Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Идентификация и функциональный анализ клеточных генов, дифференциально экспрессирующихся в результате инфекции вирусом венесуэльского энцефалита лошадей

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Идентификация и функциональный анализ клеточных генов, дифференциально экспрессирующихся в результате инфекции вирусом венесуэльского энцефалита лошадей"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМ. М.М.ШЕМЯКИНА И Ю.А.ОВЧИННИКОВА

На правах рукописи

Никифорова Наталия Николаевна

ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ КЛЕТОЧНЫХ ГЕНОВ, ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО ЭКСПРЕССИРУЮЩИХСЯ В РЕЗУЛЬТАТЕ ИНФЕКЦИИ ВИРУСОМ ВЕНЕСУЭЛЬСКОГО ЭНЦЕФАЛИТА ЛОШАДЕЙ

специальность - 03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2003

Работа выполнена в лаборатории структуры и функции генов человека Инстапута биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

Научный руководитель:

академик

Е.Д. Свердлов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук кандидат биологических наук

В.В. Носиков

М.А. Эльдаров

Ведущая организация:

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Защита диссертации состоится 11 июня 2003 года в 10 часов на заседании специализированного совета Д.002.019.01 при Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН по адресу: 117997, ГСП-7, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16-10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН.

Автореферат разослан § мая 2003 г.

Ученый секретарь специализированного совета, доктор химических наук

В. А. Несмеянов

Актуальность_проблемы. Идентификация 1енов, дифференциально

экспресеирующихся в ходе инфекции, вызываемой типичным представителем альфавирусов - вирусом венесуэльского энцефалита лошадей (ВЭЛ), является первьм шагом на пути к созданию эффективной антивирусной стратегии. Альфавирусы имеют икосаэдрический нуклеокапсид, заключенный в плотно прилегающую оболочку, гликопротеиновые компоненты которой образуют икосаэдрическую решетку. Альфавирусный нуклеокапсид содержит одноцепочечный плюс-РНК геном размером около 11,7 нт, связанный с многочисленными копиями одного капсидного белка массой около 30 кДа. Альфавирусы представляют серьезную угрозу здоровью человека, некоторые представители альфавирусов вызывают энцефалит со смертельным исходом, ряд других альфавирусов вызывают болезнь, характеризующуюся жаром, сыпью и артралгией. Несмотря на интенсивное изучение процессов, происходящих при альфавирусной инфекции, к настоящему времени идентифицировано только очень небольшое количество клеточных генов, экспрессия которых меняется в процессе инфекции.

Метод супрессионной вычитающей гибридизации позволяет идентифицировать транскрипты, отличающие инфицированные и неинфицированные вирусом клетки и делает возможной идентификацию клеточных генов, дифференциально транскрибирующихся при альфавирусной инфекции. Обнаружение дифференциальных транскриптов, соответствующих хорошо изученным генам, позволило нам впервые идентифицировать изменение сплайсинга хозяйских генов при инфекции вирусами ВЭЛ и клещевого энцефалита (ВКЭ).

Цель работы. Целью данной работы являлась идентификация клеточных генов, дифференциально экспресеирующихся при инфицировании вирусом ВЭЛ, а также сравнение их экспрессии при инфицировании ВКЭ, типичным представителем флавивирусов.

Структура работы. Диссертационная работа изложена на 89 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов и их обсуждения, экспериментальной части, выводов и списка литературы; содержит 13 рисунков и 1 таблицу.

Научная новизна и практическая ценность. Впервые была предпринята попытка выявления различий в транскрипции клеточных генов при альфавирусной инфекции на уровне полного транскриптома. Идентифицированы несколько клеточных

транскриптов, дифференциально экспрессирующ

¡еся -ири инфицировании вирусом РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА | С Петербург „Г Л

09 ИМ ^ акт,

ш

венесуэльского энцефалита лошадей, среди них мРНК спермидин/спермин Ы1-ацетилтрансферазы (ввАТ). Согласно проведенным ранее исследованиям, повышенная экспрессия этого гена противодействует опухолевому росту, и действие ряда противоопухолевых препаратов опосредовано индукцией экспрессии ЗБАТ. Дифференциальная экспрессия альтернативно сплайсированной формы этого гена, обнаруженная нами при инфекции вирусами ВЭЛ и ВКЭ в еще большей степени подчеркивает функциональную важность этого гена и возможную прямую связь его с явлением вирус-индуцируемого апоптоза. Дифференциальная регуляция гена гетерогенноядерного рибонуклеопротеина Н1, одного из клеточных факторов сплайсинга, является подтверждением вмешательства вирусов в механизмы сплайсинга клеточных генов в ходе инфекции вирусом венесуэльского энцефалита лошадей. Публикации. По теме диссертации опубликована одна печатная работа.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Клетки, инфицированные ВЭЛ и ВКЭ

Выращивание клеточных линий 293 и ЯН (линии эмбриональной почки человека), их инфицирование ВЭЛ и ВКЭ и выделение клеточной РНК проводились в Государственном научно-исследовательском центре вирусологии и биотехнологии "Вектор". Кривые роста ВЭЛ в клетках 293 и ЯН при 37°С показаны на рис. 1. Как видно из рисунка, к 36 часам после инфекции ВЭЛ клетки 293 были почти полностью лизированы, в то же время клетки ЯН не лизировались даже через 96 часов после инфекции. Различие в продукции частиц ВЭЛ (в ТСЮботГ1) между клетками ЯН и 293 достигало 1,3+/-0,4х105 к 36 часам после инфекции. Уровень репликации ВЭЛ также был оценен прямыми измерениями синтеза вирусного белка Е2 (гликопротеин, необходимый для связывания с клеточной мембраной) при помощи анти-Е2 моноклональных антител. В клетках 293 синтез белка Е2 быстро увеличивался между 6 и 24 часами после инфекции в соответствии с уровнем продукции инфекционных вирионов (данные не показаны). В клетках ЯН чувствительность иммуноферментного анализа (Е1А) оказалась недостаточной для детектирования продукции белка Е2. Наиболее вероятно, что клетки ЯН в состоянии поддерживать персистентную инфекцию ВЭЛ с низкой продукцией инфекционных вирионов и структурных вирусных полипептидов.

О 12 24 36 48 60 72 84 96

Часы после инфекции

Рис. 1. Кривые роста ЮЛ в клетках 293 и RH. монослои клеток 293 и RII инфицировали ВЭЛ, инкубировали в течение умчанных промежутков времени, собирали, грижды замороживали-оттаивали для освобождения вир\са. и инфекционные шгры определяли методом вирусного цитипатическою чффекга (СРЕ) Иммуноферментный анали i (EIА) с анти-Е2 чоноклональпыми антителами испольчокати для определения \ровня синтеза вирусного белка Е2 в 10' вирус-инфицированных клетках Квадрагы -выход вируса в клетках 293. трсмппмшки -выход вируса в клетках RH. ромбы - имм>ноферменгный анализ в клетках 293, крес1ы - иммуноферменгный анализ в KjieiKax RH. (Данные получены в лабораюрии В Б Локтева, I НТЦ '"Вектор".)

Кривые роста ВКЭ показали, что обе клеточные линии (RH и 293) высоко чувствительны к инфекции ВКЭ и допускают размножение вируса до высокого титра без видимого лизиса клеток RH и с цитопатическим эффектом в клетках 293 (данные не показаны). Продукция вирусных частиц ВКЭ быстро увеличивается между 12 и 24 часами после инфекции, и затем стабилизируется.

Конструирование и анализ дифференциальных библиотек

Для идентификации генов, индуцированных или супрессированных при инфекции ВЭЛ, были сконструированы библиотеки дифференциально экспрессирующихся кДНК при помощи модифицированного метода супрессирующей вычитающей гибридизации (рис.2). Модификация метода заключалась в том, что

з

синтез первой цепи кДНК производился с матрицы тотальной РНК, что существенно упрощает методику и позволяет использовать небольшие количества материала для конструирования библиотек. Клеточные культуры 293 или ЯН инфицировали вирусом ВЭЛ или, в контрольном эксперименте, буфером, не содержащим ВЭЛ. После 6 или 12 часов инкубации из клеток выделяли тотальную РНК и синтезировали кДНК с использованием олиго(с1Т) праймера. кДНК из инфицированных ВЭЛ клеток служила тестером для конструирования библиотеки, обогащенной индуцируемыми генами. При этом драйвером служила кДНК из контрольных неинфицированных клеток. Для библжиеки, обогащенной супрессируемыми генами, в качестве тестера использовали кДНК контрольных клеток, а драйвером служила кДНК из инфицированных клеток. Отдельно расщепляли двухцепочечную кДНК тестера и драйвера рестрикционной эндонуклеазой с целью получения коротких фрагментов с тупыми концами. кДНК тестера разделяли на две порции и лигировали каждую порцию с различным адаптором (А и Б на рис.2). Адаптерами служили последовательности кДНК длиной около 40 нт; 5'-концы адаптеров 1 и 211 имеют идентичные последовательности длиной 22 нт, поэтому для первичной ПЦР амплификации требуется только один праймер (ПЦР праймер 1). 3'-концевые части адаптеров имеют последовательности, предотвращающие амплификацию методом супрессии. Супрессия имеет место при наличии комплементарных последовательностей одного и того же адаптера на каждом конце одночепочечных кДНК. Таким образом, при отжиге праймера в процессе первичной ПЦР амплификации инвертированные повторы способствуют образованию "сковородочных" структур, препятствующих амплификации молекул кДНК с одинаковыми адаптерами, а амплификация кДНК с разными адаптерами на концах проходит нормально. кДНК драйвера с адаптерами не лигировалась. Первая гибридизация каждой порции тестера с драйвером приводила к уравниванию и обогащению дифференциально экспрессированных последовательностей среди одноцепочечных молекул тестера. После этой стадии порции А и Б смешивали и продолжали ренатурацию. Вторая гибридизация двух порций тестера приводила к образованию гетеродуплексов (трейсер-трейсер гетеродуплексы на рис.2) из молекул, оставшихся одноцепочечными после первой гибридизации. Гетеродуплексы обогащались дифференциально экспрессированными последовательностями. Гетеродуплексы могли быть селективно амплифицированы, поскольку благодаря разным концевым последовательностям они не подвергались эффекту супресии (см. рис.2). Вследствие супрессирующего эффекта ПЦР только дифференциально

Хрейсер А

лишрованне I адаптера 1 ▼

Драйвер (в тбыткс)

ратдетьная гибргитпация драйвера и трейоеров с разнь адапгорамц

трейсер-трепсер гомод> апексы

ТреЙсер £

^ лпгпрованпе адалгора 2К

трейсер-дрпйвер гетерод> ппексы ^-драйвер

я-драивер

чв-трейсер

смешивание порцт1 А н Б и продолжение ренатурацни

I

Продукты первой гибридизации

трейсер-трейсер гетеродуачексы

тре йсер-драйвер гетерод>щексы

Достройка 3* концов и ПИР с прайыером I

лилейная амплификация

с!з-драйвер ьь-драйвер

ад-трейсер

пет амплификации

треисер-трепсер НЧ супрессия

гомсш> пяексы ( N амплифшеацип

структура типа 1 сковородка'

\

экспоненциальная ашгшфньацня

Рис. 2 Схема метода вычитающей гибридизации Черные прямоугольники -внешние пасти адаптеров 1 и 211. Белые и заштрихованные прямоугольники-внутренние части адаптеров 1 и 211. соответственно ПЦР праймер 1 комплементарен внешним частям адаптеров

экспрессированные последовательности амшшфицировались экспоненциально. Аналогичным образом конструировались библиотеки индуцируемых и супрессируемых генов через 6 часов после инфицирования клеточной культуры 293 и через 12 часов после инфицирования клеточной культуры RH вирусом ВЭЛ.

Вычтенные кДНК клонировали в плазмидный вектор и рекомбинантными плазмидами трансформировали компетентные клетки Е. coli. Наличие lacZ оперона в плазмидных векторах позволило провести отбор белых рекомбинантных клонов от нерекомбинантных голубых. Рекомбинантные клоны были ранжированы в 96-луночные планшеты, и вставки, представляющие собой вычтенные кДНК, амплифицировались с помощью ПЦР. Для ПЦР в качестве матриц использовали ДНК, разрушенных нагреванием, бактериальных культур, и праймеры, применявшиеся для вычитания кДНК. Продукты ПЦР-амплификации разделяли в атрозном геле и переносили на нейлоновую мембрану. Предварительная гибридизация, проведенная с меченой геномной кДНК ВЭЛ в качестве зонда, позволила исключить клоны вирусного происхождения, содержание которых было значительным. Библиотека индуцируемых генов при инфекции клеточной культуры 293, например, содержала около 50% вирусных клонов. Так как геномная РНК ВЭЛ полиаденилирована и, следовательно, проходит те же стадии вычитания, что и фракция мРНК общей клеточной РНК, то существенное обогащение библиотеки вирусными клонами являлось внугренним конгролем эффективности вычитающей гибридизации. Зондами для сравнительной гибридизации служили полученные в результате вычитания кДНК.

Из библиотек, сконструированных для анализа генов, дифференциально экспрессированных в клеточной культуры 293 (6 часов после инфекции), таким образом было проверено по 96 случайно выбранных клонов. На основании данных дифференциальной гибридизации было отобрано 16 и 14 дифференциальных клонов из библиогек, предположительно индуцированных и супрессированных кДНК, соответственно. После определения первичной структуры этих клонов было выяснено, что они представляют собой 11 и 10 независимых последовательностей, соответственно.

Из библиотек, сконструированных для анализа дифференциально экспрессированных генов в клеточной культуре RH (12 часов после инфекции), было проверено около 400 случайно выбранных клонов, на основании анализа которых было отобрано 19 клонов из библиотеки предположительно супрессированных кДНК. После

определения первичной структуры этих клонов было выяснено, что они представляют собой 8 независимых последовательностей.

Для идентификации соответствующих геномных последовательностей или кДНК, полученные последовательности сравнивали с базами данных иуклеотидных последовательностей (GenBank, Human Genome, EST).

ОТ-ПЦР анализ

Дифференциальность экспрессии обнаруженных генов подтверждали методом ОТ-ПЦР с использованием тотальной РНК, выделенной из инфицированных клеточных линий 293 и RH, а также соответствующих неинфицированных культур в контрольном эксперименте. Для выяснения кинетики дифференциальной экспрессии относительное количество кДНК определяли через 3, 6, 9, 12, 24 и 32 часа после инфекции для клеточной линии 293 и через 3, 6, 24 и 36 часов для клеточной линии RH. Первую цепь кДНК строили на матрице суммарной РНК при помощи рассеянной затравки. Специфические праймеры для ОТ-ПЦР, соответствующие отобранным генам, подбирали с использованием программы Primer 3 (http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi). В качестве контроля проводили ОТ-ПЦР с праймерами к генам "домашнего хозяйства": р-актину или клатрину. Во всех исследованных случаях экспрессия этих генов не менялась. По результатам ОТ-ПЦР была подтверждена дифференциальность 6 клонов - для одного клона транскрипция индуцировалась, для 4 - супрессировалась (рис. 3 и 4) и для одного клона (мРНК спермидин/спермин N1-ацетилтрансферазы) наблюдалась сложная картина с участием альтернативного сплайсинга (см, ниже). Результаты ОТ-ПЦР суммированы в таблице 1. Как видно из таблицы, все последовательности, за исключением мРНК спермидин/спермин N1-ацегилтрансферазы и гетерогенноядерного рибонуклеопротеина Н, соответствуют анонимным человеческим мРНК с еще неидентифицированными функциями. Это отражает современный статус функциональной аннотации генома человека, при котором большинству генов не приписано определенных функций.

ВЭЛ/293 Часы после инфекции

6 9 12 24 32 Контроль

1 1 1 II 1 1 1 1

«в • тШ • Щ «# Йк - в

Циклы 28 31 3-1 28 31 34 28 31 34 28 31 34 28 31 34 28 31 34 28 31 34 ПЦР

Рис. 3 ОТ-ПЦР амплификация с праймерами к клону N"2 Матрица. кДНК ш клеток 293. инфицированных ВЭЛ (28. 31. 34 цикла) Равное количество кДНК матрицы (по 20 нг) проверялось амплификацией с праймерами к бета-актину (данные не покачаны)

ВЭЛУ293 Часы после инфекцнн

Контроль^

Циклы ПЦР

29

33

37

29 33

37 29 33

37

Рис 4 ОТ-ПЦР амплификация с праймерами, специфическими к клон\ N 4 Матрица-кДНК из клеток 293, инфицированных ВЭЛ (29, 33. 37 циклов; Равное количество кДНК матрицы (по 20 га) проверялось амплификацией с праймерами к бега-актит (данные пе покачаны)

Супрессия мРНК гетер ni енноядерного рибонуклеопротеина Н при инфекции ВЭЛ

Нуклеотидная последовательность одного из клонов (таблица 1) оказалась практически идентичной последовательности, кодирующей мРНК гечерогенноядерного рибонуклеопротеина Н (hnRNP Н) (№ по GenBank NM 005520). Этот клон был обнаружен в библиотеке предположительно супрессируемых генов, приготовленной через 12 часов после инфицирования клеточной культуры. ОТ-ПЦР анализ с праймерами, подобранными к этому гену, подтвердил понижение экспрессии мРНК приблизительно в 5-8 раз через 24 часа после инфекции (рис. 5). В последующих временных точках экспрессия восстанавливалась до уровня, наблюдаемого в контрольных неинфицированных клетках. Так как изменение экспрессии имело место только в одной временной точке, данный эксперимент выполнялся дважды для проверки воспроизводимости результатов.

Полученные в настоящей работе результаты, а также литературные данные показывают, что экспрессия гена hnRNP Н при многих биологических процессах меняется на относительно небольшую величину, и для peine грации этих изменений необходим количественный анализ экспрессии. Видимое нами отсутствие количественных изменений уровня мРНК hnRNP Н во временных точках 3, б. 12 и 36 часов после инфекции может являться следствием недостаточной чувствительности метода полуколичественного ОТ-ПЦР, примененного в работе.

Белок hnRNP Н концентрируется в многочисленных дискретных областях нуклеоплазмы. Наблюдаемая локализация hnRNP Н напоминает распределение факторов сплайсинга пре-мРНК, таких как SC-35 и SF2, которые также

Таблица 1. мРНК с индуцированной или супрессированной экспрессией в результате вирусной инфекции

№ Клеточная культура; часы после инфекции № доступа по GenBank Хромо сома Ген или мРНК Идентичность % Изменение экспрессии*

1 293; 6 NM_002970 5 мРНК Homo sapiens спермидин/спермик N1-ацетилтрансферазы (SSAT) 99 см. текст

2 293; 6 АК094066 9 Анонимная мРНК Homo sapiens; кДНК FLJ36747 100 Индуцирована в ~8-раз

3 293; 6 ХМ_098076 2 Анонимная мРНК Homo sapiens-, гипотетический белок 92 Супрессирована в~8-раз

4 293; 6 АС073415 2 Не известны 97 Супрессирована в ~8-раз

5 293; 6 АК025726 1 Анонимная мРНК Homo sapiens; кДНК FLJ22073 100 Супрессирована в ~8-раз

6 RH; 12 NM_005520 5 мРНК гетерогенноядерного рибонуклеопротеина Н (hnRNP Н) Homo sapiens 98 Супрессирована в ~8-раз

Изменение экспрессии в инфицированных ВЭЛ клетках относительно контроля, рассчитанное по результатам ОТ-ПЦР

ВЭЛ/1Ш

Часы после инфекции

6__12__24_36 Кот речь

Питы

I [| Ц1 23 26 29 23 26 29 23 26 29 23 26 29 23 26 29 23 26 29

Цикшл 22 25 28 22 25 28 22 25 28 22 25 28 22 25 28 22 25 28

Бета-актин

Рис 5 01-Г1ЦР амплификация с исиольювакием праймерон специфически \ л 1Я мРПК 1шКЫР П кДПК ш клеюк К11. инфнцированныч ВОЛ амп шфшшрониии в течение 23. 26 и 29 циклов с ираймерам» к кД11К ЬпЯЫР 11 и 22 25 и 28 циклон с праймерачн к бета-актит.

обнаруживаются в областях нуклеоплазмы. В настоящее время неясно, представляют ли места концентрации факторов сплайсинга области активного процессинга пре-мРНК, или же места сборки комплекса для последующего его транспорта к месту сплайсинга.

В работе МаЫагеШ и соавторов методом дифференциального дисплея была выявлена активация экспрессии мРНК фактора 8С35 при вирусной инфекции. Так, через 2 дня после инфекции НГУ-1 наблюдалось 2-3-кратное увеличение экспрессии, после достижения пиковых значений, экспрессия БС35 падала до практически первоначального уровня в последующих временных точках - к четвертому дню после инфекции. Кинетика экспрессии белка ЭСЗб в Н1У-инфицированных клетках бьиа параллельна изменениям в экспрессии мРНК.

В дополнение к сходной локализации и индуцируемости в результате вирусной инфекции (следует подчеркнуть, что оба вируса - РНК-содержащие) необходимо отметить еще одну общую черту экспрессии мРНК hnRNP Н и SC35 в инфицированных клетках. В обоих случаях содержание РНК проходит через экстремум.

SC35 является существенной частью аппарата сплайсинга клеточных транскриптов, участвует в сборке сплайсеосом и влияет на выбор мест сплайсинга. Более того, изменение количества SC35 in vitro и in vivo может влиять на выбор альтернативных мест сплайсинга клеточных пре-мРНК.

В настоящее время неизвестно, изменяет ли вирусная инфекция экспрессию белков клетки, участвующих в процессинге вирусной РНК. Если изменение экспрессии SC35 и/или hnRNP Н влияет на выбор альтернативного места сплайсинга, то опосредованные вирусом изменения экспрессии SC35 и/или hnRNP Н могут представлять собой один из механизмов, по которому вирус влияет на выбор места сплайсинга для продукции оптимального количества вирусных РНК и белков. Способность регулировать экспрессию факторов сплайсинга и их внутриклеточное распределение является чертой общей для нескольких вирусов. Например, вирус простого герпеса кодирует белок ICP27, который уменьшает уровень клеточных мРНК посредством вмешательства в их сплайсинг и, как следствие, накопления пре-мРНК. Опосредованные вирусами изменения клеточных механизмов сплайсинга, следовательно, представляют собой один из способов, которыми вирусы влияют на клетку для улучшения условий их репликации. Обнаруженное нами изменение экспрессии фактора сплайсинга hnRNP Н еще раз подтверждает влияние вирусной инфекции на клеточные механизмы сплайсинга. Тем не менее, для установления детального механизма подавления экспрессии hnRNP Н и изменения процессинга вирусных транскриптов и/или клеточных пре-мРНК в инфицированных клетках необходимы дальнейшие исследования.

Индукция мРНК спермидин/спермин Nl-ацетилтрансферазы при инфекции ВЭЛ

Увеличение уровня экспрессии мРНК SSAT в инфицированных клетках по сравнению с контрольными подтверждали О'Г-ПЦР с праймерами, выбранными таким образом, чтобы амплифицировать почти полную последовательность кДНК SSAT. Структура гена SSAT и положение пары праймеров (Р1 и Р2) показаны на рис. 6. ОТ-ПЦР с этой парой праймеров (рис.7А-7С, 7Е) на матрице кДНК, полученной из клеток 293 и RH, показал наличие двух продуктов с длинами около 690 и 790 п.н. В

контрольном эксперименте без добавления обратной транскриптазы продуктов ПЦР не наблюдали.

Р1 Р2 __

1 . "РИ . 1| I 789 ни ОТ-11ЦР продл кг (индч цир\емый)

/ // А я' \чХ / // I

/ /7 I X

—-в^иа-^-й-с 4

\ \ \ • s s

\ \ \ Дополнительный эетфн^Х' , ''

\ \ \ s"

\ \ N - ' У

\ \\ ,у У

ГЧ \\ VI,' '

¡I I lí*~ I 679 пн O I -ПЦР мродч кг

Рис 6 Стр>rrvpa гена SSAT (в центре) и дв\кеплайсинговыч форм его «РНК Стрелки чказывани поящий ираПмеров. выбранных для RT-PCR (Р1 и Р2) наш амплификации гибридиюционного зонда (РЗ и Р4)

Как видно из рис. 7А-7С и 7Е, в ходе вирусной инфекции индуцируется только синтез мРНК, приводящей к образованию ОТ-ПЦР продукта длиной 790 п.н. Количественный анализ изображения продуктов ОТ-ПЦР был выполнен с помощью программы Gel-Pro Analyzer (Media Cybernetics), и показал приблизительно 10-кратное увеличение количества ОТ-ПЦР продукта длиной 790 п.н. в случае клеток 293 и 3-5-крагное увеличение для клеток RH через 6 часов после инфекции вирусом ВЭЛ (рис.7А и 7В). ОТ-ПЦР анализ также выявил, что этот уровень экспрессии поддерживался в клетках 293 до 32 часов после инфекции, практически до того момента, когда большая часть клеток подвергается апоптозу. В клетках RH инфекция ВЭЛ вызывала постоянное увеличение количества продукта длиной 790 п.н., так что оно становилось почти равным количеству короткого продукта к 36 часам после инфекции.

Наблюдаемый эффект был выражен еще более ярко для клеток RH, инфицированных вирусом клещевого энцефалита (рис. 7С). Через 24 часа после инфекции количество длинного продукта ПЦР даже превосходило количество KopoiKoro продукта. В то же время, индукция длинного продукта ПЦР в этом случае была сравнима с индукцией в клетках 293, инфицированных ВЭЛ (10-20 раз). Избыток

£

ВЭЛ/293

Чпсы после инфекции 6 9 12 24

32

ВЭЛЛ1Н

Часы после инфекции 3 6 24 36

Бе1 а-дм ни

В

Бсгп-актпн

ВКЭ/ТШ

Часы после ннфекцин 3 6 9 24

ВЭЛ/293, олппм1Т травленная матрица

Часы после цнфекцни 3 б 12 24

В

ВЭЛ/293

£ г

3.3 кЬ

1.4 кЬ

■ 1.4 кЬ

Клатрин

К.1,11 рш|

Рис 7 ОТ-ПЦР амплификация с исиолыованием праймеров. специфических для гена спермщин'спермин Ы'-ацетатграисферазы (ЯБЛТ) Матрицы (А) кДПК из клеток 294. инфшшровашшх ВОЛ (40 циклов). (В) хДНК т клеток ЯН. инфицированных ВОЛ (30 циклов). (С) кД11К из клеюк ИИ, инфицированных ВЮ (1 цикл) Стрелки покатывают два ОТ-ПЦР продукта Количество матрицы кДНК выравнивали с использованием праймеров к р-акгину и клирику ([)) Позсрн блот-пюридюация шильной РНК ]н клеток 293. инфицированных ВИЛ в течение 9 часов, и соопвосгвующей конгрочьной РНК с чшдом. специфическим к .иыернлишнои] ийсированной мРНК АТ (верхний), к обеим ешмйсишовым формам (нижний) и с кошрольным юндом юшрина (Е) Млрнды кДНК ш клешк 293. инфицированных ВЭЛ и синте лтрованньп с олшо(<Щ праимером (30 циклов) В контрольном 'эксперименте клетки инкубировали бет вируса в течение 9 часов (Л, О) или 6 часов (В, С)

длинного продукта ОТ-ПЦР, вероятно, имел место за счет уменьшения количества короткош продукта.

Существует возможность того, что наблюдаемый длинный транскрипт представляет собой не кодирующую мРНК, а аберрантный транскрипт, считываемый с противоположной цепи ДНК гена. Так как метод ОТ-ПЦР не может различить эти два случая, для проверки происхождения этого транскрипта были выполнены специальные эксперименты. кДНК была синтезирована с использованием каждого из ввАТ-специфических праймеров (Р1 или Р2, рис. 6), т.е. при синтезе первой цегти в реакции с обратной транскриптазой в качестве затравки служил один из ЗЯАТ-специфических праймеров. В зависимости от использованного праймера первая цепь кДНК должна представлять собой преимущественно копию кодирующей или некодирующей цепей мРНК, если таковая присутствует. Как показано на рис. 8А, только кДНК, синтезированная с кодирующей цепи мРНК, способна приводить к образованию как длинного, так и короткого продуктов ОТ-ПЦР.

В следующих экспериментах нами было подтверждено, что накопление в ходе вирусной инфекции продукта, соответствующего длинному ПЦР-ампликону, является вирус-специфической особенностью. Эти эксперименты проводились с использованием кДНК, полученной на матрице суммарной РНК из клеток герминогенной опухоли человека семиномы, в качестве контроля при этом служила суммарная РНК из нормальной тестикулярной паренхимы. Общий уровень транскриптов 8ЭАТ в клетках семиномы был повышен приблизительно в 10 раз (рис.8В) по сравнению с нормальными клетками тестикулярной паренхимы. Тем не менее, в противоположность инфицированным вирусами клеткам, не бьшо обнаружено значительного накопления длинного продукта ОТ-ПЦР. По аналогии с предыдущими экспериментами, контроль на одинаковое содержание кДНК в тестируемых образцах осуществлялся амплификацией с праймерами к гену клатрина.

Индуцируемая мРНК ввАТ - продукт альтернативного сплайсинга

Видимый размер короткого продукта ОТ-ПЦР (около 690 п.н.) приближается к ожидаемому размеру для матрицы кДНК ЗБАТ человека (679 п.н.). Для выяснения точной структуры обоих транскриптов полосы ДПК после ОТ-ПЦР были разделены в агарозном геле, вырезаны, элюированы из агарозы, клонированы и секвенированы. Нуклеотидная последовательность короткого продукта ОТ-ПЦР оказалась идентичной последовательности мРНК ББАТ человека, кодирующей активный фермент (йепВапк

Accession № NM_002970). В то же время, нуклеотидная последовательность длинного продукта ОТ-ПЦР содержала дополнительную вставку длиной НО п.н., которая соответствовала по последова1ельности альтернативно сплайсированной мРНК,

ВЭЛ/293, 6 часов, SSAT-специфические матрицы

BrXJI/293, олиго-с1'Г затравленная матрица

Часы после инфекции 3 6 12 24 32

Рис 8 ОТ-ПЦР амплификация с прайчерачи (Р1 и Р2, рис о), специфическими к I ен\ спсрмилин спермин Ы'-ацет и чтрансфсразы (А) Матрицы кДНК из ктегок

и н ф и им рова н н ы х ВЭЛ в течение 6 часов, синтезировали с непо ¡ь-юванисм праймера Р1 (кодирующая цепь) или Р2 (неюадир) гс>щая цепь), 28 циклов ПЦР (В) Моггрицы кДНК, порченные из семиномы, норма ты ¡ой тест ик\лярной паренхимы и клеток 293. инфицированных ВОЛ в течение 12 часов. 30 циклов ПЦР (С 1 Магрицы кДНК ш клеток 293, инфицированных ВЭД в 1ечение ч капанных промежутков времени и синте1ированны\ с о7пго(Л ) прайчероч, 30 цикчов ПЦР М ДНК маркер

содержащей дополнительный "экзон" (рис. 9), и образовывала, таким образом, при ОТ-ПЦР фрагмент длиной 789 п.н. Оба альтернативных экзон-интронных перехода подчинялись правилу йи/АО. Более того, анонимная человеческая мРНК с той же самой экзон/интронной структурой, что и мРНК, соответствующая ферментативно-

1

i

' активному белку, была обнаружена среди нуклеотидных последовательностей в

t

GenBank (Accession № AL.050290, человеческая анонимная кДНК DKF7.p586G1923).

В то время, как нормальный транскрипт кодирует активный белок SSAT из 171 аминокислоты, альтернативно сплайсированный транскрипт, из-за присутствия в последовательности нового экзона трех терминирующих кодонов в соответствующей рамке, может приводить только к образованию укороченного полипептида из 71 аминокислоты (рис. 9). Шестьдесят восемь N-концевых аминокислотных остатков этого гипотетического полипептида идентичны аминокислотным остаткам

41 51

Нативная LLEDGFGEHPFYHCLVAEVP

Альтернативная LLEDGFGEHPFYHCLVAEVP Нативная CTGCTAGAAGATGGTTTTGGAGAGCACCCCTTTTACCACTGCCTGGTTGCAGAAGTGCCG

Альтернативная CTGCTACAAGATGGTTTTGGAGAGCACCCCTTTTACCACTGCCTGGTTGCAGAAGTGCCG

61

Нативная KEHWTPEG

Альтернативная KEHWTPEGYSL6

Нативная AAAGAGCACTGGACTCCGGAAG--------------------------------------

Альтернативная AAAGA.GCACTCGACTCCGGAAGGTTACAGTCTCTAGCTTCGCCATGTACATGGCCCTTCC

Альтернативная GTGTACATGGATGGGCGGGGAGGTAACTAAAAGATCCTTTACACAATAAAGTAGATGATC

71 81

Нативная HS IVGFAMYYFTYDP

Альтернативная MYYFTYDP

Нативная ------------GACACAGCATTGTTGGTTTTGCCATGTACTATTTTACCTATGACCCGT

Альтернативная ArGATAAArGAOSACACAGCATTGTTGGTTTTGCCATGTACTATTTTACCTATGACCCGT

91 101

Нативная WIGKLLYLEDFFVMSDYRGF

Альтернативная WIGKLLYLEDFFVMSDYRGF Нативная GGATTGGCAAGTTATTGTATCTTGAGGACTTCTTCGTGATGAGTGATTATAGAGGCTTTG

Альтернативная GGATTGGCAAGTTATTGTATCTTGAGGACTTCTTCGTGATGAGTGATTATAGAGGCTTTG

Рис. 9. Частичные нуклеотидные последовательности двух сплайсинтвых форм мРНК БЭЛТ и соответсгвующие аминокислотные последовательности. 'Нативная' и 'Альтернативная' - нуклеотидные последовательности мРНК и аминокислотные последовательности, приводящие к образованию активного фермента и альтернативно сплайсированной мРНК, соответственно. Дополнительный 110 п.н. экзон выделен курсивом; терминирующие кодоньт внутри его последовательности подчеркнуты. Номера аминокислотных остатков соответствуют последовагельности активного фермента.

белка вЯЛТ, в то же время последние три аминокислоты отличаются. Следует также добавить, что альтернативно сплайсированный транскрипт содержит и другую открытую рамку считывания, которая кодирует 96-аминокислотный полипептид

протяженностью от 76-го аминокислотного остатка до С-конца белковой последовательности ЭЙАТ (рис. 9). Тем не менее, продукция этого полипептида едва ли возможна из-за отсутствия последовательности для связывания рибосом или сайтов повторного связывания рибосом рядом с АТО-кодоном.

Нозерн блот анализ уровня транскрипции альтернативно сплайсированной мРНК БвАТ

Для подтверждения результатов, полученных методом ОТ-ПЦР, мы применили Нозерн блот-гибридизацию. Суммарную РНК, полученную через 9 часов после инфекции, и РНК из неинфицированных контрольных клеток разделяли в агарозным геле, содержащем формальдегид, и денатурированную РНК переносили на нейлоновую мембрану. Предварительные эксперименты по Нозерн-гибридизации показали, что разрешающая способность формальдегид-агарозного геля недостаточна для досюверного разделения двух альтернативных форм мРНК ЯЯА'Г, различающихся только на 110 п.н. по длине (рис. 70, нижний). В связи с этим был получен специфический зонд, гибридизующийся только с альтернативно сплайсированной мРНК. Для этого были синтезированы специфические праймеры к дополнительному экзону (РЗ и Р4, рис. 6), и с их помощью получен фрагмент дополнительного экзона с длинного ОТ-ПЦР продукта в качестве матрицы. Полученный фрагмент был очищен, радиоактивно мечен и использован в качестве гибридизационного зонда (рис.7Б, верхний). Как видно на рисунке, уровень транскрипции альтернативно сплайсированной мРНК ЭвАТ (длина около 1,4 т.п.н.) значительно возрастает в ВЭЛ-инфицированных клетках по сравнению с неинфицированным контролем. В то же время не наблюдается существенной индукции пре-мРНК БвАТ (длина около 3,5 т.п.н.).

Альтернативно сплайсированная мРНК ББАТ нолиаденшшруется

Значительный интерес представлял вопрос о том, полиаденилируется ли альтернативно сплайсированная мРНК вБАТ. Для его выяснения сравнивали количество ОТ-ПЦР продуктов, полученных при амплификации первых цепей кДНК ввАТ, синтезированных либо с помощью олиго(с!Т)-праймера, либо рассеянной затравки. Если альтернативно сплайсированная мРНК БвАТие полиаденилирована, то соответствующая полоса при ОТ-ПЦР должна быть значительно слабее при использовании в качестве матрицы кДНК, затравленной с олиго(с1Т). В

противоположном случае, соотношение обоих сплайсинговых вариантов будет тем же самым вне зависимости от выбранных затравок. Как показано на рис. 7Е, это соотношение интенсивности полос ОТ-ПЦР для матриц, затравленных при помощи олиго(с1Т), незначительно отличается от этого соотношения для матриц, полученных при помощи рассеянной затравки. Следовательно, альтернативно сплайсированная 58АТ кДНК может быть полиаденилирована и, возможно, транспортируем из ядра в цитоплазму.

Полученные нами данные указывают, что индукция альтернативно сплайсированной формы ЙЗАТ в инфицированных клетках может являться общей чертой для ранних стадий инфекции РНК-содержащими вирусами - как острой, так и персистентной, и с низкой и высокой продукцией вирусных частиц. Этот вывод основан на экспериментальных данных, показывающих, что наблюдаемый эффект вызывается обоими вирусами (ВЭЛ и ВКЭ) в двух хотя и родственных, но различных клеточных линиях. Действительно, обе клеточные линии 293 и ЯН происходят от клеток эмбриональной почки человека, но их получение и свойства значительно различаются. Линия 293 характеризуется высокой чувствительностью к инфекции ВЭЛ, и уровень продукции инфекционных вирионов достигает пика к 36 часам после инфекции, когда инфицированные клетки почти полностью лизированы. Клетки ЯН, с другой стороны, демонстрируют низкую продуктивность при инфекции ВЭЛ без видимого клеточного лизиса в течение всего наблюдаемого периода. Клетки ЯН, инфицированные ВКЭ, могут культивироваться в течение нескольких месяцев без наступления лизиса, продуцируя вирусные частицы. В то же время, инфекция вирусом клещевого энцефалита клеток 293 приводит к цитопатическому эффекту.

Индукция альтернативного сплайсинга двумя вирусами в двух типах клеток ставит вопрос о возможном биологическом значении этого эффекта. Функциональный человеческий белок ЭЭАТ содержит 171 аминокислоту и активен в олигомерных (гомотримерной или гомотетрамерной) формах. Для ею активности необходимы области, окружающие Аг£-101, и проксимальная глициновая петля. Следовательно, укороченный гипотетический 71-аминокислотный полипептид (если он существует), не содержит важных элементов активного центра фермента. Тем не менее, он может нарушать образование активных олигомеров ЭЭАТ, присоединяясь к ним в качестве субъединицы с образованием дефектного олигомера. Наличие в клетке нормального и укороченного полипептидов в сравнимых количествах, таким образом, может вызвать

существенную инактивацию Я-ЧАТ, приводящую к серьезным последствиям для клетки и жизненного цикла вируса.

Достоверно известно, что вирус-индуцируемый апоптоз, по крайней мере для некоторых представителей альфа- и флавивирусов, является одной из важных антивирусных стратегий организма. Недавно полученные данные говорят о прямой связи между индукцией БЭАТ и апоптозом. Индукция ББАТ в этих случаях была, по крайней мере частично, объяснена активацией транскрипции посредством взаимодействия белковых факторов с последовательностью ДНК, находящейся в регуляторных областях гена. Инактивация ЭЭАТ путем формирования дефектных олигомеров, таким образом, может не допустить переход зараженных клеток к апоптозу, и таким образом, содействовать распространению вируса.

Другая возможность для регуляции активности ББАТ при посредстве альтернативного сплайсинга заключается в том, что укороченный полипептид может конкурировать с нормальной 88АТ за связывание с каким-либо существенным компонентом (компонентами) клеточных систем Имеются данные в пользу стабилизации Э8АТ при связывании с внутриклеточными структурами или белками.

Еще одна гипотеза о роли альтернативно сплайсированной мРНК 88АТ (без привлечения гипотетического укороченного белка) заключается в следующем. Альфавирусная инфекция может приводить к увеличению уровня полиаминов в клетке, что, в свою очередь, приводит к индукции 88АТ, так как активность этого фермента увеличивается в ответ на высокий внутриклеточный уровень природных полиаминов. Индукция альтернативного сплайсинга мРНК ввАТ при вирусной инфекции, напротив, мешает накоплению полноразмерной мРНК йвАТ, транслируемой в активный фермент, и противодействует переходу клеток к апоптозу. Это подтверждается и тем наблюдением, что в инфицированных ВКЭ клетках количество альтернативно сплайсированного транскрипта может превосходить количество "нормального" транскрипта, при этом клетки, в отличие от инфицированных ВЭЛ, не подвергаются апоптозу.

Несмотря на их привлекательность, эти гипотезы в настоящий момент не доказаны, и требуется выполнить еще достаточно большой объем работы с целью выяснения действительной роли альтернативного сплайсинга пре-мРНК ЭБАТ в жизненном цикле вируса. Механизм регуляции генов методом альтернашвного сплайсинга в настоящее время общепризнан; он, наиболее вероятно, служит для расширения кодирующих возможностей генома. Необычная индуцируемостъ

альтернативно еплайсированной формы мРНК спермидин/спермин Ы1-ацетилтрансферазы предполагает наличие еще одного типа взаимодействий вирус-клетка и ставит важный вопрос о регуляции вирусами альтернативного сплайсиша клеточных генов. Полученные результаты также позволяют предполагать, что и другие гены могут подвергаться альтернативному сплайсингу в ходе инфекции ВКЭ и ВЭЛ.

ВЫВОДЫ

1. Методом супрессирующей вычитающей гибридизации идентифицировано шесть генов, уровень экспрессии которых меняется при заражении клеток человека в культуре вирусом венесуэльского энцефалита лошадей; экспрессия одного из этих генов меняется также и при заражении клеток человека в культуре вирусом клещевого энцефалита. Продукты четырех идентифицированных генов представляют собой анонимные мРНК с пока не установленной функцией.

2. Показано, что при инфекции вирусами венесуэльского энцефалита лошадей и клещевого энцефалита происходит 10-20-кратная индукция вновь обнаруженной альтернативно еплайсированной формы мРНК спермидин/спермин И1-ацетилтрансферазы, ключевого фермента обмена полиаминов. Высказано предположение, что индукция альтернативно еплайсированной мРНК ЯЯАТ может являться одной из форм противодействия вируса защитным системам клетки.

3. Обнаружено, что при инфекции вирусом венесуэльского энцефалита лошадей подавляется экспрессия гена гетерогенноядерного рибонуклеопротеина Н, что подтверждает влияние вирусной инфекции на клеточные механизмы сплайсинга.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

Nikiforova NN, Velikodvorskaja TV, Kachko AV, Nikolaev LG, Monastyrskaya GS, Lukyanov SA, Konovalova SN, Protopopova EV, Svyatchenko VA, Kiselev NN, Loktev VB, Sverdlov ED. Induction of alternatively spliced spermidine/spermine Nl-acetyltransferase mRNA in the human kidney cells infected by Venezuelan equine encephalitis and tick-borne encephalitis viruses. Virology 2002 Jun 5;297(2): 163-171.

Ошимяю в юшядвшре кУчебнм и итуа^п Моста, Воробыт горы, МГУ, 1 Гуманипрвы! жорпус.

WWW.Stypit m «fcjiMH- T»li»wg^|»liil и. тм «m-IIIK

3ms № 332, ярок 100 ж. Пщщкаяо в mnv 05.05.2003 г.

2-qo? - Д.

щ

» 8498

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Никифорова, Наталия Николаевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Регуляция активности клеточных генов при инфекции альфавирусами общая характеристика альфавирусов 5 изменение активности клеточных генов при инфекции вирусом венесуэльского энцефалита лошадей

Противовоспалительные гены регуляция клеточных генов при инфекции синдбис вирусом

Цитокины

Ш+/К*-АТФ-аза

Стресс-активируемые белки

Семейство клеточных генов Вс1

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Никифорова, Наталия Николаевна

1. Методом супрессирующей вычитающей гибридизации идентифицировано шесть генов, уровень экспрессии которых меняется при заражении клеток человека в культуре вирусом венесуэльского энцефалита лошадей; экспрессия одного из этих генов менялась также и при заражении клеток человека в культуре вирусом клещевого энцефалита. Продукты четырех идентифицированных генов представляют собой анонимные мРНК с пока неизвестной функцией.2. Показано, что при инфекции вирусами венесуэльского энцефалита лошадей и клещевого энцефалита происходит 10-20-кратная индукция вновь обнаруженной альтернативно сплайсированной формы мРНК спермидин/спермин N'-ацетилтрансферазы, ключевого фермента обмена полиаминов. Высказано предположение, что индукция альтернативно сплайсированной мРНК SSAT может являться одной из форм противодействия вируса защитным системам клетки.3. Обнаружено, что при инфекции вирусом венесуэльского энцефалита лошадей подавляется экспрессия гена гетерогенноядерного рибонуклеопротеина Н, что подтверждает влияние вирусной инфекции на клеточные механизмы сплайсинга.