотки.

Таким,-образом -были заложены различные изоляты ЕИЧ обоих типов " - 1 и 2. Для исследования использовали различный вирусоодержащий материал: кульгуральнув .жидкость, содержащую вирусные -частицы и

чувствительные клетки, инфшшрованяые ВИЧ. Аилу ли с лиофклизиро-занкыми' вирусада' ¡ммунодефицита' были заложены на длительное хранение ери t'+4°C. В ггосщзссе хранения а определенной периодичностью проведали вирусы ьа икфекциокность. " чч

Исследование инфекционной активности лиофилкзпрованных препаратов ЕИЧ обоих типов проводили на модели клеток МТ-4. Инфициро-ванкые клетки исследовали на жизнеспособность, определяя икфекциокность ВИЧ по 501 тканевой цитопатнческш дозе (ТЕД 50), а также на наличие ВИЧ методами электронной микроскопии и непрямой имму-нофлуоресценции. Кроме того определяли уроиень продукции антигенов ВИЧ методом иммуноферментного анализа (ША).

Провели изучение изменений свойств изолятоа е процессе воздействия на них лиофильного высушивания в сравнении со свойствами, присущими им до лиофилизации. Результаты показали,что процесс лио-филизации. визе:"" „незначительные изменения инфекционных. свейств . изолятов, снижая ищекционный титр вирусов на 0,5-1 Ig ТЦЦ/50/мл и антигенную активность, при этом не оказывая существенного воздействия на способность К синцитиеобразованиэ, тропносгь к чувствительным клеточным системам и другие биологические свойства.

Результаты исследований лиофшшзироззяных изолятов б процессе длительного хранения показывает, что в клеточные культурах, зараженных подвергшимися лиофилигации ВИЧ-1 к BIÍ4-2, обнаружено образование синцишев, цитопатическое действие вирусов набладалось уде на 3-4-й день. Причем инфекционная активность была значительно выше у штаммов, которые были хиофнлизкроЕаяы в виде ■ клеточной суспензии. ..... " ' ■

Исследование г^'.-дет^рованных ' етзммзе ВМЧ-1 и ЕКЧ-2 методом ИОА подтверждало даякк-3 ti.tp звания Еирусгл к пигдзало, что лшфя-

Prie. 2. Доследование накопления антигенов г культуральной .гладкости при восотановлешш лкоф1Ш13прованных кта.мое ВИЧ-1 и ВИЧ-2. По оси ординат - уровень продукции вирусного антигена (оптическая; плотность. нм).

По оси аппликата - лни культивирования (О-му соответствует уровень антигена в пробе лисфижизированнок вирусной суспензии, следующие - уровень антигена в проба-:, взятых в процессе культивирования де?мнсервированна5 Еирусной суспензии ка клеточной линии МГ-4).

По оси абсцисс - изоляты: а) ЕИЧ-1/В99А, Ь) ВИЧ-1/ИВ1, с) ВИЧ-1 Д5В17, d) BJW-2/ST, э) НИЧ-2/ROD, f) B1W-2/SBL599S

лиэированныи вирусный материал, растворенный в ростовой-среде, содержал еысокий уровень антигенов. При декоксервации на моделях чувствительных клеток на первых пассажах резко снижались уровни антигеноё в куль ту'раль ной жидкости, при последующем культивнрова-нии возрастав и практически мало изменяясь (рис.2).

При исследовании восстанавливаемых из лиофилизированного состояния ' итаммо'в Б1К-1 'и ВИЧ-2' методом йепрямой. юо-г/ксфлуоресценции' практически во всех случаях было заметно яркое , свечение мембран множества инфицированных клеток на 4-6-е 'сутки после заражения, что указывало на активное реплищрование вирусов внутри, клеток и проецирование большого числа антигенов на их поверхности.

. По данным электронной микроскопии незначительное количество вирионов- ВИЧ-1 нового поколения отмечалось.уже на 3-й день после инфицирования, максимальное количество внеклеточных и почкующихся вкусных частиц на 5-5-й день после заражения. Аналогичные данные были получены и для ЕИЧ-2, при этом были ЕыяЕлены характерные морфологические особенности - наличие четко выраженных шипиков на ободочке Еируса.

2.4. Заключение. Проведение сравнительного анализа двух методов консервации гзгрусов иммунодефицита человека - консервации при

* ' О о ' • • - - -

температурах -20, ■'■'и, в жидком азоте и лиотильного высушивания -не показалс значительной разницы в биологических и инфекционных свойствах изолятов, консервированных первым и Еторым способами к при длительном соответствующем хранении.

Таким образом, изучение влияния процессз лиофилизации на вирусы имыунодефицитов показало, что Еирусы данной группы хорошо вы-держизант процесс лкофильного высушивания из замороженного состояния под ."вакуумом, а изменения, происходящие с" вирусами этого се-мейстЕа в процессе длительного хранения, сохраняются в пределах нормы.

Глава 3-. Стабильность вирусов иммунодефицита

3.1. Введение. Данная часть кашей работы была направлена на изучение стабильности взносов к,агулоде^:ип"',?а человека в различных

условиях вне организма человека. Как указывалось в литературном обзоре, прямой опенки устойчивости ВИЧ'во внешней среде нами не было обнаружено.

3.2. Исследование стабильности вирусов иммунодефицита. Для изучения стабильности использовала изодяты ВИЧ, выделенные от

I .

ВИЧ-инфицированных лиц и больных' СПИДом, а также эталонные штаммы

ВКЧ-2/КСШ и ВИЧ-2/5ВЬ6Э93 и другие, которыми инфицировали культуры

"клеток 1.41-4 "и " ЛигкаЬ для накопления вирусного материала. Е

экспериментах по определен™ стабильности ВИЧ использовали вирусы

с инфекционным титром 3,5-4,5 ТЦЦ/50/мя.

Для анализа стабильности ВИЧ жидкие пробы вируса помещали в

пластиковые 96-луночные панели (по 100. мил на лунку), закрывали их

о о о

и инкубировали при температурах +25 С, +4 С и +37 С да 14-21 суток, последовательно отбирая образцы БИЧ. Для исследования стабильности ЕМ в виде сухого вещества (осадка) пробы вируса высушивали на дне лунки пластиковой панели, а при заборе пробы растворяли материал ростовой средой. В образцах проб вирусов затем определяли инфекционную активность- ВИЧ, заражая ими клеточные люты ?-Я-4 и СЕМ-55. Методом КЗА измеряли уровень антигена р24 в отобранных пробах и е культурах, инфицированных этими пробами.

Полученные данные показывают, что в течение первых 6-12 часоЕ при инкубации ЕИЧ происходило резкое падение инфекционного титра вируса. При этом отмечалось 'характерное, чередование начального' этапа ускоренной инактивации с последующим периодом сохранения ос-

I

гаточной инфекционной активности. Так, у иэолягов НИЧ 1 типа инфекционный потенциал за первые 3-6 часов понижался на 2.5-3 1е ТЦЦ/50/мл, следующие 12 часов - было более плавное снижение еще на .0.5-1 ТПД/50/мл,,и в последующие 8-10 суток отмечалась незначи-

■ 3. Инактивация изодятов ВИЧ-1/ИВ119 и ВИЧ-1/ИВ373

О о

_во внешней среде при температурах 25 С и 37 С.

Пс оси ординат - инфекционный титр ГЦД/50/мл).

По оси абсцисс - время (сутки).

тельная инфекционная активность(рис.3,4). Для ВИЧ-2 снижение инфекционной активности в процессе инкубации во внешней среде было ещ~ более выражено.

Необходимо отметить, что изоляты отличались индивидуальными особенностями устойчивости ео внешней-среде; так, одни изоляты-щели плавную кривую снижения инфекционного потенциала и уровней антигеноЕ в культуральвой среде независимо от температуры инкубации. Отмечали изоляты, которые во-внешней среде сохраняли инфекционную активность до 10-14 суток, особенно для них были характерны

// , //-#—и I //

О 1 2 3 4 5 ? 11 Н 13 21

Рис. 4. Исследование уровней антигена .при инактивации изолятов ЕИЧ-1/ИВЭ73 и ЕШ-1/ИЕ119 во внешней среде при температурах 25°С и 37°С. По оси ординат - уровень антигена (оптическая плотность, нм). По осп абсцисс - время (сутки).

высоте уровни антигена в пробах., сохранявшиеся длительное время.

Термостабильность изолятов ВИЧ коррелировала с темперзтургми инкубации следующим образом: все изолягы обоих типов оказались более стабильны при комнатиой температуре, при температуре инкубации о.

+37 С." вирусы инактивировались несколько быстрее.

Сравнительные данные о стабильности 15 изолятов ЕИЧ-1 показали, что процесс инактивации носил, в осноеном, сходный характер, не зависел от географических регионов выделения, но у высскоинфек-

- ¿и -

НИОННЫХ ЛТЗММОг иЪ!Л более ЗамеДЛеК.

Сопоставление инфекционной активности 3114 при нахождении в жидкой фазе и сухом состоянии показало, что стабильность изолятов ЗКЧ была выше в растворе.

.-З.-З. Инактивация вирусое иммунодеяишита. .В этой части нашей работы представлены результаты исследований по инактивации вирусов иммунодефицита человека нетрадиционными методами, предложенными и выполневыми с участием сотрудников Института биохимии юл.А.Н.Баха АН и Института биофизики АН.

3.3.1. Инактивация облучением монохроматическим светом. Для. исследования воздействия монохроматического света на ВИЧ использовали лимфобластоидные клетки МТ-4 и СЕМ, инфицированные различными изолятами ВХЧ-1. ....

В ходе .эксперимента вирусссдержащую жидкость облучали светом с длиной волны, соответствующей спектру поглощения магния с экспо-, зициями 20, 40 и 00 шш при полезной мощности источника света ме- • нее 0,1 Вт. После облучения проб вируса ими инфицировали чувствительные клеточные культуры. В качестве контроля использовали аналогичные препараты ВИЧ, не облученные светом. На 4-7-е сутки определяли репродукцию вируса по жизнеспособности зараженных клеток.

Полученные данные показывают, что облучение препаратов Еируса иммунодефицита человека монохроматическим сЕетом приводит к существенному снижении уровня репродукции ВИЧ. Облучение ВИЧ-1 светом в течение 20 шн увеличило вдвое по сравнений с контролем вируса число живых клеток, дальнейшее повышение времени экспозиции до 40 мин и более прямо' пропорционально повышало жизнеспособность клеток в пробах,.что было вызвано заметным подавлением репродукции облученного вируса к снижением его цитопаткческого действия.

•Сходные результаты были получены при применении монохроматического-света, ■соответствующего электронным . переходам. ,е атомах цинка. ,

5.3.2.' Противовирусное действие хлопчатобумажных тканей, содержащих различные бактерицидные препараты. Для исследования инактивации ВИЧ-1 были предложены хлопчатобумажные ткани, обладавшие бактерицидным действием, со следующими пропитками: 1) ионы меди 3,8® и 2) сангвиритрин IX.

В работе были использованы клеточные культуры Juгkat и МТ-4, н клетки-продуценты ВИЧ-1 НЭ/ШВ, в которых титр вируса составлял 5 ТЦД/50/мл. "

При исследовании образцы тканей размером 0,25x0,25 см выдерживали с вируссодержащей жидкостью в экспозициях по 5, 15, 30 и 60 шш. По окончании экспозиции фильтратами, представлнпщими из себя Еируосодэржаиую жидкость с переведшими в рзствср конами или молекулами тканевых пропиток и.воздействушпми, таким.образам, на вирус, заражали чувствительные клетки ЛигкаЬ и МТ-4. Еря этом учитывалось, что воздействие оказывало токсическое влияние, которое снижалось при разведенки фильтратов до 1:100. Нз 4-5-е сутки после заражения определяли цпгопа^огенноэ действие вируса на клетки.

Полученные результаты показали, что ткань с ионами меди 3,37. оказывала противовирусное" действие, понижая инфекционный титр ВИЧ-1 нз 1-1,5'ТЛД/50/мл:- противовирусное действие ткани с 1% сангвиритринсм составляло Ид ПЦ/50/шг при кратковременной экспозиции и повышалось до 2 ПЩ/50/мд при экспозициях до 60 мин.

3.4. Заключение. Исследование различных способов -консервации язолятов ВИЧ показало, что стабильность ВИЧ при разных формах хра-•неюга достаточно велика. Перспективным, является использование лда-

фплпзацпп БИЧ г. иелях длительной консервант:, ссобекко, при незсг-'исхяостк применения' криогенной техники.............

Исследование стабильности и ннактнЕании ВИЧ доказало налети? характерной 2-х ступенчатой кривой падения ¿шфекгшокной активности, с начальным периодом ускоренной янактивашш в течение первых* 12 часов с последушим периодом сохранения остаточной . инфекционной активности в течение 10-14 суток.

С другой стороны, показана чувствительность изолятов ВИЧ к действию испытанных наж вирулицидных тканей, обработанных специ-альныии составам, содержащими ионы меди и рствор сангвиритрина, и облучении монохроматическим светом, ссстветствущим электронным перехода!» в атомах магния и пинка. При этом действие детергентов и облучение носило универсальный характер, и какой-либо избирательной устойчивости изолятов ВИЧ к ним обнаружено не было.

Глаза í. Чувствительность к индукторам интерферона. азидоти-мидину и их комбината; у изолятов ВИЧ.

4.1. Вве'дение. Данная часть работы посвящена "исследованию чувствительности изолятов ВИЧ, выделенных от ВИЧ-инфицированных лиц из различных эпидемических очагог на территории Российской Федерации, к действию противовирусных препаратов.

Этот раздел работы включает исследование ингибкрующего действия индукторов интерферона, азидотимидина и их комбинации на репликацию ■ отечественных' изолятов ВИЧ-1.- Была исследована чувствительность к этим противовирусным препзратам у 32.изолятов.

' 4.2. Исследование влияния индукторов интерферона даоижана и ридостика на репликациюВИЧ-1 в.чувствительных клеточных' 'культурах. В качестве индукторов интерферона нами были выбраны ранее изученные отечественные индукторы человеческого интерферона (двус-

зиральные РНК) - ларифан, камедон и ридостпн. Кндуктс-ры интерферона вводили е культураануя среду в конечных концентрациях 50-200 !.;кг/].ш за 1 час до заражения п одновременно с заражением клеточных культур.

В условиях высокой множественности заражения (0,1-0,5 lg ТБД/БО/мл) культур- клеток МТ-4 уже к 4-му дню после заражения происходит гибель клеток. В .то же Еремя при внесении ларифзнз в различных концентрациях (от 50 до 200 мкг/мл) одновременно с заражением нзбладалась выраженная зашита от цитодеструктизного действия зируса. При концентрации ларифана 50 мкг/мл запзпный эффект был Солее Еыракен, чем при других концентрациях.

При использовании ридостина (50 и 100 мкг/мл) з тай же постановке эксперимента к 4-му .дна после инфицирования до 50% клеток , оставались жизнеспособными. При увеличении концентрации- ридостина -дс £00 мкг/мл зашстяш эффект снижался-. К 7-му. дня культивирования количество жизнеспособны;-: клеток возрастало и составляло 70-75% зри всех концентрациях препарата.

С результатами исследования щпопатического действия вирусов коррелировали данные реакции непрямой иммунофлуоресценгога.

4.3. Сравнительный эффект индуктс-ров интерферона и азидотими- . дина на репликации кзолятов ВИЧ-1. Было проведено сравнительное изучение противовирусного действия 2-х индукторов интерферона -ка- -медона к ридостша на репликацию изолятоз ВИЧ-1/899А и ВИЧ-1/ЙВ39 в культурах клеток МТ-4 и СИА. В качестве реферэнс-препарата использовали аэидотимидпн в концентрациях 0,05-0,001мкМ, оказывавших выраженный противовирусный эффект при введении одновременно' с за- ■ ражениек, при этом жизнеспособность инфицированных клэток сохранялась до 7Q-S0X.

;азл.1. ¡газетное лек

ткмпдпнв £

лл-ал ЕНЧ-:

твие инзукгороЕ интерферона и азидо-удь турах меток, инзвяироваянкх иго-

Степень защиты, %

Препарат !Концентрация

Щ-4

СЕК . I Ш-4 I СЕМ ■

|Азпдотими-I дин

!

|Камедон

I

¡Рпдсстин

0,05мкМ

100 мкг/цл

100 мкт/мл

50,0 * 7,5

55,0'

2,5

52,5 .. ± 5,6

51,4 |77,8 162,5 1 3,0 | - 4,0 1 - 3,51

I I

53,0 |4В,8__156,2.

1 1,25| - 20,6 | - 3,0 I .1 76,7 |65,6 |42,0 ± 0,27| * 12,9 | ± 1,05

При введении испытуемых препаратов в культуральную жидкость одновременно с заражением клеток МТ-4 (0,01-0,05 Т1Щ/50/Ш1) индукторы интерферона оказывали выраженное защитное действие на жизнеспособность клеток (примерно такое же как агидотимидин в концентрации 0,ОБмкМ) (табл.1).

3 сравнении чувствительности исследуемых изолятов. ВИЧ-1/899А и ВЙЧ-1/ИЕ39 иголгт ВИЧ-1/ИВ39 отличался повышенной чувствительности к воздействия азидотимидина и ридостина, но не к камедону.

4.4. Исследование чувствительности изолятов ВИЧ к противовирусным препаратам и их комбинации. Было проведано исследование влияния азидотшиднна, индукторов интерферона и их комбинаций -на «одели 32 изолятов ЕИЧ-1, обладающих различными биологическими свойствами. Изсшяты были получены от больных, находившихся на раз. ных стадиях ВИЧ-инфекции и, соответственна, прошедших разные курсы терапии, поэтому выделенные иаоляты отличалась репликативной ак-

S. ШШШШШ.ШШаШШШШШШШШ

и*-, мшшшшщсосоадщшйзшшшщ

OOOOOOOltUfrU^^UtJlih1. ИИ и м и о

Ш Щ га Ш й

" а......

.............. J Ш Ш È§ S § ё.

И Ш (il СО CÜ CJ СО M M « СО M I"» О) Ol Ol [11 (Л К Ю И Q -J Ol -J CO -J О) со

m to » CO M m

а ш a > a м

&

ö to Й И й й !3 м f^ <i3 м fJ f^ ы u to M ы м м

OOOOOOOOOO«

S сл

M Ы M И о M СЛ «OOOOOOOOO

о о о о is g

ь*ооо1-*ооро1-»мооо>-*а

i£ioO'H(j)ota»)ii»o(>oiHQ~iaitoM [О COlD-JCDCnU^W^OUIfflUlMUlO СП

о о о

О ООО

р р M M

о

¡o

ООО О M io

ООО СО M io

ООО m

(>it>-3mkipihbiûmaii-ltiiuœi ai oimmuóoio„ _ ....

о о о о о о о р

M О « i^ W 10 ►->• О

(О СО СЛ 1<3 со ^ to cri

■ ■ ■ " in о и о

al :а

О H ц.

&I •а

H

Си

cu .

ëi -n а .и

e-fí

ы а

зя

а : м :

s 1 ° Í

а g

сп cil

II

¡o

в g?

- n» "Cl fe til я ч

s i>

в. 'ы

в 3

й &

ф

К О

5 ч

д со

ф Л

о ф

F °

П и

ш ф

О W

11 a

и s3

cu

11 р

О ti

г i ы

о ч

й °

в ы

У*. СП СЛ « ÍO СО Ь» СО СП СЛ M >-*• СО СО It» MOOOlM-iBfflOMOOIOtil со

СО СП ,1*. i-- СИ СО ГО »f. СО ÍO « -4

M СП tri M iU CO СП CO to сл « -

го 2

s s

+ + + ч i-

с) (u

1-3 л

р s

& в

0 с5

s

о

(1)

Ё п)

к

тивность» на чувствительных клетках, способностью к синштиеобра-гован1по к уровнем продукции вирусных антлгеяой (та5л."2). Было установлено. что исследованные изоляты ВИЧ-1 обладают разной чувствительностью к действию этих препаратов.. Отмечено, • что наиболее, чувствительными к действию азидотимидина были изоляты ВИЧ, полученные от бессимптомных больных, не получавших терапии азидотимидина. Такими изолятами были ВИЧ-1/ИЕ1, ВКЧ-1/ИВ2, ВИЧ-1/ИВЗ, ВЙЧ-1/ИВ15, НЯЧ-1/ИВ17, ВИЧ-1Л1В57, ВИЧ-1/ШЭ73, ЕИЧ-1/ИВ102, ВИЗ-1/ИВЮЗ. А 23 изолята, которые были выделены от больны:;, получавших азидотишздин белее 3 месяцев, были менее подвержены дейс-■твию азщготимидина.

В случае парных изолятов ВИЧ, полученных, от одного больного о интервалами 1 год и 3 ..года, соответственно - а), ВЙЧ-1/ИВЗ и ВИЧ-1/ИВ21, б) ВИЧ-1/ИВ1 и ВИЧ-1/ИЕЭ74 - вторично выделенный вирус ' стал более резистентным не только к азидотимидину, но также и к ридостиву (рис.5).

' . Полученные "результаты свидетельствуют о появлении у изолятов ВИЧ, взятых от пациентов с выраженными симптомами заболевания и леченых азидоткмидином, устойчивости к действию препарата. Однако появления полней резистентности к .азидотимидину отмечено не было.

В то же время выявленная закономерность имела ряд отступлений. Так .в случае изолята ВИЧ-1/ИВ39, взятого от больного с ЗВ стадией СЛИД и получавшего азидотимцдин в течение '9 .месяцев, бьша отмечена выраженная чувствительность к азидотимидину и индукторам интерферона (рис.5).

При применении •комбинации индуктора интерферона ридостина с азидотшшжяом в ряде случаев (БИЧ-17ИЕЭ68, ВЙЧ-1/ИВ375) наблюдали антагонистический противовирусный эффект. В случае изолята

Рис.а. Исследование противовирусного действия азидотимиди-на, ридоспша и их комбинации ъ отношении различных йзолятов ВШ-1 в культуре клеток MJ-4. По оси срдикат - процент защиты клеток от действия вируса. По оси аппликата: I - азидотимидин, II - ридостин, III -комбинация азидотимидш-а п ридосткза. По оси абсцисс - изоляты ВИЧ-1: а) S99A, Ь) ЛЕЗ, с) ИЕ17, d) ИЕ21, е) ИВ39.

ВИЧ-1/ИВ39 был обнаружен синергвдяый эффект. Аналогичный феномен обнаружен при- использовании других индукторов интерферона: ларифа-на и камедона.

4.5. Заключение. Таким образом следует отметить, что исследованные наш.изоляты- ВКЧ-1-,,.. полученные .от .ВИЧ-инфицированных и больных СПИДом на разных стадиях заболевания, обладают широким •спектром чувствительности к противовирусным препаратам.

Эбкаруменс. что индукторы интерферона - рпдостин, камедок, лз-•рифан - облэлезг-зята-.КЯ-активностью, аналогичной активности ази-дстимидина, пр;: значительно меньшей ж токсичности.

Исследование показало также, что применение комбинированного действия 2-х (и более) препаратов, блокирующих разные этапы репродукции ВИЧ, по-видимому, позволяет каждому препарату шире использовать свой англрегровирусный потенциал, и, еозможно, вкшочать альтернативные механизмы инги&ирзвания репликации-ВЙЧ.

Выводы.

1. Впервые разработаны пути консервации вирусов иммукодефици-та человека методом лиофильного высушивания. Показано, что при этом изоляты ЕКЧ-1 и ВИЧ-2 сохраняют свой инфекционный потенциал и молекулярно-биологические свойства # течение длительного срока хранения ( срок наблюдения более 5 лет).

2. Установлено, что во внешней среде отечественные' изоляты ВИЧ-1 имеют определенный характер инактивации, который включает 2 этапа: 1 - ускоренное издание инфекционности е первые 12 часоЕ;' 2 - сохранение остатсчной инфекционной активности в течение Юг14 суток.

2. Впервые показано, что облучение ВИЧ-1 светом, соответствующим электронным переходам в атомах магния (полезная мощности источника менее 0,1 Вт 40-90 мин) заметно-снижает уровень, репродукции ВИЧ. "

■ 4. Показан вирулипвдный эффект хлопчатобумажных тканей, обработанных специальными составами,, содержащими.ионы меди и раствор оангвиритрина. и перспективность их применение в качестве средств защиты медицинского персонала.

.5. Установлено, что ¡гадуктсры интерферона: ридостин, лзрифая, камедон обладают выраженным противовирусным действием г отношении вирусов иммунодефицита человека.

6. Обнаружена резистентность к действию азидоти.адика :з снижение-чувствительности к действию ряда других противовирусных прэ-

I

паратов у изолятов ВИЧ-1, полученных на территории России от больных СПИДом и ВИЧ-инфшшрованных лиц с выраженными стзитомзми заболевания к длительно„получавших азидотинидин.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Львов Л.К., Покровский В.И., Коонеева М.Н., ГушинБ.З.. Урываев Л.В., Покооескш: З.В., Калника Л.Е.. Киселева И.А., Стахг-нова В.М., Носик Д.Н., Вочкова М.С., Злобин А.Ю., Кузнецова Н.2. Изоляция вируса иммунодефицита" человека от ' носителей ВИЧ-инфекции. // ДАН.СССР.-1989.-т.307.-Л. 5.-е.1253-1255

'2. Кондратьев К.Я. Гносик Д.Н., 'Телегина Т.А., "Корнееза М.Н., Кузнецова Н.В., Федчеккс П.П. Инактивация вируса СПИД.// ДАН СССР.-1990.-Т.314.-Н.З.-0.739-741

3. Носик Д.Н., Гущин В.В., Фадеева Л.Л., Корнееза М.Н., Гущина Е.А., Урываев Л.В., Кузнецова Н.В. Консервация ззтусов иммунодефицита человека методом лиофилизации.// Вопросы вирусологии. -1990. -N.3.-0. 243-245

4. Миляновский А.Г., Фадеева Л.Л., Халецкая Э.В., Носик Д.Н., ■Кузнецова Н.В. Антисептическое средство для профилактики ВИЧ/СПИД.// Заявка на авторское свидетельство N 5003251/14(071 .247). Положит, решение 27.09.1991г..

5. Носик" Д.Н., Кашшна Л.В., Злобин А.Ю., Кузнецова Н.В., рочкоЕа М.С., ЮринО.Г., Гущина Е.А., Покровский В.В., Клименко

-.М., Львов Д. К. Характеристика штаммов вируса иммунодефицита человека, 'выделенных'от ВИЧ-к^щированных' лиц на территории СССР.// ' Вопросы вирусологии.-1992.-КЛ.-с.24-27

5. Носик Н.Н.. Носик Д.Н., Кузнецова Н.В. Ингибирукщее дейс- * твие индуктороЕ интерферона ка размножение вируса иммунодефицита человека.// Вопросы вирусологии.-1992.-К.2.-с.52-94

7. Hossik М., Kuznetzovs N.. Bgchkova М.. Yarova Т., Pokrovs-ki У,, Nossik D. The study of the HIV-antigen prodaction in clinical material from Russian HIV-infected persons.// Abstract, IX International Conference on.AIDS.-1993.-Berlin .

S. Кузнецова H.В., Вочкова М.С.,- Петрова M.С., Шмидт 0.А.-,-Покровский В.В.. Носик Н.Н., Носик Д.Н., Смольская Т.Т. Чувствительность к противовирусным .препаратам вирусов иммунодефицита человека, выделенных на территории России.// В сб. "Актуальные проблемы инфекционной патологии."-С.-Петербург.-1993.-ч.2.- с.154