Особенности экспериментальной инфекции, вызванной вариантами вируса клещевого энцефалита с высокой и низкой нейроинвазивностью

Кондратьева, Ярослава Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Особенности экспериментальной инфекции, вызванной вариантами вируса клещевого энцефалита с высокой и низкой нейроинвазивностью
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Особенности экспериментальной инфекции, вызванной вариантами вируса клещевого энцефалита с высокой и низкой нейроинвазивностью"

ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ИНСТИТУТ ПОЛИОМИЕЛИТА И ВИРУСНЫХ ЭНЦЕФАЛИТОВ ИМ. МЛ. ЧУМАКОВА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УНИТАРНОЕ ПРЕДПРИЯТИЕ «ПРЕДПРИЯТИЕ ПО ПРОИЗВОДСТВУ БАКТЕРИЙНЫХ И ВИРУСНЫХ ПРЕПАРАТОВ ИНСТИТУТА ПОЛИОМИЕЛИТА И ВИРУСНЫХ ЭНЦЕФАЛИТОВ ИМ. МЛ ЧУМАКОВА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК»

на правах рукописи

Кондратьева Ярослава Юрьевна

Особенности экспериментальной инфекции, вызванной вариантами вируса клещевого энцефалита с высокой и низкой нейроинвазивностью

03.00.06 - вирусология

автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

МОСКВА-2005

ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ИНСТИТУТ ПОЛИОМИЕЛИТА И ВИРУСНЫХ ЭНЦЕФАЛИТОВ ИМ. М.П. ЧУМАКОВА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УНИТАРНОЕ ПРЕДПРИЯТИЕ «.ПРЕДПРИЯТИЕ ПО ПРОИЗВОДСТВУ БАКТЕРИЙНЫХ И ВИРУСНЫХ ПРЕПАРАТОВ ИНСТИТУТА ПОЛИОМИЕЛИТА И ВИРУСНЫХ ЭНЦЕФАЛИТОВ ИМ. М.П. ЧУМАКОВА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК»

на правах рукописи

Кондратьева Ярослава Юрьевна

Особенности экспериментальной инфекции, вызванной вариантами вируса клещевого энцефалита с высокой и низкой нейроинвазивностыо

03.00.06 - вирусология

автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Работа выполнена в ГУ Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов

им. М.П.Чумакова РАМН и ФГУП «Предприятие по производству бактерийных и вирусных препаратов Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П.Чумакова РАМН»

Научные руководители: кандидат биологических наук

Карганова Галина Григорьевна, доктор медицинских наук Тимофеев Андрей Викторович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук

профессор Воробьева Мая Сергеевна, кандидат биологических наук Ворович Михаил Фридрихович

Ведущая организация: ГУ Научно-исследовательский Институт

вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН

Защита состоится 2005 года в

У& ^ часов на заседании диссертационного совета Д.001.026.01 при Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П.Чумакова РАМН по адресу: 142782, Московская область, п/о Институт полиомиелита.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П.Чумакова РАМН.

Автореферат разослан 3 ytUfjZ_2005 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук Медведкина О. А.

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ |

ВМММТЕКА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ. Актуальность проблемы. Клещевой энцефалит (КЭ) - природно-очаговое заболевание, широко распространенное на территории Европы, Западной и Восточной Сибири, а также на Дальнем Востоке. В эндемичных регионах ежегодно регистрируется от 5 до 100 случаев КЭ на 100000 населения. Тем не менее, одной из основных форм проявления инфекционного процесса при КЭ (до 95%) является инаппарантная. Клинически она не диагностируется. Факты изоляции штаммов вируса КЭ (ВКЭ) от людей без клинических проявлений заболевания, но отмечавших присасывание клещей, являются прямым доказательством частой инфицированное™ лиц ВКЭ.

Таким образом, вирусологические и клинические наблюдения показывают, что инфицирование человека ВКЭ может иметь разные последствия - от инаппарантной формы инфекции до очаговых форм с летальным исходом. Исход и тяжесть заболевания определяются как свойствами вируса, так и свойствами макроорганизма.

Основной биологической характеристикой ВКЭ, определяющей течение и исход болезни, является способность вируса преодолевать гематоэнцефалический барьер и проникать в центральную нервную систему (ЦПС) - нейроинвазивность. Свойства вируса, определяющие его активность при периферическом попадании в организм млекопитающих, изучены недостаточно.

Достижения современной науки позволяют по-новому взглянуть на патогенез вирусных инфекций, в котором одно из ведущих мест занимают иммунологические процессы. Механизмы развития инфекционного процесса в совокупности с данными о формировании иммунного ответа при КЭ до сих пор не исследованы. Поэтому одной из важных задач медицинской вирусологии является изучение особенностей взаимодействия штаммов ВКЭ с разным уровнем патогенности с иммунной системой макроорганизма.

Актуальность исследуемой проблемы связана с необходимостью получения новых знаний о развитии инфекционного процесса при заражении ВКЭ и о том, какие характеристики вируса влияют на тяжесть течения заболевания. Полученные данные могут дать новые возможности для прогнозирования течения и исхода заболевания, будут важны при разработке профилактических и лекарственных средств, в том числе -иммуномодуляторов, а также для оценки эпидемической ситуации в очагах.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы было изучение основных характеристик острой и инаппарантной инфекции, вызванной вариантами ВКЭ с высокой и низкой нейроинвазивностью при периферическом заражении мышей линии ВАЬВ/с. Для этого необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить патогенез острой формы КЭ, вызванной адаптированными к мышам штаммами Абсеттаров и ЭК-328 при периферическом заражении мышей линии ВАЬВ/с.

2. Изучить патогенез инаппарантной формы Ю. вызванной адаптированным к клешам вариантом M гтри периферическом заражении мышей линии BALB/c.

3 Изучить динамику накопления специфических AT и основных цитокинов в крови мышей при острой и инаппарантной формах КЭ

4 Оценить возможность использования информации, полученной в жсперимешах на мышах, для прогнозирования течения КЭ у тюлей

5 Изучить иротективный иммунитет, формирующийся при инаппарантной инфекции, вы ¡ванной вариантом M

6 И?учшь мо теку чярно-био тог ическис характеристики белка F вариашов ВКЭ, вызывающих острую и инаппаратную формы инфекции.

7 Изучить иротективные свойства бактериальной птазмиды pMV45 с клонированным под контроль промотора ранних генов цитомегаловируса белком NS1 ВКЭ.

Научная новизна. В результате проделанной работы впервые подробно изучена инаппарантная форма инфекции КЭ у мышей, вызванная адаптированным к клещам вариантом ВКЭ с низкой нейроинвазивностью, характеризующаяся отсутствием вирусемии и инфекционного вируса в ЦНС, отсутствием персистенции вируса, синтезом AT к неструктурному белку NS1 при отсутствии синтеза AT к белку Е я формированием длительного протективного иммунитета.

Впервые показано, что отсутствие вирусемии при инаппарантной инфекции, вызванной адаптированным к клещам вариантом ВКЭ, связано с быстрым удалением вируса из кровотока за счет повышенной сорбции вирионов на клетках крови.

Впервые изучены особенное™ формирования иммунного ответа при инаппарантной форме КЭ у мышей, вызванной адаптированным к клешам вариантом ВКЭ.

Впервые показана возможность формирования длительного высокоэффективного протективного иммунитета при иммунизации мышей адаптированным к клещам вариантом ВКЭ с низкой нейроинвазивностью без участия AT к белку Е.

Впервые изучены молекулярные механизмы, лежащие в основе низкой нейроинвазивности варианта ВКЭ, полученного при адаптации к клещам. Показано, что при адаптации к клешам ВКЭ происходит селекция вариантов вируса с мутациями в геноме, приводящими к изменению >аряда вирионов и повышению их сорбции на гликозаминогликанах (ГАГ).

Научно-практическая значимость работы. В процессе данной работы было показано, что экспериментальная инфекция у мышей является хорошей моделью не только для изучения патогенеза, но и для изучения механизмов формирования иммунного ответа и протективного иммунитета при КЭ у людей.

Получены предварительные данные, указывающие на то, что повышение во время инфекции концентрации сывороточного ИЛ-6 при ТО является признаком повреждения клеток ЦНС вирусом и свидетельствует о тяжелом течении инфекционного процесса.

На модели экспериментальной инфекции КЭ у мышей показано, что для иммунизации неструктурным белком NS1 перспективной биологической системой синтеза и доставки АГ является бактериальная плазмида, с клонированным под контроль промотора ранних генов цитомегаловируса белком NS1 ВКЭ.

Полученная информация показывает, что длительная циркуляция ВКЭ в организме клеща может приводить к селекции низковирулентных вариантов, обеспечивающих скрытую иммунизацию млекопитающих против вирулентного вируса без синтеза AT к белку Е. Полученные данные следует учитывать при создании диагностических препаратов, при прогнозировании тяжести течения и исхода заболевания, а также при изучении уровня сероконверсии у людей и прокормителей. Сведения о распространении подобных вариантов в природе могут дать новую информацию о микроэволюции ВКЭ и о связи свойств циркулирующих в очаге штаммов ВКЭ с частотой и тяжестью заболевания.

Положения, выносимые на защиту.

1. Получена модель инаппарантной инфекции КЭ при периферическом заражении мышей линии BALB/c адаптированным к клещам вариантом M ВКЭ, которая характеризуется отсутствием клинических симптомов заболевания, вирусемии, инфекционного вируса и морфологических повреждений в ЦНС, а также отсутствием AT к белку Е в крови зараженных животных при наличии размножения вируса в органах иммунной системы и формирования длительного протективного иммунитета против высоковирулентного штамма ВКЭ.

2. Низкая нейроинвазивность варианта M связана с быстрым удалением вируса из кровотока за счет повышенной сорбции вирионов на клетках крови, ранней активацией неспецифического иммунитета, а также активацией Thl-лимфоцитов.

3. Протективный иммунитет при иммунизации мышей вариантом M формируется за счет активации как клеточного, так и гуморального иммунитета с образованием антител к неструктурному белку NS1 ВКЭ при отсутствии антител к белку Е.

4. Снижение нейроинвазивности адаптированного к Клещам варианта M по сравнению с родительским штаммом ЭК-328 сопровождается появлением двух замен в оболочечном белке Е, одна из которых приводит к увеличению заряда вирионов и повышению их сорбции на гликозаминогликанах клетки.

5. Повышение концентрации сывороточного ИЛ-6 при КЭ указывает на повреждение клеток ЦНС вирусом и свидетельствует о тяжелом течении инфекционного процесса.

7. Бактериальная плазмида с клонированным под контроль промотора ранних генов цитомегаловируса белком NS1 ВКЭ обеспечивает защиту мышей от выраженного инфекционного процесса при последующем введении высоковирулентного гомологичного вируса и может быть использована для иммунизации мышей неструктурным белком NS1.

Апробация работы. Материалы работы были представлены на научной конференции «Актуальные проблемы медицинской вирусологии» в Москве 2325 ноября 1999 г., на научно-практической конференции «Инфекционные болезни на рубеже XXI века» в Москве 24-26 мая 2000 г., на международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» в Санкт-Петербурге 4-5 сентября 2003 г., на Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы эпидемиологии и профилактики инфекционных болезней» в Самаре 12-14 мая 2004 г., а также на заседании межлабораторного ученого совета ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН 25 апреля 2005 г.

Публикации. По результатам работы опубликовано 2 статьи в научных журналах, 1 - в сборнике научных трудов, 1 — в сборнике материалов конференции и 7 тезисных сообщений.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 149 страницах компьютерного текста и состоит из традиционных разделов. Диссертация содержит 14 рисунков и 9 таблиц. Библиографический указатель включает 355 источников литературы отечественных и зарубежных авторов.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Материалы и методы. В работе были использованы 3 штамма ВКЭ: шт. Абсеттаров, шт. ЭК-328 и производный от него адаптированный к клещам вариант M (получены из коллекции лаборатории молекулярной биологии вирусов ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН), рекомбинантный аденовирус Rad 51, экспрессирующий белок NS1 ВКЭ (пггамм Neudoerfl) (Jacobs et al., 1992), бактериальная плазмида pMV45, с клонированным под контроль промотора ранних генов цитомегаловируса белком NS1 ВКЭ (штамм Neudoerfl) (Jacobs et al., 1992) и плазмида pMVIOO, несущая ту же экспрессирующую кассету, но без клонированного под ее контроль гена белка NS1 (Jacobs et al., 1992). Рекомбинантный аденовирус Rad 51, плазмиды pMV45 и pMVIOO были получены из коллекции лаборатории концентрации и очистки вирусных препаратов ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН.

Для моделирования инфекции мышей линии BALB/c массой 10-14 г («Столбовая», Москва) заражали иптраперитонеально (и/и) 1000 БОЕ/О,3 мл вируса.

Для проведения экспериментов по оценке протективной активности варианта М, иммунизированным мышам через разные промежутки времени вводили и/п 100 ЛД5о(и/п)/0,3 мл шт. Абсеттаров. Для оценки протективной активности плазмиды pMV45 мышей вакцинировали трижды внутримышечно в заднюю поверхность бедра. Разрешение вакцинированных животных проводили и/п шт. Абсеттаров в дозе 100 ЛД5о(и/п/0,3 мл.

Выращивание вирусов и титрование их методом бляшек в культуре клеток СПЭВ проводили по ранее описанной методике (Dzhivanyan et al., 1974). Титры вирусов определяли также на мышах линии BALB/c весом 5-6 г или 10-14 г. Для гистологического исследования образцы готовили по стандартной методике (Григорьева и др., 1985). Концентрированный вирус получали либо ультрацентрифугированием (УЦФ) вируссодержащей культуральной жидкости (КЖ) либо осаждением с помощью 10% полиэтиленгликоля по ранее описанным методикам (Ляпустин и др., 1987). Препараты ВКЭ, меченные по белку, получали, как описано ранее (Дживанян и др., 1990). Иммунопреципитацию (ИП) вирусспецифических белков осуществляли согласно известному протоколу (Stephenson et al., 1987). Анализ белков проводили с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (Laemmli, 1970). Титрование противовирусных AT в сыворотках крови проводили с помощью метода иммуноферментного анализа (ИФА). ИФА проводили непрямым методом согласно стандартной методике. В качестве антигена использовали сконцентрированную с помощью УЦФ вируссодержащую КЖ клеток СПЭВ, инфицированных шт. Абсеттаров и вариантом М. Определение сывороточных интерлейкинов (ИЛ) проводили в реакции ИФА с использованием коммерческих наборов («Genzyme», Великобритания; «Bio Source int.», Бельгия). Определение концентрации а/р интерферона (ИФН) осуществляли по противовирусному эффекту против 100 ТЦД50 вируса энцефаломиокардита мышей (ЕМС) в культуре клеток L41 (Бабаянц и др., 1985). Перед титрованием пробы обрабатывали кислотой в течение 12 часов, затем доводили рН до физиологических значений.

Выделение вирусной РНК осуществляли методом фенольной экстракции. Синтез кДНК проводили в реакции обратной транскрипции со специфическими праймерами. Специфические ДНК фрагменты амплифицировали при помощи ПНР. Нуклеотидную последовательность определяли согласно инструкции к набору для секвенирования "DNA Cycle Sequencing System" (Promega, США). Участки ДНК, где были обнаружены замены, секвенировали не менее двух раз. Анализ полученных нуклеотидных и аминокислотных последовательностей проводили с помощью программы "Gene Runner". Выявление вирусной РНК в мозговой суспензии осуществляли методом ОТ-ПЦР (Романова и др., 2005). Результаты и обсуждение.

Штаммы Абсеттаров (западный субтип) и ЭК-328 (сибирский субтип) ВКЭ, обладающие высокой периферической активностью, были выбраны нами для моделирования острой инфекции. В качестве штамма, вызывающего инаппарантную инфекцию, в данной работе был использован вариант М ВКЭ, описанный ранее в литературе как вариант 718/574, полученный в результате длительной адаптации штамма ЭК-328 к организму клещей Hyalomma marginatum marginatum (17 парентеральных пассажей) (Чунихин и Дживанян, 1977; Дживанян и др., 1986).

На первом этапе работы были исследованы биологические свойства вирусов (таблица 1). Нейровирулентность и нейроинвазивность штаммов оценивали по количеству бляшкообразующих единиц (БОЕ) вируса, которое соответствует 1 ЛД50 для мышей. Видно, что изученные вирусы обладают одинаково высокой нейровирулентностью для мышей разного возраста, а нейроинвазивность их сильно различается. Нейроинвазивность варианта М в 10000 раз меньше, чем родительского штамма ЭК-328.

Таблица 1. Нейровярулентные и нейроинвазивные свойства использованных в работе штаммов ВКЭ

Штамм ВКЭ Нейровирулентность Нейроинвазивность

Мыши 5-6 г Мыши 10-14 г Мыши 10-14 г

ДЦ50 (БОЕ) Титры в мозге Ой БОЕ/мл) ЛД50(БОЕ) ДДзо (БОЕ)

Шт. Абсеттаров 0,1 9,3±0,2 ОД 3,1

Шт. ЭК-328 0,5 8,6±0,5 0,5 18

Вариант М 0,4 8,4±0,2 2,5 250 000

При проведении морфологических исследований головного мозга мыптей, инфицированных интрацеребрально (и/ц) штаммами Абсеттаров, ЭК-328 и вариантом М, наблюдали картину тяжелого менингоэнцефалита. При и/п заражении мышей штаммами Абсеттаров и ЭК-328 в дозе 1000 БОЕ характер изменений в головном мозге животных на пике заболевания был таким же, как и при и/ц заражении. При и/п инфекции вариантом М в этой же дозе морфологических изменений в ЦНС мышей выявлено не было.

При острой инфекции, вызванной шт. Абсеттаров, вирус обнаруживали в крови (двухволновая вирусемия с более выраженным вторым пиком), в региональных лимфатических узлах (на 3 и 6 сутки после заражения), в селезенках (с 1-х по 6-е и на 8 сутки после заражения), а с 5 суток выявляли в высоких титрах в ткани головного мозга. Животные заболевали на 6-7 сутки и к 9-м суткам умирали.

При и/п заражении мышей шт. ЭК-328 также наблюдали острую инфекцию с двухволновой вирусемией, но с более выраженным первым пиком. В периферических лимфоузлах инфекционный вирус был выявлен на 7-е сутки, в селезенках - с 1-х по 6-е и на 8 сутки после заражения. Инфекционный вирус появлялся в головном мозге мышей на сутки раньше, чем при инфекции штаммом Абсеттаров, однако животные заболевали только на 8-9 сутки, погибая через 2-3 дня после появления первых признаков заболевания.

Вариант М не вызывал клинических симптомов заболевания при и/п введении 1000 БОЕ вируса в течение 5 месяцев (период наблюдения). При исследовании органов мышей, зараженных вариантом М, вирус не обнаруживали в крови и мозге, но обнаруживали в региональных лимфатических узлах на 3 и 8 сутки и в селезенках с 5-х по 7-е сутки после начала инфекции. Отсутствие вирусной РНК в мозговой суспензии мышей, полученной на 6 сутки после заражения вариантом М, было доказано с помощью ОТ-ПЦР.

Через 1 и 5 месяцев после и/п введения 1000 БОЕ варианта М в крови, мозге, лимфатических узлах и селезенках мышей (в исходных гомогенатах и после 2-го пассажа в культуре клеток СПЭВ) при титровании методом бляшек вирус выявлен не был.

На 28 сутки после и/п заражения вариантом М 10 мышам была введена летальная доза штамма Абсеттаров (100 ДП^и/п))- Все мыши выжили.

Таким образом, характерными признаками острой инфекции, вызванной вирулентными штаммами Абсеттаров и ЭК-328 при периферическом заражении мышей, являются вирусемия, размножение вируса в органах лимфатической системы, проникновение вируса в 1ЩС животных и поражение клеток ЦНС.

Периферическое заражение мышей вариантом М ВКЭ вызывает инаппарантную форму инфекции, которая характеризуется отсутствием клинических симптомов заболевания, вирусемии, инфекционного вируса и повреждений в ЦНС, отсутствием персистенции вируса, размножением вируса в лимфатических узлах и селезенке и формированием длительного протективного иммунитета к последующему заражению высоковирулентным штаммом ВКЭ.

Одной из причин отсутствия вирусемии при периферической инфекции, вызванной вариантом М, может быть низкий уровень репродукции этого вируса в клетках млекопитающих. Мы сравнили уровень и скорость репродукции изучаемых вирусов в культуре клеток СПЭВ. У штаммов ЭК-328 и Абсеттаров на протяжении периода репродукции титры внеклеточного вируса превышали титры вируса, связанного с клетками. Напротив, у варианта М титры вируса, связанного с клетками, преобладали над титрами вируса в КЖ, Замедленное высвобождение вирионов варианта М при условии ранней" активации иммунного ответа может бьггь одной из причин низкой вирусемии при этом типе инаппарнтной инфекций.

Одним из способов элиминации вируса из кровотока является поглощение его клетками ретикулоэндотелиальной системы (Lee & Lobigs, 2002), к которым вирус может доставляться либо в свободном состоянии, либо связанным с клетками крови. Так как основной пул клеток крови составляют

Рис.1. Динамика сорбции вирионов шаммов Абсеттаров, ЭК-328, варианта М на эритроцитах мыши.

сорбированного на эритроцитах вируса

0,8 0,6+ 0,4 0,2| О

1Ш

0,63

0,5

0,04

10 мин 60 мин

время инкубации

■ Абсеттаров

■ ЭК-328

Р вариант М

Рис. 2. Зависимость доли сорбированного вируса от соотношения количества эритроцитов и вирионов.

% сорбированного на эритроцитах вируса

1611 14 12+ 11>| 8в 4

0,01 БОЕ/КЛ

~ж

ЧтЛ*

0,1 БОЕ/кл 1 БОЕ/кл

соотношение количества эритроцитов и вирионов

■ Абсеттаров

■ ЭК-328

□ вариант*!

эритроциты, мы оценили динамику сорбции изучаемых в работе вариантов ВКЭ на эритроцитах мыши. Количество сорбированного вируса определяли методом бляшек (рис. 1 и 2). Видно, что насыщение эритроцитов вирионами осуществляется уже в первые 10 минут после добавления вируса. Доля вирионов варианта М, связанного с эритроцитами, всегда больше, чем этот показатель для штаммов ЭК-328 и Абсеттаров. При концентрации вирусов 0,01 БОЕ/кл. процент сорбированных на эритроцитах вирионов варианта М в 50-100 раз больше, чем у штаммов ЭК-328 и Абсеттаров. Повышенная сорбция вирионов варианта М на эритроцитах и быстрая их доставка к клеткам ретикулоэндотелиальной системы может быть решающим фактором, определяющим отсутствие вирусемии при инаппарантной инфекции, вызванной вариантом М.

Отсутствие вирусемии при инаппарантной форме КЭ может быть также связано с высоким уровнем синтеза противовирусных АТ. С помощью метода ИФА нами не было выявлено противовирусных АТ в сыворотках крови мышей, зараженных вариантом М, в течение 8 дней после начала инфекции. В

сыворотках животных, зараженных штаммом Абсеттаров, AT выявлялись с 4-х суток после инфицирования в концентрации ( ¡60-1 320

Мы также исследовали спектр AT к белкам ВКЭ в сыворотках крови мышей, инфицированных штаммом Абсеттаров и вариантом M в реакции ИП СРис. 3, 4). Пробы перед электрофорезом либо прогревали в течение 5 мин при 95°С, либо наносили без предварительного прогревания При таких условиях подготовки проб для нанесения на гель мы видим как мономерную форму белка NTS1 (после предварительного прогревания), так и димерную (в отсутствии прогревания) (Hall et al., 1986).

Сыворотка крови мышей, инфицированных шт Абсеттаров, преципитировала из тизагов к пего к С НЭП, зараженных гомогогичным штаммом и вариантом М, белки Е и NS1 ВКЭ (рис.3, треки 4,5,11,12). Сыворотка крови мышей, зараженных вариантом М, вирусспецифических белков из этих лизатов не преципитировала (рис. 3, треки 6,7,13,14).

Рисунок 3. Радиоавтографы иммунопрсципитатов белков ВКЭ с помощью сывороток крови инфицированных мышей после электрофореза в 10% ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

D и M - димерная и мономерная формы белка NS1

А Результаты иммунопреиигтитации вирусных белков из лизатов клеток СПЭВ, зараженных штаммом Абсеттаров ВКЭ и меченных |4С-гидролизатом белка хлореллы.

Б Результаты имм\ нопрекипотации вирусных белков из лизатов клеток СПЭВ. зараженных вариант« M ВКЭ и меченных "С-гидролизатом белка хлореллы

Треки I, 2, 4, 6, 8, 9, 11, H - пробы прогреты перед нанесением на ген, в течение 5 мин при 95 °С. треки 3, 5, 7, 10, 12, 14 - непрогретые пробы Треки 1 и 8 - лошадиный у-ыобулин против ВКЭ СНИИВС. Томск), треки 2. 3. 9, 10 - сыворотка незаряженных мышей, треки 4, 5 11.12 сыворотка мышей, порученная на 7 сутки после и/п введения 1000 БОЕ штамма Абсеттаров. 6, 7. 13. 14 - сыворотка мышей, полученная на 7 сутки после и/п введения 1000 ВОЕ варианта M

Рисунок 4. Радиоавтографы иммунопреципитатов белков ВКЭ с помощью сывороток крови инфииированных мышей после злект рофореза в 10% ПААГ в присутствии додецилсульфага натрия.

Ои М -димерная и мономерная формы бепка NS1

А. Результаты иммунопреципитации вирусных белкой из тизатов клеток СПЭВ, зараженных штаммом Софьин ВКЭ и меченных ,4С-гичролизатом белка хлореллы,

Б Резучьтаты иммунопреципитации вирусных бечков из тизатов клеток СПЭВ, зараженных рекомбинантным аденовирусом, зкспрессируюшим неструктурный белок N5! ВКЭ, и меченных иС-гидрочизатом бетка хлорелчы.

Греки 1, 2, 4, б, 8. 9. !0. II, 12 - пробы прогреты перед нанесением на гель в течение 5 мин при 95 °С, треки 3,5,7- непрогретые пробы

Треки I и 8 - тошалиный -/-поб\ шн против ВКЭ ШИИВС, Томск), (реки 6 7-сыворотка незараженных мышей греки 2 3 - сыворотка мышей полученная на 28 сутки после и/п введения 1000 ЬОЕ варианта М, греки 4, 5, !0 сыворотка мышей иммунизированных вариантом М и мра/кекных через 28 дней летальной дозой (ЮО ЛД5и) штамма Абсетгаров (7 с\1КИ посче введения разрешающей дозы); трек Ч - сыворотка мышей, полученная на 7 сутки поспе ип введения 1000 БОЕ вариаша М, трек И сыворотка мышей по пученная на 7 с\тки поспе и/п введения 1000 БОЕ штамма Абсспаров трек 12 сыворотка мышей вакцинированных ппазмидой рМУ45. зкепрессирующей бе гок N'51 ВКЭ

Из тизата клеток С'ГТЭВ, зараженных штаммом Софьин, сыворотка крови инфицированных вариантом Vf мышей пту«*нная ня "'S сутки после и/п введения ï000 БОЕ вируса, прецигшшровала белок NS1 (рис 4, феки 2,п) Использование лизатов клеток СПЭВ. зараженных рекомбинантным аденовирусом Rad 51, экснрессирующим белок NSI ВКЭ, позволило нам выявить специфические AT к белку 4SI ВКЭ в сыворотке крови инфицированных вариантом M животных, почученной на 7 сутки после введения вируса (рис 4, грек 9).

Таким образом, при остром КЭ у мышей, вызванном штаммом Абсеттаров, противовирусные AT в сыворотке крови животных появляются с 4-х суток после инфицирования При эгом обнаруживаются AT в основном к обо л очечному белку Е ВКЭ и в небольших количествах - к неструктурному белку NS1

При инфекции вариантом М, противовирусные AT в сыворотках крови мышей с помощью метола ИФА выявлены не были Однако при использовании бопее чувствительною по сравнению с ИФА метода ИИ было обнаружено, что при инапнарантиой форме КЭ. вызванной вариантом М, в сыворотках крови животных выявтяются Л Г к неструктурному оелку NS1 при отсуютвии ЛТ к оболочечпому белку Ь.

На следующем этапе работы мы оценили характер иммунного ответа при острой и инапгтарангной формах КЭ по уровню синтеза основных цитокинов

Таблица 2. Концентрация цитокинов в сыворотках крови мышей на ранних этапах инфекции после и/п введения 1000 БОЕ шт. Абсеттаров,

ЭК-328 и варианта \!

вирус ФНО-а ИЛ-10 ИЛ-12

5 ч 10 ч 18 ч 24 ч 10 ч 18ч 24 ч ' 10 ч '24 ч

Абс 107±19 <К <К 301=30 20+0 101±34 'К СК

ЭК-328 <к <К 75г10 <к <к 75*10 <К 352±42 £К

Вар M £К 1I6±32~> iT <к 151x20 118±21 78-13 348±21 <К

Примечание концентрация ИЛ в контрочъных сыворотках крови (К) пол>ценных от животных после введения среды 199 на растворс Эрта 'пкг/мл) ФНО-а - 23x3, ИЛ-10 - 8±4, ИЛ-12 - 131+56

Таблица 3. Концентрация а/р-ИФН в сыворотках крови мышей на ранних этапах инфекции после и/п введения 1000 БОЕ шт. Абсеттаров,

ЭК-328 и варианта М

вирус

Шт Абсеттаров

Шт "Ж;328 Вариант M

з ч

<К

'28

а/р-ИФН *

10ч

24 ч

32 "

Примечание- За титр o/fi-ИФН принимали максимальное развеление сыворотки подавчяющее цитопатогениое тейсгвие 100 П-ЦЪлМОДса ЬМС

Для оценки активации раннего неспецифического иммунного ответа мы определили содержание а/р-ИФН, ФНО-а, ИЛ-! 0 и ИЛ-! 2 в крови мышей на начальных этапах инфекции (табп. 2 и 3) При развитии острой инфекции КЭ,

вызванной штаммом Лбсепаров, a/ß ИФ!! выявлялся через 10 часов и сохранялся в невысоких титрах через сутки после начала инфекции Штамм ЭК-328 оказался менее интерфероногенным. a/ß-ИФН удалось выявить в крови только через 10 часов после начала инфекции При развитии инаппарантной инфекции, вызванной вариантом М, максимальная концентрация a/ß-ИФН была выявлена в сыворотке крови животных уже через 5 часов после заражения, затем a/ß-ИФН быстро элиминировался из крови. Через 10 часов после заражения штаммом ЭК-328 и вариантом М в крови мышей в высоких концентрациях выявлялся и ИЛ-12, который на ранних стадиях инфекции свидетельствует об активации антигенпрезентирующих и фагоцитирующих клеток (Хаитов и Пинегин, 2000, Biron & Sen, 2002) Появление в крови этого интерлейкина и a/ß-ИФН может приводить к активации натуральных киллеров (НК).

В первые часы после заражения животных изучаемыми штаммами ВКЭ мы наблюдали повышение в крови уровня ФНО-a и ИЛ-10. ФНО-а является провоспалительным цитокином. Его появление в крови свидетельствует об активации макрофагов и нейтрофилов. Ранее было показано, что ФНО-а индуцирует синтез ИЛ-10, а ИЛ-10 в свою очередь, подавляет синтез ФНО-а (van der Pool et a!, 1994) В нашем эксперименте ИЛ-10 появлялся одновременно с ФНО-а, после чего концентрация ФНО-а в крови животных понижалась до уровня контроля Известно, что ИЛ-К), явтяясь регулятором иммунных реакций, подавляет продукцию таких основных провосгалительных цитокинов, как ИЛ-6, ФНО-а, экспрессию на клеточной мембране МНС-IT и ашшенпре югавляюшую способность моноцитовЧгакрофагов. продукцию цитокинов (у-ИФН, ИЛ-2) Th-I лимфоцитами, продукцию цитокинов НК, пролиферацию Т-лимфоцигов (Кдшкин, ¡998) Гаким образом, ВКЭ, попадая в органшм мыши, индуцирует состояние иммуноденрессии у инфицированных животных в первые часы после заражения, при этом штаммы ВКЭ могут различаться по выраженности и .ьштельности вызываемой ими иммунодепресии.

Из изученных нами цитокинов маркерами активации специфического клеточного иммунитета являются ИЛ-12. ИЛ-2 и у-ИФН, а маркером активации гуморального иммунитета - ИЛ-6

На 4-е сутки у животных, зараженных шт Абсеттаров, в сыворотках крови появились ИЛ-6 и незначительное количество у-ИФН У животных, зараженных mi ЭК-328, ИЛ-6 и /-ИФН появились на сутки раньше. Повышение концентрации ИЛ-6 свидетельствует об активации Th2-лимфоцитов, которые обеспечивают формирование гуморального иммунного ответа. Продукция у-ИФН связана с активностью ИЛ-12 При инфекции шт. Абсеттаров мы наблюдали однократный подъем уровня ИЛ-12 на 2 сутки, а при инфекции шт. ЭК-328 - двукратный подъем через 10 часов и на 4 сутки после заражения животных.

Таблица 4.а. Концентрация цитокинов в сыворотках крови мышей после и/п введения 1000 БОЕ шт. Абсеттаров (пкг/мл).

Цитокины Срок после заражения животных

1 суз 2сут 3 сут 4 сут 5 сут бсут 7 сут

ФНО-а <К <К <К <К <К ас 315±43

ИЛ-10 101+34 <к <к <К ас <к 45±14 1

у-ИФН <К <к ас 27±5 39 ж 284+36

ИЛ-12 <к 328±17 <к <К н/и н/и н/и

ИЛ-6 <к Ж <к 69±9 <К 5К 640+85

ИЛ-2 ас ас <к <К ас ас аС

Таблица 4.6. Концентрация цитокинов в сыворотках крови мышей после и/п введения 1000 БОЕ штамма ЭК-328 (пкг/мл).

Цитокины Срок после заражения животных

1 сут 2 сут 3 сут 4 сут 5 сут 6 сут 7 сут

ФНО-а <К <К ас <К 107±4 <К н/и

ИЛ-10 <К ас ас <К <К <К 33±1 1

у-ИФН <К ас 30+2 49±4 <К ¿К н/и

ИЛ-12 <К ас ас 292±98 н/и н/и н/и

ИЛ-6 ¿К ас 74±6 <К <К <К 113±9

ИЛ-2 ас ж ¿К <К ЗС ас н/и

Таблица 4.в. Концентрация цитокинов в сыворотках крови мышей после и/п введения 1000 БОЕ варианта М (пкг/мл).

Цитокины Срок после заражения животных

1 сут 2сут 3 сут 4 сут 5 сут 6 сут 7 сут

ФНО-а <К <К <К <К <К <К <К

ИЛ-10 78 Ж <К 12±1 31±5 <К ас

у-ИФН <К ас 96+5 42+8 116+67 10I±14 167+70

ИЛ-12 <К 414±42 ¿К <К н/и н/и н/и

ИЛ-6 <К ас ас ас <К <К 57±6

ИЛ-2 <К ас 25+3 ас 41±6 ас 39±6

Примечание: концентрация ИЛ в контрольных сыворотках крови (К), полученных от живошых после введения среды 199 на растворе Эрла (гпег/мл)' ФНО-га - 23+3; ИЛ-10 - 8±4; у-ИФН - 25±2; ИЛ-12 - 131±56; ИЛ-6 - 16±1; ИЛ-2 - 10±3. 1 - указаны данные для заболевших животных; у мышей без клинических проявлений болезни содержание ИЛ в указанный срок было <К.

При инфекции вариантом М формирование специфического иммунного ответа произошло на 3 сутки. В крови животных повысился уровень ИЛ-2 и у-ИФН. Это говорит об активации ТЫ-лимфоцитов, которые обеспечивают развитие клеточного иммунитета. у-ИФН в крови животных,

инфицированных вариантом М, далее вывлялся на протяжении всего срока наблюдения.

На 7 сутки после заражения в крови животных, инфицированных штаммом Абсеттаров, в высоких титрах появились ИЛ-10, у-ИФН, ИЛ-6 и ФНО-а. В эта же сроки мы регистрировали появление выраженных симптомов заболевания, высокий титр инфекционного вируса в крови и мозге, развитие менингоэнцефалита. Уровень ИЛ-6 в сыворотке крови животных, заболевших на 7-е сутки после и/п введения 1000 БОЕ штамма ЭК-328, также был высоким.

Появление провоспалительных цитокинов в крови инфицированных животных в высоких титрах на этой стадии острого заболевания КЭ свидетельствует о выраженном патологическом процессе в ЦНС и нарушении гематоэнцефалического барьера.

При инаппарантной инфекции, вызванной вариантом М, на 7 сутки после заражения мы наблюдали присутствие в крови в небольших концентрациях ИЛ-2, ИЛ-6 и у-ИФН. При этом все животные были клинически здоровы, вирус из головного мозга не выделялся, и патоморфологическое исследование ЦНС не выявило каких-либо изменений. Наличие в крови ИЛ-2, ИЛ-6 и у-ИФН свидетельствует о развитии к 7-м суткам после заражения сбалансированного (ТЫ и ТЪ2) иммунного ответа при данном типе инфекции.

Таким образом, инаипарантная форма КЭ, вызванная вариантом М, характеризуется развитием более раннего неспецифического иммунного ответа и развитием сбалансированного специфического иммунного ответа. Острая форма КЭ, вызванная штаммами Абсетгаров и ЭК-328, характеризуется более поздней активацией неспецифического иммунитета и преобладанием выраженного гуморального ответа, которого оказывается недостаточно для предотвращения развития заболевания.

На следующем этапе работы мы проанализировали содержание АТ к вирусным белкам в сыворотках крови людей, больных КЭ или с подозрением на КЭ с присасыванием клеща в анамнезе с помощью ИГ1 (таблица 5). Сыворотки крови, а также истории болезни и результаты серологического обследования больных были любезно предоставлены зам. директора НПО «Вектор» В.Б. Локтевым. Для постановки диагноза наряду с данными объективного осмотра применяли лабораторные методы определения вирусспецифических АТ и Т§0) методом ИФА. У больных, умерших от энцефалитической формы КЭ, вирусспецифические АТ не определяли, а поставленный диагноз был подтвержден результатами патолого-анатомического исследования. Специфического лечения у-глобулином не проводилось. Больные поступали в стационар после появления симптомов 16

заболевания, но в разные сроки после укуса клеща. Поэтому систематизация полученных результатов затруднена.

В сыворотках крови больных, выписанных из стационара с диагнозом ОРВИ (№ 1-3) и положительных в ИФА по IgM AT, а также у всех больных лихорадочной формой КЭ разной степени тяжести (№ 4-14) в сыворотке крови были выявлены AT к белку NS1 ВКЭ. У больного с менингеальной формой КЭ (№ 12) наряду с белком NS1 в сыворотке крови обнаруживались также AT к белку Е. У двух больных с менингоэнцефалитической формой (№ 13 и 15) выявлялись AT только к белку Е. У умершего от менингоэнцефалитической формы КЭ больного (№14) в сыворотке крови AT к вирусным белкам выявлены не были. По данным анамнеза и результатам судебно-гистологической экспертизы известно, что КЭ у него развился на фоне приобретенного иммунодефицита. Таким образом, появление AT к белку Е указывает на более тяжелое течение заболевания.

При периферическом заражении мышей высоковирулентным шт. Абсеттаров гибель животных сопровождалась высокой концентрацией сывороточного ИЛ-6 и отсутствием ИЛ-2 на протяжении всего хода инфекции. При инфекции низковирулентным вариантом M уровень сывороточного ИЛ-6 был в 10 раз ниже, чем при инфекции шт. Абсеттаров, при наличии определяемого уровня ИЛ-2 на разные сроки после активации специфического иммунного ответа. Поэтому далее мы попытались оценить применимость таких показателей, как концентрация в сыворотках больных КЭ ИЛ-2 и ИЛ-6, в качестве косвенных прогностических показателей течения заболевания (таблица 5).

Как видно из таблицы 5, ни у одного из больных ИЛ-2 не выявлялся.

ИЛ-6 обладает достаточно выраженным дистанционным эффектом (Кашкин, 1998), от его действия на ЦНС зависит повышение температуры тела при инфекционных процессах, а от действия на клетки печени - синтез белков острой фазы (Хаитов, 2000). Поэтому практическая ценность сывороточного ИЛ-6 представляет определенный интерес.

У лиц контрольной группы в сыворотке крови ИЛ-6 не выявлялся. У 1 из 3-х пациентов положительных по содержанию специфических IgM AT, с диагнозом ОРВИ, в сыворотке крови был выявлен ИЛ-6. У больных лихорадочной и менингеальной формой КЭ ИЛ-6 либо не определялся, либо встречался в небольших количествах. У больных с менингоэнцефалитической формой КЭ, в том числе у двух умерших, ИЛ-6 выявлялся как в первой, так и во второй сыворотке крови, полученной на стадии выраженных неврологических синдромов.

Таблица 5. Результаты обследования больных с различными формами КЭ для выявления в сыворотках их крови ИЛ-2, ИЛ-6 и антител

к белкам ВКЭ.

№ боль- Пол Возраст, Форма КЭ 1-й анализ крови 2-й анализ крови

ного годы IgM IgG AT к белкам ил- 2 ил-6 IgM IgG AT к белкам ил-2 ИЛ-6

1 M 36 ОРВИ + - NS1 < 16 <6 н/и н/и н/и н/и н/и

Z M 43 ОРВИ + - NS1 <16 42 н/и н/и н/и н/и н/и

3 M 45 ОРВИ + - - <16 <6 и/к + NS1 <16 <6

4 M 28 Лих. ф. легк. тяж. + + NS1 <16 7,5 н/и + н/и н/и н/и

5 M 50 Лих.ф. ср. тяж. + + NS1 <46 <6 н/и + NS1 <16 <6

6 M 44 То же \ + NS1 < 16 <6 н/и + н/и н/и н/и

7 M 60 То яге + + NS1 <16 <6 н/и + н/и и/и н/и

8 ж 41 То же + + NS1 < 16 <6 н/и + н/и н/и н/и

9 ж 52 То же + - NS1 <16 35,5 н/и н/и н/и н/и н/и

10 M 71 Тоже + - NS1 <16 13,5 н/и н/и н/и н/и н/и

П ж 61 Лих.ф. тяж. тяж + + NS1 < 16 <6 н/и 1 н/и н/и н/и

12 M 47 Менин-геальная + 4 Е+ NS1 < 16 <6 н/и + NS1 <16 <6

13 M 30 Менин-го-эн-цефали-тическая + н/и Е < 16 14 + н/и г, <16 230

14! M 36 То же + н/и - < 16 11 + н/и - < 16 53

15 ! M 66 То же + н/и - < 16 24 + н/и Е <16 355

16-22 (здор овы) M 2550 н/и н/и < 16 <6 к/и н/и н/и «/я н'и

Примечание: ! - летальный исход; н/и - не исследовали, (+) - положительная реакция в ИФА; (-) - отсутствие AT; Е - антитела к белку Е вируса КЭ; NS1 - антитела к белку NS1 вируса КЭ.

Повышение концентрации ИЛ-6, наблюдаемое на ранних стадиях инфекции у больных №№ 2, 9 и 10, связано, по-видимому, с регуляторной функцией данного цитокина, что приводит к пролиферации и дифференцировке В-клеточного звена иммунной системы. Это совпадает с полученными нами данными по изучению динамики продукции цитокинов при острой и инаппарантной формах КЭ у мышей.

С другой стороны, ИЛ-6 вырабатывается клетками ЦНС при стрессах различной природы и вирусных инфекциях (ОпЯт, 2003). При тяжелых поражениях ЦНС происходит нарушение гематоэнцефалического барьера и за счет этого наблюдается резкое повышение концентрации ИЛ-6 й сыворотках крови больных. Таким образом, при анализе материала от больных КЭ мы подтвердили данные, полученные в экспериментах на мышах, о том, что повышение концентрации ИЛ-6 на стадии выраженного заболевания является показателем вовлечения в патологический процесс тканей ЦНС и свидетельствует о тяжелом течении инфекционного процесса.

При периферическом заражении мышей вариантом М ВКЭ мы наблюдали развитие постинфекционного (естественного) ттротективного иммунитета. На следующем этапе работы мы изучили основные характеристики протективного иммунитета на модели инаппарантной инфекции КЭ у мьппей.

На 28 сутки и через 5 месяцев после заражения мышей вариантом М, этим животным было ведено 100 ЛД50 штамма Абсеттаров. Все мыши выжили.

Сыворотки крови, полученные от животных на 1, 2 и 7 сутки после разрешения, были исследованы на наличие АТ в реакции ИФА. Контрольную группу составили мыши, зараженные 100 ЛД50 штамма Абсеттаров (таблица 6). Нарастание титров общего пула противовирусных АТ в сыворотках животных, иммунизированных вариантом М, наблюдалось с 1-х суток после введения летальной дозы высоковирулентного штамма ВКЭ, что говорит о ранней активации гуморального иммунитета (наличие бустерного эффекта). Об активации клеток иммунологической памяти, обеспечивающих развитие гуморального иммунитета, свидетельствует и наличие в сыворотках крови мышей ИЛ-6 и ИЛ-10 после разрешения иммуннизированных вариантом М животных (Таблица 7).

Таблица 6. Титр противовирусных антител в сыворотках крови мышей после и/и введения 1000 БОЕ варианта М и последующего и/п введения ЮОЛД50 штамма Абсеттаров

Сутки после разрешения 1 1 2 7

Титр АТ у иммуннизированных 1 > 320 животных 1 >640 >640

Титр АТ у неиммуннизированных животных <20 <20 160

Таблица 7. Концентрация цитокинов в сыворотках крови мышей после и/п введения 1000 БОЕ варианта М и последующего и/п введения 100 ЛДя, штамма Абсеттаров

Срок после введения шт. Концентрация интерлейкинов

Абсеттаров ИЛ-2 ИЛ-12 ИЛ-6 ИЛ-10 у-ИФН

1-е сутки 195±84 <К* 45±6 95,6 <К*

2-е сутки 153+60 394±231 48+12 139+31 72+8

7-е сутки н/д н/д 102+7 <К н/д

14 сутки н/д н/д <К* н/д к/д

21 сутки н/д н/д <К* н/д н/д

* Концентрация ИЛ в контрольных сыворотках крови (К), полученных от животных после и/п введения питательной средой 199 на растворе Эрла в объеме 0,3 мл (пкг/мл): ИЛ-2 - 10+3; ИЛ-12 -131±5; ИЛ-6 - 16±1; ИЛ-10 - 8±4; у-ИФН - 25±2.

В крови мышей послс разрешения шт. Абсеттаров, мы также выявили ИЛ-2, ИЛ-12 и у-ИФН. Присутствие данных цитокинов свидетельствует об активации клеток памяти, обеспечивающих развитие клеточного иммунитета.

При последующем введении иммуннизированным вариантом M животным летальной дозы шт. Абсеттаров, в сыворотках крови мышей были выявлены AT к белку NS1 ВКЭ при отсутствии AT к белку F. (Рисунок 4, треки 4,5,10).

В крови, мозге, лимфатических узлах и селезенке (в исходных гомогенатах и после второго пассажа в культуре клеток СПЭВ) животных на 7, 14, 21 и 120 сутки после разрешения при титровании методом бляшек в культуре клеток СПЭВ инфекционный вирус обнаружен не был.

Полученные данные свидетельствуют о том, что последующее введение высоковирулентного штамма не вызывает у мышей, иммунизированных вариантом М, выраженного инфекционного процесса, с чем свидетельствует отсутствие инфекционного вируса в органах мышей в течение всего периода наблюдения и отсутствие AT к белку Е.

Для оценки эффективности протективного иммунитета к белку NS1 мы использовали для иммунизации мышей бактериальную плазмиду pMV45, несущую экспрессирующую кассету цитомегаловируса с клонированным под ее контроль геном белка NS1 ВКЭ (штамм Neudoerfl), полученную Jacobs с сотрудниками (1992). В качестве контрольной использовали плазмиду pMVIOO, несущую ту же экспрессирующую кассету, но без клонированного под ее контроль гена белка NS1. Защищающий эффект плазмиды, несущей в своем составе ген белка NS1 ВКЭ, составил 88%, в то время как контрольная бактерийная плазмида защищала подопытных мышей лишь в 25% случаев.

Риснок S. Радиоавтографы иммунопреципитатов после электрофореза» S 10% ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия.

D и M - димерная и мономерная формы белка NS1

А - результаты иммунопреиипитации вирусных белков из лизатов клеток СПЭ8, зараженных вирусом К'.) и «еченных мС-гидро1изаточ бетка хлореллы Здесь и на рис Б треки I, 2 лошадиный учлобулин против ВЮ 3,4 - смесь сывороток мышей вакцинированных pMV45 и разрешенных зетальной дозой ВКЭ {21 день после введения разрешающей дозы). 5,6 сыворотка незаряженной мыши Треки 1 3.5 - пробы прогреты перед электрофорезом в течение 5 мин при 95°С, треки 2,4.6 - непротретые пробы

Б результаты ичмуиопреципитации вир>сных белков m лизатов клеток СГТЭВ, зараженных рекомбинантным аденовирусом, экспрессирующим неструктурный беток KS1 ВКЭ, и меченных 4С-гидротизатт» бечка хлореллы

Для выявления антигенной специфичности в отношении белков ВКЭ сывороток мышей, вакцинированных плазмидой pMV45 и выживших на 21 день после введения 100 ЛД5„ вирулентного штамма ВКЭ, был использован метод ИП. Эти сыворотки преципитировали белок, соответствующий по электрофоретической подвижности белку NS1 (рис.5.А). Полученные результаты были проверены с использованием радиоактивно-меченных (слеток СПЭВ, зараженных рекомбинантным аденовирусом Rad51, экспрессирующим белок NS1 ВКЭ (Jacobs et al., 1992) (рис.5.Ь) Отсутствие AT к оболочечному белку Е ВКЭ указывает на отсутствие у вакцинированных мышей выраженного инфекционного процесса при последующем введении летальной лош ВКЭ. Полученные экспериментальные данные указывают на то, что иммунный ответ только к белку N'Sl ВКЭ может обеспечивать защиту от i омологичнок летальной инфекции без развития выраженного инфекционного процесса.

Так как все работы были выполнены на линейных мышах, то можно предположить, что особенности инфекции КЭ, описанные в данной работе, связаны со свойствами вирусов. Для изучения генетических маркеров низкой нейроинвазивности нами была определена нуклеотидная последовательность

участков генома, кодирующих белок Е, адаптированного к клещам варианта M и родительского щтамма ЭК-328 и были обнаружены две аминокислотные замены: 122 Glu Gly (GAG -> GGG) и 426 Thr Ile (ACU -> AUU).

Одна из обнаруженных аминокислотных замен затрагивает позицию 426 (Thr —» Ile) белка Е. Этот аминокислотный остаток входит в состав консервативного для подгруппы вируса КЭ участка, обозначенного как CS (аминокислотные остатки 414-430), соединяющего две а-спирали III и Н2 (Ricc, 1996). Однако, именно 426 аминокислота, расположенная в точке перегиба CS-участка, неконсервативна. Роль данной мутации в формировании аттенуированного фенотипа не известна.

Вторая обнаруженная аминокислотная замена - это замена Glu —> Gly в 122 положении белка Е. Согласно рентгеноструктурной модели, полученной F.A.Rey с соавторами (1995), данный аминокислотный остаток расположен на внешней поверхности домена 2, изменяющего свое пространственное положение в процессе перехода молекулы из димерной формы в тримерную. Данная аминокислотная замена приводит к изменению общего заряда молекулы белка Е. Строением этого участка определяется также гемагглютинирующая активность вируса КЭ (Heinz et al., 1990).

Ранее было показано, что генно-инженерные мутанты, содержащие аналогичную замену, также как и вариант М, обладают низкой нейроинвазивностью для мышей, формируют мелкие бляшки в культуре клеток почек эмбрионов свиньи и индуцируют формирование протективного иммунитета (Mandl et al., 2000) Мутации, приводящие к появлению вирусов с таким же фенотипом, были обнаружены у флавивирусов японского энцефалита и энцефалита долины Мюррей (Lee et al., 2002). Таким образом, можно предположить, что фенотипические характеристики варианта M определяются заменой 122 аминокислоты белка Е.

Выводы

1.Получена модель инаппарантной инфекции КЭ при периферическом заражении мышей линии BALB^c адаптированным к клещам вариантом М, которая характеризуется отсутствием клинических симптомов заболевания, вирусемии, инфекционного вируса и морфологических повреждений в ЦНС, отсутствием персистенции вируса, а также отсутствием AT к белку Е в крови зараженных животных при наличии размножения вируса в органах иммунной системы и формирования длительного протективного иммунитета против высоковирулентного штамма ВКЭ.

2 Бессимптомное течение инфекции, вызываемой адаптированным к клещам вариантом М, определяется быстрым удалением вируса из кровотока за счет повышенной сорбции вирионов на клетках крови и рапней активацией неспецифического иммунитета, а также активацией Thl-лимфоцитов.

3. Повышение концентрации сывороточного ИЛ-6 в ходе инфекции при клещевом энцефалите указывает на повреждение клеток ЦНС вирусом, что сопровождается тяжелым течением инфекционного процесса.

4. Протективный иммунитет при иммунизации мышей вариантом M формируется за счет активации как клеточного, так и гуморального иммунитета с образованием антител к неструктурному белку NS1 ВКЭ при отсутствии антител к белку Е.

5. Иммунизация мышей бактериальной плазмидой с клонированным под контроль промотора ранних генов цитомегаловируса белком NS1 ВКЭ обеспечивает защиту мышей от выраженного инфекционного процесса при последующем ведении высоковирулентного гомологичного вируса.

6. Снижение нейроинвазивности адаптированного к клещам варианта M по сравнению с родительским штаммом ЭК-328 сопровождается появлением двух замен в оболочечном белке Е, одна из которых может приводить к увеличению заряда вирионов и повышению их сорбции на гликозаминогликанах клетки.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1.«Изменение свойств популяции вируса клещевого энцефалита при адаптации к культуре клеток СПЭВ». Г.Г. Карганова, Т.И. Дживанян, В.И. Злобин, ТВ. Вихорева, Д.А. Дрокин, Н.Г. Бочкова, Я.Ю. Кондратьева, В.В. Погодина, В.А. Лашкевич. Актуальные вопросы медицинской вирусологии. Сборник научных трудов. 1994. Екатеринбург. Стр. 108-113.

2. «Изменение антигенной специфичности вируса клещевого энцефалита при смене хозяев». Т.И. Дживанян, Г.Г. Карганова, Я.Ю. Кондратьева, В.А. Лашкевич. Материалы научной конференции «Актуальные проблемы медицинской вирусологии», Москва, 23-25 ноября 1999 г., стр. 23.

3. «Изменение структурных белков Е и С вируса клещевого энцефалита при его адаптации к клещам». Г.Г. Карганова, Т.И. Дживанян, В.Б. Локтев, В.Н. Ляпустин, Л.В. Гмыль, Я.Ю. Кондратьева, Д.В. Бахмутов, Е.В. Протопопова, В.А. Лашкевич. Материалы научной конференции «Актуальные проблемы медицинской вирусологии», Москва, 23-25 ноября 1999 г., стр. 29.

4. «Микроэволюция клещевого энцефалита, связанная со сменой .хозяина». Г.Г. Карганова, Т.И. Дживанян, А.П. Гмыль, Я.Ю. Кондратьева, Д.В. Бахмутов, Л.В. Гмыль, В.А. Лашкевич. Материалы научной конференции «Актуальные проблемы медицинской вирусологии», Москва, 23-25 ноября 1999 г., стр. 30.

5. «Особенности иммунного ответа и сравнительная патоморфология при экспериментальной инфекции некоторыми вирусами группы клещевого энцефалита». A.B. Тимофеев, C.B. Ожерелков, Я.Ю. Кондратьева, Н.В. Терешкина, Т.И. Дживанян, Г.Г. Карганова. Материалы научной конференции «Актуальные проблемы медицинской вирусологии», Москва, 23-25 ноября 1999 г., стр. 45.

6. «Перспектива использования неструктурного белка NS1 вируса клещевого энцефалита в качестве вакцины». A.B. Тимофеев, C.B. Ожерелков, Я.Ю. Кондратьева, Г.Г. Карганова, Дж. Р. Стефенсон. Материалы научной конференции «Актуальные проблемы медицинской вирусологии», Москва, 2325 ноября 1999 г., стр. 114.

7. «Неструктурный белок вируса клещевого энцефалита NS1 перспективный потенциальный компонент противовирусной вакцины». A.B. Тимофеев, C.B. Ожерелков, Я.Ю. Кондратьева, Дж. Р. Стефенсон, Г.Г. Карганова. Материалы научно-практической конференции «Инфекционные болезни на рубеже XXI века», Москва, 24-25 мая 2000 г., стр. 55-56.

8. «Протективпая активность бактериальной плазмиды, несущей ген неструктурного белка NS1 вируса клещевого энцефалита». A.B. Тимофеев, Я.Ю. Кондратьева, Г.Г. Карганова, Дж. Р. Стефенсон. Вопросы вирусологии, 2001,1, стр. ¿2-24.

9. «Сравнительная характеристика вируса клещевого энцефалита, адаптированного к клещам и млекопитающим». Г.Г. Карганова, Т.И. Дживанян, Д.В. Бахмутов, Л.Ю. Романова, Я.Ю. Кондратьева, Л.В. Гмыль, А.Н. Лукашов, A.B. Тимофеев, В.А. Лашкевич. Материалы VÜI съезда всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва, 2002 г., стр. 333-334.

10. «Изучение связи тяжести течения заболевания с концентрацией интерлейкина-2 и интерлейкина-6 в сыворотках крови больных клещевым энцефалитом». A.B. Тимофеев, Я.Ю. Кондратьева, В.Г. Орловский, Г.П. Куржуков, В.Б. Локтев, Г'.Г. Карганова. Терапевтический архив, 2002, 74, стр. 22-23.

11. «Особенности иммунного ответа при инаппарантной и острой инфекции, вызванной вирусом клещевого энцефалита, в экспериментах на мышах». Г.Г. Карганова, Я.Ю. Кондратьева, Т.И. Дживанян, C.B. Ожерелков, Л.В. Гмыль, Л.Ю. Романова, A.B. Тимофеев. Материалы третьей международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями», Санкт-Петербург, 4-5 сентября 2003 г., стр. 132.

12. «Обнаружение антител к белкам Е, NSI, NS3 и NS5 вируса клещевого энцефалита в сыворотках крови больных клещевым энцефалитом». Я.Ю. Кондратьева, В.Б. Локтев, В.Г. Орловский, Г.П. Куржуков, A.B. Тимофеев, Г.Г. Карганова. Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы эпидемиологии и профилактики инфекционных болезней», Самара, 12-14 мая 2004 г., стр. 219-221.

1 39 2 «

РНБ Русский фонд

2006-4 10439

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Кондратьева, Ярослава Юрьевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Общие характеристики вируса клещевого энцефалита.

1.1.1. Вирус клещевого энцефалита - систематическое положение.

1.1.2. Структура генома вируса клещевого энцефалита.

1.1.3. Строение и функции белков вируса клещевого энцефалита.

1.2. Патогенез клещевого энцефалита.

1.2.1. Клинические варианты клещевого энцефалита.

1.2.2. Патогенез клещевого энцефалита.

1.2.3. Факторы, влияющие на патогенез инфекции, вызванной вирусом клещевого энцефалита.

1.3. Генетические маркеры вирулентности флавивирусов.

1.4. Иммунологические механизмы защиты организма от инфекции, вызванной вирусом клещевого энцефалита.

1.5. Протективный иммунитет при клещевом энцефалите.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Вирусы.

2.2. Плазмиды.

2.3. Культура клеток.

2.4. Титрование инфекционного вируса.

2.4.1 .Титрование ВКЭ в культуре клеток СПЭВ.

2.4.2. Титрование ВКЭ на мышах.

2.5. Гистологическое исследование.

2.6. Моделирование инфекции.

2.7. Определение протективной активности.

2.8. Изучение связывания вирусов с эритроцитами мыши.

2.9. ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ анализ.

2.10. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ИНТЕРЛЕЙКИНОВ (ИЛ) В СЫВОРОТКАХ КРОВИ.

2.11. Определение концентрации а/в ИФН в сыворотках крови мышей.

2.12. Иммунопреципитация (ИП) вирусспецифических белков.

2.13. Анализ вирионов ВКЭ с помощью ракетного иммуноэлектрофореза (РИЭФ)

2.14. Определение нуклеотидной последовательности фрагментов РНК, кодирующих белок Е ВКЭ.

2.15. Анализ мозговой суспензии мышей на отсутствие РНК ВКЭ.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Характеристика острой и инаппарантной инфекции, вызванной вирусом клещевого энцефалита.

3.2. Изучение уровня репродукции в культуре клеток СПЭВ штамма Абсеттаров, родительского штамма ЭК-328 и варианта М.

3.3. Сорбция штамма Абсеттаров, родительского штамма ЭК-328 и варианта М на эритроцитах мыши.

3.4. Характеристика гуморального иммунитета при острой и инаппарантной формах клещевого энцефалита.

3.5. Синтез основных цитокинов при острой и инаппарантной формах КЭ.

3.6. Изучение связи тяжести заболевания с концентрацией ИЛ-2 и ИЛ-6 и содержанием антител к белкам ВКЭ в сыворотках крови людей, больных клещевым энцефалитом.

3.7. ПРОТЕКТИВНЫЙ ИММУНИТЕТ ПРИ ИНАППАРАНТНОЙ ФОРМЕ КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА, вызванной вариантом М.

3.9. ПРОТЕКТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ПЛАЗМИДЫ, НЕСУЩЕЙ ГЕН неструктурного белка NS1 ВКЭ.

3.9. МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БЕЛКА Е ВАРИАНТОВ ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА С ВЫСОКОЙ И НИЗКОЙ НЕЙРОИНВАЗИВНОСТЬЮ.

4. ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Особенности экспериментальной инфекции, вызванной вариантами вируса клещевого энцефалита с высокой и низкой нейроинвазивностью"

Клещевой энцефалит (КЭ) - природно-очаговое заболевание, широко распространенное на территории Европы, Западной и Восточной Сибири, а также на Дальнем Востоке. В эндемичных регионах ежегодно регистрируется от 5 до 100 случаев КЭ на 100000 населения. Наибольшее количество заболеваний приходится на лихорадочную и менингеальную формы (от 80 до 90 и более процентов). На долю очаговых форм приходится меньшая часть заболеваний (1-10%), но это наиболее тяжелая форма с летальностью от 10 до 12% и высокой степенью инвалидизации больных (до 30%).

Эффективным средством профилактики КЭ является вакцинация. Несмотря на многолетнее успешное применение инактивированных цельновирионных вакцин против КЭ, заболеваемость КЭ как в России, так и за рубежом продолжает нарастать. Наблюдается расширение ареала распространения вируса КЭ (ВКЭ), изменение пространственной структуры нозоареала КЭ, появление случаев атипичного течения заболевания с выраженным геморрагическим синдромом и увеличение числа тяжелых форм.

Тем не менее, одной из основных форм проявления инфекционного процесса при КЭ (до 95% в отдельных регионах) является инаппарантная. Клинически она не диагностируется. Факты изоляции штаммов ВКЭ от людей без клинических проявлений заболевания, но отмечавших присасывание клещей, являются прямым доказательством частой инфицированности лиц ВКЭ с проявлением довольно низкого индекса манифестности. У 45 % людей, отмечавших присасывание клеща и имеющих вирусный антиген (АГ) в крови, противовирусные антитела (AT) не выявляются.

Таким образом, вирусологические и клинические наблюдения показывают, что инфицирование человека ВКЭ может иметь разные последствия — от инаппарантной формы инфекции до очаговых форм с летальным исходом. Исход и тяжесть заболевания определяются, по-видимому, как свойствами вируса, так и свойствами макроорганизма.

Основной биологической характеристикой ВКЭ, определяющей течение и исход болезни, является способность вируса преодолевать гематоэнцефалический барьер и проникать в центральную нервную систему (ЦНС) - т.е. нейроинвазивность. Свойства вируса, определяющие его активность при периферическом попадании в организм млекопитающих, изучены недостаточно.

Достижения современной науки позволяют по-новому взглянуть на патогенез вирусных инфекций, в котором одно из ведущих мест занимают иммунологические процессы, представляющие собой сложный каскад взаимодействий вируса с различными иммунокомпетентными клетками. Механизмы развития инфекционного процесса в совокупности с данными о формировании иммунного ответа при КЭ до сих пор не исследованы. Поэтому одной из важных задач современной вирусологии является изучение особенностей взаимодействия штаммов ВКЭ с разным уровнем патогенности с иммунной системой макроорганизма.

Актуальность, своевременность и практическая значимость исследуемой проблемы связана с необходимостью получения новых знаний о развитии инфекционного процесса при заражении ВКЭ и о том, какие характеристики вируса влияют на тяжесть течения заболевания. Полученные данные могут дать новые возможности для прогнозирования течения и исхода заболевания, будут важны при разработке профилактических и лекарственных средств, в том числе - иммуномодуляторов, а также для оценки эпидемической ситуации в очагах.

Цель и задачи работы. Целью данной работы было изучение основных характеристик острой и инаппарантной инфекции, вызванной вариантами вируса КЭ с высокой и низкой нейроинвазивностыо при периферическом заражении мышей линии BALB/c.

Для этого необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить патогенез острой формы КЭ, вызванной адаптированными к мышам штаммами Абсетгаров и ЭК-328 при периферическом заражении мышей линии BALB/c.

2. Изучить патогенез инаппарантной формы КЭ, вызванной адаптированным к клещам вариантом М при периферическом заражении мышей линии BALB/c.

3. Изучить динамику накопления специфических AT и основных цитокинов в крови мышей при острой и инаппарантной формах КЭ.

4. Оценить возможность использования информации, полученной в экспериментах на мышах, для прогнозирования течения КЭ у людей.

5. Изучить протективный иммунитет, формирующийся при инаппарнтной инфекции, вызванной вариантом М ВКЭ.

6. Изучить молекулярно-биологические характеристики белка Е вариантов ВКЭ, вызывающих острую и инаппарантную формы инфекции.

7. Изучить протективные свойства бактериальной плазмиды pMV45 с клонированным под контроль промотора ранних генов цитомегаловируса белком NS1 ВКЭ.

Научная новизна. В результате проделанной работы впервые получена подробная характеристика инаппарантной формы инфекции КЭ у мышей, вызванной адаптированным к клещам вариантом ВКЭ с низкой нейроинвазивностью, характеризующаяся отсутствием 6 вирусемии и инфекционного вируса в ЦНС, синтезом AT к неструктурному белку NS1 при отсутствии синтеза AT к белку Е и формированием длительного протективного иммунитета.

Впервые изучены особенности формирования иммунного ответа при инаппарантной форме инфекции КЭ у мышей, вызванной адаптированным к клещам вариантом ВКЭ.

Впервые показана возможность формирования длительного протективного иммунитета при иммунизации мышей адаптированным к клещам вариантом ВКЭ с низкой нейроинвазивностью без участия AT к поверхностному гликопротеину Е.

Впервые изучены молекулярные механизмы, лежащие в основе низкой нейроинвазивности варианта ВКЭ, полученного при адаптации к клещам. Показано, что при адаптации к клещам ВКЭ происходит селекция вариантов вируса с мутациями в геноме, приводящими к изменению заряда вирионов и повышению их сорбции на гликозаминогликанах (ГАГ).

Научно-практическая ценность. В процессе данной работы было показано, что экспериментальная инфекция у мышей является хорошей моделью не только для изучения патогенеза, но и для изучения механизмов формирования иммунного ответа и протективного иммунитета при КЭ у людей.

Получены предварительные данные, указывающие на то, что повышение концентрации сыворотчного ИЛ-6 при КЭ является признаком повреждения клеток ЦНС вирусом и свидетельствует о тяжелом течении инфекционного процесса.

На мышиной модели показано, что для иммунизации неструктурным белком NS1 перспективной биологической системой синтеза и доставки АГ является бактериальная плазмида, с клонированным под контроль промотора ранних генов цитомегаловируса белком NS1 ВКЭ.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Кондратьева, Ярослава Юрьевна

Выводы

1. Получена модель инаппарантной инфекции КЭ при периферическом заражении' мышей линии BALB\c адаптированным к клещам вариантом М, которая характеризуется отсутствием клинических симптомов заболевания, вирусемии, инфекционного вируса и морфологических повреждений в ЦНС, отсутствием персистенции вируса, а также отсутствием AT к белку Е в крови зараженных животных при наличии размножения вируса в органах иммунной системы и формирования длительного протективного иммунитета против высоковирулентного штамма ВКЭ.

2. Бессимптомное течение инфекции, .вызываемой адаптированным к клещам вариантом М, определяется быстрым удалением вируса- из кровотока за счет повышенной сорбции вирионов на клетках крови, ранней активацией неспецифического иммунитета, а также активацией Thl-лимфоцитов.

4. Протективный иммунитет при иммунизации мышей вариантом М формируется за счет активации как клеточного, так и гуморального иммунитета с образованием антител к неструктурному белку NS1 ВКЭ при отсутствии антител к белку Е.

5. Иммунизация мышей бактериальной плазмидой с клонированным под контроль промотора ранних генов цитомегаловируса белком NS1 ВКЭ обеспечивает защиту мышей от выраженного инфекционного процесса при последующем введении высоковирулентного гомологичного вируса.

6. Снижение нейроинвазивности адаптированного к клещам варианта М по сравнению с родительским штаммом ЭК-328 сопровождается появлением двух замен в оболочечном белке Е, одна из которых может приводить к увеличению заряда вирионов и повышению их сорбции на гликозаминогликанах клетки.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Выражаю глубокую благодарность дирекции ГУ ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН (директор - академик РАМН С.Г. Дроздов) и дирекции ФГУП "ПИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН" (директор - Г.А. Белова) за предоставленную возможность выполнения данной работы. Я искренне благодарна кбн Г.Г. Каргановой и дмн А.В. Тимофееву за научное руководство, постоянное внимание и поддержку. Также благодарю сотрудников ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН Т.И. Дживанян, А.П. Гмыля, JI.B. Гмыль, Л.Ю. Романову и сотрудника ГИСК им. Л.А. Тарасевича Н.В. Терешкину за помощь и участие в настоящей работе. Я благодарна всем соавторам моих работ, не упомянутых выше, за помощь в проведении данных исследований.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Кондратьева, Ярослава Юрьевна, Московская обл.

1. Авакян А.А., Левкович Е.Н., Бусник М.М. 1960. Изучение морфологии нервных клеток, пораженных вирусами клещевого энцефалита и сходных с ними заболеваний. Вопр. вирусологии, № 3, стр. 208-216.

2. Анджапаридзе О.Г., Степанова Л.Г. 1967. Изучение изменчивости вируса клещевого энцефалита. Сообщение 3. Выделение из вирусных популяций клонов со сниженной нейропатогенностыо. Вопр. вирусологии, № 5, стр. 604-607.

3. Анджапаридзе О.Г., Степанова Л.Г., Розина Э.Э. 1967. Изучение изменчивости вируса клещевого энцефалита. Сообщение 4. патогенные свойства некоторых штаммов вирусов группы клещевого энцефалита и их вариантов. Вопр. вирусологии, № 6, стр. 691697.

4. Анджапаридзе О.Г., Степанова Л.Г. 1969. Изучение изменчивости вируса клещевого энцефалита. Сообщение 5. генетическая характеристика штаммов с разной вирулентностью. Вопр. вирусологии, № 6, стр. 687-691.

5. Бабабянц А.А., Манахова Л.С., Карганова Г.Г., Порховатый С.Я., Кондратенко И.В., Хахалин Л.Н. 1985. Интерфероновая реакция лейкоцитов у больных с первичными иммунодефицитами. Вопросы вирусологии, № 6, с. 714-717.

6. Баннова Г.Г., Сарманова Е.С., Караванов А.С., Бычкова М.В., Пиванова Г.П., Флеер Г.П. 1982. Изучение биологических свойств штаммов вируса клещевого энцефалита, выделенных в разных частях его ареала. Вопр. вирусологии, № 1, стр. 41-44.

7. Баркова Э.А., Иерусалимский А.П. 1963. Динамика накопления, вируснейтрализующих антител у больных с различными клиническими формами клещевого энцефалита. Вопр. вирусологии, № 2, стр. 189-193.

8. Борисевич В.Г., Леонова Г.Н. 2002. Инфекционный процесс при стертой и инаппарантной формах клещевого энцефалита. "Клещевой энцефалит (к 65-летию-открытия)", Владивосток, стр. 48-59.

9. Бычкова М.В., Сарманова Е.С., Мартсон М.А., Коваленко В.Н. 1964. Изучение вирусемии и динамики формирования иммунитета при клинически выраженных и инаппарантных формах клещевого энцефалита.

10. Варгин В.В., Семенов Б.Ф. 1986. Изменение активности естественных киллеров у мышей разных линий на фоне острой и бессимптомной флавивирусной инфекции. Acta virol., № 30, стр. 303-308.

11. Волкова Л.И., Образцова Р.Г. 2002. Клиническая картина острого клещевого энцефалита на Среднем Урале. "Клещевой энцефалит (к 65-летию открытия)», Владивосток, стр. 88-98.

12. Волкова Л.И., Образцова Р.Г. 2003. Эпидемиологические особенности клещевого энцефалита в Свердловской области. В сб. «Эпидемиологическая обстановка и стратегия борьбы с клещевм энцефалитом на современном этапе». М, стр. 31-32.

13. Воробьева М.С. 2002. Современное состояние вакцинопрофилактики клещевого энцефалита. "Клещевой энцефалит (к 65-летию открытия)», Владивосток, стр. 166-169.

14. Ворович М.Ф., Тимофеев А.В., Мальдов Д.Г., Эльберт Л.Б. 1988. Функциональная роль третичной структуры поверхностного антигена вируса клещевого энцефалита -полипептида Е. Доклады АН СССР, Т.301, № 3, стр. 728-730.

15. Гильманова Г.Х., Лапшина Г.Н., Ливанова И.А. 1964. Об инфицировании вирусом клещевого энцефалита через молоко коров. Вопр. вирусологии, № I, стр. 47-49.

16. Григорьева Л.В., Чигиринский А.Е., Воробьева М.С., Ладыженская И.П., Кан Г.А., Расщепкина М.Н. 1985. Методические рекомендации по морфологической оценке нейровирулентности вирусов комплекса клещевого энцефалита. Москва, ГИСК им. Л.А.Тарасевича.

17. Грицун Т.С., Ляпустин В.Н., Карганова Г.Г., Лашкевич В.А. 1988. Невирионный («растворимый») антиген вируса клещевого энцефалита. Вопр. вирусологии, № 2, стр. 217227.

18. Грицун Т.С., Ляпустин В.Н., Шаталов А.Г., Лашкевич В.А. 1990. Множественные формы белка NS1 как основного компонента невирионного («растворимого») антигена вируса клещевого энцефалита. Вопр. вирусологии, № 6, стр. 471-474.

19. Готовцева Е.П., Серов И.В., Учакин П.Н., Шестакова С.В., Суркина И.Д., Ершов Ф.И. 1990. Нарушение продукции лимфоцитами человека интерлейкина-2 и у-интерферона при стрессе и некоторые механизмы их взаимодействия. Вопр. вирусологии, №5, стр. 435437.

20. Гуляева С.Е., Квон Ю.В., Кирилюк И.И. Коваленко Л.С., Николина Л.В. 2002. Клиника клещевого энцефалита в Приморском Крае. "Клещевой Энцефалит (к 65-летию открытия)». Владивосток, стр. 39-47.

21. Давиденков С.Н., Кулькова Е.Ф., Покровская О.А., Штильбанс И.И. 1954. Клиника двухволнового вирусного менингоэнцефалита. Нейровирусные инфекции, Л., стр. 35-77.

22. Деменев В.А., Гайдамович С.Я., Захарычева Т.А., Иванов Л.И. 1999. Изучение усиления инфекционности вируса клещевого энцефалита в эксперименте. Актуальные проблемы мед вирусологии. М., стр. 21.

23. Дживанян Т.И., Чупринская М.В., Лашкевич В.А. 1973. О факторах, влияющих на появление ДС-признака вирусов комплекса клещевого энцефалита. Вопр. вирусологии, № 1, стр. 86-91.

24. Дживанян Т.И., Чунихин С.П., Лисак В.М., Каштанова Г.М., Королев М.Б. 1986. Иммунохимические характеристики антигенов варианта вируса клещевого энцефалита, адаптированного к клещам Hyaloma plumbeum. Вопр. вирусологии, № 1, стр. 92-96.

25. Добрикова Е.Ю., Плетнев А.Г., Шаманин В.А. 1986. Обнаружение вируса клещевого энцефалита в крови людей и в индивидуальных клещах методом молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот. Вопр. вирусологии, №6, стр. 739-742.

26. Дубов А.В. 1963. О противовирусном иммунитете при клещевом энцефалите. В сб. «Природно-очаговые болезни», Тюмень, стр. 100-102.

27. Дубов А.В., Ильенко В.И., Смородинцев А.А. 1965. В кн. «Актуальные проблемы вирусных инфекций», М., стр. 171-172.

28. Ерман Б.А., Дроздова Л.И., Зайцева Л.Н., Тулакина Л.Г. 1999. Патологическая анатомия современного клещевого энцефалита на Урале. Екатеринбург. Стр.77-78.

29. Заклинская В.А., Левина Л.С. 1965. В кн. «Актуальные проблемы вирусных инфекций», М., стр. 273.

30. Злобин В.И. 2003. Современные аспекты эпидемиологии клещевого энцефалита. В сб. «Эпидемиологическая обстановка и стратегия борьбы с клещевым энцефалитом на современном этапе», Москва, стр. 7.

31. Иерусалимский А.П. 2001. "Клещевой энцефалит". Новосибирск, стр. 63-92.

32. Игнатьев Г.М., Отрашевская Е.В., Воробьева М.С. 2003. Активность цитокинов при иммунизации вакциной против клещевого энцефалита в эксперименте. Вопр. вирусологии, № 2, стр. 22-25.

33. Ильенко В.И., Покровская О.А. 1960. Особенности течения экспериментальной инфекции у обезьян, зараженных вирусами клещевого, двухволнового и шотландского энцефалитов. Acta Virol., стр. 75-81.

34. Ильенко В.И. и Смородинцев А.А. 1962. В сб. «Клещевой энцефалит и другие арбовирусные инфекции». Тезисы конференции. Минск, СССР, стр. 18-19.

35. Ильенко В.И., Платонов В.Г., Смородинцев А.А. 1974. Биологические варианты вируса клещевого энцефалита, выделенные в различных очагах заболеваний. Вопр. вирусологии, № 4, стр. 414-418.

36. Канн Г. А., Воробьева М.С., Шаламберидзе Т.Д., Блоха В.В. 1986. Экспериментальное изучение иммунологической реактивности инбредных мышей сразличной чувствительностью к вирусу клещевого энцефалита. Вопр. вирусологии, № 1, стр. 107-110.

37. Карганова Г.Г. 1991. Зависимые от хозяина варианты вируса клещевого энцефалита и особенности их репродукции в клетках млекопитающих. Дисс. канд. биол. наук.

38. Карминская Н.Н. Живоляпина P.P., Мейерова Р.А., Перевозников В.А. 1965. Своеобразный штамм вируса клещевого энцефалита, выделенный от больного с прогредиентным течением заболевания. В сб. «Актуальные проблемы вирусных инфекций», М., стр. 190-191.

39. Карминская Н.Н. Живоляпина P.P., Мейерова Р. А. 1972. Опыт вирусологического изучения гиперкинетических форм клещевого энцефалита с прогредиентным течением. В сб. «Актуальные проблемы вирусологии и профилактики вирусных заболеваний», М., стр. 224-225.

40. Кашкин К.П. 1998. Цитокины иммунной системы: Основные свойства и иммунобиологическая активность. Клиническая лабораторная диагностика, №11, стр. 21-32.

41. Кветкова Э.А., Переходова С.К., Дуринова Л.П., Соколова Т.Ф. 1978. Функции Т -и В систем иммунитета при клещевом энцефалите. В сб. "Этиология, эпидемиология и меры профилактики клещевого энцефалита на Дальнем Востоке", Хабаровск, стр. 42-43.

42. Кветкова Э.А., Семенов Б.Ф., Переходова С.К., Соколова Т.Ф. 1978. Количественная характеристика Т- и В- популяции лимфоцитов у больных клещевым энцефалитом. В сб. "Вопросы иммунитета и диагностики природноочаговых болезней. Ленинград, 1978, стр. 36-41.

43. Кветкова Э.А., Переходова С.К. 1981. Развитие клеточного иммунитета при экспериментальном клещевом энцефалите. Вопр. вирусологии, № 1, стр. 67-71.

44. Кветкова Э.А., Шматко В.Г. 1982. Феномен вторичной иммунологической недостаточности и его значение в патогенезе острого клещевого энцефалита. Журн. невропатол. и психиатрии, т.82, № 2, стр. 220-224.

45. Кветкова Э.А. 1984. Диагностическое и прогностическое значение иммуноглобулинов класса М при клещевом энцефалите. В сб. «Арбовирусы2.,. Таллин, стр. 100-101.

46. Кветкова Э.А., Илюшенко Л.П., Шматко В.Г., Кротова Р.А. 1986. Иммунологические критерии прогноза течения и выздоровления при клещевом энцефалите. В сб. "Природнор-очаговые болезни человека», Омск, 1986, стр. 56-62.

47. Козлов О.Ю., Минаков С.Д., Хованова A.M., Чукреев Е.Ф. 1974. О роли макрофагов в патогенезе экспериментальной инфекции, вызванной вирусом клещевого энцефалита. ЖМЭИ, № 8, стр. 20-24.

48. Конев В.П., Кветкова Э.А. 1981. Морфогенез экспериментального клещевого энцефалита. В сб. «Природно-очаговые болезни человека (вопросы эпидемиологии и прфилактики)», Омск, стр. 71-79.

49. Ларина Г.И., Левкович Е.Н. 1980. Изучение функциональной активности макрофагальных элементов перитонеального экссудата животных в процессе инфицирования вирусами комплекса клещевого энцефалита. Вопр. вирусологии, № 4, стр. 457-460.

50. Ларина Г.И., Левкович Е.Н. 1983. Взаимосвязь генотипа животного и штаммовых особенностей, вируса с течением экспериментального клещевого энцефалита. Вопр. вирусологии, № 3, стр. 345-348.

51. Лашкевич В.А. 2003. Борьба с клещевым энцефалитом некоторые современные аспекты. В сб. «Эпидемиологическая обстановка и стратегия борьбы с клещевым энцефалитом на современном этапе», М, стр. 5.

52. Левина Л.С., Погодина В.В. 1988. Персистенция вируса клещевого энцефалита в вакцинированном организме. Вопр. вирусологии, № 4, стр. 485-490.

53. Левкович Е.Н. 1962. В кн. "Биология вирусов комплексаклещевого энцефалита", Прага, стр. 317.

54. Левкович Е.Н., Сарманова Е.С., Погодина В.В., Николаева Г.Н. 1960. Изучение особенности гуморального иммунитета у больных клещевым энцефалитом людей. "Вопросы медицинской вирусологии", № 6, стр. 28-33.

55. Левкович Е.Н., Погодина В.В., Засухина Г.Д., Карпович Л.Г. 1967. «Вирусы комплекса клещевого энцефалита». Издательство Медицина", Ленинградское отделение.

56. Лезина М.Н., Воробьева М.С. 1978. Изучение штаммов вируса клещевого энцефалита, выделенных из различных эндемических очагов инфекции. В сб. "Этиология, эпидемиология и меры профилактики клещевого энцефалита на Дальнем Востоке", Хабаровск, стр. 61-64.

57. Леонова Г.Н., Мураткина С.М., Кругляк С.П. 1990. Изучение вирулентности штаммов вируса клещевого энцефалита, изолированных на юге советского Дальнего Востока. Вопр. вирусологии, № 5, стр. 399-401.

58. Леонова Г.Н.,Исачкова Л.М., Кругляк С.П., Майстровская О.С.,Фисенко А.Ю. 1995. Патогенетические критерии оценки вирулентности штаммов вируса клещевого энцефалита, изолированных на юге Дальнего Востока. Вопр. вирусологии, № 4, стр. 165169.

59. Леонова Г.Н., Майстровская О.С. 1996. Вирусемия у больных клещевым энцефалитом и у лиц с присасыванием иксодовых клещей. Вопр. вирусологии, № 5, стр. 224-228.

60. Леонова Г.Н., Майстровская О.С., Борисевич В.Б. 1996. Антигенемия у людей, инфицированных вирусом клещевого энцефалита. Вопр. вирусологии, № 6, стр. 260-263.

61. Леонова Г.Н., Беликов С.И., Борисевич В.Б., Кожемяко В.В. 2001. Новые перспективы в изучении клещевого энцефалита. Тихоокеанский мед. журн., т. 7, № 2, стр. 17-22.

62. Леонова Г.Н. 2002. Этапы изучения клещевого энцефалита в Приморском крае. "Клещевой энцефалит (к 65-летию открытия)", Владивосток, стр. 5-14.

63. Лопатин А.Н., Львов Д.К., Бабкин П.С. 1962. Случай повторного заболевания клещевым энцефалитом. Вопр. вирусологии, № 6, стр. 741.

64. Львов Д.К. Клименко С.М., Гайдамович С.Я. 1989. В сб. «Арбовирусы и арбовирусные инфекции», М., Медицина, стр. 335.

65. Ляпустин В.Н., Лисак В.М., Грицун Т.С. 1985. Иммунологический и электронномикроскопический анализ высокомолекулярных структур вируса клещевого энцефалита. Вопр. вирусологии, №4, стр. 419-427.

66. Ляпустин В.Н., Грицун Т.С., Лашкевич В.А. 1987. Характеристики осаждения антигенных структур клещевого энцефалита полиэтиленгликолем и сульфатом аммония. Вопр. вирусологии, №2, стр. 188-195.

67. Ляпустин В.Н., Чунихин С.П., Решетников И.А., Лашкевич В.А. 1987. Изменения синтеза вирионного антигена вируса клещевого энцефалита после пассирования через иксодовых клещей и мелких млекопитающих. Вопр. вирусологии, № 4, стр. 451-456.

68. Ляпустин В.Н., Карганова Г.Г., Мустафина А.Н., Грицун Т.С., Лашкевич В.А. 1988. Выявление вирусспецифических белков вируса клещевого энцефалита с помощью иммуносорбции. Вопр. вирусологии, № 4, стр. 448-452.

69. Ляпустин В.Н., Пиванова Г.П., Караванов А.С., Лашкевич В.А. 1991. Сопоставление протективных свойств препаратов вирионного и невирионного («растворимого») антигенов вируса клещевого энцефалита. Вопр. вирусологии, № 6, стр. 496-500.

70. Малиновская В.В., Волегова Г.М., Устинова О.Ю. 1995. Система интерферона при остром клещевом энцефалите и влияние на динамику клинико-лабораторных показателей различных методов интерферонотерапии. Вопр. вирусологии, № 5, стр. 234-238.

71. Малкова Д., Франкова В. 1959. Роль лимфатической системы в развитии клещевого энцефалита у мышей. Acta virol., 3, стр. 210-214.

72. Малкова Д. 1960 а. Роль лимфатической системы при экспериментальном заражении клещевым энцефалитом. 1. Вирус клещевого энцефалита в лимфе и крови экспериментально зараженных баранов. Acta virol., 4, стр. 233-240.

73. Малкова Д. 1960 б. Участие лимфатической и кровеносной систем в дессиминации вируса клещевого энцефалита в органы экспериментально зараженных мышей. Acta virol., № 4, стр. 290-295.

74. Малкова Д., Рала Ф., Сидак 3. 1961. Изменения в составе элементов белой крови, в региональных лимфатических узлах и селезенке мышей, зараженных вирусом клещевого энцефалита. Acta virol., № 5, стр. 101-111.

75. Малкова Д. 1962. Влияние рентгеновского облучения на проникновение вируса клещевого энцефалита через региональные лимфатические узлы. Acta virol., № 6, стр. 475476.

76. Малкова Д., Сметана, А. 1966. Роль лимфатической системы при прямом введении вируса клещевого энцефалита в кровь чувствительных белых мышей. Acta virol., № 10, стр. 471-474.

77. Малкова Д. 1966. Проникновение вируса клещевого энцефалита в тимус мышей. Acta virol., № 10, стр. 549-550.

78. Майер В. 1963. Изучение вирулентности вируса клещевого энцефалита. 1. Экспериментально полученная линия вируса клещевого энцефалита с измененной патогенностью для молодых мышей и ее иммуногенность. Acta virol., № 7, стр. 421-429.

79. Майер В. 1964. Изучение вирулентности вируса клещевого энцефалита. 2. Патогенетические свойства двух вариантов одного вирусного штамма. Acta virol., № 8, стр. 14-21. ■

80. Майер В. 1965. Изучение вирулентности вируса клещевого энцефалита. 4. Термочувствительность вирионов и их отношение к другим генетическим маркерам. Acta virol., № 9, стр. 397.

81. Майер В., Сабо А. 1966. Изучение вирулентности вируса клещевого энцефалита. 5. Действие мочевины на термолабильные и термостабильные вирусные варианты. Acta virol., № 10, стр. 486.

82. Майер В., Райчени Д. 1967. Изучение вирулентности вируса клещевого энцефалита. 6. Интрацеребральное заражение обезьян клонами экспериментально ослабленного вируса. Acta virol., №11, стр. 321-333.

83. Майер В., Гаждосова Е., Славик И. 1976. Изучение клеточного иммунитета к вирусу клещевого энцефалита in vitro: исследование на реконвалесцентах и лицах с субклиническими формами инфекции. Acta virol., № 20, стр. 395-401.

84. Минаков С.Д., Хованова A.M., Козлов О.Ю. 1974. Взаимодействие вируса клещевого энцефалита с перитонеальными макрофагами. В сб. «Диагностика и профилактика вирусных инфекций», Свердловск, стр. 164-168.

85. Морозова О.В., Попова Р.В., Максимова Т.Г., Митрофанова Е.Э., Бахвалова В.Н. 2000. Сравнение иммунного ответа, индуцированного ДНК или инактивированной вакциной против клещевого энцефалита. ЖМЭИ, № 2, стр. 54-57.

86. Овчинникова Э.А., Карпович Л.Г., Левкович Е.Н. 1967. Изучение терморезистентности штаммов вирусов комплекса клещевого энцефалита, обладающих различной нейровирулентностью для лабораторных животных. Вопр. вирусологии, № 5, стр. 607-611.

87. Ожерелков С.В., Хозинский В.В., Семенов Б.Ф. 1986. Исследование иммунологических механизмов действия температурных и эмоциональных стресс-факторов при экспериментальных флавивирусных инфекциях. ЖМЭИ, № 12, стр. 95-99.

88. Онищенко Г.Г. 2003. Заболеваемость клещевым энцефалитом в Российской Федерации. В сб. «Эпидемиологическая обстановка и стратегия борьбы с клещевм энцефалитом на современном этапе», М, стр. 5.

89. Павленко Е.В., Леонова Г.Н., Яковлев А.А., Борисова О.Н. 2002. Анализ заболеваемости клещевым энцефалитом в Приморском Крае за период с 1990 по 2000 годы. "Клещевой энцефалит (к 65-летию открытия)", Владивосток, стр. 15-25.

90. Панов А.Г. 1956. Клещевой энцефалит. Ленинград.

91. Панов А.Г. Ильенко В.И. Команденко Н.И. 1977 Некоторые патогенетические механизмы прогредиентных форм клещевого энцефалита. Журнал невропатол. и психиатрии им. С.С. Корсакова, 77, № 2, стр. 161-166.

92. Первиков Ю.В., Эльберт Л.Б., Крутянская Г.Л., Белоцкий С.М., Красильников И.В., Рубин С.Г. 1982. Иммунологический статус людей, привитых различными типами инактивированной вакцины против клещевого энцефалита. Вопр. вирусологии, № 6, стр. 5661.

93. Пиванова Г.П., Баннова Г.Г., Бычкова М.В., Караванов А.С. 1990. Иммуногенная и гемагглютинирующая активность штаммов вируса клещевого энцефалита, выделенных от больных в разных частях нозоареала. Вопр. вирусологии, № 3, стр. 225-239.

94. Пиценко Н.Д., Кветкова Э.А., Илюшенко Л.П., Шаманин В.А. 1990. Персистенция вируса и вирусной РНК у больных клещевым энцефалитом. В сб. «Современные проблемы эпидемиологии, диагностики и профилактики клещевого энцефалита», Иркутск, стр. 121-122.

95. Плетнев А.Г., Ямщиков В.Ф., Блинов В.М. 1989. Нуклеотидная последовательность генома и полная аминокислотная последовательность полипротеина вируса клещевого энцефалита. Биоорг. Химия, т. 15, № 11, стр. 1504-1522.

96. Погодина В.В. 1958. Об устойчивости вируса клещевого энцефалита к действию желудочного сока. Вопр. вирусологии, № 5, стр. 271-275.

97. Погодина В.В. I960. Экспериментальное изучение клещевого энцефалита при алиментарном заражении. Сообщение 1. Динамика распределения вируса в организме белых мышей, зараженных энтерально. Вопр. вирусологии, № 3, стр. 272-279.

98. Погодина В.В., Магазаник С.С. 1961. Изучение процесса скрытой иммунизации при клещевом энцефалите клинико-вирусологическими методами. Тезисы и авторефераты докладов 6 научной сессии ИПВЭ АМН СССР, Москва, стр. 247-248.

99. Погодина В.В., Хань-Ши-Цзе. 1964. Изучение корреляций между патогенностью вирусов группы клещевого энцефалита для животных и особенностями размножения в организме. Вопр. вирусологии, № 6, стр. 682-690.

100. Погодина В.В., Бочкова Н.Г., Корешкова Г.В. 1981. Свойства штаммов серотипа Айна/1448 вируса клещевого энцефалита. Вопр. Вирусологии, № 6, стр. 741-745.

101. Погодина В.В., Ларина Г.И., Фролова М.П., Бочкова Н.Г. 1984. Варианты иммунного ответа хомяков на вирус клещевого энцефалита. Вопр. вирусологии, № 6, стр. 708-715.

102. Погодина В.В., Фролова М.П., Ерман Б.А. 1986. "Хронический клещевой энцефалит". Новосибирск, стр. 152-162.

103. Погодина В.В., Бочкова Н.Г., Левина Л.С., Фролова Т.В., Трухина А.Г., Фролова М.П., Маленко Г.В. 2002. Комплексная характеристика сибирского подтипа вируса клещевого энцефалита. "Клещевой энцефалит (к 65-летию открытия)", стр. 72-87.

104. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. 2000. Иммунология. Мир, М, 450 стр.

105. Семенов Б.Ф., Варгин В.В., Хозинский В.В. 1974. Иммунопатологические реакции, воспроизводимые с арбовирусами. Вестник АМН СССР, №11, стр. 38-40.

106. Семенов Б.Ф. 1989. Иммунология флавивирусных инфекций. В сб. «Арбовирусы и арбовирусные инфекции», М., стр.33-34.

107. Смородинцев А.А., Дробышевская А.И., Ильенко В.И., Алексеев Б.П., Гуламова В.П., Федорчук JT.B. 1954. Этиология и эпидемиология новой нейровирусной инфекции -двухволнового вирусного менингоэнцефалита. В сб. «Нейровирусные инфекции», J1., стр. 634.

108. Соловьев В.Д. 1943. Иммунитет при весенне-летнем энцефалите. Невропат, и псих., № 3, стр. 42-48.

109. Сомова-Исачкова J1.M., Фролова М.П., Леонова Г.Н., Погодина В.В., Фисенко А.Ю. Сравнительная патогистология клещевых энцефалитов в Приморском Крае. "Клещевой энцефалит (к 65-летию открытия)», Владивосток, стр. 26-38.

110. Степанова Л.Г., Шухмина Н.Р., Анджапаридзе О.Г. 1970. Изучение изменчивости вируса клещевого энцефалита, сообщение 6. Некоторые вопросы иммуногенеза при вакцинации мышей аттенуированным штаммом И-40 Д. Вопр. вирусологии, № 4, стр.405-408.

111. Сурова Ю.Ю., Стронин О.В., Соляник Р.Г., Билалова Г.П. 2002. Динамика формирования специфического иммунитета при вакцинации против клещевого энцефалита. "Клещевой энцефалит (к 65-летию открытия)", Владивосток, стр. 170-179.

112. Сысолятин В.А., Селюта И.А., Караванов А.С. 1990. Особенности иммунного ответа у больных клещевым энцефалитом. В сб. «Современные проблемы эпидемиологии, диагностики и профилактики клещевого энцефалита», Иркутск, стр. 125-126.

113. Телиш В.М., Семенов Б.Ф., Хозинский В.В. 1977. Демонстрация in vitro цитотоксической активности спленоцитов, сенсибилизированных к вирусу клещевого энцефалита. Вопр. вирусологии, № 5, стр. 568-570.

114. Тимаков В.Д., Зуев В.А. 1977. Медленные инфекции. М., 286 стр.

115. Тимофеев А.В., Эльберт Л.Б. Терлецкая Е.Н. 1987. Применение прямого твердофазного иммуноферментного анализа для оценки иммунологической активности вакцины против клещевого энцефалита. Журнал микробиологии, № 9, стр. 89-93.

116. Топчий М.К., Корнюшенко Н.П. 1967. Руководство к практическим занятиям по вирусологии. Киев: Издательство Киевского Университета, стр. 248.

117. Уманский К.Г. 1977. К патогенезу прогредиентных форм клещевого энцефалита. Журнал невропатол. и психиатрии им. С.С. Корсакова, 77, № 2, стр. 166- 171.

118. Усебаева Г.К., Карпович Л.Г., Левкович Е.Н. 1970. Особенности патогенеза инфекции у мышей, вызванной вирулентными и аттенуированными вариантами вирусов клещевого энцефалита и лангат. Вопр. вирусологии, № 4, стр. 482-488.

119. Фокина Г.И., Погодина В.В., Маленко Г.В. 1986. Приматы как лабораторная модель вирусной персистенции и хронического течения вирусных энцефалитов. Вестник АМН СССР, №3.

120. Хаитов P.M., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г. 2000. Иммунология. Медицина,1. М.

121. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. 2000. Современные представления о защите организма от инфекции. Иммунология, № 1, стр. 61-64.

122. Хань-Ши- Цзе, Погодина В.В. 1964. Применение метода флуоресцирующих антител для изучения инфекции, вызванной вирусом восточного клещевого энцефалита у мышей, хомяков и поросят. Acta Virol., № 8, 22-29.

123. Хозинский В.В., Семенов Б.В. 1980. Защитное и повреждающее действие цитотоксических Т-лимфоцитов при экспериментальном клещевом энцефалите. ЖМЭИ, № 4, стр. 56-59.

124. Хозинский В.В., Семенов Б.В. 1981. Неспецифические Т-супрессоры при экспериментальном клещевом энцефалите. Acta Virol., № 25, стр. 277-282.

125. Хозинский В.В., Семенов Б.В. 1981. Неспецифические иммунорегуляторные клетки при экспериментальных буньявирусной и флавивирусной инфекциях. Иммунология, № 1, стр. 55-58.

126. Хотлубей Л.И., Первиков Ю.В., Крутянская Г.Л., Вильнер Л.М., Семенов Б.Ф., Эльберт Л.Б. 1982. Концентрированная очищенная вакцина против клещевого энцефалита, иммунологическая оценка в опытах на мышах. Вопр. вирусологии, № 3, стр. 60-64.

127. Черницына Л.О. 1990. Клинико-иммуногенетический анализ клещевого энцефалита у городского населения Западной Сибири. Автореферат канд. дисс., Новосибирск.

128. Черницына Л.О., Коненков В.И., Иерусалимский А.П., Прокофьев В.Ф. 1991. Неоднородная последовательная процедура анализа генетических маркеров в разработке методов индивидуального прогноза исхода клещевого энцефалита. Иммунология, № 6, стр. 56-59.

129. Черницына Л.О., Коненков В.И.,Илюшенко Л.П., Прокофьев В.Ф. 1994. Ассоциированность аллельных вариантов генов HLA-комплекса класса 1 с интенсивностью гуморального иммунного ответа к антигенам вируса клещевого энцефалита в процессе заболевания.

130. Чумаков М.П., Зейтленок Н.А. 1939. Клещевой весенне-летний энцефалит на Урале и в Приуралье. Архив биол. наук, т. 56, № 2, стр. 112-120.

131. Чумаков М.П., Воробьева Н.Н., Беляева А.П. 1944. Изучение ультравирусных энцефалитов. Сообщ 3. Кожевниковская эпилепсия и клещевой энцефалит. Журнал невропатол. и психиатр. 1944, 13, №2, стр. 65-68.

132. Чунихин С.П., Дживанян Т.И. 1977. «Экологические маркеры» арбовирусов. ДС-мркер вируса клещевого энцефалитаю Вестник АМН СССРб № 5, стр. 17-21.

133. Чунихин С.П., Леонова Г.Н. 1985. Экология и геогрфическое распространение арбовирусов. М, Медицина, 126 стр.

134. Чунихин С.П., Решетников И.Н., Ляпустин В.Н. 1986. Изменчивость вируса клещевого энцефалита при пассировании через иксодовых клещей и мелких млекопитающих. Мед. паразитология и паразитарные болезни, № 6, стр.58-61.

135. Шаповал А.Н. 1965. Стертые формы клещевого энцефалита. В кн. "Клещевой энцефалит", Минск, стр. 322-328.

136. Шаповал А.Н. 1980. Клещевой энцефаломиелит. Ленинград, "Медицина".

137. Шен P.M., Дробышевская А.И. 1948. Морфология дальневосточного клещевого энцефалита. Вопр. мед. вирусологии. М, вып.1, стр. 302-316.

138. Ярилин, А.А. 1997. Система цитокинов и принципы ее функционирования в норме и патологии. Иммунология, № 5, стр. 7-13.

139. Albrecht P. 1962. Pathogenesis of experimental infection with tick-borne encephalitis virus. Biology of virus of tick-borne encephalitis complex. Praha. 1962. p. 247-257.

140. Allison S.L., Schalish J., Stiasny K., Mandl C.W., Kunz C., Heinz F.X. 1995. Oligomeric rearrangement of tick-borne encephalitis virus envelope proteins included by an acidic pH. J. Virol., 69, p. 695-700.

141. Allison S.L., Stiasny K., Mandl C.W. and Heinz F.X. 1999. Mapping of functional elements in the stem-anchor region of tick-borne encephalitis virus envelope protein E. J.Virol., 73, p. 5605-5612.

142. Allison, S.L., Schalich J., Stiasny, K., Mandl, C.W. and Heinz, F.X. 2001. Mutational evidence for an internal fusion peptide in flavivirus envelope protein E. J. Virol., 75, p. 4268-4275.

143. Anderson R., King A.D., Innis B.L. 1992. Correlation of E protein binding with cell susceptibility to dengue 4 virus infection. J.Gen.Virol., 73, p. 2155-2159.

144. Asensio V.C., Campbell I.L. 1997. Chemokine gene expression in the brains of mice with lymphocytic choriomeningitis. J. Virol., 71, p. 7832-7840.

145. Atrasheuskaya A.V., Fredeking T.M., Ignatyev G.M. 2003. Chenges in immune parameters and their correction in human cases of tick-borne encephalitis. Clin. Exp. Immunol., 131, p. 148-154.

146. Avery P.R., Hoover A. 2004. Gamma interferon/interleukin 10 balanse in tissue lymphocytes correlates with down modulation of mucosal feline immunodeficiency virus infection. J. Virol., 78, 8, p. 4011-4019.

147. Bazan J.F., Fletterick RJ. 1989. Detection of a tripsin-like serine protease domain in flaviviruses and pestiviruses. Virology, 171, p. 637-639.

148. Bernard K.A., Klimstra W.B., Johnston R.E. 2000. Mutations in the E2 glycoprotein of Venezuelan equine encephalitis virus confer heparan sulfate interaction, low morbidity, and rapin clearance from blood of mice. Virology, 276, p. 93-103.

149. Binder G., Griffin D. 2001. Interferon-y-mediated site specific clearance of alphavirus from CNS neurons. Science, 293, p. 303-306.

150. Biron Ch.A., Sen G.C. 2001. Interferons and other Cytokines. In: Fields Virology. Ed D.M. Knipe, P.M. Howley et al. Lippicott Williams & Wilkins, Philadelphia, p. 321-351.

151. Blok J., McWilliam M., Butler H.C. 1992. Comparison of a dengue-2 virus and its candidate vaccine derivative: sequence relationships with the flaviviruses and other viruses. Virology, 187, p. 573-590.

152. Brinton M.A., Despoto J.H. 1988. Sequence and secondary structure analysis of the 5"-terminal region of flavivirus genome RNA. Virology, 162, p. 290-299.

153. Bukowski J.F., Kurane I., Lai C.-J., Bray M., Falgout В., Ennis F.A. 1989. Dengue virus-specific cross-reactive CD8+ humen cytotoxic T cells. J. Virol., 63, p. 5086-5091.

154. Byrnes A.P., Griffin D.E. 1998. Binding of Sindbis virus to cell surface heparan sulfate. J. Virol., 74, p. 7349-7356.

155. Byrnes A.P., Griffin D.E. 2000. Large-plaque mutants of Sindbis virus show redused binding to heparan sulfate, heightened viremia, and slower clearance from the circulation. J. Virol., 74, p. 644-651.

156. Cahour A., Pletnev A., Vazeille-falcoz V., Rosen L., Lai C-J. 1995. Growth-restricted Dengue virus mutants containing deletions in the 5'-noncoding region of the RNA genome. Virology, 207, p. 68-77.

157. Cardiff R.D., McCloud T.G., Russel P.K. 1970. Molecular size and charge relationships of the soluble complement-fixing antigens of dengue virus. Virology, 41, p. 569-572.

158. Casals S., Webster L.T. 1944. J. Exp. Med., 79, p. 45-63.

159. Castle E., Leidner U., Nowak Т., Wengler G. and Wengler G. 1986. Primary structure of the West Nile flavivirus genome region coding for all nonstructural proteins. Virology, 149, p. 10-26.

160. Cecilia D., Gould E.A. 1991. Nucleotide changes responsible for loss of neuroinvasiveness in Japanese encephalitis virus neutralization-resistant mutants. Virology, 181, p. 70-77.

161. Chambers T.J., Hahn C.S., Galler R., Rice, C.M. 1990. Flavivirus genome organization, expression and replication. Annual Review of Microbiology, 44, p. 649-688.

162. Chen L.-K., Lin Y.-L., Liao C.-L., Lin C.-G., Huang Y.-L., Yen C.-T. 1996. Generation and characterization of organ-tropism mutants of Japanese encephalitis virus in vivi and in vitro. Virology, 223, p. 79-88.

163. Chunikhin S.P., Dzhivanyan T.I. 1979. Ecological markers of arboviruses. Arctic and Tropical Arboviruses. Ed. E. Kurstak. Academic Press, New York, p. 297-302.

164. Cohen J. 1993. Naked DNA points way to vaccines. Science, Vol. 259, p. 1691-1692.

165. Despres P., Dietrich J., Girard M., Bouloy M. 1991. Recombinant baculoviruses expressing yellow fever virus E and NS1 proteins elicit protective immunity in mice. J. Gen. Virol., 72, p. 2811-2816.

166. Dumpis U., Crook D., Oksi J. 1999. Tick-Borne Encephalitis. Clinical infect, diseases, 28, p. 882-90.

167. Dzhivanyan T.I., Lashkevich V.A., Bannova G.G. 1974. On the possible assosiation of the DS marker of tick-borne encephalitis virus strains with species of tick vectors. Arch. Gess. Virusforsch, 45, p. 209-214.

168. Ecker M., Allison S.L., Meixner T. and Heinz F.X. 1999. Sequence analysis and genetic classification of tick- borne encephalitis viruses from Europe and Asia. J. of Gen. Virology, 80, p. 179-185.

169. Falgout В., Chanock R., Lai C.-J. 1989. Proper processing of dengue virus nonstructural glycoprotein NSl recuires the N-terminalhidrophobic signal secuence and the downstream nonstructural protein NS2a. J. Virol., 63., p. 1852-1860.

170. Falgout В., Markoff. 1995. Evidence that flavivirus NSl-NS2a cleavage is mediated by a membrane-bound host protease in the endoplasmic reticulum. J. Virol., 69, p. 7232-7243.

171. Falker W.A., Diwan A.R., Halstead S.B. 1973. Human antibody to dengue soluble-complement fixing (SCF) antigens. J. Immunol., 111, p. 1804-1809.

172. Fiedler K., Simons K. 1995. The role of N-linked glycans in the secretory pathway. Cell, 81, p. 309-312.

173. Frei K., Malipiero U.V., Leist T.P., Zinkernagel R.M., Schwab M.E., Fontana A. 1989. On the cellular source and function of interleukin 6 produced in the central nervous system in viral diseases. Eur J Immunol., 19, p. 689-94.

174. Gao G.G., Hussain M.H., Reid H.W., Guold E.A. 1994. Identification of naturally occurring monoclonal antibody escape variants of louping ill virus. J. Gen. Virol., 75, p. 609-614.

175. Gaunt M.W., Sail A.A., de Lamballerie X., Falconar A.K.I., Dzhivanian T.I., Gould E.A. 2001. Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their epidemiology, disease association and biogeography. J. Gen. Virol., 82, p. 1867-1876.

176. Gollins S.W., Porterfield J.S. 1986. A new mechanism for the neutralization of enveloped viruses by antiviral antibody. Nature, 321, p. 244-246.

177. Gorbalenya A.E., Donchenko A.P., Koonin E.V., Blinov E.M. 1989. N-terminal domains of putative helicases of flavi — and pestiviruses may be serine proteases. Nucleic Acids Res. 17, p. 3889-3897.

178. Goto A., Hayasaka D., Yoshii K., Mizutani Т., Kariwa H., Takashima I. 2003. A BHK-21 cell culture-adapted tick-borne encephalitis virus mutant is attenuatd for neuroinvasiveness. Vaccine, 21, p. 4043-4051.

179. Griffin D.E. 2003. Immune responses to RNA-virus infections of the CNS. Immunology, 3, p. 493-501.

180. Gritsun T.S., Holmes E.C., Gould E.A. 1995. Analysis of flavivirus envelope proteins reveals variable domains thet reflect their antigenicity and may determine their pathogenesis. Virus Res., 35, p. 307-321.

181. Gritsun T.S., Desai A., Gould E.A. 2001. The degree of attenuation of tick- borne encephalitis virus depends on the cumulative effects of point mutations. J.Gen.Virol., 82, p. 16671675.

182. Guirakoo F., Heinz F.X., Mandl C.W., Holzmann H., Kunz C. 1991. Fusion activity of flaviviruses: comparison of mature and immature (prM-containing) tick- borne encephalitis virions. J.Gen. Virol., 72, p. 1323-1329.

183. Hahn C.S., Dalrymple J.M., Strauss 1987. Comparison of the virulent Asibi strain of yellow fever virus with the 17D vaccine strain derived from it. PNAS, 84, p. 2019-2023.

184. Hall R.A., Brand T.N.H., Lobigs M., Sangster M.Y., Howard M.J., Mackenzie J.S. 1996. Protective immune responses to the E and NS1 proteins of Murray Valley encephalitis virus in hybrids of flavivirus-resistant mice. J. Gen. Virol., 77, p. 1287-1294.

185. Harrison J.K. et al. 1998. Role for neuronally derived fractalkine in mediating interations between neurons and CX3CR1-expressing microglia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, p. 10896-10901.

186. Hase Т., Summers P.L., Eckeles K.H. Putnak, J.P. 1989 Morphogenesis of flaviviruses. In: Virally infected cells. Ed. Herris. Plenum, N.Y., p 275-308.

187. Hasegawa H., Yoshida M., Shiosaka Т., Fujita S., Kobayashi Y. 1992. Mutations in the envelope protein of Japanese encephalitis viruses affect entry into cultured cells and virulence in mice. Virology, 191, pp. 158-165.

188. Heinz F.X., Tuma W., Kunz C. 1981. Antigenic and immunogenic properties of defined phyzical forms of tick-borne encephalitis virus structural proteins. Infect. Immun., 33, p. 250-257.

189. Heinz F.X., Berger R„ Tuma W., Kunz C. 1983. A topological and functional model of epitopes on the structural glycoprotein of tick-borne encephalitis virus defined by monoclonal antibodies. Virology, 126, p. 526-537.

190. Heinz F.X. 1986. Epitope mapping of flavivirus glicoproteins. Adv.Virus Res., 31, p. 103-168.

191. Heinz F.X., Mandl C., Guirakhoo F., Holzmann H., Tuma W., Kunz C. 1990. The envelope protein E of tick-borne encephalitis virus and other flaviviruses: atructure, functions and evolutionary relationships. Arch. Virol., suppl. I, p. 125-135.

192. Heinz F.X., Allison S.L., Stiasny K., Schalich J., Holzmann H., Mandl C., Kunz C. 1995. Recombinant and virion-derived soluble and particulate immunogenes for vaccination against tick-borne encephalitis. Vaccines, 13, p. 16-36-1642.

193. Heinz F.X., Allison S.L. 2000. Structures and mechanisms in flavivirus fusion. Adv. Virus Res., 55, p. 231-269.

194. Holbrook M.R., Ni H., Shope R.E., Barrett D.T. 2001. Amono acid substitution(s) in the stem-anchor region of Langat virus envelope protein attenuates mouse neurovirulence. Virilogy, 286, p. 54-61.

195. Holzmann H., Mandl C., Guirakhoo F., Heinz F.X., Kunz C. 1989. Characterization of antigenic variants of of tick-borne encephalitis virus selected with neutralizing monoclonal antibodies. J. Gen. Virol., 70, p. 219-222.

196. Holzmann H., Heinz F.X., Mandl C., Guirakhoo F., Kunz C. 1990. A single amino acid substitution in envelope protein of tick-borne encephalitis virus leads to attenuation in mouse model. J. Virol., 64, p. 5156-5159.

197. Holzmann H., Vorobyova M.S., Ladyzhenskaya I.P., Ferenczi E., Kundi M., Kunz C., Heinz F.X. 1992. Molecular epidemiology of tick-borne encephalitis virus: cross-protection between European and Far Eastern subtypes. Vaccine, 10, p. 345-349.

198. Holzmann H., Stiasny K., Ecker M., Kunz C., Heinz F.X. 1997. Characterization of monoclonal antibody-escape mutants of tick-borne encephalitis virus with reduced neuroinvasiveness in mice. J. Gen. Virol., 78, p. 31-37.

199. Jacobs S.C., Wilkinson G.W.G., Stephenson J.R. 1992. High level expression of TBEV NS1 protein by using an adenovirus-based vector: protection elicited in murine model. J. Virol., 66, p. 2086-2095.

200. Jacobs S.C., Stephenson J.R., Wilkinson G.W.G. 1994. Protection elicited by replication-defective adenovirus vector expressing the tick-borne encephalitis virus non-structural glicoprotein NS1. J. Gen. Virol., 75, p. 2399-2402.

201. Jiang W.R., Lowe A., Higgis S., Reid H., Gould E.A. 1993. Single amino acid codon changes detected in louping ill virus antibody-resistant mutants with reduced neuruvirulence. J. Gen. Virol., 74, p. 931-935.

202. Kawano H., Rostapshov V., Rosen L., Ching-Jun Lai. 1993. Genetic determinants of Dengue type 4 virus neurovirulence for mice. J. Virol., 67, p. 6567-6575.

203. Khozinskaya G.A., Chunikhin S.P., Khozinsky V.V., Stefutkina L.F. 1985. Variability of Powassan virus cultured in tissue explants and organism of Hyalomma anatolicum ticks. Acta virol.,29, p. 305-312.

204. Kimura Т., Griffin D.E. 2000. The role of CD8+ T cells and major histocompatibility complex class I expression in the central nervous system of mice infected with neurovirulent Sindbis virus. J. Vorol. 74, p. 6117-6125.

205. Kjellen L., Lindahl U. 1991. Proteoglycans: structures and interactions. Annu. Rev. Biochem., 60, p. 443-475.

206. Klimstra W.B., Ryman K.D., Johnston R.E. 1998. Adaptation of Sindbis virus to BHK cells selects for use of heparan sulfate as an attachment receptor. J. Vorol., 72, p. 7357-7366.

207. Kobiler D., Lustig S., Gozes Y., Ben-Nathan D., Akov Y. 1989. Sodium dodecyl sulphate induces a breach in the blood-brain barrier and enables a West Nile virus variant to penetrate into mouse brain. Brain Res., 496, p. 314-316.

208. Kofler R.M., Leitner A., O-Riordain G., Heinz F.X., Mandl C.W. 2003. Spontaneous mutations restore the viability of tick-borne encephalitis virus mutants with large deletions in protein C. J. Virol., 77, p. 443-451.

209. Komatsu Т., Ireland D.D., Chen N., Reiss C.S. 1999. Neuronal expression ofNOS-1 is required for host recovery from viral encephalitis. Virology, 258, p. 389-395.

210. Kreil T.R., Eibl M.M., 1995. Viral infection of macrophages profoundly alters requirements for induction of nitric oxide synthesis. Virology, 212, p. 174-178.

211. Kreil T.R., Eibl M.M. 1996. Nitric oxide and viral infection: no antiviral activity against a Flavivirus in vitro, and evidence for contribution to pathogenesis in experimental infection in vivo. Virology, 219, p. 304-306.

212. Kreil T.R., Maier E., Fraiss S., Eibl M.M. 1998. Neutralizing antibodies protect against letal Flavivirus challenge but allow for the development of active humoral immunity to nonstructural virus protein. J. Virol., 72, p. 3076-3081.

213. Kreil T.R., Maier E., Fraiss S., Attakpah E., Burger I., Mannhalter J.W., Eibl M.M. 1998. Vaccination against tick-borne encephalitis virus, a flavivirus, prevents disease bat not infection, although viremia is undetectable. Vaccine, 16, p. 1083-1086.

214. Koonin E.V. 1993. Computer-assisted identification of putative methyl-transferase domain in NS5 protein of flaviviruses and lambda 2 protein of reovirus. J.Gen. Virol., 74, p. 733740.

215. Labuda M., Austin J.A.,Zuffova E., Kozuch 0.,Fuchsberger N., Lysy J., Nuttals P.A. 1996. Importance of lokalized skin infection in TBEV transmission. Virology, 219, pp. 357-366.

216. Laemmli V.K. 1970. Clevage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227, p. 680-685.

217. Lane Т.Е. et al. 1998. Dinamic regulation of a- and p-chemokine expression in the central nervous system during mouse hepatitis virus-induced demyelinating disease. J. Immunol., 160, pp. 970-978.

218. Lee J.M., Crooks A.J., Stephenson J.R. 1989. The synthesis and maturation of a nonstructural extracellular antigen from tick-borne encephalitis virus and its relationship to the intracellular NS1 protein. J.Gen. Virol., 70, p. 335-343.

219. Lee E. and Lobigs M. 2000. Substitutions at the putative receptor-binding site of an encephalitic flavivirus alter virulence and host cell tropism and reveal a role for glycosaminoglycans in entry. J. Virol., 74, p. 8867-8875.

220. Lee E. and Lobigs M. 2002. Mechanism of virulence attenuation of glycosaminoglycan-binding variants of japanese encephalitis virus and murray valley encephalitis virus. J. Virol., 76, p. 4901-4911.

221. Levine B. et al. 1991. Antibody-mediated clearance clearance of alphavirus infection from neurons. Science, 254, p. 856-860.

222. Lieberman A.P., Pitha P.M., Shin H.S., Shin M.L. 1989. Production of tumor necrosis factor and other cytokines by astrocytes stimulated with lipopolysaccharide or a neurotropic virus. Proc Natl Acad Sci USA, 86, p. 6348-6352.

223. Lin C., Amberg S.M., Chambers T.J., Rice C.M. 1993. Cleavage at a novel site in the NS4A region by the yellow fever virus NS2B-3 proteinase is a prerequestt for processing at the downstream 4A/4B signalase site. J. Virol., 67, p 2327-2335.

224. Lin Yi.L., Chen L.K., Liao C.L. 1998. A highly attenuated strain of Japanese encephalitis virus induces a protective immune response in mice. J. Virol., 72, p. 191-200.

225. Lindenbach B.D., Rice C.M. 1999. Genetic interaction of flavivirus nonstructural proteins NS1 and NS4A as a determinant of replicase function. J. Virol., 73, p. 4611—4621.

226. Lindenbach B.D. and Rice C.M. 2001. Flaviviridae: the Viruses and Their Replication. In: Fields Virology. Ed. D.M. Knipe, P.M. Howley. Lippicott Williams & Wilkins, Philadelphia, p. 991-1043.

227. Lindsley M.D., Rodriguez M. 1989. Characterization of the inflamatory response in the central nervous system of mice susceptible or resistant to demyelination by Theiler's virus. J. Immunol., 142, p. 2677-2682.

228. Liou V.L., Hsu C.Y. 1998. Japanese encephalitis virus is transported across the cerebral blood vessels by endocytosis in mouse brain. Cell Tissue Res., 293, p. 389-394.

229. Lobigs M., Usha R., Nestorowicz A., Marshall I.D., Weir R.C., Dalgarno L. 1990. Host cell selection of Murray Valley encephalitis virus variants altered at an RGD sequence in the envelope protein and in mouse virulence. Virology, 176, p. 587-595.

230. Lobigs M., Arthur C.E., Mullbacher A., Blanden R.V. 1994. The Flavivirus nonstructural protein NS3 is a dominant sourse of citotoxic T cell peptide dominants. Virology, 202, p. 195-201.

231. Lobigs M., Mullbacher A.,Wang Y., Pavy M., Lee E. 2003. Role of type I and II interferon responses in recovery from infection with an encephalitic flavivirus. J. Gen. Virol., 84, p. 567-572.

232. Lundkvist A., Vene S., Golovljova I., Mavtchoutko V., Forsgren M., Kalnina V., Plyusnin A. 2001. Characterization of tick-borne encephalitis virus from Latvia: evidence for co-circulation of three distinct subtypes. J. Medical Virol., 65, p. 730-735.

233. Lyon M., Deakin J.A., Gallagher. 1994. Liver heparan sulfate structure. A novel molecular design. J. Biol. Chem., 269, p. 11208-11215.

234. Mackenzie J.M., Jones M.K., Young P.R. 1996. Immunolocalization of the dengue virus nonstructural glycoprotein NS1 suggests a role in viral RNA replication. Virology, 220, p. 232-240.

235. Maldov D.G., Karganova G.G., Timofeev A.V. 1992. Tick-borne encephalitis virus interaction with the target cells. Arch. Virol., 127, p. 321-325.

236. Mandl C.W., Heinz F.X., Kunz, C. 1988. Sequence of the structural proteins of the tick-borne encephalitis virus (Western subtype) and comparative analysis with other flaviviruses. Virology, 166, p. 197-205.

237. Mandl C.W., Heinz F.X., Stockl E., Kunz C. 1989. Genome sequence of tick-borne encephalitis virus (Western subtype) and comparative analysis of nonstructural proteins with other flaviviruses. Virology, 173, p. 291-301.

238. Mandl C.W., Kunz C. and Heinz F.X. 1991. Presence of poly(A) in a flavivirus: significant differences between the 3" noncoding regions of the genomic RNAs of tick-borne encephalitis virus strains. J.Virol., 65, p. 4070-4077.

239. Mandl C.W., Holzmann H., Kunz C., Heinz F.X. 1993. Complete genomic sequence of Powassan virus: evaluation of genetic elements in tick-borne versus mosquito-borne flaviviruses. Virology, 194, p. 173-184.

240. Mandl, C.W., Allison, S.L., Holzmann, H., Meixner Т., Heinz, F.X. 2000. Attenuation of tick-borne encephalitis virus by structure-based site-specific mutagenesis of a putative Flavivirus receptor binding site. J. Virol., 74, p. 9601-9609.

241. McArtur M.A., Suderman M.T., Mutebi J.P., Xiao S.Y., Barrett D.T. 2003. Molecular characterization of a hamster viscerotropic strain of yellow fever virus. J. Virol., 77, p. 1462-1468.

242. McMinn P.C., Lee E., Hartley S., Roehrig J.T., Dalgarno L., Weir R.C. 1995. Murray Valley encephalitis virus envelope protein antigenic variants with altered haemagglutination properties and reduced neuroinvasivness in mice. Virol., 211, p. 10-20.

243. McMinn P.C., Dalgarno L., Weir R.C. 1996. A comparison of the spread of Murray Valley encephalitis viruses of high or low neuroinvasiveness in the tissues of Swiss mice after peripheral inoculation. Virol., 220, p. 414-423.

244. McMinn P.C., Weir R.C., Dalgarno L. 1996. A mouse-attenuated envelope protein variant of Murray Valley encephalitis virus with altered fusion activity. J. Gen. Virol., 77, p. 20852088.

245. McMinn P.C. 1997. The molecular basis of virulence of encephalitogenic flaviviruses. J. Gen. Virol.,78, p. 2711-2722.

246. Mims C.A. 1964. Aspects of the pathogenesis of virus diseases. Bacteriological reviews, 28, № l,p. 30-71.

247. Monath T.P. 1986. Pathobiology of the flaviviruses. In: The Togaviridae and Flaviviridae. Shlesinger S., Shlesinger M.J., eds. New York: Plenum Press, p. 375-440.

248. Monath T.P. & Heinz F.X., 1996. Flaviviruses. In: "Fields Virology". Ed. B.N.Fields D.M.Knipe, P.M.Howley et al. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, p. 961-1034.

249. Murray J.M., Aaskov J.G., Wright P.J. 1993. Processing of the dengue virus type 2 proteins prM and C-prM. J. Gen. Virol., 74, p. 175-18

250. Muylaert I.R., Chambers Т.J., Galler R., Rice C.M. 1996. Mutagenesis of the N-linked glycosylation sites of the yellow fever virus NS1 protein: Effects on virus replication and mouse neurovirulence. Virol., 222, p. 159-168.

251. Muylaert I.R., Galler R., Rice C.M. 1997. Genetic analysis of yellow fever virus NS1 protein: identification of a temperature-sensitive mutation which blocks RNA accumulation. J. Virol., 71, p. 291-298.

252. Neumann H., Schmidt H., Wihharm E., Behrens L., Wekerle H. 1997. Interferon у gene expression in sensory neurons: evidence for autocrine gene regulation. J. Exp. Med., 186, p. 2023-2031.

253. Ni H., Chang G.-J.J., Xie H., Trent D.W., Barrett A.D.T. 1995. Molecular basis of attenuation of neurovirulence of wild-type Japanese encephalitis virus strain SA14. J. Gen. Virol., 76, p. 409-413.

254. Niedrig M., Klockmann U., Lang W., Roeder J., Burk S., Modrou S., Pauli G. 1994. Monoclonal antibodies directed against tick-borne encephalitis virus with neutralizing activity in vivo. Acta Virol., 38, p. 141-149.

255. Nitayaphan S., Grant J.A., Chang G.J. 1990. Nucleotide sequense of the virulent SA-14 strain of Japanese encephalitis virus and its attenuated vaccine derivative, SA-14-14-2. Virol., 177, p. 541-552.

256. Ng M.L., Lau L.C.L. 1988. Possible involvement of receptors in the entry of Kunjin virus into Vera cells. Arch. Virol., 100, p. 199-211.

257. Nowak T, Wengler G. 1987. Analysis of the disulfides present in the membrane proteins of the West Nile flavivirus. Virology, 156, p. 127-137.

258. Oschmann P., Kraiczy P., Halperin J., Brade V. 1999. Lyme borreliosis and tick-borne encephalitis. UNI-MED Verlag AG, Bremen, Germany, International Medical Publishers, 156 p.

259. Parra В., Hinton D.R., Lin M.T., Cua D.J., Stohlman S.A. 1997. Kinetics of cytokine mRNA expression in the central nervous system following lethal and nonlethal coronavirus-indused acute encephalomyelitis. Virol., 223, p. 260-270.

260. Parrish C.R., Woo W.S., Wright P.J. 1991. Expression of the NS1 gene of dengue virus type 2 using vaccina virus. Dimerisation of the NS1 glycoprotein. Arch.Virol., 117, p. 279286.

261. Phillpotts R.J., Stephenson J.R., Porterfield J.S. 1987. Passive immunization of mice with monoclonal antibodies raised against tick-borne encephalitis virus. Brief report. Arch. Virol., 93, p. 295-301.

262. Pletnev A.G., Yamshchikov V.F., Blinov V.M. 1986. Tick-borne encephalitis virus genome. The nucleotide sequence coding for virion structural proteins. FEBS Lett., 200, p. 317321.

263. Pletnev A.G., Yamshchikov V.F., Blinov V.M. 1990. Nucleotide sequence of the genome and complete amino acid sequence of the polyprotein of tick-borne encephalitis virus. Virol., 174, p. 250-263.

264. Pletnev A.G., Bray C.J., Lai C.J. 1993. Chimeric of tick-borne encephalitis and dengue type 4 viruses: effects of mutations on neurovirulence in mice. J. Virol., 67, p. 4956-4963.

265. Proutski V., Gould E.A., Holmes E.C. 1997. Secondary structure of the 3" untranslated region of flaviviruses: similarities and differences. Nucl. Acids Res., 25, p. 1194-1202.

266. Pryor M.J., Wright P.J. 1993. The effects of site-directed mutagenesis on the dimerization and secretion of the NS1 protein specified by dengue virus. Virol., 194, p. 769-780.

267. Pryor M.J., Gualano R.C., Lin В., et al. 1998. Growth restriction of dengue virus type 2 by site-specific mutagenesis of virus-encoded glycoproteins. J. Gen. Virol., 79, p. 2631— 2639.

268. Rappert A. et al. 2002. Secondary lymphoid tissue chemokine (CCL21) activates CXCR3 trigger a CI(-) current and chemotaxis in murine microglia. J. Immunol., 168, pp. 32213226.

269. Rauscher S., Flamm C.W., Mandl C.W., Heinz F.X., Stadler P.F. 1997. Secondary structure of the З'-noncoding region of flavivirus genomes: comparative analysis of base pairing probabilities. RNA, 3, p. 779-791.

270. Rey F.A., Heinz F.X., Mandl C.W., Kunz C., Harrison S.C. 1995. The envelope glycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2 A resolution. Nature, 375, p. 292-297.

271. Rice C.M., Lenches E.M., Eddy S.R., Shin S.J., Sheets R.L., Strauss, J.H. 1985. Nucleotide sequence of yellow fever virus: implication for flavivirus gene expression and evolution. Science, 229, p. 726-733.

272. Rice C.M., Strauss E.J., Strauss J.H. 1986. Structure of the flavivirus genome. In: "The Togaviridae and Flaviviridae". Eds. Schlesinger, S., Schlesinger,M.J. N.Y.: Plenum, pp 276326.

273. Rice, C.M. 1996. Flaviviridae: the viruses and their replication. In: "Fields Virology". Ed. B.N.Fields, D.M.Knipe, P.M.Howley et al. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia: p. 931959.

274. Roehrig J.T., Hunt A.R., Johnson A.J. et al. 1989. Synthetic peptides derived from the deduced amino acid sequence of the E-glycoprotein of Murray Valley encephalitis virus elicit antiviral antibody. Virol., 171, p. 49-60.

275. Rostland K.S., Esko J.D. 1997. Microbial adherence to and invasion through proteoglycans. Infect. Immun., 65, p. 1-8.

276. Rothman A.L., Kurane I., Lai C.-J., Bray M., Falgout В., Men R., Ennis F.A. 1993. Dengue virus protein recognition by virus-specific murine CD8+ cytotoxoc lymphocytes. J. Virol., 67, p. 801-806.

277. Russell, P.K., Brandt, W.E., Dalrymple, J.M. 1980. Chemical and antigenic structure of flaviviruses. In "The Togaviruses: Biology, Structure, Replication" (Ed. R.W.Schlesinger,), Academic Press, New York, p. 503-529.

278. Ryan M.D., Monaghan S., Flint M. 1998. Virus-encoded proteinases of the Flaviviridae. J.Gen. Virol., 79, p. 947-959.

279. Ryman K.D., Xie H., Neil Ledger Т., Campbell G.A., Barrett A.D.T. 1997. Antigenic variants of Yellow Fever virus with an altered neurovirulence phenotype in mice. Virology, 230, p.v 376-380.

280. Ryman K.D., Neil Ledger Т., Campbell G.A., Watowich S.J., Barrett A.D.T. 1998. Mutation in 17D-204 vaccine substrain-specific envelope protein epitope alters the pathogenesis of Yellow Fever virus in mice. Virology, 244, p. 59-65.

281. Sanches I.J., Ruiz B.H. 1996. A single nucleotide cgange in the E protein of dengue virus 2 Mexican strain affects neuruvirulence in mice. J. Gen. Virol., 77, p. 2541-2545.

282. Sambrook J., Fritsch E.R., Maniatis T. 1989. Molecular cloning Laboratory manuals.

283. Schlesinger J.J., Brandiss M.W., Cropp C.B., Monath T.P. 1986. Protection against yellow fever in monkeys by immunization with yellow fever non-structural protein 1. Virology, 60, p. 1153-1155.

284. Spector T. 1978. Analyt. Biochem., 86, p. 142-146.

285. Sprent J. 1994. T and В memory cells. Cell, 76, p. 315-322.

286. Stiasny K., Allison S.L., Marchler-Bauer A., Kunz C., Heinz F.X. 1996. Structural requirement for low-pH-induced rearragements in the envelope glycoprotein of tick-borne encephalitis virus. J. Virol., 70, p. 8142-8147.

287. Sumiyoshi H., Tignor G.H., Shope R.E. 1995. Characterization of a highly attenuated Japanese encephalitis virus generated from molecularly cloned cDNA. J. Infect. Diseases, 171, p. 1144-1151.

288. Svitkin Y.V., Ugarova T.Y., Chernovskaya T.V., Lyapustin V.N., Lashkevich V.A., Agol V.I. 1981. Translation of tick-borne encephalitis virus (Flavivirus) genome in vitro: synthesis of two structural polypeptides. Virology, 110, p. 26-34.

289. Takashima I., Morita K., Chiba M., Hashimoto N. 1997. A case of tick-borne encephalitis in Japan and isolation of the virus. J. Clin. Microbiol., 35, p. 1843-1947.

290. Timofeev A.V., Kushch A.A., Vorovitch M.F., Tugizov S.M., Elbert L.B., Lvov D.K. 1990. A study of the NS3 nonstructural protein of tick-borne encephalitis virus using monoclonal antibodies against the virus, arch. Virol., Suppl.l, p. 119-124.

291. Van der Poll T, Jansen J., Levi M. 1994. Regulation of interleukin 10 release by tumor necrosis factor in humans and chimpanzees. J. Exp. Med., 180, p. 1985-1988.

292. Volkova T.D., Vorovitch M.F., Ivanov V.T., Timofeev A.V., Volpina O.M. 1999. A monoclonal antibody thet recognizes the predicted tick-borne encephalitis virus E protein fusion sequence blocks fusion. Arch. Virol., 144, p. 1035-1039.

293. Vorovitch M.F., Timofeev A.V., Atanadze S.N., Tugizov S.M., Kushch A.A., Elbert L.B. 1991. pH- dependent fusion of tick-borne encephalitis virus with artificial membranes. Arch. Virol., 118, p. 133-138.

294. Wallner G., Mandl C.W., Kunz C., Heinz F.X. 1995. The flavivirus З'-noncoding region: extensive size heterogeneity independent of evolutionary relationshipsamong strains of tick-borne encephalitis virus. Virol., 213, p.169-178.

295. Wallner G., Mandl C.W., Ecker M. 1996. Characterization and complete genome sequences of high- and low-virulence variants of tick-borne encephalitis virus. J. Gen. Virol., 77, p. 1035-1042.

296. Wengler G., Wengler G. 1989. Cell-assosiated West Nile flavivirus is covered with E + prM proyein heterodimers which are destroyed and reorganized by proteolytic clevage during virus release. J.Virol., 63, p. 2521-2526.

297. Wesselingh S.L., Levine В., Fox R.J., Choi S., Griffin D.E. 1994. Intracerebral cytokine mRNA expression during fatal and nonfatal alphavirus encephalitis suggests a predominant type 2 T cell response. J. Immunol., 152, p. 1289-1297.

298. Westaway E.G., Mackenzie J.M., Kenney M.T. 1997. Ultrastructure of Kunjin virus-infected cells: Colocalization of NS1 and NS3\ with double-stranded RNA, and of NS2B with NS3, in virus-induced membrane structures. J. Virol., 71, p. 6650-6661.

299. Whitton J.L., Oldstone M.B.A. 2001. The immune response to viruses. In: Fields Virology. Ed. D.M. Rnipe, P.M. Howley et al. Lippicott Williams & Wilkins, Philadelphia, p. 285320.

300. Winkler G., Maxwell S.E., Ruemmler C., Stollar V. 1989. Newly synthesized dengue-2 virus nonstructural protein NS1 is a soluble protein but becomes partially hydrophobic and membrane-associated after dimerization. Virol., 171, p. 302-305.

301. Winkler G., Randolph V.B., Cleaves G.R., Ryan Т.Е., Stollar V. 1988. Evidence that the mature form of the flavivirus nonstructural protein NS1 is a dimer. Virol., 162, p. 187-196.

Информация о работе

Кондратьева, Ярослава Юрьевна
кандидата медицинских наук
Московская обл., 2005
ВАК 03.00.06

Диссертация

Особенности экспериментальной инфекции, вызванной вариантами вируса клещевого энцефалита с высокой и низкой нейроинвазивностью - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Особенности экспериментальной инфекции, вызванной вариантами вируса клещевого энцефалита с высокой и низкой нейроинвазивностью - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы