Роль сибирского подтипа вируса клещевого энцефалита в этиологии острых и хронических форм заболевания (в сопоставлении с дальневосточным подтипом)

Безрукова, Екатерина Геннадьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль сибирского подтипа вируса клещевого энцефалита в этиологии острых и хронических форм заболевания (в сопоставлении с дальневосточным подтипом)
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Роль сибирского подтипа вируса клещевого энцефалита в этиологии острых и хронических форм заболевания (в сопоставлении с дальневосточным подтипом)"

Безрукова Екатерина Геннадьевна

Роль сибирского подтипа вируса клещевого энцефалита в этиологии острых и хронических форм заболевания (сопоставление с дальневосточным подтипом)

03.00.06 - вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2009

003481137

Безрукова Екатерина Геннадьевна

03.00.06 - вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2009

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П.Чумакова РАМН.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Погодина Ванда В ацлавовна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Воробьева Майя Сергеевна доктор биологических наук, профессор Бутенко Александр Михайлович

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт вирусологии имени Д.И. Ивановского РАМН

Защита состоится 2009 г. в ¿Г часов на заседании

диссертационного совета Д.ОЙ 1.026.01 при Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им. МЛ.Чумакова РАМН по адресу: 142782, Московская область, Ленинский район, п/о Институт полиомиелита.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П.Чумакова РАМН.

Автореферат разослан__ Ло _2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук J/ t^r/fs Медведкина O.A.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Эпидемиологическая ситуация по клещевому энцефалиту (КЭ) в Российской Федерации продолжает оставаться напряженной, несмотря на 70-летнюю историю изучения этого заболевания, активную разработку мер профилактики и борьбы с ним. Так, по состоянию на 2008 год 46 из 83 субъектов РФ были признаны эндемичными по КЭ частично либо полностью (Письмо Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека от 13 января 2009 г. № 01/176-9-32 "О перечне эндемичных территорий по клещевому вирусному энцефалиту в 2008 году"). Результаты молекулярно-эпидемиологических исследований последних лет показали циркуляцию на территории Российской Федерации (РФ) трех основных подтипов вируса клещевого энцефалита (ВКЭ): дальневосточного, европейского и сибирского (урало-сибирского) (Злобин В.Й. и др., 2002; Погодина В.В., Бочкова Н.Г., Карань Л.С. и др., 2004). Показано широкое распространение сибирского подтипа ВКЭ на европейской и азиатской территории России (Погодина В.В., Бочкова Н.Г., Карань Л.С. и др., 2004; Верхозина М.М., Злобин В.И., Демина Т.В. и др., 2007), на территории европейских стран (Адельшин Р.В., Злобин В.И., Беликов С.И. и др., 2006; Колясникова Н.М., 2008).

Обнаружение трех подтипов ВКЭ послужило стимулом к возобновлению дискуссии о единстве или множественности клещевых энцефалитов, начатой М.П. Чумаковым (1944) и продолженной в 1950-х годах ведущими учеными (Дискуссия о природе клещевых энцефалитов на заседании редакционного совета журнала "Вопросы вирусологии", 1957). По мнению Вотякова В.И. и соавт. (2002), генетические различия между подтипами ВКЭ на нуклеотидном и аминокислотном уровнях соответствуют таковым для выделения трех самостоятельных видов вируса и трех нозологических форм. Сравнивая характеристику трех подтипов ВКЭ, авторы утверждают, что штаммы дальневосточного, европейского и урало-сибирского подтипов способны вызывать качественно отличную клиническую картину заболевания (Вотяков и др., 2002). Однако, дискуссия ведется на основе недостаточного изучения патогенного потенциала сибирского подтипа ВКЭ. Так, данные, характеризующие течение инфекции при инфицировании сибирским подтипом ВКЭ, представлены по материалам Восточной Сибири и Приангарья (Борисов В.А., 1997), но на указанных территориях отмечается циркуляция одновременно двух подтипов ВКЭ -сибирского и дальневосточного (Трухина А.Г., 1989; Андаев Е.И., Трухина А.Г., Карань Л.С. и др., 2006; Погодина В.В., Карань Л.С., Колясникова Н.М., Левина Л.С., Маленко Г.В., Гамова Е.Г. и др., 2007). Кроме того, показано, что с дальневосточным подтипом ВКЭ могут быть связаны как очаговые, так и легкие формы заболевания (Кулакова Н.В., Беликов С.И., Леонова Г.Н., Борисевич В.Г., 2002). На современном уровне дискуссионные вопросы об этиологической связи различных подтипов ВКЭ с разнообразными клиническими формами КЭ должны решаться на основе молекулярно-биологического исследования возбудителей. Это относится, прежде всего, к

оценке патогенного потенциала сибирского подтипа. В настоящее время лишь немногие научные коллективы проводят генотипирование штаммов, изолированных от больных людей. Помимо ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН (Москва), такая работа ведется во Владивостоке (Кулакова Н.В., Беликов С.И., Леонова Г.Н., Борисевич В.Г., 2002; Леонова Г.Н., Беликов С.И., Джиоев Ю.П. и др., 2002), Новосибирске (Ternovoy V.A., Kurzhukov G.P., Sokolov Y.V. et al., 2003; Локтев В.Б., Терновой B.A., Нетесов C.B., 2007), Иркутске (Андаев Е.И., Трухина А.Г., Карань Л.С. и др., 2006).

В настоящее время для диагностики КЭ широко используется метод иммуноферментного анализа (ИФА), позволяющий выявить антиген возбудителя, а также антитела классов M и G. Отдельного рассмотрения заслуживает диагностическая технология, сконструированная с целью повышения не только чувствительности и специфичности, но и мультиплексности разрабатываемых тестов, разработанная в ГНЦ ФГУП "ГосНИИ БП" - фосфоресцентный твердофазный микроанализ (ФОСФАН) (Осин Н.С., Помелова В.Г., Быченкова Т.А., 2006). Она позволяет определять антиген и антитела класса M и G к ВКЭ, а также к другим вирусам комплекса КЭ, флавивирусам и другим вирусам. Метод основан на взаимодействиях по принципу "антиген-антитело". Все перечисленные тест-системы и технологии для выявления антигена ВКЭ и антител к вирусу КЭ изготовлены на основе штаммов дальневосточного подтипа возбудителя.

Цель и задачи исследования. Целью работы было изучение патогенного потенциала доминирующего в России сибирского подтипа вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) на клиническом материале в сопоставлении с дальневосточным подтипом с использованием вирусологических и молекулярно-биологических методов. Для достижения поставленной цели нужно было решить следующие задачи:

1. Сформировать коллекции штаммов, изолированных от больных клещевым энцефалитом (КЭ) и погибших пациентов в разных регионах России и ряде зарубежных стран.

2. Провести ретроспективное вирусологическое исследование и генотипирование коллекционных штаммов, изолированных от больных КЭ и погибших людей.

3. Провести вирусологическое изучение и генотипирование современных штаммов вируса КЭ, генотипирование изолятов РНК.

4. Изучить особенности штаммов ВКЭ, выделенных при инаппарантной инфекции, лихорадочных и менингеальных формах КЭ.

5. Изучить особенности штаммов ВКЭ, выделенных при очаговых формах КЭ с летальным исходом.

6. Изучить особенности штаммов ВКЭ, выделенных при хроническом КЭ.

7. Провести изучение микст-штаммов ВКЭ, изолированных от больных и погибших людей.

8. Изучить эффективность лабораторной диагностики КЭ в регионе доминирования сибирского подтипа (Кемеровская область) с использованием тест-систем, изготовленных на основе штаммов

дальневосточного подтипа, для выявления антигена и антител IgM и IgG методами ИФА при помощи коммерческих тест-систем и экспериментальных иммуночиповых тест-систем ФОСФАН. Клиническая диагностика не входила в задачи настоящего исследования и осуществлялась врачами-неврологами и инфекционистами районных и областных лечебных учреждений. Автор также не принимала непосредственного участия во взятии материала от больных и умерших людей.

Научная новизна. Впервые дана характеристика патогенного потенциала сибирского подтипа ВКЭ на основе изучения и генотипирования штаммов и изолятов, выделенных от больных и погибших людей с подтверждением этиологической связи с подтипом возбудителя. Доказана связь сибирского подтипа ВКЭ со всеми известными клиническими формами КЭ.

Впервые проведено сравнительное изучение этиологической роли сибирского и дальневосточного подтипов ВКЭ в развитии всего разнообразия клинических форм заболевания. Не установлено принципиальных различий между этими подтипами по спектру вызываемых ими клинических форм.

Доказана роль сибирского подтипа ВКЭ в развитии летальных случаев КЭ на территории Вологодской, Ярославской и Свердловской областей в 2008 году и более ранние годы. Установлено, что отягощающими факторами при развитии очаговых летальных форм КЭ являются особенности как макроорганизма (старший возраст, отсутствие вакцинации, сопутствующие заболевания и др.), так и процесса заражения (множественные укусы и длительное присасывание клещей), и свойства возбудителя (высокая нейроинвазивность и вирулентность штаммов, тропизм к различным структурам ЦНС человека).

Установлено, что сибирский подтип ВКЭ в большей степени ассоциирован с хроническими формами заболевания, что подтверждается изоляцией и генотипированием штаммов от больных, а также пролонгированным течением патологического процесса у экспериментально зараженных сирийских хомяков.

На основе исследования локализации вирусной РНК в клиническом материале установлено, что сибирский подтип ВКЭ поражает структуры ЦНС и мозговые оболочки.

Впервые микст-штаммы ВКЭ, сочетающие последовательности генов Е и NS1 сибирского и дальневосточного, либо сибирского и европейского подтипов возбудителя, изолированы от больных КЭ и умерших людей.Показана роль микст-штаммов в этиологии различных форм КЭ (менингеальной, менингоэнцефапитической, хроническом КЭ, в том числе кожевниковской эпилепсии).

Впервые на основе экспериментальных и клинических данных получены доказательства необоснованности выделения заболевания,

вызванного сибирским подтипом ВКЭ, в отдельную нозологическую единицу.

Впервые генетическими методами изучены особенности популяции ВКЭ на мало исследованной на современном этапе территории -Прокопьевском районе Кемеровской области. При доминировании сибирского подтипа ВКЭ установлена циркуляция дальневосточного и его роль в этиологии заболевания.

Исследования, проведенные в зоне доминирования сибирского подтипа ВКЭ (Кемеровская обл.), показали, что на данной территории в лабораторной диагностике с целью детекции в сыворотках крови антигена ВКЭ, антител классов и могут применяться коммерческие тест-системы,

приготовленные из штаммов дальневосточного подтипа ВКЭ.

Практическая значимость работы. Показана роль сибирского подтипа в этиологии широкого спектра клинических проявлений заболевания, от инаппарантной инфекции до острых летальных форм КЭ. В ходе работы было продолжено накопление материала по предмету дискуссии о единстве и множественности клещевого энцефалита. Данных за целесообразность выделения трех отдельных нозологических единиц вместо одной (клещевой энцефалит) получено не было.

Показало, что в зоне доминирования сибирского подтипа ВКЭ может быть эффективно проведена комплексная лабораторная диагностика КЭ при помощи коммерческих и экспериментальных и тест-систем, изготовленных на основе дальневосточного подтипа вируса.

В ходе работы диссертантом были выделены, закреплены и изучены 3 новых штамма ВКЭ,

Внедрения: в международную электронную базу данных вепВапк (http://www.ncbi.nlm.nih.pov/GenBank') были депонированы нуклеотидные последовательности полноразмерного гена белка Е 36 штаммов ВКЭ, выделенных от людей: № Р1214111, Р'1214112, N214132, Р1214133, N214120, П214121|Р1214113,Р1214114,И214115,ЕШ4116, ¥}2Ш\1, Р1214118, Р1214119, Р1214134, Р1214137,

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Штаммы сибирского и дальневосточного подтипов ВКЭ изолированы при всех клинических формах КЭ и инаппарантной инфекции.

2. Сибирский подтип ВКЭ способен вызывать тяжелые очаговые формы КЭ с летальным исходом в регионах РФ (Ярославская, Вологодская, Свердловская, Челябинская, Кемеровская, Иркутская области, Красноярский край и Читинская область). Отягощающими факторами в развитии очаговых летальных форм КЭ являются особенности макроорганизма (старший возраст, отсутствие вакцинации, сопутствующие заболевания и др.), процесса заражения (множественные укусы и длительное присасывание клещей) и свойства возбудителя (высокая нейроинвазивность и вирулентность штаммов, тропизм к различным структурам ЦНС человека).

3. Сибирский подтип ВКЭ в значительной степени связан с хроническими формами КЭ у людей, что подтверждается в опытах на сирийских хомяках.

4. Выделение заболевания, вызванного сибирским подтипом ВКЭ, в отдельную форму, необоснованно. Это подтверждено рядом клинических и экспериментальных данных.

5. В Прокопьевском районе Кемеровской области (эндемичная по КЭ административная территория РФ), где доминирует сибирский подтип ВКЭ, возможно эффективное применение коммерческих тест-систем для детекции антигена ВКЭ и антител к возбудителю, изготовленных на основе дальневосточного подтипа ВКЭ, а также использование экспериментальных иммуночиповых тест-систем "IgM-ВКЭ-ФОСФАН" и "IgG-ВКЭ-ФОСФАН", также изготовленных на основе штаммов дальневосточного подтипа ВКЭ.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на Всероссийской научно-практической конференции "Вакцинология 2006. Совершенствование иммунологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней" (Москва, 2006), Всероссийской научной конференции "Современные научные и прикладные аспекты клещевого энцефалита" (к 70-летию открытия вируса клещевого энцефалита) (г. Москва, 2007 г.), Межрегиональной научно-практической конференции с международным участием "Актуальные проблемы клещевых нейроинфекций" (г. Кемерово, 2008 г.), конференции молодых ученых ЙПВЭ им.М.П.Чумакова РАМН (г. Москва, 2009 г.).

Апробация диссертационной работы состоялась 17.06.2009г. на заседании межлабораторного Ученого совета Учреждения Российской Академии Медицинских Наук Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П.Чумакова РАМН.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и указателя литературы, состоящего из 168 работ отечественных и 65 работ зарубежных авторов. Диссертация изложена на 227 страницах машинописного текста, иллюстрирована 35 таблицами и 44 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы. Для решения поставленных задач были проанализированы результаты полевых и экспериментальных исследований: серологических, молекулярно-биологичсских и вирусологических. Этиологическая роль сибирского подтипа ВКЭ оценивалась при ретроспективном гепотипировании коллекции штаммов ВКЭ, изолированных от больных и умерших людей в разные годы в разных частях ареала, клонов штаммов, полученных путем клонирования в реакции бляшкообразования, а также изолятов РНК, выделенные из ЦНС погибших людей (табл. 1, А, Б). Всего в работе использованы 195 вируссодержащих материалов от 106 больных и умерших людей: 97 штаммов ВКЭ, 61 клон, 37 изолятов РНК.

Таблица №1. Объем вирусологических и молекулярио-биологических исследований.

А. Распределение материала по подтипам КЭ.

Подтип Дальневосточный Сибирский Европейский Микст-штаммы и микст-клоны Всего

Пациентов 43 51 6 6 106

Материалов 46 штаммов 26 клонов 39 штаммов 37 изолятов РНК 2 клона 6 штаммов 6 штаммов 33 клона 97 штаммов 37 изолятов РЖ 61 клон

Б. Распределение материала по клиническим формам КЭ.

Клин. \^фориа Кол-во Инаппаран тная Лихорадоч пая я меникгеаль на» Очаговые нелеталь ные Очаговые летальные хкэ Неизвест на Всего

Пациентов 9 19 14 43 15 6 106

Материалов 9 штаммов 17 штаммов 2 изолята РНК 14 штаммов 4 клона 55штамиоа 35 изолятов РНК 51 клон ¡бштаммов 6 клонов 6 штаммов 97 штаммов 37 изолятов РНК 61 клон

В ходе работы были исследованы сыворотки крови больных КЭ и другими клещевыми инфекциями, предоставленных МУЗ "Городская инфекционная больница" г.Прокопьевска Кемеровской обл. (2008г.), ГУВПО Кемеровская областная клиническая больница и Кемеровской государственной медицинской академией при поддержке Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Кемеровской обл. (2006г.), сыворотки крови населения г.Прокопьевска Кемеровской области (2008 г.), предоставленные МУЗ ГБ№1 г.Прокопьевска Кемеровской обл. и сыворотки крови больных КЭ в Свердловской области, полученные при поддержке ФГУЗ Центр гигиены и эпидемиологии в Свердловской области (2006 г.) (табл. 2). Автор не принимала непосредственного участия во взятии клинического материала от пациентов.

Таблица №2. Сведения об исследованных сыворотках крови (Кемеровская обл., 2008 г., г. Кемерово, 2006 г., Свердловская обл., 2006 г.).

JVs п/п Диагноз Кол-во пациентов Кол-во проб

Лихорадочная форма 17 32

Менингеальная форма 17 35

1 КЭ Очаговая форма 7 14

Неуточненная форма 9 10

Итого 49 91

ИКБ 18 28

2 Другие Клещевая лихорадка неуточненного генеза 37 60

Итого 10S 179

4 Материал от населения 100 100

ВСЕГО 205 279

Прим. От 1 пациента могли быть взяты от 1 до 4 проб биологического материала.

Современная популяция ВКЭ оценивалась в ходе исследований полевого материала (клещи вида Ixodes persulcatus), собранного на территории Свердловской области - в 2006 г. при поддержке ФГУЗ Центр гигиены и эпидемиологии в Свердловской области, на территории Кемеровской области -в 2008 г. при поддержке Филиала ФГУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии в Кемеровской области в г. Прокопьевске и Прокопьевском районе" (табл. 3).

Таблица ХаЗ. Количество исследованных иксодовых клещей на территории

Прокопьевском района Кемеровской области, 2008 г. и Свердловской обл., 2006 г.

Участок Количество клещей (экземпляры)

Кемеровская обл., Прокопьевский район Лучшево 244

Чистугаш 268

Свердловская обл. 409

Всего 921

Изоляция современных штаммов ВКЭ и изучение их вирусологических свойств проводилось в лаборатории клещевого энцефалита и других вирусных энцефалитов ГУ ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН.

Суспензии клещей готовили из индивидуальных экземпляров клещей, суспендируя их в 1 мл среды 199 на растворе Эрла. Культивирование проводили на культуре ткани почек эмбрионов свиньи (СПЭВ).

В работе использовали рандомбрендных белых мышей массой 5-7 г. и сирийских хомяков. Мышей заражали в мозг по 0,03 мл и подкожно, вводя по 0,25 мл инокулята. При интрацеребральном заражении животных наблюдали в течение 14 дней, при экстраневральном - 21 день. Титр вируса оценивали путем интрацеребрального введения мышам 10-кратно разведенной вируссодержащей суспензии. При титровании на мышах и культуре СПЭВ по цитопатическому действию титры вируса определяли по методу полных кумулятивов Рида и Менча и выражали в 1§ ЛД50/мл и ^ ТЦД50/мл.

Инвазивные свойства вируса оценивали по индексу инвазивности (ИИ) (разница титров вируса при церебральном и подкожном заражении мышей, выраженная в lg ЛД50/мл). Значение ИИ в пределах 1-2,5 свидетельствовало о высоких инвазивных свойствах, значение ИИ более 3 указывало на сниженную инвазивную активность.

Нейровирулентность изучали на 2-3-недельных сирийских хомяках путем введения животным в мозг по 0,05 мл инокулята, наблюдения до 30 дней и определения средней продолжительности жизни (СПЖ) животных.

Молекулярно-генетические исследования проводились на базе Научно-производственной лаборатории по разработке и производству препаратов для диагностики инфекционных заболеваний человека и животных ФГУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора РФ под руководством Л.С. Карань. Для детекции ВКЭ и генотипирования штаммов и изолятов из клещей использовали разработанные Л.С. Карань 3 метода генотипирования ВКЭ: секвенирование полноразмерного гена белка Е или его фрагмента длиной 211 нуклеотидных пар, включая маркерную аминокислоту в 206-й позиции,

уникальную для каждого генотипа; анализ ПДРФ и ОТ-ПЦР в режиме реального времени с гибридизационно-флуоресцентной детекцией с генотипспецифическими зондами.

Для подготовки пробы к ПЦР использовали различные методики в зависимости от типа исследуемого материала согласно указаниям производителя («РИБО-преп», «РИБОЗОЛЬ-В»). Обратную транскрипцию осуществляли набором реагентов «PEBEPTA-L-ЮО» производства ЦНИИЭ Роспотребнадзора РФ (г.Москва). При детекции кДНК ВКЭ и генотипироваиии применяли ПЦР в режиме реального времени (Real-Time PCR), где мишенью для праймеров и зондов является участок NS1 гена, РНК ВКЭ детектировали также в одноступенчатой -Time PCR (реверсия и ПЦР в одной пробирке) с праймерами и зондами, комплементарными С-гену.

Расшифровку нуклеотидных последовательностей полученных ПЦР-продуктов проводили на автоматическом секвенаторе «АВ1 Prism DNA Sequncer 3100» (Applied Biosystems, США) с набором реактивов ABI Prism Big Dye Terminator Kit v.1.1.». Множественное выравнивание нуклеотидных последовательностей с последовательностями РНК разных изолятов ВКЭ, депонированных в базе данных DDBJ/EMBL/GenBank, NCBI, осуществляли с помощью программы ClustalX 1.8. Анализ уровня генетического родства и построение филогенетических деревьев проводили в программе Mega 3.1 методом neighbor-joining; попарные расстояния между нуклеотидными последовательностями вычислялись по двупараметрической модели Kimura-2-parameter с числом бутстрепинга 1000 или методом UPGMA с применением алгоритма пропорциональных расстояний, модель p-distance.

Для анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ-анализ) в ПЦР использовали праймеры, комплементарные области гена белка Е ВКЭ. Полученный ампликон 205 нуклеотидных пар (н.п.) обрабатывали эндонуклеазами рестрикции Asu2CI, Bst4CI и Hinfl, в результате чего получали набор последовательностей ДНК с длинами, специфичными для каждого генотипа (Карань JI.C. и др., 2006; Карань JI.C. и др., 2007).

Сыворотки крови больных КЭ и населения были исследованы на наличие антигена ВКЭ методом ИФА при помощи коммерческой диагностической тест-системы производства ФГУП НПО Микроген (НПО "Вирион", г. Томск) "Тест-система иммуноферментная для выявления антигена вируса клещевого энцефалита, серия Р № JIC-000666" по инструкции производителя. Исследования на антитела к ВКЭ классов М и G были проведены на базе ГНЦ ФГУП "ГосНИИ БП" при помощи коммерческих диагностических тест-систем: набора реагентов для иммуноферментного выявления иммуноглобулинов класса М к вирусу клещевого энцефалита "ВектоВКЭ-IgM" и набора реагентов для иммуноферментного выявления иммуноглобулинов класса G к вирусу клещевого энцефалита "ВектоВКЭ-IgG" производства ЗАО "Вектор Бест" по инструкциям производителя. Учет результатов ИФА проводился при помощи спектрофотометра "Мультискан" при длине волны 492 нм.

Определение антител к вирусу КЭ классов М и в проводили на базе ГНЦ ФГУП "ГосНИИ БП" методом ФОСФАН в разработанных ГНЦ ФГУП "ГосНИИ БП" экспериментальных иммуночиповых тест-системах "1§М-ВКЭ-ФОСФАН" и "^С-ВКЭ-ФОСФАП" (Осин Н.С., Помелова В.Г., Быченкова Т.А., 2006) при поддержке В.Г. Помеловой и Т.А. Быченковой. Сигнал фосфоресценции регистрировали с помощью фосфоресцентного сканера ИФИ-02, разработанного в ГНЦ ФГУП "ГосНИИ БП", путем последовательного сканирования участков дна лунки микропланшета лазерным лучом с длиной волны 532 нм и диаметром 200 мкм.

Полученные результаты обрабатывались общепринятыми методами вариационной статистики. Для оценки достоверности различий между сравниваемыми величинами использовали Т-распределение Стьюдента (Анджапаридзе О.Г. и др.,1962; Ашмарин И.П. и др., 1962; Ворошилова М.К. и др., 1964).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Штаммы и изоляты РНК, выделенные при инаппарантной инфекции и острых нелетальных формах клещевого энцефалита. В ходе работы была исследована группа штаммов и изолятов РНК ВКЭ, выделенных от больных при инаппарантном течении инфекции, менингеальной, лихорадочной и очаговых нелетальных формах заболевания. В эту группу вошли 42 вируссодержащих материала (40 штаммов, 2 изолята РНК). 8 штаммов были выделены от пациентов с инаппарантной инфекцией, 4 - от больных, у которых была диагностирована лихорадочная форма КЭ, 15 - от больных менингеальной формой КЭ (у 2 из них была зарегистрирована менингеальная форма с двухволновым течением). Еще 14 штаммов были выделены от больных с очаговыми нелетальными формами КЭ, 12 из них -штаммы из коллекции М.П. Чумакова, изолированные им в период 19391945гг. на территории Урала, когда в структуре вирусной популяции доминироват дальневосточный подтип ВКЭ. 1 изолят РНК ВКЭ был выделен при менингеальной форме КЭ, 1 - при лихорадочной.

На исследованной группе штаммов и изолятов показано, что все 3 подтипа ВКЭ могут вызывать как бессимптомное течение инфекции, так и формы заболевания с более легким течением (лихорадочную, менингеальную), и более тяжелые очаговые нелетальиые формы (рис. 1).

Рисунок I. Этиологическая структура инаппарантной инфекции, неочаговых и очаговых нелегальных форм КЭ.

Из приведенных на рис. 1 данных может сложиться впечатление, что сибирский подтип не вызывает очаговые нелетальные формы КЭ. Это определяется выборкой

штаммов и периодом их изоляции (табл. 4).

□Дальневосточный подтип ^Европейский подтип

■ сибирский подтип □ Микст-штаммы

Таблица №4. Распределение подтипов ВКЭ при разных клинических формах нелегального КЭ в зависимости от времени и территории изоляции.

Клиническая форма КЭ Общее кол-во штамм мов м изолятов Изоляция штаммов Подтипы Микст-штаммы

Годы Территории Дальне восточный Сибирский Европейский

Менинго знцефалитическая (без летального исхода) 14 1939-1942 Урал(12) Ленинградская обл. (2) 13 . 0 1 0

Лихорадочная, менингеальная 20 1953 1961 1973-1974 1957 1974 1961 1953-1969 Чехословакия (2) Югославия (1) Латвия (2) Москва* (1) Вологодская обл. (2) Новосибирская обл. (Г Кемеровская обл. (8) 2 11 6 1

Инаппарантная инфекция 1957 i960 1961-1963 Хабаровский край (1) Урал (5) Кемеровская обл. (2) 5 3 0 0

Всего 42 20 14 7 1

* - штамм Пак изолирован при лабораторном заражении сотрудника, работавшего с возбудителями двухволнового менингоэнцефалита и двухволновой молочной лихорадки (Пан Цю-фан, 1960).

Отсутствие четкого разграничения этиологической роли подтипов видно также при анализе не вирусологических свойств штаммов. Так, на примере двух штаммов, выделенных от людей с инаппарантной инфекцией (штаммы Васенкова и Хаб-9), показано, что они имели сходные характеристики по результатам вирусологических исследований (сниженная вирулентность для мышей.). При этом штамм Васенкова генотипирован как сибирский подтип ВКЭ, штамм Хаб-9 - как дальневосточный.

В 2008г. на территории Кемеровской обл. от больных людей были выделены 2 изолята РНК ВКЭ. Из крови больного менингеальной формой КЭ был выделен изолят РНК ВКЭ Кем-Баж-08. Он был антигенно активен в ИФА. Проведенное генотипирование методом гибридизационно-флуоресцентной детекции с генотипспецифическими зондами и секвенирование по гену белка С показало принадлежность данного изолята РНК к сибирскому подтипу ВКЭ. Изолят РНК, выделенный от пациента с лихорадочной формой заболевания (Кем-Д-08), также проявивший антигенную активность в ИФА, был генотипирован методом гибридизационно-флуоресцентной детекции с генотипспецифическими зондами и методом секвенирования с филогенетическим анализом как дальневосточный подтип ВКЭ, что было подтверждено в ходе секвенирования по гену С. Следовательно, несмотря на данные последних лет, свидетельствующие об абсолютном доминировании сибирского подтипа ВКЭ на данной территории (Колясникова Н.М., 2008), дальневосточный подтип циркулирует в регионе и играет роль в этиологии заболевания.

Штаммы и нзоляты РНК, выделенные при очаговых летальных формах клещевого энцефалита. Для изучения роли различных подтипов ВКЭ в этиологии очаговых форм КЭ, приводящих к смертельному исходу, была подобрана коллекция из 35 штаммов и изучены 35 изолятов РНК ВКЭ,

выделенных от 43 погибших людей (очаговая форма КЭ с летальным исходом) (табл. 5).

Таблица №5. Штаммы и изоляты РНК ВКЭ, выделенные от умерших пациентов.

А. Штаммы ВКЭ

Территории Годы Количества штаммов (пациентов)*

Дальний Восток 1937, 1957,1975 5

Казахстан 1941 1

Урал и Западная Сибирь 1943, 1944, 1970, 2003 7(9)

Восточная Сибирь 1965, 1979, 1995-2003 15

Ярославская, Вологодская области 1992, 2001,2008 5

Всего 33 (35)

* - от больных выделены по 2 штамма ВКЭ.

Б. Изоляты РНК ВКЭ.

Территории Годы Количество изолятов РНК ВКЭ (пациентов)**

Ярославская область 2002,2003,2008 11(6)

Красноярский край 2002,2003 19(5)

Челябинская область 2004 1

Вологодская область 2008 2(1)

Свердловская область 2008 2(1)

Всего 35 изолятов РНК от 14 больных

** - в некоторых случаях из материала от одного больного выделялись несколько изолятов РНК ВКЭ (из различных участков мозга). От 4 погибших больных были выделены изоляты РНК и штаммы ВКЭ.

Среди штаммов рассматриваемой группы были исследованы 13 штаммов ВКЭ, изолированные от больных, погибших в Читинской обл. (Андаев Е.И., Трухина А.Г., Карань Л.С. и др., 2006). Штаммы были переданы в лабораторию клещевого энцефалита и других вирусных энцефалитов ИПВЭ им.М.П.Чумакова РАМН для изучения их свойств и генотипирования совместно с ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора. в 30,7% случаев в этиологии острого летального КЭ принимал участие сибирский подтип ВКЭ, в 61,5% - дальневосточный, и в 7,8% смертельные случаи КЭ на территории Читинской области были вызваны смешанными штаммами.

При заражении белых мышей штаммами сибирского подтипа, изолированными на территории Читинской обл., продолжительность инкубационного периода составляла 4-10 сут., при заражении штаммами дальневосточного подтипа - 4-8 сут. Большинство штаммов являлись высоковирулентными как при внутримозговом, так и при подкожном введении (ИИ < 2,0 1§ ЛД5</мл), и только 1 штамм сибирского подтипа проявил себя как умеренновирулентный (ИИ = 3,0 ЛД50/мл). Таким образом, не найдено различий в способности преодолевать ГЭБ между штаммами сибирского и дальневосточного подтипов ВКЭ. Независимо от принадлежности к тому или иному подтипу, все штаммы агглютинировали эритроциты гуся при рН 5,8-6,2, титры гемагглютининов колебались от 1:40 до 1:2560, преобладали штаммы со средними титрами. Исключение составил штамм дальневосточного подтипа, который не обладал гемагглютинирующей

активностью. В опытах на сирийских хомяках штаммы сибирского подтипа ВКЭ вызывали гибель 11,1-50% животных при СПЖ 14,4-32,1 дней.

Летальные случаи, вызванные сибирским подтипом ВКЭ.

Отдельного рассмотрения заслуживает исследование штаммов и изолятов, выделенных при 22 случаях заражения сибирским подтипом ВКЭ с развитием очаговой формы заболевания и летальным исходом. 19 из 22 случаев имели место в последние годы (1996-2008 гг.). Исследованные летальные случаи КЭ были зарегистрированы на территории Ярославской, Вологодской, Свердловской, Челябинской, Кемеровской, Иркутской областей и Красноярского края, а также Читинской области. Больные не были вакцинированы, возраст варьировал от 15 до 77 лет, причем, более 60% наблюдений составляют старшие возрастные группы. В большинстве случаев отмечались укусы клещей, в 1 случае — употребление сырого козьего молока. Инкубационный период варьировал от 4 до 30 дней. У 12 человек наблюдалось молниеносное течение заболевания (менингоэнцефалитическая форма КЭ с нарастанием стволовой симптоматики, парезов, комы). Специфическое лечение иммуноглобулином, РНК-азой, симптоматическая терапия и другие меры (ИВЛ, трахеостомия) не давали ожидаемых результатов, и пациенты погибали от тяжелых нарушений со стороны ЦНС.

В опытах на сирийских хомяках штаммы, выделенные от больных с молниеносным течением КЭ на территории Ярославской, Вологодской, Свердловской обл. вызывали гибель 50-90% животных при СПЖ 13-18 дней.

Генотипирование изолятов РНК из различных участков головного и спинного мозга (всего 35 изолятов), а также изолированных штаммов (всего 12 штаммов) проведено методом гибридизационно-флуоресцентной детекции с генотипспецифическими зондами при помощи ПЦР в режиме real-time. Результаты отражены на рис. 2.

Таким образом, в ходе работы впервые была исследована этиология 43 летальных случаев КЭ с доказательством принадлежности возбудителя к тому или иному подтипу ВКЭ путем генотипирования. Сибирский подтип показал способность вызывать очаговые летальные формы КЭ, наряду с дальневосточным.

Рисунок 2. Этиологическая структура очаговых летальных форм КЭ.

Микст-штаммы

Дальневосточный ^ Сибирский

подтип -— _____подтип

42% 51%

В последние годы при заражении сибирским подтипом отмечены случаи заболевания с тяжелым течением, молниеносным прогрессированием симптомов КЭ, несмотря на активное лечение. Показана способность микст-штаммов вызывать очаговые формы КЭ с летальным исходом. Показана тропность сибирского подтипа ВКЭ к различным отделам ЦНС. РНК ВКЭ

была выделена из мягких мозговых оболочек и из разных участков головного и спинного мозга погибших пациентов: коры больших полушарий, лобной и теменной долей, подкорковых ядер, аммонова рога, варолиева моста, области боковых желудочков, ствола, продолговатого мозга, гипоталамуса.

Летальные исходы КЭ, связанные с заражением сибирским подтипом возбудителя, зарегистрированы в различных регионах РФ: в Ярославской, Вологодской, Свердловской, Челябинской, Кемеровской, Иркутской областях, Красноярском крае, а также в Читинской области. Штаммы, выделенные при хроническом клещевом энцефалите (ХКЭ). Были изучены 15 штаммов и 6 клонов от 15 больных ХКЭ и умерших людей (один из клонов описан как микст-клон). 11 из 16 штаммов выделены от больных, заразившихся КЭ в Восточной Сибири (Иркутская, Читинская обл.), 2 штамма - от больных, заразившихся на Дальнем Востоке, по 1 штамму - от больных, инфицировавшихся ВКЭ в Западной Сибири, на Урале и в европейской части России.

С помощью молекулярно-биологических методов удалось выяснить, что хронические формы КЭ могут быть вызваны ВКЭ всех трех подтипов. Однако в наибольшей степени тенденция к хронизации проявляется при заражении вирусом сибирского подтипа: в ходе изучения 15 случаев ХКЭ доказана этиологическая связь 11 из них с сибирским подтипом ВКЭ. Была доказана роль дальневосточного подтипа в этиологии 3 случаев ХКЭ. При анализе историй болезни было выяснено, что больные ХКЭ, от которых выделен ВКЭ сибирского подтипа, живут с этим заболеванием достаточно долго, однако периоды безрецидивного течения болезни во всех случаях сменялись ухудшением, что характеризует ХКЭ как серьезное, неуклонно прогрессирующее заболевание.

При анализе историй болезни пациентов существенных различий в тяжести течения заболевания, вызванного сибирским и дальневосточным подтипом ВКЭ, выявлено не было. При заражении как сибирским, так и дальневосточным подтипом ВКЭ отмечалась хронизация на ранних сроках заболевания, без отчетливого периода ремиссии, активное прогредиентное течение с тяжелыми поражениями центральной нервной системы, оба подтипа ВКЭ показали способность вызывать летальные исходы.

Таким образом, исследование показало роль всех трех подтипов в этиологии ХКЭ, однако была отмечена более выраженная связь сибирского подтипа с хроническими формами заболевания. Более выраженная связь сибирского подтипа ВКЭ с хроническими формами заболевания находит отражение в пролонгировании экспериментальной инфекции у сирийских хомяков при заражении штаммами сибирского подтипа (табл. 6)

Выделение микст-штамма ВКЭ от больного ХКЭ впервые показало роль микст-штаммов и европейского подтипа ВКЭ в этиологии хронических форм заболевания. Болезнь при заражении микст-штаммом ВКЭ имела затяжное, вялое течение с постепенной регрессией симптоматики.

Таблица №6. Сравнение вирулентности штаммов дальневосточного и

сибирского подтипов для сирийских хомяков. _ А. Штаммы, выделенные от людей._

Подтип возбудителя Штамм Клиническая форма Вирулентность для сирийских хомяков

% гибели СПЖ (дни)

ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫЙ Т-кровь Очаговая нелетальная 100 11,1

Белогрудое Очаговая летальная 87,7 9,5

Юлия Очаговая летальная 100 7,1

Нина Очаговая летальная 100 9,2

Тройник ХКЭ 100 9,3

Антипов Очаговая нелетальная 80 13,2

Хаб-9 Инаппарантная инфекция 100 7,0

Хаб-17 Очаговая летальная 100 8,83

Софьин Очаговая летальная 100 9,9

Фатеев Менингеальная 100 8,0

1024 ХКЭ 100 8,0

СИБИРСКИЙ Вол-430 Очаговая летальная 50 18,0

Чита-22 Очаговая летальная 44,4 14,4

Чита-H Очаговая летальная 50 23,3

Чита-653 Очаговая летальная 11,1 32,1

215/79 Очаговая летальная 40 10,2

592 Очаговая летальная 29,2 85,8

41/65 Очаговая летальная 16,6 120,4

518 Очаговая летальная 40 100

Яр-Ав-2008 Очаговая летальная 90 13

МИКСТ-ШТАММЫ " 45/69 ХКЭ;.- * ¡00 10

- 4irra-29 ' Очаговая летальная - 75 I8.S

Байдар "1 пассаж " Очаговая летальная л * < ** * > * ^ ' ~ * зог ï 20,5

2 пассаж '100 '

Б. Штаммы, выделенные из клещей.

Подтип возбудителя Штамм Территория изоляции Вирулентность для сирийских хомяков

% гибели СПЖ (дни)

ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫЙ Екатеринбург-74 Свердловская обл. 100 7,0

Екатеринбург-42 Свердловская обл. 100 5,3

Екатеринбург-79 Свердловская обл. 100 6,3

СИБИРСКИЙ ПЧ-49 Кемеровская обл. 70 24,9

Курган-264 Курганская обл. 44,4 22,1

Курган-265 Курганская обл. 55,5 18,1

Курган-279 Курганская обл. 33,3 23,7

Курган-280 Курганская обл. 30,0 23,5

Вологда-227 Вологодская обл. 30,0 21,8

Вологда-42 Вологодская обл. 33,3 21,8

Екатеринбург-27/11 Свердловская обл. 40 27,0

Екатеринбург-37/3 . Свердловская обл. 33 22,4

Микст-штаммы ВКЭ, выделенные от больных и погибших людей.

В ходе изучения роли различных подтипов ВКЭ в этиологии и патогенезе заболевания, Ю.П. Джиоев и соавт. (2003) методом молекулярной гибридизации in situ с генотипспецифическими дезоксинуклеотидными зондами обнаружили одновременное присутствие в разрушенных клетках нейронов погибшего больного вирусные геномы, гомологичные штамму Софьин, а в глиальных клетках ЦНС этого же погибшего пациента - штамму Лесопарк-11. (Джиоев Ю.П., Беликов СМ., Каня О.В., Капустин М., Злобин В.И., 2003). Анализ показал, что Авторы отмечают, что деструкция глиальных клеток была выражена в меньшей степени, чем нейронов. Данные Ю.П. Джиоева й соавт. (2003) показывают возможность одновременного заражения человека двумя подтипами ВКЭ.

В ходе нашей работы от людей были впервые выделены, исследованы и описаны 6 политиповых штаммов ВКЭ (микст-штаммов), содержащих нуклеотидные последовательности, характерные для двух подтипов вируса, также описан один микст-клон штамма, выделенного от человека. Формы заболевания при этом были различными (табл. 6).

Таблица №6. Политиповые штаммы и клоны ВКЭ, выделенные от людей.

JVi лУп Наимено ванне штамма Форма заболевания Территория Год Подтип

1 Байдар Очаговая, летальный исход Казахстан 1941 Сибирский+дальневосточный

2 СБ-14л Менингеальная Кемеровская обл. 1963 Сибирский+дальневосточный

3 А-64 ХКЭ, кожевниковская эпилепсия (клон штамма Айна/1443) Иркутская обл. 1963 Сибирский+европейский

4 45/69 ХКЭ, сирингомиелия Иркутская обл. 1969 Сибирский+европейский

5 РБ-3315 Менингеальная Латвия, Рига 1973 Сибирский+европейский

6 Яр-13 Очаговая, летальный исход Ярославская обл. 1992 Сибирский+дальневосточный

7 Чита-29 Мекингоэнцефалитическая, летальный исход Читинская обл. 2002 Сибирский+дальневосточный

Штамм Байдар, изолированный в 1941 г. в Казахстане, является первым смешанным штаммом, выделенным при остром КЭ с летальным исходом. Также этот штамм показывает наиболее раннее обнаружение сибирского подтипа. Из образцов крови впоследствии (на 9 день) скончавшегося пациента (Чумаков М.П., 1944) М.П. Чумаковым был выделен штамм Байдар. Ретроспективное определение подтипической принадлежности штамма Байдар методом гибридизационно-флуоресцентной детекции с генотипспецифическими зондами показало, что он содержит последовательности, характерные и для дальневосточного, и для сибирского подтипов ВКЭ (рис. 3). Аналогичные данные были получены при генотипировании трех образцов штамма Байдар: суспензии лиофилизированного вируса и штамма, прошедшего 1 и 2 пассажа на белых мышах.

Рисунок 3. Генотипирование штамма Байдар при помощи генотнпспецифических зондов и анализа ПДРФ. Дальневосточный подтип Сибирский подтип Рестрикционный анализ

подтипов в популяции данного штамма варьировало. На уровне 2-го пассажа на мышах и 1-го пассажа в культуре клеток СПЭВ возросла концентрации дальневосточного подтипа. По-видимому, изменение концентраций подтипов ВКЭ в популяции штамма Байдар отражается на его вирулентности для сирийских хомяков (модель, дифференцирующая дальневосточный и сибирский подтипы ВКЭ). Гибель 30% животных при средней продолжительности жизни (СПЖ) 20,5 дня в 1 пассаже может указывать на преобладание в популяции сибирского подтипа. Гибель 100% животных при СПЖ 7,7 дня в 3-м пассаже можно связать с доминированием в популяции "микст-штамма" дальневосточного подтипа.

По данным секвенирования Е-гена, сибирский подтип, входивший в состав штамма Байдар, относится к азиатскому топоварианту и входит в кластер с прототипным штаммом Васильченко.

Штамм Яр-13 был выделен из мозга погибшей больной на территории Ярославской области в 1992 г. Генотипирование штамма Яр-13 двумя методами - путем анализа ПДРФ и детекции с генотипспецифическими зондами в real-time ПЦР показало наличие последовательностей, характерных для двух подтипов ВКЭ - дальневосточного и сибирского. После проведения 10 пассажей в культуре клеток СПЭВ штамм был клонирован. По результатам 4-кратного клонирования штамма в реакции бляшкообразования штамм показал бляшкообразующую активность 107-108 БОЕ/мл. Пробы различных систем пассирования были генотипированы. Генотипирование 26 клонов, полученных при 4-кратном клонировании в реакции бляшкообразования, показало их принадлежность к дальневосточному подтипу и вытеснение из смеси сибирского подтипа.

Штамм РБ-3315 был выделен из крови больного менингеальной формой КЭ на территории Латвии в 1973 г.

Штамм СБ-14л был выделен из ликвора больного менингеальной формой КЭ.

Штамм Чита-29 был выделен из лобной доли головного мозга умершего больного К., 28 лет (Андаев Е.И., Трухина А.Г., Карань Л.С. и др., 2006). Укус клеща был отмечен 23 июня 2002 г. Заболел остро 15 июля 2002 г., от госпитализации отказался. 17 июля был госпитализирован в тяжелом состоянии, смерть наступила 22 июля. Диагноз: клещевой энцефалит, менингоэнцефалитическая форма.

Вирусологические исследования. Инкубационный период для новорожденных белых мышей (3 пассаж) составил 13 суток. Штамм обладал

8 96

высокой патогенностью для белых мышей массой 6-7г (титр 10 ЛД50/МЛ), Штамм был охарактеризован как высоковирулентный (ИИ 0,36 ^ ЛД50/мл), агглютинировал 0,5% эритроцитов гуся при рН 5,8-6,2, титр гемагглютининов при оптимальном значении рН 6,2 на уровне 3 пассажа на новорожденных белых мышах равен 1:640. Исследование штамма на сибирских хомяках показало, что штамм Чита-29 сочетает характеристики дальневосточного подтипа ВКЭ (гибель 75% животных) и сибирского (удлиненный срок жизни, СПЖ 18,8 дней).

Рисунок 4. Генотипирование штамма Чита-29.

Европейский подтип Дальневосточный подтип Сибирский подтип

анализа

Генотипирование штамма Чита-29. По ш _ результатам генотипирования в ПЦР с

Г _ _____ гибридизационно-флуоресцентной детекцией с

г .. I- генотипспецифическими зондами и при анализе ПДРФ

штамм Чита-29 был охарактеризован как микст-штамм, содержащий последовательности сибирского и дальневосточного подтипов ВКЭ (рис. 4).

В ходе секвенирования участка Е гена штамма 29 была получена последовательность, содержащая смесь кДНК дальневосточного и сибирского подтипов - 2 сигнала в одной позиции (рис. 3). Секвенирование фрагмента гена NS1 штамма Чита-29 длиной 140 н.п. показало, что в дальневосточной составляющей генома вируса 3 системы пассирования в области связывания зонда имеются замены. В позициях 3053 и 3062 находится тирозин, что объединяет штамм Чита-29 с другим штаммом -Чита-18, имеющим такие же замены (рис. 6).

Рисунок 5. Сиквенс политипового штамма.

Рисунок б. Уникальные замены в геноме штамма Чита-29.

^ А ______ .. Ч^ -Л. ^^ 1—■

Чита-29 >?ТТС АСАС АСАТС А Чита-18 »;ттс АСАСАОАТСА

Секвенирование образцов 1 системы пассирования показало, что некоторые замены указывают на вариабельность штамма Чита-29 внутри сибирского подтипа (рис. 7).

Рисунок 7. Вариабельность штамма Чита-29 в пределах сибирского подтипа.

■ i> Translate

oi^l

lxLO

LÜJJ

TGAGTGTGACACAGGACTATOGGGGCAGCTGTCAAGAATGtH^reGCAGritACACA-OATCAGAGC"^

I >01-08-06_таЕ18_ТЕЕ3138.аЫ(1>141)^-j ^23-03-07JK_TBhlJ.abJ (3>150) ] t>01-08-06~TB£29_13E3138.abl(l>lSL)f" i >0J-08-06jrBE3SjraE3138.ebl(I>141)«-; >23-03-07J5JBI3M.ebm>148) -! >23-03-0V_lH_TBE31_1.8bl(2>153) «I t>23-03-0*iJ6JBE31J_01.abl(blSO)-

itgagtgtgacacaggagtgatgggggcagctgtcaagaatggqtggcagncacaca-gatcagagcctctggatgamtccctgagaaatgä itgactgtgacacaggagtgatgggggcagctintaagaatggcatggcaintcac^^ lt5actgtgacacliggagtgatgggggckgcygtcaagaay|ggcatgctp-gtccacacaigacc^k itgagtgtgacacaggagtgatoggggcagctotcaagmtggcatggcagtoaca^

iTGAGTCTGACACAGGAtjrGATGGGGGCAGCTGTCAAGAATGGiATGGCAGTTCACACA-GATCAGAGCCTOT

lTGACTGTGACACAGGAS7GAT0GGGGCAGCTGTCMGAATgGCAT5GCAGTTCACACA-GATC

lTGACTGTGACACAGGA.(nT3A~0GGGGCAGCTGTOiAGAATGGCArGG

Мозговая суспензия 2 системы пассирования и одна из бляшек крупного размера этой же системы пассирования были генотипированы методом секвенирования как дальневосточные без примесей последовательностей, характерных для сибирского подтипа вируса, обладающие высоким уровнем гомологии со штаммом Зе^аг^. Изучение структуры современной природной популяции вируса клещевого энцефалита в Кемеровской обл. (Проконьевский район, 2008г.). Кемеровская область представляет интерес для изучения по КЭ. На территории Кемеровской области описан феномен смены доминирующего подтипа ВКЭ (Колясникова Н.М., 2008). Изменение популяции возбудителя сопровождается патоморфозом заболевания (рис. 8, А, Б).

Рисунок 8. Структура клинических форм и популяции ВКЭ в Кемеровской обл. в

динамике.

Щ •

И Лихорадочная форма И Очаговые формы

ЕЭМешшгеальная форма

Структура ". Структура популяции популяции

возбудителя возбудителя в 1963 г. в 2005 г.

ущжщу

■Дальневосточный подтип □ Сибирский подтип

Следует отметить, что на современном этапе во многих районах области популяция ВКЭ и этиологическая роль подтипов изучены недостаточно.

Кемеровская область является уникальным регионом для проведения иммунологических исследований на КЭ. На данной территории практически не проводится вакцинопрофилактика КЭ (охват прививками - не более 1% населения) (Соколов В.М., Минаков Б.С., Субботин A.B., Дроздова О.М., 2008). Специфическая профилактика КЭ в Кемеровской области базируется преимущественно на проведении экстренной иммунопрофилактики лицам, обращающимся по поводу присасываний клещей. В зоне доминирования сибирского подтипа ВКЭ большое практическое значение приобретает вопрос об эффективности коммерческих диагностических систем для детекции антигена ВКЭ и антител к возбудителю, изготовленных на основе дальневосточного подтипа вируса. В некоторых районах Кемеровской области изучение современной популяции ВКЭ ранее не проводилось.

Вирусофорность на участке Лучшево составила 0,82%, на участке Чистугаш - 8,5%. Средний уровень зараженности клещей по Прокопьевскому району составил 4,66%. Из 25 изолятов РНК ВКЭ, выделенных на территории Прокопьевского района Кемеровской обл. в 2008 г. 20 были генотипированы методом гибридизационно-флуоресцентной детекции с генотипспецифическими зондами, 100% изолятов отнесены к сибирскому подтипу вируса. Филогенетический анализ показал, что изоляты КЭ, выделенные из клещей на территории Прокопьевского района, представляют собой неоднородную группу (рис. 9).

Рисунок 9. Анализ филогенетического родства на основе полной последовательности Е-гена штаммов ВКЭ сибирского подтипа методом ,1ошш« (N3), модель Кнпига-2-рагате1г (К-2-р) (Караиь Л.С., 2009).

закреплены в лаборатории клещевого энцефалита и других вирусных энцефалитов ИПВЭ им.М.П.Чумакова как штаммы. Все штаммы вызывали активное цитопатогенное действие в культуре клеток СПЭВ (++++ на 4-5 сутки). При интрацеребральном заражении белых мышей инкубационный период составлял 4-5 дней, после чего у 100% животных развивалась классическая клиническая картина КЭ с параличами задних конечностей. В опытах на сирийских хомяках этот же штамм вызывал гибель 70% животных,

СПЖ 24,9 дней. Материал 3 штаммов разных систем пассирования был антигенно активен в ИФА.

В 2005 г. при обследовании преимущественно северных районов Кемеровской области были получены данные о доминировании сибирского подтипа вируса КЭ (Колясникова Н.М., 2008). Изученная нами современная популяция вируса КЭ (2008г.) в южных районах Кемеровской области представлена преимущественно сибирским подтипом ВКЭ. Показано, что это гетерогенная группа азиатского топоварианта сибирского подтипа возбудителя, включающая штаммы двух подгрупп, близких к штаммам Васильченко и Заусаев. Однако, как уже говорилось выше, один из изолятов ВКЭ, выделенный от больного при лихорадочной форме КЭ, был генотипирован как дальневосточный подтип возбудителя.

Определение эффективности диагностикумов, изготовленных на основе штаммов дальневосточного подтипа, в зоне доминирования сибирского подтипа ВКЭ (по материалам Кемеровской обл.). Для проведения исследований сывороток крови людей на антиген ВКЭ и антитела классов М и в в 2008 г. были осуществлены выезды в г. Кемерово и г. Прокопьевск Кемеровской области. С целью определения наличия антигена и антител к ВКЭ в крови больных и населения на эндемичной территории, были собраны коллекции сывороток крови (табл. 2).

Диагноз КЭ был выставлен врачами-инфекционистами и неврологами на основе эпид.анамнеза, клинических симптомов, обнаружения в сыворотке крови или ликворе антител ^М и/или Принимались во внимание динамика нарастания и сероконверсия. Детекция антител класса О в небольших количествах без динамики в сторону увеличения их концентрации расценивалась как результат естественной иммунизации (проэпидемичивания).

Таблица №7. Частота обнаружения антигена ВКЭ и антител к возбудителю при

различных формах заболевания.

Показатель Форма Антиген ВКЭ 18М НС

Лихорадочная 74,1% 22,2% 81,5%

Менингеальная 47,2% 75% 69,4%

Очаговая 64,3% 85,7% 100%

[¡еуточнеиная 79,7% 13% 44,9%

Антиген ВКЭ обнаруживался с высокой частотой при различных формах КЭ (табл. 7). При лихорадочной форме заболевания антигенемия регистрировалась достоверно чаще, чем при менингеальной (разница достоверна, Р<0,05).

Обращает на себя внимание тот факт, что антитела классов М и й обнаруживались при очаговых формах КЭ достоверно чаще, чем у больных лихорадочными формами КЭ (^М -100% наблюдений при очаговых формах и 66,6% при лихорадочных, разница достоверна, Р<0,05; 1§0 - 100%

наблюдений при очаговых формах и 65,2% при лихорадочных, разница достоверна, Р<0,05).

Таким образом, диагностические тест-системы для детекции антигена и антител к ВКЭ, изготовленные на основе дальневосточного подтипа возбудителя, могут быть применены в зоне преимущественной циркуляции сибирского подтипа.

ВЫВОДЫ

1. Впервые изучен патогенный потенциал сибирского подтипа ВКЭ на клиническом материале, проведено сравнение патогенности сибирского и дальневосточного подтипов вируса. На основе вирусологических и молекулярно-биологичсских исследований 195 материалов (штаммов, клонов и изолятов РНК ВКЭ), выделенных от больных и погибших людей на территории Урала, Западной и Восточной Сибири, установлено, что сибирский подтип ВКЭ так же, как и дальневосточный, вызывает весь спектр клинических форм заболевания и разные варианты течения инфекции - от инаппарантной инфекции до очаговых форм с летальным исходом.

2. Очаговые формы КЭ с летальным исходом, этиологически связанные с сибирским подтипом вируса, зарегистрированы в европейских и азиатских регионах РФ. Очаговые формы КЭ, вызванные сибирским подтипом ВКЭ, регистрируются как в зонах доминирования сибирского подтипа ВКЭ, так и в зонах циркуляции двух подтипов - сибирского и дальневосточного.

3. Сибирский подтип поражает структуры ЦНС и мозговые оболочки. Это подтверждается развитием у пациентов многоуровневых очаговых форм, выделением изолятов РНК и штаммов сибирского подтипа ВКЭ из передних и задних рогов шейного и поясничного отделов спинного мозга, лобной и теменной долей, аммонова рога, ствола мозга, коры больших полушарий, подкорковых ядер, мягких мозговых оболочек, гипоталамуса, области боковых желудочков погибших пациентов.

4. Не выявлено значительных качественных отличий в тропизме и спектре вызываемых клинических форм между сибирским и дальневосточным подтипами ВКЭ. Данных, свидетельствующих в пользу нозологической самостоятельности клещевого энцефалита, этиологически связанного с сибирским подтипом возбудителя, получено не было.

5. Сибирский подтип ВКЭ в большей степени ассоциирован с хроническими формами заболевания, что подтверждается изоляцией и генотипированием штаммов от больных, а также пролонгированным течением патологического процесса у экспериментально зараженных сирийских хомяков.

6. Впервые от больных КЭ и умерших людей изолированы микст-штаммы ВКЭ, сочетающие последовательности генов Е и NS1 сибирского и дальневосточного, либо сибирского и европейского подтипов возбудителя. Показана роль микст-штаммов в этиологии различных форм КЭ.

7. Исследования, проведенные в зоне доминирования сибирского подтипа ВКЭ, показали, что на данной территории в лабораторной диагностике с целью детекции в сыворотках крови антигена ВКЭ, антител классов IgM и IgG могут применяться коммерческие тест-системы, приготовленные из штаммов дальневосточного подтипа ВКЭ.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. В.В. Погодина, В.В. Романенко, Л.С. Карань, М.С. Есюнина, A.C. Килячина, Н.М. Колясникова, Т.А. Булгакова, Е.Г. Гамова, Л.С. Левина, Г.В. Маленко, Н.Г. Бочкова, Т.А. Пименова. Структура популяции ВКЭ в Свердловской области на современном этапе и вопросы вакцинопрофилактики // Медицинская вирусология. - Т. XXIII. - Москва, 2006. - С. 110-115.

2. Г.В. Маленко, В.В. Погодина, Л.С. Карань, Н.М. Колясникова, Т.А. Булгакова, Е.Г. Гамова, Л.С. Левина, В.М. Соколов, И.Д. Шейдерова, Е.С. Минаков, А.Е. Платонов. Мониторинг популяций ВКЭ в Кемеровской области и особенности современной эпидситуации. Медицинская вирусология, т. XXIII - 2006, М. - С. 103-109.

3. В.В. Погодина, JI.C. Карань, Н.М. Колясникова, Л.С. Левина, Г.В. Маленко, Е.Г. Гамова, М.В. Лесникова, A.C. Килячина, М.С. Есюнина, Н.Г. Бочкова, Т.А. Шопенская, Т.В. Фролова, Е.И. Андаев, А.Г. Трухина. Эволюция клещевого энцефалита и проблема эволюции возбудителя // Вопр. вирусол. - 2007. - № 5. - С. 16-21.

4. Е.Г. Безрукова (Гамова), В.В. Погодина, Л.С. Левина. Характеристика "исторических" штаммов вируса клещевого энцефалита // Медицинская вирусология. - Том XXIV. - С. 23-35. - Москва, 2007.

5. Погодина В.В., Левина Л.С., Бочкова Н.Г., Маленко Г.В., Колясникова Н.М., Гамова Е.Г. Решенные и нерешенные проблемы профилактики клещевого энцефалита // Дезинфекционное дело. - 2007. - №1. - С. 4245.

6. В.В. Погодина, Л.С. Карань, Н.М. Колясникова, В.В. Романенко, Е.Г. Гамова, Л.С. Левина, Г.В. Маленко, М.В. Лесникова, М.С. Есюнина, A.C. Килячина, Н.Г. Бочкова, Т.В. Фролова, А.Е. Платонов. Изменение клещевого энцефалита и эволюция популяций возбудителя за 70-летний период // Дальневосточн. журн. инф. патологии. - №11. - 2007. -С. 103.

7. Карань Л.С., Маленко Г.В., Бочкова Н.Г., Левина Л.С., Ливанова Г.П., Колясникова Н.М., Гамова Е.Г., Трухина А.Г., Злобин В.И., Верхозина М.М., Козлова И.В., Джиоев Ю.П., Демина Т.В., Погодина В.В. Применение молекулярно-генетических методов для изучения структуры штаммов вируса клещевого энцефалита // Бюлл. СО РАМН. - Новосибирск. - №4 (126). - 2007. - С. 34-40.

8. Андаев Е.И., Трухина А.Г., Карань Л.С., Погодина В.В., Гамова Е.Г., Бочкова Н.Г., Борисова Т.И., Нагибина O.A., Вершинин Е.А., Сидорова Е.А. Клещевой энцефалит в Читинской области и этиология очаговых

форм с летальным исходом // Бюлл. СО РАМН. - Новосибирск. - №4 (126).-2007.-С. 60-65

9. Е.И. Андаев, А.Г. Трухина, Т.И. Борисова, Л.С. Карань, В.В. Погодина, Е.Г. Гамова, Н.Г. Бочкова, O.A. Нагибина, Е.А. Вершинин. Неоднородность популяции вируса клещевого энцефалита в природных очагах Читинской области // Эрдэм Шинжилгээний Бутээл, 16. - Улан-Батор, 2008.-С. 245-251.

10. Дружинина Т.А., Погодина В.В., Баранова Н.С., Хрящева Н.Э., Шалепо Е.В., Бочкова Н.Г., Карань Л.С., Безрукова Е.Г., Колясникова Н.М. Особенности эпидемиологии клещевого энцефалита в Ярославской области в эпидемический сезон 2008 года // Медицинская вирусология. - Москва, 2008. - T.XXV. - С. 65-70.

11. Безрукова (Гамова) Е.Г., Погодина В.В., Левина Л.С., Карань Л.С, Маленко Г.В. Изучение штаммов вируса клещевого энцефалита различных генотипов, выделенных от больных с хроническим течением болезни // Медицина в Кузбассе: Спецвыпуск №5-2008: Актуальные проблемы клещевых нейроинфекций. Материалы межрегиональной научно-практической конференции с международным участием. -Кемерово, 2008. - С. 21-29.

Результаты работы изложены в тезисах следующих конференций:

1. Колясникова Н.М., Карань Л.С., Левина Л.С., Гамова Е.Г., Погодина В.В. Генетическая и вирусологическая характеристика современных штаммов вируса клещевого энцефалита в Свердловской области и вопросы вакцинопрофилактики // тезисы докладов // Современные научные и прикладные аспекты клещевого энцефалита. - М., 2007. - С. 66-67.

2. Карань Л.С., Шопенская Т.А., Колясникова Н.М., Гамова Е.Г., Маленко Г.В., Левина Л.С., Бочкова Н.Г., Погодина В.В. Изучение возбудителей клещевых инфекций в сочетанных очагах в Северозападном, Приволжском, Уральском и Сибирском регионах РФ // тезисы докладов // Современные научные и прикладные аспекты клещевого энцефалита. - М., 2007. - С. 54-55.

3. Погодина В.В., Карань Л.С., Колясникова Н.М., Романенко В.В., Гамова Е.Г., Левина Л.С., Маленко Г.В., Лесникова М.В., Есютина М.С., Килячина A.C., Бочкова Н.Г., Фролова Т.В., Платонов А.Е. Изменение клещевого энцефалита и эволюция популяций возбудителя за 70-летний период // Тезисы юбилейной конференции, посвященной 70-летию открытия вируса клещевого энцефалита. - Владивосток, 2007.-№11.-С. 103.

4. Погодина В.В., Карань Л.С., Колясникова Н.М., Булгакова Т.А., Гамова Е.Г., Левина Л.С., Маленко Г.В., Пименова Т.А., Бочкова Н.Г., Платонов А.Е.. Структура популяции ВКЭ в Свердловской области в период проведения массовой вакцинопрофилактики заболевания // тезисы докладов И Вакцинология. - М., 2006. - С. 77.

Автор выражает признательность руководству ИПВЭ им.М.П.Чумакова РАМН за возможность проведения работы на уникальной научной базе в одной из старейших школ вирусологов.

Выражаю огромную благодарность моему научному руководителю доктору медицинских наук, профессору В.В. Погодиной за неоценимую помощь в проведении работы, внимание и ценные всесторонние знания.

■ Глубокую признательность за понимание и помощь выражаю ученому секретарю ИПВЭ им.М.П. Чумакова РАМН, кандидату биологических наук O.A. Медведкиной.

Особую признательность выражаю сотрудникам лаборатории клещевого энцефалита и других вирусных энцефалитов ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН: ведущим научным сотрудникам - к.б.н. Л.С. Левиной, к.б.н. Г.В. Маленко, к.м.н. Н.Г. Бочковой за помощь в обработке клинического материала, изоляции штаммов ВКЭ и проведении вирусологических исследований.

Диссертант благодарна старшим лаборантам З.Н. Румянцевой, М.П. Романовой, А.И. Филатовой, H.H. Трофимовой за высококвалифицированную научно-техническую помощь в работе и внимание.

Благодарю руководство ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора за предоставление возможности проведения молекулярно-биологических исследований на базе Научно-производственной лаборатории по разработке и производству препаратов для диагностики инфекционных заболеваний человека и животных ЦНИИЭ Роспотребнадзора РФ. За приобретенные знания и помощь в проведении работы по генотипированию ВКЭ выражаю особую благодарность научному сотруднику Л.С. Карань.

Автор премного благодарна сотрудникам ГНЦ ФГУП "ГосНИИ БП" В.Г. Помеловой и Т.А. Быченковой за помощь в проведении оригинального исследования с использованием фосфоресцентного микроанализа, а также других исследований, и информационную поддержку.

Проведению работы помогали и способствовали сотрудники практических учреждений санитарно-эпидемиологической службы и учреждений практического здравоохранения в различных регионах: по Свердловской области - В.В. Романенко, Т.А. Пименова, Л.И. Волкова, по Кемеровской области - В.М. Соколов, A.B. Семенов, Е.С. Минаков, И.Д. Шейдерова, С.А. Коробкин, A.B. Уфимцев, И.Д. Дедюхина, Л.Ф. Ламакина, C.B. Артамонова, Л.А. Зеркаль, по Вологодской области - М.В. Лесникова, по Ярославской обл. - Т.А. Дружинина. Автор выражает всем огромную благодарность за плодотворное сотрудничество.

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Безрукова, Екатерина Геннадьевна

Список условных сокращений.

Введение.

Часть I. Обзор литературы.

Глава 1. Генетическая вариабельность вируса клещевого энцефалита.

1.1. Организация и стратегия генома вируса клещевого энцефалита.

1.2. Подтипы вируса клещевого энцефалита.

1.3. Типирование (генотипирование) вируса клещевого энцефалита.

Глава 2. Многообразие клинических форм клещевого энцефалита.

2.1. Классификации клинических форм клещевого энцефалита.

2.2. Клинические особенности клещевого энцефалита в разных частях нозоареала.

2.3. Патоморфоз клещевого энцефалита.

2.4. Коммерческие тест-системы для диагностики клещевого энцефалита методом иммуноферментного анализа.

Глава 3. Клещевой энцефалит: одна болезнь или три?.

Часть II. Собственные исследования.

Глава 4. Материалы и методы.

4.1. Штаммы, клоны, изоляты РНК вируса клещевого энцефалита.

4.2. Клинический материал.

4.3. Секционный материал.

4.4. Клещи.

4.5. Экспедиции и командировки.

4.6. Заражение тканевых культур.

4.7. Титрование вируса.

4.8. Учет цитопатогенного действия.

4.9. Оценка инвазивных свойств и нейровирулентности вируса клещевого энцефалита.

4.10. Молекулярно-генетические исследования.

4.11. Иммуноферментный анализ.

4.12. Фосфоресцентный микроанализ (ФОСФАН).

4.13. Статистическая обработка результатов исследований.

Глава 5. Генотипирование штаммов, клонов и изолятов РНК вируса клещевого энцефалита, выделенных от больных и погибших пациентов.

5.1. Объем вирусологических и молекулярно-биологических исследований'.

5.2. Штаммы и изоляты РНК, выделенные при инаппарантной инфекции и острых нелетальных формах клещевого энцефалита.

5.3. Штаммы и изоляты РНК, выделенные при очаговых летальных формах клещевого энцефалита.

5.4. Штаммы, выделенные при хроническом клещевом энцефалите.

Глава 6. Микст-штаммы вируса клещевого энцефалита, изолированные от больных и погибших людей.

Глава 7. Определение эффективности*диагностикумов, изготовленных на основе штаммов дальневосточного подтипа, в зоне доминирования сибирского подтипа вируса клещевого энцефалита по материалам Кемеровской области).

7.1. Изучение современной генетической структуры природной популяции вируса клещевого,энцефалита и вирулентности штаммов (Прокопьевский район, 2008 г.).

7.2. Иммунологические исследования.'.

7.3. Нетипичные случаи энцефалита на территории^

Новосибирской и Кемеровской области в 1999 и 2008 годах.

Обсуждение.1.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль сибирского подтипа вируса клещевого энцефалита в этиологии острых и хронических форм заболевания (в сопоставлении с дальневосточным подтипом)"

Эпидемиологическая ситуация по клещевому энцефалиту (КЭ) в Российской Федерации продолжает оставаться напряженной, несмотря на 70-летнюю историю изучения этого заболевания, активную разработку мер профилактики и борьбы с ним. Так, по состоянию на 2008 год 46 из 83 субъектов федерации РФ были признаны эндемичными по КЭ частично либо полностью [118]. Более чем в половине эндемичных субъектов федерации регистрируются случаи заболевания КЭ, на некоторых территориях уровень заболеваемости превышает среднероссийский в 5-10 раз [110]. Ареал вируса клещевого энцефалита (ВКЭ), распространяющийся от берегов Тихого океана до берегов Атлантического океана постоянно расширяется [59]. Несмотря на это, на некоторых территориях эндемичных регионов недостаточно изучается зараженность клещей, особенности популяции ВКЭ, проэпидемичивание и клинические особенности КЭ.

Результаты молекулярно-эпидемиологических исследований последних лет показали циркуляцию на территории Российской Федерации (РФ) трех основных подтипов ВКЭ: дальневосточного, европейского и сибирского (урало-сибирского) [129]. В частности, изучение молекулярной эпидемиологии КЭ показало широкое распространение сибирского подтипа ВКЭ на европейской и азиатской территории России [20, 129]. Сибирский подтип ВКЭ был обнаружен на территории европейских стран - Австрии, Боснии и Герцеговины [3, 78]. Между тем, клинические особенности инфекционного процесса при заражении сибирским подтипом и его патогенный потенциал изучены недостаточно. Для регионов, где показана смена популяций ВКЭ, вытеснение дальневосточного подтипа возбудителя и абсолютное доминирование сибирского подтипа в настоящее время, описан патоморфоз заболевания с изменением структуры клинических форм [22]. Однако патоморфоз КЭ установлен также для других территорий, где смены доминирующего подтипа в популяции ВКЭ не наблюдается [84, 90]. На

Дальнем Востоке, в зоне доминирования дальневосточного подтипа ВКЭ, за последние десятилетия структура клинических форм изменилась в сторону уменьшения количества менингоэнцефалитов и радикулополиневритической формы заболевания, однако доля менингеальных форм сравнима с таковой в 1939-1962 гг. [54].

На фоне широкого внедрения методов генотипирования, в том числе в изучении КЭ, возобновилась дискуссия о единстве или множественности клещевых энцефалитов, начатая в 1944 году М.П. Чумаковым. Признавая различия клинического течения КЭ в западных и восточных частях нозоареала, М.П. Чумаков все-таки считал КЭ единой болезнью. В последние годы появилось мнение о необходимости выделения трех нозологических форм вместо одной [30]. Предлагается выделить:

1. клещевой вирусный серозный менингит (в настоящее время — КЭ, вызванный европейским подтипом вируса);

2. клещевой вирусный энцефаломиелит (КЭ, вызванный дальневосточным подтипом вируса);

3. клещевой вирусный менингоэнцефалит (КЭ, вызванный сибирским подтипом вируса).

Аргументами в пользу выделения трех отдельных нозологических единиц, по мнению авторов, являются географические, экспериментальные, генетические данные, одним из основных доводов служат различия в клинике КЭ в разных частях нозоареала. Распространено мнение, что КЭ, имеющий место в зоне доминирования европейского подтипа ВКЭ, протекает легко, без серьезных неврологических нарушений, и не имеет тенденции к хронизации. При анализе литературных данных становится понятно, что это не так [169, 173, 175, 176]. Между тем, КЭ на Дальнем Востоке, в зоне доминирования дальневосточного подтипа возбудителя, представлен не только тяжелыми формами заболевания. Н.В. Кулаковой и соавт. (2002) показано, что с дальневосточным подтипом ассоциированы не только тяжелые очаговые и летальные случаи КЭ в регионе, но весь спектр клинических форм и инаппарантная инфекция.

Дискуссия о единстве или множественности клещевых энцефалитов ведется на фоне недостатка данных в отношении сибирского подтипа ВКЭ. Приводимые авторами цифры, характеризующие клиническую картину при инфицировании сибирским подтипом ВКЭ, представлены по материалам Восточной Сибири и Приангарья [11, 12]. Однако эти данные нельзя считать убедительными. Они не могут адекватно характеризовать особенности заболевания, вызванного сибирским подтипом вируса КЭ, так как на указанных территориях отмечается циркуляция одновременно двух подтипов ВКЭ — сибирского и дальневосточного [6, 151]. Этиологическая взаимосвязь случаев заболевания и подтипа ВКЭ не установлена, так как генотипирование этиологических агентов не проводилось. Следовательно, особенности КЭ, вызванного сибирским подтипом возбудителя, нуждаются в дополнительном изучении. Также представляет интерес изучение этиологической роли дальневосточного подтипа КЭ в этиологии различных клинических форм заболевания за пределами Дальнего Востока. Особое значение имеет определение подтипической принадлежности ВКЭ - возбудителя тяжелых очаговых летальных случаев, имевших место на территории РФ в зонах сочетанной циркуляции сибирского и дальневосточного подтипов и на территориях, где доминирует сибирский подтип ВКЭ [125].

1 Цель работы

Целью наших исследований было изучение патогенного потенциала доминирующего в России сибирского подтипа вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) на клиническом материале в сопоставлении с дальневосточным подтипом с использованием вирусологических и молекулярно—биологических методов.

Основные задачи исследования

1. Формирование коллекции штаммов ВКЭ, изолированных от больных клещевым энцефалитом (КЭ) и погибших пациентов в разных регионах России и ряде зарубежных стран.

2. Ретроспективное вирусологическое исследование и генотипирование коллекционных штаммов ВКЭ, изолированных от больных КЭ и погибших людей.

3. Вирусологическое изучение и генотипирование современных штаммов ВКЭ, генотипирование изолятов РНК.

5. Изучение особенностей штаммов ВКЭ, выделенных при очаговых формах КЭ с летальным исходом.

6. Изучение особенностей штаммов ВКЭ, выделенных при хроническом КЭ.

7. Изучение микст-штаммов ВКЭ, изолированных от больных и погибших людей.

8. Изучение эффективности лабораторной диагностики КЭ в регионе доминирования сибирского подтипа (Кемеровская область) с использованием тест-систем, изготовленных на основе штаммов дальневосточного подтипа, для выявления антигена и антител 1§М и методами ИФА при помощи коммерческих тест-систем и экспериментальных иммуночиповых тест-систем ФОСФАН.

В ходе работы был проведен ряд разнообразных исследований: полевые, вирусологические, серологические, молекулярно-биологические. Коллекция штаммов для ретроспективного генотипирования была подобрана из коллекции лаборатории клещевого энцефалита и других вирусных энцефалитов ИПВЭ им. I

М.П.Чумакова РАМН, коллекции штаммов М.П. Чумакова, а также коллекции штаммов лаборатории биологии арбовирусов ИПВЭ им. М.П.Чумакова РАМН. Современные штаммы и изоляты РНК ВКЭ были изолированы от людей и из клещей в лаборатории клещевого энцефалита и других вирусных энцефалитов

ИПВЭ им. М.П.Чумакова РАМН. Изучение вирусологических свойств штаммов и подготовка к генотипированию проводились на базе ИПВЭ им. М.П.Чумакова РАМН. Работа по генотипированию штаммов изолятов РНК выполнялась на базе Научно-производственной лаборатории по разработке и производству препаратов для диагностики инфекционных заболеваний человека и животных ФГУН Центрального научно-исследовательского института Эпидемиологии (ЦНИИЭ) , Роспотребнадзора РФ под руководством JI.C. Карань. Генотипирование ВКЭ проводили тремя методами: секвенирование фрагмента или полноразмерного гена белка Е, анализ ПДРФ и ПЦР в режиме реального времени с гибридизационно-флуоресцентной детекцией с генотипспецифическими зондами.

Особенности современной популяции ВКЭ в Свердловской области были охарактеризованы в ходе изучения материала, собранного во время полевых исследований в 2006 г. при поддержке ФГУЗ Центр гигиены и эпидемиологии в Свердловской области. Была также изучена популяция возбудителя КЭ в малоизученном высокоэндемичном районе Кемеровской- области в ходе полевых исследований, проведенных в 2008 г. Сбор клещей на территории Кемеровской области осуществлялся диссертантом в ходе двух экспедиционных выездов при поддержке специалистов Филиала ФГУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии в Кемеровской области в г. Прокопьевске и Прокопьевском районе". Работа по сбору клещей проводилась под руководством энтомолога Л.Ф. Ламакиной.

Клинический материал от людей из Кемеровской области был получен диссертантом из стационаров различного профиля (ГУВПО Кемеровская областная клиническая больница при поддержке В.М. Соколова и д.м.н., проф. В.А. Семенова, МУЗ ГБ№1 г. Прокопьевска Кемеровской обл. под руководством главного врача МУЗ ГБ№1 С.А. Коробкина, МУЗ "Городская инфекционная больница" г.Прокопьевска Кемеровской области под руководством начальника по медицинской части И.Б.Дедюхиной). Клинический материал из г.Екатеринбурга был любезно предоставлен ГУЗ

СОКБ №1, г. Екатеринбург при участии Л.И.Волковой, В.В.Романенко. Секционный материал от умерших в 2008 году людей любезно предоставлен ФГУЗ Центр гигиены и эпидемиологии в Вологодской (Лесникова М.В.), Ярославской (Дружинина Т.А.) и Свердловской (Волкова Л.И., Килячина A.C.) областях. Секционный материал от умерших в 2008 году людей в Кемеровской обл. был любезно предоставлен ГУВПО Кемеровская областная клиническая больница при поддержке В.М.Соколова и д.м.н., проф. В.А.Семенова. Клиническая диагностика не входила в задачи настоящего исследования и осуществлялась врачами-неврологами и инфекционистами районных и областных лечебных учреждений.

Научная новизна

• Впервые дана характеристика патогенного потенциала сибирского подтипа ВКЭ на основе изучения и генотипирования штаммов и изолятов РНК, выделенных от больных и погибших людей с подтверждением этиологической связи с подтипом возбудителя. Доказана связь сибирского подтипа ВКЭ со всеми известными клиническими формами КЭ.

• Впервые проведено сравнительное изучение этиологической роли сибирского и дальневосточного подтипов ВКЭ. Не установлено принципиальных различий между этими подтипами по спектру вызываемых ими клинических форм.

• От лиц с тяжелыми летальными формами КЭ Вологодской, Ярославской и Свердловской областях в 2008 году и более ранние годы были выделены штаммы и изоляты сибирского подтипа ВКЭ. Отягощающими факторами при развитии очаговых летальных форм были особенности макроорганизма (старший возраст, отсутствие вакцинации, сопутствующие заболевания, антибактериальная терапия и др.), процесса заражения (множественные укусы и длительное присасывание клещей) и свойства возбудителя (высокая нейроинвазивность и вирулентность штаммов, тропизм к различным структурам ЦНС человека).

• Отмечена более выраженная связь сибирского подтипа ВКЭ с хроническими формами1 заболевания; что подтверждается при; моделировании хронического процесса в опытах на хомяках.

• Установлен: тропизм сибирского подтипа ВКЭ структурам головного и спинного1 мозга на основе исследования! локализации вирусной- РНК в клиническом материале.

• Впервые выделены микст-штаммы от больных и погибших от КЭ людей при менингеальной, менингоэнцефалитической, очаговых формах заболевания, с летальным? исходом;. а также: при ХКЭ, в? том? числе: кожевниковской эпилепсии.

Впервые на основе экспериментальных: и? клинических данных получены^ доказательства необоснованности» выделения? заболевания;, вызванного сибирским подтипом ВКЭ, в отдельную нозологическую единицу.

• ■■ Впервые генетическими методами. изучены особенности популяции:ВКЭ наг мало исследованной на современном этапе территории - Прокопьевском районе Кемеровской области. При доминировании сибирского подтипа ВКЭ установлена циркуляция? дальневосточного и его роль в этиологии заболевания.

• Показана возможность применения коммерческих и экспериментальных тест-систем ИФА. на основе дальневосточного подтипа ВКЭ для изучения антигенемии и выработки антител у» здорового населения и больных КЭ : в: условиях доминирования .сибирского подтипа возбудителя:

Практическая значимость работы

Изучение этиологическою ролшразличных- подтипов ВКЭ'имеет большое значение для клинической практики. Наша работа показывает возможность сибирского подтипа; вызывать весь спектр; клинических проявлений: заболевания^ от инаппарантной инфекции до острых летальных форм КЭ. В ходеработы было продолжено накопление материала по предмету дискуссии о единстве, или множественности: клещевого энцефалита: Данных за целесообразность выделения трех отдельных нозологических единиц вместо одной (клещевой энцефалит) получено не было.

Показано, что в зоне доминирования сибирского подтипа ВКЭ может быть эффективно проведена комплексная лабораторная диагностика заболевания при помощи коммерческих и экспериментальных и тест-систем, изготовленных на основе дальневосточного подтипа вируса.

В ходе работы диссертантом были выделены, закреплены и изучены 3 новых штамма ВКЭ.

Внедрения: в международную электронную базу данных ОепВапк (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank) были депонированы нуклеотидные последовательности полноразмерного гена белка Е 16 штаммов ВКЭ, выделенных от людей: № ¥Ш4Ш, РЛ14112, БЛИШ, РШ4133, БЛИШ, РШ4121, ¥Ш4113, РШ4114, РШ4115, РШ4116, РШ4117, РШ4118, ¥Ш4П9, РШ4134, Р.Г214137, Р.Ш4138.

Основные положения, выносимые на защиту

2. Сибирский подтип ВКЭ способен вызывать тяжелые очаговые формы КЭ с летальным исходом в различных регионах РФ (Ярославская, Вологодская, Свердловская, Челябинская, Кемеровская, Иркутская области, Красноярский край и Читинская область). Отягощающими факторами в развитии очаговых летальных форм КЭ являются особенности как макроорганизма (старший возраст, отсутствие вакцинации, сопутствующие заболевания и др.), так и процесса заражения (множественные укусы и длительное присасывание клещей), и свойства возбудителя (высокая нейроинвазивность и вирулентность штаммов, тропизм к различным структурам ЦНС человека).

3. Сибирский подтип ВКЭ в значительной степени связан с хроническими формами заболевания у людей, что подтверждается в опытах на сирийских хомяках.

4. ВКЭ сибирского подтипа,обладает тропностью к различным структурам ЦНС человека.

5. Выделение заболевания, вызванного сибирским подтипом ВКЭ, в отдельную форму, необоснованно. Это подтверждено рядом клинических и экспериментальных данных.

6. В Прокопьевском районе Кемеровской области (эндемичная по КЭ административная территория РФ) полностью доминирует сибирский подтип ВКЭ. На данной территории возможно эффективное применение коммерческих тест-систем для детекции антигена ВКЭ и антител к возбудителю, изготовленных на основе дальневосточного подтипа ВКЭ, а также использование экспериментальных иммуночиповых тест-систем "1§М-ВКЭ-ФОСФАН" и "1§0-ВКЭ-Ф0СФАН", также изготовленных на основе штаммов дальневосточного подтипа ВКЭ.

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены на Всероссийской научно-практической конференции "Вакцинология 2006. Совершенствование иммунологических средств профилактики, , диагностики и лечения инфекционных болезней" (Москва, 2006), Всероссийской научной конференции "Современные научные и прикладные аспекты клещевого энцефалита" (к 70-летию открытия вируса клещевого энцефалита) (г. Москва, 2007 г.), Межрегиональной научно-практической конференции с международным участием "Актуальные проблемы клещевых нейроинфекций" (г. Кемерово, 2008 г.), конференции молодых ученых ИПВЭ им.М.П.Чумакова РАМН (г. Москва, 2009 г.).

Публикации

По теме диссертации опубликованы 11 печатных работ, в том числе 5 - в изданиях, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и указателя литературы, состоящего из 168 работ отечественных и 65 работ зарубежных авторов. Диссертация изложена на 225 страницах машинописного текста, иллюстрирована 35 таблицами и 44 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Безрукова, Екатерина Геннадьевна

Выводы

1. Впервые изучен патогенный потенциал сибирского подтипа ВКЭ, проведено сравнение патогенности сибирского и дальневосточного подтипов вируса на клиническом материале. На основе вирусологических и молекулярно-биологических исследований 195 штаммов, клонов и изолятов РНК ВКЭ, выделенных от больных и погибших людей на территории Урала, Западной и Восточной Сибири, установлено, что сибирский подтип ВКЭ так же, как и дальневосточный, вызывает весь спектр клинических форм заболевания и разные варианты течения инфекционного процесса — от инаппарантной инфекции до очаговых форм с летальным исходом.

2. Очаговые формы КЭ с летальным исходом, этиологически связанные с сибирским подтипом вируса, зарегистрированы в европейских и азиатских регионах РФ. Очаговые формы КЭ, вызванные сибирским подтипом ВКЭ, регистрируются как в зонах абсолютного доминирования сибирского подтипа ВКЭ, так и в зонах циркуляции двух подтипов - сибирского и дальневосточного.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Безрукова, Екатерина Геннадьевна, Москва

1. Адельшин Р.В. Генетическая вариабельность вируса клещевого энцефалита на территории Европейской части Российской Федерации и некоторых стран Восточной и Юго-восточной Европы // Автореф. дис.канд.биол. наук. М., 2006. - С. 3-17.

2. Адельшин Р.В., Злобин В.И., Беликов С.И. и др. Молекулярная эпидемиология клещевого энцефалита в европейской части России и некоторых стран Балтии, Восточной и Юго-восточной Европы // Эпидемиол. и вакцинопрофилактика. 2006. - № 2. - С. 27-34.

3. Алисов Б.П. Климат СССР // М.: Изд-во МГУ, 1956. 104 с.

4. Амосов А.Д. Клещевой энцефалит. Кольцово, 2002 г.

5. Андаев Е.И., Трухина А.Г., Карань JI.C. и др. Этиология очаговых форм клещевого энцефалита с летальными исходами в Читинской области // Мед. вирусология. М., 2006. - Т. 23. - С. 75-77.

6. Богачек М.В., Протопопова Е.В., Терновой В.А. и др. Иммунохимические свойства белка РгМ и С-концевого фрагмента белка М вируса Западного Нила // Молекул, биол. 2007. - Т. 41. - С. 8-17.

7. Богачек М.В., Протопопова Е.В., Терновой В.А. и др. Иммунохимические свойства рекомбинантных полипептидов, моделирующих домены I и II белка Е вируса Западного Нила // Молекул, биол. 2005. - Т. 39. - С. 813822.

8. Большой энциклопедический словарь. 2001. - 816 с.

9. Борисевич В.Г., Леонова Г.Н. Инфекционный процесс при стертой и инаппарантной формах клещевого энцефалита // Клещевой энцефалит (к65.летию открытия). Владивосток: ГУП "Примполиграфкомбинат". -2002г.

10. Борисов В.А. Клинико-эпидемиологические и некоторые патогенетические аспекты клещевого энцефалита в Приангарье: Автореф.дис. канд.мед.наук. М., 1997. — 24 с.

11. Борисов В.А., Ющук Н.Д., Малов И.В., Аитов К.А. Особенности клещевого энцефалита в различных регионах. Эпидемиология и инфекц. Болезии. -2000.-№2.-С. 43-47.

12. Бочкова Н.Г., Жезмер В.Ю., Трухина A.F. и др. Изучение серотипа Айна/1448 вируса клещевого энцефалита // Вопр. вирусол. 1985. - №5. -С. 572-575.

13. Варгин В.В. Гетерогенность антител при флавивирусных инфекциях: Дис. . канд. мед. наук. Москва, 1971.

14. Васильев В.В., Злобин В.И., Дживанян Т.И. и др. Изучение электрофоретической подвижности вирусспецифических белков штаммов вируса клещевого энцефалита, выделенных в разных географических зонах СНГ//Вопр. вирусол.- 1993.-№ 1.-С. 11-16.

15. Верета JI.A. Принципы прогнозирования заболеваемости клещевым энцефалитом//М. 1975. - 134 с.

16. Верета Л.А., Воробьёва М.С. Природная гетерогенность и целенаправленный отбор штаммов вируса клещевого энцефалита. М., 1990.- 124 с.

17. Верета Л.А., Кантер В.М. Клещевой энцефалит в Хабаровском крае // Хабаровск, 1963. — 216 с.

18. Верхозина М.М. Молекулярно-эпидемиологическая и генетическая характеристика региональной популяции вируса клещевого энцефалита Восточной Сибири: Дис. . канд. биол. наук. Иркутск, 2000. - 124 с.

19. Верхозина М.М., Злобин В.И., Демина Т.В. и др. Генетическая вариабельность ВКЭ в Азиатской части ареала // Тезисы докладов:

20. Современные научные и прикладные аспекты клещевого энцефалита. — М., 15-16 ноября, 2007.- С. 23-24.

21. Весенне-летний энцефалит в Ленинградской области (труды врачей Волховского фронта). Управление полиграфии и издательств Леноблсовета. — 1945.

22. Волкова Л.И. Клещевой энцефалит на Среднем Урале: клинико-эпидемиологический анализ острых и хронических форм, пути оптимизации оказания специализированной медицинской помощи в эндемичном очаге // Автореф.дис. . докт.мед.наук. Екатеринбург, 2009.

23. Волкова Л.И., Образцова Р.Г. Клиническая картина острого клещевого энцефалита на Среднем Урале // Клещевой энцефалит (к 65-летию открытия). Владивосток: ГУП "Примполиграфкомбинат". - 2002 г.

24. Волкова Л.И., Романенко В.В., Есюнина М.С. Клещевой энцефалит: современное состояние проблемы. Материалы I национальной конференции с международным участием "Нейроинфекции", аннотированные доклады. 2007. - С. 20-24.

25. Волкова Л.И., Романенко В.В., Струин Н.Л. и др. Эпидемиология, этиология, клиника, диагностика, лечение и профилактика клещевогоэнцефалита . — Екатеринбург. 2004. - 72 с.

26. Воробьева М.С., Воронцова Т.В., Арумова Е.А. и др. Современное состояние проблемы клещевого энцефалита. Сообщение 1. Заболеваемость и эпидемиология // Здоровье населения и среда обитания. 2001. - №1 (94).-С. 12-17. •

27. Воробьева М.С., Расщепкина М.Н., Ладыженская И.П. Вакцины, иммуноглобулины и тест-системы для профилактики и диагностики клещевого энцефалита // Вопр. вирусологии. — 2007. № 6. - С. 30-36.

28. Воронкова Г.М., Захарычева Т.А. Состояние проблемы клещевых инфекций в Хабаровской крае // Бюлл. СО РАМН. 2007. - №4. - С. 82-88.

29. Ворошилова М.К., Жевандрова В.И., Балаян М.С. Методы лабораторной диагностики энтеровирусных инфекций. М., 1964- 152 с.

30. Вотяков В.И., Злобин В.И., Мишаева Н.П. Клещевые энцефалиты Евразии. Новосибирск, 2002. - 438 с.

31. Вотяков В.И., Протас И.И., Жданов В.М. Западный клещевой энцефалит. — Минск, 1978.-255 с.

32. Галиева Г.Ю., Попоникова Т.В., Dobler G., Hufert F. Клинико-прогностические аспекты исследования; нейроспецифической енолазы и белка NS-100 при клещевых, нейроинфекциях // Медицина в Кузбассе. -2008.-№5.-С: 39-43. .

33. Гвоздецкий H.A., Михайлов И.И. Физическая география СССР. Азиатская часть. Изд-е 3. М.: "Мысль". - 1978. - С. 387-410.

34. Гольдфарб Л.Г\ Изучение эпидемиологического процесса при клещевом энцефалите в связи с задачами профилактики// Дис. .докт.мед.наук. — Москва, 1973. С. 41-42.

35. Гольман С.В. Хронические прогредиентные- формы КЭ (по данным Куйбышевской области) / /Невропатология и психиатрия. 1941. — Т. 10, №4. - С. 36-А1

36. Гурарий P.M. Клиническая характеристика клещевого энцефалита в Приморском крае по материалам вспышки 1956 г. // Тез.докл. научной конференции по вопросам краевой патологии АМН СССР в Иркутске. -М.: 1957.-С. 22.

37. Джиоев Ю.П. Молекулярно-эпидемиологический и филогенетический анализ генетической гетерогенности популяций вируса клещевого энцефалита на азиатской территории России: Дис. . канд. биол. наук. -Иркутск, 2000. 155 с.

38. Дискуссия о природе клещевых энцефалитов на заседании редакционного совета журнала "Вопросы вируслолгии" // Вопр. вирусол., 1957. № 5. - С. 302-309.

39. Добрикова Е.Ю., Плетнев А.Г., Шаманин В.А. Обнаружение вируса клещевого энцефалита в крови людей и в индивидуальных клещах методом молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот // Вопр. вирусол. 1986. - №6. - С. 739-742.

40. Дроздов С.Г. Молочная двухволновая лихорадка в Московской области (материалы этиологического и эпидемического изучения очага). ДисС. канд. мед. наук. М.: 1956.

41. Жанков А.И: Сравнительное изучение белков флавивирусов: Автореф. диС.канд. мед. наук. М, 1983. - 24 с.

42. Жанков А.И., Жданов В.М., Ляпустин В.Н. и др. Сравнительное изучение олигопептидных карт вирусспецифических белков вирусов комплекса клещевого энцефалита // Вопр. вирусол. 1985. - №1. — С. 86-89.

43. Жданов В:М., Лашкевич В.А., Дживанян Т.И: Олигопептидное картирование вирусов комплекса клещевого энцефалита // Вопр. вирусол. -1981.- №1.-С. 20-33.

44. Живоляпина P.P. Материалы к изучению штаммов вируса клещевого энцефалита, выделенных в Иркутской области // Доклады Иркутского противочумного института.-Иркутск. -1971. В. 9. - С. 163-166.

45. Живоляпина P.P. Этиологическая структура очагов клещевого энцефалита в Иркутской области. Дис. . канд. мед. наук. -Иркутск, 1973.

46. Жукова Н.Г., Команденко Н.И:, Подоплекина Л;Е. Клещевой энцефалит в Томской: области^ (этиология, эпидемиология, клиника; диагностика; профилактика, лечение); - Томск, STT, 2002. - 256 с.

47. Жукова Н.Г., Лукашова Л.В., Добкина М.Н. Лепехин A.B. Классификация клещевого энцефалита // Актуальные проблемы клещевых нейроинфекций. Материалы^ межрегиональной научно-практической конференции с международным участием.- 2008. №5. - С. 53-58.

48. Захарычева Т.А., Воронкова Г.М. Патоморфоз клещевого: энцефалита в Хабаровском, крае при различных технологиях специфической профилактики и лечения // Дальневост.журн.инф.патол: — 2007. — №11. С. 122.

49. Зильбер Л.А. Весенний (весенне-летний) эпидемический клещевой энцефалит. Архив биол. наук. 1939. - Вып. 2. - Т. 56. - С. 9-37.

50. Зильбер Л.А., Шубладзе А.К. Louping ill в СССР (предварительное сообщение)//ЖМЭИ: -1944.-№ 12. С. 56-59.

51. Злобин В.И. Клещевой энцефалит в Российской Федерации: современное состояние проблемы и стратегия профилактики. Вопр. вирусол. 2005. -№3. - С. 26-32.

52. Злобин В.И. Эпидемиологическая обстановка и проблемы борьбы с клещевым энцефалитом в Российской Федерации. Бюллетень сибирской медицины — 2006. — Прил. 1. — С. 16-24.

53. Злобин В.И., Беликов С.И., Джиоев Ю.П. и др. Молекулярная эпидемиология клещевого энцефалита. Иркутск. - 2003. - 271 С.

54. Злобин В.И., Беликов С.И., Джиоев Ю.П. и др. Новая концепция природной генетической вариабельности вируса клещевого энцефалита // Тихоокеанский мед.журнал. — 2001. -№2. С.75-78.

55. Злобин В.И., Борисов В.А., Верхозина М.М., Малов И.В., Холмогорова Г.Н. Клещевой энцефалит в Восточной Сибири. Иркутск: РОИ ВСНЦ СО РАМН, 2002.

56. Злобин В.И., Верхозина М.М., Демина Т.В. и др. Молекулярная эпидемиология клещевого энцефалита // Вопр.вирусол. Т.52 - №6. -2007.-С. 4-13.

57. Злобин В.И., Горин О.З. Клещевой энцефалит: этиология, эпидемиология и профилактика в Сибири. Новосибирск. - 1996. - 117 с.

58. Злобин В.И., Демина Т.В., Мамаев Л.В. и др. Анализ генетической вариабельности штаммов вируса клещевого энцефалита по первичной структуре фрагмента гена белка оболочки Е // Вопр.вирусол. 2001. - № 1. -С. 13-16.

59. Злобин В.И., Дрокин Д.А., Мансуров П.Г. и др. Типирование штаммов вируса клещевого энцефалита по растворимому антигену // Вопр. вирусол., 1991, № 1, С. 24-27.

60. Иерусалимский А.П. Клещевой энцефалит. Новосибирск. - 2001. - 359 с.

61. Инструкция по применению к набору реагентов для иммуноферментного выявления антигена вируса клещевого энцефалита ВектоВКЭ антиген.

62. Инструкция по применению к набору реагентов для: иммуноферментного' выявления иммуноглобулинов класса G к вирусу клещевого энцефалита ВсктоВКЭ -IgG.

63. Инструкция по применению к набор реагентов: для иммуноферментного выявления иммуноглобулинов класса- М к вирусу клещевого энцефалита ВектоВКЭ-IgM.

64. Инструкция по применению тест-системы иммуноферментной для выявления антигена вируса клещевого энцефалита ФГ'УП НПО "Микроген".

65. Инфекционные заболевания в России-. Статистический справочник. М., 1992.-С. 45-47.

66. Килячина A.C. Изучение эффективности массовой вакцинации: населения против клещевого энцефалита вакцинами III поколения (по материалам Свердловской области): Дис. . канд.мед.наук. Москва: — 2008.

67. Козлова И.В. Молекулярная эпидемиология и антигенная характеристика урало-сибирского подтипа вируса клещевого энцефалита: Дис. . канд. биол. наук. Иркутск, 2000.

68. Колясникова Н.М. Мониторинг структуры популяций вируса клещевого энцефалита в уральском, западносибирском и северо-западном регионах россии (вирусологические и молекулярно-биологические исследования): Дис. . канд. мед. наук. Москва, 2008.

69. Короткое Ю.С. Основные закономерности восстановления популяции таежного клеща в очагах клещевого энцефалита Кемеровской области, обработанных акарицидами // Автореф. диС. . канд. биол. наук. М, 1977.-22 с.

70. Краминская H.H., Живоляпина P.P., Мейерова P.A. Опыт вирусологического изучения гиперкинетических форм клещевого энцефалита с прогредиентным течением // Актуальные проблемы вирусологии и профилактики вирусных заболеваний. М., 1972. — С. 224225.

71. Краминская H.H., Живоляпина P.P., Мейерова P.A., Перевозников В.А. Своеобразный штамм вируса клещевого энцефалита, выделенный от больного с прогредиентной формой заболевания // Актуальные проблемы вирусных инфекций. — М., 1965. С. 190-191.

72. Кричевская Р.Я. Клиника прогрессивных форм клещевого энцефалита. В кн.: Весенне-летний энцефалит в Ленинградской области (труды врачей Волховского фронта). Управление полиграфии и издательств Леноблсовета. 1945. - С. 209-216.'

73. Крылов Г.В., Крылов А.Г. Леса Западной Сибири // Леса СССР. Леса СССР. -М., 1969.

74. Кулакова Н.В., Беликов С.И., Леонова Г.Н., Борисевич В.Г. Определение штаммов вируса клещевого энцефалита, выделенных от больных людей с различной степенью тяжести инфекции на территории юга Дальнего

75. Востока России // Клещевой энцефалит (к 65-летию открытия). — Владивосток: ГУП "Примполиграфкомбинат". 2002 г.

76. Левкович E.H., Погодина В.В., Засухина Г.Д., Карпович Л.Г. Вирусы комплекса клещевого энцефалита. М.: Медицина, Ленинградское отделение. — 1987.

77. Леонова Г.Н. Клещевой энцефалит в Приморском крае. Владивосток, 1997.

78. Леонова Г.Н., Беликов С.И., Борисевич В.Г., Кожемяко В.Б. Новые перспективы в изучении1 клещевого энцефалита // Тихоокеанский мед.журнал. 2001. - т.7. - №2. - С. 95-98.

79. Леонова Г.Н., Беликов С.И., Джиоев.Ю.П. и др. Филогенетический анализ штаммов, вызвавших клещевой энцефалит в Приморском крае с различной тяжестью течения // Эпидемиология и инфекц.болезни. 2002. - №1. - С. 53-56.

80. Леонова Т.Н., Кожемяко В.Б., Исаева М.П., Майстровская О.С. Молекулярная характеристика популяции вируса клещевого энцефалита Южно-Сихотэ-Алинского очагового региона // Вопр. вирусол. 1996. -№4.-С. 154-158.

81. Леонова Г.Н., Майстровская О.С. Вирусемия у больных клещевым энцефалитом и у лиц с присасыванием иксодовых клещей // Вопр. вирусол. 1996. - №5. - С. 224-228.

82. Леонова Г.Н., Павленко Е.В., Крылова Н.В. Вакцинопрофилактика клещевого энцефалита. — Владивосток. 2006. - С. 5-8.

83. Леонова Г.Н., Майстровская Г.С., Борисевич В.Б. Антигенемия у людей, инфицированных вирусом клещевого энцефалита // Вопр.вирусол. 2000. -№4.-С. 28-33.

84. Лесникова М.В., Лесников И.Р., Филоненко И.В. и др. Особенности клещевого энцефалита на территории Вологодской области // Мед.вирусология. М., 2007. - T. XXIV. - С. 53-58.

85. Локтев В.Б., Терновой В.А., Нетесов C.B. Молекулярно-генетическая характеристика вируса клещевого энцефалита // Вопр. вирусол. — 2007. — № 5.-С. 10-16.

86. Львов Д.К. Иммунопрофилактика клещевого энцефалита: Дис. . докт. мед.наук. М., 1965.

87. Магазаник С.С. Клиника клещевого энцефалита в Свердловской области и лечение физическими факторами остаточных явлений // Дис. . докт.мед.наук. Свердловск, 1962.

88. Маленко Г.В., Погодина В.В., Карань Л.С. и др. Мониторинг популяций вируса клещевого энцефалита в Кемеровской области и особенности современной эпидситуации // Мед.вирусология. М., 2006. - Т. 23. - С. 103-109.

89. Медицинская вирусология: Руководство / Под ред. Д.К. Львова. М.: ООО "Медицинское информационное агентство", 2008. - 656 с.

90. Мейерова P.A. Хронические формы клещевого энцефалита в Приангарье. -Иркутск: Изд-во Иркут. ун-та, 1992. 232 С.

91. Мельников С.А. Клиника клещевого энцефалита, по материалам войскового района. В кн.: Весеннее-летний энцефалит в Ленинградскойобласти (труды врачей Волховского фронта). Управление полиграфии и издательств Леноблсовета. — 1945. С. 94—125.

92. Методические указания главного санитарного врача РФ от 05.10.2003 № МУ 3.1.1760-03 "Организация и проведение серологического мониторинга состояния коллективного иммунитета против управляемых инфекций ".

93. Мищенко В.А., Толокнов A.C., Новожилова Е.В. // Инфекционная иммунол. 1994. - №6. - С. 33-35.

94. Монастырская Г.С., Костина М.Б., Филюкова О.Б. и др. Активация гена RIG-I, кодирующего DexH/D-белок, при инфекции клеток RH вирусом клещевого энцефалита // Биоорган, химия. 2004. - Т. 30. - С. 146-150.

95. Окулова Н.М. Биологические взаимосвязи в лесных экосистемах (на примере природных очагов клещевого энцефалита) // М.: Наука, 1986.

96. Онищенко Г.Г. Современное состояние клещевого энцефалита в Российской Федерации // К 70-летию открытия вируса клещевого энцефалита: Расширенное заседание ученого совета ГУ ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН. М., 11-12 октября, 2007.

97. Павленко Е.В., Леонова Г.Н., Яковлев А.Я., Борисевич В.Г. Анализ заболеваемости клещевым энцефалитом в Приморском крае за период 1990-2000 годы // Клещевой энцефалит. Владивосток, 2002. - С. 15-25.

98. Пан Цзе-фан. Сравнительное изучение патогенеза и патоморфологии двухволнового менингоэнцефалита и двухволновой молочной лихорадки // Нейроинфекции. Вып. IV. - М.: 1960. - С. 57-61.

99. Панов А.Г. Клиника весенне-летних энцефалитов // Невропат, и псих. — 1938.-7.-6.-С. 18-32.

100. Панов А.Г. Клиника и течение весенне-летнего клещевого энцефалита во вновь возникших очагах его в восточных и западных районах Союза. -Невропатол. и психиатр. 1951. — Т. 20. - В. 2. - С. 29-36.

101. Письмо Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека от 15 января 2007 г. № 0100/24607-32 "О перечне эндемичных территорий по клещевому вирусному энцефалиту в 2006 году".

102. Письмо Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека от 27 февраля 2008 г. № 01/152068-32 "О перечне территорий, эндемичных по клещевому вирусному энцефалиту в 2007 году".

103. Письмо Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека от 13 января 2009 г. № 01/176-9-32 "О перечне эндемичных территорий по клещевому вирусному энцефалиту в 2008 году".

104. Платонов Н.В. Эпидемиология клещевого весеннее-летнего энцефалита в Новосибирской и Кемеровской областях // Объединенный сборник работкафедр нервных болезней и психиатрии. Новосибирск, 1945. — 23. — С. 3' 37.

105. Плетнев А.Г. Структура, организация и детекция генома вируса клещевого энцефалита: Дис. . д-ра хим.наук. -М.,1990. 304 с.

106. Плетнев А.Г., Ямщиков В.Ф., Блинов В.М. Нуклеотидная последовательность генома и полная аминокислотная последовательность полипротеина вируса клещевого энцефалита // Биоорганич.химия. 1989. -Т. 15.- № 11.-С. 1504—1521.

107. Погодина В.В. Мониторинг популяций вируса клещевого энцефалита и этиологической структуры заболеваемости за 60-летний период // Вопр. вирусол. 2005. — №3. — С. 7-13.

108. Погодина В.В. Алиментарное заражение клещевым энцефалитом (эпидемиологические и- экспериментальные обоснования). Дис.канд. мед. наук. -М., 1956.

109. Погодина В.В. Вирусы антигенного комплекса клещевого энцефалита. Дис. докт.мед.наук.-М., 1966.

110. Погодина В.В., Безрукова Е.Г., Левина Л.С., Карань Л.С., Колясниковаs Н.М., Андаев Е.И., Трухина А.Г., Бочкова Н.Г., Герасимов С.Г., Маленко

111. Погодина В.В., Бочкова Н.Г., Дживанян Т.И. и др. Явление антигенной дефектности у циркулирующих в природе штаммов вируса клещевого энцефалита и его возможная связь с серонегативными формами заболевания // Вопр.вирусол. 1992. - № 2. - С. 103-107.

112. Погодина В.В., Бочкова Н.Г., Злобин В.И. и др. Генетическая характеристика серотипа Вергина вируса клещевого энцефалита и особенности его патогенности // Вопр.вирусол. 1993.-№ 4 - С. 158-163.

113. Погодина В.В., Бочкова Н.Г., Карань JI.C. и др. Сравнительный анализ вирулентности сибирского и дальневосточного подтипов вируса клещевого энцефалита на основе экспериментальных и клинических данных // Вопр. вирусол. 2004. - №6. - С. 24-30.

114. Погодина В.В., Бочкова Н.Г., Карань JI.C. и др. Сибирский и дальневосточный подтипы вируса клещевого энцефалита в европейских и азиатских регионах России: генетическая и антигенная характеристика штаммов // Вопр.вирусол. 2004. - №4. - С. 20-25.

115. Погодина В.В., Бочкова Н.Г., Корешкова Г.В. Свойства штаммов серотипа Айна/1448 вируса клещевого энцефалита. Вопр. вирусол. - 1981. - № 6. -С.741-745.

116. Погодина В.В., Бочкова Н.Г., Левина JI.C. и др. Иммунологические и некоторые этиологические аспекты изучения серотипа Айна/1448 вируса КЭ // Вопр. вирусол. 1981. - № 6. - С. 735-741.

117. Погодина В.В., Карань Л.С., Колясникова Н.М., Левина Л.С., Маленко Г.В., Гамова Е.Г., Лесникова М.В., Килячина A.C. и др. Эволюция клещевого энцефалита и проблема эволюции возбудителя // Вопр.вирусол. 2007. -Т5.- С. 16-21.

118. Погодина В.В., Трухина А.Г., Шаманин В.А. и др. Дезоксиолигонуклеотидные зонды, дифференцирующие антигенные и патогенетические варианты вируса клещевого энцефалита // Вопр.вирусол. 1992. -№ 1.-С. 53-56.

119. Погодина В.В., Фролова М.П., Ерман Б.А. Хронический клещевой энцефалит. Этиология, иммунология, патогенез. Новосибирск: Наука, 1986.

120. Практикум по общей вирусологии: Учеб. пособие / Под ред. И.Г. Атабекова. 2-е изд., перераб. и доп. — М.: Изд-во МГУ. - 2002. - 184 с.

121. Романенко В.В., Есюнина М.С, Килячина А. С. Опыт реализации массовой иммунизации населения против клещевого энцефалита в Свердловской области // Вопр. вирусол. М., 2007. - № 6. - С. 22-25.

122. Рязанцева Н.В., Новицкий В.В., Зима А.П. и др. Нарушения продукции цитокинов мононуклеарами периферической крови при персистенции вируса клещевого энцефалита // Журнал неврологии и психиатрии им. С. С. Корсакова. 2006. - Т. 106. - №12 . - С. 57-62. .

123. Самаров М.Н., Воробьева H.H., Мерзлова Н.Б. Микст-инфекции, передающиеся иксодовыми клещами, у детей Пермского края // Медицина в Кузбассе. 2008. - № 5. - С. 137-139.

124. Санитарные правила "О порядке учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I IV групп патогенности" от 28 августа 1995 г. № 14.

125. Сарманова Е.С. Клещевой энцефалит (этиология, иммунология, лабораторная диагностика, клинико-эпидемиологические особенности ипрофилактика по материалам Кемеровской области) // Дис. . .докт.мед.наук. — М., 1968.-441 с.

126. Сафронов П.В., Нетесов C.B., Микрюкова Т.П. и др. Нуклеотидная последовательность генов и полная аминокислотная последовательность белков вируса клещевого энцефалита штамма 205 // Молек. генетика, микробиол. и вирусол. 1991. — № 4. — С. 23-29.

127. Семенова В.Н. К эпидемиологии клещевого энцефалита в Свердловской области // Тез.докл. межобластной научно-практич. конф. по заболеваниям с природной очаговостью. Красноярск, 1957. - С. 100-102.

128. Смородинцев A.A., Дробышевская А.И., Ильенко В.И., Алексеев Б.П., Чуланова В.П., Федорчук JI.B. Этиологии и эпидемиология новой нейровирусной инфекции двухволнового вирусного менингоэнцефалита. В кн.: Нейровирусные инфекции. Медгиз, 1954, С. 6-34.

129. Смородинцев A.A., Дубов A.B. Клещевой энцефалит и его вакцтнопрофилактика. JL, 1986.-С. 155-169.

130. Созанский В.Е. Заболеваемость клещевым энцефалитом в Красночикойском районе // Сб.статей, посвящ.бО-летию ЦГСЭН в Читинской области. Чита, 2000. - С. 95-97.

131. Соколов В.М., Минаков Е.С., Субботин A.B., Дроздова О.М. Влияние различных мер профилактики на эпидемиологическую ситуацию в разные периоды борьбы с клещевым энцефалитом в Кемеровской области // Медицина в Кузбассе. 2008. - № 5. - С. 143-144.

132. Субботин A.B. Этапы изучения клещевых нейроинфекций в Кемеровской области // Медицина в Кузбассе. 2008. - № 5. - С. 3-5.

133. Трухина А.Г. Особенности популяции возбудителя клещевого энцефалита в зоне распространения двух серотипов вируса на территории Прибайкалья: ДиС. . канд.мед.наук. Иркутск. - 1989. - 176 с.

134. Федотова С.И., Агапова H.H., Лапа П.П. и др. Лабораторная диагностика клещевого энцефалита в Читинской области с 1990 по 1999 гг. // Сб.статей, посвящ.бО-летию ЦГСЭН в Читинской области. Чита, 2000. - С. 124-125.

135. Фролова Т.В. Патогенез персистентной инфекции и активация вируса клещевого энцефалита, длительно персистирующего в организме сирийских хомячков: Автореф.дисс.канд.мед.наук. -М., 1984.

136. Чумаков М.П. Клещевой энцефалит человека. Дис. . докт. мед. наук. М., 1944.

137. Чумаков М.П. О классификации и номенклатуре вирусов в антигенной подгруппе клещевого энцефалита. Вопр. вирусол. - 1965. - №3. - С. 376379.

138. Чумаков М.П., Горчаковская Н.Н., Найдич Г.Н. и др. Возможность ликвидации заболеваемости клещевым энцефалитом путем истребления переносчика стойким акарицидом. // Эндемичные вирусные инфекции. -М., 1968.-№12.-229 с.

139. Чумаков М.П., Кусов Ю.Ю., Рубин С.Г. и др. Клонирование и изучение первичной структуры ДНК-копий участков генома вируса клещевого энцефалита // Биоорганич.химия. 1983. - Т. 9. - №2. - С. 276-279.

140. Чумаков М.П., Рубин С.Г., Линев М.Б. Три активных типа вируса клещевого энцефалита, их зависимость от основных видов клещей-переносчиков и географическое распространение. В кн.: Вопросы медицинской вирусологии. — М., 1975. - С. 371—372.

141. Шаповал А.Н. Клещевой энцефаломиелит. Л.: Медицина, 1980.-256 с.

142. Шаповал А.Н. Хронические формы клещевого энцефалита. — Л.: Медицина, 1976. 176 с.

143. Шефер Д.Г. Клиника и течение весенне-летнего (клещевого) энцефалита на Урале // Свердловск. 1948. - Т.2. - С. 11-48.

144. Шубин Н.В. Клещевой энцефалит. Биология вируса, клеща, клиника, лечение, профилактика. Изд. 2е. — Томск: Изд-во Томского ун-та, 1974. -144 с.

145. Aendekerk RP, Schrivers AN, Koehler PJ. Tick-borne encephalitis complicated by a polio-like syndrome following a holiday in central Europe // Clin. Neurol. Neurosurg. 1996. - Aug; № 98(3). - P. 262-264.

146. Allison S.L., Schalich J., Stiasny K. et al. Mutational evidence for an internal fusion peptide in flavivirus envelope protein E // J. Virol. 2001. - Vol. 75. - P. 4268-4275.

147. Boom R., Sol C.J., Heijtink R., Wertheim-van Dillen P.M., van der Noordaa J. Rapid purification of hepatitis B virus DNA from serum // J Clin Microbiol. — 1991.-Vol. 29 (9).-P. 1804-1811.

148. Brauchli YB, Gittermann M, Michot M, Krâhenbuhl S, Gnehm HE. A fatal tick bite occurring during the course of tick-borne encephalitis vaccination // Pediatr Infect Dis J. 2008. - Feb 27. - Epub ahead of print.

149. Brinton M.A., Dispoto J.H. Sequence and secondary structure analysis of 5'-terminal region of flavivirus genome RNA // Virology. 1998. - vol. 153. - P. 290-299.

150. Caruso G. TBE (Tick-borne encephalitis) in Italy // Selected abstracts from Proceedings of the VII International Potsdam Symposium on Tick-Borne Diseases (IPS VII). Berlin, Germany. - 13-14 March, 2003.

151. Casals J, Brown L., Hemmagglutination on with anthropoid borne viruses // J. Exper. Medicine. 1954. - Vol. 99. - P. 429.

152. Casati S., Gern L., Pifaretti J.C. Diversity of the population of Tick-borne encephalitis virus infecting Ixodes ricinus ticks in an endemic area of central Switzerland (Canton Bern) // J.Gen.Virol. 2006. - Vol. 87.- P. 2235-2241.

153. Chambers T.J., Hahn C.S., Galler R., Rice C.M. Flavivirus genome organization, expression, and replication // Annu. Rev. Microbiol. 1990. - Vol. 44. — P. 649668.

154. Christmann D, Staub-Schmidt T. Tick-borne encephalitis in Central and Eastern Europe // Presse Med. 1996. - Mar. - № 25(8). - P. 420^123.

155. David M Knipe, Peter M Howley. Fundamental Virology, 2001.

156. Ecker, M, Allison, S., Meixner, T, Heinz, F. Sequence analysis and genetic classification of tick-borne encephalitis viruses from Europe and Asia // J. Gen. Virol.-1999.-№80.-P. 179-185.

157. Flamand M., Megret F., Mathieu M. et al. Denge virus type 1 nonstructural glycoprotein NS1 is secreted from mammalian cells as a soluble hexamer in a glycosylation-dependent fashion // J. Virol. 1999. -Vol.73.- P.6104-6110.

158. Gorbalenya A.E., Donchenko A.P., Koonin E.V., Blinov V.M. N-terminal domains of putative helicases of flavi- and pestiviruses may be serine proteases // Nucl. Asids Res. 1989. - Vol. 17. - P. 3889-3897.

159. Gritsun T.S., Frolova T.V., Zhankov A.I. et al. Characterization of a Siberian virus isolated from patient with progressive chronic tick-borne encephalitis // J. Virol. 2003. - Vol. 77. - P. 25-36.

160. Hall R.A., Khromykh A.A., Mackenzie J.M. et al. Loss of dimerisation of the nonstructural protein NS1 of Kunjin virus delays viral replication and reduces virulence in mice, but still allows secretion of NS1 // Virology. 1999. - Vol. 264.-P. 66-75.

161. Hayasaka D., Ivanov L., Leonova G.N. et al. Distribution and characterization of tick-borne encephalitis viruses from Siberia and Far-Eastern Asia // J. Gen. Virol.-2001.-Vol. 82.-P. 1319-1328.

162. Hayasaka D., Suzuki Y., Karima H. et al. Phylogenetic and virulence analysis oftick-borne encephalitis viruses from Japan and Far-Eastern Russia // J. of Gen. Virol. 1999. -№80. - P. 3127-3135.

163. Heinz F.X., Berger M., Tuma W., Kunz Ch. A topological and functional model of epitopes on the structural glycoprotein of tick-borne encephalitis virus defined by monoclonal antibodies // Virology. 1983. - Vol. 126. - P. 525-537.

164. Heinz F.X., Kunz Ch. Homogenity of the structural glycoprotein from European isolates of tick-borne encephalitis virus: comparison with other flaviviruses // J. Gen. Virol. 1981. - Vol. 57. - P. 263-274.

165. Heinz F.X., Kunz Ch. Molecular epidemiology of tick-borne encephalitis virus: peptide mapping of large nonstructural protein of European isolates comparison with other flaviviruses // J. Gen. Virol. 1982. - Vol. 62. - P. 271-283.

166. Heinz F.X., Mandl C.W. The molecular biology of tick-borne encephalitis virus // APMIC. 1993. - Vol. 101. - P. 735-745.

167. Heinz F.X., Tuma W., Kunz Ch. Antigenic and immunogenic properties of defined physical forms of Tick-Borne Encephalitis virus structural proteins // Infect, and immun. 1981. - Vol. 33. - № 2. - P. 250-257.

168. Hoglund M., Vene S., Forsgren M. et al. Characterization of human tick-borne encephalitis virus from Sweden II J. Med. Virol. 2003. - Vol. 71. - P. 610621.

169. Holzmann H., Mandl C.W., Guirakhoo F. et al. Molecular epidemiology of tickborne encephalitis (TBE) virus // 2nd Intern. Symposium on Tick-Borne Encephalitis, 6-7 June, 1991. Baden near Vienna, Austria, 1991. - P.66.

170. Jaaskelainen A.E., Tikkakoski T., Uzcategui N.Y. et al. Siberian subtype tickborne encephalitis virus, Finland // Emerg. Infect. Dis. 2006. - Vol. 12. - P. 1568-1571.

171. Khromikh A. A., Westaway E.G. Subgenomic replicons of the flavivirus Kunjin: Construction and applications // J.Virol. 1997. - Vol. 71. - P. 1497-1505.

172. Kleppe K, Ohtsuka E, Kleppe R, Molineux I, Khorana H.G. Studies on polynucleotides. XCVI. Repair replications of short synthetic DNA's as catalyzed by DNA polymerases // J. Mol. Biol. 1971. - Vol. 56 (2). - P. 341361.

173. Koonin E.V. Computer-assisted "identification of a putative methyltransferase domain in NS5 protein of flaviviruses and lambda 2 protein of reovirus // J. Gen. Virol. 1993. - Vol. 74. - P. 733-740.

174. Lin Y.L., Chen L.K., Liao C.L. et al. DNA immunization with Japanese encephalitis virus nonstructural protein NS1 elicits protective immunity in mice // J. Virol. 1998. - Vol. 72. - P. 191-200. ,

175. Mackenzie J.M., Khromykh A.A., Jones M.K., Westaway E.G. Subcellular localization and some biochemical properties of the flavivirus Kunjin nonostructural proteins NS2A and NS4A // Virology. 1998. - Vol. 245. - P. 203-215.

176. Mandl C.W., Guirakhoo F., Holzmann H. Rt al. Antigenic structure of the flavivirus envelope protein E at the molecular level, using tick-borne encephalitis virus as a model // J. Virol. 1989. - Vol. 63, №2. - P. 564-571.

177. Mandl C.W., Heinz F.X., Stocke E., Kunz Ch. Genome sequence of tick-borne encephalitis virus (western subtype) and comparative analysis of nonstructural proteins with other flaviviruses // Virology. 1989. - Vol. 173, P. 291-301.

178. Markoff L., Falgout B., Chang A.A. Conserved internal hydrophobic domain mediates the stable membrane integration of the dengue virus capsid protein // Virology -1997.-Vol. 233.-P. 105-117.

179. Nowak T., Wenger G. Analysis of disulfides present in the membrane proteins of West Nile flavivirus // Virology. 1987. - Vol. 156. - P. 127-137.

180. Ormaasen V, Brantsaeter AB, Moen EW. Tick-borne encephalitis in Norway // Tidsskr Nor Laegeforen. 2001. - № 121.-P. 807-809.

181. Péter A. Csângô, Ellef Blakstad, Georges C. Kirtz, Judith E. Pedersen, Brigitte Czettel. Tick-borne Encephalitis in Southern Norway //.Emerging Infectious Diseases. 2004. - Vol. 10. - № 3. - P. 533-534.

182. Pletnev A.G., Yamshchikov V.F., Blinov V.M. Nucleotide sequence of the genome and complete amino sequence of the polyprotein of tick-borne encephalitis virus // Virology. 1990. - Vol. 174. - P. 250-263.

183. Reddy V.B., Thimmappaya B., Dhar R., Subramanian K.N., Zain B.S., Pan J., Ghosh P.K., Celma M.L., Weissman S.M. The genome of simian virus 40 // Science. 1978. - 200(4341). - P. 494-502.

184. Reed L.J., Muench H.A. A simple method of estimating fifty percent endpoints // Amer. J. Hyg. 1938. - No. 27. - P. 493-497.

185. Rey F.A., Heinz F.X., Mandl C. et al. The envelope glycoprotein from tickborne encephalitis virus at 2 A resolution // Nature. 1995. -Vol. 375. - P. 291298.

186. Roehrig J.T. Antigenic structure of flavivirus proteins // Adv. Virus Res. 2003. -Vol. 59.-P. 141-175.

187. Rubin S.G., Chumakov M.P. New data on the antigenic types of tick-borne encephalitis (TBE) virus. In: Arboviruses in the Mediterranean countries. Stuttgart - New York. - 1980. - P. 231 - 236.

188. Shamanin V.A., Pletnev A.G., Rubin S.G., Zlobin V.l. Differentiation of strains of tick-borne encephalitis virus by means of RNA-DNA hybridization // J. Gen. Virol. 1990.-Vol. 71. - P. 1505-1515.

189. Skarpaas T., Golovljova I., Vene S. et al. Tick-borne encephalitis virus, Norway and Denmark // Emerging Infectious Diseases 2006. - Vol. 12. - P. 411-415.

190. Susanne Fauser, Oliver Stich, Sebastian Rauer. Unusual case of tick borne encephalitis with isolated myeloradiculitis // Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 2007. - № 78. - P. 909-910.

191. Süss J. Epidemiology and ecology of TBE relevant to the production of effective vaccines // Vaccine. 2003;21. - P. 19-35.

192. Süss J, Klaus C, Diller R, Schräder C, Wohanka N, Abel U. TBE incidence versus virus prevalence and increased prevalence of the TBE virus in Ixodes ricinus removed from humans // Int. J. Med. Microbiol. 2006; 296. - P. 63-68.

193. Suss J., Schräder C., Abel U. et al. Characterization of tick-borne encephalitis (TBE) foci in Germany and Latvia (1997-2000) // Int. J. Med. Microbiol. -2002. Suppl. 33. - P. 22-29.

194. Ternovoy V.A., Kurzhukov G.P., Sokolov Y.V. et al. Tick-borne encephalitis with hemorrhagic syndrome, Novosibirsk Region, Russia, 1999 // Emerging Infectious Diseases 2003. - Vol. 9. - P. 743-746.

195. Wallner G., Mandl C.W., Kunz C. and Heinz F.X. The Flavivirus 3'-Noncoding Region: Extensive Size Heterogeneity Independent of Evolutionary

196. Relationships among Strains of Tick-Borne Encephalitis Virus // Virol. V. 213. -1.1. — P. 169-178.

197. Weidmann M., Schmidt P., Hufert F.T. et al. Tick-borne encephalitis virus in Clethrionomys glareolus in the Czech Republic // Vector Borne Zoonotic Dis. -2006.-Vol. 6.-P. 379-381.

198. Westawey E.G., Khromykh A.A., Kenney M.T. et al. Proteins C and NS4B of the flavivirus Kunjin translocate independently into the nucleus // Virology. -1997.-Vol. 234. -P. 31-41.

199. Wu J., Bera A.K., Kuhn R.J., Smith J.L. Structure of the flavivirus helicase: Implications for catalytic activity, protein interactions, and proteolytic processing // J. Virol. 2005. - Vol. 79. - P. 10268-10277.

200. Yamshikov V.F., Companc R.W. Regulation of the late events in flavivirus protein processing and maturation // Virology. 1993. - Vol. 192 - P. 38-51.

201. Yoshii K, Goto A, Kawakami K, Kariwa H, Takashima I. Construction and application of chimeric virus-like particles of tick-borne encephalitis virus and mosquito-borne Japanese encephalitis virus // J Gen Virol. 2008. - Jan, 89. -P. 200-211.a

Информация о работе

Безрукова, Екатерина Геннадьевна
кандидата медицинских наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.06

Диссертация

Роль сибирского подтипа вируса клещевого энцефалита в этиологии острых и хронических форм заболевания (в сопоставлении с дальневосточным подтипом) - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы