Вирусингибирующая активность препарата, полученного на основе мидийного гидролизата

Советова, Марина Геннадиевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Вирусингибирующая активность препарата, полученного на основе мидийного гидролизата
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Вирусингибирующая активность препарата, полученного на основе мидийного гидролизата"

На правах рукописи

РГи ОД

2 5 ДЕК ?1ГП

Советова Марина Геннадиевна

ВИРУСИНГИБИРУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ ПРЕПАРАТА, ПОЛУЧЕННОГО НА ОСНОВЕ МИДИЙНОГО ГИДРОЛИЗАТА

оз. оо. Об - Вирусология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

Сапкт - Петербург 2000 г.

Работа выполнена в Санкт-Петербургском научно-иссшдовательском институте эпидемиологии и микробиологии имени Пастер а Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель: доктор медицинских наук М.а.бичурш1а

Официальные оппоненты:

-доктор медицинских наук, профессор, засждеят.науки РФ Носков Ф.С. -доктор медицинских наук Зазимко ДА.

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН

Защита диссергации состоится « . 2000 г. в /^.часов иа заседании диссертационного совета Д001.46.01 при Научно-исслвдовательском институте гриппа РАМН по адресу: Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова, д.15/17.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке НИИ гриппа рамн.

Автореферат разослан «. 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук " Е.Е. Покровская

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Грипп и другие острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ)

с постоянством занимают ведущее место в инфекционной патологии. За последние годы на грипп и другие ОРВИ приходится 75% всех случаев инфекционных заболеваний. Ежегодно, по статистическим данным, гриппом и ОРВИ переболевают более 70 млн. человек, хотя истинное число их значительно выше. НА долю гриппа и ОРВИ приходится около 40% дней временной нетрудоспособности.

вакцинопрофилактика в силу ряда причин, таких, как многообразие этиологических факторов, смена антигенных характеристик возбудителей, особенности индивидуального и коллективного иммунитета, не в состоянии обеспечить полную защиту населения от гриппа

Поэтому поиск новых антивирусных и иммуномодулирующих препаратов остается одной из актуальных задач в системе борьбы со столь распространенной инфекционной патологией.

Широко проводимый в эксперименте скрининг соединений на предмет выявления антивирусной активности обнаружил целый ряд препаратов, обладающих вирусингибирующими потенциями: производные адамантанового ряда (Индулен М.К. и др., 1990; Киселев О.И. и др.,1997; Сготская Л.Л. и др.,1996; платонов ВТ. и др.,1989;1997; Kolocouris N. ет al.,1996; Serkeiweva J. ет al.,1993 и др.), аномальные нуклеозиды ( Галегов Г. и др.,1994; Самойлович Е.О. идр., 1989;"Валтрекс", 1998;), препараты с антиоксидантной активностью (Долг анова и др., 1991; Исаков В.А. идр.,1993;1996), ингибиторы нейраминвдазы вируса гриппа ( Hayden F. ет ai.,1999 ), индукторы интерферона ( Ершов Ф.И., Чижов Н.П. и др.,1993; Ершов Ф.И. и др., 1997; Протасова С.Ф. и др., 1989; 1995; 1996; Чекановская Л.А., 1997 и др.), ингибиторы протеолиза ( Аникин В.Б. и др., 1993; гольяндоидр., 1994; коломиецА.Г. идр.. 1997;CONDRAJ.H.et AL., 1995; HOSAXAM ет AL., 1995; и др.) и другие вещества однако, дальнейшие исследования позволили пока синтезировать и довести до клинического применения только несколько препаратов противогриппозной направленности, таких как ремантадин, дейтифорин, адапомин и аревдол (индулен м.к и др., 1972; 1979; Ильенко В.И. и др., 1977;1979; Киселева И.В. ,1982; Западников Д.М, 1983; 1987; Кубарь О.И. идр., 1988; киселев О.И. идр., 1990; вотяков В.И. идр., 1977; 1981; Лобанова Е. А.,1989; 1990; Платонов В.Г. и др., 1986; Гагаринова В.М и др.,1989; Слепушкин А.Н. и др., 1997). Каждый из них, наряду с положительным клиническим эффектом обладает и некоторыми отрицательными характеристиками: формирование в процессе их применения резистентных штаммов вируса, способность кумулироваться в организме, ограниченные возможности действия некоторых препаратов в отношении вируса гриппа типа В и ремантадинустойчивых штаммов (козелецкая К.Н.,2000), а также ограничения к применению при наличии некоторых соматических заболеваний. К тому же дейтифорин производится за пределами российской федерации, а широкий выпуск адапромин а и арбидол а в россии пока не обеспечен.

вследсгвии того, что попытки исследователей синтезировать химические соединения, прерывающие те или иные этапы взаимодействия вируса с клеткой, оказывались не всегда удачны, в последние годы возрос интерес к природным биологически активным веществам, способным задействовать в организме многие факторы защиты (eecfjihoba н.н. и др.,1996; Протасова С.Ф. и др., 1989; 1995; 1996; Цыбульский А.В. и др., 1989; 1992; Щегловитова О.Н. и др.,1987; serkidneva J. ет al.,1993; 1995). такие вещества, выделенные из природного сырья растительного или морского происхождения, являются оптимальным вариантом антивирусного

препарата в силу естественности для организма, суммарности по эффективности и широкого диапазона действия. наше внимание привлек препарат, полученный методом гидролиза мягких тканей мцдий и рекомендуемый авторами ( беседина Т.В., бойков Ю.А., рехина Н.И. и др., 1993, 1994 ), как пищевая добавка для лиц ослабленных хроническими заболеваниями. ранее в НИИ медицинской радиологии и НИИ онкологии ( г.москва ) было обнаружено, что мидийный гидролизат способствует ускорению вывода радионуклеотидов из организма, повышает устойчивость организма к действию токсических веществ, увеличивает скорость регенерации кроветворной ткани костного мозга, укрепляет стенки капилляров, повышает уровень гемоглобина и содержание эндогенных протекторов в ряде тканей (кудряшов ю.б. и др.,1989; левшггонжз. идр.,1992)

Целью данного исследования явилось изучение в эксперименте вирусингибирукмцей активности мидийного гидролизата, полученного методами кислотного и ферментативно -кислотного гидролиза из мягких тканей мидий МУПЬВ Еоиш оаш>р1юто{аье1аш, на модели вируса гриппа и других РНК- и ДНК-содержащих вирусов.

Задачи настоящего исследования:

1. Изучение вирусингибирующих потенций мидийного гидролизата (МИГИ) в опытах ин витро

на модели вируса гриша.

2. Определение зависимости противогриппозной активности МИГИ от исходного сырья, технологических схем производства.

3. Изучение защитного действия мидийного гидролизата при экспериментальном гриппе животных.

4. Изучение влияния мидийного гидролизата на иммуногенез при экспериментальной гриппозной инфекции, вакцинальном процессе и определение его интерфероногенного действия.

5. Изучение вирусингибирующих потенций мидийного гидролизата в опытах ин витро в отношении ряда других вирусов, в частности вирусов простого герпеса I и П типов и вируса иммунодефицита человека ( ВИЧ - 1 ).

Научная новизна

В результате исследований получено экспериментальное обоснование для разработки нового противовирусного препарата широкого спектра действия, полученного из естественного сырья морского происхождения.

Впервые в опытах вд углю обнаружена вирусингиеирующая активность в отношении вирусов гриппа у мидийного гидролизата - субстрата, полученного из мягких тканей мидий -моллюсков мупш еош8 сашэршжгсашаш методами кислотного или ферментативно-

кислотного гидролиза. Доказана возможность ингибиции с помощью мидийного гидролизата репродукциии вирусов гриппа типов А и В.

Впервые в опытах ин виво выявлено защитное действие мидийного гидролизата при токсическом экспериментальном гриппе животных. При разных способах аппликации мидийный гидролизат защищал от 53,0% до 84,0% экспериментальных животных, зараженных токсигенным штаммом вируса гриппа А/Виктория/35/72 (НЗШ).

Обнаружено иммуномодулирующее и интерфероногенное действие мидийного гидролизата в эксперименте. Мидийный гидролизат, введенный животным по профилактической

или лечебной схемам, способен увеличивать уровень антигемагглютинирующих антител в 2,0-3,0 раза в сыворотках крови животных. В культуре клеток лейкоцитов периферической крови человека мидийиый гидролиз ат индуцировал синтез гамм a-интерферон а.

Впервые в опытах in vrreo выявлена вирусингибирующая активность мидийного

гидролизата в отношении вирусов простого герпеса I и II типов и вируса иммунодефицита человека i типа.

Практическая значимость и внедрение результатов работы.

Результаты экспериментального изучения в опытах т vttro и ш vivo антивирусной активности медийного гидролизата в отношении вируса гриппа явились обоснованием специфической активности нового антивирусного препарата Вир амид, основой которого является мидийный пвдролизат. На указанный препарат составлен и направлен в ФПС МЗ РФ проект Временной Фармакопейной Статьи (ВФС) (вх.ФПС МЗ РФ №100 от 24.01.94).

Полученные экспериментальные данные и разработанная научно-техническая документация позволили получить разрешение на проведение клинических испытаний Вир амида на здоровых добровольцах (1-ая фаза ) и у больных гриппом и ОРВИ ( П-ая фаза ). Проверка безвредности мидийного гидролизата на 20 здоровых добровольцах показала отсутствие каких-либо побочных явлений при разных способах применения препарата (отчет НИИЭМ им. Пастера от 1.01.93 по договору №04-93).

Клинические испытания Вирамида у больных гриппом и ОРВИ, проведенные в 3-х

клиниках: диспансерно-поликли1шческом отделение НИИЭМ им. пастера МЗ РФ, военно-медицинской академии (г.с.-петербург) и ВНИИ гриппа РАМН, завершены и отправлен отчет в ФГК МЗ РФ «О клиническом исследовании препарата ВИР АМИД (МИГИ-К, МИГИ-ФК) в качестве противовирусного средства у взрослых при гриппе и ОРВИ» ( исх. НИИЭМ им.пастера №522 от 31.10.95 ).

Получено заключение Государственного института доклинической и клинической экспертизы лекарств МЗ РФ о том, что клинические исследования подтверждают эффективность препарата при лечении больных гриппом и ОРВИ и о передаче материалов для рассмотрения в ФПС РФ с целью разрешения медицинского применения вирамида в комплексной терапии больных гриппом и ОРВИ ( исх. ГИДКЭЛ МЗ РФ №211-5930/2-7J7 от 20.04.96).

На основании данных экспериментального изучения МИШ в отношении вирусов простого герпеса I и II типов в фармакологический государственный комитет МЗ РФ направлено обоснование для расширения показаний к применению вирамида и программа изучения терапевтической эффективности вирамида у больных герпетической инфекцией при местном его применении ( исх НИИЭМ им.пастера №599 от 22.12.95).

Новая Фармакопейная статья предприятия на препарат Вирамид утверждена на Президиуме Фармакопейного ГосударственнгоКомитетаМЗ РФ от 16.06.00.

материалы работы использованы при составлении практических рекомендаций для врачей «неспецифическая профилактика гриппа и орз среди рабочих промышленных

предприятий» (Санкт-Петербург, 1996г.). Основные положения, выносимые на защиту

1. мидийный гидролизат - продукт, полученный из мышечной ткани моллюсков Mytujs edülis oalloprovwaleiaxjs, обладает в эксперименте антивирусной активностью в отношении

вирусов гриппа, ингибируя репродукцию вирусов гриппа типов а и в ш \тпю и защищая от гибели мышей при заражении последних токсигенным штаммом вируса гриппа а.

Положительные результаты получены при разных способах аппликации МИГИ по лечебной и

профилактической схеме.

2. мидийный гидролизат, введенный животным перорально, интраназально или парентерально по профилактической или лечебной схемам повышает уровень специфических противогриппозных аитигемагтлютинирующих антител при заражении животных вирусом гриппа. при этом исследуемый препарат обладает интерфероногешшм действием, индуцируя синтез гамма-интерферона в культуре клеток.

3. мидийный гидролизат обладает в опытах ш \1tro выраженной вирусингибирующей активностью в отношении вирусов простого герпеса 1 и 2 типов и вируса иммунодефицита человека 1 типа (ВИЧ-1).

Апробация результатов исследования

Результаты работы были представлены на национальных и международных конгрессах, конференциях и симпозиумах: Юбилейной международной конференции "Актуальные проблемы инфекционной патологии" (СПб., 1993), Ком Международном конгрессе по вирусологии (Глазго,1993), Уой Международной конференции по химиотерапии инфекционных и онкозаболеваний (Австрия, 1994), конференции во ВНИИ гриппа РАМН "Новые подхода к целенаправленному конструированию противовирусных препаратов" (СПб.,1994), УН-ой Международной конференции по сравнительной и прикладной вирусологии (Монреаль, Канада, 1994), П-ом Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва,1995), Международном симпозиуме "Прогресс в клинической вирусологии" (Прага,Чехословакия,1995), Х-ом Международном конгрессе по вирусологии (Иерусалим, Израиль,1996), на Международной конференции " Антиинфекционные препараты и химиотерапия" (Лейпциг, Германия , 1996), на Международной конференции «Региональные проблемы профилактической медицины» (Великий Новгород, 1999) Публикации

По теме диссертации опубликовано 11 работ.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 137 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 7 рисунков и 38 таблиц. Список цитируемой литегатуры включает до отечественных и иностранных источников.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы

Препараты. Мидийный гидролизат (МИГИ) получен методами кислотного (МИГИ-К) или ферментативно- кислотного (МИГИ-ФК) гидролиза мышечной ткани беспозвоночных животных Мтпш еоиш оа1хор1ю\тае1аш в соответствии с ТУ 15-16-06-92 во Всесоюзном научно-

исследовательском институте рыбного хозяйства и океанографии ( ВНИИГО ) (г.москва) или в

Межхозяйственном объединении "Экое" (г. С.-Петербург). Препарат готовили из сырого или

свежезамороженного мяса мидий, которое сначала обрабатывали протеолитичесюш фермектом-

протосубтилином. Оптимальная концентрация фермента составляла 0,4% к сырью, температура

обработки 50-55°С. После этого субстрат упаривали до содержания сухих веществ 16-18% и проводили кислотный гидролиз в присутствии HCL в течение 20-24 ч. Гидролиз прекращали путем добавления к полученной биомассе щелочи. Приготовление МИГИ методом кислотного гидролиза проводили в той же последовательности, но без обработки протеолитическим ферментом.

Мидийный гидролизат содержит полный коплекс незаменимых и заменимых аминокислот, полиненасыщешше жирные кислоты, низкомолекулярные пептиды, фосфатиды, гуминовые кислоты, меланоидины, микроэлементы (р, са, Fe, си, mn, co, ва, мд и др.), которые в препарате представлены в виде комплексов с органическими носителями и витамины ( Bi, Вг Рр, А.Е).

Мидийный гидролизат (МИГИ, МИГИ-К) представляет собой однородную темно-коричневую жидкость, солоноватую с легким привкусом горечи и запахом сухих грибов.

Всего исследовано 135 образцов препарата, полученных из мидий, выловленных в Черном, Азовском и Белом морях.

В качестве тест-препаратов в отношении вирусов гриппа применяли ремантадин Олайнинского фармацевтического завода и виразол ф. ICN, при изучении антигерпемческой активности на культуре ткани использовали ашвсловир (виролекс) фирмы "Wellcome Foundation umtted", прииоощ1ешаниивотноше1шивич-1 —азидотимрщин (AZT) фирмы "Sksma".

Вирусы-Вирусы гриппа: А(НШ) - пггаммы А/ТайвашЛ/86, А/Виктория /36/88, Х-113; A(H3N2) -пггаммы А/Викгория/35/72, А/Миесисипи/1/85, А/СССР/1/85, NIB-25, A/resvnaae/8W4; В - штаммы ШВихторияО/87, в/ЯМагата/1&88, В/Ленинград/] 35/91, БУХареин/7/94. Аишггоисные вируссодержащие культуры получали общепринятым методом на 10-12 дневных куриных эмбрионах

Вирусы простого герпеса: ВПГ-1, штамм L2; ВПГ-2, штамм Внуково-2.

Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ-1У Штамм В/ВИЧ-1 выделен от больного в НИИЭМ им.Пастера в г. С.-Петербурге на лимфобластоидной клеточной линии МТ-4. Вирус везикулярного стоматита (ВВС): штамм Индиана.

Культуры клеток. Культура хорионаллантоисной оболочки (ХАО) для вирусов гриппа, культура периферической крови человека L-41 для определения интарферонивдуцируклцей активности препарата, перевиваемая линия почек кролика RK-13 для ВПГ-1, перевиваемая культура VERO для ВПГ-2, лимфобластоидная клеточная линия МТ-4 для ВИЧ-1.

10-12-ти дневные куриные эбрионы птицефабрики «скворицы» г. санкт-петербурга для изучения вирусингибирующей активности в реакции нейтрализации в отношении вирусов гриппа.

Животные: В экспериментах были использованы белые беспогодные мыши весом 14-16 г. в количестве 3650 шт., морские свинки весом 250-300 г. в количестве 170 шт. Животных получали го питомника "Рапполово".

вирусингибируюпгую активность МИГИ in vttro определяли в реакции нейтрализации вируса гриппа с последующим заражением куриных эмбрионов, лию на культуре хорионаллантоиспой оболочки (XАО) по стандартным методикам ( шварцман Я.С., аграновская Е.Н.,1974 ). Антивирусное действие МИГИ исследовали в зависимости от дозы препарата и времени введения МИГИ по отношению к инфицированию культуры ткани.

Инфекционный титр вычисляли то методу Кернера и выражали в lg ЭИД50. Противовирусное действие препаратов оценивали по разнице титров вируса в контрольном и опытныхрядах (ВорошиловаМК идр.,1964).

Антитоксическое действие МИГИ изучали в опытах dj vivo при заражении мышей токсигенным штаммом вируса гриппа А/Виктория /35/72. Часть животных получала мидийный пздролизат зондом per os в объеме 0,5 мл, другая группа животных интраназально в объеме 0,1 мл. Антитоксическое действие МИГИ исследовали в зависимости от дозы изучаемого препарата и источника сырья для его приготовления, способа аппликации и времени введения МИГИ то отношению к инфицированию экспериментальных животных и в зависимости от способа гидролиза при изготовлении препарата. Критерием эффективности препарата являлось увеличение частоты выживаемости мышей в опытной группе по сравнению с контрольной в течение 7 дней.

Изучение антивирусного действия МИГИ на экспериментальных моделях с

нетоксигенным штаммом вируса гриппа.

Влияние МИГИ на репродукцию вируса гриппа в легких мышей определяли при заражении их тремя конечными десятикратными разведениями нетоксигенпого штамма вируса гриппа А/Миссисипи/1/85 (H3N2), содержащими 1, 10 или 100 ИД50. На 3 сутки животных забивали, извлекали легкие, готовили суспензию легких, котоюй заражали 10-12 дневные куриные эмбрионы. О вирусингиеирующем действии мидийного гидролизата судили по разнице инфекционного тигра вируса гриппа в РГА в легких опытной и контрольной груш животных.

помимо этого, исследовали влияние МИГИ на репродукцию вируса гриппа в клетках слизистого эпителия носовых ходов экспериментальных животных. с этой целью у морских свинок iia 4, 5, 6 сутки при экспериментальной гриппозной инфекции забирали смывы из носа и инокулировали их в 10 - 12 дневные куриные эмбрионы. О вирусингиеирующем действии мидийнош гидролизата судили по разнице в частоте обнаружения вируса гриппа в смывах опытных и контрольных групп животных

при изучении влияния МИГИ на иммуногенез при экспериментальной гриппозной инфекции применяли разные способы аппликации препарата: перорально, интраназально и внутрибрюшинно. МИГИ вводили в разведении от 1/100 до 1/400 по профилактической и лечебной схемам по отношению к заражению животных. животных инфицировали вирусами гриппа А/миссисипи/1/85 (H3N2) в дозе 5,5 lg ИДЯУОДМЛ или А/Викгория/35/72 (H3N2) в нетоксичной для мышей дозе-3,5 IgHfljo/o,ib«i. Через 14 суток животных обескровливали, сыворотки исследовали

в РТГА по общепринятой методике. О влиянии мидийного гидролизата на иммуногенез судили по уровню средней геометрической титра антител в сыворотках крови животных в контрольной и опытных группах, получавших препарат.

Для определения влияния МИГИ на вакцинальный иммунитет. мышей иммунизировали ш1активированной гриппозной хроматографической вакциной (ИГХВ) из штамма вируса

гриппа А/миссисипи/1/85 (H3N2) и одновременно пеюрально вводили препарат В разведении от 1/50 до 1/200. Титры противовирусных антител в сыворотках крови мышей определяли через 14 суток в РТГА по общепринятой методике. Об иммуномодулирующем действии препарата судили по уровню средней геометрической титра антител в сыворотках крови иммунизированных животных и сыворотках животных, которым помимо ИГХВ вводили препарат.

Определение интерферон (ИФУинлуцигующей активности МИГИ проводили in \пж> в культуре периферической крови человека.* Противовирусную активность ИФ исследовали микрометодом в культуре L-41 с использованием в качестве индикатора вирус везикулярного

стоматита (ВВС). Тип ИФ определяли в реакции нейтрализации с антисывоготками к а-к у -

интерферону. За тигр ИФ принимали величину, обратную его наибольшему разведению, обеспечивающему защиту 50% клеток от ЦПД вируса ВВС (КондратьеваГ.А и др. , 1988).

Оценку антивирусной противогерпетической активности мидийного гидролизата осуществляли с использованием в качестве тест-системы для ВПГ-1 культуры клеток перевиваемой линии почек кролика (RK-13); для ВПГ-2 перевиваемой культуры VERO**. Характер действия препаратов на указанных культурах определяли при профилактической и лечебной схемах введения препарата и в реакции нейтрализации с последующим заражением культуры ткани. Антивирусный эффект при изучении профилактического и лечебного действия препарата оценивали по подавлению ЦПД вируса и по снижению инфекционной активности вируса в культуре клеток в присутствии рабочей дозы мидийного гидролизата.

Для этого на 3, 4 и 7 дни после инфицирования из контрольных и опытных культур, инфицированных различными дозами вируса (1- 10000 итд50) брали по 3 пробирки опытных и контрольных культур. Вируссодержащую жидкость из 3-х пробирок объединяли и титровали на соответствующих культурах клеток с коэффициентом 10 по обычной схеме. Учет результатов проводили по ЦПД на 7 сутки после титрования опытных и контрольных образцов и эффект оценивали по уровню снижения инфекционного титра вируса в присутствии препарата.

Изучение противовирусной активности МИГИ в отношении вируса иммунодефицита человека проводили на лимфобластоидной клеточной линии МТ-4, чувствительной к ВИЧ-1. Использовали штамм В/ВИЧ-1, относящийся по своим характеристикам к группе высокоинфекционных вирусов***. Характер действия МИГИ определяли при профилактической и лечебной схемах введения по отношению к заражению культуры ткани, в реакции нейтрализации с последующим заражением культуры клеток МТ-4 и при сочетанном применении МИГИ с AZT в многофакторном эксперименте.

Статистичр.скую обработку материалов проводили с использованием общепринятого расчета стандартной ошибки. Достоверность разности средних М+m оценивали по критерию Стьюдента (Ворощилова М.К. и др.,1964). Различия средних считали достоверными при уровне значимости Р< 0,05.

•Данный раздел исследований проводили совместно с зав. лае. интерферона НИИЭМ им. Пастера, к.м.н. ИовлевымВ.И.

•♦Данный раздел исследований выполнен совместно со с.н.с. лаборатории детских вирусных инфекций НИИЭМ им.пастера Тарос Л.Ю

** »Данный раздел работы проводили совместно с зав. лаб СПИДа НИИЭМ им.Пастера д.м.н.СмсшьскойТ.Т. и с.н.с. Коровиной Г.И

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. вирусшнтширующая активность мидийного гидролизата ( МИГИ) в отношении вируса гриппа в реакциях еч упио. стабильность вирусингибирующей активности МИГИ в процессе хранения

1.1. Определение ингибирующей вирус гриппа активности в реакции нейтрализации на куриных

эмбрионах и при заражении культуры ХАО

Для изучения вирусингибирующего действия мидийного гидролизата на вирусы гриппа о) углю выбраны две реакции: реакция нейтрализации вируса гриппа в пробирках с последующим заражением этой смесью куриных эмбрионов и изучение вирусингибирующей активности препарата при аппликации в культуру переживающей хорионаллантоисной оболочки. первая из реакций позволяла сделать вывод о непосредственном влиянии (вирусингибирующее действие) препарата на вирус, вторая - определить антивирусную активность в культуре клеток при разных схемах его введения. использование реакции нейтрализации для изучения вирусингибирующей активности мидийного гидролизата потребовало проведение ряда предварительных экспериментов по уточнению условий ее постановки. это касалось продолжительности контакта вируса с препаратом, температурных условий взаимодействия, содержания иась в мидийном гидюлизате и влияния значений рн на результаты реакции.

Изучение разного времени контакта МИГИ с вирусом выявили, что инактивация вируса гриппа начинается в первые 5 минут, постепенно увеличиваясь при контакте в 20 минут и 1час. Увеличение времени контакта до 90 минут не влияло на результаты опыта При разном временном контакте вируса с МИГИ ( 5, 20, 60, 90 минут ) снижение титра вируса на куриных эмбрионах составило соответственно 1,5; 2,5; 2,75; 2,75 ^эидзд.

Температурные условия реакции (+4°С, +18°С, +37°С) не влияли на ее результаты. Различие в инфекционной активности вируса гриппа не превышало 1,0 ЭИД50. При разных температурных условиях постановки реакции нейтрализации на кэ, снижение инфекционного титра вируса гриппа под действием МИГИ составляло в среднем 2,5-3,5 ^ ЭИД50 (р<0,05).

Учитывая, что разброс показателей рН в соответствии с техническими условиями к препарату составлял 5,0 и выше, представлялось необходимым определить влияние рН на исход реакции нейтрализации. Выявлено, что значение рН препарата ниже 5,5 не давало достоверной информации о нейтрализующей активности мидийного гидролизата вследсгвии его влияния на инфекционную акгивноспъ. Поэтому для характеристики вирусингибирующей активности разных серий препарата перед исследованием обязательно определяли рН (концентрацию водородных ионов) и при необходимости доводили значение рН до >5,7. в настоящее время согласно ВФС на Вир амид требования по рН параметру к препарату составляют 5,3-5,8.

Мидийныйпщролизат в соответствии с ТУ содержит достаточно высокую концентрацию соли (до 15%Ыа(Х), и это обусловлено технологическим процессом приготовления субстрата, когда киаклный гидролиз приостанавливают, добавляя к биомассе ЫаОП. Реакция нейтрализации была поставлена с вирусом гриппа А(НЗ№) на растворе с различным содержанием ЫаСЬ. Реакция имитирована таким образом, что вместо МИГИ к разведениям вируса добавляли равный объем раствора, содержащий разные концентрации КаСЬ (от 2% до 22%). При этом концентрация соли ЫаС1. от 2% до 11% не оказывала влияния на инфекционную активность вируса при обычной постановке

реакции нейтрализации, т.е. при соединении равных объемов вируса и солевого раствора с последующим заражением этой смесью куриных эмбрионов, если же содержание NaCL в контрольном растворе составляло 15% и выше, то инфекционный титр вируса гриша снижался в среднем по результатам 5-ти экспериментов на 1,25+0,6 lg ЭИД50 ( р<0,05 ), поэтому В качестве контроля в реакции нейтрализации использовали раствор NaCL в концентрации, соответствующей ее содержанию в испытуемом образце.

Адаптация условий постановки реакции нейтрализации для выявления вирусингибирующих потенций мидийного гидролизата позволила использовать упомянутую реакцию для решения ряда вопросов технологического плана: сравнение разных способов гидролиза, продолжительности гидролиза, стабильности сохранения вирусингибирующих свойств препарата, а также для определения антивирусной активности мидийного гидролизата в отношении других вирусов.

проведенные в реакции нейттализации с вирусом гриппа A(H3N2) исследования выявили вирусингибирующую активность мидийного гидролизата. всего исследовано 135 образцов мидийного гидролизата, полученных из разных географических точек и 8 зависимости от этого обозначенных, как беломорские, азовские, черноморские. с наибольшим постоянством вирусингибирующая активность отмечена у субстрата, полученного из беломорских мидий, под действием которого происходило снижение инфекционной активности вируса до 4,0-6,0 lg ЭИД50 у разных образцов препарата. остальные перечисленные образцы гидролизата мидий обладали менее выраженным вируснейтрализующим действием: черноморские - 3,0-4,5 lg ЭИДЭД, азовские- 2,5-2,75lgЭИД50.

Наличие вирусшшибирующей активности образцов МИГИ из разных источников

подтверждено и на культуре переживающей хорионаллантоисной оболочки. при этом зафиксировано снижение инфекционного титра вируса гриппа типа A/H3N2 на 2,0-3,5 lg при введении препарата, разведенного в 10 раз, за 2 часа до инфицирования клеток. аппликация препарата после заражения клеток регулярно снижала инфекционный титр вируса на 1,0-2,25 lg ТИД50 (рис.1). под действием тест - препаратов ремантадина в дозе 20 мкг/мл и виразола (10 мкг/мл) инфекционный титр вируса снижался на 2,0-2,5 lg ТИД50.

ВЕРОЯТНО, ВВЕДЕНИЕ МИГИ ДО ЗАРАЖЕНИЯ КУЛЬТУРЫ ХАО ОКАЗЫВАЛО НЕ ТОЛЬКО НЕПОСРЕДСТВЕННОЕ ВИРУСИНГИБИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ НА ВИРУС ГРИППА, НО И МОДИФИЦИРОВАЛО ЧУВСТВИТЕЛЬНЫЕ КЛЕТКИ КУЛЬТУРЫ ТКАНИ, ЧТО ПОДТВЕРЖДЕНО РЕЗУЛЬТАТАМИ ОПЫТОВ, ПРИ КОТОРЫХ КУЛЬТУРУ ХАО ПОСЛЕ 2-Х ЧАСОВОГО КОНТАКТА С ПРЕПАРАТОМ ПЕРЕНОСИЛИ В СВЕЖУЮ ПИТАТЕЛЬНУЮ СРЕДУ. В ЭТОМ СЛУЧАЕ ТАКЖЕ ИМЕЛА МЕСТО ИНГИБИЦИЯ ВИРУСНОЙ АКТИВНОСТИ, ХОТЯ И МЕНЕЕ ВЫРАЖЕННАЯ ( НА 1,75 lg ТИД50). ПОЛУЧЕННЫЕ ДАННЫЕ ПРЕДПОЛАГАЮТ, ЧТО ВИРУСИНГИБИРУЮЩИЙ ЭФФЕКТ ПРЕПАРАТА ОПРЕДЕЛЯЕТСЯ СУММАРНЫМ ВОЗДЕЙСТВИЕМ ПЕРЕЧИСЛЕННЫХ ФАКТОРОВ.

Наблюдение за 5 образцами мидийного гвдролизата в течение 2-5 лет выявило, что вирусингибирующее действие препарата сохранялось на протяжении 3-х и более лет.

Рис.1. Влияние МИГИ на репродукцию вируса гриппа типа А (Н3№) на культуре

хорионаллантоисной оболочки.

Инфекц. активн. в 1д ТИД50/0,5мп

Образцы МИГИ

1 ¿.определим широты спектра антивирусной активности МИГИ в отношении различных серотипов вируса гриппа

Расширение спектра вирусов гриппа, включение в реакцию нейтрализации различных штаммов типов А (НШ1) и В, равно, как и штаммов вируса гриппа А(НЗЫ2) разных лет выделения (в работе было использовано 10 штаммов вируса гриппа), выявило антивирусную активность МИГИ в отношении всех перечисленных вирусов. В целом, под действием беломорских МИГИ зафиксировано снижение ЭИД50 вируса гриппа А(НЗМ2) равное 2,5-6,0 А(НШ1) - 2,5-4,5 ^ и В -2,5-6,5 1$ и зависело от образца гидролизата, а не от используемых в реакции штаммов ( таел. 1 и табл.2 ).

Таблица 1.

СУММАРНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ МИГИ В РЕАКЦИИ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ НА КУРИНЫХ ЭМБРИОНАХ В ОТНОШЕНИИ ВИРУСОВ ГРИППА СЕРОТИПА А/Ю1С.

Штаммы вируса гриппа серотипа А(НЗМ2) количество образцов препарата Инфекционный титр вируса 1яЭИД50 /0,2мл Снижение антивир. активности Ы ЭИД50 М+ш р

контроль М+6 Опыт М+б

А/ВИКТОРИЯ/35/72 4 6,7+1,3 3,8+1,4 2,9+0,7 >0,05

А/Мнссисипи/1/85 29 7,5+0,5 3,0+0,6 4,5+1,3 <0,001

ИШ -25 4 7,0+0,5 2,1+1,1 4,9+1,1 <0,001

А/СССР/1/85 3 6,7+0,4 1,5+0,5 5,2+0,6 <0,001

А/резвир/8/94 3 6,5+0,5 2,7+0,6 3,8+0,5 <0,01

Таблица 2.

ВИРУСИНГИБИРУЮ1ЦАЯ АКТИВНОСТЬ МИГИ В РЕАКЦИИ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ НА КУРИНЫХ ЭМБРИОНАХ В ОТНОШЕНИИ ВИРУСОВ ГРИППА СЕРОГГИПА А/НШ1 и ТИПА В.

Штаммы вируса Количество Инфекционный титр вируса Снижение инф.

гриппа образцов 1гЭИД50/0,2мл активности

препарата вируса

18ЭИД50

Контроль Опыт м+ш

М+8 М+5

А/Тайвань/1/86 (НШ1) з 7,0+0,5 3,3+1,0 3,7+0,7*

А/Виктория/36/88( НШ1) 3 6,5+1,0 2,9+0,8 3,6+0,8»

В/Ям АГАТА/16/88 2 2,25 <1,0 1,25>М>2,25

В/Ленинград/9 1 2 2,75 <1,0 1,75>М>2,75

В/Харбин/7/94 2 6,5 <1,0 5,5>№6, 5

Примечание: !.♦ р < 0,05.

эти данные выли подтверждены и в культуре ХАО, инфицированной вирусами гриппа, где под действием мидийного гидролизата в разведении 1/10, введенного за 2 часа до инфицирования культуры наблюдали снижение инфекционной активности вируса гриппа типа А(НЗ№) в среднем 11а 2,5А(Н1М1) - 3,0В - 3,25 ^ ( р < 0,05).

2. Изучение зависимости противогриппозной активности МИГИ от технологии его производства и времени гидролиза

усовершенствование технологии производства мидийного гидролизата, связанного с заменой кислотного гидролиза на ферментативно-кислотный с использованием протесщитического фермента протосубтилина, выделенного из бактерий васпаш вивпш, что позволило масштабировать производство вследствие исключения ручного труда, не повлияло на степень выраженности его вирусингибирующего действия. сравнительное изучение в реакции нейтрализации на куриных эмбрионах вирусингиьирующих потенций образцов мидийного гидролизата, приготовленного указанными способами не выявило достоверных различий в их активности. различия в снижении инфекционной активности вируса гриппа под действием кислотного и ферментативно-кислоггного гидролизатов мидий составляли менее одного логарифма: образцы, полученные методом кислотного гидролиза снижали инфекционный титр вируса гриппа в среднем на 3,0 ^ ЭИД50 (р<0,05), ферментативно-кислотным- 3,68 ^ ЭИД50 (р<0,05).

аналогичные данные были получены и в культуре ХАО. аппликация препарата (МИГИ-К) в разведении 1/10 в культуру ХАО за 2 часа до заражения снижала инфекционный титр вируса гриппа типа А/НЗШ на 2,25 1$ ТИД50 (р<0,01), МИГИ-ФК - на 2,5 ТИД50 (р<0,01). получешше результаты дали возможность перейти на ферментативно-кислотную технологию, это значительно сократило трудоемкость и продолжительность технологического процесса и позволило масштабировать производство препарата.

Реакция нейтрализации, как информативный и легко воспроизводимый тест использована также для решения вопросов оптимизации продолжительности гидролиза при

производстве препарата. Изучена антивирусная активность проб МИГИ, взятых на разные сроки

от начала гидролиза, от 8 до 28 часов с интервалом в 2 часа наиболее стабильные результаты получены при 20-24 часах гидролиза снижение инфекционного титра вируса гриппа в эти сроки колебалось в пределах 3,0+0,5 ^ ЭИД50

Таким образом, при изучении вирусингибирующего действия мидийного гидролизата в опытах шугпю выявлено, что

♦ почти все образцы мидийного гидролизата, независимо от источника сырья для получения, обладали антигриппозной активностью. наиболее высокие антивирусные свойства выявлены у образцов препарата из мидий, выловленных в белом море, которые снижали репродукцию вируса гриппа на КЭ на 4,0-6,0 ¡¡> ЭИД50 ;

♦ МИГИ обладал широким спектюм антивирусного действия в отношении 2 серотипов вируса гриппа А: А(НЗШ), А(НШ1) и в отношении вируса гриппа типа В;

У5-

♦ замена кислотного способа гидролиза на ферментативно-кислотный с использованием фермента протосубтилина не повлияла на антивирусные свойства препарата, но значительно сократила трудоемкость и продолжительность гидролиза;

♦ наиболее стабильные результаты по антивирусному действию препарата 3 афиксированы при продолжительности гидролиз а в 20-24 часа.

результаты, полученные нами по изучению антивирусного действия МИГИ в реакциях 1м \ttro, послужили основанием для испытания его в опытах мугго.

3. Изучение антивирусной активности мпдпйпого гидролизата при экспериментальном

гриппе животных

антивирусную активность гидролизата мидий ш у1уо определяли на модели 2-х видов животных: белых мышах и морских свинках. Для заражения животных использовали токсигенный для мышей штамм вируса гриппа - А/виктория/35/72(НЗМ2) и не адаптированный к мышам штамм вируса гриппа А/миссисипи/1/85 (Н3№).

3.1. Антитоксическое действие МИГИ полученного из разных источников сырья. Влияние

концентрации и способа аппликации препарата на уровень его антивирусной активности.

Изучение антитоксического действия мидийного гидролизата на мышах, зараженных токсигенным штаммом вируса гриппа А/виктория/35А72 (Н3№), показало, что препарат, введенный мышам за 5 часов до заражения, оказывал защитное действие. степень защиты (частота выживаемости) мышей зависели от исходного сырья, концентрации препарата, времени его введения по отношению к заражению и в меньшей степени от способа аппликации.

сравнительное изучение различных образцов гидролизата, полученных из сырья черноморских и беломорских мидий, проведенное в 15 экспериментах, выявило различие в их

активности. Достоверное антитоксическое действие - ( 59,5-64,7)% (р<0,001) защиты животных

отмечали при использовании гидролизата из черноморских мидий в дозе 0,5 мл/кг, в то время, как препарат из беломорских мддий проявлял максимальную активность в дозе 0,12 мл/кг- (51,9-84,0)% (р<0,001). в контрольных группах животных, получавших физиологический раствор

вместо МИГИ, процент выживших животных составлял 13,3+5,1% в разных экспериментах (

табл.3 ).

Выявленные преимущества гидролизата из беломорских мидий коррелировали с результатами, полученными при изучении вирусингибирующего действия МИГИ из беломорских мидий в опытах 1к углю. Достоверные результаты при профилактическом введении МИГИ в опытах на животных обнаружены и при больших разведениях препарата: от 1/600 до 1/1000. Частота выживаемости животных в опытных группах при пероралыюй аппликации препарата составляла ( 45,4 - 54,0 )% (р<0,01-0,001), при интраназальной аппликации - ( 39,1-42,4 )% (р<0,01) при 6,5% выживших животных в контроле. При этом количество выживших животных в экспериментальных группах увеличивалось по сравнению с контролем в 6 - 8 раз. При использовании тест-препарата - ремантадина в дозе 50 мг/кг, введенного перорально, однократно за 5 часов до заражения выживало ( 54 -72 )% (р<0,01) инфицированных животных в разных экспериментах. Выявленная антитоксическая активность мидийного гидролизата зафиксирована нами при введении МИШ по профилактической схеме.

Таблица 1.

ВЫЖИВАЕМОСТЬ МЫШЕЙ, ЗАРАЖЕННЫХ ТОКСИГЕННЫМ ШТАММОМ ВИРУСА ГРИППА А/ВИКТОРИЯ/35/72, ПРИ ВВЕДЕНИИ МИДИЙНОГО

гидролизата, приготовленного из разных исгочникоа

Способ введения препарата

Образцы МИГИ разввде- ние препарата Шрогалыю Интраназалыю

Концентрация МИГИ (мл/кг веса животных) всего животных выжило % выживших М+я Концентрация миги (мл/кг веса животных) всего животных выжило % выживших М+И

МИГИ 1/10 V 10 4 40,0+16,5 0,5 18 10 55+12,0««»

из черно- 1/50 0,5 51 33 64,746,8"» 0,1 42 25 59,5+7,9***

морских 1/100 0,25 22 9 40,9+10,7* 0,05 19 11 57,9+11,6"*

мидий 1/200 контроль вируса 0,125 18 46 2 6 11,1+7,6 13,0+5,0 0j025 11 3 27,3+13,1

№3 МИГИ 1/100 0,25 21 8 38,1+10,9"* 0,05 21 9 42^+11,1*

из бело- 1/200 0,125 31 26 84,0+6,7**« oflls 52 27 51,9+6,9»*«

морских 1/400 0,062 21 11 52,4+11,2" 0,012 20 9 45^+11,4*

мидий 1/800 контроль вируса 0,031 18 45 3 6 16,6+9,0 13Д+5Д 0,006 11 3 27,3+13,1

ремантадин 50М1/КГ 20 14 72,0+10,3**

Примечание: 1.*р<0,05, •» р<0,01,*«»р< 0,001. Препарат введеп за 5 часов до заражения, однократно.

2. Заражающая дотл вируса - 10ДЦ50Л),1 мл

мы пока затрудняемся объяснить почему образцы препарата полученные из беломорских мидий активнее образцов, полученных из черноморских мидий, хотя по физико-химическим параметрам, заложенным ВОВФС iiа вир амид, данные образцы были идентичны.

при испытании разных способов аппликации мидийного гидролизата антитоксический эффект был менее выражен при внутрибрюшинном введении, в то время как защита при интраназальной и оральной аппликации была одного порядка. В среднем, различие в защитном действие МИГИ при указанных способах введения не превышало 10-15,0% и колебалось впользу перорального, либо интраназального методов от опыта к опыту с разными образцами препарата.

3.2.антитоксическое действие мидийного гидролизата в зависимости от способа гидролиза и сроков введения препарата

В связи с модификацией технологии производства мидийного гидролизата пговвдено сравнительное изучение активности препаратов, полученных по двум схемам, в опытах на мышах, зараженных токсигенным вирусом гриппа А/виктория/35/72. предварительное изучение вирусингибирующего действия МИГИ в опытах in vitro выявило близкую по значению ингибицию вирусной активности образцов, полученных кислотным или ферментативно -кислотным способами. заражение мышей токсигенным штаммом вируса на фоне перорального введения образцов показало, что при 100% гибели животных в контрольной группе, МИГИ-К защищал 47,6% иМИГИ-ФК -57,1% (р<0,001) инфицированных животных.

полученные в опытах in vitro и in vivo результаты свидетельствуют, что изменение технологической схемы производства мидийного гидролизата не привело к снижению активности препаратов. антивирусное действие обоих препаратов было аналогичным.

антивирусную активность МИГИ исследовали на разных сроках введения препарата по отношению к заражению животных; за 48, 24 и 5 часов до заражения и 5, 24 часа спустя после заражения. при этом показатель защиты животных при интраназальном способе аппликации составлял (52,6; 60,0; и 52,0 )% ( Р<0,05Х соответственно, при пероральной аппликации МИГИ -<35,8; 52,9 и 84,0)% (р<0,05-0,001), соответственно. Количество выживших животных в контрольных группах составляло ( 13,9-18,3 )% Хсггя при обоих способах аппликации препарата на сроках 24 и 48 часов до заражения показатели выживаемости мышей статистически значимо отличались от контроля в пользу групп мышей с препаратом, сравнение этих же результатов с данными, полученными при введении препарата за 5 часов до заражения, свидетельствовало о лучших результатах у последних, особенно при плюральном способе введения: выживало до 84% инфицированных животных (р<0,001).

Таким образом, результаты изучения частоты выживаемости мышей при введении МИГИ на разных стоках до заражения их токсигенным штаммом вируса гриппа, свидетельствует о наличии защитного действия препарата при профилактическом его применении.

Антитоксическое действие мидийного гидролизата в опытах на мышах при использовании его после заражения, по лечебной схеме, было менее выражено. Достоверное увеличение частоты выживаемости животных до 42% (р< 0,05) по сравнению с контролем, где

выживало 9-14% животных, наблюдали при введении препарата пероралыю через 24 часа после заражения. При интраназальном способе аппликации МИГИ в эти же сроки частота выживаемости составила 24% ( РХ),05 ). Тем не менее, результаты экспериментов, полученные при аппликации препаратапо лечебной схеме дают основание говорить о тенденции к снижению частоты гибели животных и о лечебном эффекте мидийного гидролиз ata.

По-видимому, из-за сложного многокомпонентного состава препарата, мидий шй гидролизат обладает не только этиоггропным действием, но антиоксидангным и иммуномодулирующим действием, т.е. необходимо время для запуска тех механизмов антивирусной защиты, которые обеспечивают выживаемость животных при заражении их токсигенным штаммом вирус а гриппа.

З.З.Изучение антивирусного действия МИГИ на экспериментальных моделях с нетоксигенным штаммом вируса гриппа

Антивирусное действие МИГИ на экспериментальных моделях с нетоксигенным штаммом вируса гриппа А/Миссисипи/1/85 (H3N2) оценивали по снижению содержания вируса гриппа в носовых смывах и по снижению репродукции вируса в легких опытных и контрольных групп животных.

Опыты по обнаружению вируса гриппа в смывах от инфицированных морских свинок, получавших мидийный гидролизат дважды в день в течение 3-х суток после заражения вирусом гриппа А/Миссисипи/1/85, выявили, что частота обнаружения вируса в смывах на протяжении трех дней после введения препарата отличалась лишь на 11-17% от контрольной ( р>0,05).

При сравнительном титровании на куриных эмбрионах объединенных образцов легких, взятых от мышей, зараженных 1, 10, 100 ид50/0.1мл нетоксигенного вируса гриша А/Миссисипи/1/85 (H3N2), выявлено различие в содержании вируса в легких мышей, получавших МИГИ перорально в разведении 1/200, это различие составляло 1,75 lg при 1ИД50 и 0,75 lg при 10 ИД50- На основании изложенного можно предположить, что антитоксическое действие мидийного гидролизата обусловлено не только снижением содержания вируса в легких, но и связано с другими факторами защиты: например, с предотвращением токсикоза и связанных с ним нарушений - отека легких, каппиляротоксикоза и других проявлений, а также со способностью МИГИ вызывать образование гамма - интерферона и активацией в связи с этим клеточных факторов иммунитета.

4. Изучение влияния мидийного гидролюата на иммуногенез при экспериментальной гриппозной инфекции, вакцинальном процессе и определение его интерфероногенного действия

Изучение влияния мидийного гидролизата на иммуногенез при экспериментальной гриппозной инфекции и вакцинальном процессе проводили на модели животных ( белых мышах и морских свинках), инфицированных вирусом гриппа, либо мышах, вакцинированных инакгивированной гриппозной хроматографической вакциной, приготовленной в лаборатории для экспериментальных целей из штамма вируса гриша А/миссисипи/1/85 (H3N2).

ПРИ сочетанном введении ИГХВ И мидийного гидролизата перорально в разведении 1/200 обнаружить достоверный диагноститеский прирост среднего геометрического титра антител не

удалось, увеличение СГТА не превышало 0,4 - 0,7 log 2 (в 1,3 - 1,5 раза). ЭТО связано прежде всего с тем, что инактивированная гриппозная вакцина сама является сильным антигенным раздражителем, на который формируется высокий уровень гуморальных антител. однако, выводы по данным экспериментам делать преждевременно, необходимо провести параллельные клинические исследования на волонтерах или добровольцах, иммунизированных ИГХВ.

при экспериментальной гриппозной инфекции на мышах ( штамм А/виктория/35/72 в нетоксичной дозе ) введение мидийного гидрояизата стимулировало антителообразование. Уровень антигемагглютинирующих антител возрастал в 2,0-2,6 раза в зависимости от способа введения препарата: при пероральном введении зафиксировано увеличение СГТА в 2,6 раза, при шгграназальной аппликации - в 2,0 раза, при в1гутрибрюшинном введении - в 2,3 раза по сравнению с контрольной группой инфицированных мышей, не получавших препарат. при этом вариации стоков введения МИГИ не отражались на результатах эксперимента, при всех испытанных сроках ( за 5, 24 и 48 часов до заражения ) уровень антигемагглютинирующих антител возрастал в 2,1-2,8 раза ( р<0,001) ( табл. 4 ).

Таблица 4.

ИММУННЫЙ ОТВЕТ МЫШЕЙ, ИНФИЦИРОВАННЫХ ВИРУСОМ ГРИППА А/МИССИСИПИ/1/85, НА ФОНЕ ПРОФИЛАКТИЧЕСКОГО ВВЕДЕНИЯ МИДИЙНОГО ГИДРОЛИЗАТА

Способ вве- Время введения препарата Количество мышей в СГТА кратность при-

дения МИГИ (час.) группах log 2 Х±ш числовые значения роста титра антител ♦р

-48 20 10.6+0.2» 1560 2.8 <0,001

интраназально -24 18 10.4+0.2» 1350 2.4 <0,001

-5 20 10.2+0.2» 1175 2.1 <0,001

перорально -24 17 10.3±0.3» 1270 2.3 <0,01

-5 18 10.3+0.3» 1270 2.3 <0,01

контроль 0 20 9.1+0.2 549 0

вируса

В опытах на морских свинках, инфицированных вирусом гриппа А/Миссисипи/1/85 (НЗЫ2) и получавших мидийный гидролизат по лечебной схеме перорально, интраназально, либо сочетакным способом, наилучшие результаты получены при пероральном и пероралыю-интраназальном способах аппликации МИГИ: прирост титра антител по сравнению с контрольной группой инфицирова1шых животных, не получавших препарат, составлял в среднем 2,8 и 2,5 раза( р<0,01), соответственно.

следовательно, введение мидийного гидголизата положительно влияло на иммуногенез при экспериментальном гриппе животных, стимулируя образование антигемагглютинирующих антител в два и более раза

Результаты этих экспериментов напши свое подтверждение в клинических испытаниях Вирамида при иммунологическом обследовании здоровых добровольцев и больных гриппом

пациентов, получавших мидийный гидролизат. Было обнаружено, что мидийный гидролизат оказывал влияние на в-клеточный иммунитет, повышая биосинтез иммуноглобулинов класса A.M.G уже через сутки после приема препарата, особенно при интраназальном способе аппликации МИГИ. поликлональная или избирательная стимуляция продукции иммуноглобулинов имела место и на 14 сутки наблюдения. кроме того показано, что хотя МИГИ и не оказывал влияние на увеличение популяции Т- лимфоцитов, однако приводил к стимуляции активности синтетических процессов в них ( были обнаружены такие признаки, как перераспределение t-клеток с появлением в кровяном русле большого количества молодых постгимических предшественников T-клеток ), повышал их функциональную активность (

Кубарь ОД идр., 1994,1998; StepanovaL. et al., 1995).

Было обнаружено, что МИГИ улучшал показатели неспецифической резистентности организма к вирусной и бактериальной инфекции: повышался уровень секреции пероксида, продуцируемого макрофагами, повышался уровень миграционной активности лейкоцитов периферической крови, увеличивалось содержание лизоцима и Ig А в слюне, особенно у людей с исходно низкими показателями ( кубарь О.И. и др., 1994, 1998; Stepanova L. et al., 1995; гагаринова В.M. идр., 1996; Бичурина MA. и др., 1998,1999).

Изучение интерфероногенных потенций МИШ на модели лейкоцитов донорской крови , выявило способность препарата в разведении от 1/100 до 1/1000 индуцировать интерферон на сроках 20 -72 часа Оптимальные результаты зафиксированы при внесении препарата в культуру клеток в разввдении 1/850, при этом разведении содержание интерферона в культуре ткани на 3-и сутки составляло 48 me. По срокам образования и антигенным характеристикам интерферон, индуцированный мцдийным гидролизатом, отнесен ко второму типу -у- интерферонов.

Данные об интерферониндуцирующей активности МИГИ были подтверждены

клиническими испытаниями мидийного гидролшата при лечении вирусного гепатита а у детей 3-14 лет препаратом, полученным на основе мидийного гидролизата, в дозе 5-10 мл в сутки перорально. (рейзис а.о. и др., 1995). было обнаружено его нлияние на интерфероногенез, о состоянии которого судили по уровню сывороточного интерферона и способности лейкоцитов

крови к выработке а- и у - интерферонов в ответ на вирусную стимуляцию. Лечение

предлагаемым способом в среднем в 2-2,5 раза повышало показатели интерферонового статуса по сравнению с контролем, нормализовало функциональную активность макрофагов, существенно ускоряло снижение тимоловой пробы, снижало активность фермента апанинаминотрансферазы (AlAT), нормализовало уровень билирубина в гепатоцитах (рейзис а.о. идр.,1995).

Итак, опираясь на экспериментальные данные, полученные in vivo, и на результаты при

исследовании антивирусной активности мидийного гцдролизата на людях, можно предположить, что способность мышей при экспериментальной гриппозной инфекции, зараженных токсигенным штаммом вируса гриппа а/виктория/35/72, к выживаемости при профилактическом назначении МИГИ обусловлена целым комплексом факторов, задействованных в организме мцдийным гидролизатом. можно предположить, что вследствии многокомпонентности субстрата на каждом этапе его взаимодействия с организмом включаются разные факторы защиты. это может быть обусловлено как ингибицией репродукции вируса гриппа в присутствии препарата, так и индукцией у - интерферона и активацией в связи с

этим клеточных факторов иммунитета и их функциональной активности. наши данные согласуются с реэультами исследований цыбульского A.B. и соавтор., 1989, 1990; протасовой С.ф.,1996; в которых было показано, что препараты, способные вызывать образование эндогенного интерферона, в основном типа у, активизировали системы мононуклеарных фагоцитов, эффекторы зависимой от антител клеточной цитотоксичности, увеличивали количество полиморфноядерных лейкоцитов, стимулировали выработку интерлейкина-2, функциональную активность естественных киллеров, цитоксичность и фагоцитарную активность макрофагов пги экспериментальной гриппозной инфекции на мышах

Кроме того, благодаря наличию в мидийном пэдролизате фракции полиненасыщенных жирных кислот, препарат может обладать антиоксидантным действием, т.е. блокировать действие фермента липидной пероксидазы и образование продуктов пол и тем самым, препятствовать проникновению вируса через мембрану клетки. Так в клинике при лечении бронхиальной астмы, хронического обсштсгивного бронхита и тяжелых форм гриппа было

показано, что препараты, содержащие полиненысыщенные жирные кислоты, активизируют кислоюдтранспортную функцию крови, нормализуя дыхание в тканях с наиболее высоким уровнем активности: головной мозг, легкие, сердечная мышца, печень ( бурбелло а.т. и др. 1996 ,

Исаков В.А. и др, 1994).

В итоге ( по разделам 3 - 4 ) можно заключить, что проведенные на модели вирусов гриппа экспериментальные исследования по изучению вирусингжирующих потенций мидийного гидролизата в опытах IN VIVO выявили, что

• миги, приготовленный из разных источников сырья (черноморских и беломорских мидий) обладал антитоксическим действием при экспериментальной гриппозной инфекции на мышах, защищая 53-84 % животных от гибели при 6,5-13%выжившихживотныхвконтроле;

• а1гпггоксическое действие МИГИ отмечали при разных способах введения препарата: перорально, интраназально, парентерально;

• замена кислотного способа гидролиза мидий на ферментативно-кислотпый в процессе приготовления препарата не повлияла на антивирусные свойства мидийного гидролизата: профилактическая аппликация МИГИ-К защищала 47,6% инфицированных животных, МИГИ-ФК - 57,1%, при 100 % гибели животных в контроле;

• МИГИ обладал иммун0м0дулиру10щим действием при экспериментальной гриппозной инфекции, вызванной нетоксигенным штаммом вируса гриппа, повышая средние геометрические титры аптигемагглютинирующих антител в 2,0 - 2,6 раза на мышах и в 2,52,8 раза на морских свинках. это явление отмечали как при профилактической, так и при лечебной схемах аппликации препарата.

• в культуре лейкоцитов периферической крови in vttko МИГИ способен индуцировать синтез у -интерферона.

по своей активности в экспериментах изучаемый препарат сопоставим с широко используемым в настоящее время ремантадином. хотя, в отличие от химически синтезированного ремантадина, мидийный гидролизат является биологически активным естественным продуктом, МИГИ активен не только при пероралыюй, но и иштаназалыюй аппликации; оказывает иммупомодулирующее действие не только при экспериментальной гриппозной инфекции , но и, как показали дальнейшие исследования, индуцировал синтез

2.2

лизоцима и иммуноглобулинов у людей, нормализуя при этом показатели т- и в -клеточного иммунитета. МИГИ, в отличие от ремантадина, обладал интерферошщдуцирующей активностью, что было потверждено дальнейшими клиническими испытаниями препарата ( рейзис АО. и др., 1995).

Полученные данные позволили перейти к следующим этапам изучения мидийного гидролизата. Проверка безвредности мидийного гидролизата на 20 здоровых добровольцах показала отсутствие каких-либо побочных явлений при разных способах (оральный, интраназальный) его применения.

на основании представленных в работе даннных в фармакологический

Государственный Комитет МЗ РФ направлен проект Временной Фармакопейной Статьи (ВФС) на антивирусный препарат (Вирамид) и пояснительная записка с отчетом о специфической активности МИГИ (Вирамида) для разрешения клинических испытаний (2-ая фаза) по изучению терапевтической эффективности у больных гриппом и ОРВИ.

Завершены клинические испытания Вир амида (2-ая фаза) у больных гриппом и ОРВИ, проведенные в 3-х клиниках: диспансерно-поликлиническом отделении НИИЭМ им. Пастера МЗ РФ, Военно-медицинской академии (г. С.-Петербург) и ВНИИ гриппа РАМН и отправлен отчет в ФПС МЗ РФ «О клиническом исследовании препарата вирамид (МИГИ-К, МИГИ-ФК) в качестве противовирусного средства у взрослых при гриппе и других ОРВИ ». Полученные данные свидетельствовали, что препарат не оказывал отрицательного влияния на состояние организма взрослого человека, его терапевтическое действие сопоставимо с действием противогриппозного препарата ремантадин. Применение Вирамида при гриппе и ОРВИ способствовало сокращению развития осложненного течения заболевания. Кроме того, в отличие от ремантадина, Вирамид, по данным иммунологического исследования, нормализовал показатели Т-клеточного иммунитета, стимулировал функцию В-клеток, повышая продукцию иммуноглобулинов класса А, М, в, активизировал факторы неспецифической резистентности

организма к вирусной инфекции.

Получено заключение Государственного института доклинической и клинической экспертизы лекарств МЗ РФ о передаче материалов для рассмотрения в Фармакопейный и Фармакологический государственные комитеты с целью разрешения медицинского примене1ия Вирамида в комплексной терапии больных гриппом и ОРВИ.

На Президиуме Фармакопейного Государственна) Комитета МЗ РФ утверждена новая Фармакопейная статья предприятия на препарат Вирамид .

Материалы работы и результаты по клиническому изучению антивирусной активности Вирамида использованы при составлении практических рекомендаций для врачей «Неспецифическая профилактика гриппа и ОРЗ среди рабочих промышленных предприятий» (СПб.,19% г.)

5. Изучение вирусингибирующих потенций мидийного гидролизата в опытах га утю в отношении вирусов простого герпеса I и П типов и вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1)

Вирусингибирующие потенции МИГИ в отношении других ДНК- и РНК-содержащих вирусов были изучены на модели наиболее актуальных для настоящего времени возбудителей

заболеваний - вирусах простого герпеса 1-го и п-го типов и вирусе иммунодефицита человека

(ВИЧ-1).

5.1.изучение вирусингибируюпмх потенций мидийного гидролизата в опытах in vitro в отношении вируса простого герпеса1 типа

антивирусную активность мидийного гидролизата в отношении вируса простого герпеса i типа определяли м vitro на культуре ткани - RK-13. В исследованиях использовали нетоксичное для культуры ткани разведение мидийного гидролизата 1/64. ЗА минимальную токсичную дозу МИГИ для культуры ткани RK-13 принимали разведение препарата 1/32.

проведенные исследования позволили выявить вирусингибирующее действие мидийного гидролизата при всех модификациях опыта' пги введении препарата в культуру ткани за 2 часа до заражения, 2 часа спустя после заражения и при нейтрализации вируса в пробирках с последующим заражением культуры ткани.

Снижение инфекционной активности вируса простого герпеса 1-го типа под действием МИГИ составляло 3,0-5,0 lg ТЦД50 при профилактической и 2,0-5,5 lg при лечебной схемах введения при заражающей дозе вируса 10 -100 ИТД50/0.2мл (рис. 2). антивирусное действие мидийного гидролизата зафиксировано как с однократным внесением дозы препарата в культуру ткани после заражения ВПГ-1, так и при ежедневной смене кулътуральной среды и препарата в опытных и контрольных рядах на протяжении всего срока наблюдения эксперимента: снижение инфекционной активности ВПГ-1 составляло 1,5-2,5 lg ТЦД50 в первые 2-ое суток наблюдения и 3,0 lgTU550 на4 сутки наблюдения.

В реакции нейтрализации ВПГ-1 в присутствии МИГИ в разведении 1/64 в пробирках с последующим заражением культуры ткани, показано снижение инфекциошюго титра вируса на 6 сутки наблюдения на 2,5-5,0 lgttjjxjo в зависимости от заражающей дозы вируса

Тест - препарат ацикловир (виролекс) ф. Wellcome Foundation в дозе 10 мкг/мл снижал репродукцию вируса ВПГ-1 на культуре ткани RK-13 iia 3,3 lg ТЦД50.

5.2. Изучение противовирусной активности МИГИ в отношении вируса простого герпеса П типа

в культуре клеток vero

Исследования антивирусной активности МИГИ в отношении ВПГ-2 проводили на

культуре клеток vero с предварительным подбором минимальной нетоксичной дозы мидийного гидролизата для культуры клеток. В эксперименте использовали МИШ в разведении1/64, что составляло 1/2 от МТД на культуре клеток vero.

было обнаружено, что при различных заражающих дозах вируса ВПГ-2 от 10 до 10000 ИТД5 0/0,2 мл, аппликация препарата за 2 часа до заражения снижала инфекционный титр вируса от 2,0 до 3,5 lg тцд50, аппликация препарата спустя 2 часа после заражения снижала инфекционный титр вируса ВПГ-2 в среднем на 2,5 ^ТЦД5() (гис.з ).

Таким образом, мидийный гидролизат зарекомендовал себя как перспективный препарат в отношении днк- содержащих вирусов. выраженная инпибиция отмечена при всех схемах введения МИГИ в культуру клеток. Использование изученных схем аппликации препарата по отношению к инфицированию культуры ткани ВПГ -1 и П-го типов свидетельствуют о том, что МИГИ либо блокирует процесс адсорбции вируса на клетку, либо процесс декапсидации вирусов,

Рис.2. Влияние МИГИ на репродукцию ВПГ-1 в культуре клеток ЯК-13

(лечебная схема)

- •КВ1ИТД50 -О—МИГИ+1ИТД50 *--кв10ИТД50 -А—МИГИ+10 ИТД50 0--ИВ100ИТД50 ■О—МИГИ+100 ИТД50

Примечанием-ый вариант- препарат МИГИ вносили в культуру ткани однократно

3 4 5

время наблюдения в (сут.)

го

Рис.3. Влияние МИГИ на репродукцию ВПГ-2 в культуре клеток vero.

Инфекц. акт.вируса в lg ТЦД50/0,2мл

100 1000 ИТД50/0,2мл

□ КВ ВПГ-2 В МИГИ (-2ч) ИМИГИ(+2ч)

|V>

10000

Примечание:результаты эксперимента на 5 сутки наблюдения

либо ранние стадии репликации (т.е. может выступать как ингибитор кепирования или ингибитор вирусспецифических синтезов), но для выяснения этого потребуется проведение дополнительных молекулярно-биологических исследований

Данные по экспериментальному изучению МИГИ в отношении вирусов простого герпеса i и п типов in vttro позволили составить отчет об экспериментальном изучении антивирусной активности МИГИ в отношении вирусов герпеса i и п-го типов и программу клинических испытаний вирамида при герпетической инфекции при местном применении и направитьв ФГК

МЗРФ.

5.3. Влияние МИГИ на репродукцию вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) in vttro

Влияние МИГИ на репродукцию ВИЧ-1 исследовали на культуре клеток МТ-4 с предварительным подбором минимальной нетоксичной для культуры клеток дозы мидийного гидролизата, которая составляла 1/50. вирусингибирующий эффект препарата в отношении ВИЧ-1 оценивали при разном временном режиме по отношению к заражению, в реакции нейтрализации с последующим заражением культуры ткани и при сочетанной аппликации AZT и МИГИ.

Препарат оказывал вирусингибирукяцее действие при использовании лечебной схемы его введения. При введении его в культуру клеток по лечебной схеме при множественности заражения 0,01-0,1 тцд50/кл, мидийный гидролизат проявлял вирусингибирующее действие, которое отчетливо регистрировали на 3 сутки (угнетение синцитиеобразования на 50% и продукции антигена р-24 на 92-96%) и было менее выражено на 6 сутки - ингибиция уровня р24 антигенавич-1 на 81% при 100% ингибиции тест-препаратом AZT в дозе 1мкг/мл. МИГИ снижал инфекционный титр вирусавич-1 в реакции нейтрализации на 2,5 lg ТЦД50.

в многофакторном эксперименте, спланированном на основе математической модели, где использовались разные концентрации препаратов и заражающие дозы вируса при лечебной схеме введения препаратов по отношению к заражению культуры ткани, антивирусная активность мидийного гидролизата, использованного в малых дозах на фоне малых доз азидотимидин а была в 4 раза ниже эталонного препарата. однако, при сравнении использования максимальной дозы МИГИ (разведении 1/50) с AZT в концентрации 0,1 мкг/мл, уровень ингибирующей активности был одинаков ( рис.4). суммарный эффект выявить не удалось, поскольку при использовании только AZT даже в минимально используемой в данном эксперименте дозе, имела место полная ингибиция репродукции вируса вероятно, в дальнейших исследованиях следует идти по пути снижения дозы AZT при комплексном его использовании с максимальной концентрацией МИГИ.

Учитывая вирусингибирующий эффект МИГИ на вирус ВИЧ-1 в эксперименте, а также многофакторное воздействие препарата на организм, что было показано ранее (образование интерферона, повышение уровня иммуноглобулинов, влияние на функцию Т- и В - клеток ), можно предположить перспективность его использования в комплексной терапии ВИЧ-инфекции.

Рис.4. Влияние сочетанного применения МИГИ и А2ПГ на уровень р24 антигена

ВИЧ-1 в культуре клеток МТ-4.

1400-

1200-

1000

1280

титр антигена р-24, обратные величины

800

600

400

200

Го

1 2 3

Примечание : заражающая доза вируса-0,1 ТЦД50/кл;1-минимальные концентрации (МИГИ 1/800 и А2Т 0,1 мкг/мл); 2-средние концентрации (МИГИ 1/200 и А2ПГ1 мкг/мл), 3-максимапьные концентрации ( МИГИ 1/50 и Агт 10 мкг/мл).

выводы.

1. Впервые показано, что мидийный гидролизат обладает вирусингибирующим действием в отношении вирусов гриппа в опытах ш vitro. В реакции нейтрализации под воздействием препарата инфекционная активность вируса гриппа A/H3N2 снижалась на 3,0-6,0 lg ЭИД50, A/HlNl-2,5-5,0 lg ЭИД50, B-2,0-6,J lg ЭИДго в зависимости от партии препарата В культуре хао мидийный гидролизат снижал инфекционную активность вирусов гриппа а и В на 1,75-3,5 lg ТИД50.

2. Выявлена антивирусная активность мидийного гидролизата в опытах in vivo на мышах, зараженных токсигенным штаммом вируса гриппа А/Виктория/35/72. Аппликация препарата за 5 часов до заражения защищала от гибели 53-84 % животных в зависимости от исходного материала, использованного для приготовления препарата. при введении препарата после заражения антитоксическая активность МИГИ была менее выражена, хотя регулярно отмечалась тенденция к сокращению числа погибших животных

3. мидийный гидролизат, полученный методом кислотного или ферментативно-кислотного гидролиза обладал аналогичным антивирусным действием. при заражении мышей токсигенным штаммом вируса гриппа а/виктория/35/72, защита мышей, получавших МИГИ-кислотный /или МИГИ-ферментативно-кислогный, составила 47,6% и 57,1%, соответственно, при 100% гибели животных в контроле. внедрение в технологию производства МИГИ метода ферментативно-кислотного гидролиза значительно сократило трудоемкость и продолжительность производственного процесса, дало возможность масштабировать его производство.

4. мидийный гидролизат при экспериментальном гриппе у мышей и морских свинок стимулировал специфический противогриппозный иммунитет, как при профилактической, так и при лечебной схемах аппликации миги. уровень антигемагглютинирующих антител возрастал в 2,0 раза при интраназальной и в 2,6 раза при пероральной аппликации препарата.

в культуре лейкоцитов донорской крови препарат индуцировал синтез гамма-интерферона.

5. Выявлена вирусингибирующая активность мидийного гидролизата в отношении вирусов

простого герпеса i ип типов и вируса иммунодефицита (ВИЧ-1).

Препарат ингибировал репродукцию вирусов герпеса в культуре RK-13 и VERO, снижая инфекционную активность вируса ВПГ-1 наз,0-5,0 lg ТЦД50, ВПГ-2 -яа 2,0-3,5 lg ТЦД50-

В отношении ВИЧ-1 зафиксировано достоверное снижение инфекционной активности ВИЧ-1 под действием мидийного гидролизата (угнетение синцитиеобразования на 50% и продукции антигена Р-24 на 92-96,0 %) на 3 -и сутки наблюдения при лечебной схеме введения. В реакции нейтрализации мидийный гидролизат снижал инфекционный титр вируса на 2,5 lg ТЦД50.

Список работ ■ опубликованных по материалам диссертации.

1. БичуринаМ.А, Никитина Л.Е., СоветоваМГ. и дрУ/ Новый антивирусный препарат на основе мидийногогидролизата. Сб. научи, тр." Актуальные проблемы инфекционной патологии" - СПб.,

1993.-Ч1.-С. 107.

2. Бичурина М.Л, СоветоваМГ., НикитинаЛ.Е., Бойков Ю.А, Тарос Л.Ю.// Вирусингибирующая активность препарата из мидий (вир амида) в эксперименте. Сб. научн. тр. НИИ грипп а РАМН "Новые подходы к целенаправленному конструированию противовирусных препаратов",-СПб.,

1994.-С.19.

3. Бичурина М.А., Советова М.Г., Никитина Л.Е., Рехина НЛЗеседина Т.В., Бойков Ю.А., Тарос ДЮ., Смольская Т.Т., Коровина Г.И.// Экспериментальное подтверждение вирусингибирующих свойств препарата из мидий- вирамида (МИГИ-К, ЛП). Мат. П Рос. нац. конгр. "Человек и лекарство ".-Москва .-1995.-C .187.

4. KUBAR О., BlCHURINA М., NlKTINA L., SOVETOVA М., STEPANOVA L. // FIRST PHASE OF CLINICAL TRIEL NEW ANTIVIRAL DRUG- VIRAMID. J. ANTIVIRAL RESEARCH.-1994.-№3. -P.185.

5. BlCHURINA M., NKITINA L., SOVETOVA M., REHINA N„ BESEDINA Т., BOIKOV J. //A NEW DRUO FROM MUSSELES. THE MATERIALS OF 5-TH BIENIAL CON'F. OF INTECT. DIS.- SALZBURG, AUSTRIA.- 1994.-P.119.

6. BlCHURINA M., NlKTTINA L., SOVETOVA V. ET AL// VlRAMID IS THE NEW ANTIVIRAL DRUO .- MATERIALS OF 7-TH INTERNATIONALCONF. OF COMPERATIVE AND APPLIED VIR0L0GY.-M0NREAL,CANADA.-1994.-P.121.

7. BlCHURINA М., TAROS L., sovetova M., smolskaya Т., korov1na G., BOIKOV J., stepanova L. Paskonkina О. И Studies of the new antiviral drug from the musselles in the experiments and in adults. Abstracts of Joint mettino" Progress in clinical virology", Praque.-1995.-P.301.

8. BlCHURINA M.,KUBAR O.,boikov J., SOVETOVA M., TAROS L.// THE NEW DRUO FROM THE MUSSELES WITH WIDE SPECTOR OF ANTIVIRAL ACTIVITY. IN: XXX DA.NI PREVENTIVNE MEDICINE / ZBOR.MK REaMEA. NlS.,-

19%.-P.87-88.

9. BlCHURINA M., BOIKOV J., SOVETOVA M. , NOOTINA L., STEPANOVA L., KUBAR O. // THE PREVENTION AND TREATMENT OF AVRI BY MEANS OF MUSSELES HYDROLISAT. ABSTRACTS OF X-TH INTERNATIONAL CONGRESS OF VIROLOGY.-jERUSALEM.-1996.-P. 190.

10. Гагаринова B.M..Бичурина M.A., Советова М.Г., Васильева O.B., Егоренкова В.А., Болдырева НА., Кирсанов А.И., Горбачева И.А., Шестакова JIA., Долгодворов А.Ф., Федоровой Г.И., Слепушкин АН. Кучеренко Т.П., Ротанова Т.Е., Морозова Т.е., Бирюкова Н.Г., Кириллова Т.П., Евдокимов Ю. А. // Неспецифическая профилактика гриппа и острых респираторных заболеваний среди рабочих промышленных предприятий. Практические рекомендации .- СПб.,1996,- 43 с.

11. Бичурина М.А.,Кубарь О.И., Степанова JLА, Гагаринова B.M., Советова М.Г., Бойков Ю.А // Оценка профилактической эффективности Вирамида при гриппе и ОРВИ у детей и взрослых.-Мат. международной научн. конф. к 200-летию Военно-медицинской академии "Вирусные инфекции на пороге XXI века: эпидемиология и профилактика».-Спб.,1999.-С256-257.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Советова, Марина Геннадиевна

Введение.4

Глава 1. Обзор литературы.8

1.1.Характеристика современных противовирусных препаратов, применяемых для профилактики и лечения гриппа .8

1.2.Современные препараты, используемые для лечения ВИЧ-инфекции: их достоинства и недостатки.22

1.3.антивирусные препараты, предназначенные для лечения герпесвирусных инфекций.29

Введение Диссертация по биологии, на тему "Вирусингибирующая активность препарата, полученного на основе мидийного гидролизата"

Актуальность работы. Грипп и другие острые респираторные вирусные инфекции (ОРВЙ) с постоянством занимают ведущее место в инфекционной патологии. За последние годы на грипп и другие ОРВИ приходится от 75 до 90 % всех случаев инфекционных заболеваний. Ежегодно, по статистическим данным, гриппом и ОРВИ переболевают более 70 млн. человек, хотя истинное число их значительно выше. На долю гриппа и ОРВИ приходится около 40% дней временной нетрудоспособности.

Вакцинопрофилактика в силу ряда причин, таких, как многообразие этиологических факторов, смена антигенных характеристик возбудителей, особенности индивидуального и коллективного иммунитета не в состоянии обеспечить полную защиту населения от гриппа. Поэтому поиск новых антивирусных и иммуномодулирующих препаратов остается одной из актуальных задач в системе борьбы со столь распространенной инфекционной патологией.

Широко проводимый в эксперименте скрининг соединений на предмет выявления антивирусной активности обнаружил целый ряд препаратов, обладающих вирусингибирующими потенциями: производные адамантанового ряда ( 76, 92, 148, 149, 276, 303, 309 ), аномальные нуклеозиды ( 25, 35 , 37, 168 ), препараты с антиоксидантной активностью ( 54, 80, 82 ), мукозальные и полинуклеотидные вирусные вакцины ( 41 ), индукторы интерферона (58, 59, 60,

155-157, 191 ), ингибиторы протеолиза( 5, 102, 249, 264 ) и другие вещества. Однако, дальнейшие исследования позволили пока синтезировать и довести до клинического применения только несколько препаратов противогриппозной направленности, таких как ремантадин, адапромин, дейтифорин, арбидол( 29-30, 66, 68, 70-72, 90, 94, 106, 120-121, 147, 305 ). Каждый из них, наряду с положительным клиническим эффектом обладает и некоторыми отрицательными характеристиками: формирование в процессе их применения резистентных штаммов вируса, способность кумулироваться в организме, ограниченные возможности действия некоторых препаратов в отношении вируса гриппа типа В и ремантадинустойчивых штаммов и прочие. К тому же дейтифорин производится за пределами Российской Федерации, а широкий выпуск р арбидола и адапомина в России пока не обеспечен.

Вследствии того, что попытки исследователей синтезиювать химические соединения, прерывающие те или иные этапы взаимодействия вируса с клеткой, оказывались не всегда удачны, в последние годы возрос интерес к природным биологически активным веществам, способным задействовать в организме многие факторы защиты ( 13-14,155-157, 189-190, 198, 301, 303). Такие вещества, выделенные из природного сырья растительного или морского происхождения, являются оптимальным вариантом антивирусного препарата в силу естественности для организма, суммарности по эффективности и широкого диапазона действия. Наше внимание привлек препарат, полученный методом гидролиза мягких тканей мидий и рекомендуемый авторами ( 12, 45, 63, 114 ), как пищевая добавка для лиц ослабленных хроническими заболеваниями. Ранее в НИИ медицинской радиологии и НИИ онкологии (г.Москва) было обнаружено, что мидийный гидролизат при пероральном способе введения 5 способствует выводу радионуклидов из организмз, повышает устойчивость организма к действию токсических веществ, увеличивает скорость регенерации кроветворной ткани костного мозга, укрепляет стенки капилляров, повышает уровень гемоглобина и содержание а эндогенных пртекторов в ряде тканей (111,114)

Целью данного исследования явилось изучение в эксперименте вирусингибирующей активности мидийного гидролизатл, полученного методами кислотного и ферментативно кислотного гидролиза из мягких тканей мидий mytilis edulis galloprovinaleialis на модели вируса гриппа и других РНК- и ДНК-содержащих вирусов.

Задачи настоящего исследования:

1. Изучение вирусингибирующих потенций мидийного гидролизата ( МИГИ ) в опытах ин витро на модели вируса гриппа.

2. Определение зависимости противогриппозной активности МИГИ от исходного сырья и технологических схем производства.

3. Изучение защитного действия мидийного гидролизата при экспериментальном гриппе животных.

5. Изучение вирусингибирующих потенций мидийного гидролизата в опытах ин витро в отношении ряда других вирусов, в частности вирусов простого герпеса i и ii типов и вируса иммунодефицита человека ( ВИЧ - 1 ).

Основные положения, выносимые на защиту

1. Мидийный гидролизат - продукт, полученный из мышечной ткани моллюсков mytilis edulis galloprovinaleialis обладает в эксперименте антивирусной активностью в отношении вирусов гриппа, ингибируя репродукцию вирусов гриппа типов А и В in vitro и защищая от гибели мышей при заражении последних токсигенным штаммом вируса гриппа

А. Положительные результаты получены при разных способах аппликации МИГИ по лечебной и профилактической схемам.

2. мидийный гидролизат, введенный животным перорально, интраназально или парентерально по профилактической или лечебной схемам повышает уровень специфических противогриппозных антигемагглютинирующих антител при заражении животных вирусом гриппа. При этом исследуемый препарат обладает интерфероногенным действием, индуцируя синтез гамма-интерферона в культуре клеток.

3. мидийный гидролизат обладает в опытах in vitro выраженной вирусингибирующей активностью в отношении вирусов простого герпеса 1 и 2 типов и вируса иммунодефицита человека! типа(ВИЧ-1).

Научная новизна

Впервые в опытах ин витро обнаружена вирусингибирующая активность в отношении вирусов гриппа у мидийного гидролизата - субстрата, полученного из мягких тканей мидий моллюсков mytilis edulis galloprovinaleialis методами кислотного или ферментативнокислотного гидролиза. Доказана возможность ингибиции с помощью мидийного гидролизата репродукциии вирусов гриппа типов а и в.

Впервые в опытах ин виво выявлено защитное действие мидийного гидролизата при токсическом экспериментальном гриппе животных. При разных способах аппликации мидийный гидролизат защищал от 53,0% до 84,0% животных, зараженных токсигенным штаммом вируса гриппа А/Виктория/35/72 (H3N2 ).

Обнаружено иммуномодулирующее и интерфероногенное действие мидийного гидролизата в эксперименте. Мидийный гидролизат, введенный животным по профилактической или лечебной схемам, способен увеличивать уровень антигемагглютинирующих антител в 2,0-2,8 раза в сыворотках крови животных. В культуре клеток лейкоцитов периферической крови человека мидийный гидролизат индуцировал синтез гамма-интерферона.

Впервые в опытах in vitro выявлена вирусингибирующая активность мидийного гидролизата в отношении вирусов простого герпеса I и II типов и вируса иммунодефицита человека i типа.

Практическая значимость и внедрение результатов работы.

Результаты экспериментального изучения в опытах in vitro и in vivo антивирусной активности мидийного гидролизата в отношении вируса гриппа явились обоснованием специфической активности нового антивирусного препарата Вирамида, основой которого является мидийный гидролизат. На указанный препарат составлен и направлен в ФГК МЗ РФ проект Временной Фармакопейной Статьи (ВФС) (вх.ФГК МЗ РФ №100 от 24.01.94).

Полученные экспериментальные данные и разработанная научно-техническая документация позволили получить разрешение на проведение клинических испытаний Вирамида на здоровых добровольцах (I- ая фаза) и у больных гриппом и ОРВИ (П-ая фаза). Проверка безвредности мидийного гидролизата на 20 здоровых добровольцах показала отсутствие каких-либо побочных явлений при разных способах применения препарата (отчет НИИЭМ им. Пастераот 1.01.93 по договору №04-93).

Клинические испытания Вирамида у больных гриппом и ОРВИ, проведенные в 3-х клиниках: диспансерно-поликлиническом отделение НИИЭМ им. Пастера МЗ РФ, Военно-медицинской академии (г. С.-Петербург) и ВНИИ гриппа РАМН, завершены и отправлен отчет в ФГК МЗ РФ «О клиническом исследовании препарата ВИР АМИД (МИГИ-К, МИГИ-ФК) в 7 качестве противовирусного средства у взрослых при гриппе и ОРВИ» (исх. НИИЭМ им. Пастера №522 от 31.10.95.)

Получено заключение Государственного института доклинической и клинической экспертизы лекарств МЗ РФ от 20.04.96 о том, что клинические исследования подтверждают эффективность препарата при лечении больных гриппом и ОРВИ и о передаче материалов для рассмотрения в ФГК РФ с целью разрешения медицинского применения Вир амида в комплексной терапии больных гриппом и ОРВИ (исх. ГИДКЭЛ МЗ РФ №211-5930/2-757).

На основании данных экспериментального изучения МИГИ в отношении вирусов простого герпеса I и II типов в Государственный Фармакологический Комитет МЗ РФ направлено обоснование для расширения показаний Вирамида и программа изучения терапевтической эффективности Вирамида у больных герпетической инфекцией при местном его применении (исх. НИИЭМ им. Пастера №599 от 22.12.95).

На Президиуме Фармакопейного Государственного Комитета МЗ РФ утверждена новая Фармакопейная статья предприятия на препарат Вир амид от 16.06.00.

Материалы работы использованы при составлении практических рекомендаций для врачей «Неспецифическая профилактика гриппа и ОРЗ среди рабочих промышленных предприятий » (Санкт - Петербург, 1996 г.). Апробация результатов исследования.

1994 ), П-ом Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" ( Москва, 1995 ), Международном симпозиуме "Прогресс в клинической вирусологии" ( Прага, Чехословакия,

1995 ), Х-ом Международном конгрессе по вирусологии ( Иерусалим, Израиль, 1996 ), на Международной конференции "Антиинфекционные препараты и химиотерапия" ( Лейпциг, Германия , 1996).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 11 работ. Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 13& страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списьса цитируемой литературы. Работа содержит 7 рисунков и 38 таблиц. Список цитируемой литературы включает 213 отечественных и 129 иностранных источников.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Советова, Марина Геннадиевна

HS выводы.

Впервые показано, что мидийный гвдролизат обладает вирусингибирующим действием в отношении вирусов гриппа в опытах in vitro. В реакции нейтрализации под воздействием препарата инфекционная активность вируса гриппа A/H3N2 снижалась на 3,0-6,0 логарифмов ЭИД50, A/HlNl-2,5-5,0 lg ЭИД50 , В-2,0-6,5 lg ЭИД50 в зависимости от партии препарата. В культуре ХАО мидийный гидролизат снижал инфекционную активность вирусов гриппа А и В на 1,75-3,5 lg.

Выявлена антивирусная активность мидийного гидролизата в опытах in vivo на мышах, зараженных токсигенным штаммом вируса гриппа А/Виктория/35/72. Аппликация препарата по профилактической схеме защищала от гибели 53-84 % животных в зависимости от исходного материала, использованного для приготовления препарата. При введении препарата после заражения антитоксическая активность МИГИ была менее выражена, хотя регулярно отмечалась тенденция к сокращению числа погибших животных. мидийный гидролизат, полученный методом кислотного или ферментативно-кислотного гидролиза обладал аналогичным антивирусным действием. При заражении мышей токсигенным штаммом вируса гриппа А/Виктория/35/72, защита мышей, получавших МИГИ-кислотный и МИГИ-ферментативно-кислотный, составила 47,6% и 57,1%, соответственно, при 100% гибели животных в контроле. Внедрение в технологию производства МИШ метода ферментативно-кислотного гидролиза значительно сократило трудоемкость и продолжительность производственного процесса, дало возможность масштабировать его производство.

Мидийный гидролизат при экспериментальном гриппе у мышей и морских свинок стимулировал специфический противогриппозный иммунитет как при профилактической, так и при лечебной схемах аппликации МИГИ. Уровень антигемагглютинирующих антител возрастал в 2,0 раза при интраназальной и в 2,6 раза при пероральной аппликации препарата. в культуре лейкоцитов донорской крови препарат индуцировал синтез гамма-интерферона.

Выявлена вирусингибирующая активность мидийного гидролизата в отношении вирусов простого герпеса I и II типов и вируса иммунодефицита (ВИЧ-1). Препарат ингибировал репродукцию вирусов герпеса в культуре RK-13 и VERO, снижая инфекционную активность вируса ВПГ-1 на 3,0-5,0 lg ТЦД50, ВПГ-2 - на 2,0-3,5 lg ТЦД50. В отношении ВИЧ-1 зафиксировано достоверное снижение инфекционной активности ВИЧ-1 под действием мидийного гидролизата ( угнетение синцитиеобразования на 50% и продукции антигена Р-24 на 92-96,0 %) на 3-й сутки наблюдения при лечебной схеме введения. В реакции нейтрализации мидийный гидролизат снижал инфекционный титр вируса на 2,5 lg ТЦД50.

116

Заключение.

Грипп и другие острые респираторные вирусные заболевания продолжают сохранять ведущую юль в инфекционной патологии человека. Медицинское, социальное и экономическое

ЗНАЧЕНИЕ ПРОБЛЕМЫ ОПРЕДЕЛЯЮТ МАСШТАБЫ ЗАБОЛЕВАЕМОСТИ, БОЛЬШОЕ КОЛИЧЕСТВО СОПУТСТВУЮЩИХ ОСЛОЖНЕНИЙ и ЗНАЧИТЕЛЬНЫЙ УЩЕРБ В НАРОДНОМ ХОЗЯЙСТВЕ СТРАНЫ. По ДАННЫМ ВОЗ, ГРИПП И ДРУГИЕ ОРЗ ЯВЛЯЮТСЯ ОДНОЙ ИЗ ВАЖНЕЙШИХ ПРИЧИН ЗАБОЛЕВАЕМОСТИ И СМЕРТНОСТИ ВО ВСЕМ МИРЕ, ЧТО ОБЪЯСНЯЕТСЯ ВЫСОКИМ УРОВНЕМ ИХ РАСПРОСТРАНЕНИЯ СРЕДИ НАСЕЛЕНИЯ: ОДНА ЧЕТВЕРТАЯ ЧАСТЬ ЖИТЕЛЕЙ ПЛАНЕТЫ ЕЖЕГОД НО БОЛЕЮТ ИНФЕКЦИОННЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ, ИЗ НИХ ГРИПП И Д РУГИЕ ОРЗ СОСТАВЛЯЮТ ОТ 70-90% ( 15, 42 ). Однако, медицинское значение совершенствования терапии гриппа обосновано не только

ОГРОМНЫМ ЭПИДЕМИЧЕСКИМ ДИАГНОЗОМ, НО ТАКЖЕ ОПРЕДЕЛЯЕТСЯ ХАРАКТЕРОМ ВОЗДЕЙСТВИЯ ГРИППОЗНОЙ ИНФЕКЦИИ НА ОРГАНИЗМ ЧЕЛОВЕКА И ТЯЖЕСТЬЮ ПОСЛЕДСТВИЙ, ОБУСЛОВЛЕННЫХ ЧАСТОТОЙ РАЗВИТИЯ ОСЛОЖНЕНИЙ И ОПАСНОСТЬЮ ФАТАЛЬНЫХ ИСХОДОВ, ОСОБЕННО У ЛИЦ, СТРАДАЮЩИХ СОПУТСТВУЮЩИМИ ХРОНИЧЕСКИМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ, НАРУШЕНИЯМИ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ , ЛИЦ ПОЖИЛОГО ВОЗРАСТА И ДЕТЕЙ (

42, 56,81,151,182,213).

Важным обстоятельством с эпидемической точки зрения являются особенности гриппозной инфекции, такие как быстрая смена антигенной разновидности возбудителя, циркуляция на протяжении одного эпидемического цикла вирусов гриппа разных видов или нескольких сеютипов одного вида, не позволяют вести эффективную борьбу с инфекцией, опираясь лишь на средства ващинопрофилактики. попытки создания эффективных и безвредных вакцин против таких острых респираторных инфекций как аденовирусная, респираторно-синцитиальная, парагриппозная, до настоящего времени не увенчались успехом. вышесказанное относится и к герпетическим инфекциям, профилактика которых при помощи отечественной инакгивированной пготивогерпетической вакцины также не является высокоэффективной. Вместе с тем, высокое тератогенное действие герпесвирусов приводит к рождению детей с тяжелыми эмбриопатиями, нередко являющимися причиной смерти новорожденных (181, 330 ). высокий уровень инфицированности населения как ВПГ-1, так и ВПГ-2, широкий спектр клинических проявлений герпетической инфекции, рецидивирующее течение, генерализация процесса у лиц с первичными и вторичными иммунодефицитами инфекционной и неинфекционной природы повышает значимость исследований по поиску противогерпетических препаратов пюфилактического и лечебного действия ( 9, 49, 79, 113, 132, 257, 294 , 340) .

В последние годы в россии неуклонно повышатся количество ВИЧ-инфицированных лиц.

Эпидемии в Калининграде , Санкт- Петербурге, в районах Среднего Поволжья, Дальнего Востока и на Украине свидетельствуют о том, что чума XX века перестает быть уделом той части населения, которая относится к группам риска, приобретая тенденцию к распространению ( 23, 127, 332, 333 ). Несмотря на интенсивные исследования отечественных и зарубежных специалистов по разработке эффективных методов профилактики и лечения ВИЧ- инфекции, следует признать, что проблема далека от разрешения.

Следовательно, клинико-эпидемиологическая ситуация в отношении гриппа, вирусов простого герпеса и вируса иммунодефицита человека служит аргументированным обоснованием разработки средств лечения и профилактики данных инфекций и диктует конкретные требования к новым препаратам , среди которых наиважнейшими считаются специфическая эффективность, безопасность приема пациентами различного возраста, биодоступность, фармакологическая совместимость ( возможность назначения на фоне приема других медикаментов ), доступность ( стоимость препарата ), отсутствие негативного влияния на состояние иммунной системы, наличие фармакологического влияния на весь симптомокомплекс заболевания, удобство лекарственной формы ( местное и системное применение ), возможность приема как для лечения, так и профилактики ( сезонной и экстренной ) , отсутствие развития резистентных штаммов.

Из материалов литературного обзора очевидно, что имеется большой спектр вновь синтезированных химических соединений и биологически- активных субстанций, выделенных из растений и животных с обнаруженной антивирусной активностью в отношении вирусов гриппа,

37 простого герпеса и вируса иммунодефицита человека К таким препаратам можно отнести производные адамантана ( 76, 92, 276, 303, 309 ), аналоги нуклеозидов (19, 25, 35, 37, 168), антисмысловые полинуклеотиды ( 324 ), вещества, блокирующие фузию вирусной и клеточной мембран (19,148-150,231,344), а также созревание и почкование вирионов (20, 37, 219, 275, 279), но несмотря на явное этиотропное действие этих соединений, лишь немногие из них дошли до клинических испытаний в виду обнаруженной токсичности и еще меньше до широкого выпуска в качестве специфических профилактических и лечебных препаратов.

Тем не менее заслуга ученых состоит в том , что на каждом этапе исследований активности того или иного химиопрепарата все больше информации накапливалось о юли вирусных белков гриппа, простого герпеса и ВИЧ в патогенезе инфекций, вызываемых данными вирусами, о депрессивном их воздействии на формирование клеточного и гуморального иммунитета

На фоне бурного роста развития химиопрофилактики и химиотерапии вирусных инфекций возникла проблема ингибитоюрезистентности патогенов. поэтому особую важность приобретают исследования закономерностей формирования резистентности вирусов к химиопрепаратам, выделение резистентных мутантов вирусов, разработка путей предотвращения и преодоления резистентности. одним из направлений снижения вероятности появления резистентных мутантов вирусов является использование комбинации химиопрепаратов и разработка рациональных схем и способов их применения ( 59, 80, 125, 137, 171, 260 , 271, 323 ). Но с другой стороны, это приводит к удорожанию стоимости лечения, также увеличивается вероятность возникновения побочных явлений, особенно , если препараты следует принимать длительно. кюме того, комбинированная терапия тоже может приводить к созданию и выделению штаммов вирусов, обладающих множественной резистентностью, как правило, при использовании препаратов одного класса,относящимся к производным исходно активного агента ( 178, 225, 295 ). При этом наиболее актуальной является задача создания антивирусных препаратов, способных к многоточечному взаимодействию с вирусом на разных стадиях его репликации, так как в этих -условиях формирование и последующее выделение резистентных штаммов сводится к минимуму.

Таким образом , проблема терапии и профилактики вирусных инфекций , в частности гриппа, инфекций вызванных вирусами простого герпеса и вирусом иммунодефицита человека продолжает оставаться актуальной , несмотря на первые успехи в разработке средств и препаратов против выше указанных инфекций.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Препараты: Мидийный гидролизат ( МИГИ ) получен методами кислотного (МИГИ-К) или ферментативно-кислотного (МИГИ-ФК) гидролиза мягких тканей беспозвоночных животных Mytilis edulis galloprovineialis в соответствии с ТУ 15-16-06-92 во ВНИРО (г. Москва) или в МХО "Экос"(С.-Петербург ). Препарат готовили из сырых или свежезамороженных мягких тканей мидий, которые сначала обрабатывали протеолитическим ферментом пготосубтилином. Оптимальная концентрация фермента составляла 0,4% к сырью, температура обработки 50-55°С. После этого субстрат упаривали до содержания сухих веществ 16-18% и проводили кислотный гидролиз в присутствии концентрированной соляной кислоты ( HCL) в течение 20-24 ч. Гидролиз прекращали путем добавления к полученной биомассе концентрированной щелочи ( NaOH ). Приготовление МИГИ методом кислотного гидролиза проводили в той же последовательности, но без обработки протеолитическим ферментом. при исследовании химического состава мидийного гидролизата было обнаружено, что препарат состоит из нескольких фракций: 1) низкомолекулярная фракция представлена аминокислотами, свободными жирными кислотами ( из них 67,2 % полиненасыщенные жирные кислоты) , аминами, минеральными солями, содержание азота свободных аминогрупп в препарате составляет 850-1100 мг %; 2) высокомолекулярная фракция МИГИ представлена белками, количество ее составляет 0,001% от массы исходного гидролизата и содержит полипептиды с молекулярной массой 1,2 х 106; 5 x 105 и 2-3 x 105 дальтон; 3) щелочерастворимая фракция составляет 0,01% от массы исходного гидролизата, ее молекулярная масса 10 -15 x 104 дальтон, данная фракция представлена в основном, меланоидинами; 4) кислоторастворимая фракция ( 0,04% ) содержит вещества с молекулярной массой 3000-5000 дальтон, элементный состав и Ж - спектры сходны с таковыми для щелочерастворимой фракции.

Мягкие ткани мидий богаты микроэлементами (Р, Са, Fe, Си, Mn, Со, Ва, Мд и др.), которые в препарате представлены в виде комплексов с органическими носителями и витамины Вь В2, Pp, А, Е. Их содержание в мидиях в 10 раз больше, чем у рыб, и в 50-100 раз выше, чем в мясе животных. мидийный гидролизат ( миги-К, миги-ФК ) представляет собой однородную темно-коричневую жидкость, солоноватую, с легким привкусом горечи и запахом сухих грибов.

Массовая доля сухих веществ в препарате составляет 28,8-33,0%, NaCL - 15,0%, азотистых веществ - 1,0-1,5%. PH препарата колеблется от 5,3 до 5,8, относительная плотность от 1,175 до 1,185 г/см3. Массовая доля осадка не более 5%. Всего исследовано 135 образцов препарата, полученных из мидий, выловленных в разных морях: Черном, Азовском и Белом. в качестве тест-препаратов при исследовании антигриппозной активности применяли ремантадин Олайнинского фармацевтического завода и виразол ф. ICN, при изучении антигерпетической активности на культуре ткани использовали ацикловир (виролекс) фирмы

Wellcome Foundation LTD", при исследовании в отношении ВИЧ-1 - азидотимидин (AZT) фирмы "Sigma".

Вирусы.

Вирусы гриппа: А (H1N1) - штаммы А/Гайвань/1/86, А/Виьсгория/36/88, Х-113; А ( H3N2 ) - штаммы А/Виктория/35/72, А/Миссисипи/1/85, А/СССР/1/85, NIB-25; А/Резвир/8/94; В-штаммыВ/Ямагата/16/88, В/Ленинград/91, В/Харбин/7/94. Аллантоисные вируссодержащие культуры получали общепринятыми методами на 10-12 дневных куриных эмбрионах.

Вирусы простого герпеса : ВII Г-1 - штамм ji2, ВПГ-2 - штамм Внуково-2. Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ): использован штамм В/ВИЧ-1. Вирус был выделен от больного в НИИЭМ им. Пастера в г. Санкг - Петербурге на лимфобластоидной клеточной линии МТ-4.

Вирус везикулярного стоматита (ВВС): штамм Индиана.

10-12 дневные куриные эмбрионы птицефабрики «Скворицы» г. Санкт-Петербурга для изучения вирусингибирующей активности вирусов гриппа в реакции нейтрализации.

Культуры клеток: культура переживающей хорион-аллантоисной оболочки (ХАО) для вирусов гриппа, RK-13 - клетки перевиваемой линии почек кролика для ВПГ-1, перевиваемая культура VERO для ВПГ-2; лимфобластоидная клеточная линия МТ-4 для ВИЧ-1, культура лейкоцитов периферической крови человека L-41 для определения интерфеюниндуцирующей активности мидийного гидролизата.

Животные: В экспериментах были использованы белые беспогодные мыши весом 14-16 г. в количестве 3650 шт, морские свинки весом 250-300г. в количестве 170 шт. Животных получали из питомника "Рапполою". Методы исследования: вирусингибирующую активность МИГИ in vitro определяли в реакции нейтрализации вируса гриппа с последующим заражением куриных эмбрионов, лию в культуре кусочков хорионаллантоисной оболочки. Непременным условием реакции являлось определение токсичности препарата для культуры ХАО. Для определения токсичности, в культуру ХАО вносили исследуемые разведения препарата без последующего внесения вируса. Культуру с препаратом инкубировали в течение 2-х суток при t 36°С. Токсическое действие препарата оценивали визуально по изменению выраженности сосудистого рисунка, плотности прикрепления оболочки к скорлупе, изменению рН среды, а также по наличию неспецифической агглютинации после добавления 5% взвеси куриных эритроцитов. Определяли предельное разведение препарата, в котором обнаруживалось токсическое действие. В дальнейших экспериментах использовали нетоксичное для культуры ХАО разведение

МИГИ постановка реакции нейтрализации: к десятикратным разведениям вируса гриппа с 10"1 до 7

10 добавляли равный объем цельного препарата. В качестве контроля вместо препарата использовали 6,5% «пептонную воду». После часового контакта при комнатной температуре каждое

РАЗВЕДЕНИЕ ИНОКУЛИЮВАЛИ В 4 КУРИНЫХ ЭМБРИОНА В ОБЪЕМЕ 0,2 МЛ В КАЖДЫЙ. ЧЕРЕЗ 48-72 ЧАСА ПОСЛЕ ИНКУБАЦИИ ПРИ t 34 -36° С ЭМБРИОНЫ ОХЛАЖДАЛИ, ОТСАСЫВАЛИ АЛЛАНТОИСНУЮ ЖИДКОСТЬ. О НАЛИЧИИ ВИРУСА СУДИЛИ ПО РЕАКЦИИ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ С 1% ВЗВЕСЬЮ КУРИНЫХ ЭРИТРОЦИТОВ. ИНФЕКЦИОННЫЙ ТИТР ВЫЧИСЛЯЛИ ПО МЕТОДУ КЕРБЕРА И ВЫРАЖАЛИ В ЛОГАРИФМАХ ЭИД50 ( 27 ). ОБ УРОВНЕ АНТИВИРУСНОЙ АКТИВНОСТИ СУДИЛИ ПО ВЕЛИЧИНЕ РАЗЛИЧИЙ МЕЖДУ ЭИД50 КОНТРОЛЬНЫМИ И ОПЫТНЫМИ ОБРАЗЦАМИ.

Антивирусное действие МИГИ на культуре переживающей хорионалллантоисной оболочки (ХАО). Культуру ХАО готовили по методу Fazekas de St. Crouths в модификации Шварцмана Я.С. и Аграновской Е.Н. ( 311 ). Для культуры ХАО использовали среду, содержащую на 1 литр дистиллированной воды NaCL - 8 г, KCL - 0,6 г, СаСЬг - 0,8 г, MgCL2 - 0,15 г, глюкозу - 0,9 г, желатину нейтральную-2,0 г, левомицитин-ОДг и индикатор- фенол красный-0,0 1%,рН среды 7,0.

При постановке реакции использовали 72-луночные полистироловые панели, предварительно обработанные 70% раствором этилового спирта и УФО в течение I часа. В каждую лунку разливали србду для ХАО в объеме 0,5 мл. Потом вносили кусочки скорлупы с хорионаллантоисной оболочкой размеюм 0,5 x 0,5 мм с хорошо выраженными кровеносными сосудами. В реакции нейтрализации использовали вирус гриппа в разведении с 10~2 до 10~7 в объеме 0,1 мл . в каждую лунку вносили по 0,1 мл исследуемого препарата соответствующего разведения в разное время по отношению к заражению культуры ХАО: за 2 часа до заражения, одновременно и спустя 2 часа после инфицирования. Контролем служили зараженные разведениями вируса гриппа культуры ХАО без препарата. Панели с содержимым инкубировали в течение 48-72 часов при температуре 34-36°С в зависимости от типа вируса гриппа. После этого кусочки ХАО удаляли. Учет опыта проводили по реакции гемагтлютанации с 5% взвесью куриных эритроцитов, которые вносили в объеме 0,05 мл. Инфекционный титр вычисляли по методу Кербера и выражали в lg ЭИД50 (27). Антивирусное действие препаратов оценивали по разнице титров вируса в контрольном и опытных образцах. Наличие вирусингибирующей активности препарата оценивали при различие не менее, чем в 1,75 lg ЭИД50 в опытных и контрольных образцах (193).

Антитоксическое и иммуномодулирующее действие мидийного гидролизата изучали на модели экспериментальной гриппозной инфекции на мышах и морских свинках.

Антитоксическое действие МИГИ изучали в опытах in vivo при заражении мышей токсигенным штаммом вируса гриппа А/Виктория/35/72 (H3N2) под легким эфирным наркозом по 0,05 мл в каждую ноздрю животного. Заражающая доза вируса составляла 10 ЛД50 /ОД мл. Использовали разведения МИГИ от 1/10 до 1/2000. Часть животных получала мидийный гидролизат per os с помощью зонда в объеме 0,5 мл, другая группа животных - интраназально в объеме 0,1 мл. Препарат исследовали на разные сроки по отношению к инфицированию животных: по профилактической (за 5 часа до заражения) и лечебной ( спустя 5 часа после заражения ) схемам назначения. Препарат вводили однократно. Критерием эффективности препарата являлось увеличение частоты выживаемости мышей в опытной группе по сравнению

41 tbCYQ

К5ССЯЙСКА* -VQ A " rtf.HK с контрольной в течение 7 дней. достоверность различий оценивали с использованием т -критерия стьюдента и считали достоверными при уровне значимости р<0,05 (27 ).

Изучение антивирусного действия МИГИ на экспериментальных моделях с нетоксигенным штаммом вируса гриппа.

Влияние МИГИ на репродукцию вируса гриппа в легких мышей определяли при заражении их 1,10,100 ИД50 нетоксигенного штамма вируса гриппа А/миссиоипи/Ш5(НЗШ) с последующим титрованием вируссодержащей суспензии легких на куриных эмбрионах. у мышей забирали легкие на 3 сутки после инфицирования. легкие растирали механически в ступке с добавлением 2 мл физиологического раствора NaCL с антибиотиками (пенициллин

1000 мгк/мл, гентамицин 1000 мгк/мл, канамицин 1000 мгк/мл). Содержимое центрифугировали, а полученную суспензию инокулировали в куриные эмбрионы в объеме 0,2 мл. Далее эмбрионы с инокулятом инкубировали при t 36^ С в течение 48 часов. Влияние препарата на репродукцию вируса гриппа оценивали по разнице инфекционного титра вируса в аллантоисной жидкости опытных и контрольных образцов в РГА с 1% взвесью куриных эритроцитов.

У морских свинок на 4, 5, 6 сутки при экспериментальной гриппозной инфекции забирали смывы из носа в объеме 1,5 мл и инокулировали в 10 - 12 дневные куриные эмбрионы в объеме

0,2мл. Дальнейшее культивирование вируса проводили общепринятым способом. О вирусингибирующем действии мидийного гидролизата судили по разнице в частоте обнаружения вируса гриппа в аллантоисной жидкости опытных и контрольных образцов в РГА с 1% взвесью куриных эритроцитов.

Для изучения влияния МИГИ на иммуногенез при экспериментальной гриппозной инфекции мышам и морским свинкам вводили препарат в разведении 1/100 -1/200 по пюфилактической ( за 48, 24 и 5 часов до заражения) однократно и лечебным схемам ( спустя 5 часов после заражения и в течение 3-х последующих суток 2 раза в день ). использовали разные способы аппликации препарата: пеюрально по 0,5 мл, ИНТРАНАЗАЛЬНО по 0,1 МЛ и внутрибрюшинно - 0,2 мл. Животных инфицировали нетоксигенным штаммом вируса гриппа А/Миссисипи/1/85 (H3N2) с инфекционным титром на мышах 5,5 ig ид50 , который вводили интраназально в объеме одмл мышам и 0,2 мл-морским свинкам. Через 14 суток после заражения у животных забирали кровь, отделяли центрифугированием сыворотку и обрабатывали нейраминидазой нехолерного вибриона (мышиные) или 0,4% раствором риванола (сыворотки морских свинок) для удаления неспецифических ингибиторов гемагглютинации и исследовали в РТГА по общепринятой методике с 1% взвесью куриных эритроцитов. о влиянии мидийного ГИДРОЛИЗАТА на иммуногенез судили по величине средней геометрической титра антител в сыворотках крови животных в контрольных и опытных группах, получавших препарат.

Для определения влияния МИГИ на вакцинальный иммунитет, мышей иммунизировали инактивированной гриппозной хроматографической вакциной (ИГХВ) из штамма вируса гриппа А/миссисипи/1/85 (H3N2) внутрибрюшинно в объеме 0,2 мл и одновременно вводили МИШ

42 пегорально в разведении от 1/50 до 1/400. Титры противовирусных антител в сыворотках крови мышей определяли через 14 суток в РТГА по общепринятой методике. ОБ иммуномодулирующем действии препарата на вакцинальный иммунитет судили по величине средней геометрической титра антител в сытоготках крови иммунизированных животных и сыворотках животных, которым помимо ИГХВ, вводили препарат. определение противовирусной активности МИГИ в отношении репродукции вируса простого герпеса i и п типа*. Изучение противовирусной активности препаратов в отношении вируса простого герпеса I и П типов проводили в два этапа: 1) проверка токсичности препарата на культуре ткани, используемой в дальнейшем для культивирования вируса с целью определения минимальной токсичной дозы (МТД) ( в дальнейшей работе использовали 1/2-1/4 МГД ); 2) оценка антивирусной противогерпетической активности препаратов, которую осуществляли с использованием в качестве тест-системы: а) дляВПГ-1 культуры клеток перевиваемой линии почеккролика(ШС-13); б) дляВПГ - 2 - перевиваемой культуры VERO. Определение характера действия препаратов на указанных культурах: профилактическое, лечебное и вирулицидное. Используемые дозы вируса: 1-10 ООО ИТД50/0,2мл, сроки наблюдения от одного дня до 7 суток. Посевная доза клеток на одну пробирку составила 1х105 на 1 мл среды. В качестве ростовой среды использовали ср. 199 с добавлением 5% эмбриональной сыворотки и 5% сыворотки крупного рогатого скота Поддерживающая среда содержала - cp . 199 с добавлением 1% эмбриональной сыворотки и 4% сыворотки крупного югатого скота ингибирующий эффект препаратов на всех сроках оценивали по подавлению цитопатического действия вируса в культуре клеток (ЦПД50) и снижению инфекционной активности в присутствии препарата определение токсичности препарата готовили разведения МИГИ от 1/2 до 1/512 на поддерживающей среде. из пробирок со сформировавшимся монослоем клеток удаляли ростовую среду и вносили но 1,0 мл поддерживающей среды, содержащей различное разведение препарата ( на каждое разведение - 4 пробирки с тканевой культурой ). контролем служили пробирки с культурой, в которые внесена только поддерживающая среда В дальнейшем пробирки с культурой ( опыт и контроль ) помещали в термостат при 37^0 и проверяли состояние клеточного пласта путем ежедневного микроскопиювания в течение 7 дней. наименьшее разведение препарата, вызывающего дегенерацию клеток культуры, принимали за минимальную токсическую дозу (МГД). В опыте использовали разведение мидийного гидролизата, составляющее 1/2 МТД. были проведены опыты с различными образцами МИГИ (образцы 12, 13, 14 ).

Исследование вирусингибирующего действия препарата Из пробирок с монослоем клеток удаляли ростовую среду и вносили по 0,8 мл поддерживающей среды. Затем готовили два вспомогательных ряда пробирок: а) опытный - мидийный гидролизат в разведении 1/64 ,что соответствует 1/2 МТД , соединялисравнымобъемомразличныхдозвирусагерпеса(1-10000 ИТД50).

Смесь в пробирках встряхивали и выдерживали в течение 2-х часов при 37°С; б) контрольный - к указанным выше различным дозам вируса добавляли равный объем поддерживающей среды и

43 аналогичным способом проводили инкубацию. полученные после инкубации смеси опытного и контрольного ряда вносили по 0,2 мл в пробирки с тканевой культурой, из которых предварительно еылаудалена ростовая среда и добавлено по 0,8 мл поддерживающей среды. на каждое разведение вируса в смеси с МИГИ (опыт) и средой (контроль) использовали по 6 пробирок тканевой культуры.

Контрольные и опытные пробирки инкубировали при 370с в течение 7 дней.

Испытание профилактического действия препарата. Из пробирок с монослоем клеток удаляли ростовую среду и вносили в опытные пробирки по 0,8 мл поддерживающей среды, содержащей 1/2 МТД МИГИ, в контрольные - по 0,8 мл поддерживающей среды. Через 2 часа контакта при 37°С в опытные и контрольные пробирки вносили по 0,2 мл ВПГ-1 или ВПГ-2, содержащего 1,10 и 100 ИТД50. На каждое разведение вируса (в опыте и контроле) использовали по 12 пробирок тканевой культуры. Пробирки встряхивали и помещали в термостат при 37°С до 7 суток. Дополнительные контроли: а) контроль культуры - в 4 пробирки вносили по 1,0 мл поддерживающей среды; б) контроль препарата - в 4 пробирки вносили по 0,8 мл рабочего разведения препарата и через 2 часа контакта при 37°С добавляли по 0,2 мл поддерживающей среды.

Испытание лечебного действия препарата. Испытание лечебного действия препарата проведено по 2 схемам :

1-ая схема предусматривала однократное введение в поддерживающую среду испытуемого препарата. Из пробирок с монослоем удаляли ростовую среду и вносили по 0,2 мл ВПГ-1 или ВПГ-2, содержащего 1, 10 и 100 ИТДзо Контакт вируса с клетками - 2 часа при 370с. Через 2 часа после инфицирования культуры клеток, вирус из пробирок удаляли, инфицированные культуры тщательно отмывали раствором Хенкса, а затем в опытные ряды добавляли по 1,0 мл поддерживающей среды, содержащей МИГИ в разведении 1/64, в контрольные - по 1,0 мл поддерживающей среды. На каждое разведение вируса ( в опыте и контроле ) использовали по 12 пробирок тканевой культуры. Пробирки встряхивали и помещали в термостат при 37°С. Срок наблюдения 7 суток. п - ая схема предусматривала ежедневную смену поддерживающей среды в опытных и контрольных рядах: в опытных рядах поддерживающая среда содержала МИГИ в разведении 1/64, в контрольных рядах - одна свежая поддерживающая среда. весь ход эксперимента в остальном был аналогичен, описанному выше при постановке по схеме 1. срок наблюдения 5 суток антивирусный эффект при изучении профилактического и лечебного действия препарата на основе мидийного гидролизата оценивали по подавлению цитопатогеннош действия (ЦПД) ВПГ-1 и ВПГ-П ( ежедневное микроскопирование в течение 7 дней ) и по снижению репродукции вируса в культуре клеток в присутствии рабочей дозы препарата. для этого на 3, 4 и 7 дни после инфицирования из контрольных и опытных культур инфицированных различными дозами вируса ( 1-10 000 ИТД50/ 0,2мл ) изымали по 3 пробирки опытных и контрольных культур. Данный раздел работы проводился совместно со с.н.т. лаборатории тривакцины НИИЭМ им. Пастера,к.м.н. ТаросЯЮ.

ВИРУССОСОДЕРЖАЩУЮ ЖИДКОСТЬ ИЗ КАЖДЫХ 3-Х ПРОБИРОК ОБЪЕДИНЯЛИ И ТИТРОВАЛИ НА СООТВЕТСТВУЮЩИХ КУЛЬТУРАХ КЛЕТОК С КОЭФФЕЦИЕНТОМ 10 ПО ОБЫЧНОЙ СХЕМЕ. УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ ПРОВОДИЛИ ПО ЦП Д НА 7 СУТКИ ПОСЛЕ ТИТРОВАНИЯ ПРОБ И ПО СНИЖЕНИЮ ИНФЕКЦИОННОГО ТИТРА ВИРУСА ПО СРАВНЕНИЮ с КОНТРОЛЕМ

Изучение противовирусной активности МИГИ в отношении вируса иммунодефицита человека**. Исследование проводили па лимфобластоидной клеточной линии МТ-4, чувствительной к ВИЧ-1. Активность МИГИ оценивали на модели острой инфекции клеток. Заражение осуществляли свободной от клеток вируссодержащей культуральной жидкостью в

ОБЪЕМЕ ОД МЛ НА 1х10б КЛЕТОК. ПОСЛЕ ИНКУБАЦИИ КЛЕТОК С ВИРУСОМ В ТЕЧЕНИЕ 1 ЧАСА ПРИ 37°С НЕСВЯЗАВПШЙСЯ ВИРУС УДАЛЯЛИ, А ИНФИЦИРОВАННЫЕ КЛЕТКИ КУЛЬТИВИРОВАЛИ С ПОСЕВНОЙ КОНЦЕНТРАЦИЕЙ 5x105 КЛ/МЛ СРЕДЫ RPM-1640, СОДЕРЖАЩЕЙ 10% ЭМБРИОНАЛЬНОЙ ТЕЛЯЧЬЕЙ СЫВОРОТКИ, 300 мкг/мл L-ГЛУТАМИНА, 100 МКГ/МЛ ГЕНТАМИЦИНА В ВИДЕ СУСПЕНЗИИ ПРИ 37°С И СОДЕРЖАНИЕМ 5% ДВУОКИСИ УГЛЕРОДА В ГАЗОВОЙ СРЕДЕ . КЛЕТКИ КУЛЬТИВИРОВАЛИ В 24-ЛУНОЧНЫХ КУЛЬТУРАЛЬНЫХ ПЛАСТИКОВЫХ ПЛАНШЕТАХ И ФЛАКОНАХ ФИРМЫ "COSTAR" (США). МИГИ ИСПЫТЫВАЛИ В РАЗВЕДЕНИЯХ 1/10; 1/25; 1/50; 1/100. В КАЧЕСТВЕ ЭТАЛОННОГО ПРЕПАРАТА ПРИМЕНЯЛИ АЗИДОТИМИДИН (AZT) ФИРМЫ "SIGMA"b КОНЦЕНТРАЦИИ 1 МКГ/МЛ.

Определение токсичности МИГИ на культуре клеток МГ-4. Влияние мидийного гидролизата

НА ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ И ПРОЛИФЕРАТИВНУЮ АКТИВНОСТЬ КЛЕТОК МТ-4 ИЗУЧАЛИ В ТЕСТЕ С ТРИПАНОВЫМ СИНИМ. С ЭТОЙ ЦЕЛЬЮ ГОТОВИЛИ РЯД РАЗВЕДЕНИЙ МИДИЙНОГО ГИДРОЛИЗАТА С РАЗЛИЧНОЙ КОНЦЕНТРАЦИЕЙ (1/10, 1/25, 1/50, 1/100 ) и КУЛЬТУРУ КЛЕТОК МТ- 4 с ПОСЕВНОЙ КОНЦЕНТРАЦИЕЙ 5 X 105 кл/мл В 24 -ЛУНОЧНЫХ ПЛАНШЕТАХ ПОТОМ УДАЛЯЛИ РОСТОВУЮ СРЕДУ PRMI-1640 С 10% ЭМБРИОНАЛЬНОЙ ТЕЛЯЧЬЕЙ СЫВОРОТКИ И ВНОСИЛИ ПРЕПАРАТ В СООТВЕТСТВУЮЩЕЙ КОНЦЕНТРАЦИИ ( НА КАЖДОЕ РАЗВЕДЕНИЕ - 4 ЛУНКИ ТКАНЕВОЙ КУЛЬТУРЫ ). КОНТРОЛЕМ СЛУЖИЛИ ЛУНКИ С КУЛЬТУРОЙ КЛЕТОК, В КОТОРЫЕ ВНЕСЕНА ТОЛЬКО РОСТОВАЯ СРЕДА. ПАНЕЛИ ПОМЕЩАЛИ В ТЕРМОСТАТ ПРИ 37°С И ПРОВЕРЯЛИ СОСТОЯНИЕ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК ПУТЕМ МИКРОСКОПИГОВАНИЯ НА 3 СУТКИ. Токсичность МИГИ ДЛЯ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК ОЦЕНИВАЛИ ПО ДВУМ ПОКАЗАТЕЛЯМ: ДОЗЕ ЖИЗНЕСПОСОБНЫХ КЛЕТОК И ИНДЕКСУ ПРОЛИФЕРАЦИИ. НАИМЕНЬШЕЕ РАЗВЕДЕНИЕ ПРЕПАРАТА, ЕЩЕ ВЫЗЫВАЮЩЕГО ДЕГЕНЕРАЦИЮ КЛЕТОК ПРИНИМАЛИ ЗА МИНИМАЛЬНУЮ ТОКСИЧЕСКУЮ ДОЗУ (МТД). В ЭКСПЕРИМЕНТАХ ИСПОЛЬЗОВАЛИ РАЗВЕДЕНИЕ МИГИ, СОСТАВЛЯЮЩЕЕ 1/5 МТД. ДЕЙСТВИЕ МИГИ на РАЗМНОЖЕНИЕ ВИРУСА в КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРЕ ОЦЕНИВАЛИ по ПОКАЗАТЕЛЯМ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ КЛЕТОК, АКТИВНОСТИ СИНЦИТИЕОБРАЗОВАНИЯ, а ТАКЖЕ ПО УРОВНЮ СОДЕРЖАНИЯ АНТИГЕНА Р24 ВИЧ-1 в КУЛЬТУРАЛЬНОЙ СРЕДЕ. СТЕПЕНЬ ЗАЩИТЫ КЛЕТОК ОТ ЦИТОПАТОГЕННОГО ДЕЙСТВИЯ ВИЧ-1 ОПРЕДЕЛЯЛИ по ФОРМУЛЕ: % защиты=(А-В) / (К-В) X 100%, где А - КОЛИЧЕСТВО ЖИЗНЕСПОСОБНЫХ КЛЕТОК в ОПЫТНОЙ КУЛЬТУРЕ, В - то ЖЕ в ИНФИЦИРОВАННОЙ КУЛЬТУРЕ ( КОНТРОЛЬ ВИРУСА), К - то ЖЕ в КОНТРОЛЬНОЙ НЕИНФИЦИРОВАННОЙ КУЛЬТУРЕ (286). Данный раздел работы проводили совместно со ст.н.с.лаб. СПИДа НИИЭМ им. Пастера, к.м.н.Коровиной Г.И. и зав.лаб.СПИДа, д.м.н.СмольскойТ.Т.

При исследовании профилактического действия препарата на ингибицию репродукции вируса ВИЧ-1, клетки МТ-4 отделяли от культуральной жидкости центрифугигованием при 1000 об/мин. в течение 10 мин, затем ресуспендировали в свежей питательной среде, содержащей различные дозы препарата ( разведения 1/25 и 1/50 ). контакт клеток с мидийным гидролизатом составил 2 часа при 37° С. последующее инфицирование и культивирование клеток осуществляли по стандартной методике.

При изучении лечебного действия препарата, МИГИ в разведениях 1/10, 1/50,1/100 вносили в суспензию клеток в объеме 0,2 мл сразу после адсорбции вируса. ингибирующий эффект оценивали на 3 и 6 сутки по подавлению цитопатогенного действия ( ЦПД ) вируса и продукции антигена Р24 в клеточной культуре, а также проценту жизнеспособных клеток . иммуноферментный анализ (ифа) применяли для выявления концентрации антигена Р24 вируса иммунодефицита человека в культуральной жидкости с использованием коммерческой тест - системы НПО " вектор".

Изучение эффективности сочетанного применения МИГИ и азидотимидина на модели ВИЧ -инфекции. Активность препарата оценивали на модели острой инфекции клеток МТ-4. Использован штамм В/ВИЧ-1 с инфекционным титром 5,0 lg ТЦЦ50/0Д мл. Заражение осуществлялось вируссодержащей культуральной жидкостью в объеме од мл на 1 х 10б клеток. После инкубации клеток с вирусом в течение 1 часа при температуре 37°С, несвязлвшийся вирус удаляли, А инфицированные клетки культивировали с посевной концентрацией 5 X 105 кл/мл в 24 -луночных планшетах в течение 4-х суток. Ввиду многофакторности эксперимента представлялось целесообразным использование методов математического планирования. были спланированы три трехфакторных эксперимента по планам первого порядка. В качестве факторов рассматривались концентрация препаратов (МИГИ, AZT) и заражающие дозы вируса. препараты и их сочетания вносили в среду культивирования сразу после адсорбции вируса. эффект препарата или их сочетанного применения оценивали на 4-е сутки по подавлению продукции антигена Р24 ВИЧ-1 в культуральной жидкости с использованием коммерческой тест - системы НПО "Вектор".

Интерферон - индуцирующая активность мидийного гидролизата in vitro ***. Определение интерферон (ИФ) - индуцирующей .активности препарата МИГИ проводили in vitro в культуре лейкоцитов периферической крови человека. лейкоциты выделяли из крови доноров методом избирательного лизиса эритроцитов 0,83% раствором хлористого аммония ( NH4 CL ) ( 103 ). Клетки суспендировали в минимальной среде ИГЛА "MEM' с добавлением 2% или 7% нативной сыворотки крови человека группы ав так, чтобы конечная их плотность составляла 7-8 млн. клеток на 1 мл и инкубировали при температуре 37° С. В культуры лейкоцитов вносили МИГИ в концентрации от 0,1% до 10% ( в разведении от 1/1000 до 1/10). На сроках 20 и 72 часа культуры центрифугировали при 2000 об/мин. в течение 20 мин. и надосадочную жидкость исследовали на наличие противовирусной активности. данный раздел работы проводили совместно с зав. лаб. интерферона НИИЭМ им. пастера, к.м.н. ИовлевымВ.И.

Противовирусную активность ИФ исследовали микрометодом в культуре клеток L-41 с

ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ В КАЧЕСТВЕ ИНДИКАТОРА ВИРУС ВЕЗИКУЛЯРНОГО СТОМАТИТА (ВВС) (103). ТИП ИФ ОПРЕДЕЛЯЛИ В РЕАКЦИИ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ С АНТИСЫВОРОТКАМИ К а - И у- ИНТЕРФЕРОНУ. За ТИТР ИФ ПРИНИМАЛИ ВЕЛИЧИНУ, ОБРАТНУЮ ЕГО НАИБОЛЬШЕМУ РАЗВЕДЕНИЮ, ОБЕСПЕЧИВАЮЩЕМУ ЗАЩИТУ 50% КЛЕТОК ОТ ЦИТОПАТОГЕННОГО ДЕЙСТВИЯ (ЦПД) ВИРУСА ВЕЗИКУЛЯРНОГО СТОМАТИТА. АКТИВНОСТЬ ИНТЕРФЕРОНА ВЫРАЖАЛИ В МЕЖДУНАРОДНЫХ ЕДИНИЦАХ (ME).

Статистическую обработку материалов проводили с использованием общепринятого расчета стандартной ошибки. достоверность разности средних величин оценивали по критерию

Стьюдента (27). Различия средних считали достоверными при уровне значимости р<0,05. Глава 3. Вирусингибирующая активность мидийного щцролизата (МИГИ) в отношении вируса гриппа в реакциях in vitro и v'vo

3.1. Определение ингибирующей вирус гриппа активности в реакции нейтрализации на куриных эмбрионах ( КЭ ) и в культуре хорион-аллантоисной оболочки. Стабильность антивирусной активности миги в процессе хранения

Для определения вирусингибирующей активности препарата нами была выбрана реакция нейтрализации вируса гриппа на КЭ и культуре ХАО. первым этапом работы по изучению антивирусной активности мидийного гидролизата in vitro явился подбор условий реакции нейтрализации вируса гриппа С целью оптимизации условий реакции поставлен ряд экспериментов по уточнению факторов, которые могли бы повлиять на ход реакции: время контакта вируса с препаратом, температурные условия их воздействия, разные значения ph мидийного гидролизата, а также влияние на ход реакции концентрации NaCL ( два последних фактора связаны с параметрами изучаемого препарата в соответствии с ТУ 15-15-16-06-92 ). изучение перечисленных условий проводили с вирусом гриппа А/Миссисипи/1/85 (H3N2) и МИГИ , полученным методом кислотного гидролиза

Для выбора оптимального температурного режима постановки реакции, контакт вируса с мидийным гидролизатом осуществляли в диапазоне температур от +4°С; +18°-20°С; +37°С. При этом не удалось выявить достоверных различий в активности препарата при указанных колебаниях температуры. Различие в инфекционной активности (ЭИД50) вируса гриппа не превышало 1,0 lg. Снижение репродукции вируса на КЭ под действием мидийного гидролизата колебалось в пределах 2,5 - 3,5 lg ЭИД50.

Следовательно, температурные условия предварительного контакта вируса с исследуемым образцом не влияли на ход реакции нейтрализации на КЭ и для дальнейших экспериментов нами была выбрана комнатная температура (+18°-20°с).

Изучение разного времени контакта препарата с вирусом выявило, что инактивация вируса начинается в первые пять минут, постепенно увеличиваясь при контакте в 20 минут и 1 час.

Дальнейшее увеличение времени контакта до 90 минут не оказывало влияния на результаты опыта При различном временном контакте вируса с препаратом 5, 20, 60, 90 минут снижение титра вируса гриппа на куриных эмбрионах составляло соответственно 1,5; 2,5; 2,75; 2,75 lg ЭИД50.

Аналогичные эксперименты проведены с тремя разными образцами МИГИ, но с одним штаммом вируса гриппа и результаты были сравнимы с предыдущим опытом, различия заключались лишь в активности самих образцов, а динамика ингибиции вируса по времени совпадала Учитывая полученные данные, был выбран следующий вариант постановки предварительного этапа реакции нейтрализации: контакт вируса гриппа с препаратом в течение часа при комнатной температуре -+18°-20°С.

Принимая во внимание, что в соответствии с ТУ на МИГИ, значения рН препарата могли колебаться от 5,0 до 6,0, представлялось необходимым оценить влияние значения рН на инфекционную активность вируса гриппа при их предварительном контакте. Были приготовлены контрольные разведения вируса гриппа A(H3N2) на фосфатно - буферном растворе, содержащим лимоннокислый натрий, с рН от 4,5 до 7,5 с интервалом / 0,5. Показано , что кислые значения среды ( рН от 4,5 до 5,5 ) частично ингибируют инфекционную активность вируса на КЭ, в то время , как рн среды, начиная с 5,5 до 7,5 не оказывало влияния на накопление вируса гриппа на КЭ. однако, не отрицая влияния РН на инфекционную активность вируса гриппа, надо отметить, что в действии мидийного гидролизата даже с низким значением РН это не имело главенствующего значения. при анализе вирусингибирующей активности разных образцов МИГИ не выявлено четких корреляций между значениями РН и снижением инфекционной активности ( ЭИД50 ) вируса МИГИ с РН 5,0 -5,5 вызывал снижение инфекционного титра вируса на куриных эмбрионах от 1,5 до 7,0 lg ЭИД50 у разных исследуемых образцов; препараты с РН 5,6 - 6,0 - от 2,0 до 5,5 lg. Для того, чтобы избежать возможного влияния РН на ход реакции нейтрализации, в дальнейшем при сравнительном изучении различных образцов МИГИ, проводили измерение РН исследуемых образцов и доводили при необходимости до уровня 5,6-5,8 насыщенным раствором NaOH.

Образцы мидийного гидролизата в соответствии с ТУ содержат достаточно высокую концентрацию соли ( до 15% NaCL ), как результат технологического процесса приготовления препарата, когда кислотный ГИДРОЛИЗ приостанавливают, добавляя к биомассе NaOH. реакция нейтрализации была поставлена с вирусом гриппа A(H3N2) на растворе с различным содержанием

NaCL. Реакция имитирована таким образом, что вместо МИГИ к разведениям вируса добавляли равный объем раствора, содержащий разные концентрации NaCL (от 2% до 22%). При этом концентрация соли NaCL от 2% до 11% не оказывала влияния на инфекционную активность вируса при обычной постановке реакции нейтрализации, т.е. при соединении равных объемов вируса и солевого раствора с последующим заражением этой смесыо куриных эмбрионов. колебания в титре вируса не превышали 1,0+0,25 lg ЭИД50. Если же содержание NaCL в контрольном растворе составляло 15% и выше, то инфекционный титр вируса гриппа снижался в среднем по результатам 5ти экспериментов на1,25+0,6 lg ЭИД50.

Содержание NaCL в препарате 15% и ниже оказалось нетоксичным для эмбрионов, вероятно, ввиду того, что в курином эмбрионе содержится около 8-10 мл хорионаллантоисной жидкости и по физико-химическим законам концентрация соли перераспределяется на весь объем жидкости.

Поскольку на культуре ХАО использовали МИШ в разведении 1/10, то тем юлее эта концентрация NaCL не могла отразиться на результатах эксперимента, так как конечное разведение мидийного гидролизата в культуре ХАО составляло 1/60.

Таким образом, учитывая изложенное, можно констатировать, что регламентированное содержание соли в МИГИ значимо не влияло на репродукцию вируса гриппа в КЭ и на культуре ХАО.

После отработки условий предварительного этапа постановки реакции нейтрализации, а также исключив возможные факторы, влияющие на окончательные результаты опытов, проверена воспроизводимость получаемого снижения инфекционного титра вируса гриппа в реакции нейтрализации на КЭ. исследование 6 образцов препарата в нескольких параллельных экспериментах выявило колебание титра вируса под действием препарата в пределах 1,0 lg ЭИД50, что, вероятно связано с качеством используемых эмбрионов (табл. 3.1).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Советова, Марина Геннадиевна, Санкт-Петербург

1. Алимбарова Л.М., Соха Л.Г., Балева Л.С. и др.// Оценка иммунного и интерфероновогостатуса детей, инфицированных вирусом простого герпеса, проживающих на территории с повышенным радиационным фоном. Ж. вопр. виру сол. М. ,1997. -№ 1. -С. 36-41.

2. Алимбарова Л.М., Баринский И.Ф., Кузьмин К.К. //Оценка противовирусной активности новых лекарственных форм фоскарнета при генитальном герпесе морских свинок. Ж. Вопр. вирусол,- М.Д998.-№2.-С.82-86.

3. Аникин В.Б., Романцов М.Г., Ариненко Р.Ю., Смирнов B.C.// Нетрадиционные подходы к профилактике повторной респираторной заболеваемости у детей. В кн: Актуальные проблемы инфекционной патологии,- СПб.,1993,- Ч. 1. С. 105.

4. Антигипоксанты и адаптация. Под ред. Соколовского В.В.-Л., 1984.-62 с.

5. Баландин И.Г. //Роль и место методов молекулярной биологии в изучении препаратов с антивирусными свойствами.Сб.научн.тр.-Минск.-1977.-С.68-70.

6. Балтина Л. А., Покровский А.Г. Толстиков Г.А. // Глицирризиновая кислота и ее производные новые АНТИ-ВИЧ средства. Тез.докл. III Рос.нац. когресса "Человек и лекарство". - М., 1996. - С. 9.

7. Баринский И.Ф.//Роль герпетической инфекции в патологии человека. Ж.Врач.-1994.-Ы5.-С.5-9.

8. Баринский И.Ф., Шубладзе А.К., Каспаров А.А., Гребенюк В.П.// Герпес (этиология, диагностика, лечение).- М.,1986.-269 с.

9. БеляковВ.Д., ЯфаевР.Х. //Ж. Эпидемиология.-М„ 1989.-С.192.

10. БесединаТ.В., Новиков М.В., Королев А.Н., Бойков Ю.А.//Организация и проведение исследований по модификации способа получения лечебно-профилактического продукта из мидий. ОтчетВНИРО.-Москва.-1993.-С.3-65.

11. Беседнова Н.Н., Оводова Р.Г., Запорожец Г.С.//Ж. теорет. и прикладная инфекц. иммунология.-Ташкент.-1984.-С. 138-139.

12. Беседнова Н.Н., Эпштейн Л.М., Боровская Г.А., Гажа А.К.// Пептиды из морских организмов: перспективы использования. Тез. докл. III Рос.нац. конгресса "Человек и лекарство."-М., 1996.-С.78.

13. Бичурина М.А.//грипп и острые респираторные вирусные инфекции на современном этапе. Мат. II межд. конфер. НИИЭМ им.Пастера "Идеи Пастерав борьбе с инфекциями",- Спб.,1998,-с.ЗЗ.

14. Бичурина М.А, Розаева Н.Р., Кубарь О. И. и др.// Профилактика гриппа и ОРВИ в детских дошкольных учреждениях с помощью мидийного гидролизата (вирамида). Мат. II межд. конфер. НИИЭМ им.Пастера "Идеи Пастера в борьбе с инфекциями",- Спб.,1998.-с.34.117

15. Бичурина М.А, Кубарь О.И., Гагаринова В.М. и др.//Результаты изучения профилактического действия арбидола при гриппе и других ОРВИ у детей. мат. II межд. конфер. НИИЭМ им.Пастера "Идеи Пастера в борьбе с инфекциями",- Спб.Д998.-с.34.

16. Брязжикова Т.С., Исаков В.А., Юрлова Т.И. и др.//Варьирующая чувствительность клинических изолятов вируса простого герпеса к ацикловиру. В кн.: Новые подходы кцеленаправленному конструированию противовирусных препаратов. СПБ., 1994,- С. 17.

17. Бубович В.И., Рязанцева Г.М., Индулен М.К. // Ранние стадии размножения миксовирусов и влияние на них ингибиторов.-Рига.-1987,- 164 с.

18. Букринская А.Г., Корни, вд М.Н., Носик Д.Н., Жданов В.М.// Подавление репродукции вируса иммунодефицита человека в культуре клеток с помощью ингибиторов протеолиза. Ж. Вопр. вирУСОЛ.-1989.-.№1.-С.53-55.

19. Бурмистрова В.В., Козелецкая КН.// Лабораторная оценка противогриппозных свойств дейтифорина. В кн.: Неспецифические средства и методы профилактики гриппа и других ОРЗ.-Л.Д986.-С.94-99.

20. Бурова Н.В., Воронин Е.Е., Фомин Ю.А. и др.//Первый опыт применения комбинированной противоретровирусной терапии. Mat. И межд. конфер. НИИЭМ им. Пастера "Идеи Пастера в борьбе с инфекциями",- Спб.,1998.-с,57.

21. Вакер А., Эйхлер А., Лодеман Е. //Молекулярный механизм ингибирования вирусов элеутерококком. Mat.II Междунар. симп. по элеутерококку,-М., 1984.-С.13-15.

22. Валтрекс. Монография фирмы Glaxo Wellcome. -М.Д998.-С.7-8, 24-30.

23. ВИЧ-инфекция в северо-западном регионе России. Информ. бюллетень за 1997. од.-СПб.1998,-10с.

24. Ворошилова М.К., Жевандрова В.И. Балаян М.С. // Методы лабораторной диагностики энтеровирусных инфекций.-М.,1964.-С. 127-139.

25. Вотяков В.И., Бореко Е.И. // Подход к оценке активности химических соединений противвирусов, размножающихся в тканевых культур ах.-Сб.научн. тр. -минск.-1977.-С.10-14.

26. Вотяков В.И., Бореко Е.И., Владыко Г.В. и др.// Поиск соединений, активных в отношении вирусов гриппа и возбудителей других ОРВИ. В кн.: Химиотерапия и химиопрофилактика гриппа и ОРЗ.-Л., 1990.-С. 16-23.

27. Гагаринова В.М., Крук Н.Н., Васильева О.В. и др. // Новая комбинированная схема использования препаратов-индукторов интерферона для снижения заболеваемостиреспираторными инфекциями. Ж. впервые в медицине. 1995. -№2-3- С.38.118

28. Гагаринова В.М., Щербина А.Н., Балабанова Е.Е. и др. // Иммунокоррегирующее действиеряда препаратов адаптогенов у часто болеющих детей при вторичных иммунодефицитныхсостояниях. Ж. Впервые в медицине. 1995.-№2-3 - С.38-39.

29. Гагаринова B.M., Карпухина О.Г., Маликова П. и др.// Изучение эффективност и реаферона в организованном коллективе взрослых. В кн.: Реаферон-генноинженерный альфа-2-интерферон.-Л.Д988.-С.53-58.

30. Гагаринова B.M., Бичурина M.A., Советова М.Г. и др.// Неспецифическая профилактикагриппа и острых респираторных заболеваний среди рабочих промышленных предприятий. Практическ. Рекомендации.-СПб., 1996,- С. 16-39.

31. Галегов Г.А., Шобухов В.М., Леонтьева Н.А. и др. // Лекарственная терапия вирусных инфекций. Тез. докл. ПРос. нац. когресса "Человек и лекарство". -М., 1995. -С.188.

32. Галегов Г.А., Наат В., Пушкарская Н.Л. и др.// Изучение комбинированного действия ремантадина (амантадина ) и рибавирина на экспериментальную гриппозную инфекцию. Ж. Вопр. вирусол,-1981,-№6.-С.697-701.

33. Галегов Г. А. // Синтетические ингибиторы протеиназы ВИЧ и новые возможности лекарственной терапии ВИЧ-инфекции и СПИДа. Ж. Вопр. вирусол,- М.,1997. -№1,- С. 284-286.

34. Галицкая Н.Н., Русяев B.A., Шашихина M.H. и др.//К характеристике спектра про тивовирусной активности производного бициклогептана. -Сб.научн. тр. НИИЭМ.-Минск. -1978.-С.55-60.

35. Гендон Ю.З., Чернос В.И.// Химиотерапия вирусных инфекций и проблема ингибиторорезистентных мутантов. В кн.: Молек. биол. вирусов, химиотерапия и химиопрофилактика вирусных инфекций.-Минск.-1974.- С.40-42.

36. Гендон Ю.З.// Мукозальные и полинуклеотидные вирусные вакцины. Мат. И межд. конфер. НИИЭМ им.Пастера "Идеи Пастера в борьбе с инфекциями".- Спб.,1998.-С.46.

37. Гендон Ю.З.//Пандемия гриппа: можно ли с ней бороться? Ж Вопр. вирусол.-1998.-№1.-С43-47.

38. Германе С.К. //Экспериментальная оценка нейротропных свойств адапромина. В.кн.: Экспериментальная и клиническая фармакотерапия.-Рига.-1986.-С. 6-14.

39. Германе С.К.//Сравнение психостимулирующей активности адапромина с фенамином и сиднокарбом.Там же.-С. 14-21

40. Гладкова В.Т., Молчанова З.И., Михейская Л.В. и др.// Дальневосточная мидия- источник биологически активных веществ. Тез. докл. Всесоюзн. Конф.-Владивосток.-1988.-С.77.

41. Глинских Н.П. //Эпидемиология и клинические формы герпесвирусных заболеваний человека: распространение, пути передачи, особенности эпидемиологического процесса. В кн.:Неизвестнаяэпидемия:герпес.-Смоленск.-1997.-С.8.

42. Голубев Д.Б., Медведев M.B., Козелщкая К.Н.//Чувствительность к ремантадину штаммов вирусов гриппа А, выделенных в разные годы. Резистентность вирусов к химиопрепаратам,-Риг а. -1987.-С.86-93.119

43. Голубев Д.Б., Козелецкая КН., Бурмистрова В.В. и др.// Дейтифорин и ремантадин при гриппе В в эпидемию 1986 года. В кн.: Клиника, патогенез и лечение гриппа и других ОРЗ.-Л.Д989-С. 113-118.

44. Голубев С.Ю., Коваленко А.Л., Романцов М.Г. // Опыт применения поливирана в лечении герпетических кератитов. Тез. межд.конф." Грипп XXI век".-СПб. , 1997. -С. 65.

45. Грибкова Н.В., Казак Н.Ф., Судник Ю.М. и др. // Изучение влияния производного бициклогептана на культуру ткани при миксовирусной инфекции.-Сб. научн. тр. НИИЭМ,-минск.-1978.-С.97-100.

46. Грибкова Н.В., Казак Н.Ф., Подольская И.А. // Чувствительность к противогриппознымпрепаратам вирусов гриппа типа А, резистентных к 2-(1-аминоэтил)-бицикло(2,2,1) гептанхлоргидрату. Сб.научн. тр. "Антивирусные вещества".-Минск.-1983.-С.46.

47. Долганова A.B., Шаронов Б.П., Киселев О.И. и др.// Активные формы кислорода в патогенезе гриппозной инфекции и перспективы применения СОД из эритроцитов человека. В кн.: Иммунология и патогенез гриппа и гриппоподобных заболеваний.-Л, 1991.-С. 101-107.

48. Дубинина Е.Е.,Туркин В.В., Бабенко Г.А., Исаков В.А. //Биохимия,- 1992.-т.57.-вып.12- С. 18921901.

49. Ермаков Е.В., Остапенко Г.П. // Особенности гемодинамических нарушений у больных вирусно-бактериальной пневмонией молодого возраста. Ж.терапевт. арх.-1984.-ЖЗ.-С.ЮЗ-104.

50. Ерофеева М.К., Шадрин А.С., Турьева А.В. и др.// Изучение эффективности ремантадина иадапромина при экстренной профилактике гриппа. В кн.: экспериментальная и клиническаяфармакотерапия.-Рига.-1986,- С. 126-130.

51. Ершов Ф.И.,Чижов Н.П. Противовирусные средства .- СПб., 1993.-С.65

52. Ершов Ф.И., Тазулахова Э.Б., Григорян С.С. // Индукторы интерферона в профилактике и терапии вирусных инфекций. Тез.докл. III Рос.нац.когр. "Человек и лекарство",-М.Д996.-С. 21.

53. Ершов Ф.И., Романцова М.Г.//Циклоферон: от эксперимента-в клинику. Монография. -СПб.,1997,- С.5-11.

54. Жербина Л.А., Шаманова М.Г., Чепик Е.Б., Фуксон В.Л.// Отдаленные исходы гриппа и ОРЗ, осложненные острыми пневмониями. В кн.: Клиника, патогенез и лечение гриппа и других ОРЗ.-Л.Д989.-С.23-27.

55. Ж.СПИД, секс, здоровье. -1997.-№2(22).-С.31.

56. Запорожец Т.С., Оводова Ф.Г., Артюков А.Л. и др.//Лектиновая активность полис ах аридбелкового комплекса, вьщеленного из мидии. Тез. докл. Всесоюзн. Конф. Владивосток. -1988.-С.16-11.

57. Злыдников Д.М., Романов Ю.А., Мажинский и др. // Возможности длительного приема ремантадина и анализ возникающих при этом побочных явлений. В кн.: Химиопрофилактика гриппа am ант адином,- Л.,1971,- С. 230-241.120

58. Злыдников Д.М., Кубарь О.И., Ковалева Т.П.// Химиопрофилактика и химиотерапия гриппа ремантадином. Ж.Вопр. вирусол.-1981.-№.5-С.516-5254.

59. Злыдников Д.М., Якушин А.И.// Лечение амбулаторных больных гриппом сочетанием виразола и ремантадина. В кн.: Антивирусные вещества,-Минск,- 1983,- С.5-6.

60. Злыдников ДМ. Кубарь О.И., Фирсов С.Л. и др.// Итоги клинического применения 2-(1-аминоэтил)-бицикло(2,2,1) гептан гидрохлорида. Сб. научн.тр. "Антивирусные вещества при экспериментальной терапии вирусной инфекции". Минск.-1986.-С.31-32.

61. Злыдников Д.М., Кубарь О.И. // В кн.: Химиотерапия и химиопрофилактика острых респираторных вирусных инфекций. -Л.Д987.-С. 10-15.

62. Иванов КС., Рыков А.И. Хавинсон В.Х.// Клинико-иммунологическое обоснование применения тималина при гриппе. В кн.: Клиника, патогенез и лечение гриппа и других ОРЗ,-Л., 1989.-С 138-141.

63. Ильенко В.И.// Методы отбора соединений, обладающих противовирусной активностью в отношении возбудителей гриппа,- Сб. научн.тр. -Минск. -1977.-С.36-42.

64. Ильенко В.И. Платонов В.Г., Прозорова И.Н. // Основные итоги лабораторного изучения ремантадина. В кн.: Проблемы гриппа и ОРЗ.- Л.Л979.-Т.24.-С.24-44.

65. Ильенко В.И., Ветласенин А.В., Алферова О.Ф., Киселева И.В. //Влияние ремантадина на развитие токсических поражений при экспериментальной химиотерапии вирусных инфекций. Итоги и перспективы.-Минск.-1979.-С.73-75.

66. Ильенко В.И. Ветласенин А.В. Киселева И.В. и др.// Результаты лабораторного изучения адапромина в качестве противовирусного препарата. В кн. Экспериментальная и клиническая фармакотерапия.-Рига.-1986.- С. 108-117.

67. Индулен М.К., Калныня В.А. НО резистентности вирусов к химиопрепаратам. Антивирусные вещества .-Минск.-1984.-С.48-57.

68. Индулен М.К., Рязанцев Г.М., Дзегузе Д.Р. и др.// Антивирусная активность и механизм действия адапромина. Экспериментальная и клиническая фармакотерапия,- Рига.-1986,-С.99-107.

69. Индулен М.К., Калныня В.А., Городкова Н.В. // Чувствительность свежих эпидемических штаммов вируса гриппа А к производным адамантана. В кн.: Химиотерапия и химиопрофилактика гриппа и ОРЗ.-Л., 1990.-С.41-45.

70. Исаева Т.Н. Воронин Е.Е., Купцов Д.Б. и др .//Профилактическое лечение беременных женщин азидотимидином для предупреждения вертикальной передачи ВИЧ-инфекции. Мат. И межд. конфер.НИИЭМим.Пастера "Идеи Пастера в борьбе с инфекциями",-Спб.,1 998.-с.60.

71. Исаков В.А., Чепик Е.Б., Камышенцев М.В. и др. //Экспериментальное и клиническое использованиеолифенав терапии гриппа. Сб.научн. тр.НИИЭМим. Пастера.-СПб.,1993.-С.124.

72. Исаков В.А., Ермоленко Д.К., Черных М.Д.// В кн: Терапия герпетической инфекции.-СПб.,1993.-С.3-30.

73. Исаков В. А., Чепик Е.Б., Шаманова М.Г. и др. //Принципы патогенетической терапии тяжелых форм гриппа. Сб. научн. тр.НИИЭМим. Пастера. -СПб.,1993,-4.1.-С.125.

74. Исаков В.А., Чепик Е.Б., Шаманова М.Г., НасоринаР.Н. В кн.: Диспансерное наблюдение и реабилитация больных гриппом и ОРЗ, осложненными острыми пневмониями. Рекомендации для врачей,-СПб., 1994.-С. 37-38.121

75. Исаков B.A., Туркин В.В., Киселев О.И. и др.//Использование антиоксидантов в терапии гриппа и ОРЗ. Метод. Рекомендации. -СПб.,1996- С.7-13,18-21, 33-37.

76. Камышенцев М.В., Чижов Н.П. // Методические подходы анализа метаболических нарушений в клетках органа-мишени при экспериментальном гриппе. В кн.: Иммунология и патогенез гриппа и гриппоподобных заболеваний. -Л.Д991.-С. 141-146.

77. Камышенцев M.B. , Сухинин В.П., Евдокимов В.Л., Шитикова Г.С. //Коррекция перекисного окисления липидов при экспериментальном гриппе. В кн.: Клиника, патогенез и лечение гриппа и других ОРЗ .-Л., 1989-С.82-88.

78. Камышенцев M.B., Чижов Н.П. //Иммунология и патогенез гриппа и гриппоподобных заболеваний. -M., 1991. -С. 141 -144.

79. Карпов А.В., Антоненко С.В., Барбашева Е.В. Спивак Н.Я. //Изучение анти-ВИЧ-активности молекулярного комплекса дрожжевая РНК-тилорон. Ж. Вопр. Вирусол.-1997.-№1.-С17-19.

80. Каташова Т.Н. //Влияние экспериментальной гриппозной инфекции разной степени тяжестина функциональную активность системы клеточного иммунитета.-Л.,1986. -18с.

81. Киселев О.И., Шаронов Б.П., Смородинцев Е.А. //Развитие гриппозной инфекции и токсичность молекулярного кислорода. В кн.: Клиника, патогенез и лечение гриппа и других ОРЗ.-Л.Д989.-С .63-75.

82. Киселев О.И., Блинов В.М., Решетникова О.Ю. и др.// Молекулярный механизм действия антивирусных препаратов адамантанового ряда. В кн.: Химиотерапия и химиопрофилактика гриппа и ОРЗ. -Л., 1990,- С29-38.

83. Киселев О.И., Блинов В.М., Платонов В.Г. и др. //Организация белков М1и М2 в мембранах и молекулярная модель действия ремантадина. В кн.: Химиотерапия и химиопрофилактика гриппа и ОРЗ. -Л., 1990. С. 10-16.

84. Киселев О.И. идр.//Ж. Вест. РАМН.-1994.-№2.-С.32-36.

85. Киселев О.И., Платонов В.Г., Шальнова Л.И. // Полимерные препараты- новое направление в фармакологии противовирусных средств.Тез. межд. конф. "Грипп-XXI век."-СПБ.,1997.-С.51.

86. Киселева И.В. //Влияние ремантадина на развитие токсикоза, вызванного различными штаммами вируса гриппа. Ж.Вопр. вирусол.-1981.-№5.-С.541-543.

87. Киселева И.В. // Механизм противогриппозного действия ремантадина в организме экспериментальных животных.-Авторе®. дисс.канд.-Л., 1982.-20 с.

88. Ковальчук А.Н., Дорофеева Р.П. //Состояние свертывающей и антисвертывающей систем крови и тромбоэластография у больных гриппом с геморрагическим синдромом. Вирусы и вирусные заболевания.-Kheb.-1984.-N2.-C.70-73.122

89. Козелецкая КН., Юхнова Л.Г., Жукова Т.Я. и др.// К механизму противогриппозного действия ремантадина. Сб. научн. тр.НИИЭМ.-Минск.- 1977,- С. 77-79.

90. Козелецкая КН., Ковалева Т.П., Голубев Д.Б.// Механизмы противогриппозной активностихимиопрепаратов адамантанового ряда,- В кн.: проблемы гриппа и острых респираторных заболеваний.-Л.Д979.-Т.24.-С. 13-19.

91. Козелецкая К.Н., Медведев Л.М., Голубев Д.Б. // Чувствительность к ремантадину и другим химиопрепаратам вирусов гриппа А 1982-1983 гг. выделения. микробиолог. журнал,- 1986-№ 4.-С. 67-71.

92. Коломиец А.Г., Малевич Ю.К., Коломиец Н.Д.и др. // Вирус простого герпеса и его роль в патолог ии человека.-Минск.-1986.-С.264.

93. Коломиец А.Г., Коломиец Н.Д., Лозицкий В.П.// Этиологическая структура респираторных вирусных заболеваний и современные возможности терапии. Ж. Клин. Мед.-1997.-№2.-С.6-12.

94. Кондратьева Г.А., Екимова е.Д., Иовлев В.И. // Определение противовирусной активности интерферонов человека микрометодом. В кн.: Реаферон-генно-инженерный человеческий альфа интерферон.-Л., 1988.-C. 105-109.

95. Кубарь О.И.// Основы клинической химиотерапии гриппа,-Мат. диссерт. д.м.н.-Л.,1988,- С. 163165, 170-191.

96. НИИЭМ им.Пастера "Идеи Пастера в борьбе с инфекциями",- Спб.,1998.-с.39. ИО.Кудряшов С.Ф., Изможеров Н.А. // Определение мутагенной, эмбриотоксической и тератогенной активности МИГИ-К. Отчет Естествен, института Пермского госуниверситета. -1988.-С.6-10.

97. Кузенкова А.В. // Разработка иммуноферментых тест систем для выявления антител к вирусам простого герпеса и цитомегалии и их апробация на клиническом материале . Автореф. дисс. к.б.н.-СПб.,1998.-19 с.

98. Леонов В.М., Романов Ю.А., Захарова Н.Г. и др.// Клиническое исследование переносимости и безвредности адапромина. В кн.: Экспериментальная и клиническая фармакопия .- Рига,-1986,-С. 118-121.

99. Леонов В.М., Романов Ю.А., Кубарь О.И. и др. //Терапевтическая эффективность адапромина пригриппе типов А и В. Там же,- С. 122-125.

100. Леонов В.М., Кубарь О.И., Рейх Л.Я. и др.// Изучение терапевтического действия и переносимости виразола при гриппе. В кн.: Осложнения гриппа и других ОРЗ у взрослых и детей.-Л.,1985,- С 86-93.

101. Леонов В.М., Кубарь О.И., Рейх Л.Я. и др.// Сравнительная оценка результатов лечения амбулаторных больных гриппом виразолом и симптоматическими средствами. Антивирусные вещества.- Минск.-1984.-С.35-36.

102. Леонов В.М., Кубарь О.И. Романов Ю.А. и др. //Результаты клинического изучения нового противогриппозного преп.арата адапромина при гриппе А и В. В кн.: Антивирусные вещества. -Минск. -1984. -С. 3 3 -3 5.

103. Лозицкий В.П., Поляк Р.Я. //Антивирусная активность и механизм действия химических соединений .-М.Л979.-С.7-16.

104. Лозицкий В.П. //Экспериментальное обоснование применение ингибиторов протеолиза для лечения и профилактики гриппа и в производстве иммунопрепаратов. В кн.:Химиотерания и химиопрофилактика гриппа и ОРЗ. -СПб. , 1990. -С. 58.

105. Львов Н.Д., Самойлович Е.О., Баринский И.Ф.//Комбинированная терапия герпесвирусной инфекции (экспериментальные и клинические данные). Ж. Вопр. вирусол.-1992.-№1.-С.8-11.

106. Ш.Лысенко А.Я., Турьянов М.Х., Лавдовская М.В., Подольский В.М.//В кн.:ВИЧ-инфекция и СПИД-ассоциируемые заболевания.-М. Д996,- С.53-55.

107. Меркулов а Л.Н., Колобухина Л.В., Белокуров А.В. и др.// Терапевтическая эффективность гипорамина при лечении больных гриппом. Ж.Эпидем. иинф. болезни.-1996.-№1.-С.42-43.

108. Микаэлян Э.М., Карагезян H.K., Овакимян С.С.// Элеутерококк- регулятор нерикисного окисления липидов при стрессе. Биол. ж. армении.-1989. -№2.-С140-143.

109. Миндел А.// Генитальный герпес- "забытая эпидемия". Ж.Заболевания, передаваемые половым путем.-1995.-№2.-С.З-10.

110. Нагибина М.В., Нейорах Е.А., Крылов В.Д. и др.// О лечении пневмоний при гриппе антиоксид антами. Ж.Терапевт. архив.-М.Д996.-№11.-С.35-37.

111. Наровлянский А.Н., Амченкова A.M., Сайткулов A.M. и др.// Новые перспективные противовирусные препараты растительного происхождения (кагоцел, рагосин, саврац) . Тез.докл. II Рос.нац.когресса "Человек и лекарство". -М., 1995. С. 190.

112. Нацина В.К. // Лечебная эффективность ремантадина при гриппе A (H3N2) у детей .В кн.: Клиника, патогенез и лечение гриппа и других ОРЗ.-Л. ,1989-С. 118-124.

113. Никитина Л.Е., Носков Ф.С., Фридман Э.А. Перадзе Т.В.// Методические аспекты изучения химиопрепаратов на модели экпериментальной гриппозной инфекции. Ж.Вопр. вирусол. -М.Д987,- № 5.-С.579-582.

114. Неовир- новые перспективы в лекарственной терапии. Стенд, докл. межд. конф. "Актуальные проблемы инфекционной патологии.-СПб.,1993.

115. ПарамоноваМ.С., ГагариноваВ.М., РодинаМ.А. и др.//Биологическая активность сапарала при гриппозной инфекции. Ж.Вопр. вирусол. -1994.-№3.-С. 131.125

116. Перцева Н.Т., Ананенко А,А., Малиновская В.О. и др. //Влияние реаферона и альфатокоферрола на процессы перекисного окисления липидов при экспериментальной гриппозной инфекции. Ж. Вопр. Вирусол. -1995.-№2.-С.59-62.

117. Платонов ВГ., Прозорова И.Н., Киселева И.В. и др.// Результаты изучения противовирусной активности дейтифорина. Сб. научн. тр. НИИЭМ,- Минск.-1986.-С 40-42.

118. Платонов В.Г., Шальнова ЛИ., Александрова Н.В. и др.// Противовирусная активность полимерного соединения -этил (1-адамантил)-метилана. В кн.: Клиника, патогенез и лечение гриппа и других OP3.- Л.,1989.-С. 150-155.

119. Платонов В.Г., Шальнова Л.И., Киселев О.И.//Экспериментальное обоснование возможности конструирования новых противовирусных препаратов пролонгированного действия. Тез.межд. Конф. Трипп-ХХ1век".-СПб,1997.-С.52.

120. Платонов В.Г., Ильенко В.И., Гордон M.A. и др.// Итоги и перспективы разработки противовирусных препаратов. Тез. межд. докл. конф. "Грипп-XXI век ".-СПб., 1997.-С.50 .

121. Ш.Полякова Т.Г., Иванова Л.А., Князева Л.Д. и др.//Вирусологические исследования при летальных исходах от гриппа и его осложнения у взрослых в период циркуляции вируса гриппа A (H3N2) с 1969 по 1983 гг. Ж.Вопрос.вирусол.-1987.-К5.-С.524-528.

122. ПолипчукВ.Н.//Ж.Врачебноедело.-№8.-1988.-С.62-65.

123. Приказ Минздрава РФ и ГКСЭН РФ " Он усилении мероприятий по профилактике гриппа и других острых респираторных вирусных инфекций" от 23.01.98. Монисов А. А., Зелинская Д.И., Вялков А.И.

124. Протасова С.Ф.,Щеканова С.М.// Влияние продигиозана на течение экспериментальной гриппозной инфекции . В кн.: Клиника, патогенез и лечение гриппа и других ОРЗ.-Л.Д989.-С. 163-166.

125. Протасова С.Ф.// Новое поколение иммуномодуляторов в профилактике и лечении гриппа и других ОРЗ. Тез. докл. ПВсесоюзн. Конф. "Человеки лекарство".-М.,1995.-С.191.

126. Растунцев л.П., Паранинский Г.К.//причины летальных исходов при гриппе. П-ой съезд инфекционистов УССР.-киев.-1983.-С.86-87.

127. Рахманова А.Г., Степанова Е.В., Касьянов А.Д. и др.// Опыт лечения простого герпеса ациююгуанозином. Ж. клинич. медицина-1997.-№7.-с.56-59.

128. Рахманова А.Г., Халдеева Н.В., Романова Е.И. и др.// О комбинированной противовирусной терапии больных ВИЧ-инфекцией. Mat. И межд. конфер.НИИЭМ им.Пастера "Идеи Пастера в борьбе с инфекциями",- Спб.Д998.-с.67.

129. Рейзис А.О. Дрондина A.K., Никитина Т.С. и др.// Иммуномодулирующее действие и клиническая эффективность мидийного гидролизата ЛП (л.аретен) при вирусных гепатитах у детей. Тез. Докл.П Всерос . конгр. "Человек и лекарство" .-М.Д995.-С.191.

130. Рид Д.//Ферменты в пищевой промышленности. -М.,Пищевая промышл.-1971.-С. 101-104.

131. Руитер А., Тин Р.Н.// Генитальный герпес. Принципы фармакотерапии. Ж. Заболевания, передаваемые половым путем.-1995.-№1,- С. 11-17.

132. Рыбакова Т.М., Скрипченко Г.С., Понаморенко С.И., Безброж И.М. // Влияние химиопрепаратов на биологические свойства вирусов гриппа. В кн.: Новые подходы к химиотерапии вирусных инфекций.-Рига.-1991 ,-С. 134-137.

133. СелимоваЛ.М., ЮринО.Г., Покровский В.В.//Репликативные свойства ВИЧ-1, резистентных к 3-азидо-2,3-дидезокситимидину. Ж. Вопр. вирусол.-1997.-№1.-С.10-13.

134. Сельков С.А, Кохреидзе Н.А., Шальнова Л.И., Платонов В.Г.//Клиническое использованиенового противогерпетического препарата "полирем" в терапии рецидивирующейгерпетической инфекции. Тез.межд. Конф. Трипп-XXI век",-СПб., 1997.-С.59.

135. Семенова Т.Б., Клейменов В.Н., Синюшкин А.И.// Циююферон для лечения герпетической инфекции. В кн.: Циююферон: от эксперимента- в клинику,-СПб.,1997.-С. 60-66.

136. Семенов А.Е., Исаков В.А., Ермоленко Д.К. и др.// Применение циклоферона в лечении генитального герпеса. Тез.межд. Конф. " Грипп XXI век".-СПб., 1997-С.69.

137. Серкеджиева Ю., Найденова Е.// Антигриппозное действие вещества, изолированного из Narcissus pseudonarcissus . Actamicrobiol . Luig.-1991.-№27. C.64-69.

138. СидороваЮ.М., Осидак Л.В., Дриневский В.П.// Опыт применения арбидолапри лечении ОРВИ у детей с различными формами туберкулезной инфекции. Тез. межд.Конф. "Грипп-XXI век",-СПб.,1997.-С.54.127

139. Смородинцев А.А., Степанов А.Н. // Интерферон и его роль в неспецифической противовирусной резистентности. В кн.: Факторы неспецифической резистентности при вирусных инфекциях,- JI.,1980,- С.51-63.

140. Смородинцев А. А.// Грипп и его профилактика.-Л.Д984.-С.326, 333-348, 352.

141. Смородинцев А.А.,Злыдников Д.М., Романов Ю.А. и др.// Изучение профилактической и лечебной эффективности противогриппозного препарата мидантана (аминоадамантаиа). Ж.Эксперим. и клин. фармакопея.-1970.-вып. 1.-С.47-60.

142. Смольская Т.Т.// Второе десятилетие жизни в условиях СПИДа: уроки и проблемы,- Доклад НИИЭМ. -СПб. , 1997. -С.37-43.

143. Современные данные о ВИЧ-инфекции и СПИДе в мире,Европе и России.-СПб., 1996.-22C.

144. Слободенюк A.B., Пономарев А.И. // Взаимодействие между вирусом гриппа и макрофагами,- Сб. научн. тр.: Респираторные инфекции.-Свердловск.-1978.-С.61-63.

145. СорокинаМ.Н. Безух C.M.// В кн.: Поражение нервной системы при герпетической инфекции .-СПб.,1996.-С. 15-22.

146. Ш.СтаршовП.Д., ЕгороваМ.М., БезяеваЛ.А.//Ж.Терапевт. архив.-№3.-1980.-С.125-128.

147. Сухинин В.Л. и др.// Иммунология и патогенез гриппа и гриппоподобных заболеваний .-Л.Д991.-С.107-110.

148. Хусаинов P.M., Игнатенко M.A., Грищенко Л.И. и др.// Новый индуктор иммунного интерферона в человеческих лейкоцитах- германий органическое соединение МОП -11. Ж. Вопр. вирусол. -1991.-№1.-С. 63-64.

149. Цыбульский А.В., Исачкова Л.М., Оводова Р.Г. и др.// Влияние митилана биогликапа из мидий Granomitilis Gray anus на течение и исход экспериментальной гриппозной инфекции. ЖМЭИ.-1992. -№3.-С.62-64.

150. ШароновБ.П. и др.//Доклад АН СССР.-1991.-Т.317.-№5.-С. 1265-1267.

151. Шубладзе А.К. МаевскаяТ.М.//Лечение. В кн.: Герпес.-М., 1971.-С. 169-182.

152. Якушин А.И., ШвецоваЕ.Г., Злыдников Д.М. // Экстренная профилактика гриппа рибавирином в квартирных оча1 ах. В кн. :Химиотерапия и химиопрофилактика гриппа и ОРЗ.-Л., 1990.-С. 136137.

153. Ada G.L.// Controlling influenza epidemics.- J. Immunology today.-1981 .-N.1 l.-P. 219-224.

154. Aboulker J.P. Swart A.M.// Preliminary analisis of the concorde trial. J. Lancet.-1993.-v.341.-P.889-890.

155. Anikin V., Romansov M., Chirnov M.// Antiviral effectivness of the combined use of the recombinfnt Alfa-2 Interferone and syntetic inhibitors of proteolis. The 5-th bienial conf. of infection dis.,- Abstr.-Salzburg, Austria.-1994.-P. 119.

156. Appleton A.L., Svil.and L // Pathogenesis of GVHD:Role of herpes viruses. J.Bone marrow transplant.-1993.-V. 11.-Ж5.-Р.349-355.

157. Bach M.C// Clinical responce to dideoxyinosine in patient with HIV infection resistant to zidovudine. NEJM.-1996. Vol. 323. -№4.-P.75

158. Bailowttz A., KaslowR.// Use of amantadine in the United States 1977-1988. J. Infect. dis.-1985.-Vol. 151.-N2.-P.372-373.

159. Balfour J.R., Chase B.A., Stapleton J.T. et al.//A randomized , placebo- controlled trial oforal acyclovir for the prevention of cytomegalovirus disease in recipients of renal allografts. Engl.J. Med. -1989.-320-P. 1381-1387.

160. Barness D.W., Whitley R.T.// Antiviral therapy and pulmonary diesease. J.Ciiest.-1987.-Vol.91.-№2.- P.246-251.

161. Barry W., Cockburn F., Cornall R. et al.// Ribavirin aerosol for acute bronchiolitis. Arch. Dis. Child.-1986.-Vol.61.-№6.-P.593-597.211 .Bartlett.// Zudovudin now or later. NEJM.-1993.-vol.329-P.351.

162. Beauchamp L.M., Orr G.E., de Miranda P. et al.// Aminoacid ester prodrug of aciclovir. Antiviral chem. and chemother.-1992.-№3.-P. 157-164.

163. Barker W.H., Mulloly J.P.// Pneumonia and influenza death during epidemics implication for prevention. Arch, intern, med.-1982.-Vol. 142.-N1.-P.85-89.214.behan P.//Postviralneurological syndromes. Brit. Med.J.-1983.-Vol.287(6396)-P. 853-854.129

164. Cameron B. et al.// Prolongation of life and prevention of AIDS in advansed HIVimmunodeficiency with ritonavir. abstr. LB бА.ТНЕ 3-rd conferense on retroviruses and Opportunistic Infections.- Washington DC.- 1996.

165. Canonico P.G.// Efficacy, toxycology and clinical applications of ribavirin against virulent RNA viral infection. J. Antivir. res.-1985.-Vol.5.-Suppl.1.-P.75-81.

166. Chang Te-Wen, Butter T.// Amantadine in uncomplicated influenza A. NEJM.-1980.- Vol.302,-№17.-P.966-967.

167. Chanin A.// Amantadine for influenza A. Canad. Med. Ass. J.-1981.-Vol.124.-N12.-P.1555.

168. Coller L.H., Oxford I. //Antiviral therapy- the end of the begining, developments in antiviral therapy. -London. -1980. -P.273-285.

169. Corey L.// Herpes simplex virus infections during the decade since the licensure of acyclovir. J. Med. virol-.1993.-Suppl.1.-P.7-12.

170. Damonte E.B., Matulewiez M.S., Cerezo A.S., Сото С.Е.// Sulfated xylogalactans from marine algae useful as ANTlHSV-I agents. J. antiviral research.-1995.-vol.26.-3-P.306.

171. Das K., Shukri N., Nasris A.// Protein concentrate from waste cat fish and its quality improvement by enzyme. J. food sci. andtechnol.-1979.-vol.16,- №2.-P.58-61.

172. DolinR., Bentley D.W.// Amantadine and remantadine prophilaxis and therapy of influenza in adults. Options conf. influenza Prog, viratek.-New York.-1986.-P.3 17-326.

173. Dresher J., Zink P., Verhagen W. et al// Recent influenza virus A infection in forensic causes of sudden unexplained death. J.Arch. virol.-1987.-Vol.92.-№1/2.-P.63-76.

174. Diezel W., Gortelmeyer R., Ostheimerk E.// Efficacy of tromantadine and aciclovir in thetopical treatment of recurrent herpes orofacialis. comparision in a clinical trial. j.

175. Arzneimittel- forshung.-1993.- Vol.43.-№ 4,- P. 491-496.

176. Ellenhorn M.J., Sidwell R., Limu J.M. et al.// Ribavirin ( virazole): review of clinical efficacy in human viral infections. current chemother. proc. 10-th int. congr. chemother.- zurich.-1977. Washington. -1978. - Vol. 2. -P. 1027-1029.

177. Elion G.B. // Acyclovir: discovery, mechanism of action and selectivity. J. Med. Virol.- 1993.-Suppl.1-P.2-6.

178. Fadeeva N.I., Lineva J.A., Fedjakina I.T., Sotova S.A.// Inhibitors oe the early stades of viralreproduction with potential antiviral activity. the 5-th bif.nial conf. of infection dis. abstr.

179. Group. J.Sexually transmitted diseases.-1997.-Vol.24,- №.8.-P.481-486.

180. FunOMOTO S. et al.// PCR on cerebrospinal fluid to show influenza associated acute encephalophaty or encephalitis. J.Lancet.-1998.-Vol.352(9131).-P.873-875.

181. Fishl М.А. et al// A randomized controlled trial of reduced daily dose of zidovudine in patients with the acquired immunodeficiency syndrome. NEJM -1990. -Vol. 325.(15) P. 10091014.

182. Frederick G., Hayden R. // Combination antiviral therapy for respiratory virus infection. J.Antiviral research.- 1996,-Vol .29. -N3.-P.45-48.

183. Galasso G.// An tiviral agents for the control of viral diseases. Bull.Wrld.Hlth. Org.-1981.-Vol.59.-N4.-P.503-512.244.galbraith A.W. // Theraretic trials of amantadine in general practice. J.Antimicrob. chemother. -1976. -N1. -P. 81 -86.

184. Galegov G.A., Pushkarskaya N.L., Obrosova-Serova N.P., Zhdanov V.M.// Combined action of ribavirin and rimantadine in experimental myxovirus infection.-experientia.-1977.-V.33.-P.905-907.

185. Gelfand E.W., Mccurdy D., Rao C.P., Middleton P.J.// Ribavirin treatment of viral pneumonitis in severe combined immunodeficiency disease. J. Lancet.-1983.-Vol.2.-N8352.-P.732-733.

186. Gottlieb M. et al// Comparision of safety and efficacy of two doses of stavudine (zerit, d4t) ina large trial in the USA parallel track programm 35-th ICCAAC. abstr.#1 ni.-sqan-francisco. -1995.

187. Graham N.M. et al// The effects on survival of early treatment of human immunodeficiency virus infection. NEJM-1992.- Vol. 326,-P. 1037-1042.

188. Grambas S., Benetti M.S., Hay A.J.// Influence of amantadine resistance mutations the РНregulatory function of the M2 protein of influenza A viruses. J. virology, 1992.-vol. 192-№. 1-P.541-549.

189. Halt, C.B., Mc Bride J.T., Gala C.L. et al.// Ribavirin treatment of respiratory syncytial viral infection in infante disease. JAMA.-1985.-Vol.254,- №21.-P.3047-3051.

190. Hall C.B.// Ribavirin: beginning the blittz on respiratory viruses. J. pediat. infect. dis.-1985.-Vol. 4.-P.668-671.

191. Hamilton J.D. et al // A controlled trial of early versus late treatment with zidovudine in symptomatic HIV infection. NEJM.-1992-. Vol.326.- №.7- P. 437-443.

192. Hills J., May A., Giese H. f;t al.// Untersuchungen zur Rimantadin- empgindlickkeit von influenza virus isolation des J ah res 1982 mit verschiedemen testsystemen. dtsch. gesundh.-wesen.-1983.-Bd.38.-H. 10,-S.398-400.

193. Huff J.C., Bean В., Balfour H.H. Jr et al //Therapy of herpes zoster with oral acyclovir . Am. J. med.- 1988.-Vol.85.-Suppl.2A -P. 84-89.

194. Imperato P.J.//A perspective of influenza control. J.Lancet.-1986.-Vol. 1.- №8483.-P.728-730.

195. Jackson G.G.// A perspective from controlled investigations on chemotherapy for viral respiratory infections.-J. infect, dis.-1976,-V. 133.-Suppl.1.-P.83-92.

196. Ching C. , Lopez C. // Natural Killing of herpes simplex virus type I infected target cells.-infect. immunol.-1979. -V. 26,- P.49-56.

197. Junker A., Scheifle D.// Prevention and treatment of influenza with amantadine hudrociiloride.Can.Med. Ass.I-1986.-Vol. 123,-jvfol 0.-Р.961-962.

198. Kalvaciiev Z., Walder R., Garzaro D., Barrios M.//Anti- HIV-I effects from Calendulla officinalys flowersJ Abstr. PW06-13.-The X-th Intern. Congress of virology.-Jerusalem, Israel.-1996.

199. Kimura S.// Clinical and radiological variability of influenza-related encephalopaty or encephalitis. J. Actapaediatrica Japonica .-1998.-Vol.40.- №.3-P.264-270.

200. Kubar O., Bishurina M., Nikitina L., Sovetova М. et al // First phase of clinical trial new antiviral drug vlramid. j. antiviral research .-1994,-№3.-p. 185.

201. Linos A.et al// Reported influenza in pregnancy and childhood tumor. European Journal of Epidemiolcx;y.-1998.-Vol. 14,-N.5.- P.471-475.

202. Markowitz M. et al // A preliminary study of ritonavir an inhibitor of HIV-I protease to treat HIV-infection. NEJM.-1995.-Vol.333.-P. 1534-1539.

203. Trial. Italy, The Netherlands, Canada and Australia Study.-JAMA.-1998.-Vol.279.-N.12,-P.930-937.

204. Montefiori D.C., Robinson W.E., Mitchell W.M.// AIDS Res. hum. retrovirus.-1989.- Vol.5-N2.-P. 193 -203.

205. Mohri H., SighM.K., Ciiing W.T. et al//Proc. nat. Acad. USA.-1993.-Vol.90.-P.25-29.

206. Pott age J.R. et al.// Stavudine in the therapy of patients with advanced AIDS and <50 CD4+celles/ Abstr.#270.2-nd National conference on Human Retroviruses.-Wasiiington DS-1995.

207. Prentice G.H., Gluckman E., Powles R.I. et al // Impact of long-term acyclovir on cytomegalovirus infection and survival after allogeneic bone marrow transplantation. J. Lancet.-. 994.- Vol.-343.-P.749-753.

208. Richm.an D. et al. // Human immunodeficiensy virus type I mutans resistant to non nucleoside inhibitors of reverse transcriptase arise in tissue culture . PNAS .-1991.-vol.88.-P.H241-11243.

209. Rhone S.A.,Hogg R.S., Yip B. et al.// The antiviral effect of ritonavir and saqunavir in combination amongst HIV-infected adults: results from a community-based study.-J.AIDS.-1998.-Vol.12.-№.6.-P.619-624.

210. Rodriguez, Hall C.B.,Welliyer R. et al// Efficacy and safety of aerosolized ribavirin injonung children hospitalized wiht influenzae double-blind, multicententer placebocontrolled trial. J.of Pediatries.-1994,-Vol. 125.-№1.-P. 129-135.134

211. Salon О. et al// Myelitis associated with influenza A virus infection. J.Neurovirol.-1997.-Vol. 3. -N. 1. -P. 83-85.

212. Scotti C. // Combined treatment of Parkinsons disease with amantadine and L-DEPA. Lancet.-1970.-Vol.1-№.7661.-P.1394-1395.

213. Schulman N.R.// Assessment of hf.motologic effects of ribavirin in Humans Clinical applications of ribavirin.-London.-1984.-Р.79-82.

214. Serkedjieva J.// Inhibition of influenza virus protein synthesis by a plant preparation from Geranium sanguineum L. J. Acta Virologica.-1995.- Vol.39 -№.1-P. 5-10.(Болгария).

215. Serked.heva J., Hay A.// In vitro antiinfluenza virus activity of plant preparation from

216. Stepanova L.A., Kubar O.I, Bichurina M.A.//The influenza of new antiviral drug(viramid) ofthe state of the immune system in healthy adults and patients with influenza. Abstr of theinternational conf. on .antiviral reseach.-sant-francisco,USA.-1995.

217. Swartsman J.S., Agranovskaja E.W., Zukov f.// Formation of secretory circulating antibodies after immunization with live and inactivated virus vaccines. J. infect. DIS.-1974.-Vol 135.-Р.697-705.

218. Tang A.M., Graham N.M. Chandra R.K., Saah A.J.// Low serum vitamin B-12 concentrations mrus type 1 (HIV-1) disease progression.-1997,- J. of nutrition.-vol. 127,-№.2.-P.345-351.

219. Togo X., McCracken E.A. // Double- blind clinical assessment of ribavirin ( virazole) in the prevention of induced infection with type В influenza virus . J. Infect. dis.-1976.- Vol. 133,-№.6.-P. 109-113.

220. Van PraagE., Fernyak S., Katz A.M.// Book: The Implications of anti retroviral treatmens. -Bull. WHO.-1997.-Vol.75.-№.5.-P.434.

221. Vere Hodge: R.A. //Review : Famciclovir and penciclovir . The mode of action of famaciclovir including its conversion to penciclovir. J.Antiviral Chemother. 1993-Vol.4.-№.2.-P. 67-84.

222. Voller G. W.// Die Behandluns des Parkinson syndroms mit amantadin. -Dt. Med. Woch.-Schr.-1974.-№17.-S.934-935.

223. Wagstaef A.J., Faulds D., Goa K.L. // Acyclovir: A reappraisal of its antiviral activity, pharmacokinetic properties and therapeutic efficacy. drugs .-1994.-VOL.47.-Nl-P. 153-205.

224. Whitley fur Middliebrooks M., Grann J. // Acyclovir: The past ten years. Adv. Exp. Med. BlOL.-1990.-VOL. 278.-P. 243-253.

225. Whitley R.J.// Neonatal Herpes simplex virus infection. J. Med. Virol. Suppl. 1-1993,- Vol. 1,-P. 13-21.

226. Wintermeyer S.H., Nahate M.S. //Rimantadine: a clinical perspective. J.Annals of phafmacotherapy. -1995 .-Vol. 29.-№3. -P.299-310.

227. Zgorniak Nowosielska I. Crzybek J. Mandova N. et al // Antiviral activity of Flos verbasci infusion agains t in influenza and herpes simplex viruses . Arch. Immunologiae f;t Therapiae Experimentalis .-1991,- Vol.39.-№. 1-2 P.103-108

228. Coffin J.M.//J. Science.-1995. Vol.267.-P.483-486.

229. WeixX., Ghosh S.K., Taylor M.E. et al.// J.Nature.-1995.-Vol.373.-P. 117-122.

230. Александровский A.B., Кадашов Н.И., Ванько Jl. В.// Клинико-иммунологическиеособенности герпесвирусной инфекции у новорожденных детей. -ж. росс. вестникперинатологииипедиатрии.-М.Д999.-№ 5.-С. 19-23.

231. Боев Б.В., Бондаренко В.М. // Прогноз эпидемии ВИЧ инфекции в России. ЖМЭИ-1999,-№4.-С. 115-119

232. ВИЧ-инфекция . Информационный бюллетень.-1998.-№12 (10).- 20 с.

233. Гуськова Т.А.// Арбидол- отечественный препарат для профилактики и лечения гриппа и других острых респираторных инфекций,- Мат. II Всерос. конгр. «Человек и лекарство». -М.71995.-С,188.

234. Караулов А.В., Сидоренко ИВ., Булычева Н.А. и др.// Новые аспекты применения противовирусного препарата Арбидол,- Мат. II Всерос. конгр. «Человек и лекарство».-М., 1995.-С. 188.

235. Кильдивлтов И.Ю., Крамская T.A. Филиппов В.К., Фролов Б.А. // Влияние ионола на нормализацию состава Т- и В-лимфоцитов в селезенке мышей, зараженных вирусом гриппа.-В кн.: « Новые подходы к химиотерапии вирусных инфекций ».-Рига.-1991.-С.162-168.

236. Кравченко А.В., Серебровская Л,В., Шахгильдян В.И. // Показатели иммунитета у больных ВИЧ- инфекцией на разных стадиях заболевания,- Ж. Эпидем. и инф. болезни.-М.Д999.-№3,-С.50-54.

237. Семенов Б.Ф., Каулен Д.Р. Баландин И.Г.// Клеточные и молекулярные основы противовирусного иммунитета,- М. "Медицина".-1982.-239 с.

238. Weekly epidemiological record.- WHO.- Geneva.-1998.-V.73.-№ 26.-P. 193-200.

239. Исаков B.A., Аспель Ю.В. // Иммуногенез и лечение генитального герпеса и хламидиоза,-Рук. дляврачей.-Новгород-Санкт-Петербург.-1999. С.3-69,84-140.

240. Жилинская И.Н. // Роль вирусных белков в патогенезе гриппозной инфекции.-Авт. докт. диссерт.-СПб., 2000.-С.8-19,30-35.

241. Козелецкая К.Н. // Проблема резистентности в химиотерапии и пути ее решения,- Авт. докт. диссерт.-СПб., 2000.-С.9-24,29-39.

Информация о работе

Советова, Марина Геннадиевна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2000
ВАК 03.00.06

Диссертация

Вирусингибирующая активность препарата, полученного на основе мидийного гидролизата - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы