Изменение свойств популяции вируса клещевого энцефалита при смене хозяина

Романова, Лидия Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изменение свойств популяции вируса клещевого энцефалита при смене хозяина
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Изменение свойств популяции вируса клещевого энцефалита при смене хозяина"

ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ИНСТИТУТ ПОЛИОМИЕЛИТА И ВИРУСНЫХ ЭНЦЕФАЛИТОВ ИМЕНИ М.П. ЧУМАКОВА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

на правах рукописи

Романова Лидия Юрьевна

Изменение свойств популяции вируса клещевого энцефалита при смене хозяина

03.00.06 — вирусология

автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

научный руководитель: кандидат биологических наук Карганова Г.Г.

МОСКВА - 2006

Работа выполнена в ГУ Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Карганова Галина Григорьевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук профессор Гараев Мансур Мухамедович,

кандидат биологических наук Ворович Михаил Фридрихович

Ведущая организация: Федеральное Государственное

учреждение науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»

Защита состоится ^ О _2006 года в £2.' часов

на заседании диссертационного совета Д.001.026.01 при Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П.Чумакова РАМН по адресу: 142782, Московская область, пос. Институт полиомиелита.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П.Чумакова РАМН.

Автореферат разослан 3 & _2006 года.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук Медведкина О.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Вирус клещевого энцефалита (ВКЭ) является представителем рода Flavivirus и вызывает тяжелые заболевания человека, такие как энцефалиты и менингиты. Очаги клещевого энцефалита (КЭ) различаются по количеству и тяжести течения заболевания людей (Gritsun et al., 2003). В последние годы в ряде регионов было показано увеличение числа тяжелых форм, появление новых клинических форм заболевания в виде энцефалита с геморрагическим синдром, а также расширение ареала этого вируса.

В природных очагах ВКЭ существует за счет попеременного размножения в клещах и позвоночных. Филогенетические исследования указывают на то, что эволюция флавивирусов определяется прежде всего видом переносчика, хотя определенное значение имеет и вид прокормителя (Gaunt et al., 2001). На фенотипическом уровне показано, что клещи и позвоночные оказывают разное селективное давление на ВКЭ (Дживанян и др., 1988; Чунихин и др., 1986; Labuda et al., 1994). Однако, информация о хозяин-специфических детерминантах в геноме ВКЭ крайне ограничена. До сих пор нет никаких данных о поведении гетерогенной популяции ВКЭ при смене хозяина, а также в процессе вирусной инфекции.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы было изучение изменения свойств популяции ВКЭ при смене хозяина. Для этого было необходимо решить следующие задачи:

1. Сравнить полные нуклеотидные последовательности геномов штамма ЭК-328 и варианта М, полученного в результате пассажей штамма ЭК-328 в клещах.

2. Сравнить антигенную структура белка Е адаптированного к клещам варианта М и родительского штамма ЭК-328.

3. Изучить изменение свойств популяции варианта М на генетическом и фенотипическом уровне при пассажах in vivo и in vitro.

4. На основе анализа ревертантов, полученных из популяции варианта М, выявить хозяин-специфические детерминанты в геноме ВКЭ. Научная новизна. Впервые изучены молекулярные основы адаптации

ВКЭ к клещам и млекопитающим и предложена схема, объясняющая быструю переадаптацию вируса при смене хозяина.

Впервые показано, что адаптация ВКЭ к клещам связана с появлением мутаций в белке Е, повышающих аффинность связывания вирионов с гликозаминогликанами (ГАГ) на поверхности клетки.

Впервые показано, что адаптация ВКЭ к клещам может приводить к комплексному изменению антигенной структуры основного гликопротеина оболочки Е.

Впервые изучены механизмы восстановления низкой аффинности связывания вирионов с ГАГ на поверхности клетки у мутантов ВКЭ с ГАГ-связывающим фенотипом. Впервые показано, что в процессе реверсии ГАГ-связывающего фенотипа образуются варианты ВКЭ, способные вызывать все формы инфекции.

Научно-практическая значимость работы. Получена фенотипическая и генетическая характеристика вариантов ВКЭ, имеющих селективное преимущество при размножении в клещах и млекопитающих.

Разработан корректный методический подход, позволяющий оценить попадание вируса в мозг и наличие персистенции вируса в ЦНС.

Определена первая полная нуклеотидная последовательность генома штамма ВКЭ прибалтийской группы сибирского подтипа, депонирована в международной базе данных ОепВапк (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank, №00486861).

Выявлено, что адаптация ВКЭ к клещам может приводить к значительному изменению антигенной структуры белка Е. Это необходимо учитывать при разработке и применении вакцинных препаратов, а также при оценке природной изменчивости антигенной структуры ВКЭ.

Показано, что при переадаптации ВКЭ от клещей к млекопитающим в популяции вируса появляются варианты, различающиеся по патогенетическим характеристикам. Положения, выносимые на защиту.

1. Определена первая полная нуклеотидная последовательность генома штамма ВКЭ (ЭК-328) прибалтийской группы сибирского подтипа.

2. Замены в белке Е 01и122-»01у и ТЪг42б-»11е определяют основные свойства адаптированного к клещам варианта М, отличающие его от родительского штамма ЭК-328.

3. Адаптация ВКЭ к клещам связана с появлением мутаций в белке Е, повышающих аффинность связывания с гликозаминогликанами (ГАГ) на поверхности клетки. Мутанты ВКЭ с ГАГ-связывающим фенотипом восстанавливают способность к низкоаффинному связыванию с ГАГ клеток за счет появления обратных и компенсирующих замен. Свойства ревертантов зависят от характера и расположения компенсирующих замен в белке Е.

4. ВКЭ может существовать в виде гетерогенной популяции, содержащей варианты, обладающие селективным преимуществом при репродукции либо в клещах, либо в млекопитающих. Переадаптация к млекопитающим адаптированного к клещам вируса происходит за счет изменения соотношения этих вариантов в популяции, а также за счет появления новых мутантов.

5. Скорость изменения генетической структуры популяции ВКЭ и разнообразие мутантов определяется характеристикой хозяина и наличием эффекта "бутылочного горлышка".

Апробация работы. Результаты были представлены на 2-х заседаниях Межлабораторного ученого совета ИПВЭ им. М.П.Чумакова РАМН (май 2002, 11 мая 2006 г.), а также на Международном конгрессе «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней - прогресс и проблемы», г. Санкт-Петербург, 4-5 сентября, 2003г.

Публикации. По материалам диссертации опубликована 1 статья в научном журнале, 3 статьи в сборниках материалов научных конференций и 3 тезисных сообщения.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из традиционных разделов и изложена на 143 страницах, содержит 27 рисунков и 20 таблиц. Список литературы включает 190 ссылок.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы. В работе использовали следующие штаммы и варианты ВКЭ, любезно предоставленные ст. н. с. ИПВЭ им. М.П.Чумакова РАМН Т.И. Дживанян (зав. лаб. В.А. Лашкевич): штамм Софьин -изолирован в Приморье из мозга человека в 1937г.; штамм Рс - выделен до 1980г. (эти штаммы прошли неизвестное количество пассажей через мозг мышей); штамм ЭК-328 - изолирован из клещей Ix. persulcatus, собранных в Эстонии в 1972г. (Баннова и др., 1973), прошел 6 пассажей через мозг белых мышей. В работе также использовали адаптированный к клещам вариант 718/574, полученный в результате 17 парентеральных пассажей штамма ЭК-328 через клещей Hyalomma marginatum marginatum (Чунихин и Дживанян, 1977). Этот вариант после 10 лет хранения и двух дополнительных пассажей через мозг мышей был назван вариантом М.

В работе были использованы лошадиный у-глобулин против ВКЭ (НИИ ВС, г. Томск) и набор моноклональных антител к белку Е, любезно предоставленный зам. директора ГНЦ Вирусологии и биотехнологии «Вектор» (Кольцово) В.Б. Локтевым. Сыворотка человека, больного КЭ, была любезно предоставлена доктором Л.П. Антыковой (Центр Госсанэпиднадзора, г. Санкт-Петербург).

Выращивание вирусов и титрование их методом бляшек в культуре клеток СПЭВ проводили по ранее описанной методике (Dzhivanyan et al., 1974). Титры инфекционного вируса определяли на беспородных (б/п) белых мышах (6 г) и мышах линии BALB/c (6 г или 12 г). Титр вируса рассчитывали по методу Кербера и выражали в БОЕ/1ЛД50-Концентрирование ВКЭ из культуральной жидкости (КЖ) инфицированных клеток проводили с помощью полиэтиленгликоля 6000 ранее описанным методом (Ляпустин и др., 1987). Опыт по оценке размножения вирусов в клещах проводили на лабораторной культуре клещей Hyalomma marginatum turanicum, Pomeranzev, 1946. Вирус вводили парентерально под 4 коксу, как описано ранее (Алексеев, Чунихин, 1987). Все работы по определению клещей, их содержанию и заражению были проведены вед. н. с. ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН Л.А. Буренковой.

Препараты ВКЭ, меченные по белку, получали, как описано ранее (Дживанян и др., 1991). Иммунопреципитацию (ИП) вирусспецифических белков из лизатов инфицированных клеток осуществляли по ранее описанной методике (Гмыль и др., 2001). Анализ белков проводили с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) (Laemmli, 1970). Для ИФА использовали непрямой метод согласно стандартной методике (Романова и др., 2006). Реакция гемагглютинации проводилась по

стандартной методике (Clarke and Casals, 1958). Сорбцию вирусов на гепаринсефарозе (ГС) осуществляли при +4 °С в течение 18 ч. Результат оценивали с помощью титрования методом бляшек несвязавшегося и контрольного вирусов. Ракетный иммуноэлектрофорез (РИЭФ) проводили по ранее описанной методике (Дживанян и др.., 1991).

РНК выделяли методом фенольной экстракции. Для обратной транскрипции (ОТ) использовали специфические олигонуклеотиды. Для определения нуклеотидной последовательности геномов исследуемых вирусов использовали непосредственно продукт ПЦР. Реакцию проводили с помощью набора "finol" ("Promega", США). Электрофорез продуктов реакции осуществлялся согласно стандартной методике. Также секвенирование ДНК проводили с помощью набора реактивов ABI PRISM BigDye Terminator v. 3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3100-Avant (ЦКП "Геном"). Анализ полученных нуклеотидных и аминокислотных последовательностей проводили с помощью программы Gene Runner и ClustalX 1.8. Филогенетические деревья были построены с помощью программы ClustalX 1.8 с использованием параметров по умолчанию, с параметрами "exclude positions with gap" и "correct for multiple substitutions" и были визуализированы с помощью программы njplot.

Результаты и обсуждение.

Основной целью работы было изучение изменения свойств популяции ВКЭ при смене хозяина. В работе был использован штамм ЭК-328, а также полученный из него ранее адаптированный к клещам вариант 718/574 (Дживанян и др. 1975, 1988; Чунихин и др., 1975; Чунихин и Дживанян, 1977). Этот вариант был стабилен по своим характеристикам в течение трех первых пассажей через мозг белых мышей (Дживанян и др., 1988).

Адаптированный к клещам вариант отличался от исходного штамма ЭК-328 по нескольким характеристикам, в том числе: мелкоточечным размером бляшек под агаровым покрытием в культуре клеток СПЭВ с примесью 1% крупных бляшек, более низким уровнем репродукции в культуре клеток СПЭВ, сниженной нейроинвазивностью для лабораторных белых мышей, более высокими титрами в клещах Н. т. marginatum (Дживанян и др., 1988; Чунихин и др., 1975, 1978). Вирионы варианта 718/574 в отличие от вирионов родительского штамма, не обладали гемагглютинирующей активностью (ГА), были не способны образовывать преципитаты с антителами в агаре в РДПА, а в РИЭФ не образовывали ракету вирионного преципитата, направленную к катоду (Дживанян и др., 1986,1988,1990).

Вариант 718/574 хранился более 10 лет при -20° в виде мозга инфицированной мыши. Для использования в дальнейшей работе нами было сделано дополнительно 2 пассажа через мозг мышей. Этот вирус был назван вариантом М.

На первом этапе работы была проведена оценка сохранения вариантом M фенотипических характеристик адаптированного к клещам варианта. При титровании варианта M в культуре клеток СПЭВ

соотношение точечных бляшек (<1мм) к крупным (б-8мм) было примерно 100:1 (рис. 1). Нейровирулентность при интрацеребральном (и/ц) введении для б/п мышей весом 6 г штамма ЭК-328 составила 5,4 BOE/1LD50, для мышей линии BALB/c (10 - 12 г) 0,5 EOE/1LD50, нейроинвазивность При интраперитонеальном (и/п) введении - 18 БОЕ/1 LD50. Нейровирулентность для б/п мышей 6г варианта M составила 0,4 БОЕ/1 LD50, для мышей линии BALB/c (10-12 г) 2,5 БОЕ/1 LD50, нейроинвазивность - 250000 БОЕ/1 LD50. Эти данные демонстрируют, что вариант M сохранил низкую нейроинвазивность при высокой нейровирулентности для лабораторных мышей. При анализе с помощью РИЭФ антигенных структур, накапливающихся в КЖ клеток СПЭВ, инфицированных родительским штаммом ЭК-328, было обнаружено, что вирионы образуют преципитаты с антителами (AT), движущиеся в электрическом поле в основном к катоду (рис.2). Невирионный антиген (НА), представляющий собой олигомеры неструктурного белка NS1, образует преципитаты с AT в виде «воздушной» ракеты, движущейся к аноду (рис. 2). Вирионы варианта М, как и вирионы варианта 718/574, не обладали ГА, а в РИЭФ не образовывали преципитат с AT, направленный к катоду (рис. 2). В РИЭФ не было выявлено различий между вирусами по содержанию НА в КЖ инфицированных клеток.

Штамм ЭК-328 Вариант М

Рисунок 1. Морфология бляшек штамма ЭК-328 и адаптированного к клещам варианта М в культуре клеток СПЭВ.

ЯСдИ Рисунок 2. Анализ с помощью РИЭФ

антигенных структур ВКЭ, накапливающихся в КЖ клеток СПЭВ, инфицированных » штаммом ЭК-328 и адаптированным к клещам

{■ вариантом М.

вирионныйАГ

Г'

М ЭК-328

Для оценки уровня репродукции данных вирусов в клещах в нашей работе мы использовали клещей Н. marginatum turanicum (подвид Н. marginatum). Мы заразили парентерально по 5 клещей штаммом ЭК-328 и вариантом М в дозе 4,3 lg БОЕ. Клещи содержались при комнатной температуре. На 7 день клещи были заморожены, а затем из каждого клеща отдельно была приготовлена 5% суспензия, и вирус был оттитрован методом бляшек. Вирус был обнаружен в 4 из 5 клещей, зараженных штаммом ЭК-328. Средний титр в этих 4 клещевых суспензиях, составил 3,2±0,51g БОЕ/мл. Вирус был обнаружен во всех инфицированных вариантом М клещах, средний титр составил 5,0±0,8 lg БОЕ/мл и был статистически достоверно выше (Р<0,0005), чем в клещах, зараженных штаммом ЭК-328.

Таким образом, мы показали, что вариант М сохранил все исследованные фенотипические свойства, характерные для исходного варианта 718/574, и может быть использован для описания свойств варианта ВКЭ, обладающего селективным преимуществом при репродукции в организме клеща.

Для выявления генетических основ, лежащих в основе фенотипических отличий адаптированного к клещам варианта М и родительского штамма ЭК-328, были определены полные нуклеотидные последовательности их геномов (за исключением 16 нуклеотидов (нт) на 5' конце генома и 25 нт на 3' конце генома).

Для характеристики родительского штамма ЭК-328 был проведен филогенетический анализ с использованием нуклеотидных последовательностей, кодирующих полный полипротеин (рис. 3). Как известно, ВКЭ делится на три подтипа: европейский (основной переносчик - I. ricinus), дальневосточный и сибирский (основной переносчик - I. persulcatus). В областях, где ареалы основных переносчиков перекрываются, возможно их сосуществование. Как правило, наблюдается сосуществование 2 подтипов, более редко на одной территории встречаются 3 подтипа (Погодина, 2005). Так, в Латвии и Эстонии были обнаружены все три подтипа вируса (Golovljova et al., 2004; Limdkvist et al., 2001).

По данным филогенетического анализа штамм ЭК-328 принадлежит к сибирскому подтипу, причем образует отдельную ветвь внутри него. Поскольку на настоящий момент для большинства штаммов ВКЭ определена нуклеотидная последовательность только для участков, кодирующих различные фрагменты белка Е, мы построили также филогенетическое дерево для участка 1210 нт (рис. 4). Штамм ЭК-328 попал в одну филогенетическую группу с прибалтийскими штаммами принадлежащими к сибирскому подтипу, в частности, со штаммами выделенными в Эстонии, - Est54 и Est3535, а также одним штаммом из Латвии - Latvial-96.

Таким образом, штамм ЭК-328 является третьим штаммом сибирского подтипа, для которого определена полная нуклеотидная последовательность. Это особенно важно, поскольку только штамм ЭК-328 был выделен из клеща, тогда как штаммы Васильченко и Заусаев были

выделены ох инфицированных людей. Штамм ЭК-328 - первый среди прибалтийских штаммов ВКЭ, для которого определена полная нуклеотидная последовательность генома.

0.02 -Senzhang

100

ЖГ

LmDJ-01 Китай

Китай

9£

feofiii

.0sh(ma5-10 Япония Юфп-НО Россия: Приморье

100

■ vas

100

¡oflin

ЕК-328 Эстония

■Vasilchenko Россия, ЬЬвосибирская о&7.

lUSaev Россия. Томская обл. —Нург Чехия Brno —Noudoerfl Австрии, Neudorü —263 Чехия, Vernein ■LangatTP21

] ]

Дальневосточный подтип ,

Сибирский подтип

Европейский подтип

Рисунок 3. Филогенетическое дерево штаммов ВКЭ, построенное по нуклеотидной последовательности, кодирующей полный полипротеин. Алгоритм neighbour-joining.

0.02

100

-Latvia1-96 Латвия

■i

Эстония, северо-восток Эстония

ЕвйбЗб Эстония, юго-восток аем Россия, Томская обл.

___-1пт4 Россия, Иркутская обл.

I Н99-2т7 Россия, Иркутская оба 11499-2т7 Россия, Иркутскаяобп. К99-1 т1 Россия, Иркутскаяобп. _Г|В99-2тЗ Россия, Иркутскаяобп. I К99-2Т13 Россия, Иркутская обл.

_Г УавЛсИепкО Россия, Новосибирская оба

^ /

Aina Россия, Иркутская обл.

Рисунок 4. Фрагмент филогенетического дерева штаммов ВКЭ, построенного по нуклеотидной последовательности, кодирующей часть бежа Е (973-2173нт). Алгоритм neighboш■-joinmg. Представлены только штаммы, относящиеся к сибирскому подтипу.

При сравнении геномов родительского штамма ЭК-328 и адаптированного к клещам варианта М было обнаружено 15 нуклеотидных замен, из которых 2 нуклеотидные замены . были обнаружены в 5'-нетранслируемой области (НТО), а 6 приводили к аминокислотным заменам (табл. 1).

В неструктурной области было выявлено 8 нуклеотидных замен, 3 из которых привели к аминокислотным заменам: одна замена в белке NS2a и две замены в белке NS4a. Белки NS2a и NS4 являются небольшими гидрофобными мембрансвязанными белками и входят в репликативный комплекс флавивирусов (Westaway et al., 2003). Нельзя исключить, что замены в этих белках могут быть связаны с заменами выявленными в 5'-НТО. Для некоторых флавивирусов, переносимых комарами, показано участие этих белков в подавлении интерферонового ответа клетки (Liu et al., 2004; Munoz-Jordan et al., 2003).

При сравнении нуклеотидных последовательностей, кодирующих структурные белки родительского штамма ЭК-328 и полученного из него путем адаптации к клещам варианта М, было выявлено 5 нуклеотидных замен, 3 из которых приводили к аминокислотным заменам: 2 в белке Е и 1 в сигнальной последовательности белка ргМ.

Таблица 1. Замены в геноме адаптированного к клещам варианта М по сравнению с родительским штаммом ЭК-328.

область генома нуклеотидная замена аминокислотная замена®

5'-НТО Ai,-» G/A С42-»А -

сигнальный пептид ргМ C470->U Ala-»Val

Е Ai337—>G С2,90-Ш Сг249~ Цш2— Glu122-»Gly Thr426-»Ile

NS1 C3387-»U G3438~>A -

NS2a G3672->U Lys52—>Asn

NS3 G4827—>A -

NS4a A6526-»G G6584-»A Ser22-»Gly Arg4i-»Lys

NS4b G7437—>C -

NS5 U9888-►G -

" Аминокислотная позиция в соответствующем белке, нумерация с начала соответствующего белка

В сигнальной последовательности белка ргМ варианта М была выявлена замена аланина на валин в -4 позиции С-концевого региона. Эта позиция сигнального пептида неконсервативна у флавивирусов и, в частности, у штаммов ВКЭ. Аминокислота аланин в этой позиции уникальна для штамма ЭК-328, а в полипротеине многих штаммов ВКЭ в этом положении находится валин. Отрезаемая сигнальная последовательность не входит ни в белок С, ни в белок ргМ. То есть, только ю

заменами в белке Е определяется разница свойств вирионов штамма ЭК-328 и вариантам.

. Гликопротеин Е экспонирован на поверхности вирионов, отвечает за взаимодействие с рецептором на поверхности клеток, слияние вирусной и клеточной мембран, а также является основным иммуногеном, индуцирующим вируснейтрализующие АТ.

Одна из аминокислотных замен в белке Е треонина на изолейцин затрагивает позицию 426 белка Е, расположенную в стебле. Другая аминокислотная замена глутаминовой кислоты на глицин в 122 положении белка Е приводит к изменению заряда молекулы в сторону более положительного, так как происходит замена отрицательно заряженной аминокислоты на незаряженную. Согласно ренгеноструктурной модели, полученой F. A. Rey с соавторами (1995), данный аминокислотный остаток расположен на внешней поверхности домена II (рис. 5), изменяющего свое пространственное положение в процессе перехода молекулы из димерной формы в тримерную в ходе слияния мембран, а также определяющего ГА вируса.

Ом&шмиА

да»« Рис. 5. Схематическое

изображение структуры белка Е.

Стебель

Яяорь

Было проведено сравнение антигенной структуры белка Е варианта М и штамма ЭК-328 с использованием набора моноклональных АТ к этому белку, любезно предоставленного зам. директора ГНЦ вирусологии и биотехнологии «Вектор» (Кольцово) В.Б. Локтевым, с помощью ИФА и в реакции иммунопреципитации.

ИФА проводили по непрямому методу. Первый слой представлял собой двукратные разведения моноклональных АТ к белку Е, второй слой — вирусный антиген (АГ), третий слой — сыворотка человека, больного КЭ, четвертый слой - АТ против человеческих АТ, меченные пероксидазой хрена. Для сравнения использовали штамм Софьин (дальневосточный подтип) и штамм Рс (европейский подтип по данным секвенирования участка, кодирующего фрагмент белка Е) так, чтобы в реакции были представлены все 3 подтипа ВКЭ. Результаты приведены в таблице 2.

Поликлональная сыворотка человека, больного КЭ, практически одинаково реагировала со всеми АГ. С помощью ИФА мы определили, что моноклональные АТ Е6В значительно слабее взаимодействовали с вариантом М по сравнению с исходным штаммом ЭК-328 и штаммами Рс и Софьин. Е6В является нейтрализующим и обладающим антигемагглютинирующей активностью моноклоном к эпитопу, принадлежащему к антигенному домену е2 белка Е, согласно эпитопной

карте Цехановской и др. (ТБекЪапсткауа е1 а1., 1993). Моноклональные АТ Е4А, не обладающие нейтрализующими и антигемагглютинирующими свойствами, также различили штамм ЭК-328 и вариант М.

Таблица 2. Изучение антигенной структуры вирионов ВКЭ с помощью ИФА с использованием моноклональных АТ к белку Е (представлены обратные величины титров).__

Сыворотка и моноклональные АТ Характеристика моноклональных АТ* Титр в 1 след [ФА с использованием АГ ующих штаммов ВКЭ:

РНБ РТГА Домен** ЭК-328 Вариант М Софьин Рс

сыв-ка чел., больного КЭ 1600 800 1600 800

Е4А - - н.о. >25600 64 >25600 >25600

ЕВ1 - - е2 >25600 12500 >25600 >25600

Е6В + + е2 >25600 640 25600 25600

РНБ - реакция нейтрализации бляшек; РТГА - реакция торможения ГА. * - приводится по Гайдамович и др., 1990; Протопопова, и др., 1996, 1997. +/- - наличие или отсутствие активности в данной реакции и.о.— не определяли

** - домены белка Е указаны согласно эпитопной карте, предложенной Цехановской и др. (ТзекЬапоувкауа е1 а1., 1993).

Далее был проведен анализ вирусных белков из лизатов зараженных вирусами клеток в реакции ИП (табл. 3). Оценивали количество белка, которое преципитируют данные моноклональные АТ из лизатов клеток СПЭВ, инфицированных вышеперечисленными штаммами, по отношению к количеству белка, преципитированного из этих лизатов у-глобулином против ВКЭ.

Моноклональные АТ 7Е10 к эпитопу в домене е1 (по эпитопной карте Цехановской и др.) статистически достоверно более активно преципитировали белок Е штамма ЭК-328 по сравнению с белком Е варианта М.

Таким образом, моноклональные АТ, различившие белок Е варианта М и исходного штамма ЭК-328, связываются с эпитопами в разных антигенных доменах белка Е (табл. 2, 3). Следовательно, изменение антигенной структуры затрагивает удаленные эпитопы этого белка, то есть при адаптации к клещам произошло не просто локальное изменение в месте мутации на поверхности гликопротеина, а более комплексное изменение его структуры. Такие конформационные отличия могут быть обусловлены как заменой во 2 домене, так и могут быть связаны с мутацией в стебле. Ранее при изучении атгенуированных мутантов вируса Лангат, входящего в комплекс клещевого энцефалита, было показано, что аминокислотные замены в стебле могут приводить к изменению антигенной структуры этого белка (Но1Ьгоок й а1., 2001).

Таблица 3. Условное количество белка Е, преципитированного моноклональными АТ из лизатов инфицированных клеток, вычисленное по данным денситометрирования соответствующей полосы на флюорограмме после электрофореза в 15% ПААГ. ,

Монокло Характеристика Вирусы, использованные для

нальные моноклональных AT* получения лизатов клеток

AT РНБ РТГА ДомеЙ** ЭК-328 Вариант М Софьин Рс

6В9 - - elre2 0,9±0,2 0,5±0,1 0,2±0,1 0,5±0,1

7F10 - - et 1,4±0,3 0,7±0,2 0,2±0,3 0,2±0,2

4С7 - + el ' 0,7±0,2 0,6+0,3 0,0±0,1 0,3+0,1

10Н10 - + е2. 1,7±0,3 1,9±0,3 2,7±0,4 1,3±0,2

13F2 - - е2 0,1±0,1 0,2±0,1 0,1 ±0,2 0,4±0,2

* - приводится по Гайдамович и др., 1990; Протопопова, и др., 1996,1997. ** - домены белка Е указаны согласно эпитопной карте, предложенной Цехановской и др. (Tsekhanovskaya et al., 1993).

Значения в графах таблицы соответствуют отношению результатов денситометрирования полосы белка Е, преципитированного моноклональными AT, к результатам денситометрирования полосы белка Е, преципитированного лошадиным у-глобулином против ВКЭ из этого же лизата.

Для того, чтобы установить, какие мутации в геноме варианта М связаны с фенотипом, был получен набор ревертантов. Для этого в культуре клеток СПЭВ из популяции варианта М было выделено несколько мелкобляшечных и крупнобляшечных клонов. Все клоны после размножения в этих клетках образовывали под агаровым покрытием крупные бляшки с примесью мелких. Вирионы всех клонов приобрели способность в РИЭФ образовывать преципитаты с AT в виде ракеты, направленной к катоду, то есть в результате 1 клонирования и 1-2 пассажей в культуре клеток СПЭВ произошла реверсия этих свойств к таковым у исходного штамма ЭК-328.

Для получения гомогенной популяции были проведены дополнительные клонирования 5 клонов, исходно изолированных как мелкая бляшка, и 1 клона, взятого исходно как крупная бляшка. Для получения крупнобляшечных вариантов на каждом этапе брали крупную бляшку. Отобранные таким образом клоны' 160/57, 118/58, и 103/84 образовывали в культуре клеток СПЭВ бляшки, похожие на бляшки родительского штамма ЭК-328, которые к 8 дню достигали размера 6-8 мм и продолжали расти в течение всего периода наблюдения (рис. 6). В отличие от них клон 116/59 образовывал бляшки диаметром 4-5 мм, не увеличивающиеся в размере. Только в результате четырех клонирований мелких бляшек, в ходе которых на каждом этапе брали мелкую бляшку, были получены клоны 424 и 298, которые практически не содержали крупнобляшечных вариантов в популяции. Вирионы клонов 160/57, 118/58,

116/59 и 103/84 обладали ГА и в РИЭФ образовывали ракету, направленную к катоду (рис. 7). Вирионы клонов 424 и 298 не обладали ГА и в РИЭФ не образовывали ракету, направленную к катоду. Для всех этих клонов также была определена нуклеотидная последовательность в тех областях генома, где ранее были обнаружены замены у варианта М по сравнению со штаммом ЭК-328 (табл. 5). .

Рисунок 6. Морфология бляшек клонов 118/58 и клона 116/59 в культуре клеток СПЭВ.

клон 118/58

клон 116/59

Рисунок 7. Анализ с помощью РИЭФ антигенных структур ВКЭ, накапливающихся в КЖ клеток СПЭВ, инфицированных клонами из популяции варианта М. 1 — клон 118/58, 2-клон 116/59, 3-клон 103/84,4 - клон 160/57,5 - клон 298.

Мелкобляшечные клоны (клоны 298 и 424) сохранили все замены, свойственные варианту М. У всех крупнобляшечных (ревертировавших к родительскому фенотипу) клонов сохранились все аминокислотные замены в неструктурных белках и сигнальной последовательности белка ргМ, характерные для варианта М. Нуклеотид в позиции 42 5-НТО остался у всех клонов тот же, что и у варианта М. В 19 позиции 5'-НТО у варианта М наблюдалась гетерогенность (нуклеотиды аденин и гуанин). У четырех ревертантов в 19 положении был обнаружен аденин, как у штамма ЭК-328, а у одного клона 116/59 - гуанин. Исходя из этих данных мы не можем точно сказать, имеет ли эта замена какое-либо значение в проявлении фенотипа, или нет.

У всех клонов, имеющих фенотип, сходный с фенотипом штамма ЭК-328, в положении 426 белка Е произошла обратная замена изолейцина на треонин. Это свидетельствует о том, что эта позиция имеет прямое отношение к реверсии их свойств. Этот аминокислотный остаток входит в состав консервативного для вирусов подгруппы клещевого энцефалита

участка, обозначенного как CS (Allison et al,, 1999). Функциональная роль элемента CS не определена.

Таблица 4. Генетические свойства клонов, выделенных из популяции варианта М._

вирус 19нт 42нт с.п. 64 122 124 2190 426 2362 52 22 41

5'- 5'- ргМ Е Е Е нтЕ E нтЕ NS2a NS4a NS4a

НТО НТО

ЕК-328 а с А К Е К с T t К S R

Вариант М Ф а V К G К t I с N G К

160/57 а а V К G Е t T с N G К

118/58 а а V к Е К t T с N G К

116/59 g а V к G 0 t T с N G К

103/84 а а V Q G к t T с N G К

клон 298 S а V к G к t I с N G К

клон 424 н/о н/о н/о к G к t I с н/о н/о н/о

н/о - не оценивали; с.п. - сигнальная последовательность. Прописные буквы - аминокислоты, строчные — нуклеотиды.

А - аланин, К - лизин, Е - глутаминовая кислота, V - валин, G - глицин, Q - глутамин, I - изолейцнн, Т - треонин, N - аспарагин, S - серин.

Интересно, что в составе элемента CS именно 426 позиция не является строго консервативной. У вирусов, относящиеся к европейскому субтипу, связаных общим ареалом с клещами вида I. ricinus, обнаруживается в этом положении аминокислота аланин. В то время как у всех изученных штаммов дальневосточного и сибирского подтипов ВКЭ, основным переносчиком которых является клещ I. persulcatus, в 426 позиции находят аминокислоту треонин. Определенную роль могло сыграть то, что штамм ЭК-328 пассировался через организм клеща (Н. т. marginatum), не участвующего в циркуляции этого вируса в природе. Таким образом, очевидно, что эта позиция является одной из хозяин-специфических детерминант переносимых клещами флавивирусов.

Все клоны, ревертировавшие по своим характеристикам к родительскому штамму ЭК-328, приобрели либо обратную замену в позиции 122, либо дополнительные замены, расположенные пространственно в непосредственной близости от 122 позиции. Эти дополнительные замены приводят к снижению положительного заряда белка Е.

Ранее для штамма Найдорфл было показано, что замена в 122 позиции глутаминовой кислоты на глицин, повышая заряд молекулы белка Е, увеличивает аффинность связывания вируса с отрицательно заряженными гликозаминогликанами (ГАГ), в частности, гепарансульфатами, на поверхности клетки (Kroschewski et al., 2003; Mandl et al., 2001). Для оценки влияния этой замены в 122 позиции в контексте структуры белка Е данных вирусов, а также проверки влияния дополнительных замен на связывание вирионов с ГАГ клеток, мы изучили сорбцию вирионов этих вирусов на

более простой общепринятой модели — сорбции на ГС. Доля вирионов, сорбированных на ГС, у варианта М оказалась статистически достоверно выше, чем у родительского штамма. У клонов с компенсирующими заменами способность связываться с ГС была примерно такая же или даже ниже, чем у штамма ЭК-328 (рис. 8). Полученные данные свидетельствуют о том, что вирионы варианта М действительно обладают большей аффиностью связывания с ГАГ на поверхности клеток, а мутации у данных ревертантов являются компенсирующими.

100

8 90 £ ао

5 70 р

6 во

I 50 в

ä 40 1 30 и 20 10 о

-п —

—г

Рисунок 8. Процент вирионов, сорбированных на ГС для штамма ЭК-328, варианта М и клонов 160/57, 116/59 и 103/84.

ЭК-328

Вариант 160/ M 57

116/ 59

103/ 84

Таким образом, со свойствами адаптированного к клещам варианта М напрямую связаны только две выявленные нами замены в гликопротеине Е и, возможно, 1 замена 5-НТО. Аминокислотная замена в 122 позиции глутаминовой кислоты на глицин является одной из определяющих важнейшие фенотипические характеристики адаптированного к клещам варианта М. Так, мелкобляшечный фенотип варианта М можно объяснить нарушением его диффузии в агаре за'счет более прочного связывания с ГАГ клеток, а также сульфополисахаридами агара. Прочным связыванием с сульфополисахаридами агарозы или агара можно объяснить неспособность вирионов варианта М образовывать преципитаты с AT. Для образования преципитата необходимо, чтобы вирионы двигались одним фронтом, и расстояние между ними соответствовало длине плеча молекулы иммуноглобулина. За счет более прочного взаимодействия с сульфогруппами агарозы вирионы варианта М движутся в виде размытого шлейфа, что мешает образованию преципитата.

В литературе для вирусов, принадлежащих разным семействам, и, в частности, для флавивирусов, описаны варианты, обладающие повышенной аффинностью связывания с ГАГ на поверхности клетки (Goto et al., 2003; Kroschewsky et al., 2003; Lee et al., 2002, 2004; Mandl et al., 2001). Все они были получены путем адаптации к определенным культурам клеток. Для этих вариантов характерно наличие мутаций в оболочечных гликопротеинах, приводящих к повышению заряда белка Е, и снижение нейроинвазивности для лабораторных мышей.

При адаптации ВКЭ разных подтипов к разным видам клещей -Hyalomma marginatum marginatum, Hyalomma anatolicum, Ixodes ricinus, -наблюдали схожее изменение фенотипа: мелкие бляшки (Дживанян и др.

1975; Чунихин и др., 1986), потеря ГА вирионов (Дживанян и др. 1975; Ляпустин и др., 1987; Labuda et al., 1994), снижение вирулентности при периферическом заражении мышей (Дживанян и др. 1975; Чунихин и др., 1986; Labuda et al., 1994). Как и в нашем случае, при адаптации 4 штаммов к клещам Hyalomma anatolicum наблюдали схожее поведение вирионов в РИЭФ (Ляпустин и др., 1987). При адаптации ВКЭ к клещам I. ricinus было обнаружено появление замены в домене II белка Е глутаминовой кислоты на лизин в положении 84. Авторы не выяснили функциональное значение данной замены. Тем не менее, можно ожидать, что такая замена -отрицательно заряженной аминокислоты на положительно заряженную -приводит к повышению заряда белка Е и, таким образом, по-видимому, к повышению аффинности связывания с ГАГ на поверхности клетки так же, как и в нашем случае.

Представленные данные показывают, что адаптация ВКЭ к клещам разных видов сопровождается появлением вариантов с ГАГ-связывающим фенотипом.

На следующем этапе мы оценили значение различных компенсирующих мутаций в белке Е для проявления вирулентности для мышей. Для клонов 160/57, 118/58, 116/59, и 103/84 была оценена нейровирулентность и нейроинвазивность для мышей линии BALB/c разного возраста (табл. 5).

Таблица 5. Вирулентность клонов варианта М для мышей линии BALB/c

Вирус Вирулентность для мышей

Мыши 5-6 г Мыши 10-12 г

LD50 (БОЕ) LD50 (БОЕ)

и/ц и/ц и/п

ЭК-328 2 0,5 16

Вариант М 0,4 2,5 250000

клон 160/57 8 0,3 >500

клон 118/58 1,6 1,6 2,5

клон 116/59 1 0,3 1

клон 103/84 6,3 2 >500

Клоны 118/58, 116/59 восстановили нейроинвазивность, однако у клонов 160/57 и 103/84 нейроинвазивность осталась низкой. Клоны 160/57 и 116/59 имеют разные компенсирующие замены в позиции 124, клон 118/58 является обратным ревертантом, а клон 103/84 имеет компенсирующую замену как клон 116/59, но в позиции 64. При этом, аминокислотные замены в других позициях у всех этих клонов одинаковы.

Таким образом, отличия в нейроинвазивности клонов варианта М, обладающих всеми другими фенотипическими признаками, свойственными родительскому штамму ЭК-328, могут быть связаны с конкретной аминокислотной заменой и ее позицией в белке Е.

В наших, экспериментах^ как и было показано ранее (Кондратьева, 2005), при и/п введении мышам линии BALB/c ЮООБОЕ варианта М заболевание не развивалось. При и/п введении той же дозы клонов 118/58 и 116/59, также как и штамма ЭК-328, развивается острая инфекция. Однако, при введении сублетальной дозы этих вирусов часть животных погибало, . часть не заболевала, а часть заболевших животных выздоравливала. Отсутствие развития заболевания может быть обусловлено как неспособностью вируса проникать в ЦНС, так и неспособностью вируса поражать клетки ЦНС из-за изменения свойств вируса или присуствия AT или у-интерферона. В мозге незаболевших и выздоровевших мышей вирус методом бляшек не был выявлен. Однако, для доказательства отсутствия вируса вирусологических методов недостаточно. Мы разработали метод, основанный на выявлении специфической РНК вируса посредством ОТ-ПЦР, позволяющий убедительно доказать в пределах его чувствительности отсутствие вируса в органах мыши. Для этого мы использовали постановку контролей на каждой стадии определения вирусной РНК: выделение РНК, ОТ, ПЦР, а также корректный подход к определению чувствительности метода. В качестве положительного внутреннего контроля нами был выбран штамм Сэбина полиовируса тип 3 с известным титром. В каждом опыте использовали положительный контроль в виде мозговой суспензии (MC) с известным содержанием ВКЭ. Для проверки отсутствия контаминации всегда ставили отрицательный контроль для обоих вирусов (вода, MC незаряженных мышей). Для определения чувствительности нашего метода, были использованы последовательные десятикратные разведения 10% MC, содержащей известное количество ВКЭ, в 10% MC незараженных мышей. Чувствительность нашего метода составила 12 вирусных РНК в пробе.

В мозге мышей, инфицированных ЮООБОЕ варианта М, на 7 день инфекции с помощью разработанного метода ОТ-ПЦР РНК вируса обнаружено не было, что демонстрирует не способность варианта М попадать и накапливаться в ЦНС. В мозге мышей, зараженных сублетальной дозой штамма ЭК-328, у которых не наблюдалось клинических проявлений заболевания, на 7 день инфекции вирус не был обнаружен при титровании методом бляшек, но была выявлена вирусная РНК, что показывает способность этого вируса проникать в ЦНС при периферическом введении низкой дозы вируса.

Чувствительность разработанного нами метода не позволяет полностью исключить попадание небольшого количества вируса (ниже предела его чувствительности) и его персистенции в ЦНС. Для доказательства отсутствия персистенции вируса в ЦНС мышам, инфицированным и/п ЮООБОЕ варианта М, через разные сроки после начала инфекции дважды был введен циклофосфан (ЦФ), который, как известно, активирует хроническую инфекцию (Фролова и др., 1982). Никаких клинических проявлений заболевания обнаружено не было. В MC мышей, взятых через 21-день и 5 месяцев после заражения, при титровании в культуре клеток СПЭВ инфекционный вирус не был обнаружен. С помощью разработанного

нами метода ОТ-ПЦР вирусная РНК, а, следовательно, и вирус также не был обнаружен.

Способность персистировать в ЦНС высоковирулентных вирусов была проверена на одном из клонов из популяции варианта М, восстановившим свою нейроинвазивность. При и/п заражении мышей сублетальной дозой клона 116/59 3 мыши не заболели, а у 2 мышей развились параличи, но на 6 неделе они полностью выздоровели. У всех этих животных на фоне иммунодепрессии, вызванной введением ЦФ, развития заболевания не наблюдалось, и инфекционный вирус в мозге не выявлялся. При проверке методом ОТ-ПЦР оказалось, что у всех этих мышей присутствует вирусная РНК в мозге. Таким образом, учитывая отсутствие клинических признаков заболевания и отдаленные сроки после начала инфекции, можно утверждать, что клон 116/59 в сублетальной дозе вызвал у них персистентную инфекцию, которая, по-видимому, была активирована введением циклофосфана. То есть, хотя сам вариант М не вызывает персистентную инфекцию, клоны, полученные из него, могут ее вызывать.

Таким образом, мы показали, что варианты ВКЭ, обладающие повышенной аффинностью связывания с ГАГ, а также варианты, ревертировавшие по этому свойству как за счет обратной, так и за счет различных компенсирующих замен, могут вызывать все типы инфекций: инаппарантную, острую и персистентную.

Ранее для всех адаптированных к клещам вариантов было показано, что при обратных пассажах в клетках млекопитающих (в культуре клеток СПЭВ, белых мышах, полевках) адаптированные. к клещам варианты возвращались к свойственному родительским вирусам фенотипу (Дживанян и др., 1988; Чунихин и др., 1979, 1986; Kaluzova et al., 1994). В данной работе мы проанализировали поведение популяции адаптированного к клещам варианта М при смене хозяина in vitro и in vivo.

При переадаптации варианта М к культуре клеток СПЭВ было проведено 12-20 пассажей в 6 независимых линиях. Во всех линиях даже на 20 пассаже, хотя количество крупных бляшек и увеличилось до 10%, но не произошло вытеснения варианта М крупнобляшечным вирусом. Полученные вирусы в РИЭФ не образовывали с AT ракету вирионного антигена (ВА), направленную к катоду. Для вируса, полученного на 20 пассаже в одной из линий, была определена нуклеотидная последовательность участков генома, различающихся у родительского штамма ЭК-328 и варианта М. Все аминокислотные замены соответствовали таковым у варианта М. То есть, адаптированный к клещам вариант М при пассажах в культуре клеток млекопитающих был способен длительное время существовать в виде гетерогенной популяции с преобладанием мелкобляшечного вируса. С другой стороны, как было описано выше, создание эффекта «бутылочного горлышка» (то есть значительное уменьшение размера популяции) при клонировании мелкой бляшки приводило к образованию гетерогенной популяции с преобладанием крупнобляшечного вируса уже на первом пассаже. При этом появлялся

целый спектр ревертантов с обратными и различными компенсирующими заменами.

Для изучения поведения популяции варианта М при адаптации к мозгу мышей этот вирус был пропассирован шесть раз через мозг белой мыши. Полученный вариант, обозначенный как RNm, частично ревертировал к родительскому фенотипу. Увеличилось количество крупных бляшек до 50%, повысилась нейроинвазивность для мышей (LD50 - 2500 БОЕ), при этом вирус не обладал ГА и давал, но не регулярно (в 50% случаев), в РИЭФ небольшую ракету ВА, направленную к катоду. При секвенировании структурной области генома оказалось, что нуклеотидная последовательность полностью совпадала с таковой варианта М. То есть, мы также наблюдали гетерогенную популяцию с преобладанием мелкобляшечного вируса.

Из варианта RNm было выделено 3 крупнобляшечных клона. Все клоны на 2 пассаже образовывали бляшки крупного размера в культуре клеток СПЭВ, а вирионы этих клонов в РИЭФ формировали направленный к катоду преципитат с АТ. Для этих клонов была определена нуклеотидная последовательность РНК, кодирующая белок Е. У этих клонов совпадали со штаммом ЭК-328 2 аминокислотные и 2 нуклеотидные замены. Для одного из клонов также были проанализированы фрагменты генома, включающие нуклеотидную замену в области, кодирующей белок NS5, и аминокислотную замену в сигнальной последовательности ргМ, которые отличают вариант М от штамма ЭК-328. Все найденные замены соответствовали последовательности штамма ЭК-328.

Аминокислотные замены могут ревертировать при попадании вируса в прежнее селективное 01фужение, однако, реверсия трех нуклеотидных замен в разных частях генома крайне мало вероятна, и их можно использовать в качестве маркера, позволяющего различить вариант М и штамм ЭК-328. На основании совпадения нуклеотидных замен у крупнобляшечных клонов из популяции варианта М после 6 пассажей через мозг мышей и у штамма ЭК-328, можно сделать заключение, что эти крупнобляшечные клоны произошли от исходно присутствующего в популяции варианта М небольшого количества штамма ЭК-328, содержание которого увеличивается при пассировании в этой системе. Таким образом, очевидно, что после 17 пассажей штамма ЭК-328 через клещей в полученной популяции варианта М сохранилась примесь штамма ЭК-328. То есть, в клещах также возможно длительное сохранение гетерогенности ВКЭ в виде смеси вариантов, имеющих селективное преимущество при размножении в клещах или млекопитающих.

Для изучения поведения популяции варианта М in vivo мышам линии BALB/c и/п ввели большую дозу вируса - 15000 БОЕ. Некоторые животные заболевали с развитием поражений ЦНС. На последних стадиях болезни у одной из заболевших мышей были взяты мозг и кровь. Выделенный из мозга вирус имел 50% крупных бляшек, а вирус, выделенный из крови, содержал мелкие бляшки и крупные блящки в соотношении 1:3. Из этих вирусов было изолировано 3 крупные бляшки. Полученные варианты обладали

свойствами, близкими к штамму ЭК-328. Все 3 клона оказались обратными ревертантами по 2 аминокислотным позициям в белке Е. Все эти клоны имели нуклеотидные замены, как у варианта М, то есть были истинными ревертантами.

Мы поставили опыт по смешанной инфекции варианта М и родительского штамма ЭК-328. Клетки были инфицированы смесью вирусов в различных пропорциях или индивидуальными вирусами. Вирусный урожай был оттитрован по бляшкам в культуре клеток СПЭВ, а свойства вирионов были проанализированы в РИЭФ (табл. б).

При средней множественности заражения и равной пропорции вирусов в инокуляте урожай вирусов был как при индивидуальном размножении (строка 6). Однако, при низкой множественности заражения и равном соотношении вирусов в инокуляте урожай варианта М увеличивался, что свидетельствует о возможности комплементации между вариантами. При заражении смесью вирусов с большим количеством какого-либо из вирусов урожай вируса, которого внесли меньше, снижался (строки 7 и 8), то есть мы наблюдали интерференцию.

Таблица 8. Опыт по смешанной инфекции варианта М и штамма ЭК-

№ множественность заражения. (БОЕ/клетка) Урожай вируса

титр вируса, lgBOE/мл РИЭФ»

общий ЭК-328 Вариант М крупные бляшки" мелкие бляшки®

1 1,000 1,000 - 7,6 - +

2 0,100 0,100 - 7,3 ■ ■ +

3 1,000 - 1,000 5,0Г 6,7 -

4 0,100 - 0,100 4,3Г 6,7 -

5 0,010 - 0,010 3,0Г 6,7 -

6 1,000 0,500 0,500 7,1 6,7 +

7 0,550 0,500 0,050 7,1 5,5 +

8 0,550 0,050 0,500 6,0 6,7 -

9 0,100 0,050 0,050 7,1 8,5 -

" (+) - наличие ракеты ВА, направленной к катоду, (-) - отсутствие ракеты ВА, направленной к катоду.

г - в популяции варианта М изначально на 100 мелких бляшек возможно присутствие 1-2 крупных бляшек.

Представленные данные показывают, что при пассажах варианта М in vitro и in vivo наблюдается длительное сохранение гетерогенной популяции с преобладанием мелкобляшечного вируса, хотя этот вирус не имеет селективного преимущества в данной системе. Это может объясняться наличием показанного нами интерферирующего действия преобладающего в популяции мелкобляшечного варианта. При создании эффекта «бутылочного горлышка» при клонировании мелкой бляшки мы наблюдали

. 21

появление и быструю фиксацию в популяции целого спектра мутантов. По всей видимости, это происходит за счет смещения концентраций вирусов с мелкобляшечным фенотипом, обладающим интерферирующей активностью, и ревертировавшего вируса в сторону увеличения концентрации последнего. Длительное сохранение в популяции примеси не имеющего в данных условиях селективного преимущества варианта объясняется, по-видимому, выявленной нами комплементацией.

Таким образом, мы на фенотипическом и генотипическом уровне охарактеризовали варианты ВКЭ, имеющие селективные преимущества при репродукции в клещах и млекопитающих, в модельных экспериментах описали поведение вируса при смене хозяина и возможные механизмы, определяющие способность вируса быстро репродуцироваться в новом хозяине при его смене, и роль в этом процессе мутаций, изменяющих аффинность связывания с ГАГ клетки.

Выводы

2. Адаптация штамма ЭК-328 к клещам Hyalomma marginatum marginatum сопровождается появлением 15 нуклеотидных замен в геноме, в том числе нуклеотидными заменами в 5-НТО, аминокислотными заменами в сигнальной последовательности белка ргМ, в области белков Е, NS2a, NS4a. Замены в белке Е GIU122—»Gly и Th^s—»Не определяют основные свойства адаптированного к клещам варианта М, отличающие его от родительского штамма ЭК-328.

3. Адаптация ВКЭ к клещам связана с появлением мутаций в белке Е, повышающих аффинность связывания вирионов с гликозаминогликанами (ГАГ) на поверхности клетки. Мутанты ВКЭ с ГАГ-связывающим фенотипом восстанавливают способность к низкоаффинному связыванию с ГАГ клеток за счет появления обратных и компенсирующих замен. Свойства ревертантов зависят от характера и расположения компенсирующих замен в белке Е.

4. ВКЭ может существовать в виде гетерогенной популяции, содержащей варианты, обладающие селективным преимуществом при-репродукции либо в клещах, либо в млекопитающих. Переадаптация к млекопитающим адаптированного к клещам вируса происходит за счет изменения соотношения этих вариантов в популяции, а также за счет появления новых мутантов. .... г ,. .

5. Скорость изменения генетической структуры популяции ВКЭ и разнообразие мутантов определяется характеристикой, хозяина и наличием эффекта "бутылочного горлышка".

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Карганова Г.Г., Дживанян Т.И., Бахмутов Д.В., Романова Л.Ю., Кондратьева Я.Ю., Гмыль Л.В., Лукашов А.Н., Тимофеев A.B., Лашкевич В.А. Сравнительная характеристика вируса клещевого энцефалита, адаптированного к клещам и млекопитающим. Материалы VIII всероссийского съезда эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. 26-28 марта 2002г., Москва, РОСИНЭКС, том 1, стр. 333-334.

2. Романова Л.Ю., Бахмутов Д.В., Дживанян Т.И., Гмыль Л.В., Румянцев A.A., Лукашев А.Н., Гмыль А.П., Карганова Г.Г. Молекулярные основы изменения фенотипических характеристик вируса клещевого энцефалита при его адаптации к клещам и млекопитающим. Материалы Всероссийской научно-практической конференции "Актуальные проблемы эпидемиологии и профилактики инфекционных болезней". 1214 мая 2004г., Самара, том 2, стр. 225-229.

3. Романова Л.Ю., Козловская Л.И., Дживанян Т.И., Гмыль Л.В., Румянцев A.A., Лукашев А.Н., Гмыль А.П., Карганова Г.Г. Молекулярные основы аттенуации вируса клещевого энцефалита при его адаптации к клещам. Материалы всероссийской конференции молодых ученых и специалистов "Окружающая среда и здоровье". 19-22 мая 2005г., Суздаль, стр. 82-185.

4. Романова Л.Ю., Козловская Л.И., Шевцова A.C., Карганова Г.Г. Метод доказательства отсутствия РНК вируса клещевого энцефалита в биопробах. Вопросы вирусологии, 2006г., №1, стр. 38-41.

Результаты работы изложены в тезисах следующих конференций:

5. Романова Л.Ю., Дживанян Т.Н., Гмыль А.П., Бахмутов Д.В., Гмыль Л.В., Румянцев A.A., Лукашев А.Н., Карганова Г.Г. Изменение структуры популяции адаптированного к клещам варианта вируса клещевого энцефалита при его переадаптации к культуре клеток млекопитающих. Тезисы научной конференции «Проблема инфекции в клинической медицине». 4-7 декабря 2002г., Санкт-Петербург, стр. 289-290.

6. Карганова Г.Г., Гмыль А.П., Бахмутов Д.В., Гмыль Л.В., Романова Л.Ю., Румянцев A.A., Лукашев А.Н., Дживанян Т.И., Лашкевич В.А. Механизмы адаптации вируса клещевого энцефалита к клещам и млекопитающим. Тезисы второй научной конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера». 29-31 мая 2002г., Новосибирск, ЦЭРИС, стр. 125.

7. Карганова Г.Г., Кондратьева Я.Ю., Дживанян Т.И., Ожерелков C.B., Гмыль Л.В., Романова Л.Ю., Тимофеев A.B. Особенности иммунного ответа при инаппарантной и острой инфекции, вызываемой вирусом клещевого энцефалита в экспериментах на мышах. Тезисы Международного конгресса «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней - прогресс и проблемы». 4-5 сентября 2003г., Санкт-Петербург, стр. 132.

Заказ №417. Объем 1 пл. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Петроруш». г. Москва, ул. Палиха-2а, тел. 250-92-06 www.postator.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Романова, Лидия Юрьевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1 Общая характеристика флавивирусов.

Структура и функции белков флавивирусов. Ю

Цикл репродукции флавивирусов.

2 Молекулярные основы вирулентности флавивирусов.

3. Хозяин-специфические детерминанты флавивирусов.

4. Эволюция флавивирусов.

5 Экология ВКЭ.

6 Популяционная биология РНК-содержащих вирусов

6.1. Общие положения

6.2. Изменения приспособленности 38 7. Популяция вируса и смена хозяев.

7.1. Общие положения

7.2. Фенотипические и генетические изменения вирусов ККЭ при адаптации к клещам и млекопитающим.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Использованные в работе вирусы

2. Кулы ура клеток

3 Животные

4 Клещи.

5 Иммунные сыворотки и моноклональные антитела.

6 Олигонуклеотиды.

7. Титрование инфекционного вируса.

8. Клонирование вируса методом бляшек.

9. Титрование ВКЭ на мышах.

10 Опьп на клещах

11. Реакция гемагглютинации.

12. Концентрирование ВКЭ из культуральной жидкости инфицированных клеток.

13. Ракетный иммуноэлектрофорез.

14. Сорбция на гепарин сефарозь.

15 Сорбция на эритроцитах

16. иммуноферментный анализ.

17. иммунопреципитация вирусспецифических белков.

18 Электрофорез белков в полиакриламидном геле.

19 Выделение РНК.

20 Обратная транскрипция.

21 полимеразная цепная реакция

22 АНАЛИ1ИЧЕСКИЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ ДНК в АГАРОЗНОМ ГЕЛЕ

23. Препаративный электрофорез и выделение продукта ПЦР из легкоплавкой агарозы

24. определение нуклеотидной последовательности.

25 Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей

26 Me год доказательства отсутствия РНК ВКЭ в биопробах

РЕЗУЛЬТАТЫ.

1. фенотипическая характеристика варианта м.

2. Определение полной нукльотидной последовательности генома штамма ЭК-328 и выявление его филогенетического положения среди штаммов ВКЭ.

3. Сравнение полных последова i ельностей геномов цп амма ЭК-328 и baphai гта М

4. Сравнение антигенной структуры белка Е ш гамма ЭК-328 и варианта М.

5. Характеристика ревертантов, полученных при репродукции варианта М в культуре клеток СПЭВ с помощью клонирования.

5.1. Получение клонов из популяции варианта М, обладающих крупнобляшечным и мелкобляшечным фенотипом.

5.2. Сорбция на гепаринсефарозе

5.3. Оценка вирулентности для мышей дополнительно клонированных ревертантов.

5.4. Сорбция на эритроцитах

6. Разработка метода доказательства отсутствия РНК ВКЭ в биопробах.

7. Оценка способности варианта М, штамма ЭК-328 и клона 116/59 попадать и персистировать в ЦНС мыши после периферического введения с помощью ОТ-ПЦР.

8 Поведение популяции варианта М при репродукции in vivo.

9. Поведение популяции варианта М при пассажах через мозг мыши.

10 Пассажи варианта М в культуре клеток СПЭВ.

11. Опыт по смешанной инфекции штамма ЭК-328 и адаптированного к клещам варианта М в культуре клеток СПЭВ.

ОБСУЖДЕНИЕ.

1 Обоснование выбора данной модели для изучения изменения свойств популяции ВКЭ при смене хозяина

2. Выявление филогенетического положения штамма ЭК-328 среди штаммов ВКЭ.

3. Сравнение геномов родительского штамма ЭК-328 и варианта М.

4 Выявление замен, связанных с фенотипом

5. Роль мутаций, повышающих аффинность связывания с ГАГ, в проявлении свойств ВКЭ.

6 Поведение популяции варианта М при смене хозяина.

ВЫВОДЫ.

С ПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.

Список сокращений а.к. - аминокислота(ы); б/п - беспородные;

БОЕ - бляшкообразующая единица;

ВА - вирионный антиген;

ВКЭ - вирус клещевого энцефалита;

ВС - везикулярный стоматит;

ВЭЛ - восточный энцефалит лошадей;

ГА - гемагглютинирующая активность;

ГАГ - гликозаминогликаны;

ГС - гепаринсефароза; дНТФ - дезоксинуклеотидтрифосфат;

ЖЛ - желтая лихорадка;

ИП - иммунопреципитация; и/п - интраперитонеально;

ИПБ - иммуно-преципитационный буфер;

ИФА- иммуноферментный анализ; и/ц - интрацеребрально;

КЖ - культуральная жидкость;

ККЭ - комплекс клещевого энцефалита

КЭ - клещевой энцефалит;

ЛЗН - лихорадка Западного Нила;

ЛСБ - ламинин-связывающий белок;

М.в. - молекулярный вес;

МС - мозговая суспензия;

НА - невирионный антиген; нт - нуклеотид (ы);

НТО - нетранслируемая область;

ОРС - открытая рамка считывания;

ОТ - обратная транскрипция;

ПААГ— полиакриламидный гель; п/к - подкожно;

ПЦР - полимеразная цепная реакция;

ПЭГ - полиэтиленгликоль;

РГА - реакция гемагглютинации;

РДПА - реакция диффузной преципитации в агаре;

РИЭФ - ракетный иммуноэлектрофорез;

РНБ - реакция нейтрализации бляшек;

СПЭВ - культура клеток почек эмбриона свиньи;

ЦНС - центральная нервная система;

ЦПД - цитопатическое действие;

ЭДМ - энцефалит долины Мюррей;

ЭПР - эндоплазматический ретикулум;

ЯЭ - Японский энцефалит.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изменение свойств популяции вируса клещевого энцефалита при смене хозяина"

На современном этапе накоплен большой массив данных по эволюции вирусов. Установлено, что арбовирусы эволюционируют медленнее, чем другие РНК-содержащие вирусы. Тем не менее, среди вирусов этой группы наблюдается внезапное появление новых эпидемически значимых вариантов. Для понимания закономерностей эволюции вирусов, для предсказания появления более вирулентных вариантов или вариантов с измененным тропизмом необходимо изучение микроэволюционных процессов, определяющих уровень и направление изменчивости.

Вирус клещевого энцефалита (ВКЭ) является представителем рода Flavivirus и вызывает тяжелые заболевания человека, такие как энцефалиты и менингиты. Очаги клещевого энцефалита (КЭ) различаются по количеству и тяжести течения заболевания людей. В последние годы в ряде регионов было показано увеличение числа тяжелых форм, появление новых клинических форм заболевания в виде энцефалита с геморрагическим синдром, а также расширение ареала этого вируса.

В природных очагах ВКЭ существует за счет попеременного размножения в клещах и позвоночных. Филогенетические исследования указывают на то, что эволюция флавивирусов определяется прежде всего видом переносчика, хотя определенное значение имеет и вид прокормителя. На фенотипическом уровне показано, что клещи и позвоночные оказывают разное селективное давление на ВКЭ. Однако, информация о хозяин-специфических детерминантах в геноме ВКЭ крайне ограничена. До сих пор нет никаких данных о поведении гетерогенной популяции ВКЭ при смене хозяина, а также в процессе вирусной инфекции.

Цель и задачи работы: Целью данной работы было изучение изменения свойств популяции ВКЭ при смене хозяина.

Для этого было необходимо решить следующие задачи:

2. Сравнить антигенную структура белка Е адаптированного к клещам варианта М и родительского штамма ЭК-328.

4. На основе анализа ревертантов, полученных из популяции варианта М, выявить хозяин-специфические детерминанты в геноме ВКЭ.

Научная новизна.

Впервые изучены молекулярные основы адаптации ВКЭ к клещам и млекопитающим и предложена схема, объясняющая быструю переадаптацию вируса при смене хозяина.

Получена фенотипическая и генетическая характеристика вариантов, имеющих селективное преимущество при размножении в клещах и млекопитающих.

Определена первая полная нуклеотидная последовательность генома штамма ВКЭ прибалтийской группы сибирского подтипа, депонирована в международной базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.mh.gov/Genbank, № DQ486861).

Показано, что при переадаптации ВКЭ от клещей к млекопитающим в популяции вируса появляются варианты, различающиеся по патогенетическим характеристикам.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Романова, Лидия Юрьевна

Выводы

2. Адаптация штамма ЭК-328 к клещам Hyalomma marginatum marginatum сопровождается набором несинонимических замен в геноме: нуклеотидными заменами в 5'-НТО, аминокислотными заменами в сигнальной последовательности белка ргМ, в области белков Е, NS2A, NS4A. Замены в белке Е Gluj22->Gly и ТЬг42б—>11е определяют основные свойства адаптированного к клещам варианта М, отличающие его от родительского штамма ЭК-328.

• т

Благодарности

Выражаю глубокую благодарность дирекции ГУ ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН (академику РАМН С.Г. Дроздову и профессору М.И. Михайлову) за предоставленную возможность выполнения данной работы. Я искренне благодарна к.б.н. Г.Г. Каргановой за научное руководство, постоянное внимание и поддержку. Также благодарю сотрудников ГУ ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН [Д.В. Бахмутова|, к.б.н. А.П. Гмыль, к.б.н. JI.B. Гмыль, к.м.н. Т.И. Дживанян, к.б.н. JI.A. Буренкову, Л.И. Козловскую, Ю.В. Рогову, д.м.н. А.Н Лукашева за помощь и участие в настоящей работе. Я глубоко признательна академику РАМН В.А. Лашкевичу за плодотворные научные дискуссии. Я благодарна официальным рецензентам д.б.н. В.Н. Ляпустину и к.б.н. Е.В. Белоусову за внимательное прочтение работы и ценные замечания. Я благодарна всем соавторам моих работ, не упомянутых выше, за помощь в проведении данных исследований.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Романова, Лидия Юрьевна, Москва

1. Алексеев А.И., Чунихин С.П. 1987. Способ изготовления стеклянных микроигл для инъецирования клещей и других мелких членистоногих. Мед. паразитол. и паразит, болезни, №6, стр.69-70.

2. Баннова Г.Г., Сарманова Е.С., Караванов А.С., Бычкова М.В., Ливанова Г.П., Флеер Г.П. 1982. Изучение биологических свойств штаммов вируса клещевого энцефалита, выделенных в разных частях его ареала. Вопр. вирусол., №3, стр. 41-44.

3. Богачек М.В., Протопопова Е.В., Терновой В.А., Качко А.В., Иванова А.В., Иванисенко В.А., Локтев В.Б. 2005. Иммунохимические свойства рекомбинантных полипептидов, моделирующих домены I и II белка Е вируса Западного Нила. Мол. биол., №5, стр. 813-822.

4. Гмыль Л.В., Карганова Г.Г., Смирнова С.Е., Лашкевич В.А. 2001. Вирусспецифические белки вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки. Вопр. вирусол., № 3, стр. 16-21.

5. Грицун Т.С., Ляпустин В.Н., Шаталов А.Г., Лашкевич В.А. 1990. Множественные формы белка NS1 как основного компонента невирионного («растворимого») антигена вируса клещевого энцефалита. Вопр. вирусол., № 6, стр. 471-474.

6. Дживанян Т.И., Чунихин С.П., Чупринская М.В., Лашкевич В.А. 1975. Изменчивость вируса клещевого энцефалита по ДС-признаку при пассажах через клещей и позвоночных животных. Материалы IX симпозиума «Экология вирусов», г. Душанбе, стр. 22-24.

7. Дживанян Т.И., Чунихин С.П., Лисак В.М., Каштанова Г.М., Королев М.Б. 1986.

8. Иммунохимические характеристики антигенов варианта вируса клещевого128энцефалита, адаптированного к клещам Hyalomma plumbeum. Вопр. вирусол., №1, стр. 92-96.

9. Дживанян Т.И., Карганова Г.Г., Кондратьева Я.Ю., Лашкевич В.А. 1999. Изменение антигенной специфичности вируса клещевого энцефалита при смене хозяев. Материалы конференции «Актуальные проблемы вирусологии», Москва, стр. 23.

10. Злобин В.И. 2005. Клещевой энцефалит в Российской Федерации: современное состояние проблемы и стратегия профилактики. Вопр. вирусол., №3, 26-32.

11. Иерусалимский А.П. 2001. "Клещевой энцефалит". Новосибирск, 360 с.

12. Карганова Г.Г. 1991. Зависимые от хозяина варианты вируса клещевого энцефалита и особенности их репродукции в клетках млекопитающих. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности вирусология.

13. Кимура М. 1985. Молекулярная эволюция: теория нейтральности. М., Мир, 520 с.

14. Кондратьева Я.Ю. 2005. Особенности экспериментальной инфекции, вызванной вариантами вируса клещевого энцефалита с высокой и низкой нейроинвазивностью. Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности вирусология.

15. Леонова Г.Н., Майстровская О.С. 1996. Вирусемия у больных клещевым энцефалитом и у лиц с присасыванием иксодовых клещей. Вопр. вирусол., №5, стр. 224-228.

16. Ляпустин В.Н., Лисак В.М., Грицун Т.С., Королев М.Б., Лашкевич В.А. 1985. Иммунохимический и электронномикроскопический анализ высокомолекулярных структур вируса клещевого энцефалита. Вопр. вирусол., №4, стр. 419-426.

17. Ляпустин В.Н., Чунихин С.П., Решетников И.Н., Лашкевич В.А. 1987. Изменения синтеза вирионного антигена вируса клещевого энцефалита после пассирования через иксодовых клещей и мелких млекопитающих. Вопр. вирусол., №4, стр. 451456.

18. Малкова Д., Франкова В. 1959. Роль лимфатической системы в развитии клещевого энцефалита у мышей. Acta virol., т.З, стр. 210-214.

19. Мальдов Д.Г., Гмыль Л.В., Карганова Г.Г. 1997. Изменение активности Na+, К+ -АТФазы при репродукции вируса клещевого энцефалита в культуре клеток СПЭВ. Вопр. вирусол., №4, стр. 23-26.

20. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. 1984. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М., Мир, 480 с.

21. Остерман Л.А. 1981. Исследование белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование. М., Наука, 286 с.

22. Пиванова Г.П., Баннова Г.Г., Бычкова М.В., Караванов А.С. 1990. Иммуногенная и гемагглютинирующая активность штаммов вируса клещевого энцефалита, выделенных от больных в разных частях нозоареала. Вопр. вирусол., №3, стр. 49-51.

23. Погодина В.В., Бочкова Н.Г., Корешкова Г.В. 1981. Свойства штаммов серотипа Айна/1448 вируса клещевого энцефалита. Вопр. вирусол., №6, стр.741-745.

24. Погодина В.В., Бочкова Н.Г., Карань Л.С., Фролова М.Н., Трухина А.Г., Маленко Г.В., Левина Л.С., Платонов А.Е. 20046. Сравнительный анализ вирулентности сибирского и дальневосточного подтипов вируса клещевого энцефалита. Вопр. вирусол., №6, стр. 24-30.

25. Погодина В.В. 2005. Мониторинг популяций вируса клещевого энцефалита и этиологической структуры заболеваемости за 60-летний период. Вопр. вирусол., №3, стр.7-13.

26. Протопопова Е.И., Хусаинова А.Д., Коновалова С.Н., Локтев В.Б. 1996. Получение и характеризация антиидиотипических антител, несущих на своей поверхности гемагглютинирующие паратопы вируса клещевого энцефалита. Вопр. вирусол., № 2, стр. 50-53.

27. Протопопова Е.В., Коновалова С.Н., Локтев В.Б. 1997. Выделение клеточного рецетора для вируса клещевого энцефалита при помощи антиидиотипических антител. Вопр. вирусол., № 6, стр. 264-268.

28. Северцев А.С. 1987. Основы теории эволюции. М., Изд-во МГУ, 320 с.

29. Смородинцев А.А., Дубов А.В. 1986. Клещевой энцефалит и его вакцинопрофилактика. Л., Медицина.

30. Топчий М.К., Корнюшенко Н.П. 1967. Руководство к практическим занятиям по вирусологии. Киев, Издательство Киевского Университета, 248 с.

31. Фролова Т.В., Погодина В.В., Ларина Г.И. 1982. Активирующий эффект циклофосфана на поздних этапах персистенции вируса клещевого энцефалита. Вопр. вирусол., №5, стр.578-585.

32. Чунихин С.П., Дживанян Т. И., Баннова Г.Г., Бабенко Л.В. 1975. Экспериментальное изучение роли иксодовых клещей в изменчивости вируса клещевого энцефалита по ДС-признаку. Мед. паразитол. и паразит, болезни, т.44, вып. 3, стр. 344-347.

33. Чунихин С.П., Дживанян Т. И. 1977. «Экологические маркеры» арбовирусов. ДС-маркер вируса клещевого энцефалита. Вестник АМН СССР, №5, стр. 17-21.

34. Чунихин С.П., Куренков В.Б., Дживанян Т. И., Рыльцева Е.В. 1979. Изучение особенностей трансфазовой и трансмиссивной передачи штаммов вируса клещевого энцефалита с разной степенью патогенности для мышей. Мед. паразитол., №2, стр. 61-65.

35. Чунихин С.П., Леонова Г.Н. 1985. Экология и географическое распространение арбовирусов. М., Медицина, 128 с.

36. Чунихин С.П., Решетников И.Н., Ляпустин В.Н. 1986. Изменчивость вируса клещевого энцефалита при пассировании через иксодовых клещей и мелких млекопитающих. Мед. паразитол. и паразит, болезни, №6, стр. 58-61.

37. Шаповал А.Н. 1980. Клещевой энцефаломиелит. Ленинград, Медицина, 180 с.

38. Allison S.L., Stiasny К., Stadler К., Mandl C.W., Heinz F.X. 1999. Mapping of functional elements in the stem-anchor region of tick-borne encephalitis virus envelope protein E. J. Virol., v. 73, p. 5605-5612.

39. Bernfield M., Gotte M., Park P.W., Reizes O., Fitzgerald M. L., Lincecum J., Zako M. Functions of cell surface heparan sulfate proteoglycans. 1999. Annu. Rev. Biochem., v.68, p. 729-777.

40. Billoir F., Chesse R., Tolou H., Micco P., Gould E.A., Lamballerie X. 2000. Phylogeny of the genus Flavivirus using complete coding sequences of arthropod-borne viruses and viruses with no known vector. J. Gen.Virol., v. 81, p. 781-790.5558,59,60

Информация о работе

Романова, Лидия Юрьевна
кандидата биологических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.06

Диссертация

Изменение свойств популяции вируса клещевого энцефалита при смене хозяина - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы