Механизмы микроэволюции вируса клещевого энцефалита

Карганова, Галина Григорьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Механизмы микроэволюции вируса клещевого энцефалита
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Механизмы микроэволюции вируса клещевого энцефалита"

На правах рукописи и«-"'

Карганова Галина Григорьевна

МЕХАНИЗМЫ МИКРОЭВОЛЮЦИИ ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА

03.00.06 - вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

^ /

МОСКВА-2009

1 [|

003472687

На правах рукописи

Карганова Галина Григорьевна

МЕХАНИЗМЫ МИКРОЭВОЛЮЦИИ ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА

03.00.06 - вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

МОСКВА-2009

Работа выполнена в Государственном учреждении Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П. Чумакова РАМН

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН

Дашкевич Василий Андреевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, академик РАМН

Зверев Виталий Васильевич

доктор биологических наук, профессор

Гараев Мансур Мухамедович доктор биологических наук, старший научный сотрудник

Калинина Наталья Олеговна

Ведущая организация:

Государственное учреждение Научно-Исследовательский Институт вирусологии

имени Д.И. Ивановского РАМН

Защита состоится « /9 »2009 г. в '¡¿¿час.^'^мин. на заседании диссертационного совета Д 001.026.01 при Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН по адресу 142782, Московская обл., п/о Институт полиомиелита.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им М.П. Чумакова РАМН (142782, Московская обл., п/о Институт полиомиелита).

Автореферат разослан «Д» ЫлО^Л^ 2009 г. Ученый секретарь

диссертационного совета к.б.н. // , п у

А/М/к

/Медведкина О.А./

■// /'лУ Л-А,

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Высокий риск инфицирования, широкое распространение и тяжесть заболевания делают клещевой энцефалит (КЭ) одной из самых актуальных природно-очаговых вирусных инфекций в России. Для заболеваемости этой инфекцией характерна цикличность, и в последнее время наблюдается ее снижение по сравнению с 1999 годом, когда в России было зарегистрировано более 10000 случаев КЭ. Несмотря на это, эпидемиологическая ситуация остается напряженной. Клещевой энцефалит распространен на территории 50 субъектов РФ. Число регистрируемых случаев в последнее время превышает 2000 в год, около трети которых протекает с остаточными осложнениями разной степени тяжести, часто приводящими к инвалидности. У 1-5% пациентов КЭ переходит в хроническую форму. Предыдущие 20 лет характеризовались повсеместным увеличением численности клещей-переносчиков вируса КЭ (ВКЭ), расширением ареала инфекции, увеличением группы риска за счет городских жителей до практически всего населения, проживающего на эндемичных территориях, а также большим числом смешанных вирусных и бактериальных переносимых клещами инфекций.

Цикличность и географическая неравномерность заболеваемости КЭ определяются многими факторами, в том числе, числом и видом клещей-переносчиков, их зараженностью ВКЭ, численностью и видами прокормителей, количеством восприимчивого населения, свойствами циркулирующего вируса и наличием в клещах возбудителей сопутствующих инфекций.

Постоянный комплексный мониторинг эпидемиологической и эпизоотологической ситуации в очагах и понимание связи эпизоотологических характеристик и заболеваемости КЭ могут дать информацию, позволяющую делать как краткосрочные прогнозы, так и разрабатывать сценарии изменения риска заболевания КЭ в зависимости от изменения климата, проведения профилактических мероприятий, антропогенного и других воздействий на биоценоз, а также предсказывать появление новых эпидемически важных вариантов этого вируса. Очевидно, что для этого необходимо изучение механизмов взаимодействия всех звеньев паразитарной системы: прокормитель -клещ - вирус.

вариантов этого вируса. Тем не менее, полученной информации недостаточно для объяснения различных уровней заболеваемости в разных регионах России. Остаются открытыми вопросы о том, какие факторы определяют активность очагов, цикличность подъема заболеваемости, и существует ли связь между уровнем заболеваемости и вирулентностью циркулирующих вариантов ВКЭ в данном региоие.

Современные достижения в молекулярной биологии и вирусологии позволяют изучать вирусы на популяционном уровне, оценивать гетерогенность популяции и влияние этой гетерогенности на основные характеристики вируса, в том числе и патогенетические.

Настоящая работа посвящена исследованию механизмов микроэволюции ВКЭ. Популяционный подход при изучении арбовирусов, специфики поведения вирусной популяции при чередовании хозяев (членистоногие-прокормители) дает новую информацию, позволяющую объяснить зависимость вирулентности вируса и активности очагов от различных характеристик биоценоза. ЦЕЛЬ РАБОТЫ: изучение механизмов микроэволюции популяции ВКЭ. ЗАДАЧИ РАБОТЫ:

- на основе данных филогенетического анализа оценить основные факторы, определяющие эволюцию ВКЭ;

- на модели одного штамма ВКЭ изучить геном и свойства вариантов вируса, имеющих селективные преимущества при репродукции в клещах и млекопитающих;

- исследовать начальные этапы взаимодействия ВКЭ с клетками и их роль в изменчивости этого вируса;

- описать патогенез и формирование иммунного ответа при инфекции, вызванной вариантами вируса, адаптированными к клещам и млекопитающим;

- изучить механизмы изменения генетической структуры популяции при смене хозяина.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые показано, что на поверхности клеток существует два типа рецепторов для ВКЭ, обеспечивающих высоко- и низкоаффинное связывание вирионов.

Впервые изучены молекулярные основы адаптации ВКЭ к клещам и млекопитающим и предложена схема, объясняющая быструю переадаптацию вируса при чередовании хозяев. Впервые показано, что адаптация ВКЭ к клещам связана с появлением в основном гликопротеине Е мутаций, приводящих к комплексному изменению его антигенной структуры и повышающих аффинность

связывания вирионов с гликозаминогликанами (ГЛГ) на поверхности клетки, которые служат низкоаффинным рецептором для вирионов ВКЭ.

Впервые изучены механизмы восстановления низкой аффинности связывания вирионов с ГАГ у мутантов ВКЭ с ГАГ-связывающим фенотипом. Впервые показано, что при репродукции вируса с подобным фенотипом в клетках млекопитающих могут возникать варианты ВКЭ, способные вызывать все формы инфекции (инаппарантную, острую и персистентную).

В результате проделанной работы впервые в экспериментах на мышах охарактеризована инаппарантная форма КЭ, вызванная периферическим введением адаптированного к клещам варианта ВКЭ с ГАГ-связывающим фенотипом. При данной инфекции нет виремии, не выявляется вирус и вирусная РНК в центральной нервной системе (ЦНС), не выявляются антитела (AT) к основному гликопротеину Е при синтезе в небольших количествах AT к неструктурному белку NS1 и формируется длительный протективный иммунитет. НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Настоящая работа является первым комплексным исследованием, позволяющим оценить поведение популяции переносимого клещами арбовируса при чередовании хозяев (клещ-млекопитающее). Для экспериментально полученных вариантов ВКЭ, имеющих селективное преимущество при размножении в клещах и млекопитающих, проведено сравнение геномов, свойств вирионов, характеристик репродукции в клетках, патогенетических характеристик и особенностей иммунного ответа в экспериментах на лабораторных мышах и показаны механизмы изменения структуры популяции ВКЭ при смене хозяина.

Выявлено, что адаптация ВКЭ к клещам может приводить к значительному изменению антигенной структуры белка Е. Это необходимо учитывать при разработке и применении вакцинных препаратов, а также при оценке природной изменчивости антигенной структуры ВКЭ.

Показано, что при переадаптации ВКЭ от клещей к млекопитающим в популяции вируса появляются варианты, различающиеся по патогенетическим характеристикам.

Накопленная информация показывает, что длительная циркуляция ВКЭ в клещах может приводить к селекции низковирулентных вариантов, обеспечивающих скрытую иммунизацию млекопитающих против вирулентного вируса без синтеза AT к белку Е. Полученные данные следует учитывать при создании диагностических препаратов, при прогнозировании тяжести течения и исхода заболевания, а также при изучении уровня сероконверсии у людей и прокормителей.

Приведенные данные относятся к изучению механизмов микроэволюции ВКЭ и патогенеза при разных формах КЭ с учетом гетерогенности популяции, которое является одним из приоритетных направлений фундаментальных исследований в области инфекционной патологии. ВНЕДРЕНИЕ

Материалы исследований были использованы при составлении Санитарно-эпидемиологических правил 3.1.3.2352-07 «Профилактика клещевого вирусного энцефалита», включены в программу лекций на кафедре вирусологии биологического факультета МГУ им. М.ИЛомоносова.

Определена первая полная нуклеотидная последовательность генома представителя прибалтийской группы сибирского генотипа ВКЭ (штамм Эк-328 вепВапк http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank, № 0(^486861).

Разработан корректный методический подход, позволяющий контролировать отсутствие персистенции вируса в ЦНС (Вопросы вирусологии, 2006). ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

- на поверхносги клеток существует два типа рецепторов для ВКЭ, обеспечивающих высоко- и низкоаффинное связывание вирионов;

- популяция ВКЭ испытывает разное селективное воздействие при репродукции в клещах и млекопитающих, адаптация ВКЭ к клещам связана с появлением мутаций в белке Е, повышающих аффинность связывания вирионов с ГАГ на поверхности клетки, которые служат низкоаффинным рецептором для этого вируса;

- адаптированный к клещам вариант ВКЭ с ГАГ-связывающим фенотипом при периферическом введении лабораторным мышам вызывает инаппарантную инфекцию, которая характеризуется формированием длительного протективного иммунитета без выраженного синтеза антител (АТ) к основному вирусному гликопротеину Е;

- варианты одного штамма ВКЭ, полученные на разной стадии адаптации к клещам и переадаптации к млекопитающим, могут вызывать все формы КЭ: острую, инаппарантную и хроническую;

- ВКЭ может существовать в виде гетерогенной стабильной по составу популяции, содержащей варианты, обладающие селективным преимуществом при репродукции либо в клещах, либо в млекопитающих, соотношение которых в популяции меняется при чередовании хозяев в процессе циркуляции вируса;

- при определенных условиях в популяции ВКЭ могут быстро (за один пассаж) возникать новые мутанты с более высокой приспособленностью к репродукции в данной системе, при этом скорость изменения генетической

структуры популяции ВКЭ и разнообразие мутантов определяется характеристикой хозяина и наличием эффекта "бутылочного горлышка". АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Работа была апробирована на заседании межлабораторного Ученого совета ГУ ИПВЭ им. М.П.Чумакова РАМН 20 февраля 2009 года.

Материалы диссертации представлены на заседании Ученого совета ГУ ИПВЭ им. М.П.Чумакова РАМН (2007), на научной конференции, посвященной 90-летию со дня рождения М.П.Чумакова (Москва, 1999), на региональных научно-практических конференциях (Якутск, 2007; Красноярск, 2008; Пермь, 2008), на Всесоюзных и Всероссийских научно-практических конференциях (Иркутск, 1990; Алма-Ата, 1991; Ярославль, 1992; Ижевск, 1.998; Новосибирск, 2002; Пермь, 2003; Самара, 2004; Красноярск, 2005), на Международных конференциях по арбовирусам и арбовирусным инфекциям (Москва, 1989), по проблемам инфекций в клинической медицине (Санкт-Петербург. 2002), по ликвидации и элиминации инфекционных болезней (Санкт-Петербург, 2003), по возникающим болезням и выживанию (1MED Вена-Австрия, 2007), на VIII и X Международных конгрессах по вирусологии (Берлин-Германия, 1990; Иерусалим-Израиль, 1996), на III Совместном совещании европейского общества борьбы с вирусными заболеваниями и европейской группы по быстрой вирусной диагностике (Страсбург-Франция, 1991), на V Интернациональном симпозиуме по (+)РНК содержащим вирусам (Флорида, 1998), на IV Конгрессе Европейского общества по инфекционным болезням (ESEI Лиссабон-Португалия, 2007); на VIII Всероссийском съезде эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2002), на IV Всероссийском съезде общества паразитологов (Санкт-Петербург, 2008); на расширенных пленумах проблемных комиссий по клещевым и другим вирусным энцефалитам (Москва, 2003) и арбовирусам (Астрахань, 2006), на Бюро Отделения профилактической медицины РАМН (Москва, 2008). ПУБЛИКАЦИИ

По результатам работы опубликовано 14 статей в реферируемых научных журналах, из них 3 за рубежом, 1 монография и 10 статей в научных сборниках. СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 385 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и списка литературы, содержащего 511 источников. Работа иллюстрирована 21 таблицей и 38 рисунками.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

МАТЕРИАЛЫ

Использованные в работе штаммы и варианты ВКЭ были любезно предоставлены в.н.с. ГУ ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН Т.И. Дживанян: штамм Софьин (выделен от больного в 1937 г. на Дальнем Востоке); штамм Рс (выделен до 1980 г.), штамм Абсеттаров (выделен от больного в Ленинградской области в 1951 г.), штамм Эк-328 (выделен в 1972 году из клеща Ixodes persulcatus в Эстонии), вариант 718/574 (получен в результате пассажей штамма Эк-328 через клещей Hyalomma marginatum marginatum). Все исследования были проведены с использованием перевиваемой культуры клеток почек эмбриона свиньи (СПЭВ) (Dzhivanyan et al., 1974).

Лабораторная культура клещей Hyalomma marginatum turanicum Pomeranzev 1946 была выведена от сытых самок, собранных в Ставропольском крае в 2004 г. Все работы по определению клешей, их содержанию и заражению были проведены в.н.с. ГУ ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН JI.A. Буренковой.

Эксперименты проводили на беспородных (б/п) мышах (филиал «Андреевка» ГУ НЦ биотехнологий РАМН) и мышах линии BALB/c (филиал «Столбовая» ГУ НЦ биотехнологий РАМН).

Гистологическое исследование головного мозга инфицированных ВКЭ мышей было выполнено ст.н.с. ФГУН ГИСК им. Л.А.Тарасевича Ростботребнадзора Н.В.Терешкиной.

В работе были использованы лошадиный у-глобулин против ВКЭ (НИИ ВС, г.Томск) и набор моноклональных антител (мкАТ) к белку Е ВКЭ, предоставленный заместителем директора ГНЦ вирусологии и биотехнологии «Вектор» (Кольцово) В.БЛоктевым.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Особенности эволюции переносимых клещами флавивирусов

К началу данного исследования были известны полные геномы только для двух штаммов ВКЭ (Плетнев и др., 1989; Pletnev et al., 1990; Mandl et al., 1990, 1991). В настоящее время в Генбанке представлено 28 полных геномов для 25 штаммов этого вируса.

Нами был проведен филогенетический анализ с использованием всех известных полных геномов штаммов ВКЭ и переносимых клещом Ixodes ricinus

флавивирусов, вызывающих энцефаломиелиты у домашних животных (рис.1). Вирусы разделились на две группы. В первую' группу вошли 5 европейских штаммов ВКЭ в виде одной подгруппы и вирусы шотландского энцефаломиелита овец (ШЭО), испанского энцефаломиелита овец (ИЭО), турецкого энцефаломиелита овец (ТЭО) и греческого энцефаломиелита коз (ГЭК). Для каждого из этих вирусов известен геном только одного штамма. Вторая группа достоверно разделилась на несколько ветвей. Отдельную ветвь представили штаммы, относящиеся к сибирскому генотипу, две отдельные ветви - иркутские штаммы 178-79 и 886-84, выделенные в 1979 и 1984 годах, соответственно, и отдельную ветвь сформировал дальневосточный генотип вируса.

Дивергенция геномов штаммов внутри европейского генотипа до 3%, внутри дальневосточного - до 6,5%, и у сибирского генотипа - до 7,8%. Обращает на себя внимание то, что штаммы, относящиеся к одному генотипу, очень близки между собой, несмотря на большую разницу во времени выделения.

Представители сибирского генотипа почти равно удалены от штаммов европейского и дальневосточного генотипов на 17,1-18,2% и 16,3-17,3%, соответственно. Различия между дальневосточными и сибирскими штаммами превышают или на уровне различий между европейскими штаммами и вирусами ШЭО, ТЭО, ИЭО, ГЭК. Штамм Эк-328, для которого нами была определена последовательность полного генома, принадлежит сибирскому подтипу и образует отдельную ветвь внутри него.

Штаммы 178-79 и 886-84 отличаются друг от друга на 13,2%, и на 12,214,3% от представителей ближайшего к ним дальневосточного генотипа. Эти отличия значительно больше, чем между штаммами внутри генотипов ВКЭ, и близки к уровню дивергенции европейского генотипа ВКЭ и вирусов ШЭО (13,313,5%) и ИЭО (14,2-14,7%). Эти значения и данные филогенетического анализа свидетельствуют о том, что иркутские штаммы представляют собой два новых генотипа.

Одним из актуальных в вирусологии вопросов является определение понятия вида. Критериями объединения в один вид считаются следующие факторы: возможность рекомбинации геномов, наличие общего хозяина, данные филогенетического анализа и молекулярной дистанции и др. У флавивирусов, переносимых комарами, была зарегистрирована внутритиповая рекомбинация (Holmes et al., 1999; Baillie et al., 2008). Проведенный нами анализ 26 геномов штаммов ВКЭ с помощью программы "Simplot" не выявил признаков рекомбинации.

).02|

100 100

100

Pri ШОГуе-25 3 199í- Homo sapiens,

кровь

г Primorye-332 РйссиЯш 1991-Ното53Р^5-

rimorye-212

кровь

Россия, 1991. Homo sapiens, кровь

_ _ . Россия. 1991. Homo sapiens.

г Рптогуе-270 кроеь primorve-86 P0CCHft f9ee

ri Iiiiuiyc ou Homo sapiens, мозг

pri mo rye- 69 20m Homo sm

100

Россия: Приморье. 1937. Honю sapiens, кюэг

100

1001

-oshima5-10 SSS,^

205 Россия: Хабаровский kpaû, 1973 мог Dalnegorsk Hoir,о sapions, мозг 00 Primo rye-94 Россия- 1994- sapiens,

кровь

îooi sof jin-но

Sofjin — Glybinnoe/2004

liaualernun Россия. <955.

K.dVd leiuvu Homi) apiens. u033 MDJ-01 Китай Senzhang «м

— 170 7Q Россия: Иркутская область. <979. /. oeisi:lcalus

"886-84

— EK-328 Эстония. 1972. f. persufcatus

-Irtcilrtionl^n Россия, новосибирская обл.. VdbT и-пепко 1 дед. Homo sapiens, кровь

100

Россия: Иркутская область. 19Q4. doiltnorlomyS rufocanus

"Zausaev

Россия. Томская обл., 1985,

100

Homo sapiens, мозг, хронич. знцефапит " Нур Г Чехия, Brno. 1953. Нота sapiens, кровь ' Neudocrfl Австрия, Nendorf!, 1971,1. ricinus ~ К2 3 Германия: Karlsruhe. 1975. /. г

Г,-1 Германия: Macaca sylvonus, ba I em naturally exposed monkey brain

100

100 I_

100

263 Чехия. Temelin, 1987.1. ricinus

-SSEV

-LIV

100

' TSEV " GGEV

— Bogolubovka

powassan lb

Рисунок 1. Филогенетическое дерево для полных геномов (без концевых 16 нуклеотидов (нт)) штаммов ВКЭ и вирусов, переносимых клещом I.ricinus: SSEV -вирус ИЭО, LIV - вирус ШЭО, TSEV - вирус ТЭО, GGEV - вирус ГЭК. Алгоритм neighbor joining.

По предложению др. Kuno с соавт. (1998) у флавивируеов в вид объединяются вирусы, имеющие общего переносчика, с процентом гомологии более 84%. Др. Grard с соавт. (2007) предложил, чтобы все флавивирусы, переносимые клещами I,ricinus и I.persulcatus, были отнесены к одному виду -вирус клещевого энцефалита. Это достаточно разумно, если учесть антигенную близость, общих хозяев, общий ареал и близкую клиническую картину при заболеваниях, вызванных у чувствительных к этим вирусам млекопитающих. Если все вирусы объединить в один вид ВКЭ, уровень дивергенции геномов внутри вида будет достигать 21,5%. С другой стороны, все вирусы можно разделить на два вида: вирусы, переносимые клещом I.persulcatus, и вирусы, переносимые клещом I.ricinus. Уровни дивергенции геномов внутри вида будут достигать 16,4% и 17,1%, соответственно. При этом встанет вопрос о случаях выделения сибирского и дальневосточного генотипов ВКЭ из клещей I. ricinus, а также о вариантах ВКЭ, филогенетически относящихся к дальневосточному и европейскому генотипам и циркулирующих в Юго-Восточной Азии без участия этих видов клещей (Takashima et al., 1997; Kim et al., 2008).

В любом случае, очевидно, что основным фактором эволюции на уровне вида для переносимых клещами флавивируеов млекопитающих является вид основного переносчика вируса. Независимо от того, как будут названы группы вирусов с разными переносчиками (видом или подвидом), рицинусная группа, очевидно, состоит из 4 субтипов: европейский генотип ВКЭ, вирус ШЭО, вирус ИЭО и подгруппа, включающая вирусы ГЭК и ТЭО. Персулькатусная группа также включает 4 субтипа: дальневосточный, сибирский и субтипы, представленные штаммами 178-79 и 886-84.

Для многих вирусов основным фактором, определяющими эволюцию внутри вида, является иммунный ответ хозяина. Анализ представленных в Ген-банке данных для фрагментов РНК, длиной 1020 нуклеотидов (н.т.), кодирующих большую часть поверхностного белка Е, который отвечает за формирование гуморального иммунитета при флавивирусной инфекции, показал высокую гомологию генов этого белка у штаммов, относящихся к одному генотипу и значительно отстоящих друг от друга по времени выделения. Например, гены белка Е эстонских штаммов Эк-328 и Est3535, выделенных с 30-летней разницей, различаются всего 3 нуклеотидными заменами.

При анализе известных 27 полных геномов 25 штаммов ВКЭ мы выявили 40 аминокислотных (а.к.) остатков, отличающих рицинусные вирусы от персулькатусных, и всего 4 сайта, которые различаются у вирусов КЭ и вирусов энцефаломиелита домашних животных. Мы не нашли сайты, которые могли бы дифференцировать все рицинусные и персулькатусные субтипы, но выявили 15

сайтов, различающихся у всех трех генотипов ВКЭ. Только один из них находится в белке Е. Это означает, что разделение на генотипы не связано с уходом вируса от гуморального иммунного ответа прокормителей.

Таким образом, для ВКЭ характерно существование стабильных в течение большого периода времени локальных популяций, привязанных к географическому месту, возможность циркуляции нескольких генотипов в одном и том же очаге и незначительное селективное воздействие иммунной системы позвоночного хозяина на уровне гуморального иммунитета. В пользу последнего говорят следующие данные: идентичность белков Е вирусов, выделенных на определенной территории с интервалом более 30 лет; наличие всего 1 а.к. позиции в гене белка Е, различающей генотипы ВКЭ; антигенная близость в серологических реакциях штаммов ВКЭ, принадлежащих к разным генотипам (Clarke, I960, 1964; Calisher et al., 1989); случаи несовпадения принадлежности штаммов ВКЭ к определенному генотипу и серотипу (Злобин и др., 2003; Погодина и др., 2004); эффективность инактивированных вакцин на основе дальневосточных и европейских штаммов на всей территории РФ, где, в основном, представлены другие генотипы вируса (Леонова и др., 2004; Романенко и др., 2007).

2. Изменение свойств ВКЭ при адаптации к клещам и млекопитающим и выявление хозяин-специфических генетических детерминант

Рядом авторов, в том числе и нами, для разных штаммов ВКЭ и вируса Повассан были получены данные, указывающие па то, что репродукция в клещах и млекопитающих оказывает разное селективное воздействие на вирусы (Дживанян и др. 1975; Чунихин и др., 1975; Чунихин и Дживанян, 1977; Khozinskaya et al., 1985; Дживанян и др., 1986, 1988, 1991; Чунихин и др., 1986; Kaluzova et al., 1994; Labuda et al., 1994, Romanova et al., 2007). Адаптация ВКЭ к клещам разных видов способствует отбору вариантов, обладающих сниженной нейроинвазивностью (НИ), т.е. вирулентностью при периферическом заражении мышей, и сниженной гемагглютинирующей активностью (ГА). Репродукция ВКЭ в клетках млекопитающих, напротив, способствует повышению НИ и ГА.

В данной работе использовали штамм Эк-328 ВКЭ и полученный из него в результате 17 парэнтеральных пассажей на клещах Н.т.marginatum вариант М (в оригинальных работах - вариант 718/574) (Чунихин и Дживанян, 1977; Chunikhin and Dzhivanyan, 1979; Дживанян и др., 1986, 1988, 1991). Клон 718/574 хранился в течение 10 лет при -20°С и прошел еще 2 дополнительных пассажа через мозг б/п мышей. Мы назвали его вариантом М и показали, что по основным свойствам

этот вирус не отличается от варианта 718/574. Методы, использованные при изучении вирусов, описаны в работе Romanova et al. (2007). Основные характеристики штаммаЭк-328 и вариантам приведены втабл.1.

Таблица 1. Характеристики родительского штамма Эк-328 и адаптированного к клещам //. marginatum marginatum варианта М

Характеристики Штамм Эк-328 Вариант М

титр вируса в клещах H.marginatum 5,2+0,2 ^БОЕ/клещ 6,9+0.2 1йБОЕ/клещ

титр вируса в мозге мышей после интрацеребрального (и/ц) заражения 9,0+0,3 1дБОЕ/мозг 7,9+0,3 ^БОЕ/мозг

нейровирулентность для б/п мышей 6г (ЛД50 при и/ц введении) 0,5 БОЕ 0,1 БОЕ

нейроинвазивность для б/п мышей 6г (ЛД50 при подкожном введении ) 0,8 БОЕ ЮООБОЕ

размер бляшек в культуре клеток СПЭВ 7 мм <1мм+7мм отношение 100:1

характеристика репродукции в культуре клеток СПЭВ Количество вируса в КЖ выше, чем в клетках Замедленный цикл репродукции, количество вируса в КЖ ниже, чем в клетках

соотношение копий РНК* к БОЕ для вируса в КЖ клеток СПЭВ (24 часа) 2,2 ^ 2,31ц

ГА в КЖ клеток СПЭВ + -

наличие катодного преципитата вирионов с АТ в РИЭФ + -

наличие преципитата невирионного антигена в РИЭФ + +

* - количество копий РНК в КЖ определяли методом ПЦР в реальном времени; ЛД -летальная доза; БОЕ - бляшкообразующая единица; КЖ - культуральная жидкость; АТ - антитела; РИЭФ - ракетный иммунноэлектрофорез.

Способ получения и свойства варианта М указывают на то, что этот вирус имеет селективное преимущество при репродукции в клещах. В этом заключении мы основываемся на нижеследующих соображениях. 1) В ранней работе в процессе двух независимых линий пассажей на клещах штамма Эк-328, клонированного методом бляшек и без предварительного клонирования, сначала появлялась примесь мелкобляшсчного вируса в популяции, а затем при последующих пассажах происходило вытеснение крупных бляшек мелкими (Чунихин и др., 1977, 1979; Т.И. Дживанян, личное сообщение). 2) Вариант М имеет более высокие титры при репродукции в клещах, чем родительский штамм Эк-328.

Поведение штамма Эк-328 при разных способах заражения мышей и при размножении в культуре клеток показывает, что этот вирус по сравнению с вариантом M имеет преимущества при репродукции в клетках млекопитающих. В пользу этого свидетельствуют следующие факты: 1) более высокие титры в мозге мышей; 2) крупный размер бляшек в культуре клеток СПЭВ; 3) быстрый, по сравнению с вариантом М, цикл репродукции в культуре клеток СПЭВ, количество свободного вируса в течение всего цикла репродукции выше, чем количество вируса, связанного с клетками.

Были определены последовательности полных геномов данных вирусов. В табл.2 приведены замены, которые были выявлены в геноме варианта M при сравнении с геномом штамма Эк-328. Всего было обнаружено 15 н.т. замен, две из которых были в 5-НТО, 5 - в структурных белках и 8 - в неструктурных белках. 6 н.т. приводили к а.к. в сигнальной последовательности белка prM, а также в белках Е, NS2a и NS4a. Одна из а.к. замен в белке Е в позиции 426 Thr—>11е расположена в стебле, а вторая (122) Glu—>Gly - в домене II (рис.2). Замена глутаминовой кислоты на глицин в позиции 122 белка Е описана ранее для варианта ВКЭ, полученного при адаптации штамма Найдорфл к культуре клеток ВНК-21 (Mandl et al., 2001). Она приводит к повышению положительного заряда белка Е и повышению аффинности связывания вирионов с ГАГ клетки (Mandl et al., 2001; Kroschewski et al., 2003), что сопровождается образованием мелких бляшек в культуре клеток почки эмбриона свиньи и снижением НИ для мышей. Следует отметить, что 122 позиция расположена в районе, непосредственно примыкающем к пептиду слияния белка Е, и изменения в этом районе могут влиять на пространственное положение cd-петли (пептида слияния) в составе димера белка Е при физиологических значениях pH и особенно в составе тримера при закислении в эндосоме клетки.

Рисунок 2. Схематическое изображение структуры белка Е ВКЭ.

. жг:

ш «I Ж : шш

Визшний рати

% 42.6

мембрана

с-шйеяь

И.орь

Таблица 2. Замены в геноме варианта M по сравнению со штаммом Эк-328

область генома нуклеотидная замена аминокислотная замена3

5'-НТО Ai9-> G/A С,2->А .

сигнальный пептид ргМ C470->U Ala-» Val

AU37->G Glu1H-»Gly

Е C2190~>U -

С 2249—^U Thr426->He

U236Z->C -

NS1 C3387->U G3438->A -

NS2a G3672->U Lys52~>Asn

NS3 G4827->A -

NS4a Аб526~ Ser22—>Gly

G6584->A Arg4i—>Lys

NS4b G7437—»C -

NS5 U9888—>G -

а нумерация с начала соответствующего белка

Для проверки влияния а.к. замены в 122 позиции в контексте структуры белка Е данных вирусов на связывание вирионов с ГАГ клетки мы изучили сорбцию вирионов на гепарин-сефарозе (ГС) - аналоге ГАГ (Romanova et al., 2007). Для этого вирусы в равной дозе в виде вируссодержащей ЮК инфицированных клеток СПЭВ были сорбированы на ГС, инкубированы в течение 1 часа при 37°С при периодическом перемешивании. В отдельных пробирках готовили контрольные вирусы, которые выдерживали в тех же условиях. После адсорбции сефарозу осаждали, супернатант собирали. Полученные пробы нссорбированного на сефарозе и контрольного вируса титровали методом бляшек в культуре клеток СПЭВ. Сорбция вирионов адаптированного к клещам варианта M на ГС оказалась выше, чем у вирионов штамма Эк-328 (рис.3).

Варианты с подобным ГАГ-связывающим фенотипом описаны для многих вирусов (Byrnes and Griffin, 2000; Hülst et al., 2000; Lin et al., 2000), в том числе и

для флавивирусов японского энцефалита (ЯЭ), лихорадки Западного Нила (JI3H) и энцефалита Долины Муррей (ЭДМ) (Lee and Lobigs, 2002; Lee et al., 2004), в частности для ВКЭ (Mandl et al., 2001; Goto et al., 2003). Для всех подобных вариантов характерна низкая виремия и низкая НИ для лабораторных мышей.

Эк-328 вар.М клон клоп клон 160/57 116/59 103/84

Рисунок 3. Процент вируса, сорбированного на ГС, для штамма Эк-328, варианта М и полученных из популяции варианта М клонов-ревертантов 160/57, 116/59 и 103/84.

В наших экспериментах появление вируса с ГАГ-связывающим фенотипом наблюдали при адаптации штамма ВКЭ сибирского генотипа к клещам Н.та^тШит. Др. Чунихин с соавт. (1986) адаптировал к клещам Н.апШоИсит 4 штамма ВКЭ, выделенных в Сибири и на дальнем Востоке. Во всех случаях в результате пассажей на клещах были получены мелкобляшечные варианты с низкой НИ для мышей. Вирионы всех полученных вариантов, подобно нашему варианту М, не образовывали преципитата с АТ в РИЭФ. Таким образом, разные штаммы ВКЭ имели сходную изменчивость при адаптации к клещам, относящимся к роду Нуа1отта, которые не являются переносчиками этого вируса в природных очагах. Доктор Labuda с соавт. (1994) получил сходное изменение свойств ВКЭ при пассировании штамма европейского генотипа в клещах /пс/гаи-, т.е. в основном переносчике этого вируса. Авторы наблюдали снижение НИ вируса и выявили а.к. замену в позиции 84 белка Е, которая приводит к повышению положительного заряда вирионов и может обеспечивать ГАГ-связывающий фенотип полученного мутанта. Все перечисленные факты позволяют предположить, что появление вариантов ВКЭ с ГАГ-связывающим фенотипом является закономерностью при адаптации ВКЭ к клещам.

Для оценки влияния выявленных в белке Е замен на антигенные свойства вирусов были изучены вирионы штамма Эк-328 и варианта М с помощью мкАТ в иммуноферментном анализе (ИФА) и с использованием радиоиммуной

преципитации (РИП) меченых вирусных белков из лизатов инфицированных клеток СПЭВ. Для сравнения брали штамм Софьин (дальневосточный генотип) и штамм Рс (европейский генотип) так, чтобы в реакции были представлены все 3 генотипа ВКЭ. ИФА проводили по непрямому методу (Романова и др., 2006). С помощью ИФА было установлено, что мкАТ Е4А и Е6В значительно слабее взаимодействуют с вариантом М, по сравнению со штаммами Эк-328, Рс и Софьин (табл.3). Е6В является нейтрализующим и обладающим антиГА активностью моноклоном к эпитопу, принадлежащему к антигенному домену е2 белка Е, согласно эпитопной карте др. Цехановской с соавт. (1993).

Таблица 3. Сравнение антигенной структуры вирионов штамма Эк-328 и варианта М с помощью набора мкАТ к белку Е.

Сыворотка и мкАТ Ха р а кте р и сти ка мкАТ* Антигены

РНБ РТГА домен Эк-328 Вариант М Софыш Рс

ИФА

Контрольная сыворотка к ВКЭ 1600 800 1600 800

Е4А - - н.о. >25600 64 >25600 >25600

ЕВ1 - - е2 >25600 12500 >25600 >25600

Е6В + + е2 >25600 640 25600 25600

Нммунопрецппитация радиоактивно меченных белков

6В9 - - е1-с2 0,9+0,2 0,5±0,1 0,2±0,1 0,5+0,1

7П0 - - с1 1,4±0,3 0,7±0,2 0,2±0,3 0,2+0,2

4С7 - + е1 0,7±0,2 0,6±0,3 0,0±0,1 0,3+0,1

10Н10 - + е2 1,7+0,3 1,9+0,3 2,7±0,4 1,3+0,2

Ш2 - - е2 0,1±0,1 0,2±0Д 0,1±0,2 0,4±0,2

* по опубликованным данным (Гайдамович и др., 1990; Протопопова и др., 1996, 1997); РНБ - реакция нейтрализации бляшек; РТГА - реакция торможения ГА.

В РИП оценивали количество белка, которое преципитируют мкАТ из лизатов клеток СПЭВ, инфицированных вышеперечисленными штаммами, по отношению к количеству белка, преципитированного из этого лизата у-глобулином против ВКЭ (Романова и др., 2006). Моноклоналыше АТ 7140 к эпитопу в домене е1 статистически достоверно более активно преципитировали белок Е штамма Эк-328, по сравнению с вариантом М.

Моноклональиые АТ, различившие в данной работе белок Е варианта М и штамма Эк-328, связываются с эпитопами в разных антигенных доменах белка Е. Следовательно, изменение антигенной структуры у варианта М затрагивает удаленные эпитопы этого белка.

3. Взаимодействие вирионов ВКЭ с рецепторами на поверхности клеток

Представленные выше данные показывают, что адаптация к клещам приводит к селекции вариантов ВКЭ с ГАГ-связывающим фенотипом. Для понимания роли ГАГ в процессе проникновения вирионов ВКЭ в клетку важно иметь представление об основных характеристиках адсорбции вирионов этого вируса на поверхности клеток. К началу данного исследования сведения о природе клеточных рецепторов для флавивирусов и, в частности, для ВКЭ отсутствовали.

В экспериментах использовали штамм Софьин. Вирионы метили по РНК при выращивании в клетках почек зеленых мартышек 46-47 в присутствии [3Н]-уридина (Тптю1ееу е1 а!., 1991). Меченые вирионы концентрировали с помощью ультрацентрифугирования и использовали для экспериментов по адсорбции на клетках СПЭВ. Клетки выращивали в 96-луночных пластинах. К монослоям добавляли возрастающие концентрации меченого вируса. Проводили адсорбцию в течение 2 часов при +4 С. После этого собирали не связавшийся с клетками вирус, промывали клеточный монослой средой и собирали клетки. Определяли количество связавшегося и свободного вируса по радиоактивности. Полученные результаты представляли в координатах Скэтчарда (Бса^Ьагс!, 1949). Взаимодействие лиганда с одним рецептором в этих координатах описывается прямой, которая отсекает на оси ординат константу связывания, а на оси абсцисс - количество рецепторов данного типа. Если лиганд связывается с двумя или большим количеством типов рецепторов, то в данной системе процесс описывается гиперболой или кривой более высокого порядка. Асимптоты к ветвям гиперболы характеризуют соответствующие типы рецепторов, которые различаются аффинностью связывания с лигандом. Под одним типом рецепторов могут выступать химически разные молекулы.

Как видно на рис.4, в координатах Скэтчарда взаимодействие вирионов ВКЭ с клетками описывается гиперболой. Один из рецепторов характеризуется высокой константой связывания и представлен небольшим количеством на поверхности клеток. Второй, низкоаффинный рецептор, связывает практически все вирионы ВКЭ. Таким образом, адсорбция вирионов ВКЭ на клетках

обусловлено взаимодействием с двумя типами рецепторов: высокоаффинными и низкоаффинными.

+ - экспериментальные данные;

аппроксимированная кривая;

----асимптоты к

аппроксимированной кривой.

Аппроксим ированная кривая рассчитана

S 0.01 -

методом наименьших квадратов. Асимптоты рассчитаны,согласно

0.00

работе Варфоломеева и др. (1980).

100 200 300 400 500 600 700 800

Связанный вирус, (1рш

Рисунок 4. Результаты связывания меченных [3Н]-уридином вирионов BIO на монослое клеток СПЭВ, выраженные в координатах Скэтчарда.

Для выяснения природы клеточных рецепторов, обуславливающих вышеописанные взаимодействия вирионов ВКЭ с клеточной поверхностью, клетки СПЭВ обрабатывали раствором ТРСК-трипсина в течение 15 минут при комнатной температуре и проводили адсорбцию меченого вируса. Обработка клеток трипсином полностью блокировала высокоаффинное связывание вирионов с клетками. Эти данные позволили сделать предположение о белковой природе высокоаффинного рецептора.

Для более детального изучения предполагаемого клеточного белкового рецептора была получена антиидиотипическая сыворотка к поверхностному гликопротеину Е ВКЭ. Для этого мыши были однократно иммунизированы 50 мкг очищенного белка Е (Timofeev et al., 1991). Для получения сыворотки у мышей была взята кровь из супраорбиталыюй вены на 9 (нормальный иммунный ответ на введение антигена) и 35 сутки после иммунизации (время максимального накопления антиидиотипических антител). Сыворотка мышей, взятая на 9 сутки после иммунизации, преципитировала из лизата клеток СПЭВ, инфицированных ВКЭ, белок Е. Сыворотка, взятая у тех же мышей на 35 сутки после иммунизации белком Е, содержала антиидиотипические антитела к этому белку, поскольку в ИФА при взаимодействии с иммуноглобулином против ВКЭ вела себя как антиген.

Обработка клеток сывороткой с антиидиотипическими антителами перед адсорбцией вируса практически полностью блокировала связывание вирионов ВКЭ на высокоаффинном рецепторе. Данная сыворотка в РИП белков, меченных смесью [14С]-аминокислот или [мС]-глюкозамином, из лизатов незараженных клеток СПЭВ преципитировала только гликопротеин с мол. массой около 110кДа.

В последствие появился ряд работ, в которых при использовании антиидиотипических поликлональных и мкАТ был выявлен целый набор претендентов в рецепторы для вирионов ВКЭ (Протопопова и др, 1996, 1997; Kopecky et а!., 2005). С помощью мкАТ к нейтрализующим мкАТ к белку Е (в том числе к использованным в данной работе Е6В и ЮН 10) из нескольких культур клеток были выделены белки с мол. массами 43, 67, 110, 210 кДа (Протопопова и др., 1996, 1997). Было показано, что белок 110 кДа является pi-цепью, а белок 210 кДа - аЗ-цепью интегрина. Для вирусов ЛЗН и ЯЭ так же показано, что аурЗ-интегрин является общим для этих вирусов рецептором на поверхности клеток Vero, HeLa, N2A (клетки мышиной нейробластомы) (Chu &Ng, 2004), и этот рецептор опосредует проникновение вирионов в клетку.

Выявленный белок с мол. массой 67 кДа оказался ламининсвязывающим белком (ЛСБ) и был предложен авторами в качестве рецептора для ВКЭ с константой связывания 2,5х107 М'1, т.е. низкоаффинного рецептора (Protopopova et al., 1997; Локтев и др., 2002). Известно, что рецепторами для ламинана могут служит интегрины, ГАГ, ЛСБ и др. Представленные данные позволяют высказать предположение, что на поверхности белка Е ВКЭ есть участок или участки, структурно близкие рецепторным областям ламииина, которые могут взаимодействовать с разными типами рецепторов для ламинина. В таком случае, взаимодействие ЛСБ и ГАГ с белком Е ВКЭ может иметь сходный механизм. Выявленная нами замена в 122 позиции белка Е глутаминовой кислоты на глицин, повышает положительный заряд белка Е и приводит к повышению связывания с ГАГ клетки. В наших экспериментах, в отличие от родительского штамма Эк-328 вариант М, имеющий такую замену, слабо взаимодействует с мкАТ Е6В к эпитопу белка Е ВКЭ, отвечающему за связывание вирионов с ЛСБ на поверхности клетки. Это позволяет предположить, что ГАГ и ЛСБ могут служить в качестве одного из ко-рецепторов для разных вариантов ВКЭ, при этом адаптация к новому хозяину может сопровождаться изменением взаимодействия с этими рецепторами.

Таким образом, нами впервые было показано, что ВКЭ имеет два типа рецепторов на поверхности клетки: высокоаффинный, по-видимому, белковой

природы, с которым связывается менее 1% сорбированных вирионов, и низкоаффинный, на котором сорбируется основная масса вирионов ВКЭ.

4. Изменение патогенетических характеристик ВКЭ при адаптации к клешам и переадаптации к млекопитающим

Сравнение вирулентности штамма Эк-328 и варианта М проводили на мышах линии ВАЬВ/с разного возраста, которые были инокулированы и/ц и интраперитонеально (и/п): Для сравнения использовали штамм Абсегтаров ВКЭ, обладающий высокой НИ для мышей этой линии.

Как видно из табл.4, все изученные вирусы обладали близкой нейровирулентностью для мышей 6 и 12 г. В экспериментах на взрослых мышах штамм Эк-328 продемонстрировал несколько меньшую НИ, чем штамм Абсеттаров, исходя из данных о количестве БОЕ, необходимых для того, чтобы вызвать 50% гибель животных. НИ варианта М была в 10000 раз ниже, чем у штамма Эк-328.

Таблица 4. Вирулентность штаммов Абсеттаров, Эк-328 и варианта М для мышей ВАЬВ/с разного возраста

вирусы и/ц заражение и/п заражение

Мыши 6 г Мыши 12 г Мыши 6 г

ЛД50(БОЕ) СПЖ(сутки)* ЛД50(БОЕ) ЛД50(БОЕ) СПЖ(сутки)**

Абсеттаров 0,1 4,2±0,2 0,1 3 9,9+0,5

Эк-328 0,5 5,0+0,0 0,5 18 12,0±1,2

Вариант М 0,4 5,1±0,3 2,5 250 000 5 месяцев ***

* - доза заражения 5,5 ЛД50; ** - доза заражения 10 ЛД50; *** - период наблюдения. СПЖ- средняя продолжительность жизни.

Для характеристики инфекции мыши линии ВАЕВ/с 12г были инокулированы и/п данными вирусами в дозе 1000 БОЕ. Ежедневно у 3-х мышей брали кровь и органы, содержание инфекционного вируса в которых определяли методом бляшек. На. 7-8 день по три мыши для каждого вируса были использованы для патоморфологического исследования.

У мышей, инфицированных штаммом Абсеттаров, после и/п введения 1000 БОЕ инфекция протекала остро. Все животные заболели на 6-7 сутки и к 9 дню погибли. Гистологическое исследование выявило характерную для ВКЭ картину менингоэнцефалита. У животных наблюдали двухволновую виремию с более выраженным вторым пиком (табл.5). В мозгу вирус появлялся, начиная с 5 суток.

Таблица 5. Динамика появления инфекционного вируса (^БОЕ/мл 10% суспензии) в крови и органах, а также противовирусных АТ (ИФА) в сыворотках мышей после и/д введения 1000 БОЕ штаммов Абсеттаров, Эк-328 и варианта М

- штамм Абсеттаров

дни после начала инфекции

1 2 3 4 5 6 7 8

кровь* ' 2 2,7 2,7 0 2 4 2,7 4,1

мозг 0 0 0 0 4,8 6,6 7,8 7,6

л/у 0 0 2 0 0 3 0 0

селезенка 0 4,7 2,4 3,9 4,9 4 0 5,8

АТ 0 0 0 160 160 320 320 320

штамм Эк-328

дни после начала инфекции

1 2 3 4 5 6 7 8

кровь 23 4,3 4,1 0 2,3 2 0 0

мозг 0 0 0 3,2 4,3 4,7 6,8 7,2

л/у 0 0 0 0 0 0 3 0

селезенка 2 3 3,2 3,7 3,4 2,7 0 4,7

АТ 0 0 0 160 160 160 320 320

вариант М

дни после начала инфекции

1 2 .3 4 5 6 7 8

кровь 0 0 0 0 0 0 0 0

мозг 0 0 0 0 0 0 0 0

л/у 0 0 2 0 0 0 0 3

селезенка 0 0 0 0 - 3** 2,7** 0 0

АТ 0 0 0 0 0 0 0 0

* для титрования использовали сгустки крови; ** популяция вируса была представлена характерными для варианта М точечными бляшками и бляшками с диаметром 5-6 мм, соотношение 1:1.0- титр вируса < 1,4 ^БОЕ/мл, титр АТ менее 1:8.

При инфицировании мышей 1000 БОЕ штамма Эк-328 наблюдали также острую инфекцию с двухволновой виремией с более выраженным первым пиком. В мозге мышей вирус появлялся на сутки раньше, чем при инфекции, вызванной штаммом Абсеттаров, однако животные заболевали только на 8-9 сутки, погибая к 11 дню. При гистологическом исследовании был обнаружен менингоэнцефалит.

Введение 1000 БОЕ варианта М и/п не вызвало никаких признаков заболевания у 49 из 50 зараженных животных, у которых в ЦНС с помощью гистологического анализа не было обнаружено каких-либо специфических повреждений. Нам не удалось выявить инфекционный вирус в крови мышей,

зараженных вариантом M, лимфоузлах и селезенках был найден вирус в невысоких титрах. У одной мыши из 50 на 7 сутки после начала инфекции наблюдали типичную для КЭ картину заболевания.

Сыворотки крови мышей были проверены на наличие противовирусных антител с помощью ИФА. При острой инфекции, вызванной штаммами Абсеттаров и Эк-328, противовирусные AT появлялись на 4 сутки после заражения (табл.5). При инаппарантной инфекций после введения варианта M с помощью ИФА противовирусные AT выявлены не были.

Сыворотки крови мышей, инфицированных штаммом Абсеттаров и вариантом М, полученные на 6 сутки после заражения, были проанализированы с помощью РИП вирусных белков из лизатов инфицированных клеток. Сыворотка крови мышей, зараженных штаммом Абсеттаров, преципитировала белок Е и высокомолекулярные неструктурные белки NSI, NS3 и NS5 из лизатов клеток СПЭВ, инфицированных как штаммом Абсеттаров, так и вариантом М. С помощью сыворотки крови мышей, зараженных вариантом М, никакие вирусные белки выявлены не были. При использовании лизата клеток СПЭВ, инфицированных дефектным аденовирусом Rad51, несущим ген белка NS1 ВКЭ (Timofeev et al., 1998), были выявлены в небольших количествах AT к белку NS1 в сыворотках крови мышей, инфицированных вариантом М, взятых на 7 и 28 дни инфекции.

Через 3 недели и 5 месяцев после и/'п введения 1000 БОЕ варианта M мыши были умерщвлены, у них были взяты головной мозг, селезенки, лимфоузлы, а также были получены сгустки крови. Ни в исходных гомогенатах органов, ни в материалах после двух слепых пассажей этих гомогенатов в культуре клеток СПЭВ инфекционный вирус не был обнаружен. На эти сроки в мозге и селезенках мышей, инфицированных вариантом М, на фоне введения циклофосфана не удалось выявить вирусную РНК с помощью предложенного нами варианта ОТ-ПЦР с внутренним контролем (Романова и др., 2006).

В те же сроки через 3 недели и через 5 месяцев после и/п введения 1000 БОЕ варианта M мыши были разрешены 100 ЛД50 штамма Абсеттаров. Все контрольные мыши, зараженные данной дозой этого вируса, погибли. Все животные, предварительно инфицированные вариантом М, были защищены от последующего введения вирулентного ВКЭ. Формирование длительного протективного иммунитета после и/п введения варианта M было показано в трех независимых экспериментах.

Отсутствие клинических признаков заболевания и повреждений в ЦНС показывают, что вариант M при и/п введении мышам вызывает инаппарантную форму инфекции, характеризующуюся отсутствием вируса в крови и ЦНС, хотя

чувствительность использованного метода (45 БОЕ в пробе) не позволяет полностью исключить попадание небольшого количества вируса и его персистенции в ЦНС.

Для ГАГ-связывающих мутантов переносимых комарами флавивирусов ЯЭ и ЭДМ было показано, что после внутривенного введения они быстро попадают в печень, где, по-видимому, элиминируются макрофагами (Lee and Lobigs, 2003). Вирионы могут попадать в печень в свободном состоянии или связанными с клетками крови. Мы проверили сорбцию вирионов изучаемых вирусов на эритроцитах мыши. Для этого у здоровых мышей были взяты эритроциты, к которым были добавлены вирусы. После инкубации не связавшийся с клетками вирус был собран, и титры свободного и связанного с эритроцитами вируса были определены методом бляшек. На рис.5А представлена динамика сорбции вирионов штаммов Абсеттаров, Эк-328 и варианта М на эритроцитах мыши. Насыщение эритроцитов вирионами происходило в первые 10 мин после добавления вируса. На рис.5Б показана доля связанного вируса при разных соотношениях эритроцитов и вирионов. В любых условиях доля вирусных частиц варианта М, связанных с эритроцитами, была в 50-100 раз больше, чем этот показатель для штаммов Эк-328 и Абсеттаров.

Для оценки активации . раннего неспецифического противовирусного иммунного ответа проводили определение содержания а/|3-ИФН, ФНО-а, ИЛ-10 и ИЛ-12 в крови мышей на начальных этапах инфекции после и/п введения 1000 БОЕ вирусов.-

Содержание а/р-ИФП в сыворотках крови, взятых от трех мышей через разные сроки после начала инфекции, определяли по подавлению цитопатического действия (ЦПД) вируса энцефаломиокардита мышей (ЭММ) (Бабаянц и др., 1985). В качестве контроля использовали сыворотку от трех мышей, которым вместо вируса вводили мозговую суспензию от здоровых мышей в соответствующем разведении.

В сыворотке крови контрольных мышей через 5 часов после введения мозговой суспензии от здоровых мышей обнаружили а/(3-ИФН в титрах 1:8, который отсутствовал в контрольной пробе, взятой через следующие 5 часов (рис.6). Штамм ЭК-328 оказался слабым индуктором ИФН 1 типа. Штамм Абсеттаров и вариант М индуцировали а/р-ИФН в сопоставимых титрах, но при инфекции, вызванной вариантом М, ИФН появлялся в крови животных уже через 5 часов, а у мышей, зараженных штаммом Абсеттаров, только через 10 часов после введения вируса.

А. Динамика насыщения эритроцитов вирусами

Мвариаит

Абсеттаров

Б. Адсорбция вирусов на эритроцитах при разных дозах вируса

Рисунок 5.

Характеристика

адсорбции

штаммов

Абсеттаров,

Эк-328 и

варианта М на

эритроцитах

мыши.

Уровень остальных ключевых цитокинов в сыворотках крови животных, зараженных и/п 1000 БОЕ штаммов Абсеттаров, ЭК-328 и варианта М в виде КЖ инфицированных клеток СПЭВ, определяли с помощью коммерческих наборов методом ИФА. Количество цитокинов в сыворотках крови инфицированных мышей сравнивали с уровнем цитокинов в контрольных сыворотках, полученных от животных, которым и/п была введена питательная среда 199.

В первые часы после заражения животных изучаемыми штаммами ВКЭ мы наблюдали повышение в крови уровня ФНО-а и ИЛ-10 (табл.6). ФНО-а является провоспалительным цитокином. Его появление в крови свидетельствует об активации макрофагов.и нейтрофилов. ФНО-а индуцирует синтез ИЛ-10, а ИЛ-10 в свою очередь, подавляет синтез ФНО-а (van der Pool et al., 1994). В нашем эксперименте ИЛ-10 выявляли одновременно с ФНО-а, после чего концентрация

Рисунок 6. Динамика появления а/р-ИФН в сыворотках крови мышей, и/п инфицированных штамм-мами Абсетта-ров, Эк-328 и вариантом М в дозе ЮООБОЕ.

ФНО-а в крови животных понижалась до уровня контроля. Известно, что ИЛ-10, являясь регулятором иммунных реакций, подавляет продукцию таких основных провоспалительных цитокинов, как ИЛ-6, ФНО-а, экспрессию на клеточной мембране МНС-Н, антигенпрезентирующую способность моноцитов/макрофагов, продукцию цитокинов ТЬ-1 лимфоцитами (у-ИФН, ИЛ-2), продукцию цитокинов натуральными киллерами (НК), пролиферацию Т-лимфоцитов (Кашкин, 1998). Таким образом, ВКЭ через индукцию 1Ь-10 может вызывать состояние иммунодепрессии у инфицированных животных в первые часы после заражения, при этом штаммы ВКЭ, вызывающие острую инфекцию у мышей, могут различаться по выраженности и длительности вызываемой ими иммунодепресии.

Таблица 6. Концентрация цитокинов в сыворотках крови мышей на ранних этапах инфекции после и/п введения 1000 БОЕ штаммов Абсеттаров, Эк-328 и варианта М (пкг/мл)

вирус ФНО-а ИЛ-10 ИЛ-12

5 час 10 час 18 час 10 час 18 час 10 час

Абсеттаров <К 107±19 <К 301±30 20±0 <К

Эк-328 <К <К 75±10 <К 75±10 352±42

Вариант М <К 11б±32 <К 151±20 118±21 348±21

Примечание: концентрация ИЛ в контрольных сыворотках крови (К), полученных от животных после введения среды 199 на растворе Эрла (пкг/мл): ФНО-а - 23±3; ИЛ-10 -8±4; ИЛ-12 - 131±56.

В отличие от штамма Абсеттаров через 10 часов после заражения штаммом Эк-328 и вариантом М в крови мышей в высоких концентрациях выявляли ИЛ-12, который на ранних стадиях инфекции свидетельствует об активации антигенпрезентирующих и фагоцитирующих клеток (Хаитов и Пинегин, 2000; Biron and Sen, 2002). Появление в крови этого интерлейкина и а/р-ИФН может приводить к активации НК.

На 4-е сутки у мышей, зараженных штаммом Абсеттаров, в сыворотках крови обнаруживааи ИЛ-6 и незначительное количество у-ИФН (табл.7). У животных после введения штамма Эк-328 ИЛ-6 и у-ИФН появились на сутки раньше. Повышение концентрации ИЛ-б свидетельствует об активации Th2-лимфоцитов, которые обеспечивают формирование гуморального иммунного ответа. Об этом свидетельствует и появление в это время противовирусных антител в сыворотках крови мышей, инфицированных этими вирусами. Продукция у-ИФН связана с появлением ИЛ-12. При инфекции штаммом Абсеттаров мы наблюдали однократный подъем уровня ИЛ-12 на 2 сутки, а при инфекции штаммом Эк-328 - двукратный подъем через 10 часов и на 4 сутки после заражения животных. При этом второе повышение количества ИЛ-12 в крови мышей, инфицированных штаммом Эк-328, не сопровождалось последующей продукцией у-ИФН.

При инфекции вариантом М на 3 сутки в крови животных повысился уровень ИЛ-2 и у-ИФН. Это говорит об активации Thl-лимфоцитов, которые обеспечивают развитие клеточного иммунитета. у-ИФН в крови животных далее выявляли на протяжении всего срока наблюдения.

На 7 сутки после заражения в крови мышей, инфицированных штаммом Абсеттаров, обнаружили в высоких титрах ИЛ-10, у-ИФН, ИЛ-6 и ФНО-а. В эти же сроки отмечали выраженные симптомы заболевания, высокий титр инфекционного вируса в крови и мозге, развитие менингоэнцефалита. Уровень ИЛ-6 в сыворотке крови животных, заболевших на 7-е сутки после и/п введения 1000 БОЕ штамма Эк-328, также был высоким. Появление провоспалительных цитокинов в крови инфицированных мышей в высоких титрах на этой стадии острого заболевания КЭ свидетельствует о выраженном патологическом процессе в ЦНС и нарушении гематоэнцефалического барьера.

При инаппарантной инфекции, вызванной вариантом М, на 7 сутки после заражения мы наблюдали присутствие в крови в небольших концентрациях ИЛ-2, ИЛ-6 и у-ИФН. При этом все животные были клинически здоровы, вирус из

Таблица 7. Концентрация цитокинов в сыворотках крови мышей после и/п введения 1000 БОЕ штаммов Абсетгаров, Эк-328 и варианта М (пкг/мл)

штамм Абсетгаров

Цитокины Время после заражения животных

1 сут 2 сут 3 сут 4 сут 5 сут 6 сут 7 сут

ФНО-а <К <К <К йК <К <К 315+43

ИЛ-10 . 101+34 <К ¿К <К <К <К 45+14*

у-ИФН <;К <ж ¿К 27±5 39 <к 284±36

ИЛ-12 <К 328±17 <К <К н/и н/и н/и

ИЛ-6 <к <К <К 69+9 <К <К 640+85

ИЛ-2 <к <к <к <К <К <К <К

штамм Эк-328

Цитокины Время после заражения животных

1 сут 2 сут 3 сут 4 сут 5 сут б сут 7 сут

ФНО-а <К <К <к <К 107±4 <К н/и

ИЛ-10 <К <К <к <к <К <К 33±1 *

у-ИФН <К <К 30±2 49±4 <К <К н/и

ИЛ-12 <К <К <к 292+98 н/и н/и н/и

ИЛ-6 <К ¿К 74+6 <К <К <К 113±9

ИЛ-2 <К ¿к <К ¿К <К <К н/и

вариант М

Цитокины Время после заражения животных

1 сут 2 сут 3 сут 4 сут 5 сут 6 сут 7 сут

ФНО- а <:К <К <К <К <К <К <К

ИЛ-10 78 ¿К <к 12+1 31+5 <К <к

у-ИФН <К <к 96+5 42+8 116±67 101+14 167±70

ИЛ-12 <К 414±42 <К <К н/и н/и н/и

ИЛ-6 <К <К <К <К <К 57±6

ИЛ-2 <к <К 25±3 <к 41+6 <К 39+6

Примечание: концентрация ИЛ в контрольных сыворотках крови (К), полученных от животных после введения среды 199 на растворе Эрла (пкг/мл): ФНО-а - 23±3; ИЛ-10 -8+4; у-ИФН - 25±2; ИЛ-12 - 131 ±56; ИЛ-6 - 16±1; ИЛ-2 - 10±3. *- указаны данные для заболевших животных; у мышей без клинических проявлений содержание ИЛ в указанный срок было <К.

головного мозга не выделялся, и патоморфологическое исследование ЦНС не выявило каких-либо изменений. Наличие в крови ИЛ-2, ИЛ-6 и у-ИФН свидетельствует о развитии к 7-м суткам после заражения сбалансированного (ТЫ и 1Ъ2) иммунного ответа при данном типе инфекции.

Таким образом, инаппарантная форма КЭ, вызванная вариантом М, характеризуется развитием более раннего неспецифического иммунного ответа и

развитием сбалансированного специфического иммунного ответа. Острая форма КЭ, вызванная штаммами Абсеттаров и Эк-328, характеризуется более поздней активацией неспецифического иммунитета и преобладанием выраженного гуморального ответа, которого оказывается недостаточно для предотвращения развития заболевания.

5. Поведение популяции ВКЭ при смснс хозяина

Как было показано в табл.1, адаптированный к клещам вариант М образовывал точечные (<1 мм) бляшки в культуре клеток СПЭВ, при чем на 100 мелких бляшек практически всегда можно было обнаружить 1-2 крупные. Из популяции варианта М были клонированы крупная и мелкие бляшки (табл.8) в культуру клеток СПЭВ. После первого же пассажа клоны, которые были взяты при клонировании как мелкая бляшка, приобретали круинобляшечный или смешанный фенотип. При следующих пассажах в культуре клеток вирус, образующий крупные бляшки, вытеснял мелкобляшечный вариант. Для устранения примеси мелкобляшечного вируса были сделаны дополнительные клонирования, при которых отбирали крупные бляшки. Только после трех клонирований точечные бляшки при титровании перестали появляться. Полученные клоны 160/57, 118/58 и 103/84 образовывали в культуре клеток СПЭВ бляшки, похожие на бляшки родительского штамма Эк-328, которые к 8 дню достигали размера 6-8 мм и продолжали расти в течение всего периода наблюдения. Клон 116/59 образовывал бляшки диаметром 4-5мм. В параллельных экспериментах было предпринято клонирование для получения мелкобляшечного вируса. Только в результате четырех клонирований мелких бляшек были получены клоны 424 и 298, которые практически не содержали в популяции крупнобляшечных вариантов.

Оценка свойств вирионов клонов,, полученных из популяции варианта М, показала, что крупнобляшечные клоны восстановили свойства родительского штамма Эк-328, а мелкобляшечные сохранили характеристики варианта М. Вирионы клонов 160/57, 118/58, 103/84 и 116/59 обладали ГА, а также образовывали преципитат с AT в РИЭФ, направленный к катоду (рис.7). Клоны 424 и 298, подобно варианту М, не обладали ГА и в РИЭФ не образовывали катодного преципитата.

Таблица 8. Характеристика клонов, выделенных из популяции варианта М в культуре клеток СПЭВ

вирус Диаметр бляшки, использованной для: клонирования Диаметр бляшек полученных клонов после 1 пассажа в клетках СПЭВ (мм на 8 сутки)

клон 57 1 мм тчк:4:7=(1:1:7)*

клон 58 1 мм 7

кяон 59 1 мм 4

клон 83 1 мм гчк;3:7=(1:2:2)

клон 84 5 мм тчк:7 = (2:1)

клон 86 5 мм 7

Эк-328 7

вариант М тчк:7 = (100:1)

* - в скобках указано соотношение бляшек разного размера; тчк - точечные, т.е. <1мм.

анод

У Я ) м4 -

1 2 3 4 5

катод

Рисунок 7.

Анализ с помощью РИЭФ антигенных структур ВКЭ, накапливающихся в КЖ клеток СПЭВ, инфицированных клонами из популяции варианта М. 1 - клон 118/58, 2 -клон 116/59, 3 - клон 103/84, 4 - клон 160/57, 5 - клон 298.

Для клонов, полученных из популяции варианта М и прошедших 3-4 пассажа в культуре клеток СПЭВ, была определена нуклеотидная последовательность генов белка Е, а также фрагментов РНК, включающих позиции, где были выявлены различия между штаммом Эк-328 и вариантом М. Мелкобляшечный клон 298 сохранил а.к. остатки в белке Е, характерные для варианта М (табл.9). Все крупнобляшечные клоны имели треонин в позиции 426, как у штамма Эк-328. Следовательно, эта позиция имеет прямое отношение к реверсии свойств полученных нами клонов.

Таблица 9. Фенотипические и генетические характеристики клонов, выделенных из популяции варианта М.

вирус фенотип 5'НТО сп-ргМ Е NS2A NS4A

19 42 1 64 122 124 2190 426 2362 52 22 41

Эк-328 Э а с А К Е К с T t К S R

Вар. М м g/a а V К G К t I с N G К

160/57 Э а а V К G Е t T с N G К

118/58 Э а а V к Е К t T с N G К

116/59 э g а V к G Q t T с N G К

103/84 Э а а V Q G К t T с N G К

клон 298 - м о & а V к G К t I с N G К

клон 424 м н/о к/о н/о к G к t 1 с н/о н/о н/о

сп - сигнальная последовательность; н/о - не оценивали; прописные буквы -аминокислоты, строчные - нуклеотиды. Феногип: Э - размер бляшек и свойства вирионов, как у штамма Эк-328; М - размер бляшек и свойства вирионов, как у варианта М.

Как говорилось выше, замена в позиции 122 у варианта М приводит к повышению положительного заряда белка Е. У клона 118/58, который, как и штамм Эк-328 формировал крупные бляшки в культуре клеток СПЭВ и образовывал преципитат с АТ в РИЭФ, мы наблюдали обратную замену глицина на глутаминовую кислоту. У трех клонов 160/57, 116/59 и 103/84, также обладающих фенотипом штамма Эк-328, в позиции 122 сохранился глицин, как у варианта М. Тем не менее, у клона 160/57 появилась замена лизина на глутаминовую кислоту в позиции 124. У клона 116/59 в той же позиции лизин заменился на глутамин, а у клона 103/84 аналогичная замена лизина на глутамин появилась в позиции 64. Эти замены приводят к снижению положительного заряда. Как видно на рис.3, у крупнобляшечных клонов способность связываться с ГС была даже несколько ниже, чем у штамма Эк-328. Это свидетельствует о том, что а.к. замены в позициях 124 и 64 являются компенсирующими. У всех клонов н.т. в позициях 2190 и 2362 совпали с таковыми у варианта М, т.е. эти клоны являются истинными ревертантами. Вне зависимости от фенотипа все клоны, полученные из варианта М, имели те же а.к. остатки в сигнальной последовательности РгМ и в белках Ш2а и И84а, что и вариант М, т.е. эти замены, по-видимому, не имеют прямого отношения к описанному фенотипу. Представленные данные не позволяют сделать однозначного заключения о роли

замены в позиции 19 в 5'-НТО в изменении характеристик варианта М, но очевидно, что эта замена не может определять свойства вирионов этого вируса.

Таким образом, при репродукции варианта М в культуре клеток СПЭВ образуется большой спектр ревертантов с различными компенсирующими заменами. Анализ этих ревертантов показал, что характерный для адаптированного к клещам варианта М фенотип определяется двумя а.к. заменами в белке Е в позициях 122 и 426, а также определенную роль может играть замена в позиции 19 5-НТО.

Для клонов 160/57, 118/58, 116/59 и 103/84 провели оценку нейровирулентности и НИ для мышей линии BALB/c разного возраста (табл.10). Клопы 118/58 и 116/59 восстановили НИ, однако у клонов 160/57 и 103/84 НИ осталась низкой. Клоны 160/57 и 116/59 имеют разные компенсирующие замены в позиции 124 белка Е, клон 118/58 является обратным ревертантом, а клон 103/84 имеет компенсирующую замену, как клон 116/59, но в позиции 64. При этом а.к. замены в других позициях у всех этих клонов одинаковы. Таким образом, отличия в НИ клонов варианта М, обладающих всеми другими фенотипическими признаками, свойственными родительскому штамму Эк-328, могут быть связаны с конкретной а.к. заменой и ее позицией в белке Е, хотя также нельзя полностью исключить связь с заменами в других не изученных нами областях генома. Представленные данные позволяют предположить, что вирулентность вируса может определяться аффинностью связывания вирионов с рецепторами на каких-то определенных клетках, и компенсирующие замены модулируют взаимодействие с этими рецепторами.

Таблица 10. Вирулентность клонов варианта М для мышей линии BALB/c разного возраста.

Вирулентность для мышей

Вирус Мыши 6 г Мыши 12 г

БОЕ/ЛД50 БОЕ /ЛД50

и/ц и/ц и/п

Эк-328 2 0,5 16

Вариант М 0,4 2,5 250000

клон 160/57 8 0,3 >500

клон 118/58 1,6 1,6 2,5

клон 116/59 1 0,3 1

клон 103/84 6,3 2 >500

Способность полученных ревертантов персистировать в ЦНС была проверена па одном из клонов из популяции варианта М, восстановившим свою НИ. При и/п заражении мышей сублеталыюй дозой клона 116/59 3 мыши не заболели, а у 2 мышей наблюдали развитие параличей задних конечностей. На 6 неделе они полностью выздоровели. У всех животных, не заболевших и выздоровевших, на фоне иммунодепрессии, вызванной введением циклофосфана, развития заболевания пе наблюдали и инфекционный вирус в мозге не выявляли. При проверке методом ОТ-ПЦР оказалось, что у всех мышей в мозге присутствует вирусная РНК. Таким образом, учитывая отсутствие клинических признаков заболевания и отдаленные сроки после начала инфекции, можно утверждать, что клон 116/59 в сублеталыюй дозе вызвал у них персистентную инфекцию.

Таким образом, мы показали, что варианты ВКЭ, обладающие повышенной аффинностью связывания с ГАГ, а также варианты, ревертировавшие по этому свойству как за счет обратной, так и за счет различных компенсирующих замен, могут вызывать все типы инфекций: инаппарантную, острую и персистентную.

Было изучено поведение популяции варианта M в пассажах in vitro и in vive. При пассажах в культуре клеток СПЭВ была выбрана схема, предусматривающая пассирование вируса в двух режимах: три независимых линии вели таким образом, что КЖ инфицированных клеток брали для следующего пассажа до наступления ЦПД (24-36 час после начала инфекции), а 3 линии - после наступления ЦПД (48-72 час). Для всех линий пассажей 2 раза материал был заморожен между пассированием. Таким образом, было сделано 12 пассажей линий с ЦПД и 20 пассажей для линий без ЦПД. Полученные вирусы были оттитрованы методом бляшек.

Во всех линиях количество крупных бляшек увеличилось уже на первых пассажах до 7-10% и при дальнейшем пассировании колебалось от пассажа к пассажу, но оставалось на данном уровне. Во всех 6 линиях вирус не приобрел способности формировать направленный к катоду преципитат вирионов с AT в РИЭФ. Для одной из линий, пассированной без выраженного ЦПД, была определена нуклеотидная последовательность в областях генома, где были найдены замены между штаммом Эк-328 и вариантом М. Только в 19 позиции в 5!НТО у пассированного в культуре клеток СПЭВ вируса наблюдали реверсию к штамму Эк-328. НИ этого вируса повысилась до 600 БОЕ/ЛД50, однако не достигла уровня, свойственного штамму Эк-328.

Полученные данные показывают, что в отличие от случая клонирования вируса методом бляшек, т.е. заражения с низкой множественностью, при пассажах адаптированного к клещам варианта M в культуре клеток СПЭВ

формируется стабильная гетерогенная популяция с содержанием 7-10% крупнобляшечного варианта.

При пассировании варианта М через мозг юных мышей наблюдали постепенное нарастание количества крупнобляшечных вариантов в популяции. К 12 пассажу соотношение крупных и мелких бляшек было 1:1. Полученный вирус был назван RNm. Вирионы этого вируса нерегулярно образовывали катодный преципитат с АТ в РИЭФ. Секвенирование фрагмента РНК варианта RNm, кодирующего белок Е, показало, что он сохранил нуклеотидпую последовательность варианта М (табл. 11). Из популяции варианта RNm были выделены 2 крупнобляшечных клона 46 и 48. Вирионы этих клонов вели себя в РИЭФ, как вирионы штамма Эк-328. При секвенировании генов Е этих клонов было установлено, что все они имели нуклеотидную последовательность, аналогичную таковой родительского штамма Эк-328, включая н.т. в позициях 2190 и 2362, по которым вариант М отличается от родительского штамма Эк-328. У этих клонов и в позиции 9888 был уридин, как у родительского штамма. Аминокислотные замены могут иметь адаптивный характер и ревертировать при изменении селективного воздействия, однако, реверсия трех н.т. замен в разных частях генома крайне маловероятна, и их можно использовать в качестве маркера, позволяющего различить вариант М и штамм Эк-328. Таким образом, крупнобляшечные клоны, выделенные из популяции варианта М, переадаптированного к мозгу белых мышей, оказались примесью родительского штамма Эк-328, сохранившейся в популяции варианта М в процессе 17 пассажей через клещей. Это показывает, что ВКЭ может существовать в виде гетерогенной популяции не только при репродукции в клетках млекопитающих, но и в клещах.

В одном из экспериментов взрослые мыши линии BALB/c были и/п инфицированы 10000 БОЕ варианта М. Несколько мышей заболело. На пике болезни у них были взяты кровь и мозг. При титровании сгустка крови и мозговой суспензии методом бляшек была выявлена гетерогенность вирусной популяции. Соотношение крупных и мелких бляшек было примерно 1:1. Из этих популяций были изолированы крупнобляшечные клоны 51, 53 и 56. Вирионы всех клонов вели себя в РИЭФ как вирионы штамма Эк-328. Секвенирование гена Е показало, что данные вирусы являются истинными ревертантами. Аминокислотные остатки в позициях 122 и 426 были как у штамма Эк-328, но клоны сохранили н.т. замены, по которым вариант М отличается от родительского штамма. Это свидетельствует о том, что при репродукции адаптированного к клещам варианта М in vivo изменение структуры популяции может идти за счет появления ревертантов.

Таблица 11. Характеристика ревертантов, появившихся в популяции варианта М при пассажах in vivo.

вирус Характеристика вируса и источник выделения клонов Размер бляшек (мм) РИЭФ* замены в гене белка Е

несинонимические. синонимии-ческие

122 426 2190 2362

Эк-328 - 5-6 + Glu Thr с t

вариант М - тчк - Gly lie t с

ЮЧт 11 пассажей варианта М через мозг мышей 5:тчк =1:1 +/- Gly lie t с

клон 46 Я1Мт 5 + Glu Thr с t

клон 48 ШЧт 5 + Glu Thr с t

клон 51 кровь ОТ мыши, заболевшей после и/п введения варианта М 5 + Glu Thr t с

клон 53 мозг от мыши, заболевшей после и/п введения варианта М 5 + Glu Thr t с

клон 56 мозг от мыши, заболевшей после и/п введения варианта М 5 + Glu Thr t с

* + - наличие катодного преципитата вирионов с АТ, - - отсутствие катодного преципитата вирионов; тчк - точечные (< 1мм).

Далее мы попытались оценить влияние данных вирусов друг на друга при одновременной репродукции. Для этого клетки СПЭВ были инфицированы раздельно и смесью вирусов, взятых в разных соотношениях. Полученное потомство оценивали по соотношению крупных и мелких бляшек при титровании в культуре клеток СПЭВ, а также по его поведению в РИЭФ. Очевидно, что такой эксперимент может дать только приблизительные данные о соотношении вирусов с разными фенотипами в популяции. Тем не менее, было поставлено 3 подобных эксперимента, и во всех были получены сходные результаты. Данные одного из этих опытов приведены в табл.12. При равном количестве штамма Эк-328 и

варианта М в инокуляте при средней множественности заражения вирусы с разным фенотипом не мешают репродукции друг друга, а при низкой множественности титры варианта М даже увеличиваются (комплементация). При определенных соотношениях вирусов в инокуляте вариант М может снижать титры штамма Эк-328 и наоборот (интерференция).

Таблица 12.'Характеристика вирусного потомства при смешанной инфекции клеток СПЭВ вариантом М и штаммом Эк-328, взятых в разных соотношениях._

Иноку лят Вирусное потомство

множественность заражения (БОЕ/клетку) Титр вируса (1§БОЕ/мл) РИЭФ***

Общая Эк-328 М вариант общий Эк-328* вариаитМ**

1,000 1,000 - 7,6 7,6 - +

0,100 0,100 - 7,3 7,3 - +

1,000 - 1,000 6,7 п 6,7 -

0,100 - 0,100 6,7 _**** 6,7 -

0,010 - 0,010 6,7 6,7 -

1,000 0,500 0,500 7,1 7,1 6,7 +

0,550 0,500 0,050 7,1 7,1 5,5 +

0,550 0,505 0,005 6,3 6,3 - +

0,550 0,050 0,500 6,7 6,0 6,7 -

0,100 0,050 0,050 7,1 7,1 8,5 -

* - оценивали по количеству крупных бляшек; ** - оценивали по количеству точечных бляшек; ***+ - наличие катодного преципитата вирионов, - - отсутствие катодного преципитата вирионов. В предварительных экспериментах было показано, что вирионы штамма Эк-328, полученные при концентрировании КЖ, содержащей 61§БОЕ, образуют катодный преципитат с АТ в РИЭФ. **** - как отмечалось ранее, так и данном эксперименте, при титровании варианта М иногда на фоне большого количества точечных бляшек можно было выявить 1 -2 крупные бляшки.

Необходимы тщательные исследования по изучению взаимодействия описанных вирусов при смешанной инфекции на генетическом уровне, а также изучение механизмов описанной интерференции и комплементации. Тем не менее, этот эксперимент и результаты обратных пассажей адаптированного к клещам варианта М показывают, что в клетках млекопитающих ВКЭ может длительно существовать в виде стабильной гетерогенной популяции, в которой присутствует как варианты, обладающие селективным преимуществом при

репродукции в клетках млекопитающих, так и варианты, имеющие преимущества при репродукции в членистоногих.

При выделении мелкобляшечных клонов из популяции варианта М, т.е. при создании эффекта «бутылочного горлышка», в результате 1 пассажа в культуре клеток мы получили целый набор ревертантов с обратными и различными компенсирующими мутациями. Это свидетельствует о том, что образование мутантов является при определенных условиях частым событием при репродукции ВКЭ. Нельзя исключить, что подобные мутанты в следовых количествах могут возникать и длительно существовать в любой популяции, тем не менее, за счет интерференции основной вирусной компоненты они так и остаются в следовых количествах. При клонировании интерференция основной компоненты популяции снижается, и это приводит к резкому изменению структуры популяции с преобладанием более приспособленного к данным условиям варианта вируса.

Очевидным является вопрос: если адаптация ВКЭ к клещам приводит к появлению таких мутантов с ГАГ-связывающим фенотипом, то подобные вирусы должны постоянно выявляться в клещах. Естественно нельзя ожидать, что все изоляты ВКЭ, выделенные из клещей, должны обладать таким фенотипом, поскольку неизвестно, на какой стадии адаптации в клещам находится этот вирус, поскольку ВКЭ может длительное время циркулировать в популяции клещей без попадания в млекопитающих на счет трансфазовой или трансовариальной передачи или при совместном питании зараженных и незараженных клещей. Также не известно, как быстро такой вариант может отбираться в клещах в природных условиях. Из клещей, собранных в разных регионах России, часто выделяют вирусы с мелкобляшечиым фенотипом. Нами было просмотрено более 100 вируссодержащих клещевых суспензий, приготовленных из клещей, собранных в разных регионах РФ. Более половины имели мелкобляшечный фенотип или представляли собой смешанную популяцию, которая в процессе лабораторных пассажей через мозг белых мышей или в культуре клеток СПЭВ превращались в вирусы с крупными бляшками (Карганова. 1991; Погодина и др., 1991; Карганова и др., 1992, 1994; неопубликованные данные). Часть из этих вирусов были изучены подробнее, и было показано, что их свойства близки свойствам варианта М, в том числе у этих вирусов отсутствовала ГА, вирионы не образовывали катодные преципитаты с AT в РИЭФ. Нужны специальные исследования, чтобы установить, что представляют собой изоляты ВКЭ из клещей с мелкобляшечиым фенотипом, связана ли мелкая бляшка с особенностями связывания вирионов с ГАГ клетками, и какую роль в их возникновении играет длительность пребывания в

клещах. Тем не менее, очевидно, что в природных очагах в клещах циркулируют вирусы, обладающие фенотипом, близким адаптированному в лабораторных условиях к клещам варианту М, который представлен в этой работе.

Полученные данные относятся к модели, которая не может быть просто экстраполирована на природную популяцию ВКЭ. Тем не менее, описанный нами полиморфизм популяции этого вируса позволяет объяснить его способность к быстрой репродукции в клеще или прокормителе при их чередовании. Схематично это можно объяснить следующим образом. Быстрое размножение вируса в клеще или прокормителе осуществляется за счет активной репродукции либо уже присутствующих в популяции, либо вновь возникающих мутантов, приспособленных к репродукции именно в этом виде хозяина. Основная популяция не может подавлять репродукцию этих мутантов, поскольку они значительно более приспособлены к новым условиям. Подобная стабильная ситуация будет существовать до тех пор, пока регулярно будет осуществляться чередование характерной для данного локального очага пары хозяев ВКЭ (клещ -данный вид прокормителя). Отсутствие эффекта бутылочного горлышка при передаче вируса обусловлено длительным периодом питания клеща на прокормителе, в течение которого возможна активная репродукция вируса как в клеще, так и в организме прокормителя, и обмен новым вирусным потомством между хозяевами. При инфицировании прокормителя низкой дозой вируса, возможно появление новых вариантов ВКЭ, при этом неожиданные мутанты, по-видимому, могут возникать при размножении вируса в совершенно новом хозяине (прокормителе), с которым этот вирус еще не встречался. Таким образом, стабильность популяции ВКЭ в локальном очаге будет определяться постоянством видов хозяев (прокормителей и клещей), а соотношение вариантов с низкой и высокой НИ - активностью циркуляции вируса, т.е. числом прокормителей определенного вида.

Представленные нами данные показывают, что важную роль в этой изменчивости играют мутации, определяющие начальные этапы взаимодействия ВКЭ с клетками. Определенное значение, по-видимому, могут иметь и мутации, обеспечивающие наиболее эффективное взаимодействие вирусной РНК и белков и клеточных факторов, формирующих репликативный комплекс, или участвующих в подавлении защитных средств клетки, в первую очередь, индукции ИФН или ИФН сигнальных путей.

ВЫВОДЫ

1. Адаптация штамма Эк-328 вируса клещевого энцефалита к клещам Hyalomma marginatum marginatum сопровождается набором несинонимических замен в геноме: нуклеотидными заменами в 5'-НТО, аминокислотными заменами в сигнальной последовательности белка ргМ, в области белков Е, NS2a, NS4a. Замены в белке Е Glui22->Gly и Thr426—>11е определяют основные свойства адаптированного к клещам варианта М, отличающие его от адаптированного к мышам родительского штамма Эк-328.

2. ВЮ имеет два типа рецепторов на поверхности клеток млекопитающих: высокоаффинный и низкоаффинный. Адаптация ВКЭ к клещам связана с появлением мутаций в белке Е, повышающих аффинность связывания вирионов с гликозаминогликанами на поверхности клетки, которые служат низкоаффинным рецептором для этого вируса.

3. При репродукции в клетках млекопитающих вариант ВКЭ с ГАГ-связывающим фенотипом восстанавливает способность к низкоаффинному связыванию с ГАГ клеток за счет появления обратных и компенсирующих замен. Свойства ревертантов зависят от характера и расположения компенсирующих замен в белке Е.

4. Получена модель инаппарантной формы КЭ при периферическом заражении лабораторных мышей адаптированным к клещам вариантом М, которая характеризуется формированием длительного протективного иммунитета без выраженного синтеза антител к основному вирусному гликопротеину Е. Особенности инаппарантной инфекции определяются быстрым удалением вируса из кровотока за счет повышенной сорбции вирионов на эритроцитах, ранней активации неспецифического иммунитета, а также активацией Thl-лимфоцитов.

5. На экспериментальной модели показано, что ВКЭ может существовать в виде гетерогенной популяции, содержащей варианты, обладающие селективным преимуществом при репродукции либо в клещах, либо в млекопитающих. Переадаптация к млекопитающим адаптированного к клещам вируса происходит за счет изменения соотношения этих вариантов в популяции, а также за счет появления новых мутантов с более высокой приспособленностью к репродукции в данной системе.

6. Скорость изменения генетической структуры популяции ВКЭ и разнообразие мутантов определяется характеристикой хозяина и наличием эффекта "бутылочного горлышка".

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Тимофеев А.В., Карганова Г.Г., Мальдов Д.Г., Лашкевич В.А., Эльберт Л.Б. Обнаружение возможного рецептора для вируса клещевого энцефалита с помощью антиидиотипических антител. //ДАН СССР. - 1990.-Т. 315(1).- С. 226-228..

2. Дживанян Т.И., Карганова Г.Г., Соболев С.Г., Королев М.Б., Каштанова Г.М., Чупринская MB., Лашкевич В.А. Свойства частиц, формирующихся при воспроизведении острой инфекции адаптированного к клещам H.plumbeum вируса клещевого энцефалита. //Вопр. вирусол.-1991,- № 4.- С.297-300.

3. Погодина В.В., Бочкова Н.Г., Дживанян Т.Н., Левина Л.С., Карганова Г.Г., Рясова Р.А., Сергеева В.А., Лашкевич В.А. Явление антигенной дефектности у циркулирующих в природе штаммов вируса клещевого энцефалита и его возможная связь с серонегативными формами заболевания. //Вопр. вирусол.-1992,-№2.- С. 103-107.

4. Maldov D.G., Karganova G.G., Timofeev A.V. Tick-borne encephalitis virus interaction with the target cells. //Arch. Virology.- 1992.- Vol.127.- P.321-325.

5. Васильев B.B., Злобин В.И., Дживанян Т.И., Карганова Г.Г., Верхозина М.М., Воронко И.В., Гусарова Н.А., Лашкевич В.А. Изучение электрофоретической подвижности вирусспецифических.- белков штаммов вируса клещевого энцефалита, выделенных в различных регионах СНГ. //Вопр. вирусол.-1993.-№1.-С.11-16.

6. Дрокин Д.А., Злобин В.И., Карганова Г.Г., Вихорева Т.В., Якименко В.В., Дживанян Т.И., Лашкевич В.А. Изменение геномов штаммов вируса клещевого энцефалита в результате пассажей на мышах. //Вопр. вирусол.-1994.-№1.-С. 160-162.

7. Мальдов Д.Г., Гмыль Л.В., Карганова Г.Г. Изменение активности • Na+,K+-АТФазы при репродукции вируса клещевого энцефалита в культуре клеток СПЭВ. //Вопр. Вирусол.-1997.-№1.-С. 23-26.

8. Timofeev A.V., Ozherelkov S.G., Pronin A.V., Deeva A.V., Karganova G.G., Elbert L.B., Stephenson J.R. Immunological basis for protection in a murine model of tickborne encephalitis by a recombinant adenovirus carrying the gene encoding the MS 1 non-structural protein. //J. Gen. Virol.-1998.-Vo[.79.- P. 689-695.

9. Тимофеев A.B., Кондратьева Я.Ю., Карганова Г.Г., Стефенсон Дж. Протективная активность бактериальной плазмиды, несущей ген неструктурного белка NS1 вируса клещевого энцефалита. //Вопр. Вирусол.-2001.-№ 1.-С.22-24.

10. Тимофеев A.B., Кондратьева Я.Ю., Орловский В.Г., Локтев В.Б., Карганова Г.Г. Изучение корреляции тяжести течения заболевания клещевым энцефалитом и концентрацией интерлейкинов 2 и 6 в сыворотках больных клещевым энцефалитом. //Терапевтический архив.-2002.-№ 6.-С.22-23.

И.Романова Л.Ю., Козловская Л.И., Шевцова A.C., Карганова Г.Г. Метод доказательства отсутствия РНК вируса клещевого энцефалита в биопробах. //Вопр. вирусап.- 2006.- №1.- С.38-41.

12. Романова Л.Ю., Гмыль Л.В., Локтев В.Б., Протопова Е.В., Дживанян Т.И., Лашкевич В.А., Карганова Г.Г. Изменение антигенной структуры поверхностного гликопротеина Е вируса клещевого энцефалита при его адаптации к клещам и млекопитающим. //Вопр. Вирусол,- 2006.- №6.- С.31-34.

13. Romanova L.I., Gmyl А.P., Dzhivanian T.I., Bakhmutov D.V., Lukashev A.N., Gmyl L.V., Rumyantsev A.A., Burenkova L.A., Lashkevich V.A., Karganova G.G. Microevolution of Tick-Bome Encephalitis virus (TBEV) in course of host alternation.//Virology.-2007.-Vol.362(l).-P.75-84.

14. Лашкевич B.A., Карганова Г.Г. Современные аспекты профилактики клещевого энцефалита. //Вопр. вирусол.- 2007,- №5.- С.31 -32.

Монография

1. Timofeev A.V., Karganova G.G. Tick-borne encephalitis vaccine: from past to future.-2003.-Cnn,- Москва, РФ.- 44C.

Санитарные правила

1. Санитарно-эпидемиологические правила 3.1.3.2352-07 «Профилактика клещевого вирусного энцефалита».

Научные статьи, опубликованные в сборниках:

1. Карганова Г.Г., Дживанян Т.И., Терешкина Н.В., Гмыль Л.В., Антыкова Л.П., Лашкевич ВА. Изменение патогенетических и иммуногенных характеристик вируса клещевого энцефалита при его адаптации к клешам и млекопитающим. /"Актуальные проблемы природноочаговых инфекций". Сборник материалов II республиканской научно-практической конференции, посвященной 75-летию инфекционной службы Удмуртии.-1998.-Ижевск. С.167-169.

2. Карганова Г.Г. Emerging потенциал переносимых клещами флавивирусов млекопитающих. /"Эпидемиологическая обстановка и стратегия борьбы с клещевым энцефалитом на современном этапе". Материалы расширенного пленума проблемной комиссии "Клещевой и другие вирусные энцефалиты" РАМН.-2003 .-Москва-С. 16-17.

3. Кондратьева Я.Ю., Локтев В.Б., Орловский В.Г., Куржуков Г.П., Тимофеев A.B., Карганова Г.Г. Обнаружение антител к белкам Е, NSI, NS3 и NS5 вируса клещевого энцефалита в сыворотках крови больных КЭ. /"Актуальные

проблемЕл эпидемиологии и профилактики инфекционных болезней". Материалы Всероссийской научно-практической конференции.-2004,-Самара,- Т.2.-С.219-221.

4. Романова Л.Ю., Бахмутов Д.В., Дживанян Т.И., Гмыль Л.В., Румянцев A.A., Лукашев А.Н., Гмыль А.П., Карганова Г.Г. Молекулярные основы изменения фенотипических характеристик вируса клещевого энцефалита при его адаптации к клещам и млекопитающим. /"Актуальные проблемы эпидемиологии и профилактики инфекционных болезней". Материалы Всероссийской научно-практической конференции.-2004.-Самара.-Т.2.-С.225-229.

5. Романова Л.Ю., Козловская Л.И., Дживанян Т.И., Гмыль Л.В., Румянцев A.A., Лукашев А.Н., 1'мыль А.П., Карганова Г.Г. Молекулярные основы аттенуации вируса клещевого энцефалита при его адаптации к клещам. /"Окружающая среда и здоровье". Материалы всероссийской научно-практической конференции.-2005.- Суздаль.-С. 182-185.

6. Карганова Г.Г., Гмыль А.П., Романова Л.Ю., Гмыль Л.В. Особенности эволюции переносимых клещами арбовирусов. /«Арбовирусы и арбовирусные инфекции». Материалы расширенного пленума проблемной комиссии «Арбовирусы» и научно-практической конференции «Арбовирусы и арбовирусные инфекции»,- 200б.-Астрахань,- С.30-35.

7. Романова Л.Ю., Козловская Л.И., Рогова Ю.В., Дживанян Т.И., Гмыль А.П., Карганова Г.Г. Стабильность популяции адаптированного к клещам варианта вируса клещевого энцефалита с повышенной сорбцией на клеточных гликозаминогликанах при пассажах в культуре клеток СПЭВ. /«Медицинская вирусология». Труды ИПВЭ им. М.П.Чумакова РАМН.-2007.-Москва.-Т.24,-С.73-79.

8. Шевцова A.C., Рогова Ю.В., Романова Л.Ю., Кондратьева Я.Ю., Карганова Г.Г. Различия в характере взаимодействия с интерфероновой системой клетки, выявленные у двух близкородственных вариантов вируса клещевого энцефалита. /«Медицинская вирусология». Труды ИПВЭ им. М.П.Чумакова РАМН.-2007.-Москва.-Т.24.-С.89-96.

9. Романова Л.Ю., Козловская Л.И., Карганова Г.Г. Взаимодействие вирионов с клеточными гепарансульфат гликозаминогликанами и нейроинвазивность вируса клещевого энцефалита. /«Медицинская вирусология». Труды ИПВЭ им. М.П,Чумакова РАМН,- 2007.-Москва.-Т.24.-С.273-279.

10. Карганова Г.Г. Клещ как фактор микроэволюции вируса клещевого ' энцефалита. /«Паразитология в XXI веке - проблемы, методы, решения».

Материалы IV Всероссийского съезда паразитологического общества при РАН.-2008.-С.-Петербург.-Т.2.-С. 23-27.

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Карганова, Галина Григорьевна

Список сокращений.

Введение.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Общая характеристика флавивирусов.

1.1 . Классификация флавивирусов

1.2 . Эволюция флавивирусов

1.3 . Строение вирионов

1.4 Характеристика генома и вирусных белков

1.5 . Репродукция флавивирусов в клетке

2. Патогенез клещевого энцефалита.

2.1. Характер инфекции.

2.2. Факторы, влияющие на патогенез инфекции, вызванной ВКЭ

2.3. Молекулярные детерминанты вирулентности флавивирусов

Глава 3. Основные механизмы микроэволюции РНК-содержащих арбовирусов.

3.1. Основные характеристики микроэволюции РНК-содержащих вирусов

3.2. Факторы, влияющие на приспособленность вирусной популяции 77 Собственные исследования.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Ml. Использованные в работе вирусы.

М2. Плазмиды.

МЗ. Культуры клеток.

М4. Животные.

М5. Клещи.

Мб. Иммунные сыворотки и моноклональные антитела.

М7. Олигонуклеотиды.

М8. Титрование инфекционного вируса.

М9. Клонирование вируса методом бляшек.

М10. Титрование ВКЭ на мышах.

Mil. Опыт на клещах.

Ml2. Реакция гемагглютинации.

М13. Гистологическое исследование.

Ml4. Моделирование инфекции.

Ml5. Определение протективной активности.

Ml6. Концентрирование ВКЭ из КЖ инфицированных клеток.

Ml7. Иммуноферментный анализ (ИФА).

М18. Определение концентрации ИЛ в сыворотках крови.

Ml 9. Определение концентрации а/р интерферона (ИФН) в сыворотках крови мышей.

М20. Ракетный иммуноэлектрофорез (РИЭФ).

М21. Сорбция на гепарин сефарозе (ГС).

М22. Сорбция вируса на эритроцитах мыши.

М23. Электрофорез белков в полиакриламидном геле (ПААГ).

М24. Реакция иммунопреципитации (РИП) вирусных белков.

М25. Выделение РНК.

М26. Обратная транскрипция.

М27. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

М28. Аналитический электрофорез ДНК в агарозном геле.

М29. Препаративный электрофорез и выделение продуктов ПЦР из легкоплавкой агарозы.

М30. Определение нуклеотидной последовательности.

МЗ1. Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей.

М32. Метод доказательства отсутствия РНК ВКЭ в биопробах.

МЗЗ. Определение количества копий РНК ВКЭ в КЖ инфицированных клеток СПЭВ с помощью ПЦР в реальном времени.

М34. Получение препарата цитомембран.

М35. Измерение активности Na+,K+-ATOa3bi.

М36. Изучение адсорбции вирионов ВКЭ на клетках.

М37. Получение антиидиотипической сыворотки к белку Е ВКЭ.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

Глава 1. Особенности эволюции переносимых клещами флавивирусов.

Литературные данные.

Л. 1.1. Филогенетические связи в группе переносимых клещами флавивирусов млекопитающих

Л. 1.2. Разнообразие штаммов ВКЭ

Собственные результаты.

С. 1.1. Филогенетические связи между штаммами ВКЭ по данным для полных геномов

С. 1.2. Филогенетические связи между штаммами ВКЭ по данным для фрагментов РНК, кодирующих белок Е

С.1.3. Выявление генотип- и хозяин-специфических детерминант в геноме ВКЭ

Глава 2. Изменение свойств вируса КЭ при адаптации к клещам и млекопитающим и выявление хозяин-специфических генетических детерминант.

Литературные данные.

Л.2.1. Хозяин-специфические детерминанты в геноме флавивирусов

Л.2.2. Фенотипические и генетические изменения вирусов ККЭ при адаптации к клещам и млекопитающим

Собственные результаты.

С.2.1. Общая характеристика использованных в работе вирусов

С.2.1.1 Репродукция варианта М и штамма ЭК-328 в клетках СПЭВ.

С.2.1.2. Вирулентность варианта М и штамма Эк-328 для мышей

С.2.1.3. Репродукция варианта М и штамма Эк-328 в клещах Н. marginatum 181 С.2.2. Секвенирование генома адаптированного к клещам варианта М

С.2.3 Сорбция вирионов родительского штамма ЭК-328 и варианта М на гепарин-сефарозе

С.2.4. Изучение антигенной структуры белка Е штамма ЭК-328 и варианта М

Глава 3. Взаимодействие вируса клещевого энцефалита с рецепторами на поверхности клеток.

Собственные результаты.

С.3.1 Изучение основных характеристик адсорбции вирионов ВКЭ на поверхности клеток

С.3.2. Доказательство белковой природы высокоаффинного рецептора для ВКЭ

С.3.3. Изучение природы клеточных рецепторов с помощью антиидиотипической сыворотки к белку Е

С.3.4 Изменение активности Na+, К+-АТФазы при репродукции ВКЭ в культуре клеток СПЭВ

Глава 4. Изменение патогенетических характеристик ВКЭ при адаптации к клещам и переадаптации к млекопитающим.

Литературные данные.

JI.4.1 Распространение вируса в организме млекопитающего

JI.4.2. Формирование иммунного ответа при КЭ

Собственные результаты.

С.4.1. Сравнение вирулентности для мышей штамма ЭК-328 и варианта М с использованием данных вирусологического и гистологического анализа

С.4.2. Характеристика инфекции, вызванной вариантами вируса КЭ при периферическом введении мышам

С.4.3 Сорбция вирусов на эритроцитах мыши

С.4.4 Синтез противовирусных антител в процессе вирусной инфекции

Рис. 4-5. продолжение

С.4.5 Динамика появления ключевых интерлейкинов при острой и инаппарантной формах инфекции, вызванной данными вариантами ВКЭ

С.4.7. Оценка чувствительности штамма Эк-328 и варианта М к экзогенному интерферону

С.4.8 Изучение связи тяжести заболевания с концентрацией ИЛ-2 и ИЛ-6 и содержанием антител к белкам ВКЭ в сыворотках крови людей, больных клещевым энцефалитом

С.4.9 Характеристика протективного иммунитета, индуцируемого вариантом М

Глава 5. Поведение популяции ВКЭ при смене хозяина.

Собственные результаты.

С.5.1 Получение крупнобляшечных ревертантов в культуре клеток СПЭВ 289 С.5.2 Свойства вирионов клонов, полученных из популяции варианта М в культуре клеток СПЭВ

С.5.3 Секвенирование фрагментов РНК клонов, выделенных из популяции варианта М

С.5.4 Оценка вирулентности для мышей дополнительно клонированных ревертантов

С.5.5 Сорбция ревертантов из популяции варианта М на эритроцитах мыши 300 С.5.6 Пассажи варианта М в культуре клеток СПЭВ

С.5.7. Поведение популяции варианта М при репродукции in vivo

С.5.8 Смешанная инфекция клеток СПЭВ родительским штаммом Эк-328 и вариантом М

Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизмы микроэволюции вируса клещевого энцефалита"

В последнее время, благодаря усилиям нескольких научных коллективов отмечаются большие успехи в области молекулярной эпидемиологии КЭ. Установлены ареалы трех генотипов ВКЭ, получены предварительные данные, указывающие на возможную циркуляцию в природе новых генетических вариантов этого вируса. Тем не менее, полученной информации недостаточно для объяснения различных уровней заболеваемости в разных регионах России. Остаются открытыми вопросы о том, какие факторы определяют активность очагов, цикличность подъема заболеваемости, и существует ли связь между уровнем заболеваемости и вирулентностью циркулирующих вариантов ВКЭ в данном регионе.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ: изучение механизмов микроэволюции популяции ВКЭ. ЗАДАЧИ РАБОТЫ:

- на основе данных филогенетического анализа оценить основные факторы, определяющие эволюцию ВКЭ;

- исследовать начальные этапы взаимодействия ВКЭ с клетками и их роль в изменчивости этого вируса;

- изучить механизмы изменения генетической структуры популяции при смене хозяина.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

ВНЕДРЕНИЕ

Определена первая полная нуклеотидная последовательность генома представителя прибалтийской группы сибирского генотипа ВКЭ (штамм Эк-328 GenBank http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank, № DQ486861).

Разработан корректный методический подход, позволяющий контролировать отсутствие персистенции вируса в ЦНС (Вопросы вирусологии, 2006).

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Материалы диссертации представлены на заседании Ученого совета ГУ ИПВЭ им. М.П.Чумакова РАМН (2007), на научной конференции, посвященной 90-летию со дня рождения М.П.Чумакова (Москва, 1999), на региональных научно-практических конференциях (Якутск, 2007; Красноярск, 2008; Пермь, 2008), на Всесоюзных и Всероссийских научно-практических конференциях (Иркутск, 1990; Алма-Ата, 1991; Ярославль, 1992; Ижевск, 1998; Новосибирск, 2002; Пермь, 2003; Самара, 2004; Красноярск, 2005), на Международных конференциях по арбовирусам и арбовирусным инфекциям (Москва, 1989), по проблемам инфекций в клинической медицине (Санкт-Петербург, 2002), по ликвидации и элиминации инфекционных болезней (Санкт-Петербург, 2003), по возникающим болезням и выживанию (IMED Вена-Австрия, 2007), на VIII и X Международных конгрессах по вирусологии (Берлин-Германия, 1990; Иерусалим-Израиль, 1996), на III Совместном совещании европейского общества борьбы с вирусными заболеваниями и европейской группы по быстрой вирусной диагностике (Страсбург-Франция, 1991), на V Интернациональном симпозиуме по (+)РНК содержащим вирусам (Флорида, 1998), на IV Конгрессе Европейского общества по инфекционным болезням (ESEI Лиссабон-Португалия, 2007); на VIII Всероссийском съезде эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2002), на IV Всероссийском съезде общества паразитологов (Санкт-Петербург, 2008); на расширенных пленумах проблемных комиссий по клещевым и другим вирусным энцефалитам (Москва, 2003) и арбовирусам (Астрахань, 2006), на Бюро Отделения профилактической медицины РАМН (Москва, 2008).

ПУБЛИКАЦИИ

По результатам работы опубликовано 14 статей в реферируемых научных журналах, из них 3 за рубежом, 1 монография и 10 статей в научных сборниках.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Карганова, Галина Григорьевна

выводы

1. Адаптация штамма Эк-328 вируса клещевого энцефалита к клещам Hyalomma marginatum marginatum сопровождается набором несинонимических замен в геноме: нуклеотидными заменами в 5'-НТО, аминокислотными заменами в сигнальной последовательности белка ргМ, в области белков Е, NS2a, NS4a. Замены в белке Е Glu J22—»Gly и Thr426—>Пе определяют основные свойства адаптированного к клещам варианта М, отличающие его от адаптированного к мышам родительского штамма Эк-328.

2. ВКЭ имеет два типа рецепторов на поверхности клеток млекопитающих: высокоаффинный и низкоаффинный. Адаптация ВКЭ к клещам связана с появлением мутаций в белке Е, повышающих аффинность связывания вирионов с гликозаминогликанами на поверхности клетки, которые служат низкоаффинным рецептором для этого вируса.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Научные статьи, опубликованные в рецензируемых научных журналах

1. Тимофеев А.В., Карганова Г.Г., Мальдов Д.Г., Лашкевич В.А., Эльберт Л.Б. Обнаружение возможного рецептора для вируса клещевого энцефалита с помощью антиидиотипических антител //ДАН СССР. — 1990.-т. 315(1).-С. 226-228.

2. Дживанян Т.Н., Карганова Г.Г., Соболев С.Г., Королев М.Б., Каштанова Г.М., Чупринская М.В., Лашкевич В.А. Свойства частиц, формирующихся при воспроизведении острой инфекции адаптированного к клещам H.plumbeum вируса клещевого энцефалита //Вопр. вирусол. - 1991. - № 4. С.297-300.

3. Погодина В.В., Бочкова Н.Г., Дживанян Т.Н., Левина Л.С., Карганова Г.Г., Рясова Р.А., Сергеева В.А., Лашкевич В.А. Явление антигенной дефектности у циркулирующих в природе штаммов вируса клещевого энцефалита и его возможная связь с серонегативными формами заболевания //Вопр. вирусол. - 1992. - №2. - С. 103-107.

4. Maldov D.G., Karganova G.G., Timofeev A.V. Tick-borne encephalitis virus interaction with the target cells //Arch. Virology. - 1992. - V.127. - P. 321-325.

5. Васильев B.B., Злобин В.И., Дживанян Т.Н., Карганова Г.Г., Верхозина М.М., Воронко И.В., Гусарова Н.А., Лашкевич В.А. Изучение электрофоретической подвижности вирусспецифических белков штаммов вируса клещевого энцефалита, выделенных в различных регионах СНГ //Вопр. вирусол. - 1993. - №1. - С. 11-16.

6. Дрокин Д.А., Злобин В.И., Карганова Г.Г., Вихорева Т.В., Якименко В.В., Дживанян Т.И., Лашкевич В.А. Изменение геномов штаммов вируса клещевого энцефалита в результате пассажей на мышах //Вопр. вирусол. - 1994. - №1. - С. 160-162.

7. Мальдов Д.Г, Гмыль Л.В, Карганова Г.Г. Изменение активности Na+,K+-ATOa3bi при репродукции вируса клещевого энцефалита в культуре клеток СПЭВ //Вопр. Вирусол. - 1997. - №1. - С. 23-26.

8. Timofeev A.V, Ozherelkov S.G, Pronin A.V, Deeva A.V, Karganova G.G, Elbert L.B, Stephenson J.R. Immunological basis for protection in a murine model of tick-bome encephalitis by a recombinant adenovirus carrying the gene encoding the NS1 non-structural protein //J. Gen. Virol.-1998.-V. 79.-P. 689-695.

9. Тимофеев A.B, Кондратьева Я.Ю, Карганова Г.Г, Стефенсон Дж. Протективная активность бактериальной плазмиды, несущей ген неструктурного белка NS1 вируса клещевого энцефалита //Вопр. Вирусол. - 2001. - № 1. с. 22-24.

10. Тимофеев А.В, Кондратьева Я.Ю, Орловский В.Г, Локтев В.Б, Карганова Г.Г. Изучение корреляции тяжести течения заболевания клещевым энцефалитом и концентрацией интерлейкинов 2 и 6 в сыворотках больных клещевым энцефалитом //Терапевтический архив. - 2002. - № 6. - С. 22-23.

11. Романова Л.Ю, Козловская Л.И, Шевцова А.С, Карганова Г.Г. Метод доказательства отсутствия РНК вируса клещевого энцефалита в биопробах //Вопр. вирусол. - 2006. - №1. - С. 38-41.

12. Романова Л.Ю, Гмыль Л.В, Локтев В.Б, Протопова Е.В, Дживанян Т.И, Лашкевич В.А, Карганова Г.Г. Изменение антигенной структуры поверхностного гликопротеина Е вируса клещевого энцефалита при его адаптации к клещам и млекопитающим //Вопр. Вирусол. - 2006. -№6.-С. 31-34.

13. Romanova L.I, Gmyl А.Р, Dzhivanian T.I, Bakhmutov D.V, Lukashev A.N, Gmyl L.V, Rumyantsev A.A, Burenkova L.A, Lashkevich V.A,

Karganova G.G. Microevolution of Tick-Borne Encephalitis virus (TBEV) in course of host alternation //Virology. - 2007. - V. 362(1). - P. 75-84.

14. Лашкевич B.A., Карганова Г.Г. Современные аспекты профилактики клещевого энцефалита//Вопр. вирусол. - 2007. - №5. - С. 31-32.

Монография

15.Timofeev A.V., Karganova G.G. Tick-borne encephalitis vaccine: from past to future. - Москва, 2003.

Научные статьи, материалы, опубликованные в сборниках:

16. Карганова Г.Г., Дживанян Т.И., Бочкова Н.Г., Вертинский Б.В., Лубкина М.О., Погодина В.В., Лашкевич В.А. Циркуляция в Калининградской области штаммов вируса клещевого энцефалита со сниженной антигенной активностью //«Эпидемиология, клиника и профилактика вирусных инфекций». - Екатеринбург, 1992. — С. 136-140.

17.Карганова Г.Г., Дживанян Т.П., Терешкина Н.В., Гмыль Л.В., Антыкова Л.П., Лашкевич В.А. Изменение патогенетических и иммуногенных характеристик вируса клещевого энцефалита при его адаптации к клещам и млекопитающим //"Актуальные проблемы природноочаговых инфекций". Сборник материалов II республиканской научно-практической конференции, посвященной 75-летию инфекционной службы Удмуртии. - Ижевск, 1998. - С. 167-169.

18. Карганова Г.Г. Emerging потенциал переносимых клещами флавивирусов млекопитающих. //«Эпидемиологическая обстановка и стратегия борьбы с клещевым энцефалитом на современном этапе". Материалы расширенного пленума проблемной комиссии "Клещевой и другие вирусные энцефалиты" РАМН. - Москва, 2003. - С. 16-17.

19. Кондратьева Я.Ю., Локтев В.Б., Орловский В.Г., Куржуков Г.П., Тимофеев А.В., Карганова Г.Г. Обнаружение антител к белкам Е, NS1,

NS3 и NS5 вируса клещевого энцефалита в сыворотках крови больных КЭ. //«Актуальные проблемы эпидемиологии и профилактики инфекционных болезней". Материалы Всероссийской научно-практической конференции. - Самара, 2004. - Т. 2. - С. 219-221.

20. Романова Л.Ю., Бахмутов Д.В., Дживанян Т.И., Гмыль Л.В., Румянцев А.А., Лукашев А.Н., Гмыль А.П., Карганова Г.Г. Молекулярные основы изменения фенотипических характеристик вируса клещевого энцефалита при его адаптации к клещам и млекопитающим //"Актуальные проблемы эпидемиологии и профилактики инфекционных болезней". Материалы Всероссийской научно-практической конференции. - Самара, 2004.- Т. 2. - С. 225-229.

21. Карганова Г.Г., Гмыль А.П., Романова Л.Ю., Гмыль Л.В. Особенности эволюции переносимых клещами арбовирусов. //Материалы расширенного пленума проблемной комиссии «Арбовирусы» и научно-практической конференции «Арбовирусы и арбовирусные инфекции».- Астрахань, 2006. - С. 30-35.

22. Романова Л.Ю., Козловская Л.И., Рогова Ю.В., Дживанян Т.И., Гмыль А.П., Карганова Г.Г. Стабильность популяции адаптированного к клещам варианта вируса клещевого энцефалита с повышенной сорбцией на клеточных гликозаминогликанах при пассажах в культуре клеток СПЭВ. //«Медицинская вирусология». Труды ИПВЭ им. М.П.Чумакова РАМН. - Москва, 2007. - Т. 24. - С. 73-79.

23. Шевцова А.С., Рогова Ю.В., Романова Л.Ю., Кондратьева Я.Ю., Карганова Г.Г. Различия в характере взаимодействия с интерфероновой системой клетки, выявленные у двух близкородственных вариантов вируса клещевого энцефалита. //«Медицинская вирусология». Труды ИПВЭ им. М.П.Чумакова РАМН. - Москва, 2007. - Т. 24. - С. 89-96.

24. Романова Л.Ю., Козловская Л.И., Карганова Г.Г. Взаимодействие вирионов с клеточными гепарансульфат гликозаминогликанами и нейроинвазивность вируса клещевого энцефалита. //«Медицинская вирусология». Труды ИПВЭ им. М.П.Чумакова РАМН. - Москва, 2007. - Т. 24. - С. 273-279.

25. Карганова Г.Г. Клещ как фактор микроэволюции вируса клещевого энцефалита. //«Паразитология в XXI веке - проблемы, методы, решения». Материалы IV Всероссийского съезда паразитологического общества при РАН. - С.-Петербург, 2008. - Т. 2. - С. 23-27.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю глубокую благодарность дирекции ГУ ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН в лице академика РАМН С.Г. Дроздова и профессора М.И. Михайлова за предоставленную возможность выполнения данной работы. Я искренне признательна своему научному консультанту академику РАМН В.А. Дашкевичу за неоценимые научные рекомендации и постоянную поддержку во всех начинаниях. Данная работа является продолжением исследований, которые были начаты в Институте научными сотрудниками Т.И.Дживанян и С.П.Чунихиным. Я очень благодарна вед.н.с. Т.И.Дживанян за помощь в выборе этого направления в научной работе. Большую теоретическую и практическую помощь при проведении данных исследований оказали к.б.н. А.П.Гмыль, д.м.н. А.В.Тимофеев и к.б.н. Д.Г.Мальдов, Л.Ю.Романова. Также благодарю бывших и настоящих сотрудников ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН [Д.В.

Бахмутова|, к.б.н. Л.А. Буренкову, к.б.н. Л.В. Гмыль, Л.И. Козловскую, к.м.н. Я.Ю. Кондратьеву, д.м.н. А.Н Лукашева, д.б.н. В.Н.Ляпустина, Ю.В. Рогову, к.б.н. А.А.Румянцева, к.м.н. Н.В. Терешкину, А.С.Шевцову, за помощь и участие в настоящей работе. Я благодарна официальным рецензентам д.б.н. А.С.Гамбарян и к.б.н. М.Ф.Воровичу за внимательное прочтение работы и ценные замечания. Большую помощь при проведении исследований оказали старшие лаборанты лаборатории молекулярной биологии вирусов Г.М. Каштанова и А.А. Медведкова. Я благодарна всем соавторам моих работ, не упомянутых выше, за помощь в проведении данных исследований.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Карганова, Галина Григорьевна, Москва

1. Авакян А.А., Левкович Е.Н., Бусник М.М. Изучение морфологии нервных клеток, пораженных вирусами клещевого энцефалита и сходных с ними заболеваний //Вопр. Вирусол. 1960. - № 3. - С. 208216.

2. Авакян А.А., Альтштейн А.Д. Изучение острой и хронической инфекции, вызываемой вирусом клещевого энцефалита в культуре ткани. Сообщение 3. О возможном механизме хронической инфекции // Вопр. Вирусол. 1964. - №5. - С. 575-580.

3. Алексеев А.И., Чунихин С.П. Способ изготовления стеклянных микроигл для инъецирования клещей и других мелких членистоногих //Мед. паразитол. и паразит. Болезни. 1987. - №6. - С. 69-70.

4. Анджапаридзе О.Г., Степанова Л.Г. Изучение изменчивости вируса клещевого энцефалита. Сообщение 3. Выделение из вирусных популяций клонов со сниженной нейропатогенностью //Вопр. Вирусол.-1967. № 5. -С. 604-607.

5. Анджапаридзе О.Г., Степанова Л.Г., Розина Э.Э. Изучение изменчивости вируса клещевого энцефалита. Сообщение 4. Патогенные свойства некоторых штаммов вирусов группы клещевого энцефалита и их вариантов //Вопр. Вирусол. 1967. - № 6. - С. 691697.

6. Анджапаридзе О.Г., Степанова Л.Г. Изучение изменчивости вируса клещевого энцефалита. Сообщение 5. Генетическая характеристика штаммов с разной вирулентностью //Вопр. Вирусол. 1969. - № 6 - С. 687-691.

7. Бабабянц А.А., Манахова Л.С., Карганова Г.Г., Порховатый С.Я., Кондратенко И.В., Хахалин Л.Н. Интерфероновая реакциялейкоцитов у больных с первичными иммунодефицитами //Вопр. Вирусол. 1985. - № 6. - С. 714-717.

8. Баннова Г.Г., Сарманова Е.С., Караванов А.С., Бычкова М.В., Пиванова Г.П., Флеер Г.П. Изучение биологических свойств штаммов вируса клещевого энцефалита, выделенных в разных частях его ареала //Вопр. Вирусол.- 1982.- № 1. С. 41-44.

9. Баркова Э.А., Иерусалимский А.П. Динамика накопления вируснейтрализующих антител у больных с различными клиническими формами клещевого энцефалита //Вопр. Вирусол. -1963. № 2. - С. 189-193.

10. Бахвалова В.Н., Караванов А.С., Матвеев Л.Э., Матвеева В.А., Морозова О.В. Исследование с помощью моноклональных антител антигенов Е и NS1 штаммов вируса клещевого энцефалита Западной Сибири //Вопр. Вирусол. 2001. - №6. - С. 33-36.

11. Бахвалова В.И., Морозова О.В., Морозов И. Свойство популяции вируса клещевого энцефалита, циркулировавшего в 1980-2006 гг. на территории Новосибирской области //Бюллетень СО РАМН. 2007.- т. 126. - С. 41-48.

12. Бедарева Т.Ю., Попонникова Т.В., Доблер Г., Хуферт Ф., Галиева Г.Ю., Вахрамеева Т.Н. Особенности цитокинового статуса при клещевых нейроинфекциях у детей //Медицина в Кузбассе. — 2008. -№5.-С. 13-18.

13. Богачек М.В., Протопопова Е.В., Терновой В.А., Качко А.В., Иванова А.В., Иванисенко В.А., Локтев В.Б. Иммунохимические свойства рекомбинантных полипептидов, моделирующих домены I и II белка Е вируса Западного Нила //Мол. биол. 2005. - №5. - С. 813822.

14. Богачек М.В., Протопопова Е.В., Терновой В.А., Качко А.В., Иванова А.В., Ивасенко В.А., Шалов А., Локтев В.Б. Иммунохимические свойства белка РгМ и С-концевого фрагмента белка М вируса Западного Нила //Мол. биол. 2007. - т.41. - С. 8-17.

15. Борисевич В.Г., Леонова Г.Н. Инфекционный процесс при стертой и инаппарантной формах клещевого энцефалита //"Клещевой энцефалит (к 65-летию открытия)".- Владивосток, 2002. С. 48-59.

16. Бычкова М.В., Сарманова Е.С., Мартсон М.А., Коваленко В.Н. Изучение вирусемии и динамики формирования иммунитета при клинически выраженных и инаппарантных формах клещевого энцефалита. 1964.

17. Варгин В.В., Семенов Б.Ф. Изменение активности естественных киллеров у мышей разных линий на фоне острой и бессимптомной флавивирусной инфекции //Acta virol.- 1986. № 30. - С. 303-308.

18. Волкова Л.И., Образцова Р.Г. Клиническая картина острого клещевого энцефалита на Среднем Урале //"Клещевой энцефалит (к 65-летию открытия)». Владивосток, 2002. - С. 88-98.

19. Воробьева М.С. Современное состояние вакцинопрофилактики клещевого энцефалита //"Клещевой энцефалит (к 65-летию открытия)». Владивосток, 2002. С. 166-169.

20. Ворович М.Ф., Тимофеев А.В., Мальдов Д.Г., Эльберт Л.Б. Функциональная роль третичной структуры поверхностного антигена вируса клещевого энцефалита полипептида Е //Доклады АН СССР.-1988. - Т. 301. - № 3. - С. 728-730.

21. Вотяков В.И., Злобин В.И., Мишаева Н.П. Клещевые энцефалиты Евразии. Вопросы экологии, молеклуярной эпидемиологии, нозологии, эволюции. Новосибирск, 2002.

22. Гильманова Г.Х., Лапшина Т.Н., Ливанова И.А. Об инфицировании вирусом клещевого энцефалита через молоко коров //Вопр. Вирусол. -1964. -№ 1.-С. 47-49.

23. Гмыль Л.В., Карганова Г.Г., Смирнова С.Е., Лашкевич В.А. Вирусспецифические белки вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки //Вопр. вирусол. 2001. - № 3. - С. 16-21.

24. Григорьева Л.В., Чигиринский А.Е., Воробьева М.С., Ладыженская И.П., Кан Г.А., Расщепкина М.Н. Методические рекомендации по морфологической оценке нейровирулентности вирусов комплекса клещевого энцефалита. Москва, 1985.

25. Грицун Т.С, Ляпустин В.Н, Карганова Г.Г, Лашкевич В.А. Невирнонный («растворимый») антиген вируса клещевого энцефалита//Вопр. Вирусол. 1988. - № 2. - С. 217-227.

26. Грицун Т.С, Ляпустин В.Н, Шаталов А.Г, Лашкевич В.А. Множественные формы белка NS 1 как основного компонента невирионного («растворимого») антигена вируса клещевого энцефалита //Вопр. вирусол. 1990. - № 6. - С. 471-474.

27. Готовцева Е.П, Серов И.В, Учакин П.Н, Шестакова С.В, Суркина И.Д, Ершов Ф.И. Нарушение продукции лимфоцитами человека интерлейкина-2 и у-интерферона при стрессе и некоторые механизмы их взаимодействия //Вопр. Вирусол. 1990. - №5. - С. 435-437.

28. Гуляева С.Е, Квон Ю.В, Кирилюк И.И. Коваленко Л.С, Николина Л.В. Клиника клещевого энцефалита в Приморском Крае //"Клещевой Энцефалит (к 65-летию открытия)». Владивосток, 2002. С. 39-47.

29. Дживанян Т.И, Чупринская М.В, Лашкевич В.А. О факторах, влияющих на появление ДС-признака вирусов комплекса клещевого энцефалита//Вопр. вирусол. 1973. - № 1. - С. 86-91.

30. Дживанян Т.И, Чунихин С.П, Чупринская М.В, Лашкевич В.А. Изменчивость вируса клещевого энцефалита по ДС-признаку при пассажах через клещей и позвоночных животных //«Экология вирусов». Материалы IX симпозиума. Душанбе, 1975. С. 22-24.

31. Дживанян Т.И, Чунихин С.П, Лисак В.М, Каштанова Г.М, Королев М.Б. Иммунохимические характеристики антигенов варианта вирусаклещевого энцефалита, адаптированного к клещам Hyalomma plumbeum //Вопр. вирусол. 1986. - №1. - С. 92-96.

32. Дживанян Т.И., Королев М.Б., Лисак В.М., Карганова Г.Г., Каштанова Г.Г., Чупринская М.Ф., Лашкевич В.А. Действие туникамицина на инфекционность и белковый синтез вируса клещевого энцефалита //Вопр. Вирусол. 1987. - №6. - С. 690-696.

33. Дживанян Т.И., Карганова Г.Г., Кондратьева Я.Ю., Лашкевич В.А. Изменение антигенной специфичности вируса клещевого энцефалита при смене хозяев //«Актуальные проблемы вирусологии». Материалы конференции. Москва, 1999. - С. 23.

34. Ерман Б.А., Дроздова Л.И., Зайцева Л.Н., Тулакина Л.Г. Патологическая анатомия современного клещевого энцефалита на Урале. Екатеринбург, 1999.

35. Злобин В.И., Дрокин Д.А., Мансуров П.Г., Калмин О.Б., Якименко В.В. Типирование штаммов вируса клещевого энцефалита по растворимому антигену //Вопр. Вирусол. 1991. - №1. - С. 24-27.

36. Злобин В.И., Борисов В.А., Верхозина М.М., Малов И.В., Холмогорова Г.Н. Клещевой энцефалит в Восточной Сибири. Иркутск, 2002.

37. Злобин В.И., Беликов С.И., Джиоев Ю.П., Демина Т.В., Козлова И.В. Молекулярная эпидемиология клещевого энцефалита. Иркутск, 2003.

38. Злобин В.И. Клещевой энцефалит в Российской Федерации: современное состояние проблемы и стратегия профилактики //Вопр. вирусол. 2005. - №3. - С. 26-32.

39. Злобин В.И., Верхозина М.М., Демина Т.В., Джиоев Ю.П., Адельшин Р.В., Козлова И.В., Беликов С.И., Хаснатинов М.А., Данчинова Г.А., Исаева Е.И., Гришечкин А.Е. Молекулярная эпидемиология клещевого энцефалита //Вопр. Вирусол. 2007. - № 6. -С. 4-13.

40. Иерусалимский А.П. Клещевой энцефалит. Новосибирск, 2001.

41. Ильенко В.И., Покровская О.А. Особенности течения экспериментальной инфекции у обезьян, зараженных вирусами клещевого, двухволнового и шотландского энцефалитов //Acta Virol. -1960.-С. 75-81.

42. Ильенко В.И., Платонов В.Г., Смородинцев А.А. Биологические варианты вируса клещевого энцефалита, выделенные в различных очагах заболеваний //Вопр. Вирусол. 1974. - № 4. - С. 414-418.

43. Канн Г.А., Воробьева М.С., Шаламберидзе Т.Д., Блоха В.В. Экспериментальное изучение иммунологической реактивности инбредных мышей с различной чувствительностью к вирусу клещевого энцефалита //Вопр. Вирусол. 1986. - № 1. - С. 107-110.

44. Карганова Г.Г. Зависимые от хозяина варианты вируса клещевого энцефалита и особенности их репродукции в клетках млекопитающих. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности вирусология. Москва, 1991.

45. Карганова Г.Г. Emerging потенциал переносимых клещами флавивирусов млекопитающих //«Эпидемиологическая обстановка и стратегия борьбы с клещевым энцефалитом на современном этапе".

46. Материалы расширенного пленума проблемной комиссии "Клещевой и другие вирусные энцефалиты" РАМН.- Москва, 2003.- С. 16-17.

47. Карганова Г.Г, Припузова Н.С, Терешкина Н.В, Гмыль Л.В, Дживанян Т.И, Румянцев А.А, Лашкевич В.А. Оценка остаточной нейровирулентности химеры флавиврусов Лангат и денге-4 при интрацеребральном заражении обезьян //Вопр. Вирусол. 2005. - №1. -С. 27-31.

48. Карганова Г.Г. Клещ как фактор микроэволюции вируса клещевого энцефалита. //«Паразитология в XXI веке — проблемы, методы, решения». Материалы IV Всероссийского съезда паразитологического общества при РАН. С.-Петербург, 2008. - Т. 2. - С. 23-27.

49. Кашкин К.П. Цитокины иммунной системы: Основные свойства и иммунобиологическая активность //Клиническая лабораторная диагностика. 1998. - № 11. - С. 21-32.

50. Кветкова Э.А, Переходова С.К, Дуринова Л.П, Соколова Т.Ф. Функции Т и В - систем иммунитета при клещевом энцефалите

51. Этиология, эпидемиология и меры профилактики клещевого энцефалита на Дальнем Востоке". Хабаровск, 1978. - С. 42-43.

52. Кветкова Э.А., Семенов Б.Ф., Переходова С.К., Соколова Т.Ф. Количественная характеристика Т- и В- популяции лимфоцитов у больных клещевым энцефалитом //"Вопросы иммунитета и диагностики природноочаговых болезней». Ленинград, 1978. - С. 36-41.

53. Кветкова Э.А., Переходова С.К. Развитие клеточного иммунитета при экспериментальном клещевом энцефалите //Вопр. Вирусол. -1981.-№1.-С. 67-71.

54. Кветкова Э.А., Шматко В.Г. Феномен вторичной иммунологической недостаточности и его значение в патогенезе острого клещевого энцефалита //Журн. невропатол. и психиатрии. 1982. - т. 82. - № 2. -С. 220-224.

55. Кветкова Э.А. Диагностическое и прогностическое значение иммуноглобулинов класса М при клещевом энцефалите //«Арбовирусы». Таллин, 1984. - С. 100-101.

56. Кветкова Э.А., Илюшенко Л.П., Шматко В.Г., Кротова Р.А. Иммунологические критерии прогноза течения и выздоровления при клещевом энцефалите //"Природнор-очаговые болезни человека». -Омск, 1986.-С. 56-62.

57. Кимура М. Молекулярная эволюция: теория нейтральности. М., 1985.

58. Козлов О.Ю., Минаков С.Д., Хованова A.M., Чукреев Е.Ф. О роли макрофагов в патогенезе экспериментальной инфекции, вызванной вирусом клещевого энцефалита //ЖМЭИ. 1974. - № 8. - С. 20-24.

59. Козловская Л.И., Рудской В.И. Разработка и применение математической модели для описания сорбции вирионов вируса клещевого жэнцефалита на клеточных рецепторах //2Медицинскаявирусология»ю ТрудыИПВЭ им. М.П.Чумакова РАМН. 2006. - т. XXIII.-С. 82-89.

60. Конев В.П., Кветкова Э.А. Морфогенез экспериментального клещевого энцефалита //«Природно-очаговые болезни человека (вопросы эпидемиологии и прфилактики)». Омск, 1981. - С. 71-79.

61. Конькова А.Б., Ратникова Л.И. Медико-биологические эффекты нитроксид-молекулы в патогенезе клещевого менингоэнцефалита //Эпидемиол. и инфекцуионные болезни. 2004. - №3. - С. 25-28.

62. Коротков Ю.С., Никитин А.Я., Антонова A.M. Роль климатических факторов в многолетней динамике заболеваемости населения города Иркутска клещевым энцефалитом //Бюлл. Восточно-сибирского НЦ СО РАМН. 2007. - № 3 (55). - С. 121-125.

63. Ларина Г.И., Левкович Е.Н. Изучение функциональной активности макрофагальных элементов перитонеального экссудата животных в процессе инфицирования вирусами комплекса клещевого энцефалита // Вопр. Вирусол. 1980. - № 4. - С. 457-460.

64. Ларина Г.И., Левкович Е.Н. Взаимосвязь генотипа животного и штаммовых особенностей вируса с течением экспериментального клещевого энцефалита //Вопр. Вирусол. 1983. - № 3.- С. 345-348.

65. Лашкевич В.А., Карганова Г.Г. Современные аспекты профилактики клещевого энцефалита //Вопр. вирусол. 2007. - №5 - С. 31-32.

66. Левина Л.С., Погодина В.В. Персистенция вируса клещевого энцефалита в вакцинированном организме //Вопр. Вирусол. 1988. -№ 4. - С. 485-490.

67. Левкович Е.Н., Сарманова Е.С., Погодина В.В., Николаева Г.Н. Изучение особенности гуморального иммунитета у больных клещевым энцефалитом людей //Вопросы медицинской вирусологии. 1960. -№ 6. -С. 28-33.

68. Левкович Е.Н., Погодина В.В., Засухина Г.Д., Карпович Л.Г. Вирусы комплекса клещевого энцефалита. — Ленинград, 1967.

69. Лезина М.Н., Воробьева М.С. Изучение штаммов вируса клещевого энцефалита, выделенных из различных эндемических очагов инфекции //"Этиология, эпидемиология и меры профилактики клещевого энцефалита на Дальнем Востоке". Хабаровск, 1978. - С. 61-64.

70. Леонова Г.Н., Мураткина С.М., Кругляк С.П. Изучение вирулентности штаммов вируса клещевого энцефалита, изолированных на юге советского Дальнего Востока //Вопр. Вирусол. 1990.-№5.- С. 399-401.

71. Леонова Г.Н., Исачкова Л.М., Кругляк С.П., Майстровская О.С., Фисенко А.Ю. Патогенетические критерии оценки вирулентности штаммов вируса клещевого энцефалита, изолированных на юге Дальнего Востока //Вопр. Вирусол. 1995. - № 4. - С. 165-169.

72. Леонова Г.Н., Майстровская О.С. Вирусемия у больных клещевым энцефалитом и у лиц с присасыванием иксодовых клещей //Вопр. вирусол. 1996. - №5. - С. 224-228.

73. Леонова Г.Н., Майстровская О.С., Борисевич В.Б. Антигенемия у людей, инфицированных вирусом клещевого энцефалита //Вопр. Вирусол. 1996а. - № 6. - С. 260-263.

74. Леонова Г.Н. Клещевой энцефалит в Приморском крае. Вирусологические и эколого-эпидемиологические аспекты. Владивосток, 1997.

75. Леонова Г.Н., Беликов С.И., Борисевич В.Б., Кожемяко В.В. Новые перспективы в изучении клещевого энцефалита //Тихоокеанский мед. журн. 2001. - т. 7. - № 2. - С. 17-22.

76. Леонова Г.Н. Этапы изучения клещевого энцефалита в Приморском крае //"Клещевой энцефалит (к 65-летию открытия)". Владивосток, 2002. - С. 5-14.

77. Леонова Г.Н., Павленко Е.В., Крылова Н.В. Вакцинопрофилактика клещевого энцефалита. Владивосток, 2006.

78. Лисак В.М., Королев М.Б., Дживанян Т.Н., Карганова Г.Г., Лашкевич В.А. Электронно-микроскопическое изучение инфицированной вирусом клещевого энцефалита клеточной культуры при воздействии туникамицина //Вопр. Вирусол. 1987. -№6.-С. 696-701.

79. Локтев В.Б., Терновой В.А., Нетесов С.В. Молеклуряно-генетическая характеристика вируса клещевого энцефалита //Вопр. Вирусол. 2007. -№ 5. - С. 10-16.

80. ЮЗ.Ляпустин В.Н., Лисак В.М., Грицун Т.С., Королев М.Б., Лашкевич В.А. Иммунохимический и электронномикроскопический анализ высокомолекулярных структур вируса клещевого энцефалита //Вопр. вирусол. 1985. - №4. - С. 419-426.

81. Ляпустин, В.Н., Лашкевич В.А., Мустафина А.Н., Решетников И.А., Чунихин С.П. Зависимость синтеза вирионных структур вирусаклещевого энцефалита от вида клеточных культур //Вопр. Вирусол. 1987.-№6.-С. 701-709.

82. Ляпустин В.Н, Чунихин С.П, Решетников И.Н, Лашкевич В.А. Изменения синтеза вирионного антигена вируса клещевого энцефалита после пассирования через иксодовых клещей и мелких млекопитающих //Вопр. вирусол. 1987. - № 4. - С. 451-456.

83. Ляпустин В.Н, Карганова Г.Г, Мустафина А.Н, Грицун Т.С, Лашкевич В.А. Выявление вирусспецифических белков вируса клещевого энцефалита с помощью иммуносорбции //Вопр. Вирусол.1988.-№4.-С. 448-452.

84. Ляпустин В.Н, Ливанова Г.П, Караванов А.С, Лашкевич В.А. Сопоставление протективных свойств препаратов вирионного иневирионного («растворимого») антигенов вируса клещевогоэнцефалита //Вопр. Вирусол. 1991. - № 6. - С. 496-500.

85. Майер В. Изучение вирулентности вируса клещевого энцефалита. 1. Экспериментально полученная линия вируса клещевого энцефалита с измененной патогенностью для молодых мышей и ее иммуногенность //Acta virol. 1963. - № 7. - С. 421-429.

86. Майер В. Изучение вирулентности вируса клещевого энцефалита. 2. Патогенетические свойства двух вариантов одного вирусного штамма //Acta virol. 1964. - № 8. - С. 14-21.

87. Майер В. Изучение вирулентности вируса клещевого энцефалита. 4. Термочувствительность вирионов и их отношение к другим генетическим маркерам //Acta virol. 1965. - № 9. - С. 397.

88. Майер В, Сабо А. Изучение вирулентности вируса клещевого энцефалита. 5. Действие мочевины на термолабильные и термостабильные вирусные варианты //Acta virol. 1966. - № 10. - С. 486.

89. Майер В., Гаждосова Е., Славик И. Изучение клеточного иммунитета к вирусу клещевого энцефалита in vitro: исследование на реконвалесцентах и лицах с субклиническими формами инфекции //Acta virol. 1976. - № 20. - С. 395-401.

90. Малиновская В.В., Волегова Г.М., Устинова О.Ю. Система интерферона при остром клещевом энцефалите и влияние на динамику клинико-лабораторных показателей различных методов интерферонотерапии //Вопр. Вирусол. 1995. - № 5. - С. 234-238.

91. Малкова Д., Франкова В. Роль лимфатической системы в развитии клещевого энцефалита у мышей //Acta virol. 1959. - т. 3. - С. 210214.

92. Малкова Д. Роль лимфатической системы при экспериментальном заражении клещевым энцефалитом. 1. Вирус клещевого энцефалита в лимфе и крови экспериментально зараженных баранов //Acta virol.1960.-т. 4.-С. 233-240.

93. Малкова Д. Участие лимфатической и кровеносной систем в дессиминации вируса клещевого энцефалита в органы экспериментально зараженных мышей //Acta virol. 1960а. — т. 4. - С. 290-295.

94. Малкова Д., Рала Ф., Сидак 3. Изменения в составе элементов белой крови, в региональных лимфатических узлах и селезенке мышей, зараженных вирусом клещевого энцефалита //Acta virol.1961.-т. 5.-С. 101-111.

95. Малкова Д. Влияние рентгеновского облучения на проникновение вируса клещевого энцефалита через региональные лимфатические узлы //Acta virol. 1962. - т. 6. - С. 475-476.

96. Малкова Д., Сметана, А. Роль лимфатической системы при прямом введении вируса клещевого энцефалита в кровь чувствительных белых мышей //Acta virol. 1966. - т. 10. - С. 471-474.

97. Мальдов Д.Г., Гмыль Л.В., Карганова Г.Г. Изменение активности Na, К -АТФазы при репродукции вируса клещевого энцефалита в культуре клеток СПЭВ //Вопр. вирусол. 1997. - №4. - С. 23-26.

98. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М., 1984.

99. Овчинникова Э.А., Карпович Л.Г., Левкович Е.Н. Изучение терморезистентности штаммов вирусов комплекса клещевого энцефалита, обладающих различной нейровирулентностью для лабораторных животных //Вопр. Вирусол. 1967. - № 5. - С. 607-611.

100. Ожерелков С.В., Хозинский В.В., Семенов Б.Ф. Исследование иммунологических механизмов действия температурных и эмоциональных стресс-факторов при экспериментальных флавивирусных инфекциях //ЖМЭИ. 1986. - № 12. - С. 95-99.

101. Остерман Л.А. Исследование белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование. М., 1981.

102. Павленко Е.В., Леонова Г.Н., Яковлев А.А., Борисова О.Н. Анализ заболеваемости клещевым энцефалитом в Приморском Крае запериод с 1990 по 2000 годы //"Клещевой энцефалит (к 65-летию открытия)". Владивосток, 2002. С. 15-25.

103. Панов А.Г. Клещевой энцефалит. Ленинград, 1956.

104. Панов А.Г., Ильенко В.И. Команденко Н.И. Некоторые патогенетические механизмы прогредиентных форм клещевого энцефалита //Журнал невропатол. и психиатрии им. С.С. Корсакова.-1977.-т. 77. -№2. С. 161-166.

105. Пиванова Г.П., Баннова Г.Г., Бычкова М.В., Караванов А.С. Иммуногенная и гемагглютинирующая активность штаммов вируса клещевого энцефалита, выделенных от больных в разных частях нозоареала//Вопр. вирусол. 1990. - № 3. - С. 49-51.

106. Плетнев А.Г., Ямщиков В.Ф., Блинов В.М. Нуклеотидная последовательность генома и полная аминокислотная последовательность полипротеина вируса клещевого энцефалита //Биоорг. Химия. 1989. - т. 15. - № 11. - С. 1504-1522.

107. Погодина В.В., Магазаник С.С. Изучение процесса скрытой иммунизации при клещевом энцефалите клинико-вирусологическими методами //Тезисы и авторефераты докладов 6 научной сессии ИПВЭ АМН СССР. Москва, 1961. - С. 247-248.

108. Погодина В.В., Хань-Ши-Цзе. Изучение корреляций между патогенностыо вирусов группы клещевого энцефалита для животных и особенностями размножения в организме //Вопр. Вирусол. 1964. -№ 6. - С. 682-690.

109. Погодина В.В., Бочкова Н.Г., Корешкова Г.В. Свойства штаммов серотипа Айна/1448 вируса клещевого энцефалита //Вопр. вирусол., -1981.-№6.-С. 741-745.

110. Погодина В.В., Ларина Г.И., Фролова М.П., Бочкова Н.Г. Варианты иммунного ответа хомяков на вирус клещевого энцефалита //Вопр. Вирусол. 1984. - № 6. - С. 708-715.

111. Погодина В.В., Фролова М.П., Ерман Б.А. Хронический клещевой энцефалит. Новосибирск, 1986.

112. Погодина В.В., Бочкова Н.Г., Левина Л.С., Фролова Т.В., Трухина А.Г., Фролова М.П., Маленко Г.В. Комплексная характеристика сибирского подтипа вируса клещевого энцефалита //"Клещевой энцефалит (к 65-летию открытия)". Владивосток, 2002. - С. 72-87.

113. Погодина В.В. Мониторинг популяций вируса клещевого энцефалита и этиологической структуры заболеваемости за 60-летний период//Вопр. вирусол. 2005. - № 3. - С. 7-13.

114. Протопопова Е.И., Хусаинова А.Д., Коновалова С.Н., Локтев В.Б. Получение и характеризация антиидиотипических антител, несущих на своей поверхности гемагглютинирующие паратопы вируса клещевого энцефалита //Вопр. вирусол. 1996. - № 2. - С. 50-53.

115. Протопопова Е.В., Коновалова С.Н., Локтев В.Б. Выделение клеточного рецетора для вируса клещевого энцефалита при помощи антиидиотипических антител //Вопр. вирусол. 1997. - № 6. - С. 264268.

116. Романенко В.В., Есюнина М.С., Килячина А.С. Опыт реализации программы массовой иммунизации населения против клещевого энцефалита в Свердловской области //Вопр. Вирусол. 2007.- № 6. — С. 22-25.

117. Романова Л.Ю, Козловская Л.И, Шевцова А.С, Карганова Г.Г. Метод доказательства отсутствия РНК вируса клещевого энцефалита в биопробах //Вопр. вирусол. 2006. - №1. - С. 38-41.

118. Северцев А.С. Основы теории эволюции. М, 1987.

119. Семенов Б.Ф., Варгин В.В., Хозинский В.В. Иммунопатологические реакции, воспроизводимые с арбовирусами //Вестник АМН СССР,. -1974.-№ 11.-С. 38-40.

120. Скулачев, В. П. Биоэнергетика. Мембранные преобразователи энергии, Москва, 1989.

121. Соколова Е.Д., Камалов И.И., Коновалова Г.В. Характеристика нейровирулентности, стабильности и иммуногенности ослабленных вариантов вируса Лангат Тр-21 //Вопр. Вирусол. 1994. - №5. - С. 220-223.

122. Сомова-Исачкова Л.М., Фролова М.П., Леонова Г.Н., Погодина

123. B.В., Фисенко А.Ю. Сравнительная патогистология клещевых энцефалитов в Приморском Крае //«Клещевой энцефалит (к 65-летию открытия)». Владивосток, 2002. - С. 26-38.

124. Степанова Л.Г., Шухмина Н.Р., Анджапаридзе О.Г. Изучение изменчивости вируса клещевого энцефалита. Сообщение 6. Некоторые вопросы иммуногенеза при вакцинации мышей аттенуированным штаммом И-40 Д //Вопр. Вирусол. 1970. - № 4.1. C. 405-408.

125. Сысолятин В.А., Селюта И.А., Караванов А.С. Особенности иммунного ответа у больных клещевым энцефалитом //«Современные проблемы эпидемиологии, диагностики и профилактики клещевого энцефалита». Иркутск, 1990. - С. 125-126.

126. Тимофеев А.В., Карганова Г.Г., Мальдов Д.Г., Лашкевич В.А., Эльберт Л.Б. Обнаружение возможного рецептора для вируса клещевого энцефалита с помощью антиидиотипических антител //ДАН СССР. 1990. - т. 315(1). - С. 226-228.

127. Тимофеев А.В., Ожерелков С.В., Кондратьева Я.Ю., Терешкина

128. Тимофеев, А., Я. Кондратьева, Г. Карганова. Протективная активность бактериальной плазмиды, несущей ген неструктурного белка NS1 вируса клещевого энцефалита //Вопр. Вирусол. 2001.- №1.-С. 22-24.

129. Топчий М.К., Корнюшенко Н.П. Руководство к практическим занятиям по вирусологии. Киев, 1967.

130. Усебаева Г.К., Карпович Л.Г., Левкович Е.Н. Особенности патогенеза инфекции у мышей, вызванной вирулентными и аттенуированными вариантами вирусов клещевого энцефалита и лангат //Вопр. Вирусол. 1970. - № 4. - С. 482-488.

131. Фокина Г.И., Погодина В.В., Маленко Г.В. Приматы как лабораторная модель вирусной персистенции и хронического течения вирусных энцефалитов //Вестник АМН СССР. 1986. - № 3. - С. 6368.

132. Фролова Т.В., Погодина В.В., Ларина Г.И. Активирующий эффект циклофосфана на поздних этапах персистенции вируса клещевого энцефалита//Вопр. вирусол. 1982. - № 5. - С. 578-585.

133. Хаитов P.M., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г. Иммунология. М., 2000.

134. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Современные представления о защите организма от инфекции //Иммунология. 2000. - № 1. - С. 61-64.

135. Хань-Ши-Цзе, Погодина В.В. Применение метода флуоресцирующих антител для изучения инфекции, вызванной вирусом восточного клещевого энцефалита у мышей, хомяков и поросят //Acta Virol. 1964. - т. 8. - С. 22-29.

136. Хозинский В.В., Семенов Б.В. 1980. Защитное и повреждающее действие цитотоксических Т-лимфоцитов при экспериментальном клещевом энцефалите. ЖМЭИ, № 4, стр. 56-59.

137. Хозинский В.В., Семенов Б.В. Неспецифические Т-супрессоры при экспериментальном клещевом энцефалите //Acta Virol. 1981. - № 25.- С. 277-282.

138. Черницына Л.О., Коненков В.И., Иерусалимский А.П., Прокофьев В.Ф. Неоднородная последовательная процедура анализа генетических маркеров в разработке методов индивидуального прогноза исхода клещевого энцефалита //Иммунология. 1991. - № 6.- С. 56-59.

139. Черницына Л.О., Коненков В.И.,Илюшенко Л.П., Прокофьев В.Ф. Ассоциированность аллельных вариантов генов HLA-комплекса класса 1 с интенсивностью гуморального иммунного ответа к антигенам вируса клещевого энцефалита в процессе заболевания. 1994.

140. Чумаков М.П., Рубин С.Г., Линев М.Б. Три антигенных типа вируса клещевого энцефалита, их хависимость от основных видов клещей-переносчиков и географическое распространение //Вопросы Медицинской Вирусологии. М., 1975. - С. 371-372.

141. Чунихин С.П., Куренков В.Б., Дживанян Т. И., Рыльцева Е.В. Изучение особенностей трансфазовой и трансмиссивной передачи штаммов вируса клещевого энцефалита с разной степенью патогенности для мышей //Мед. паразитол. 1979. - № 2. - С. 61-65.

142. Чунихин С.П., Леонова Г.Н. Экология и географическое распространение арбовирусов. М., 1985.

143. Чунихин С.П., Решетников И.Н., Ляпустин В.Н. Изменчивость вируса клещевого энцефалита при пассировании через иксодовых клещей и мелких млекопитающих //Мед. паразитол. и паразит. Болезни. 1986. - № 6. - С. 58-61.

144. Шаповал А.Н. Клещевой энцефаломиелит. Ленинград, 1980.

145. Ярилин, А.А. Система цитокинов и принципы ее функционирования в норме и патологии //Иммунология. 1997. - № 5. - С. 7-13.

146. Aaskov J., Buzacott К., Field Е., Lowry К., Berlioz-Arthaud A., Holmes E. Multiple recombinant dengue type 1 viruses in an isolate from a dengue patient //J. Gen. Virol. 2007. - v. 88. - P. 3334-3340.

147. Albrecht P. Pathogenesis of experimental infection with tick-borne encephalitis virus //"Biology of virus of tick-borne encephalitis complex". -Praha, 1962. P. 247-257.

148. Allison S.L., Schalish J., Stiasny K., Mandl C.W., Kunz C., Heinz F.X. Oligomeric rearrangement of tick-borne encephalitis virus envelope proteins included by an acidic pH //J. Virol. 1995. - v. 69. - P. 695-700.

149. Allison S.L, Stiasny K, Stadler K, Mandl C.W, Heinz F.X. Mapping of functional elements in the stem-anchor region of tick-borne encephalitis virus envelope protein E //J. Virol. 1999. - v. 73. - P. 5605-5612.

150. Allison, S.L, Schalich J, Stiasny, K, Mandl, C.W, Heinz, F.X. Mutational evidence for an internal fusion peptide in flavivirus envelope protein E //J. Virol. 2001. - v. 75. - P. 4268-4275.

151. Altamirano A, Fons M, Russel J, Cragoe E.J.Jr, Albrecht T. Human cytomegalovirus infection increases the number of ouabain-binding sites in human fibroblasts // . 1994. - V. 199. - P. 151-154.

152. Anderson R, King A.D, Innis B.L. Correlation of E protein binding with cell susceptibility to dengue 4 virus infection //J.Gen.Virol. 1992. -V. 73. - P. 2155-2159.

153. Arias A, Ruiz-Jarabo C, Escarmis C, Domingo E. Fitness increase of memory genomes in a viral quasispecies //J. Mol. Biol. 2004. - V. 339. -P. 405-12.

154. Atrasheuskaya A.V, Fredeking T.M, Ignatyev G.M. Chenges in immune parameters and their correction in human cases of tick-borne encephalitis //Clin. Exp. Immunol. 2003. - V/ 131. - P. 148-154.

155. Avery P.R, Hoover A. Gamma interferon/interleukin 10 balanse in tissue lymphocytes correlates with down modulation of mucosal feline immunodeficiency virus infection // J. Virol. 2004. - V. 78(8) - P. 40114019.

156. Baillie G.J, Kolokotronis S.O, Waltari E, Maffei J.G, Kramer L.D, Perkins S.L. Phylogenetic and evolutionary analyses of St. Louis encephalitis virus genomes //Mol. Phylogenet. Evol. 2008. - V. 47(2). -P. 717-28.

157. Bernard K.A, Klimstra W.B, Johnston R.E. Mutations in the E2 glycoprotein of Venezuelan equine encephalitis virus confer heparansulfate interaction, low morbidity, and rapin clearance from blood of mice //Virology. 2000. - V. 276. - P. 93-103.

158. Bernfield M., Gotte M., Park P.W., Reizes O., Fitzgerald M. L., Lincecum J., Zako M. Functions of cell surface heparan sulfate proteoglycans //Annu. Rev. Biochem. 1999. - V. 68. - P. 729-777.

159. Bhardwaj S., Holbrook M., Shope R.E., Barrett A.D., Watowich S.J. Biophysical characterization and vector-specific antagonist activity of domain III of the tick-borne flavivirus envelope protein //J. Virol. 2001. -V. 75. - P. 4002-^1007.

160. Biebricher C., Eigen M. What is a quasispecies //Quasisspecies: concept and implications for virology /Е. Domingi (ed.). 2006. - V. 299. - P. 131.

161. Billoir F., Chesse R., Tolou H., Micco P., Gould E.A., Lamballerie X. Phylogeny of the genus Flavivirus using complete coding sequences of arthropod-borne viruses and viruses with no known vector //J. Gen.Virol. -2000.-V. 81.-P. 781-790.

162. Binder G., Griffin D. Interferon-y-mediated site specific clearance of alphavirus from CNS neurons //Science. 2001. - V. 293 - P. 303-306.

163. Blok J., Mc William M., Butler H.C. Comparison of a dengue-2 virus and its candidate vaccine derivative: sequence relationships with the flaviviruses and other viruses //Virology. 1992. - V. 187.- P. 573-590.

164. Bressanelli S., Stiasny K., Allison S. L., Stura E.A., Duquerroy S., Lescar J., Heinz F.X., Rey F.A. Structure of a flavivirus envelope glycoprotein in its low-pH-induced membrane fusion conformation //EMBO J. 2004. - V. 23. - P. 728-738.

165. Bukowski J.F., Kurane I., Lai C.-J., Bray M., Falgout В., Ennis F.A. Dengue virus-specific cross-reactive CD8+ humen cytotoxic T cells //J. Virol. 1989. -V. 63. - P. 5086-5091.

166. Burke D.S., Monaht T.P. Flaviviruses // Fields virology / Knipe D.M., Howley P.M. et al. (eds.). 4-th ed. Philadelphia, 2001. - P. 1042-1150.

167. Butenko A.M., Karganova G.G. Crimean-Congo hemorrhagic fever in Russia and other countries of the former soviet union //Crimean-Congo Hemorrhagic fever /О. Ergonul, C.A. Whitehouse (eds.). Springer, 2007. -P. 99-114.

168. Byrnes A.P., Griffin, D.E. Large-plaque mutants of Sindbis virus show reduced binding to heparan sulfate, heightened viremia, and slower clearence from the circulation //J. Virol. 2000. - V. 74. - P. 644-651.

169. Cahour A., Pletnev A., Vazeille-Falcoz V., Rosen L., Lai C-J. Growth-restricted Dengue virus mutants containing deletions in the 5' noncoding region of the RNA genome //Virology. 1995. - V. 207. - P. 68-76.

170. Calisher, Gould E. Taxonomy of the virus family Flaviviridae //Adv. Virus Res. 2003. - V. 59. - P. 1-19.

171. Casati, S., Gern L., Piffaretti J. Diversity of the population of Tick-borne encephalitis virus infecting Ixodes ricinus ticks in an endemic area of central Switzerland (Canton Bern) //J. Gen. Virol. 2006. - V. 87. - P. 2235-41.

172. Cecilia D., Gould E.A. Nucleotide changes responsible for loss of neuroinvasiveness in Japanese encephalitis virus neutralization-resistant mutants //Virology. 1991. - V. 181. - P. 70-77.

173. Chao L. Fitness of RNA virus decreased by Muller's ratchet //Nature. -1990.-V. 348-P. 454-455.

174. Chen W.-J., Wu H.-R., Chiou S.-S. E/NS1 modifications of Dengue 2 virus after serial passages in mammalian and/or mosquito cells //Intervirology. 2003. - V. 46 - P. 289-295.

175. Chu J. J. H., Ng M. L. Infectious entry of West Nile virus occurs through a clathrin-mediated endocytic pathway //J. Virol. 2004. - V. 78. -P. 10543-10555.

176. Chua J.J.E., Ng M.M.L., Chow V.T.K. The non-structural 3 (NS3) protein of dengue virus type 2 interacts with human nuclear receptor binding protein and is associated with alterations in membrane structure //Virus Res. 2004. - V. 102 - P. 151-163.

177. Chunikhin S.P., Dzhivanyan T.I. Ecological markers of arboviruses //Arctic and Tropical Arboviruses /Ed. E. Kurstak. New York, 1979. - p. 297-302.

178. Church J., Ghosh S., Roufogalis В., Villalobo A. Endogenous hyperphosphorylation in plasa membrane from an ascites hepatocarcinoma cell line //Biochem. Cell Biol. 1988. - V. 66. - P. 1-12.

179. Clarke D.K., Casals J. Techniques for hemagglutination and hemagglutination-inhibition with arthropod-borne viruses //Am. J. Trop. Med. Hygiene. 1958. - V. 7. - P. 561-573.

180. Clarke D.K. Antigenic analysis of certain group В arthropodborne viruses by antibody absorption //J. Exp. Med. 1960. -V. 111.- P. 2132.

181. Clarke D. Studies on antigenic relationships among yhe viruses of the group В tick-borne complex //Bull. World Health Organ. 1964. - V. 31. -P. 45-56.

182. Clarke D.K., Duarte E.A, Elena S.F., Moya A., Domingo E., Holland J. The red queen reigns in the kingdom of RNA viruses //Proc. Nath. Acad. Sci. USF. 1994. - V. 91. - P. 4821-4824.

183. Cooper L., Scott T. Differential evolution of eastern equine encephalitis virus populations in response to host cell type //Genetics. 2001. - V. 157. -P. 1403-1412.

184. Crabtree M., Sang R., Stollar V., Dunster L., Miller B. Genetic and phenotypic characterization of the newly described insect flavivirus, Kamiti River virus //Arch Virol. 2003. - V. 148. - P. 1095-1118.

185. Domingo E., Sabo D., Taniguchi Т., Welssmann C. Nucleotide Sequence Heterogeneity of an RNA Phage Population //Cell. 1988. - V. 13. - P. 739-744.

186. Domingo E., Escarmis C., Sevilla N., Moya A., Elena S.F., Quer J. Novella I.S., Holland JJ. Basic concepts in RNA virus evolution //Faseb J. 1996. -V. 10. - P. 859-864.

187. Domingo E., Holland J.J. RNA virus mutations and fitness for survival //Annu. Rev. Micribiol. 1997. - V. 51 - P. 151-178.

188. Domingo E. Quasispecies theory in virology //J. Virol. 2002. - V. 76. -P. 463-465.

189. Drake J.W., Holland J.J. Mutation rates among RNA viruses //Proc. Nath. Acad. Sci. USA. 1999. - V. 96. - P. 13910-13913.

190. Ecker M., Allison S.L., Meixner Т., Heinz F.X. Sequence analysis and genetic classification of tick- borne encephalitis viruses from Europe and Asia//J. of Gen. Virol. 1999.-V. 80. - P. 179-185.

191. Eigen M. On the nature of virus qusispecies. Trends Microbiol., v. 4, p. 216-218.

192. Elshuber S., Allison S., Heinz F., Mandl C. Cleavage of protein prM is necessary for infection of BHK-21 cells by tick-borne encephalitis virus //J. Gen. Virol.-2003.-V. 84.-P. 183-191.

193. De Filippis V.R., Villarreal L.P. Virus evolution //"Fields Virology" /Eds. Knipe D.M., Howley P.M. et al. Lippincott Williams&WilkinsrPhiladelphia, 2001. P. 353-371.

194. Fischl W, Elshuber S., Schrauf S, Mandl C. Changing the protease specificity for activation of a flavivirus, tick-borne encephalitis virus //J. Virol. 2008. - V. 82. - P. 8272-8282.

195. Flamand M, Megret F, Mathieu M, Lepault J, Rey F, Deubel V. Dengue virus type 1 nonstructural glycoprotein NS1 is secreted from mammalian cells as a soluble hexamer in a glycosylation-dependent fashion //J. Virol. 1999. - V. 73. - P. 6104-6110.

196. Fritz R, Stiasny K, Heinz F.X. Identification of specific histidines as pH sensors in flavivirus membrane fusion //J. Cell Biol. 2008. - V. 183. - P. 353-361.

197. Gao G.G, Hussain M.H, Reid H.W, Gould E.A. Identification of naturally occurring monoclonal antibody escape variants of louping ill virus //J. Gen. Virol. 1994. - V. 75. - P. 609-614.

198. Gao C.F, Zanotto P.M., Holmes E.C, Reid H.W, Gould E.A. Molecular variation, evolution and geographical distribution of louping ill virus //Acta Virol. 1997. - V. 41(5). - P. 259-268.

199. Gaunt M.W, Sail A.A, de Lamballerie X, Falconar A.K.I, Dzhivanian Т. I, Gould E. A. Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their epidemiology, disease association and biogeography //J. Gen. Virol. -2001.-V. 82.-P. 1867-1876.

200. Gilbert L., Jones L.D., Hudson P.J., Gould E.A., Reid H.W. Role of small mammals in the persistence of Louping-ill virus: field survey and tick co-feeding studies //Med. Vet. Entomol. 2000. - V. 14(3). - P. 277282.

201. Gojobori Т., Moriyama E.N., Kimura M. Molecular clock of virol evolution, and neutral theory //Proc. Nath. Acad. Sci. USA. 1990. - V. 87. - P. 10015-10018.

202. Golovljova I., Vene S., Sjolander K.B., Vasilenko V., Plyusnin A., Lundkvist A. Characterization of tick-borne encephalitis virus from Estonia //J. Med. Virol. 2004. - V. 74. - P. 580-588.

203. Gould E.A., Zanotto P.M.A., Holmes E.C. The genetic evolution of flaviviruses //"Factors in the Emergence of Arbovirus Diseases" /Eds. Saluzzo J.F., Dodet B. Elsevier:Paris, 1997. - P. 51-62.

204. Gould E.A., de Lamballerie X., de Zanotto P.M., Holmes E.C. Origins, evolution, and vector/host coadaptations within the genus flavivirus //Adv. Virus Res. 2003. - V. 59. - P. 277-314.

205. Goto A., Hayasaka D., Yoshii K., Mizutani Т., Kariwa H., Takashima I. A. BHK-21 cell culture-adapted tick-borne encephalitis virus mutant is attenuated for neuroinvasiveness //Vaccine. 2003. - V. 21. - P. 4043— 4051.

206. Green S., Kurane I., Pincus S., Paoletti E., Ennis F.A. Recognition of dengue virus NSl-NS2a proteins by human CD4+ cytotoxic T lymphocyte clones //Virology. 1997. - V. 234(2). - P. 383-386.

207. Griffin D.E. Immune responses to RNA-virus infections of the CNS //Immunology. 2003. -V. 3. - P. 493-501.

208. Gritsun T.S., Holmes E.C., Gould E.A. Analysis of flavivirus envelope proteins reveals variable domains that reflect their antigenicity and may determine their pathogenesis //Virus Res. 1995. -V. 35. - P. 307-321.

209. Gritsun T.S., Desai A., Gould E.A. The degree of attenuation of tick-borne encephalitis virus depends on the cumulative effects of point mutations //J. Gen. Virol. 2001. - V. 82. - P. 1667-1675.

210. Gritsun T.S., Lashkevich V.A., Gould E.A. Tick-borne encephalitis //Antiviral research. 2003a. -V. 57. - P. 129-146.

211. Haglund M., Gunther G. Tick-borne encephalitis — pathogenesis, clinical course and long-term follow-up //Vaccine. 2003. - V. 21. - Suppl. 1. - S. 11-18.

212. Hahn C.S., Dalrymple J.M., Strauss F. Comparison of the virulent Asibi strain of yellow fever virus with the 17D vaccine strain derived from it //Proc. Nath. Acad. Sci. USA. 1987. - V. 84. - P. 2019-2023.

213. Hase Т., Summers P.L., Eckeles K.H., Putnak J.P. Morphogenesis of flaviviruses //Virally infected cells /Ed. Herris. Plenum:N.Y., 1989. - P. 275-308.

214. Hasegawa H., Yoshida M., Shiosaka Т., Fujita S., Kobayashi Y. Mutations in the envelope protein of Japanese encephalitis viruses affect entry into cultured cells and virulence in mice //Virology. 1992. - V. 191.-P. 158-165.

215. Haysaka D., Suzuki Y., Kariwa H., Gojobori Т., Takashima I. Phylogenetic and virulence analysis of tick-borne encephalitis viruses from Japan and Far-eastern Russia //J. Gen. Virol. 1999. - V. 80. - P. 3127-3135.

216. Heinz F.X., Berger R., Tuma W., Kunz C. A topological and functional model of epitopes on the structural glycoprotein of tick-borne encephalitisvirus defined by monoclonal antibodies //Virology. 1983. - V. 126. - P. 526-537.

217. Heinz F.X. Epitope mapping of flavivirus glicoproteins //Adv.Virus Res. 1986.-V. 31.-P. 103-168.

218. Heinz F.X., Allison S.L., Stiasny K., Schalich J., Holzmann H., Mandl C., Kunz C. Recombinant and virion-derived soluble and particulate immunogenes for vaccination against tick-borne encephalitis //Vaccines. -1995.-V. 13. P. 1636-1642.

219. Heinz F.X., Allison S.L. Structures and mechanisms in flavivirus fusion //Adv. Virus Res. 2000a. - V. 55. - H. 231-269.

220. Heinz F.X., Allison S.L. Flavivirus structure and membrane fusion //Adv. Virus Res. 2003. - V. 59. - P. 63-97.

221. Holbrook M.R., Ni H., Shope R.E., Barrett A.D.T. Amino acid substitution(s) in the stem-anchor region of Langat virus envelope protein attenuates mouse neurovirulence //Virology. 2001. - V. 286. - P. 54-61.

222. Holland J.J., Torre J.C., Steinhauer D.A. RNA virus populations as quasispecies //Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1992. - V. 176. - P. 1-16.

223. Holland J.J. Evolving virus plaques //Proc. Nath. Acad. Sci. USA. -1996.-V. 93.-P. 545-546.

224. Holmes, E. С., M. Worobey, and A. Rambaut. 1999. Phylogenetic evidence for recombination in dengue virus. . Mol Biol Evol 16:405-409.

225. Holmes E.C., Moya A. Is the Quasispecies Concept Relevant to RNA Viruses? //J. Virol. 2002. - V. 76. - P. 460-462.

226. Holzmann H., Mandl C., Guirakhoo F., Heinz F.X., Kunz C. Characterization of antigenic variants of of tick-borne encephalitis virus selected with neutralizing monoclonal antibodies //J. Gen. Virol. 1989. -V. 70.-P. 219-222.

227. Holzmann H., Heinz F.X., Mandl C., Guirakhoo F., Kunz C. A single amino acid substitution in envelope protein of tick-borne encephalitis virus leads to attenuation in mouse model //J. Virol. 1990. - V. 64. - P. 51565159.

228. Holzmann H., Vorobyova M.S., Ladyzhenskaya I.P., Ferenczi E., Kundi M., Kunz C., Heinz F.X. Molecular epidemiology of tick-borne encephalitis virus: cross-protection between European and Far Eastern subtypes //Vaccine. 1992. - V. 10. - p. 345-349.

229. Holzmann H., Stiasny K., Ecker M., Kunz C., Heinz F.X. Characterization of monoclonal antibody-escape mutants of tick-borne encephalitis virus with reduced neuroinvasiveness in mice //J. Gen. Virol. 1997.-V. 78. -P. 31-37.

230. Hoshino K., Isawa H., Tsuda Y., Yano K., Sasaki Т., Yuda M., Takasaki Т., Kobayashi M., Sawabe K. Genetic characterization of a new insect flavivirus isolated from Culex pipiens mosquito in Japan //Virology. -2007. V. 359. - P. 405-414.

231. Jacobs S.C, Wilkinson G.W.G, Stephenson J.R. High level expression of TBEV NS1 protein by using an adenovirus-based vector: protection elicited in murine model //J. Virol. 1992. -V. 66. - P. 2086-2095.

232. Jenkins G, Worobey M, Wolk C.H, Holmes E.C. Evidence for the non-quasispecies evolution of RNA viruses //Mol. Biol. Evol. 2001. - V. 18. -P. 987-994.

233. Jenkins G.M, Rambaut A, Pybus O.G, Holmes E.C. 2002. Rates of molecular evolution in RNA viruses: a quantitative phylogenetic analysis //J. Mol. Evol. V. 54. - P. 156-165.

234. Jiang W.R, Lowe A, Higgis S, Reid H, Gould E.A. Single amino acid codon changes detected in louping ill virus antibody-resistant mutants with reduced neurovirulence //J. Gen. Virol. 1993. - V. 74. - P. 931-935.

235. Johnsos P.A., Rosner M.R. Characterization of murine-specific leukemia virus receptor from L cells //J. Virol. 1986. - V. 58. - P. 900-908.

236. Jones C.T., Ma L., Burgner J.W., Groesch T.D., Post C.B., Kuhn R.J. Flavivirus capsid is a dimeric alpha-helical protein //J. Virol. 2003. - V. 77.-P. 7143-7149.

237. Jones M., Davidson A., Hibbert L., Gruenwald P., Schlaak J., Ball S., Foster G., Jacobs M. Dengue virus inhibits alpha interferon signaling by reducing STAT2 expression //J. Virol. 2005. - V. 79. - P. 5414-5420.

238. Kawano H., Rostapshov V., Rosen L., Ching-Jun Lai. Genetic determinants of Dengue type 4 virus neurovirulence for mice //J. Virol. -1993.-V. 67. P. 6567-6575.

239. Khan A., Pichler J., Rosemann A., Blaas D. Human rhinovirus type 54 infection via heparan sulfate is less efficient and strictly dependent of low endosomal pH //J. Virol. 2007. - V. 81. - P. 4625-4632.

240. Khromykh A.A., Varnavski A.N., Sedlak P.L., Westaway E.G. Coupling between replication and packaging of flavivirus RNA: evidence derivedfrom the use of DNA-based full-length cDNA clones of Kunjin virus //J. Virol. 2001a. - V. 75. - P. 4633-4640.

241. Kiermayr S., Kofler R.M., Mandl C.W., Messner P., Heinz F.X. Isolation of capsid protein dimers from the tick-borne encephalitis flavivirus and in vitro assembly of capsid-like particles //J. Virol. 2004. - V. 78. - P. 80788084.

242. Kim S.-Y., Yun S.-M., Han M.G., Lee I.Y., Lee N.Y., Jeong Y.E., Lee B.C., Ju Y.R. Isolation of Tick-Borne viruses from wild rodents, South Korea //Vector-Borne Zoonitic Dis. 2008. - V. 8(1). - P. 7-13.

243. Kjellen L., Lindahl U. Proteoglycans: structures and interactions //Annu. Rev. Biochem. 1991. -V. 60. - P. 443-475.

244. Klimstra W.B., Ryman K.D., Johnston R.E. Adaptation of Sindbis virus to BHK cells selects for use of heparan sulfate as an attachment receptor //J. Virol. 1998. - V. 72. - P. 7357-7366.

245. Kofler R.M., Leitner A., O'Riordain G., Heinz F.X., Mandl C.W. Spontaneous mutations restore the viability of tick-borne encephalitis virus mutants with large deletions in protein С //J. Virol. 2003. - V. 77. -p. 443-451.

246. Kopecky J., Gruhoffer L., Kovar V., Jindrak L., Vokurkova D. A putative host cell receptor for tick-borne encephalitis virus identified by anty-idiotypic antibodies and virus affinoblotting //Intervirology. 1999. -V. 42.-P. 9-16.

247. Krah D.L., Choppin P.W. Mice immunized with measles virus develop antibodies to a cell surface of Vero cells //J. Virol. 1988. - V. 62. - P. 1565-1572.

248. Kreil T.R., Eibl M.M. Viral infection of macrophages profoundly alters requirements for induction of nitric oxide synthesis //Virology. 1995. -V. 212. - P. 174-178.

249. Kreil T.R., Eibl M.M. Nitric oxide and viral infection: no antiviral activity against a Flavivirus in vitro, and evidence for contribution to pathogenesis in experimental infection in vivo //Virology. 1996. - V. 219.-P. 304-306.

250. Kroschewski H., Allison S.L., Heinz F.X., Mandl C.W. Role of heparan sulfate for attachment and entry of tick-borne encephalitis virus //Virology. 2003. - V. 308. - P. 92-100.

251. Kummerer B.M., Rice C.M. Mutations in the yellow fever virus nonstructural protein NS2A selectively block production of infectious particles //J. Virol. 2002. - V. 76(10). - P. 4773-4784.

252. Kuno G., Chang G., Tsuchiya K., Karabatsos N., Cropp C. Phylogeny of the genus Flavivirus //J. Virol. 1998. - V. 72. - P. 73-83.

253. Kuno G., Chang G.J. Biological transmission of arboviruses: reexamination of and new insights into components, mechanisms, and unique traits as well as their evolutionary trends //Clin. Microbiol. Rev. -2005. -V. 18(4). P. 608-637.

254. Кигапе I., Brinton M.A., Samson A.L., Ennis F.A. Dengue virus-specific, human CD4+ CD8- cytotoxic T-cell clones: multiple patterns of virus cross-reactivity recognized by NS3-specific T-cell clones //J. Virol. -1991.-V. 65(4).-P. 1823-1828.

255. Labuda M., Austin J.A., Zuffova E., Kozuch O., Fuchsberger N., Lysy J., Nuttals P.A. Importance of lokalized skin infection in TBEV transmission //Virology. 1996. -V. 219. - P. 357-366.

256. Laemmli V.K. Clevage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 //Nature. 1970. - V. 227. - P. 680-685.

257. Lamballerie X. de, Crochu S., Billoir F., Neyts J., Micco P. de, Holmes E.C., Gould E.A. Genome sequence analysis of Tamana bat virus and its relationship with the genus Flavivirus //3 Gen Virol. 2002. - V. 83 - P. 2443-2454.

258. Lane Т.Е., Hardison J.L., Walsh K.B. Functional diversity of chemokines and chemokine receptors in response to viral infection of the central nervous system //Curr. Top. Microbiol. Immunol. — 2006. — V. 303.-P. 1-27.

259. Lee J.M., Crooks A.J., Stephenson J.R. The synthesis and maturation of a non-structural extracellular antigen from tick-bome encephalitis virus and its relationship to the intracellular NS1 protein //J.Gen. Virol. 1989. -V. 70. - P. 335-343.

260. Lee E., Weir R.C., Dalgarno L. Changes in the Dengue major envelope protein on passaging and their localization on the three-dimensional structure of the protein //Virology. 1997. -V. 232. - P. 281-290.

261. Lee E., Lobigs M. Substitution at the putative receptor-binding site of an encephalitic flavivirus alter virlence and host cell tropism and reveal a role for glycosaminoglycans in entry //J. Virol. 2000. - V. 74. - P. 8867-8875.

262. Lee E., Lobigs M. Mechanism of virulence attenuation of glycosaminoglycan-binding variants of Japanese encephalitis virus and Murray Valley encephalitis virus //J.Virol. 2002. - V. 76. - P. 4901-4911.

263. Lee E., Hall R.A., Lobigs M. Common E protein determinants for attenuation of glycosaminoglycan-binding variants of Japanese encephalitis and West Nile viruses //J. Virol. 2004. - V. 78. - P. 82718280.

264. Levine В., Hardwick J.M., Trapp B.D., Crawford Т.О., Bollinger R.C., Griffin D.E. Antibody-mediated clearance of alphavirus infection from neurons //Science. 1991. - V. 254 - P. 856-860.

265. Lieberman A.P., Pitha P.M., Shin H.S., Shin M.L. Production of tumor necrosis factor and other cytokines by astrocytes stimulated withlipopolysaccharide or a neurotropic virus //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1989.-V. 86.-P. 6348-6352.

266. Lin C, Amberg S.M, Chambers T.J, Rice C.M. Cleavage at a novel site in the NS4A region by the yellow fever virus NS2B-3 proteinase is a prerequest for processing at the downstream 4A/4B signalase site //J. Virol. 1993. - V. 67. - P. 2327-2335.

267. Lin Yi.L, Chen L.K, Liao C.L. A highly attenuated strain of Japanese encephalitis virus induces a protective immune response in mice //J. Virol. 1998.-V. 72. - P. 191-200.

268. Lindenbach B.D, Rice C.M. Genetic interaction of flavivirus nonstructural proteins NS1 and NS4A as a determinant of replicase function //J. Virol. 1999. - V. 73. - P. 4611-4621.

269. Lindenbach B.D, Rice C.M. Flaviviridae: The Viruses and Their Replication //"Fields Virology" /Eds. Knipe D.M, Howley P.M. et al. -Lippincott Williams&Wilkins:Philadelphia, 2001. P. 991-1043.

270. Lindenbach B.D, Rice C.M. Molecular biology of flaviviruses //Adv. Virus Res. 2003. - V. 59. - P. 23-60.

271. Lindsley M.D, Rodriguez M. Characterization of the inflamatory response in the central nervous system of mice susceptible or resistant to demyelination by Theiler's virus //J. Immunol. 1989. - V. 142 - P. 26772682.

272. Liou V.L, Hsu C.Y. Japanese encephalitis virus is transported across the cerebral blood vessels by endocytosis in mouse brain //Cell Tissue Res. -1998.- V. 293-P. 389-394.

273. Lobigs M., Arthur C.E., Mullbacher A., Blanden R.V. The Flavivirus nonstructural protein NS3 is a dominant sourse of citotoxic T cell peptide dominants //Virology. 1994. - V. 202. - P. 195-201.

274. Lobigs M., Mullbacher A.,Wang Y., Pavy M., Lee E. Role of type I and II interferon responses in recovery from infection with an encephalitic flavivirus //J. Gen. Virol. 2003. - V. 84. - P. 567-572.

275. Lobigs M., Lee E. Inefficient signalase cleavage promotes efficient nucleocapsid incorporation into budding flavivirus membranes //J. Virol. -2004.-V. 78.-P. 178-186.

276. Lorenz I.C., Allison S.L., Heinz F.X., Helenius A. Folding and dimerization of tick-borne encephalitis virus envelope proteins prM and E in the endoplasmic reticulum //J. Virol. 2002. - V. 76. - P. 5480-5491.--------r------- -----r„. . . . . 367

277. Lukashev A.N. Role of recombination in evolution of enteroviruses //Rev. Med. Virol. 2005. - V. 15. - P. 157-67.

278. Lyon M., Deakin J.A., Gallagher. Liver heparan sulfate structure. A novel molecular design //J. Biol. Chem. 1994. - V. 269. - P. 1120811215.

279. Ma L., Jones C.T., Groesch T.D., Kunh R.J., Post C.B. Solution structure of dengue virus capsid protein reveals another fold //Proc. Nath. Acad. Sci. USA. 2004. - V. 101. - P. 3414-3419.

280. Mackenzie J.M., Jones M.K., Young P.R. Immunolocalization of the dengue virus nonstructural glycoprotein NS 1 suggests a role in viral RNA replication //Virology. 1996. - V. 220. - P. 232-240.

281. Mackenzie J.M., Khromykh A.A., Jones M.K., Westaway E.G. Subcellular localization and some biochemical properties of the flavivirus Kunjin nonstructural proteins NS2A and NS4A //Virology. 1998. - V. 245.-P. 203-215.

282. Major L., Linn M., Slade R., Schroder W., Hyatt A., Gardner J., Cowley J., Suhrbier A. Ticks associated with macquarie island penguins carry arboviruses from four genera //PLoS ONE 4. Epub 2009. - e4375.

283. Maldov D.G., Karganova G.G., Timofeev A.V. Tick-borne encephalitis virus interaction with the target cells //Arch. Virol. 1992. - V. 127 - P. 321-325.

284. Mandl C.W., Heinz F.X., Kunz C. Sequence of the structural proteins of the tick-borne encephalitis virus (Western subtype) and comparative analysis with other flaviviruses //Virology. 1988. -V. 166. - P. 197-205.

285. Mandl C.W., Guirakhoo F., Holzmann H., Heinz F.X., Kunz C. Antigenic strucrure of the flavivirus envelope protein E at the molecular level, using tick-borne encephalitis virus as a model //J. Virol. 1989. - V. 63 - P. 564-571.

286. Mandl C.W., Heinz F.X., Stockl E., Kunz C. Genome sequence of tick-borne encephalitis virus (Western subtype) and comparative analysis of nonstructural proteins with other flaviviruses //Virology. 1989. - V. 173. -P. 291-301.

287. Mandl C.W., Kunz C., Heinz F.X. Presence of poly(A) in a flavivirus: significant differences between the 3" noncoding regions of the genomic RNAs of tick-borne encephalitis virus strains //J.Virol. 1991. - V. 65. -P. 4070-4077.

288. Mandl C.W., Holzmann H., Kunz C., Heinz F.X. Complete genomic sequence of Powassan virus: evaluation of genetic elements in tick-borne versus mosquito-borne flaviviruses //Virology. 1993. - V. 194. - P. 173184.

289. Mandl C.W., Holzmann H., Meixner Т., Rauscher S., Stadler P.F., Allison S.L., Heinz F.X. Spontaneous and engineered deletion in 3' NCR of TBE: construction of highly attenuated mutants of a Flavivirus //J.Gen. Virol.- 1998.-V. 72 -P. 2132-2140.

290. Mandl C.W., Allison S.L., Holzmann H., Meixner Т., Heinz F.X. Attenuation of tick-borne encephalitis virus by structure-based site-specific mutagenesis of a putative Flavivirus receptor binding site // J. Virol. 2000. - V. 74. - P. 9601-9609.

291. Mandl C.W. Steps of the tick-borne encephalitis virus replication cycle that affect neuropathogenesis //Virus Res. 2005. - V. 111 - P. 161-174.

292. Marin M.S., Zanotto P.M.De A., Gritsun T.S., Gould E.A. Phylogeny of TYU, SRE, and CFA virus: different evolutionary rates in the genus Flavivirus //Virology. 1995. - V. 206. - P. 1133-1139.

293. Markoff L., Falgout В., Chang A. Conserved internal hydrophobic domain mediates the stable membrane integration of the dengue virus capsid protein //Virology. 1997. - V. 233. - P. 105-117.

294. Markoff L. 5'- and З'-noncoding regions in flavivirus RNA //Adv. Virus Res. 2003. - V. 59 - P. 177-228.

295. Martinez-Barragan J.J., del Angel R.M. Identification of a putative coreceptor on Vero cells that participates in dengue 4 virus infection //J. Virol. -2001.-V. 75(17). -P. 7818-7827.

296. McArtur M.A., Suderman M.T., Mutebi J.P., Xiao S.Y., Barrett D.T. Molecular characterization of a hamster viscerotropic strain of yellow fever virus //J. Virol. 2003. - V. 77. - P. 1462-1468.

297. McMinn P.C., Dalgarno L., Weir R.C. A comparison of the spread of Murray Valley encephalitis viruses of high or low neuroinvasiveness in the tissues of Swiss mice after peripheral inoculation //Viroljgy. 1996. — V. 220.-P. 414-423.

298. McMinn P.C., Weir R.C., Dalgarno L. A mouse-attenuated envelope protein variant of Murray Valley encephalitis virus with altered fusion activity //J. Gen. Virol. 1996a. - V. 77 - P. 2085-2088.

299. McMinn P.C. The molecular basis of virulence of the encephalitogenic flaviviruses //J. Gen.Virol. 1997. - V. 78. - P. 2711-2722.

300. Mecham R.P. Receptors for laminin on mammalian cells //FASEB J. -1991.-V. 5.-P. 2538-2546.

301. Mims C.A. Aspects of the pathogenesis of virus diseases //Bacteriolog. Reviews. 1964. - V. 28( 1). - P. 3 0-71.

302. Miralles R., Moya A., Elena S.F. Effect of population patchiness and migration rates on the adaptation and divergence of vesicular stomatitis virus quasispecies populations //J. Gen. Virol. 1999. - V. 80. - P. 20512059.

303. Miralles R., Moya A., Elena S.F. Diminishing returns of population size in the rate of RNA virus adaptation //J. Virol. 2000. - V. 74. - P. 35663571.

304. Modis Y., Ogata S., Clements D., Harrison S.C. A ligand-binding pocket in the dengue virus envelope glycoprotein //Proc. Nath. Acad. Sci. USA. -2003. V. 100. - P. 6986-6991.

305. Modis Y, Ogata S, Clements D, Harrison S.C. Structure of the dengue virus envelope protein after membrane fusion //Nature. 2004. - V. 427. -P. 313-319.

306. Modis Y, Ogata S, Clements D, Harrison S.C. Variable surface epitopes in the crystal structure of Dengue virus type 3 envelope glycoprotein //J. Virol. 2005. - V. 79. - P. 1223-1231.

307. Monath T.P, Heinz F.X. Flaviviruses //"Fields Virology" /Eds. Fields B.N, Knipe D.M, Howley P.M. et al. Lippincott-Raven Publishers Philadelphia, 1996. - P. 961-1034.

308. Morales-Betoulle M. E, Pineda M. L. M, Sosa S. M, Panella N, Lopez M.R, Cordon-Rosales C, Komar N, Powers A, Johnson B.W. Culex Flavivirus Isolates from Mosquitoes in Guatemala //J. Med. Entomol. -2008.-V. 45.- P. 1187-1190.

309. Moya A, Elena S.F, Bracho A, Miralles R, Barrio E. The evolution of RNA viruses: A population genetics view //Proc. Nath. Acad. Sci. USA. -2000. V. 97. - P. 6967-6973.

310. Moya A, Holmes E.C, Gonzalez-Candelas F. The population genetics and evolutionary epidemiology of RNA viruses //Nat. Rev. Microbiol. -2004. V. 2 - P. 279-288.

311. Mukhopadhyay S, Kim B.-S, Chipman P.R, Rossmann M.G, Kuhn R.J. Structure of West Nile virus //Science. 2003. - V. 302. - P. 248.

312. Munoz-Jordan J.L, Sanchez-Burgos G.G, Laurent-Rolle M, Garcia-Sastre A. Inhibition of interferon signaling by dengue virus //Proc. Nath. Acad. Sci. USA. 2003. - V. 100 - P. 14333-14338.

313. Murray J.M., Aaskov J.G., Wright P.J. Processing of the dengue virus type 2 proteins prM and C-prM //J. Gen. Virol. 1993. - V. 74. - P. 175180.

314. Muszbek L., Szabo Т., Fesus L. A high sensitive method for the measurement of ATPase activity //Anal. Biochemistry. 1977. - V. 77. -P. 286-288.

315. Muylaert I.R., Chambers T.J., Galler R., Rice C.M. Mutagenesis of the N-linked glycosylation sites of the yellow fever virus NS1 protein: Effects on virus replication and mouse neurovirulence //Viroljgy. 1996. — V. 222.-P. 159-168.

316. Muylaert I.R., Galler R., Rice C.M. Genetic analysis of yellow fever virus NS1 protein: identification of a temperature-sensitive mutation which blocks RNA accumulation //J. Virol. 1997. -V. 71. - P. 291-298.

317. Nawa M., Takasaki Т., Yamada K.-I., Kurane I., Akatsuka T. Interference in Japanese encephalitis virus infection of Vero cells by a cationic amphiphilic drug, chloropromazine //J. Gen. Virol. 2003. - V. 84. - P. 1737-1741.

318. Neumann H., Schmidt H., Wihharm E., Behrens L., Wekerle H. Interferon у gene expression in sensory neurons: evidence for autocrine gene regulation //J. Exp. Med. 1997. -V. 186. - P. 2023-2031.

319. Ni H., Chang G.-J.J., Xie H., Trent D.W., Barrett A.D.T. Molecular basis of attenuation of neurovirulence of wild-type Japanese encephalitis virus strain SA14 //J. Gen. Virol. 1995. -V. 76. - P. 409-413.

320. Niedrig M., Klockmann U., Lang W., Roeder J., Burk S., Modrou S., Pauli G. Monoclonal antibodies directed against tick-borne encephalitis virus with neutralizing activity in vivo //Acta Virol. 1994. — V. 38. - P. 141-149.

321. Nisbet D., Lee K., van den Hurk A., Johansen C., Kuno G., Chang G., Mackenzie J., Ritchie S., Hall R. Identification of new flaviviruses in the Kokobera virus complex //J. Gen. Virol. 2005. - V. 86. - P. 121-124.

322. Nitayaphan S., Grant J.A., Chang G.J. Nucleotide sequense of the virulent SA-14 strain of Japanese encephalitis virus and its attenuated vaccine derivative, SA-14-14-2 //Virology. 1990. - V. 177. - P. 541-552.

323. Novella I.S, Elena S.F., Moya A., Domingo E., Holland J.J. Size of genetic bottlenecks leading to virus fitness loss is determined by mean initial population fitness //J. Virol. 1995. - V. 69 - P. 2869-2872.

324. Novella I.S., Duarte E.A., Elena S.F., Moya A., Domingo E., Holland J.J. Exponential increases of RNA virus fitness during large population transmissions //Proc. Nath. Acad. Sci. USA. 1995b. - V. 92. - P. 58415844.

325. Novella I.S., Quer J., Holland J.J. Exponential fitness gains of RNA virus populations are limited by bottleneck effects //J. Virol. 1999. - V. 73.-P. 1668-1671.

326. Novella I.S., Hershey C.L., Escannis C., Domingo E., Holland J.J. Lack of evolutionary stasis during alternating replication of an arbovirus in insect and mammalian cells //J. Mol. Biol. 1999a - V. 287. - P. 459-465.

327. Nowak Т., Wengler G. Analysis of the disulfides present in the membrane proteins of the West Nile flavivirus //Virology. 1987. - V. 156.-P. 127-137.

328. Nuttall P. A., Labuda M. Dynamics of infection in tick vectors and at the tick-host interface //Adv. Virus Res. 2003. - V. 60. - P. 233-272.

329. Parrish C.R., Woo W.S., Wright P.J. Expression of the NS1 gene of dengue virus type 2 using vaccina virus. Dimerisation of the NS1 glycoprotein //Arch.Virol. 1991. - V. 117.- P. 279-286.

330. Patkar C., Kuhn R. Yellow Fever virus NS3 plays an essential role in virus assembly independent of its known enzymatic functions //J. Virol. -2008.-V. 82.-P. 3342-52.

331. Pletnev A.G., Yamshchikov V.F., Blinov V.M. Tick-borne encephalitis virus genome. The nucleotide sequence coding for virion structural proteins //FEBS Lett. 1986. -V. 200. - P. 317-321.

332. Pletnev A.G., Yamshchikov V.F., Blinov V.M. Nucleotide sequence of the genome and complete amino acid sequence of the polyprotein of tick-borne encephalitis virus //Viroljgy. 1990. - V. 174. - P. 250-263.

333. Pletnev A.G., Bray C.J., Lai C.J. Chimeric of tick-borne encephalitis and dengue type 4 viruses: effects of mutations on neurovirulence in mice //J. Virol. 1993. - V. 67. - P. 4956-4963.

334. Pletnev A.G., Men R. Attenuation of the Langat tick-borne flavivirus by chimerization with mosquito-borne flavivirus dengue type 4 //Proc. Nath. Acad. Sci. USA. 1998. - V. 95. - P. 1746-1751.

335. Pletnev A.G., Karganova G.G., Dzhivanyan T.I., Lashkevich V.A., Bray M. Chimeric Langat/Dengue viruses protect mice from heterologouschallenge with the highly virulent strains of tick-borne encephalitis virus //Virology. 2000. - V. 274. - P. 26-31.

336. Protopopova E.V., Sorokin A.V., Konovalova S.N. Human laminin-binding protein as cell receptor for the tick-borne encephalitis virus //Zenr. bl. Bacteriol. 1999. - V. 289. - P. 632-638.

337. Proutsky V., Gould E.A., Holmes E.C. Secondary structure of the 3'untranslated region of flaviviruses: similarities and difference //Nucl. Acids Res. 1997. - V. 25. - P. 1194-1202.

338. Rauscher S., Flamm C.W., Mandl C.W., Heinz F.X., Stadler P.F. Secondary structure of the З'-noncoding region of flavivirus genomes: comparative analysis of base pairing probabilities //RNA. 1997. — V. 3. — P. 779-791.

339. Rey O., Rossi J., Lopez R., Iapalucci-Espinoza S.J., Franze-Rernandez M.T. Tacaribe virus infection may induce inhibition of the activity of the host cell Ca2+ and Na+/K+ pumps //J. Gen. Virol. 1988. - V. 69. - P. 951-954.

340. Rey F.A., Heinz F.X., Mandl C.W., Kunz C., Harrison S.C. The envelope glycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2A resolution //Nature. -1995. V. 375. - P. 292-297.

341. Rice C.M. Flaviviridae: the viruses and their replication //"Fields Virology" /Eds. Fields B.N., Knipe D.M., Howley P.M. et al. Lippincott-Raven Publishers:Philadelphia. - 1996. - P. 931-959.

342. Roehrig J.T. Antigenic structure of flavivirus proteins //Adv. Virus Res. 2003. — V. 59. - P. 141-175.

343. Rostland K.S., Esko J.D. Microbial adherence to and invasion through proteoglycans //Infect. Immun. 1997. - V. 65. - P. 1-8.

344. Rothman A.L., Kurane I., Lai C.-J., Bray M., Falgout В., Men R., Ennis F.A. Dengue virus protein recognition by virus-specific murine CD8+ cytotoxoc lymphocytes //J. Virol., 1993. - V. 67. - P. 801-806.

345. Rubin S.G., Chumakov M.P. New data on the antigenic types of tick-borne encephalitis virus //Arboviruses in the Mediterranean Countreies / Ed. by J. Veseniak-Hirjan. Fisher:Stuttgart, New York, 1980. - P. 231236.

346. Ruiz-Jabaro C.M. Arias A. Baranowski E., Escarmis C., Domingo E. Memory in viral quasispecies //J. Virol. 2000. - V. 74. - P. 3543-3547.

347. Ruiz-Jarabo C., Arias A., Molina-Paris C., Briones C., Baranowski E., Escarmis C., Domingo E. Duration and fitness dependence of quasispecies memory //J. Mol. Biol. 2002. -V. 315. - P. 285-296.

348. Ruoslahti E. Integrins //J. Clin. Invest. 1991. - V. 87(1). - P. 1-5.

349. Ryan M.D., Monaghan S., Flint M. Virus-encoded proteinases of the Flaviviridae //J.Gen. Virol. 1998. - V. 79. - P. 947-959.

350. Ryman K.D., Xie H., Neil Ledger Т., Campbell G.A., Barrett A.D.T. Antigenic variants of Yellow Fever virus with an altered neurovirulence phenotype in mice //Virology. 1997. - V. 230. - P. 376-380.

351. Ryman K.D., Neil Ledger Т., Campbell G.A., Watowich S.J., Barrett A.D.T. Mutation in 17D-204 vaccine substrain-specific envelope protein epitope alters the pathogenesis of Yellow Fever virus in mice //Virology. -1998.-V. 244. P. 59-65.

352. Sambrook J., Fritsch E.R., Maniatis T. Molecular cloning Laboratory manuals. CSH Laboratory Press:USA. - 1989.

353. Sanches I.J., Ruiz B.H. A single nucleotide change in the E protein of dengue virus 2 Mexican strain affects neuruvirulence in mice //J. Gen. Virol. 1996.-V. 77.-P. 2541-2545.

354. Scatchard G. The interaction of proteins for small molecules and ions //Ann .NY Acad. Sci. 1949. - V. 51. - P. 660-672.

355. Schlegel R., Willingham M.C., Pastan I.H. Saturable binding sites for vesicular stomatitis virus on the surfage of Vero cells //J. Virol. 1982. — V. 43.-P. 871-875.

356. Schlesinger J.J., Brandiss M.W., Cropp C.B., Monath T.P. Protection against yellow fever in monkeys by immunization with yellow fever nonstructural protein 1 //Virology. 1986. -V. 60. - P. 1153-1155.

357. Spector T. Refinement of the coomassie blue method of protein quantitation. A simple and linear spectrophotometric assay for less than or equal to 0.5 to 50 microgram of protein //Analyt. Biochem. 1978. - V. 86.-P. 142-146.

358. Sprent J. T and В memory cells //Cell.- 1994. V. 76. - P. 315-322.

359. Sprent J, Surh C.D. Cytokines and T cell homeostasis //Immunol. Lett. -2003. V. 85(2). - P. 145-149.

360. Standler K, Allison S.L, Schalish J, Heinz F.X. Proteolitic activation of tick-borne encephalitis virus by furin //J.Gen. Virol. 1997. — V. 71. - P. 8475-8481.

361. Stephenson J.R, Crooks A.J, Lee J.M. The synthesis of immunogenic polypeptides encoded by tick-borne encephalitis virus //J.Gen. Virol. -1987.-V. 68. P. 1307-1316.

362. Stiasny K, Allison S.L, Marchler-Bauer A, Kunz C, Heinz F.X. Structural requirement for low-pH-induced rearragements in the envelope glycoprotein of tick-bome encephalitis virus //J. Virol. 1996. — V. 70. - P. 8142-8147.

363. Stiasny K, Allison S.L, Schalich J, Heinz F.X. Membrane interactions of the tick-borne encephalitis virus fusion protein E at low pH //J. Virol. -2002. V. 76. - P. 3784-3790.

364. Stiasny К, C. Kossl C, Heinz F.X. Involvement of lipids in different steps of the flavivirus fusion mechanism //J. Virol. 2003. - V. 77. - P. 7856-7862.

365. Stiasny К., Kossl С., Heinz F.X. Differences in the postfusion conformations of full-lenth and truncated class II fusion protein E of tick-borne encephalitis virus //J. Virol. 2005. - V. 79 - P. 6511-6515.

366. Stocks C.E., Lobigs M. Signal peptidase cleavage at the Flavivirus CprM junction: dependence on the viral NS2B-3 protease for efficient processing requires determinants in C, the signal peptide, and prM //J. Virol., 1998. V. 72. - P. 2141-2149.

367. Stollar V, Thomas V. An agent in the Aedes aegypti cell line (Peleg) wich causes fusion of Aedes albopictus cells //Virology. 1975. - V. 64. — P. 367-377.

368. Takashima I., Morita K., Chiba M., Hashimoto N. A case of tick-borne encephalitis in Japan and isolation of the virus //J. Clin. Microbiol. 1997. -V. 35.-P. 1843-1947.

369. Takeda Т., Ito Т., Chiba M., Takahashi K., Niioka Т., Takashima I. Isolation of tick-borne encephalitis virus from Ixodes ovatus (Acari: Ixodidae) in Japan //J. Med. Entomol. 1998. - V. 35(3). - P 227-231.

370. Thepparit C., Smith D.R. Serotype-specific entry of dengue virus into liver cells: identification of the 37 kilodalton/67-kilodalton high-affinity laminin receptor as a dengue virus serotype 1 receptor //J. Virol. 2004. — V. 78(22).-P. 12647-12656.

371. Thurner C., Witwer C., Hofacker I. L., Stadler P. F. Conserved RNA-secondary structures in Flaviviridae genomes //J. Gen. Virol. 2004. - V. 85.-P. 1113-1124.

372. Turner P.E., Elena S.F. Cost of host radiation in RNA virus //Genetics. -2000. -V. 15. P. 1465-1470.

373. Twiddy S., Holmes E. The extent of homologous recombination in members of the genus Flavivirus //J. Gen. Virol. 2003. - V. 84. - P. 429440.

374. Uchil P., Satchidanandam V. Architecture of the flaviviral replication complex //J. Biol. Chem. 2003. - V. 278. - P. 24388-24398.

375. Ulug Т., Garry R.F., Waite M.R.F., Bose H.R. Alterations in monovalent cftion transport in Sindbis virus-infected chich cells // Virology. 1984. -V. 132.-P. 118-130.

376. Ulug, E., Garry R., Bose H. The role of monovalent cation transport in Sindbis virus maturation and release //Virology. 1989. - V. 172(1). - P. 42-50.

377. Ulug E.T., Garry R.F., Bose H.RJr. Inhibition of Na+K+ATPase activity in membranes of Sindbis virus-infected chick cells //Virology.- 1996. V. 216(2).-P. 299-308.

378. Van der Poll Т., Jansen J., Levi M. 1994. Regulation of interleukin 10 release by tumor necrosis factor in humans and chimpanzees //J. Exp. Med. V. 180.-P. 1985-1988.

379. Venugopal K., Reid H.W., Gould E.A. Tick-borne flavivirus NS1 gene: identification of conserved peptides and antigenic analysis of recombinant louping ill virus NS1 protein //Virus Res. 1993. - V. 31. - P. 245-254.

380. Vignuzzi M., Stone J.K., Arnold J.J., Cameron C.E., Andino R. Quasispecies diversity determines patogenesis through cooperative interactions in a viral population //Nature. 2006. - V. 439. - P. 344-348.

381. Volkova T.D., Vorovitch M.F., Ivanov V.T., Timofeev A.V., Volpina O.M. A monoclonal antibody that recognizes the predicted tick borne encephalitis virus E protein fusion sequence blocks fusion //Arch. Virol. -1999.-V. 144.-P. 1035-1039.

382. Vorovitch M.F., Timofeev A.V., Atanadze S.N., Tugizov S.M., Kushch A.A., Elbert L.B. pH- dependent fusion of tick-borne encephalitis virus with artificial membranes //Arch. Virol. 1991. -V. 118. - P. 133-138.

383. Wallner G., Mandl C.W., Kunz C., Heinz F.X. The flavivirus Зл-noncoding region: extensive size heterogeneity independent ofevolutionary relationshipsamong strains of tick-borne encephalitis virus //Virology. 1995.-V. 213. - P. 169-178.

384. Wallner G., Mandl C.W., Ecker M. Characterization and complete genome sequences of high- and low-virulence variants of tick-borne encephalitis vims //J. Gen. Virol. 1996. - V. 77. - P. 1035-1042.

385. Weaver S.C., Rico-Hesse R., Scott T.W. Genetic diversity and slow rates of evolution in New World Alphaviruses //Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1992.-V. 176.-P. 99-115.

386. Weaver S.C., Brault A.C. Kang W., Holland J.J. Genetic and fitness changes accompanying adaptation of an arbovirus to vertebrate and invertabrate cells //J. Virol. 1999. - V. 73 - P. 4316-4326.

387. Westaway E.G., Mackenzie J.M., Kenney M.T. Ultrastructure of Kunjin virus-infected cells: Colocalization of NS1 and NS3 with double-stranded RNA, and of NS2B with NS3, in virus-induced membrane structures //J. Virol. 1997 - V. 71. - P. 6650-6661.

388. Westaway E.G., Mackenzie J M., Khromykh A.A. Kunjin RNA replication and applications of Kunjin replicons //Adv. Virus Res. 2003. -v. 59.-P. 99-140.

389. Whitton J.L., Oldstone M.B.A. The immune response to viruses //Fields Virology /Ed. D.M. Knipe, P.M. Howley et al. Lippicott Williams& Wilkins:Philadelphia, 2001. - P. 285-320.

390. Winkler G., Randolph V.B., Cleaves G.R., Ryan Т.Е., Stollar V. Evidence that the mature form of the flavivirus nonstructural protein NS1 is a dimmer //Virology. 1988. -V. 162. - P. 187-196.

391. Winkler G., Maxwell S.E., Ruemmler C., Stollar V. Newly synthesized dengue-2 virus nonstructural protein NS1 is a soluble protein but becomes partially hydrophobic and membrane-associated after dimerization //Virology. 1989. -V. 171. - P. 302-305.

392. Woolhouse M.E.J., Louise Т.Н., Haydon D.T. Population biology of multihost pathogens //Science. 2001. - V. 292. - P. 1109-1112.

393. Worobey M., Rambaut A., Holmes E.C. Widespread intra-serotypic recombination in natural populations of dengue virus //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. - P. 7352-7357.

394. Wu J., Bera A., Kuhn R., Smith J. Structure of the Flavivirus helicase: implications for catalytic activity, protein interactions, and proteolytic processing//J. Virol. 2005. -V. 79. - P. 10268-10277.

395. Xie H., Ryman K.D., Campbell G.A., Barrett A.D. Mutation in NS5 protein attenuates mouse neurovirulence of yellow fever 17D vaccine virus //J. Gen. Virol. 1998. - V. 79. - P. 1895-1899.

396. Xu Т., Sampath A., Chao A., Wen D., Nanao M., Chene P., Vasudevan S., Lescar J. Structure of the Dengue virus helicase/nucleoside triphosphatase catalytic domain at a resolution of 2.4 A//J Virol. 2005.79:10278-88.

397. Yap Т., Xu Т., Chen Y., Malet H., Egloff M., Canard В., Vasudevan S., Lescar J. Crystal structure of the dengue virus RNA-dependent RNA polymerase catalytic domain at 1.85-angstrom resolution //J. Virol. -2007.-V. 81.-P. 4753-4765.

398. Zanotto P.M.A, Gao G.F, Gritsun T, Marin M.S, Jiang W.R, Venugopal K, Reid H.W, Gould E.A. An Arbovirus cline across the Nothern Hemisphere //Virology. 1995. - V. 210. - P. 152-159.

399. Zanotto P.M.A, Gould E.A, Gao G.F, Harvey P.H, Holmes E.C. Population dynamics of flaviviruses revealed by molecular phylogenies //Proc. Nath. Acad. Sci. USA. 1996. - V. 93. - P. 548-553.

400. Zhang Y, Corver J, Chipman P.R, Zhang W, Pletnev S.V, Sedlak D, Baker T.S, Strauss J.H, Kuhn RJ, Rossmann M.G. Structures of immature flavivirus particles //EMBO J. 2003. - V. 22 - P. 2604-2613.

Информация о работе

Карганова, Галина Григорьевна
доктора биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.06

Диссертация

Механизмы микроэволюции вируса клещевого энцефалита - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Механизмы микроэволюции вируса клещевого энцефалита ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Механизмы микроэволюции вируса клещевого энцефалита"

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Карганова, Галина Григорьевна

Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизмы микроэволюции вируса клещевого энцефалита"

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Карганова, Галина Григорьевна

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Карганова, Галина Григорьевна, Москва

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Механизмы микроэволюции вируса клещевого энцефалита
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология