Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Поиск и выделение клеточного рецептора для вируса клещевого энцефалита при помощи антиидиотипических антител

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Поиск и выделение клеточного рецептора для вируса клещевого энцефалита при помощи антиидиотипических антител"

На правах рукописи

Протопопова Елена Викторовна

ПОИСК И ВЫДЕЛЕНИЕ КЛЕТОЧНОГО РЕЦЕПТОРА ДЛЯ ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА ПРИ ПОМОЩИ АНТИИДИОТИПИЧЕСКИХ

АНТИТЕЛ.

03.00.06. - вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биолог -.веских наук

Кольцово, 1998

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте молекулярной биологии Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» Минздрава РФ.

Научный руководитель:

доктор биологических наук В.Б. Локтев

Официальные оппоненты:

профессор, доктор биологических наук С.Н. Щелкунов профессор, доктор медицинских наук А.Н. Евстропов

Ведуша " срг ан кзаиия:

Институт биорганической химии СОР АН

о о

асов на заседании

т: <¿4, CjlUuill Л 1998 г. в ß ч диссертационного совета Д 074.20.01 в КИИ молекулярной биологии ГН1Д ВБ «Вектор-) по адресу: 633159 Колыюво Новосибирской области.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор».

Автореферат разослан t^Ö Дл) h\99& г.

Ученый секретарь диссертационного совета

/Т.Н. Шубина/

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. Ранние стадии флавивирусной инфекции, особенно взаимодействие вирусных частиц с чувствительной клеткой изучены недостаточно полно. Посвященные изучению этого вопроса работы фрагментарны и отрывочны. Они не позволяют полно описать процесс проникновения флавивирусов в клетку, представить во всех деталях механизм проникновения вирионов через мембрану клетки и определить молекулы вируса и клетки, а также их основные домены, участвующие в этом процессе. Первые фазы взаимодействия вируса и клетки являются важнейшими в определении тропизма вирусов, их вирулентности и патогенности. Знание механизмов рецепторного взаимодействия вируса и клетки дает принципиально нозые возможности в создании новых антивирусных препаратов и разработке новых способов профилактики и лечения вирусных инфекций.

К сожалению, можно констатировать, что процесс рецепторного взаимодействия вируса клещевого энцефалита (КЭ) с клеткой во многом остается непонятным. Широкий тканевой тропизм флавивирусов, в том числе и вируса КЭ, а именно, способность реплицироваться в клетках различного видового происхождения, инфицировать насекомых, птиц и различных млекопитающих позволяет предположить, что взаимодействие вируса КЭ с клеткой значительно сложнее, чем представлялось ранее. Вполне возможно, что он способен использовать несколько различных клеточных молекул в качестве рецепторных и обладает способностью проникать в чувствительную клетку различными способами.

ЦЕЛЬ II ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Цель настоящей работы заключалась в поиске и выделении клеточного рецептора для вируса КЭ при помощи антиидиотипических антител При этом решались следующие задачи:

формирование коллекции гибридом, секретируюших моноклональные антитела (МКА) против нативного гликопротеина Е вируса КЭ

- исследование антигенной структуры гликопротеина Е при помощи полученных МКА. Картирование эпитопов белка Е, предположительно участвующих в рецепторном взаимодействии с клеткой.

- получение поликлональных и моноклональных АИА к рецепторным сайтам белка Е.

- изучение основных свойств этих АИА и их способности моделировать рецепторные эпигопы гликопротеина Е вируса КЭ.

- использование антирецепторных антител для выделения и идентификации клеточного рецептора для вируса КЭ методами аффинной хроматографии.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.

Создана коллекция гибридом, секретируюших МКА к вирусу клещевого энцефалита, штамм 205, состоящая из 14 мышиных клеточных линий. Коллекция депонирована в банке гибридом ГНЦ ВБ "Вектор". Полученные моноклональные антитела используются для проведения научно-исследовательских работ, связанных с конструированием рекомбинантных

антител против вируса КЭ и изучением экспрессии белка Е флавивирусов в различных системах экспрессии. МКА используются для картирования на третичной структуре белка Е эпитопов связывания антител методами фагового дисплея. Препараты МКА использованы для конструирования диагностических тест систем для выявления антигена и антител к клещевому энцефалиту.

С помощью панели моноклональных антител к гликопротеину Е вируса КЭ, штамм 205, изучена антигенная структура данного белка. Предложена карта антигенной структуры гликопротеина Е, включающая в себя 8 сайтов, объединяющих 12 эпитопов связывания МКА. Эпитопы сайтов е4, е7 и е8 вовлечены в реакцию торможения гемагглготинации, а один эпитоп сайта е7 связан с нейтрализацией вируса КЭ, штамм 205.

Создана коллекция из 3 крысиных клеточных линий, секретируюших антиидиотипические МКА, моделирующих рецепторные эпитрпы белка Е вируса КЭ, штамм 205. Коллекция депонирована в банке гибридом ГНЦ ВБ "Вектор". Получены поликлональные кроличьи АИА, взаимодействующие с активным центром антивирусных МКА ЕбВ и 10Н10 и моделирующих эпитопы белка Е вируса клещевого энцефалита.

Поликлональные АКА использованы для выделения клеточного рецептора вируса КЭ при помощи метода аффинной хроматографии на антиидиотипических антителах. Получены высокоочищенные препарата рецептора, анализ которых показал, что очищенные фракции содержат полипептиды с молекулярной массой 43, 67, 110 и 210 кДа.

Спот-анализом и ИФА при помощи панели антител к некоторым видам интегрина человека проведена иммунохимическая идентификация выделенных белковых молекул рецептора. Показано, что очищенные

препараты клеточного рецептора содержат в своем составе аЗ[)1 лнтегрин человека.

Полипепттгд с молекулярной массой 67 кДа предварительно идентифицирован, как ламининовый рецептор.

Впервые сформулирована гипотеза, что ламининовый рецептор и аЗр1 интегрин человека могут являться клеточными молекулами, участвующими в рецепторном взаимодействии с вирионами вируса КЭ.

Подтверждено наличие специфического взаимодействия нативного белка Е в составе вириона КЭ с рекомбинантным ламининовым рецептором человека.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1 Создание коллекции гибридом, секретирующих моноклональные антитела к вирусу клещевого энцефалита, штамм 205. Построение карты антигенной структуры гликопротеина Е, включающей в себя 8 сайтов, объединяющих 12 эпитопов связывания МКА.

2 Создание коллекции гибридом, секретирующих моноклональные АИА, которые моделируют эпитопы белка Е вируса КЭ, штамм 205.

3 Получение поликлональных кроличьих АИА. Установление факта, что препараты поликлональных АИА эффективно моделируют эпитопы белка Е вируса клещевого энцефалита. Они способны вызывать появление антивирусных антител при иммунизации животных, взаимодействовать с клетками СПЭВ и ЯН и 1гх мембранными фракциями, а также вызывать гемагглютинацию гусиных эритроцитов.

4 Применение метода аффинной хроматографии на антиидиотипических

6

антителах для проведения выделения клеточного рецептора вируса клещевого энцефалита. Получение высокоочищенных препаратов рецептора, которые содержат полипептиды 43, 67, 110 и 210 кДа. Взаимодействие АИА с полипептидом 67 кДа в иммуноблотпшге.

5 Установление факта, что выявленный полипептид с молекулярной массой 67 кДа является ламининовым рецептором человека, и что белок Е в составе вириона КЭ эффективно взаимодействует с рекомбинантным ламининовым рецептором.

6 Предположение, что очищенный препарат клеточного рецептора содержит в своем составе альфаЗ(210кДа) бета1(110кДа)-интегрин человека, который может являться рецепторной молекулой на поверхности клеток RH для вируса КЭ.

АПРОоАЦПЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации были представлены на следующих конференциях, симпозиумах: Вторая всесоюзная конференция "Геном человека - 91" ВИНИТИ, Москва, 1991 ; Вторая всесоюзная планово-отчетная конференция "Генная и клеточная инженерия", Москва, 1992; Межведомственная конференция. Изучение и профилактика особо опасных вирусных инфекций, Кольцово , 1993; Третья всероссийская планово-отчетная конференция по направлению "Генная и клеточная инженерия", Москва, 1993; Vllth International conference of comparative and applied virology, Montreal, Quebec, Canada, 1994; Научная конференция. Актуальные вопросы современной медицин., Новосибирск, 1995; Xth International Congress of Virology, Jerusalem, Israel, 1996; International Scientific Confercncc "Tiek-Bome Viral, Rickettsial and bacterial infections" Irkutsk, Russia, 1996; Научная конференция "Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера", Новосибирск, 1998

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ.

СТРУКТУРА РАБОТЫ. Работа состоит из введения, обзора литературы, результатов и их обсуждений, выводов и примечаний. Работа изложена на 120 страницах, включая 98 страниц текста, 18 рисунков, 12 таблиц и списка литературы (205 ссылок)

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

МАТЕРИАЛЫ II МЕТОДЫ.

В работе использовали штаммы Софьин и 205 вируса КЭ и штамм Пекин-1 вируса Японского энцефалита (ЯЭ). Вирусы были получены из Государственной коллекции вирусных штаммов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН. Вирусы КЭ и ЯЭ нарабатывали на культурах клеток СПЭВ и/или RH. Наработку и очистку вирусов КЭ и ЯЭ проводили согласно модифицированной методике, предложенной Enzmann and Weiland (1979).

Концентрацию белка оценивали при помощи набора "Bio-Rad Protein Assay Kit" с использованием в качестве стандарта БСА.

Для иммунизации и получения асцитных жидкостей использовали мышей линии BALB/C и крыс линии LOU. Для слияния брали культуру мыминой миелоиы РЗ NS 1/1-Ag4.1 (NS-1) и крысиной миеломы 210RC-Y3-Ag 1.2.3 (Y-3). Для выращивания культур клеток использовали среду Игла MEM в модификации Дульбекко, селективную среду HAT, эбриональную

сыворотку ("Flow", Англия). Клетки выращивали в термостатируемом СО: -инкубаторе при температуре 37°С и концентрации СОг равной 7%.Слияние клеток (гибридизацию) проводили с помощью полиэтиленгликоля согласно методике, предложенной Geíter et al..(1977). Очистку МКА с помощью каприловой кислоты проводили, как описано в работе Mc'Kinney and Parkinson (1987).

Класс и подкласс иммуноглобулинов МКА определяли методом ИФА с использованием козьих антител против подклассов иммуноглобулинов мыши по предлагаемой к набору ("Sigma", США) инструкции.

Мечение антител биотипом проводили раствором эфира биотин-сукцинимида в диметилсульфоксиде из расчета 1 мг антител 250 мг эфира. Инкубировали при комнатной температуре, а после этого диализовали против фосфатного буфера.

Белки, разделенные электрофорезом в полиакриламидном геле, как описано Laemli (1970), переносили на нитроцеллюлозную мембран}' ("Millipore", США) по методу Towbin et al. (1979). Перенос проводили в течение 1.5 часов на аппарате Transphor фирмы "LKB" (Швеция) при напряжении 80В. (иммуноблотинг)

ИФА проводили, как описано ранее (Разумов и др., 1991), и измеряли оптическую плотность образцов на спектрофотометре "Uniscan" (Финляндия) с использованием светофильтра с максимумом пропускания 450 нм.

Реакцию нейтрализации вируса КЭ выполняли микрометодом, описанным Chañas et al. (1976).

Микро.метод РТГА проводила, как описано Clark and Casals (1958) Электрофорез проводили по Laemmli (1970) с использованием 8-12 % полиакриламидного геля с 0,1 % додецилсульфата натрия. Окраску гелей

проводили при помощи Кумасси 0-250. Выделение мембранных фракций проводили по методу ТотавБШ! & Со1оппо (1986). Клеточные мембраны лизировапи 0.3% дезоксихолатом натрия.

Аффинную хроматографию проводили на колонке с БерНагоБе - ВгСИ с иммобилизованными поликлональными или моноклональными АИА. После нанесения на колонку лизата мембран, колонку промывали 0.5% дезоксихолатом натрия в 20мМ Трис-НС1 буфере, рН-7.4 в течение 1 часа. Препараты клеточного рецептора элюировали с колонки буфером, содержащим 50мМ дизтиламина, рН-11.5.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Получение и характернзация МКА к вирусу КЭ

Была создана оригинальная коллекция гибридом к вирусу клещевого энцефалита, штамм 205, состоящая из 14 мышиных клеточных линий. В настоящее время полученные гибридомы хранятся в банке гибридом ГНЦ ВБ "Вектор". МКА к вирусу КЭ были наработаны в виде асцитных жидкостей и культуральных сред (культуральная среда, в которой росли гибридные клетки) для использования в дальнейшей работе. Основные характеристики моноклональных антител, специфичных к вирусу КЭ, представлены в табл.1.

Панель МКА, полученная в ходе данной работы, позволила построить карту антигенной структуры поверхностного гликопротеина Е вируса КЭ, штамм 205 (рис. 1).

На гликопротеине Е удалось картировать 8 антигенных сайтов, 2 из ни; частично перекрывающихся, 3 сайта способны индуцировать МКА,

блокирующие реакцию вирусной гемагглютк нации и 1 сайт индуцирует МКА, нейтрализующие вирусную инфекционность на :-улыуре клеток. Карта антигенной структуры гликопротеппа Е вируса КЭ, штамм 205, отличается от ■зпи -опчой карты штамм я Софьин (работы Цехачовской) тем, что домены Е1 и Е2 перекрываются.

Таблица 1

Сгопстпа МКА, полученных к вирусу КЭ.

МКА Домены белка Е Лч>Ал Г i ГА Класс глобулинов

Е6В Е2 656100 + + - IgGl

10JI10 Е2 213700 - + 218700 IgG2b

4С7 El 24300 - + 2700 IgGl

13D12 н.о. 72900 - + 900 ILO.

ЗСЗ El 218700 - - 218700 IgGl

4F6 Е1-Е2 218700 - - - IaGl

Е'.А н.о. 2137СЭ - - - и.о.

7F10 El. 72900 72900 ------ —--- - IgGl

6В9 Е1-Е2 - IaGI

13F6 Е2 218700 - — - IgGl

ЕВ1 Е2 656100 - - IgGl

7D3 - 900 - - - IgGl

12С7 900 - - - и.о.

SC б - 8100 - - - IgM

Примечания: *- обратные величины титров; + - наличие взаимодействия ч титре РК^ЮСЮ, РТГА>40; - - отсутствие взаимодействия в РН<10; РТГЛ<4; н.о. - не определяли. Классификация доменов белка Е вируса КЭ, штамм 205,по Tsckhanovskaya et а' (1993).

Изучение специфичности МКА показало, чго МКА 10К1С и Е6В обладают ачтигемагглютинирующей активностью и распознают два различных сайта белка Е вируса КЭ. Консерватизм эпитопов, распознаваемых данными антителами, их способность блокировать реакцию гемагглютинации позволили предположить, что МКА 10Н10 и ЕбВ распознают эпитопы белка

Е, участвующие во взаимодействии вируса и клетки. МКА 10Н10 и Е6В были исполъзовг.ны для получения кроличьих поликлонапышх антиидиотипических антител (АИА) и крысиных антиидиотигшческих МКА, моделирующих рецепторные районы белка Е вируса КЭ.

Рисунок 1 Карта аптигснноГ| структуры rji.iKonporeiiiia Е вируса КЭ, штамм 205.

сЗ

Обозначения: [ | - Отсутствие биологических функций

-FITA. - РТГА, РН

Получение и изучение свойств антиидиотипических моноклональных и поликлональных антител к МКА ЕбВ и 101110

Была создана коллекция гибридом к МКА ЕбВ и 10Н10 против вируса КЭ, штамм 205, состоящая из 3 крысиных клеточных линий. Коллекция депонирована в банке гибридом ГНЦ ВБ "Вектор". Получены поликлональные кроличьи АИА к МКА ЕбВ и 10Н10.

Полученные кроличьи поликлональные АИД. и крысиные моноклональные АИА взаимодействовали с МКА к вирусу КЭ в присутствии избытка нормальной мышиной сыворотки и не реагировали с нормальными мышиными иммуноглобулинами, нанесенными в качестве подложки на твердую фазу (рис. 2,3)

Рисунок 2. Взаимодействие поликлональных АИА с мышиными антивирусными МКА в непрямом варианте иммуноферментного анализа.

На твердую фазу сорбированы очищенные МКА в концентрации 10мкг/мл. 1 -взаимодействие АЛА 10Н10 с МКА 10Н10, 2 - АИА Е6В с МКА ЕбВ; 3 - нормальной кроличьей сыворотки с антивирусными МКА; 4 - в качестве подложки была нанесена нормальная мышиная сыворотка в концентрации Ю мкг/мл для оценки взаимодействия с АИА ЕбВ и АИА 10Н10.

Разведение

Рисунок.З

Взаимодействие антиидиотипических крысиных МКА с мышиными МКА против вируса КЭ в иммуноферментном анализе.

На твердую фазу сорбированы очищенные мышиные МКА 10Н10 в концентрации 10мкг/мл. 1 - взаимодействие с МКА АИА 8ЕБ; 2-е крысиными гюликлональными АИА полученными к МКА 10Н10; 3 - с МКА АИА 4011; 4 - с МКА АИА 2А9; 5 - с нормальной крысиной сывороткой.

Эти данные позволили предположить, что АИА взаимодействуют с активным центром антивирусных МКА и несут на себе паратопы вируса КЭ.При иммунизациии очищенными препаратами АИА беспородных белых мышей было обнаружено появление антител, взаимодействующих с очищенным в градиенте плотности вирусом. Это позволило расценить их, как «антирецепторные» антитела и попытаться с их помощью выделить и идентифицировать клеточный рецептор вируса КЭ.

Изучение возможности использования АИА как «антирецепторных» антител.

Изучение способности АИА взаимодействовать с клеточными рецепторами было проведено с использованием мембранных фракций различных культур высокочувствительных к вирусу КЭ клеток и гусиных эритроцитов. В табл. 2 представлены данные иммуноферментного анализа по связыванию различных типов АИА с препаратами мембранных фракций, выделенных из различных клеток и сорбированных на твердой фазе полистироловых планшет.

Таблица 2. Изучение взаимодействия АИА с мембранными

_фракциями различных видов клеток._

__Титр в ИФА (обратные величины)_

АИА Контро Мембранные фракции клеток

ль

НМС Y-3 RH СПЭВ Эритроци т

MKA4G11 <10 <10 270 90 н.о

МКА2А9 <10 <10 270 90 н.о

МКА 8Е8 <10 <10 90 90 н.о

АИАЕ6В <10 270 7290 2430 21800

АИА <10 90 810 810 2430

10Н10

НКС <10 <10 <10 <10 <10

Примечания: и.о. - не определяли.

Примечание: НМС -нормальная мышиная сыворотка; НКС - нормальная кроличья сыворотка.

Полученные результаты показали, что моноклональные АИА крайне слабо взаимодействовали с мембранными фракциями исследованных клеток, только МКА 4G11 и МКА 2А9 более выражено взаимодействовали с клетками RH (клетки почек эмбриона человека). Поликлоналыше АИА 10Н10 и ЕбВ, особенно АИА ЕбВ, эффективно реагировали с мембранами культур клеток RH, СПЭВ (клетки почки эмбриона свиньи) и эритроцитов. Интересно отметить, что все полученные АИА взаимодействовали, как с МКА Е6В, так и с MICA 10Н10. Это говорило об антигенной схожести эпитопов связывания этих двух типов МКА. Данные конкурентного анализа, показали, что МКА ЕбВ и 10Н10 взаимодействовали с сайтами е7 и е8, соответственно.

Выделение клеточного рецептора.

Для проведения выделения клеточного рецептора вируса клещеного энцефалита был использован метод аффинной хроматографии на антиидиотипических антителах. Суть метода заключалась в получении методом дифференциального центрифугирования наружных мембран клеточной линии RH, их лизиса детергентом в предложенных условиях и последующей очистке белка клеточного рецептора при помощи аффинной хроматографии на колонках с иммобилизованными АИА. Была проведена оптимизация методов выделения рецептора. Один из подходов заключался в проведении сравнительного изучения возможности очистки клеточного рецептора из различных культур клеток и использовании различных типов поликлональных и моноклональных АИА. Полученные результаты показали, что для выделения клеточного рецептора вируса КЭ с успехом могут быть

использованы два вида клеточных культур СПЭВ и RH, причем в обоих случаях, несмотря на различное видовое происхождение клеточных культур, выделяется белок с одинаковым молекулярным весом и сходной иммунохимичсской активностью. Для дальнейшей работы мы остановили свой выбор на использовании APIA 1 OHIO и клегочной культуры RH.

Проведенные серийные очистки в выбранных условиях позволили 1.0Л)Чнть г-лссксочи ценные рег.гптер-., анализ ко- эрых показал,

что очищенные фракции содержали полкнептиды с молекулярной массой 43, 67, 110 и 210 кДа. На рис. 4 представлены результаты электрофоретического анализа фракций, полученных, после аффинной хроматографии, содержащих клеточный рецептор,.

'Дк

205 <3 г:" "" sp i———210

Мб z":; --g ■ км* <-no

97 л_

66 ^ i-л —-— 67

«-1 fci \ Л-,

\ 'IaG

29

л/'

1 2 3 4 5 6 7 8

Рис.4. Аффинная очистка белков клеточной мембраны на колонке с АИА Е6В. Фракции анализировали в БОБ-РАСЕ. Линия 1 - стандарты молекулярных весов; 2 - клеточные мембраны; 3-6 - различные фракции с колонки; 7 и 8 - отрицательный контроль.

Поликлональные и моноклоналыше АИА специфически взаимодействовали в ИФА с полученными очищенными препаратами клеточного рецептора. В иммуноблотгинге поликлональные антитела

взаимодействовали только с белком 67 кДа. (рис. ->)

205

116

97

" " би

-V 45 29

4

Рис. 5. Иммуноблотинг клеточного рецептора для вируса КЭ, очищенного на колонке с АИА 10Ш0.1 - отрицательный контроль с нормальной кроличьей сывороткой; 2 и 3 - взаимодействие с АИА 10Н10 и Е6В; 4 - стандарты молекулярных весов.

Пм.^унмнмичсскан идентификация питегринп человека Молекулярная масса белков 110 и 210 кДа и их приблизительно эквимолярная представленность в очищенных препчратах позволила высказать предположение, что эти белки относятся к интегринам и представляют из себя альфа и бета - цепи инте) рина

При помощи сформированной панели референс-антител к некоторым видам интегрина человека была проведена иммунохимическая идентификация выделенных белковых молекул (Таблица 3).

Таблица 3. Взаимодействие очищенного клеточного рецептора

¡¡пруса КЭ с антителами к различным интсгрннам человека._

Специфичность

Название антител против Снот - ИФА Источник получения ангител ннтегринов анализ

человека

MKjí 16В4 МКА 11G5 I1KAP1D6 г. L'A v;-:ri?9 МКА 8ЕЗ МКАЗЕ1 МКА HAS3 МКА HAS б MICA M-KID2 Поликлон, антитела (кролик) против фибронектина Поликпон антитела (кролик) против витронектина

а2 - цепь аЗ - цепь а.5 - цепь с V - ц;иь р>1 - цепь Р4 - цепь Интегрин а2р1 Интегрин а2р1 Интегрин аЗр] Интегрин а5р1

Интегрин aVB3/B5

Dr. Huüiphries M.J. Dr. Humphries M.J. Dr. lioivaüyji M Dr. Roivainen M Dr. Humpliries M.J. Dr. Roivainen M Dr. Watt F.M. Dr. Watt F.M. Dr. Bartolazzi A. Dr. Roivainen M

Dr. Roivainen M

Примечание: - МКА - моноклональпые антитела; оснозываясь на паспортных данных антител. "Ч" пли слот анализе; "-" отс>тстпие взаимодействия в С-ют-аналнз и ИФА показали,

ИФА и спот анализ проводили, наличие взаимодействия в ИФА этих тестах, что четыре вида антител

взаимодействовали с очищенными препаратами клеточного рецептора вируса КЭ. Моноклональпые антитела 8ЕЗ получены против бета 1 цепи интегрина человека, их взаимодействие с препаратом клеточного рецептора показывает наличие бста1 цепи в препарате клеточного рецептора. Молекулярный вес бета 1 цепи интегрина при электрофорезе в ПААГ составляет приблизительно 110 кДа. Это удовлетворительно совпадает с наблюдаемым полипептидом с

+

+

+

+

молекулярной массой 110 кДа в очищенном препарате клеточного рецептора. Высокомолекулярная разновидность альфаЗ - цепи интегрина человека имеет молекулярный вес при электрофорезе в ПААГ, приблизительно, 210-225 кДа. Это полностью совпадает с наблюдаемой электрофоретической подвижностью белка 210 кДа в очищенном препарате клеточного рецептора из клеток RH. Наличие взаимодействия моноклональных антител M-KID2 к интегрину человека альфаЗбета1 подтверждает присутствие этого интегрина в составе полученных препаратов очищенного клеточного рецептора вируса КЭ, и альфаЗбета1-интегрин человека может являться рецепторной молекулой на поверхности клеток RH для вируса КЭ.

ЛаминнновыП рецептор, как рецептор для вируса КЭ

Электрофоретический анализ показал, что удалось получить высокоочищенный препарат клеточного рецептора с молекулярной массой 67 кДа. Этот белок был предварительно идентифицирован, как ламининовый рецептор. Для подтверждения этого предположения были использованы рекомбинантные белки ламининового рецептора (LBP), а именно, полноразмерный белок - recLBP и его С-концевая часть -recCLBP, любезно предоставленные Сорокиным A.B. и Качко A.B.

Для идентификации и точной характеризации выделенных рекомбинантных продуктов были использованы МКА М1иС5 и MPLR Pool (смесь из 9 типов MRA) к высокоаффинному ламининовому рецептору, любезно предоставленные Dr. S. Menard, Национальный институт рака, Милан, Италия. Иммуноблоттинг, проведенный с моноклональными антителами MPLR Pool, показал наличие взаимодействия с обоими вариантами рекомбинантных белков recLBP и recCLBP (рис.6).

(

66 кДа 45 кДа

О

1 1

29 кДа I '

24 кДа

I

t .

I

1 2 3 4 5 6 7

- Рис. 6. Иммуноблстинг очищенных рекомбинантных рецепторных белков LBP и CLBP с различными антителами. Стрипы 2, 4. 6 -отрицательные контроля: 1 - взаимодействие белка LBP и АИА 10Н10; 3 -белка LBP и АИА Е6В; 5 - белка CLBP и МКА MPLR Pool против ламининового рецептора; 7 - белка LBP и МКА MPLR Pool.

. Это позволило сделать вывод о полной тождественности полученных продуктов высокоаффинному ламининовому рецептору человека. Оценка взаимодействия белка recLBP с «антирецепторными» антителами (АИА и поликлональная кроличья анти-LBP сыворотка) в ИФА показала наличие выраженного взаимодействия. Проведенный иммуноблоттинг подтвердил это взаимодействие и показал. что «антирецепторные» антитела взаимодействовали с полипептидами 40 и 67 кДа (рис. 6).

Это позволило предположить, что рецепторный район белка recLBP

I»»

охранил свою конформацшо и способен взаимодействовать с белком Е вируса КЭ. ИФА показал, что нативный белок Е в составе вириона КЭ, сорбированный на твердую фазу пластиковых планшет, эффективно взаимодействовал с рекомбинантным белком ЬВР (рис. 7).

-rfccLBP i -recVP40 [ -ИКС

1 /too 1/300 1/900 1/2700 1/Э1

-soo -

Разведение

Рисунок 7. Взаимодействие белка Е вируса КЭ с рекомбинантным ламининовым рецептором в ИФА.

На твердую фазу нанесено 200 нг очищенного вируса КЭ. RecLBP и iecVP40(Mapoypr) - ъзаи.модействие с белком Е. Поликлональная кроличья сыворотка против recLBP и НКС (нормальная кроличья сыворотка) взяты в разведении 1:1000. Статистическая обработка сделана с помощью компьютерной программы Excel 7.0, достоверность 95%.

Иммуноблотгинг подтвердил специфичность взаимодействия этих двух белков (рис. 8).

$$_ з

ббкДа

45кД.<

ЗькДа

Рис. 8. Иммуноблоттинг очищенного белка Е вируса КЭ с рекомбинантным белком LBP. Стрипы 1,3 - отрицательные контроля; 2 -взаимодействие белка LBP и белка Е вируса КЭ.

Таким образом, фракции, полученные с колонки с АИА, содержат в своем составе альфаЗбета1-интегрин человека и белок с молекулярной массой 67 кДа. Этот белок был предварительно идентифицирован как ламининовый рецептор. Нативный белок Е в составе вириона КЭ эффективно взаимодействовал с рекомбинантным белком ламининового рецептора.

ВЫВОДЫ

1. Создана коллекция гибридом к вирусу клещевого энцефалита, штамм 205, состоящая из 14 мышиных клеточных линий. Коллекция клеточных гибридных линий депонирована в банке гибридом ГНЦ ВБ "Вектор".

2. С помощью панели моноклональных антител к гликопротеину Е вируса КЭ, штамм 205, изучена антигенная структура данного белка.

Предложена оригинальная карта антигенной структуры гликопротеича Е, включающая в себя 8 сайтов, объединяющих 12 эпигопов связывания МКА. Эпитопы сайтов е4, е7 и е8 вовлечены в реакцию торможения гемагглютинации, а один эпигоп саша е7 связан с нейтрализацией вируса КЭ, штамм 205.

3. Получена коллекция из 3 крысиных гибридом, секретирующих моноклональные АИА, которые моделируют эпитопы белка Е вируса КЭ, штамм 205. Коллекция депонирована в банке гибридом ГНЦ ВБ "Вектор'".

4. Показано, что препараты поликлональных кроличьих АИА эффективно моделируют эпитопы белка Е вируса клещевого энцефалита. Они способны индуцировать появление антивирусных антител при иммунизации животных, взаимодействовать с клетками СПЭВ и 1Ш и их мембранными фпакциями, а также вызывать гемагглютинацию гусиных эритроцитов, поэтому АИА могут быть использованы в качестве лиганда для очистки клеточного рецептора из мембранных фракций клеток.

5. С использованием метода аффинной хроматографии лизата клеточных мембран на колонке с иммобилизованными антиидиотипическими антителами получены высокоочищенные препараты рецептора, которые содержат полипептиды 43, 67, 110 и 210 кДа., причем, АИЛ взаимодействуют в иммуноблотинге только с белком 67 кДа.

6. При помощи панели референс-антител к интегринам человека проведена иммунохимическая идентификация выделенных полипептидов. Показано, чю очишепный препарат клеточмо;о реце тгорг. содержит в своем составе альфаЗ(210кДа) бета1(110кДа)-интегрин человека.

7. Впервые получены данные о том, что выделенный лилипетнд, с молекулярной массой 67 кДа является ламинйновым рецептором человека.

Белок Е в составе вириона КЭ эффективно взаимодействует с рскомбинантнпм ламининовым рецептором. Высказано предположение о ведущей роли ламининового рецептора во взаимодействии вируса и клетки.

8 На основании экспериментального выделения двух ламишшевязывающих молекул (ачьфаЗ бета1-интегрин и ламининовый рецептор) в качестве клеточных рецепторов для вируса КЭ и данных анализа антгенной структуры белка Е высказана гипотеза о наличии не менее двух ламининподобных рецепторных районов на белке Е вируса клещевого энцефалита.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Протопопова Е.В., Хусаинова А.Д., Коноралова С.Н., Локтев В.Б. Получение и характеризация антиидиотипических антител несущих на своей поверхности гемагглютинирующие паратопы вируса клещевого энцефалита. // Вопр. вирусол., 1996, №2, 50-53

2. Протопопова Е.В., Коновалова С.Н., Локтев В.Б. Выделение клеточного рецептора для вируса клещевого энцефалита при помощи антиидиотипических антител. // Журнал инфекционной патологии, 1996, т.З, N 4, 60-63

3. Белавин П.А. Нетесова H.A., Решетников С.С., Иванисенко В.А., Ерошкии A.M.. Протопопова Е.В., Локтев В.Б., Малыгин Э.Г. Экспрессия фрагментов гена Е вируса японского энцефалита в клетках Escherichia coli. // Биотехнология, 1997, N 3,.3-9

л Протопопова Е.В., Коновалова С.Н., Локтев В.Б. Выделение клеточного рецептора для вируса клещевого энцефалита при помощи антиидиотипических антител. // Вопр. вирусол., 1997, т. 42, N 6, 264-268

5 Чешенко H.В., Петров B.C., Протопопова Ь.В., Нетесова H.A., Коновалова С.Н., Белавин П.А., Локтев В.Б., Малыгин Э.Г. Рекомбинантный вирус осповакцины экспрессирующий белок Е вируса японского энцефалита. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 1997, N 3, 24-27

6 Локтев В.Б., Перебоев A.B., Протопопова Е.В., Разумов И.А. и др., Поиск и изучение структуры гена клеточного рецептора для вируса клещевого энцефалита. // Вторая всесоюзная конференция "Геном человека - 91" ВИНИТИ, тезисы докладов, Москва, 1991, с.90

7 Нетесов C.B., Локтев В.Б., Протопопова Е.В., Хусаинова А.Д., и др., Поиск и изучение струкгуры гена клеточного рецептора для вируса клещевого энцефалита. // Вторая всесоюзная планово-отчетная конференция "Генная и клеточная инженерия", тезисы докладов, Москва, 1992, с. 40

S Протопопова Е.В., Хусаинова А.Д., Ксноьачова С.Н., Локтев В.Б. Получение и характеризация антиидиотипических антител, блокирующих взаимодействие вируса клещевого энцефалита с эритроцитами. // Межведомственная конференция «Изучение и профилактика особо опасных вирусных инфекций», 7-8 апреля, тезисы докладов, Кольцово, 1993, с.35.

9 Локтев В.Б., Протопопова Е.В., Хусаинова А.Д., Коновалова С.Н. Поиск и изучение структуры гена клеточного рецептора для вируса клещевого энцефалита. // Третья всероссийская планово-отчетная конференция по направлению "Генная и клеточная инженерия", тезисы докладов, Москва, 1993, с. 22

10 Protopopova E.V,. Kliusaínova A.D,.Konovalova S.N,.Loktev V.B Identification of the cell surface receptor for Tick-Borne Encephalitis virus by using anti-idiotypic antibodies. // VHth International conference of comparative and applied virology, Montreal, Quebec, Canada, October Í2-17, Abstract, P4-51, 1994, p. 130.

11 Протопопова Е.В., Хусаинова А.Д., Коновалова С.Н., Локтев В.Б. Изучение возможности использования антиидиотипических антител для формирования иммунитета к вирусу клещевого энцефалита.// Научная конференция «Акту.щьные вопросы современной медицины», тезисы докладов, Новосибирск, 1995,. Т. 2, с. 202-204.

12 Loktev V.B., Protopopova E.V., Khusainova A.D., Konovalova S.N Identification of the cell surface receptor for tick-borne encephalitis virus by using anti-idiotypic antibodies. // Xth International Congress of Virology, Jerusalem, Israel 11-16 August, Abstract, PW13-5,1996, p 134

13 Loktev V.B, Protopopova E.V.,. Khusainova A.D, Konovalova S.N. Identification of the cell surface receptor for Tick-borne encephalitis vims by using anti-idiotypinc antibodies. // International Scicntific Conference "Tick-Bome Viral, Rickettsia! ?nd bacterial infections" Irkutsk. Russia, Septun 24-26, Abstract, 199C, p 41-42.

14 Протопопова E В,. Сорокин A.B, Качко А.В., Коновалова C.H., Ерошкин A.M., Иванова A.B.,. Нетесов С.В, Локтев В.Б. Ламининовый рецептор человека как клеточный рецептор для вируса клещевого энцефалита // Научная конференция "Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего востока и Крайнего Севера", 10-11 апреля, тезисы докладов. Новосибирск, 1998, с. 13.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Протопопова, Елена Викторовна, Кольцово

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ

РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ВИРУСОЛОГИИ И БИОТЕХНОЛОГИИ « ВЕКТОР» НАУЧНО - ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ

ПРОТОПОПОВА ЕЛЕНА ВИКТОРОВНА

ПОИСК И ВЫДЕЛЕНИЕ КЛЕТОЧНОГО РЕЦЕПТОРА ДЛЯ ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА ПРИ ПОМОЩИ АНТИИДИОТИПИЧЕСКИХ

АНТИТЕЛ.

на правах рукописи

03.00Ю6.- вирусология

Диссертация ч"

на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

научный руководитель: доктор биологических наук В.Б. Локтев.

Кольцово - 1998

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список использованных сокращений. 5

ВВЕДЕНИЕ 7

ГЛАВА 1. Обзор литературных данных. 16

1.1 Вирус клещевого энцефалита. 16

1.1.1. Общая характеристика. 16

1.1.2. Структура вириона. 20

1.1.3. Строение генома. 21

1.1.4. Трансляция и процессинг полипротеинов. 22

1.1.5. Элементы консервативной РНК последовательности. 24

1.1.6. Структура белка Е. 26

1.2. Клеточные рецепторы, используемые вирусами. 33 1.2.1 Общая характеристика клеточных рецепторов, используемых вирусами. 33

1.2.2. Рецепторы и вирусный тропизм. 41

1.2.3. Биологические эффекты, возникающие в результате взаимодействия вируса и рецептора. 47

1.2.4. Поиск и изучение агентов, которые предотвращают прикрепление вируса к рецепторам клетки - хозяина 49

1.3. Заключение по обзору литературы. 54 ГЛАВА 2. Исходные материалы и основные методы. 57

2.1. Исходные материалы. 5 7

2.1.1. Материалы и реактивы. 57

2.1.2. Антитела к интегринам человека. 57

2.1.3. Рекомбинантные белки 58

2.2. Основные методы. 58 2.2.1. Животные. 58

2.2.2. Вирусные препараты. 58

2.2.3. Клеточные культуры 60

2.2.4. Иммунизация животных. 60

2.2.5. Получение гибридом. 61

2.2.6. Криоконсервация гибридных клеточных линий. 63

2.2.7. Наработка препаративных количеств МКА in vivo. 63 2.2.8.Очистка препаратов МКА. 64 2.2.9.0пределение класса и подкласса иммуноглобулинов МКА. 65

2.2.10. Биотинилирование белков. 65

2.2.11. Иммунологические методы 65

2.2.11.1. Иммуноферментный анализ. .66

2.2.11.2. Иммуноблоттинг. 66

2.2.11.3. Реакция нейтрализации. 67

2.2.11.4. Реакция торможения гемагглютинации. 68

2.2.12. Электрофорез 68

2.2.13. Выделение клеточных мембран. 68

2.2.14. Аффинная хроматография. 69 ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение исследований. 70

3.1. Получение коллекции гибридом к вирусу КЭ. 70

3.2. Получение и характеризация МКА к вирусу КЭ. 74

3.3. Заключение по разделу. 81

3.4. Получение антиидиотипических моноклональных антител к МКА Е6В и 10Н10. 84

3.5. Получение кроличьих антиидиотипических поликлональных антител к МКА Е6В иЮНЮ 89

3.6. Изучение свойств поликлональных и моноклональных АИА. 89

3.7. Заключение по разделу. 91

3.8.-. Изучение возможности использования АИА как «антирецепторных»

антител. 93

3.9. Выделение клеточного рецептора. 97

3.10 Заключение по разделу. 110

3.11. Иммунохимическая идентификация интегрина человека 111

3.12 .JIамининовый рецептор как рецептор для вируса КЭ 116

3.13. Иммунохимическая идентификация рекомбинантных рецепторных молекул. 118

3.14. Заключение. 119 ВЫВОДЫ. 126 Список используемой литературы. 128 Приложения. 152

Список использованных сокращений.

АГ - антиген;

АЕ - аглютинирующая единица;

АИА - антиидиотипические антитела;

а.о. ' - аминокислотные остатки;

АС - антисыворотка;

АТ - антитела;

БСА - бычий сывороточный альбумин;

ГАТ - гипоксантин, аминоптерин, тимидин;

ДМСО -диметилсульфоксид;

ЗФР - забуференный физраствор;

ИФА - иммуноферментный анализ;

КРС - крупный рогатый скот;

КЭ - клещевой энцефалит;

МКА - моноклональные антитела;

НКС - нормальная кроличья сыворотка;

НМС - нормальная мышиная сыворотка;

ПЭГ - полиэтиленгликоль;

РН - реакция нейтрализации;

РТГА - реакция торможения гемагглютинации:

СПЭВ - клетки почки эмбриона свиньи;

ТЦПД - тканевая цитопатическая доза;

у.е. - условные единицы;

ФБС - фетальная бычья сыворотка;

ФЭК - фибробласты эмбриона курицы;

ЯЭ - Японский энцефалит;

Абу - антисыворотка;

ВНК - клетки почки сирийского хомячка;

CDR2 - второй комплементарно-определяющий район;

HIV - вирус иммунодефицита человека;

HLA - лейкоцетарный антиген человека;

МНС - молекула главного комплекса гистосовместимости;

NRK -нормальные фибробласты почки крысы;

OD - оптическая плотность;

recLBP - рекомбинантный белок ламининового рецептора;

RGD - Arg - Gly -Asp;

RH - клетки почки эмбриона человека;

SIV - вирус иммунодефицита обезьян;

VAP - вирусный прикрепляющий белок.

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность проблемы.

Ранние стадии флавивирусной инфекции, особенно взаимодействие вирусных частиц с чувствительной клеткой, изучены недостаточно полно. Работы, посвященные изучению этого вопроса, фрагментарны и отрывочны. Они не позволяют полно описать процесс проникновения флавивирусов в клетку, представить во всех деталях механизм проникновения вирионов через мембрану клетки и определить молекулы вируса и клетки, а также их основные домены, участвующие в этом процессе. Первые фазы взаимодействия вируса и клетки являются важнейшими в определении тропизма вирусов, их вирулентности и патогенности. Знание механизмов рецепторного взаимодействия вируса и клетки дает принципиально новые возможности в создании антивирусных препаратов и разработке новых способов профилактики и лечения вирусных инфекций.

Вирус клещевого энцефалита (КЭ) является типичным флавивирусом и крайне широко распространен на территории России. Ежегодно регистрируется от 6000 до 10000 случаев этого крайне тяжелого инфекционного заболевания (ЗНиСО, 1997). Поэтому разработка новых подходов для профилактики и лечения этого заболевания имеет большое медицинское значение. К сожалению, можно констатировать, что процесс рецепторного взаимодействия вируса клещевого энцефалита с клеткой во многом остается непонятным. Широкий тканевой тропизм флавивирусов, в том числе и вируса КЭ, то есть их способность реплицироваться в клетках различного видового происхождения, инфицировать насекомых, птиц и различных млекопитающих, позволяет предположить, что взаимодействие вируса КЭ с клеткой значительно сложнее, чем представлялось ранее. Вполне

возможно, что он способен использовать несколько различных, расположенных на поверхности клетки, молекул в качества рецепторных и обладает способностью проникать в чувствительную клетку различными способами. Поэтому, механизм проникновения в клетку вируса КЭ, также как и других флавивирусов, представляет значительный научный и практический интерес (Hase et al, 1989).

Недавно появилось сообщение о попытке обнаружения клеточного рецептора для вируса клещевого энцефалйта при помощи антиидиотипических антител (Тимофеев и др., 1990; Maldov et al, 1992). Был обнаружен полипептид рПО, с которым взаимодействовали антиидиотипические антитела, однако, не удалось выделить значимые количества клеточного рецептора, идентифицировать его природу и подробно исследовать взаимодействие вируса и клетки. Методы электронной микроскопии позволили установить, что флавивирусы способны проникать в клетку различными путями: слиянием мембран, рецепторно опосредованным эндоцитозом и транслокацией (Hase et al, 1989). Однако, выполненные ранее работы не дают точной информации о клеточных молекулах, участвующих в этих процессах и, как следствие этого, не дают возможности сформулировать рабочие гипотезы о молекулярных основах взаимодействия вируса КЭ и клеток.

Вышесказанное показывает, что актуальность, своевременность и практическая значимость исследуемой проблемы связана с недостаточностью наших фундаментальных знаний о рецепторных взаимодействиях вируса КЭ и клетки, с возможностью использования этих знаний для поиска новых способов блокирования проникновения вируса в клетку с целью создания новых антивирусных препаратов, воздействующих на рецепторное взаимодействие вириона и клетки. Важность проблемы также связана с необходимостью установления контроля над заболеваемостью клещевым

энцефалитом в нашей стране; и высокой эпидемической значимостью других флавивирусов, таких как вирусы Денге., Японского энцефалита, желтой лихорадки, Западного Нила и т.д. для многих других стран. Использование в качестве модели вируса КЭ, типичного представителя семейства флавивирусов, для исследования рецепторного взаимодействия может иметь актуальное значение для всех флавивирусов и может дать значительный толчок для развития исследований в этом направлении для других флавивирусов.

Цель работы и основные моменты ее достижения.

Недостаточность наших знаний о клеточных рецепторах для вируса КЭ и начальных этапах взаимодействия вируса и клетки, по всей вероятности, связана с методическими проблемами по изучению этого явления. Дело в том, что в настоящее время отсутствуют готовые общепринятые методики выделения клеточных рецепторных белков. Наиболее часто используются методы, основанные на взаимодействии рецептора с лигандом. В последнее время в качестве лиганда достаточно часто выбираются антиидиотипические антитела (АИА), которые несут на своей поверхности паратопы, моделирующие структуру вирусных белков. АИА были успешно использованы для выделения клеточных рецепторов реовируса (Со et al, 198i>), полиомавируса (Marriott et al, 1987), вируса кори (Krah & Choppin 1988), цитомегаловируса человека (Keay et al, 1989), вируса синего языка (Grieder. & Schultz 1990), вируса диареи быков (Xue et al, 1993; Xue & Minocha, 1993) и риновирусов (Greve et al, 1989; Mischak et al, 1988a; Mischak et al, 1988b). Прогресс в выделении и идентификации клеточных рецепторов для ряда вирусов, достигнутый с помощью использования АИА дал нам возможность высказать предположение, что этот новый методический подход

может позволить найти и выделить клеточный рецептор для вируса клещевого энцефалита.

Цель настоящей работы заключалась в поиске и выделении клеточного рецептора для вируса КЭ при помощи антиидиотипичесхих антител

Для достижения этого была запланирована следующая линия исследований:

формирование коллекции гибридом, секретируюших моноклональные антитела (МКА) против нативного гликопротеина Е вируса КЭ.

исследование антигенной структуры гликопротеина Е при помощи полученных МКА. Картирование эпитопов белка Е, предположительно участвующих в рецепторном взаимодействии с клеткой.

получение поликлональных и моноклональных АИА к рецепторным сайтам белка Е.

- изучение основных свойств этих АИА и их способности моделировать рецепторные эпитопы гликопротеина Е вируса КЭ.

- использование антирецепторных антител для выделения и идентификации клеточного рецептора для вируса КЭ методами аффинной хроматографии.

Большинство из запланированных этапов работы являлись новыми в исследуемой области, и успех их выполнения предсказать было невозможно. Данная методология для флавивирусов еще не использовалась. Однако, сложившиеся предпосылки, основанные на аналогичных экспериментах с другими вирусами, позволяли надеяться на успех работы. Вполне очевидно, что ключевым моментом работы было выделение МКА, взаимодействующих с рецепторными районами белка Е вируса КЭ. Для этого необходимо было

провести тщательное исследование антигенной структуры белка при помощи панели МКА и выбрать МКА, предположительно взаимодействующие с этими районами белка.

Научная новизна и практическая ценность.

В результате проделанной работы была создана коллекция гибридом, секретирующих МКА к вирусу клещевого энцефалита, штамм 205, состоящая из 14 мышиных клеточных линий. Коллекция была депонирована в банке гибридом ГНЦ ВБ "Вектор". Полученные моноклональные антитела используются для проведения научно-исследовательских работ, связанных с конструированием рекомбинантных антител против вируса КЭ и изучением экспрессии белка Е флавивирусов в различных системах экспрессии. МКА также используются для картирования на третичной структуре белка Е эпитопов связывания антител методами фагового дисплея. Препараты МКА также были использованы для конструирования диагностических тест-систем для выявления антигена и антител к клещевому энцефалиту.

С помощью панели моноклональных антител к гликопротеину Е вируса КЭ, штамм 205, изучена антигенная структура данного белка. Предложена карта антигенной структуры гликопротеина Е, включающая в себя 8 сайтов, объединяющих 12 эпитопов связывания МКА. Эпитопы сайтов е4, е7 и е8 вовлечены в реакцию торможения гемагглютинации, а один эпитоп сайта е7 связан с нейтрализацией вируса КЭ, штамм 205. Экспериментальное сравнение с другой известной картой антигенной структуры штамма Софьин показало, что нам удалось выявить три новых сайта на белке Е. Это позволяет считать предложенную карту наиболее полной и подробной для восточного подтипа вируса КЭ.

В результате проделанной работы была создана коллекция из 3 крысиных клеточных линий, секретирующих антиидиотипические МКА, моделирующие рецепторные эпитопы белка Е вируса КЭ, штамм 205. Коллекция была депонирована в банке гибридом ГНЦ ВБ "Вектор". Также были получены поликлональные кроличьи АИА, взаимодействующие с активным центром антивирусных МКА Е6В и ЮН 10 и моделирующие эпитопы белка Е вируса клещевого энцефалита.

Поликлональные АИА были использованы для выделения клеточного рецептора вируса клещевого энцефалита при помощи метода аффинной хроматографии на антиидиотипических антителах. Удалось получить высокоочищенные препараты рецептора, анализ которых показал, что очищенные фракции содержали полипептиды с молекулярной массой 43, 67, 110 и 210 кДа.

При помощи панели антител к некоторым видам интегрина человека была проведена иммунохимическая идентификация спот-анализом и ИФА выделенных белковых молекул рецептора. Молекулярная масса полипептидов 110 и 210 кДа и их взаимодействие с референс-антителами против интегринов человека показали, что очищенные препараты клеточного рецептора содержат в своем составе аЗр1 интегрин человека.

Полипептид с молекулярной массой 67 кДа был предварительно идентифицирован, как ламининовый рецептор. Полипептид 43 кДа не удалось идентифицировать.

Полученные результаты позволили нам впервые сформулировать гипотезу, что ламининовый рецептор и аЗр1 интегрин человека могут являться клеточными молекулами участвующими в рецепторном взаимодействии с вирионами вируса КЭ.

•Проведенный анализ взаимодействия нативного белка Е в составе вириона КЭ с рекомбинантным ламининовым рецептором человека

подтвердил наличие специфического взаимодействия этих двух белков и возможную роль ламининового рецептора в качестве клеточного рецептора для вируса клещевого энцефалита.

Апробация работы и публикации.

Материалы диссертации были представлены на следующих конференциях, симпозиумах.

1. Вторая всесоюзная конференция "Геном человека - 91" ВИНИТИ, Москва, -1991

2. Вторая всесоюзная планово-отчетная конференция "Генная и клеточная инженерия", Москва, - 1992

3. Межведомственная конференция «Изучение и профилактика особо опасных вирусных инфекций» , Кольцово , 1993

4. Третья всероссийская планово-отчетная конференция по направлению "Генная и клеточная инженерия", Москва, 1993

5. Vllth International conference of comparative and applied virology, Montreal, Quebec, Canada, 1994

6. Научная конференция «Актуальные вопросы современной медицины», Новосибирск, 1995

7. Xth International Congress of Virology, Jerusalem, Israel, 1996

8. International Scientific Conference "Tick-Borne Viral, Rickettsial and bacterial infections" Irkutsk, Russia, 1996

9. Научная конференция "Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера", Новосибирск, 1998

По материалам диссертации опубликовано 14 работ в отечественной и зарубежной печати.

Экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены лично диссертантом и в соавторстве с: к.м.н. Хусаиновай А. Д., Коноваловой С. Н., Сорокиным А. В., Качко А. В.

Положения, выносимые на защиту.

Создание коллекции гибридом, секретирующих моноклональные антйтела к вирусу клещевого энцефалита, штамм 205. Построение карты антигенной структуры гликопротеина Е, включающей в себя 8 сайтов, объединяющих 12 эпитопов связывания МКА.

Создание коллекции гибридом, секретирующих моноклональные АИА, которые моделируют эпитопы белка Е вируса КЭ, штамм 205.

Получение поликлональных кроличьих АИА. Установление факта, что препараты поликлональных АИА эффективно моделируют эпитопы белка Е вируса клещевого энцефалита. Они способны вызывать появление антивирусных антител при иммунизации животных, взаимодействовать с клетками СПЭВ и ЯН и их мембранными фракциями, а также вызывать гемагглютинацию гусиных эритроцитов.

Применение метода аффинной хроматографии на антиидиотипических антителах для проведения выделения клеточного рецептора вируса клещевого энцефалита. Получение высокоочищенных препаратов рецептора, которые содержат полипептиды 43, 67, 110 и 210 кДа. Взаимодействие АИА с полипептидом 67 кДа в иммуноблоттинге.

Установление факта, что выявленный полипептид с молекулярной массой 67 кДа является ламининовым рецептором человека, и что белок Е в составе вириона КЭ эффективно взаимодейству