Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Закономерности персистенции флавивируса японского энцефалита и экспериментальная разработка диагностических и профилактических препаратов

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Закономерности персистенции флавивируса японского энцефалита и экспериментальная разработка диагностических и профилактических препаратов"

но 19 а о

российская академия медицинских наук

нии вирусологии ии. д. и. ивановского

На правах рукописи

Экз. № _

удк 578.833.27:578.23

ДЕРЯБИН Петр Григорьевич

ЗАКОНОМЕРНОСТИ ПЕРСИСТЕНЦИИ ФЛАВИВИРУСА ЯПОНСКОГО ЭНЦЕФАЛИТА И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ РАЗРАБОТКА ДИАГНОСТИЧЕСКИХ И ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ

ПРЕПАРАТОВ

03.00.06 — Вирусология

Доклад, обобщающий опубликованные работы, на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва — 1992

Работа выполнена в НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского Российской АМН.

Директор НИИ Академик Российской АМН, профессор

Д. К. Львов

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор

Н. В. Логинова

Официальные оппоненты:

Заслуженный деятель науки Российской Федерации, почетный Академик Академии естественных наук России, профессор, доктор медицинских наук С. Я. Гайдамовнч

Академик Академии естественных наук России, профессор, доктор медицинских наук В. А. Зуев

Профессор, доктор медицинских наук В. В. Погодина

Ведущее учреждение — Московский научно-исследовательский институт вирусных препаратов Российской АМН

Защита диссертации состоится. 4 ШЛ'ОЛ; 109И) г.

в часов на заседании специализированного совета Д 001.20.02 при НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского Российской АМН по адресу: 123098, Москва, ул. Н. Ф. Гамалеи, 16.

С диссертацией можно познакомиться в библиотеке НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского Российской АМН.

Автореферат разослан.

Л б 199года.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат медицинских наук

А. М. Жуковский

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. В последние годы японский энцефалит (ЯЭ) приобретает все большее значение как проблема здравоохранения.По данным ВОЗ, ЯЭ относится к числу наиболее значимых для здравоохранения мнсгих стран мира инфекционных заболеваний вирусной природы. Это тяяелая нейроинфекция человека. характеризуется высокой летальностью, достигавшей 30-70%. а такае способность!) вызывать хроническое течение у лвдей со значительными неврологическими ослоянениями (ТШга, !981). ЯЭ - природно-очаговая инфекция, относящаяся к географически локализованным инфекционным заболеванием, лироко распространена в странах Юго-Восточной Азии, Западного побер.еаья Тихого Океана, в том числе, и в сопредельных с СНГ регионах (рис.1).

Рис.1. Распространение -японского энцефалита в странах Юго-Восточной Азии и Западного побереяья Тихого океана.

В последние годы очаги ЯЭ регистрируются в районах., ранее не эндемичных для данного заболевания!' а именно, в северных и

- г -

северо-западных областях Китая, Индии, в пестах зимовки перелетных птиц, гнездящихся на территории нашей страны. Это создает опасность интродукции возбудителя ЯЭ в республики Средней йзии и в юшные районы Сибири Российской Федерации с помощью перелетных птиц, а такие формирования очагов опасной инфекции в регионах, благоприятных для MatcoBoro выплода комаров - переносчиков ЯЭ (Culex, Aedes, ßnopheles, Mansonia). Отсутствие иммунитета у населения к этой инфекции, моает привести к эпид-ситуации с непредсказуемыми последствиями.

Зндемичными регионами Российской Федерации является Приморье и Хабаровский край, где эпидемиические вспышки ЯЗ регулярно регистрировались с .1938 по 1965 гг., и до сих пор отмечаются спорадические случаи заболевания ЯЗ. Интенсивное рисосеяние bV'Vtom регионе России приводит к росту численности основного переносчика ЯЗ - C.tritaenlorhynchus, что монет сказаться на обострении эпидемической ситуации (/¡.К.Львов и др.,1989), о чем свидетельствуют и данные серозпидемиологичес-кого анализа, полученные при изучении этого края.

Вирус ЯЗ является родоначальником одноименного антигенного комплекса флавивирусов.в который вход^ от 9 до 16 вирусов, в зависимости от используемого метода серологического анализа (Н. Charles ик др.,198Э г. ).Антигенные свойства вируса ЯЭ, как и других флавивирусов, связаны с гликопротеином Е. содераацим в своем составе антигенные детерминанты,которые мокно разделить на три класса: типоспецифические.коыплексреактивные и группореактивные эпитопы.Среди штаммов вируса ЯЭ установлены два основных иммунотипа: Двагар и Накаяма, однако с помощью ыоноклональных антител идентифицированы и проыевуточные варианты.

Изучение биологических свойств циркулирующих в природе вариантов вируса ЯЗ (Н.В.Логинова,1989) показало их слабую репродуктивную активность в культурах клеток различного проис-ховдения, не высокие антигенные и иммуногенные свойства, что, вероятно, и создает значительные трудности в разработке на основе природных штаммов диагностических"и профилактических препаратов. Следовательно, возникает потребность в получении экспериментальным путем стабильных мутантов вируса ЯЭ, по своим характеристикам пригодных для успешного использования в практических целях.

Проводившиеся в течение многих лет в лаборатории исследования по изучению способности флавивирусов индуцировать in vitro персистентнуи инфекцию позволили не только выяснить ваяние теоретические аспекты взаимодействия вируса и клетки в условиях персистенции (В.И.Гаврилов и др.. 1973, 1974, 1975: Н.В.Логинова и др.,1985, 1986). Результаты этих исследований убедительно свидетельствовали о том, что в процессе персистенции флавивирусов в культурах клеток, как правило, происходят стабильные изменения биологических свойств вируса. Иными словами, предполагалось, что персистенция флавивирусов, возмояно. является одним из из основных источников стабильно измененных мутантов флавивирусов. пригодных в качестве 'кандидатов для приготовления диагностических и профилактических препаратов.Вероятно, это единственно возыонный способ получения "полезных" стабильных вариантов вируса 93, что было убедительно подтверадено результатами исследований Н.В.Логиновой (1972, 1973, 1989), показавней безуспенность индукции мутантов вируса ЯЗ со стабильными свойствами с помоцьл физического или химического мутагенеза.

Кроме того, на наш взгляд, остается недостаточно изученным ваяный фундаментальный аспект проблемы персистенции флавивирусов, а именно, роль факторов, участвующих в механизме реализации длительного вирусоносительства, а такме изменчивости вирусов в условиях хронической инфекции. Дальнейвее изучение механизмов персистенции вируса ЯЗ на разных стадиях взаимодействия вируса . и клетки, несомнено, представляет значительный интерес, поскольку позволяет выяснить основные 'закономерности эволюции вируса ЯЭ, оценить роль различных факторов, учавствувщих в реализации механизма становления и под-деряания вирусоносительства, а, -'следовательно, в сохранении вируса ЯЗ в мензпиденический период, определить условия, способствующие активации латентной инфекции.

Цельп диссертационной работы является изучение основных закономерностей длительного взаимодействия влруса ЯЭ и клетки в условиях персистентной инфекции в культурах клеток, определение роли различных'факторов в механизме становлениями поддержания персистенции на разных стадиях вирусоносительства, проведение анализа популяции персистирунщего вируса (ПВ) ЯЭ и

/

отбор вариантов, по биологическим свойствам пригодных для разработки диагностических и профилактических препаратов.

В соответствии с поставленной целью в задачи исследований входило:

1. Анализ популяции персистирунщего в культурах клеток различного происхоядения вируса ЯЗ и отбор вариантов вируса, пригодных для практического использования.

2. Биологическая характеристика отобранных вариантов вируса ЯЗ в условиях острой инфекции In vitro и in vivo для оценки их пригодности в качестве кандидатов в вакцинные штамны.

5. Изучение способности одного из вариантов ПВ ЯЭ индуцировать хронич^кую инфекцию.культур клеток L 929 , а такяе изучение основных параметров взаимодействия вируса и клетки в условиях персйстенции на разных стадиях инфекционного процесса.

4. Оценка роли клеточных и вирусных факторов (дефектно-интерферирующих частиц, интерферона, температуро-чувстви-тельных мутантов) в становлении н стабилизации вирусоноси-тельства на разных урсвнях персистенции.

5. Анализ условий и особенностей течзния латентной инфекции, способствующих активации "скрытого".состояния виру-соносительства}в культурах клеток LJ2J.

6. Получение ыоноклональных антител к антигенма Г)В ЯЗ и оценка возможности их использования для дифференциальной серодиагностики вариантов вируса ЯЭ, а также для изучения протек-тивной активности при летальном вирусном энцефалите в эксперименте на животных.

7. Изучение влияния стимулятора антитслопродуцентов (мие-лопида) на выработку противовирусных антител и выживаемость животных при экспериментальном энцефалите, вызванном вирусом ЯЭ.

8. Разработка и изучение основных параметров культураль-ной инактивированной вакцины против ЯЭ на основе ПВ ЯЭ -одного из кандидатов в вакцинные штаммы ПВ ЯЭ - и сравнительная оценка иммуногенной и протективно(Рактивностей полупроиэ-водственных серий препарата в эксперименте на животных.

9. Выделение и характеристика препаратов высокомолекулярной РНК вируса ЯЗ для конструирования на их основе плазыид, содержащих ДНК-копию генома ПВ ЯЗ. Оценка пригодности получен-

ных плазмид для разработки генно-инженерной вакцины против ЯЭ н метода точечной гибридизации нуклеиновых кислот для диагностики 93 и индикации специфических последовательностей в исследуемой материале.

Научная новизна работы.

- Анализ популяции персистирувцего в культурах клеток различного происхондения вируса 93 позволил выявить основные закономерности нзмечивости биологических свойств ПВ. характеризующихся как фенотипическиыи. так и генотипическими модификациями (снияение патогенной и нейровирулентной активностей ПВ. изменение антигенных, культуральных свойств, физико-химических параметров и т.д.). *

- Впервые из популяции вирионов, персистирупщих в культурах клеток головного мозга мыией-сосунков, выделен высокорепродуктивный для клеток куриного эмбриона, антигенноактнвный иммуногенный вариант вируса ЯЗ. обозначенный как клон Но 3 (КЗ) вируса ЯЗ. КЗ характеризовался низкой патогенностьв для экспериментальных ниоотннх. Наряду с этим, необычная способность КЗ вызывать цитодеструкцип фибробластов куриного эмбриона и накапливаться в среде этнх культур в титрах до 10,0 - И, 0 1ц БОЕ/ыл позволила отнести его к мутантам по кругу хозяев и успеано использовать КЗ в вирусологических, молекулярно-биоло-гических и биотехнологических исследованиях, в том числе, для разработки профилактических и диагностических препаратов.

- Впервые на основе КЗ вируса ЯЭ получена модель персис-тентной инфекции культур клеток Ь 929 и изучены основные параметры становления и поддераання длительной инфекции этих куль-тур(на протяпении более чей трех лет).

- Впервые получены данные, сридетельствуицие о разнообразии форм взаимодействия вируса и клетки в условиях персистен-ции, которая, в зависимости от срока наблюдения, характеризовалась как хроническая, персистентная или- латентная инфекция с присущими для каядой стадии особенностями этого взаимодействия.

- Анализ известных в литературе данных о способности фла-вивирусов к персистенции и результатов, полученных в нартояцец исследовании, позволил получить убедительные доказательства о

точ,что персистенция имеет общебиологическое значение для фла-ривирусов, играет вамную роль в эволюции вирусов и в сохранении флавизирусов природе.

- Оценка роли факторов, участвующих в механизме персис-тенции вируса ЯЗ в культурах клеток L 929, дала возмоиность впервые получить данные о реализации в одной системе многофакторного механизма лерсистенции вируса 33 и определить ведущую роль одного из факторов в поддершании зирусоносительства (интерферон - на стадии хронической инфекции¡дефектные интерферирующие частицы - на стадии персистентной инфекции: температуро -чувствитетельные мутанты - на стадии латентной инфекции). Выявлены общие закономерности, изменения биологических свойств ПВ ЯЗ в системе LJ2J.

- Показана"высокая устойчивость популяции хронически инфицированных клеток к воздействию неблагоприятных факторов внешней среды. Впервые определены условия, способствующие активации латентного вируса ЯЭ in vitro.

- Получено 7 гибридом, продуцирующих моноклинальные антитела (МКЙ) к антигенам ПВ ЯЭ - КЗ, изучены основные параметры гибридом и моноклональных антител:

а) МНЯ серии ЭЯ-4 и ЭЛ-19 являются втаммовоспецифически-ми, что позволило их использование для дифференциации антигенных вариантов вируса ЯЭ:

б) Показано, что гибридома ЭЯ-4 лродуцирует HKfl, обладающие способностью'нейтрализовать инфекционный вирус ЯЭ, а такае высокой протективной активностью при летальном энцефалите у мышей, вызванном разными антигзнныыи вариантами вируса ЯЭ. С помощью ИКР) серии ЭЯ-4 удалось обнаружить индивидуальную особенность КЗ вируса ЯЭ, проявивившуися в функциональной активности вируснейтрализуюцего штаммовоспецифического эпитопа:

в) Впервые на уровне организма с помощью KKft серии ЭЯ-4 достоверно обнарувен феномен антителозависимого усиления репродуктивной активности вируса ЯЗ (штамм Даагар 01), а в присутствии МКЙ серии 226 к штамму Тринидад вируса Венесуэльского энцефаломиелита лоиадей (ВЗЛ) этот феномен впервые выявлен при летальном энцефалите ыывей, вызванном вирусом ВЭЛ-230. В частости, показано, что усиление репродуктивной активности вирусов ногет приводить или к усилению патогенной активности возбудителя, или к длительной продуктивной персистентной инфекции.

- Впервые показана способность рибонуклеопротеида костного мозга яивотных, миелопида, на высоте иммунного ответа стимулировать антителообразование п^и острой и хронической инфекции яивотных, вызванной вирусом ЯЭ и другими флавивирусаыи. Обнаруяена большая эффективность препарата при инфекциях яивотных. вызванных слабоиммунногенными вариантами флавивирусов, причем введение миелопида. как правило, приводило к усилению продукции вируснейтрализующих (протективных) антител в организме инфицированных животных и. в меньпей степени, антиге-магглвтининов.Выявлена протективная активность препарата при инфекции яивотных вирусом ЯЗ.

- На основе авторского вакцинного штамма,"КЗ вируса ЯЭ, и его способности накапливаться в высоких титрах в зараженных клетках куриного эмбриона разработана культуральная инактиви-рованная вакцина против ЯЭ. В частности, получено 10 полупро-нзводственшх серий вакцины, предложена оригинальная технологическая схема производства препарата, обусловленная особенностям« КЗ вируса ЯЭ. а такве схема иммунизации, позволяющая при введений малых доз в короткие сроки обеспечивать индукции вируснейтрализушщих антител в титрах, достаточных для обеспечения стойкого протективного эффекта в экспериментах на вивотиых. Разработан метод экспресс-оценки иымуногенности препарата до стадии его инактивации.

- Получена препаративные количества очищенной РНК КЗ вируса ЯЗ. поэволиваие на ее основе сконструировать 3 рекомби-нантные плазмиды СpUC ЭЕ22, pUC JEi2 и pUC ЗЕ 02), содержащие вставки кДНК генома вируса ЯЗ длинной 2200, 1200 и 200 основа-гай соответственно. Показано, что рекомбинантная плазмида pUC 22 содержит последовательности, кодирующие структурные белки вируса ЯЭ (С, pre М, Ни Е),таким образом, обеспечивающие ее пригодность для конструирования генно-инненерной вакцины против ЯЗ.

- Впервые на основе плазмиды pUC ЗЕ 12 получены ДНК-зондн и разработан метод точечной гибридизации нуклеиновых кислот для индикации последовательностей геноиа вируса ЯЭ в иследуе-ыон материале.

Основные полояення.выносимые на зациту.

1. Особенностью вируса ЯЗ является способность индуцировать в культурах клеток различного происхождения как острую, так и персистентную инфекцию, которая определяется, премде всего, индивидуальными свойствами используемой системы вирус-клетка. Персистенция вируса ЯЭ в культурах клеток, как правило, приводит к изменению биологических свойств вируса, которые могут носить характер фенотипической или генотипической модификации,

2. Оптимальным способом получения стабильно изменных мутантов вируса.$3, пригодных для разработки на их основе диагностических к, профилактических препаратов, является выделение их из клонированной популяции персистирующего в культурах клеток вируса;

3. Особенности взаимодействия вируса ЯЗ и клетки в условиях персистенции в одной и той яе системе определяются условиями и периодом этого взаимодействия, в зависимости от которых персистенция может характеризоваться как хроническая, персистентная или латентная с присущими культуральными и вирусологическими параметрами для каждой стадии этого взаимодействия. ,

4. Вирус ЯЗ, находящийся в скрытом (латентном) состоянии в культурах клеток Ь 929 , при изменении температурного реяима инкубации система вирус-клетка способен к активации цитопато-генных, инфекционных свойств. Таким образом," бессимптомная" инфекция трансформируется в острую или хроническую инфекцию культур клеток.

5. Стабильность взаимодействия вируса ЯЗ и клетки в условиях персистентной инфекции определяется высокой яизнеспособ-ностью клеток, что позволило сохранять активно продуцирующие П8 ЯЭ клетки I в течение 1,5 месяцев "голодания" при 37 С (без смены среды), В обычных условиях вывившие клетки активно про-лиферировали и в высоких титрах продуцировали вирус ЯЭ.

6. В поддержании длительного вирусоносительства в культурах клеток 1.929 важную роль играет многофакторный механизм персистенции (интерферон, ДИ-частицы, 1з-мутанты, а. возможно, и ДНН-транскрипты); в то ве время, один из факторов во взаимосвязи с другими - является ведущим для данной стадии персистенции.

7. Вируснейтрализукщие НКО к белкам КЗ вируса ЯЭ обеспечивают высокий протективный эффект при летальном энцефалите мышей, вызванном внутримозговым заражением как гомо-, так и изологичныни вариантами вируса ЯЭ. В то яе время. являясь штаммовоспецифическими, эти МКА в субнейтрализующих концентра-иях способны индуцировать антителозависимое усиление репродукции изологичного варианта вируса ЯЗ при периферическом зараяе-нии животных. Феномен антителозависимого усиления репродукции вирусов, в зависимости от степени их патогенности для животных, может привести или к продуктивной персистентной инфекции, или к повышению заболеваемости и гибели инфицированных животных.

8. Костномозговой стимулятор антителопродуцентов - м1.ело-пид - на высоте иммуного ответа вызывает усиление продукции вируснейтрализующих (протективных) антител и, в меньвей степени, антигемагглютининов у животных, зараженных флавивирусами. Препарат более эффективен при инфекциях, вызванных слабоимму-ногенннми штаммами флавивирусов.

Э.Иммуногенност^ кучьтуральной инактивированной вакцины против ЯЗ находится в прямой зависимости от гемагглвтинирующей активности, определяемой до инактивации в вируссодержащем сливе и являющейся косвенным показателем количества структурного белка Е вируса ЯЭ, а такяе от предлагаемой схемы иммунизации. Преимущества полупроизводственных серий препарата обусловлены свойствами вакцинного штамма. КЗ вируса ЯЭ. Протективные свойства культуральной вакцины в организме иммунизированных животных в большей степени обеспечивает индукция вируснейтрализующих антител, чем антигемагглютининов.

10. Оригинальный авторский штамм. КЗ вируса ЯЭ. обладающий высокой репродуктивной активностью в клетках куриного эмбриона, широким спектром антигенных связей, высокими иммуноген-ными свойствами и сниженной нейровирулентностыо, монет быть успеино использован для разработки современных эффективных профилактических и диагностических препаратов и тест-систем.

Практическое значение работы.

- Из хронически инфицированных вирусом ЯЭ культур клеток головного мозга мывей-сосунков выделен штамм вируса ЯЭ, КЗ.

пригодный для разработки диагностических и профилактических препаратов. КЗ вируса ЯЗ депонирован в ГКВ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского Российской АМН под N0 677. защищен авторским свидетельством (половительное решение от 27.12.90 г. по заявке 484322/13).

- В лабораторных и полевых исследованиях показана эффективность использования фиксированных на стеклах антигенсодер-ващих клеток и хронически инфицированных КЗ вируса ЯЗ, для выявления вирусспецифических антител в сыворотках людей и ми-вотных методом флюоресцеирующих антител.

- Получено 7 гибридом, продуцирующих МКА к антигенам вируса ЯЗ (КЗ). МКА серии ЭЯ-4, ЗЯ-19 могут быть успеино использованы для дифференциации огтаммов вируса ЯЗ, выделенных в природе, а РБМ и РСК соответственно.Один из итаммов гибри-доиных мышиных клеток, ЯК - 121, продуцирующих МКА к вирусу ЯЭ, защищен авторским сидетельством (N0 1212044 от 15 октября 1985 г. по заявке 3787128 - приоритет от 31 августа 1984 г).

- Изучение корреляции гемагглютинирувщей, инфекционной и иммуногенной активностей КЗ вируса ЯЭ позволило использовать показатели ГА-активности для отработки метода экспресс-анализа количественного накопления вируса в среде культур клеток куриного эмбриона р прогнозировать иммуногенность полученного ви-русс'одерващего препарата.

- Высокопродуктивный штамм вируса ЯЭ, КЗ. был использован для разработки культуральной инактивированной вакцины против ЯЗ. Подготовлена и утвервдена Ученым Советом НИИ вирусологии "Инструкция по изготовлению и контролю вакцины против японского энцефалита, культуральной инактивированной, сорбированной (дата утвервдения :19 июня 1990 г.).

- Благодаря высокой антигенной активности КЗ вируса ЯЭ и широте спектра антигенных связей, антигены КЗ вируса ЯЭ, поли-и моноклональные ИАЙ, полученные к этому штамму, были успешно использованы для серологических исследований по изучению японского энцефалита методами: РБМ, РТГП, НМФА, ИФА, иммуноб-логтинга, РСК и др.

- На основе плазмиды р!1С Л: 22, содержащей кДНК-вставку гпномд КЗ вируса ЯЗ, получены ДНК-зонды и разработан мьтод точечной гибридизации нуклеиновых кислот, характеризующийся высокой спсцифичносстью и чувствительностью.

Публикация работ. Основные полояения диссертации от-раяены в 41 опубликованных научных работах, в том числе, 2 авторских свидетельствах. Подробное излояение этапов работы било предусмотрено такяе в еяегодных отчетах и обзорах по проблеме ( 1980 - 1991 гг.).

Апробация работы.

Основные экспериментальные материалы и полояения диссертации были долояены и обсуждены на научных сессиях НИИ вирусологии им.Д.И.Ивановского по обцей и медицинской вирусологии (1985-1991 гг). Пленумах проблемной комиссии "Арбовирусы'Ч 1985 -1991 гг.), Меядународном симпозиуме "Медленнее и хронические вирусные инфекции", 1977 г., Братислава, на Всесоюзных конференциях "Актуальные вопросы иммунопрофилактики вирусных и бактериальных инфекций" в г.Томске, 1981 г.. " Теоретическая и прикладная инфекционная иммунология", Москва, 1982 г.. Горький, 1982 г., на Меядународном симпозиуме "Арбовирусы и арбо-вирусные инфекции". Москва, 1990 г., на Всесоюзной конференции "Арбовирусы и арбовирусные инфекции", Москва-Лыткино, 1991 г., на III Меядународном симпозиуме "Positive strand RNA ", СИ. 1992 г.

Автор выранает благодарность за продуктивное сотрудничество научным сотрудникам НИИ вирусологии ии.Д.И.Ивановского Российской АМН.'Урываеву Л.В., Новохатскому A.C., Лебедевой Г.А., Мещаниновой Л.И., Барсуковой И.М., Родиной К.В., Евтее-вой И.Н.. Парыгиной М.М.; сотрудникам НИИ молекулярной биологии им.Энгельгардта Российской АН Козлову Ю.В., Курмановой А.Г.; сотруднику НИИЭН им.Н.Ф.Гамалеи Тазулаховой З.Б., сотруднику НИИ иммунологии Российской АМН Сергееву Ю.О. Автор выражает глубокую признательность профессору докт.медиц.наук Н.В. Логиновой за консультативную помочь в процессе выполнения работы.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материал и методы работы

В работе использовали культуральные, вирусологические, серологические, иммунологические, молекулярно-биологические и др. методы исследований. В исследованиях использовали различные штаммы флавивирусов ЯЭ: КЗ, штаммы Дяагар, ДВК-4, Сасаза-ки, Накаяма, КЗЗ и К40, Пекин-i: флавивирусы комплекса клещевого энцефалита (КЗ): вирус КЗ, штаммы Софьин и его персистиурющий вариант"МФ", выделенный из хронически инфицированных культур клеток Нер-2тСоф, Еланцев, вирус Лангат-штамм ТР-21; флавивирусы Западного Нила (ЗН), велтой лихорадки С Sil) - для определения принадлеаности КЗ к штамму вируса ЯЭ; альфа-вирусы Венесуэльского энцефаломиелита лошадей (ВЭЛ) - штамм Тринидад и аттенуированный вариант вируса ВЭЛ - ВЭЛ-230. Вирусы получены из коллекции штаммов флавивирусов лаборатории генетики арбовирусов или из ГКВ НИИ вирусологии им.Д.И.Ивановского Российской АМН (рук.профессор Л.Л. Фадеева).

Для титрования и культивирования . вирусов в условиях острой и хронической инфекиии использовали первичные и перевиваемые культуру клеток различного происховдения: PS. СПЗВ, ВНК -21,' Uero, L 929, 464?, клетки 9-дневных куриных эмбрионов, культуры клеток головного мозга мышей-сосунков и др. В работе использовали беспородных белых мышей, а такае мышей линии Balb /с различных весовых категорий, сирийских хомячков. Для проведения исследований использовали методы моделирования хронической инфекции в культурах клеток и на вивотных, методы получения гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к антигенам вирусов, современные физико-химические методы, методы клонального анализа популяции вируса ЯЭ, и характеристики его основных биологических свойств, методы получения препаративных количеств высокомолекулярной РНК вируса ЯЭ и др. Описания ряда методов, использованных в работе, приводится при из-ловении полученных результатов.

РЕЗаЛЬТПТН РПБОТЙ И ИХ 0ВС31ДЕИИЕ 1.Анализ популяции персистирующих в культурах клеток флавивирусов.

1.1 Биологические свойства флавивирусов, выделенных из хронически инфицированных культур клеток. Целью данного раздела работы было проведение вирусогенетического анализа вариантов персистирующих в культурах клеток флавивирусов на уровне популяции для выявления основных закономерностей изменчивости ПВ, а такие стабильно измененных вариантов ПВ, биологические свойства которых позволяли бы использовать вирус для теоретических исследований и практических разработок..'.Для осуществления этой задачи в работе использовали штаммы ПВ японского и комплекса клещевого энцефалитов (ККЭ), имеющиеся в коллекции лаборатории генетики арбовирусов, выделенные из хронически инфицированных культур клеток ГМС-1-Кзз, ГИС-2-Кэз, НеЬа-Кз, иего-К43, ПЗС-ЯЭ, ПЭС-МФ. ГМСХ-Лангат, Нер-2-Соф С1974, 1975,1976, 1977,1980,1981 гг.). ПВ изучали по набору сирусоге-нетических признаков',' представленных в табл.1.

Сопоставление генетических признаков, характеризующих биологические свойства флавивирусов, выделенных их хронически инфицированных культур клеток различного происхоядения, показало, что по целому ряду маркеров свойства ПВ характеризуются как фенотипическая модификация. Иными словами, последовательное пассирование вируса через головной мозг мышей-сосунков, как правило, приводило к реверсии приобретенных им о результате персистенции биологических свойств к исходным показателям, в частности, признаки НА, Йй, СРрэ/сЬ для большинства вариантов ПВ являлись фенотипической модификацией. Исключением явился штамм "МФ" вируса КЗ, выделенный нами методом трансфек-ции препаратами ДНК хронически инфицированных клеток Нер-2-СоФ (О.Г.Андяапаридзе и Н.Н.Богомолова, 1974). Этот вирус стабильно сохранял упомянутые признаки после многих последовательных лассаяей через мозг чувствительных яивотных и п культурах клеток, Однако невысокие показателч биологической активности варианта "НФ" вируса КЗ сделали нецелесообразным его дальнейшее использование в практических целях.

Таблица i.

Анализ 11В, выделенного из хронически инфицированных кулыур клеток, по набору вирусогенетических маркеров (статистически средние данные).

ПВ.виде- 1)

лешшй из Генетический признак

культур ---------------------------------------------------------

клеток 11П Ur Rs bHíc «sHic bHsc CPps/ch ts S

абабабаб а б а б a 6 а б а б

ГНС-1-Кзз ++ — +-- +

ГНС-2-Кзз -+ ■"++-++ + * — íf i- +-- +

lleLa Кз -f - ■»•»-+«■ » i — ++ +- + - - +

üero-K43 -t-t+-++ * + ~ i »--■»- — —

11ЭС-ЯЭ - -t - + + - t + + i - i i- +- - - - -

113С-МФ __ __ ----

Нер-2-Соф — — + + — — — ■«- -i- — —"

ГИСХ-Ланг -♦■»«••»-•»+ + + — +- i- — —

1) Все варианты ПВ изучали по набору генетических признаков до(а) и после (б) трех и более пассажей через мозг мышей -сосунков .

П) Обозначения генетических признаков: НА- гемагглю-тшшруюшая (гл) активность! ( + ) -наличие га активности. (-) -отсутствие ра активности; иг - чувствительность ПВ к обработке <1 М иочешшои: (О снижение титров вируса на 3 18 и более, (-) - снижение титров ПВ менее чем на 3 1в; КЗ - чувствительность ПВ к обработке РПК-азой:(<) - снижение титров вируса на 3 18

н более, (-) - снижение титров пв менее чем на 3 1?; пШс патогенность вируса для мышей нассоя 6-7 г при внутримозговом введении материала; тэте - патогенность ив для мышей-сосунков при внутринозгойом введении возбудителя: шнзе - патогенность для мшей массой 6-7 г при подкожномм введении материала: ( + )-наличие заболевания инфицированных животных. (-) - отсутствие клинических симптомов энцефалита; - чувствительность репродукции вируса к температуре: (♦> -увеличение титров вируса на 1,518 при температуре инкубации инфицированных культур клеток 28 С, (-) - отстутствие увеличения титров пв при снижении температуры инкубации; СРрз/сЬ - цитопатогенная активность пв для культур клеток почки эмбриона свиньи - спэв и первичных клеток 9-дневных куриных эмбрионов- ккэ: (♦♦> - наличие иито-деструкшш монослоя инфицированных клеток обоих типов, (--) отсутствие аитопатогенной активности вируса;. Э - размер бляшек, Формируеных пв в культурах ккэ: (♦> - диаметр бляшки г. г нм и более. (-) - дианетр менее 2 мм.

Особенно интересной, на наш взгляд, оказалась популяция ПВ 33, выделенного на поздних сроках из хронически инфицированных культур клеток головного мозга мыией-сосунков (ГМС-1-Кзз, 422-й день, 100-я субкультура). Как и большинство вариантов ПВ. эта популяция вируса ЯЭ стабильно сохраняла приобретенный в результате персистенции признак шНзс(-), т.е., вирус оказался апатогенным для белых мыией массой б-? г при периферическом введении материала.Однако, в отличие от других ПВ, этот вариант вируса ЯЭ в течение персистенции приобрел способность вызывать отчетливую деструкцию 24-часового монослоя культур ККЗ, накапливаться в среде этих культур в титрах, значительно превышающие титры других вариантов вируса ЯЭ для этих клеток и формировать в этих культурах бляшки размеров более 2,3 мм. Приобретенные признаки ПВ ЯЗ стабильно сохранялись на протяжении 5 и более пассажей вируса в чувствительных системах.

1.2 Изучение биологических свойств клона Но 3, выделенного из популяции ЯЭ, перснстируючего в культурах клеток ГНС-1-Кзз.

Дальнейшие исследования были посвящены детальному'изуче нию популяции ПВ ЯЭ из культур клетокТМС-1-Кзз, выделенной на

422-й день субкультивирования этой линии.Проведен клональный анализ ПВ ЯЭ, в результате которого был выделен КЗ вируса ЯЗ. После 10 последовательных пассавей КЗ вируса ЯЗ через головной мозг мишей-сосунков изучены его основные биологические и антигенные свойства в условиях острой инфекции культур клеток и экспериментальных животных в сравнении с другими вариантами вируса ЯЭ, хранящихся в коллекции лаборатории.

Таблица 2.

Натогенность КЗ вируса ЯЭ для белых мышей массой 6-7 г и культур клеток.

Итаыы Титры вируса ЯЭ

вируса ----------------------------------------------------

для белых мывей (1е Ю50) культур клеток (1е ТС050)

ЯЭ -------------------------------------------------------

вШс шИзс СПЗВ ВНК-21 ККЭ 4647

КЗ В,7 0 7,5 7.4 9,5 7.2

Пекин-1 9,0 3.5 7,0 7,5 1.0 7,0

Пакаяма 8.2 1.5 7,2 7,2 0 7.4

Двагар 01 7,3 2,0 7,4 7.0 1.0 7.1

ДВК-4 ■ 9,0 3,0 7.5 7,6 0 7,3

КЗ вируса ЯЗ характеризовался снивенной нейровирулент-настьв для белых мышей массой 6-7 г. (индекс инвазивности составлял 6,7 при подковном введении мышам вирус, как правило, не вызывал заболеваемости и гибели аивотных, в то время как другие варианты вируса ЯЗ были активны и при периферическом зарааении мышей аналогичной весовой категории. Являясь слабопатогенным для экспериментальных яивотных вариантом, КЗ активно репродуцировался в культурах клеток различного происхождения, причем, репродукция вируса сопровождалась выравенны-ии цитопатическими изменениями в кцльтурах клеток СПЗВ, ВНК-21, 4647, характерными и для других вариантов вируса ЯЭ. Однако, в отличие от всех известных штаммов вируса ЯЭ, КЗ характеризовался необычной способностью вызывать в культурах клеток ККЭ цитопатогенное действие и накапливаться в титрах,

на 2 и более порядка превышавших эти значения для других культур.Титры известных вариантов вируса ЯЭ для клеток ККЭ. определяемые по бляикообразованип, такше были существенно нняе титров КЗ вируса ЯЗ (табл.3).

Таблица 3.

Сравнительная характеристика репродуктивной активности штаммов вируса ЯЭ в клетках куриного эмбриона.

Итаммы

вируса ЯЭ

Титры вируса для культур ККЗ

1й ТЦД50/мл 1й БОЕ/мл о -1.0 6.5-7,0 8,5-9,0 9,0-10,0 0 - 1.0 6,5-7,5

ГЙ-активность -- (по данным РГЙ)

Какаяма Клон Но 3 Двагар 01

1:2 - 1:4 1:32-1:64 1:2 - 1:8

Показано такве.^'что в культуральной «идкости ККЗ, инфицированных КЗ, содераатся геиагглютинины, в 8-16 раз превыиапщие показатели Гй-активности для других вариантов вируса ЯЭ. что. как правило, .коррелировало с накоплением в культуральной иид-кости инфекционной активности вируса. Интересные результаты были получены при градиентном центрифугировании концентрированного материала вируса в 15-60Х линейном сахарозном градиенте. В сравнительных опытах определения плавучей плотности ви-рионов КЗ было показано.что вирионы располагаются в зоне градиента сплотностьп 1,21 и 1,24 г/куб.см. В этих же зонах концентрируется и инфекционная активность вируса ЯЭ. В то ив время, ГЙ-активность, выявляемая в этих зонах, была минимальна и составляла 5-102 от исходной ГА активности осаженного вируса. В градиенте плотности сахарозы обнаруяивалась дополнительная зона с высокой ГД активностьи. как правило, свободная от инфекционных вирусных частиц, совпадающая с плавучей плотностью 1,15 -1,16 г/см куб.

Следовательно, культуры ККЗ, зараяенные КЗ, помимо полноценных инфекционных частиц, продуцировали в культуральндп среду неинфекционные ГЙ частицы вируса, имеющие иную плавучую плотность. Поскольку ГЙ активность связана с белком Е вируса ЯЗ, мовно было предполояить, что наряду с продукцией зрелых

вирионив культуры ККЭ продуцировали отдельные структурные оел-ки вируса ЯЗ. Веское подтверждение этому предположению было получено при электронно-микроскопическом исследовании концентрированных препаратов КЗ: среди полноценных вирионов в поле зрения было обнару«ено большое количество "пустышек", по морфологии неотличимых от оболочечного каркаса вируса. Кроме того, анализ материала, полученного в зоне с плавучей плотностью 1,15 - 1,16 г/см куб. и содержащего высокий титр гемагглютини-нов, методом электрофореза в полиакриламидном геле, показал, что по молекулярной массе этот белок неотличим от белка £ вируса ЯЗ.

Таким образом, полученные результаты, свидетельствовали о продукции инфицированными КЗ вируса ЯЭ культурами клеток свободных гемагглю^ининов, что в полной мере согласуется с данными Л.В.Урываева (1991 г.),наблюдавшего аналогичный феномен при альфавирусной инфекции культур клеток. Важность полученных результатов. вероятно, обусловлена возможностью использования белков вируса ЯЭ в диагностических и профилактических целях. В частности, выделенный из зоны линейного сахарозного градиента 1, 15 -1.10 г/см куб. белок вируса ЯЗ в дальнейшем был успешно использован в лаборатории е качестве вирусспецифического антигена для изучения иммунных сывороток животных и человека в им-муноблоттинге,

В результате проведенных исследований получен КЗ вируса ЯЭ. Изучение биологических свойств этого штамма вируса ЯЭ позволило обнаружить уникальные для вируса ЯЭ свойства: высокая репродуктивная активность для культур ККЭ. сочетающаяся с низкой патог.енностью для экспериментальных животных и высокой антигенной активностью. На основании полученных данных КЗ вируса ЯЗ был рекомендован как перспективный кандидат в производственные штаммы вируса ЯЭ для разработке на его основе, а также на основе его компонентов (вирусспецифических белков, РНК) диагностических и профилактических препаратов. Данные по серологической идентификации вируса, выделенного из хронически инфицированных культур клеток, подтвердили обоснованность этих рекомендаций.

- 1У -

1.3 Серолпгичоскаа идентификация клонированного варианта вируса ЯЗ.

Таблица 4.

Идентификация КЗ и сравнительная характеристика его антигенной активности

ИП» Серо- АНТИГЕНЫ 0 Т П К М О I)

мывей логи- --------------------------------------------

к «там- ческие

май реак- Накаяма Двагар 01 КЗ Пекин-1 ции

РТГА 1280 1280 2560 640

КЗ

РБН 5,0 3.5 5.5 5.0

РСК 80 160 320 00

ТИФМ(х1000 ).Ю 20 10 10

МФА 640 1280 1280 640

Примечание: В РТГП и РСК использовали сахдрозо-ацетоновие антигены штампов вируса ЯЭ;

Сравнительный анализ КЗ и других вариантов вируса ИЗ в различных серологических реакциях позволил идентифицировать этот штамм вируса как вирус ЯЭ. Кроме того, в этих реакциях удалось показать, что КЗ характеризуется высокой антигенной активностью, широким спектром антигенных связей в отношении имеющихся в коллекции лаборатории втаммов вируса ЯЭ. относящихся как к антигенной группе Дягагар, так и к иммунотипу Накаяма (табл.4). В ряде опытов было показано, что антигены КЗ вируса ЯЭ не реагировали с иммунными сывороткаин или ИП1 мышей, полученными к флавивирусам ККЗ и к альфавирусам Синдбис, ВЭЛ-230.

Таким образом, в серологических "реакциях: (РТГй, РСК. РБН, ТИФМ, МФП) выявлены антигенные связи КЗ вируса ЯЭ, харак-

теризующие этот штамп вируса как антигенноактивный вариант, одинаково активно реагирующий с представителями антигенных групп Джагар и Накаяма, *

Следует отметить, что КЗ. как вирус 93, был идентифицирован и в других иммунологических реакциях (иммуноблотинг.латек-сагглютинация, РИГА - реакция непрямой гемагглютинации). Это позволяло вироко использовать этот итамм вируса в дальнейших исследованиях: с его помощью изучали механизмы реализации острой и хронической инфекции культур клеток различного происхождения. к этому вирусу были получены моноклональные антитела и проведен цикл исследований по оценке их использования в практических целяц; КЗ был использован в исследованиях по разработке профилактических и диагностических препаратов, результаты которых приведены в следующих разделах работы.

Н.НЕРСИСТЕНЦИЯ КЗ ВИРУСА 33 В !',УЛЬТУРЙХ КЛЕТОК I. 929.

Результаты изучения биологических_ сойств КЗ вируса Я3 в условиях острой инфекции позволили сделать вывод о том, что этот вариант вируса ЯЭ может быть отнесен к вакцинным «таммам вируса ЯЭ. В этой связи представляло интерес изучить способность КЗ индуцировать хроническую инфекцию в культурах клеток и оценить роль различных, известных в литературе факторов, участвующих в поддержании равновесного состояния между вирусом и клеткой. Необходимость проведения такого рода исследований диктовалось прежде всего недостаточностью сведений о механизме персистенции флавивирусов, несмотря на то, что, персистентная инфекция является наиболее важным, если не единственным источником генетической вариации вирусов, подобно вирусу ЯЗ. неспособных к изменчивости путем рекомбинации генов (Рг1пв1е,1979). Следовательно. персистентная инфекция флавивирусов должна рассматриваться как существенный фактор их эволюции в природе.

Таким образом, целью настоящего исследования было моделирование длительной инфекции КЗ вируса ЯЭ в клетках линии мыши-

ного происхоядения - L929, анализ основных параметров, характеризуют взаимодействие вируса и клетки. и факторов, участвущих в механизме длительного вирусоносительства в этой системе (L-ЯЗ).

2.1 Общая характеристика системы L-ЯЭ.

Двухдневный монослой клеток L929 отмывали раствором Хенк-са. и клетки синхронизировали посредством двойного тимидиново-го блока (РгеЫе, 1975 ), после чего зараяали КЗ вируса ЯЭ в дозе 10 БОЕ на клетку. Инфицированные культуры клеток выращивали на среде 199 с 10* бычьей сыворотки, с добавлением антибиотиков. Субкультивирования инфицированных клеток проводили в среднем каядые 10 дней в соотновении 1:3.

Дни наблюдения

Рис.2.Основные параметры становления и развития длительной инфекции КЗ вируса ЯЗ в культурах клеток I 929. х - заболевание и гибель инфицированных мышей-сосунков; о -отсутствие клинических симптомов заболевание животных; — -Фаза активной репопуляции хронически инфицированных клеток; -. -.-.- Фаза аитодеструкции; цифры над кружками - процент анти-генположительных клеток ь-ЯЭ, выявляемых НМФА.

Таким образом, была получена модель персистентной инфекции культур клеток 1929, вызванная КЗ вируса ЯЭ - Ь-ЯЭ. Система наблюдалась в течение более 3,5 лет (3 года и 7 месяцев). За это время было проведено около 100 субкультивирований.

В соответствие с классификацией основных форм взаимодействия вирусов и их хозяев в условиях персистенции, предложенной В.А.Зуевым, 1977 г., длительное взаимодействие вируса ЯЭ и клетки в системе Ь-ЯЭ в течение всего периода наблюдения можно было разделить на три стадии: хроническая, персистентная и латентная (рис.2).

Первая стадия - развитие и становление хронической инфекции культур кд£ток - продолжалась около 200 дней. Характерным признаком это^периода была периодическая смена фаз цитодест-рукции и репопдляции клеток. Регулярная смена среды способе-? твовала излечиванию монослоя клеток от цитодеструктивного действия вируса ЯЭ, и в течение 3 месяцев в системе не обнаруживали патогенного действия вируса на клетку. Клетки в этот период постоянно продуцировали в среду инфекционный вирус, титры которого колебались от 2,5 до 3,518 ТЦД50/мл, а в фазе цитодеструкции - до 5,2 1в ТЦД50/мл, ПВ 13 вызывал заболевание и гибель мышей-сосунков и мывей массой 5-6 г., накапливаясь в головном мозгек животных в титрах от 3,5 до 4,01в Ю50/мл при внутримозговом введении, в то время как при подкожном заражении заболеваемости и гибели животных не отмечали (табл.4). В реакции нейтрализации ЛВ постоянно идентифицировали как вирус ЯЭ, а в цитоплазме 252 хронически инфицированных клеток отмечали интенсивное свечение вирусспецифического антигена (ВШ ЯЭ, что позволило в дальнейвем успевно использовать эти культуры в качестве антигенсодерхацих клеток для изучения сывороток на антитела к вирусу ЯЭ в лабораторных и полевых условиях, в частности, при обследовании очагов ЯЭ на севере Вьетнама ( 1980 г.) методом флюоресцеирувдих антител'(рис.3),

Представляют интерес рездльтаты, полученные в опытах, когда культуры клеток 1.-ЯЭ инкубировали в течение 45 дней без смены среды и субкультивирований. В эйт период была обнаружена высокая жизнеспособность хронически инфицированных клеток; перенесшие "поковый" период единичные клетки после сиены питательной среды не только активно пролиферировали до формирования сплошного монослоя, но и сохранили способность продуциро-

вать инфекционный вирус, титры которого достигали 4.5-5,5 и ТЦД 50/мл. При этой ПВ сохранял превнке показатели нейровиру-лентности для вивотных, а в монослое в НЫФй обнарувивали до ЗОИ антигенсодервавих клеток. Таким образом, последствия "воко-вого"периода в системе Ь -ЯЗ не привели к полной элиминации вируссодервацих клеток из системы, наоборот, в этих условиях инфицированные клетки оказались более виэнеспособными. чем популяция не содервацих вирусспецифический антиген клеток.

Рис.3. Картина" свечения вирусспецифического антигена в хронически инфицированных клетках Ь-ЯЭ; а - гранулярная локализация антигена в цитоплазме: б - перинуклеарное распределение антигена.

Дальнейвие исследования показали, что инфекция в культурах клеток Ь-ЯЭ вступила в новую стадии - стабильного равновесного Состояния , мевду вирусом и клеткой без видимых признаков цитодеструкции. Вероятно, что в период "голодания" произошла селекция клеток, , чувствительных к репликации ПВ. но резистентных к цитопатогеннову действии вируса, в результате чего наступила быстрая стабилизация системы и переход ее в стадип перснстентноЛ шюекцяп, которая длилась более 500 дней (рис.2, табл.4). Отличительной особенностьп этой стадии было относительное увеличение продукции ПВ в .культуральнув среду (до 7,51в Щ50/нл) и прогрессивное снивение титров ПВ ЯЗ для белых мнией;инокулированных в головной йозг, увеличение инкубационного периода. Иными слове^и, в системе Ь-ЯЭ происходила аттендация ПВ для мнвей, которая коррелировала со значительнам снивение» В монослое Ь-ЯЭ антигенполовительных.клеток (до 2X). ." '. После 560 дня наблвдения ПВ ЯЭ'не вызывал " заболевания и . „ гибели вивотных. причем реверсии вирулентных свойств вируса не

происходили и после серийных "слепых" пассажей в чувствительной системе.Обработка 11В в пробах среды, отобранных в этот период, РНКазой (100 мкг/мл) приводила к полной инактивации ин-фекционности ПВ. в том время как снижение титров ПВ для клеток СПЗВ не наблюдали после обработки 4 М мочевиной. Зто. вероятно. свидетельствовало о продукции в этот период в системе L-ЯЗ вирионов ЯЗ с дефектом в суперкапсидной оболочке.

С 750 дня наблюдения в системе наступил новый период -стадия латентной инфекции. Характерной ее особенностью было значительное снижение титров I1B ЯЭ, продуцируемого клетками L929, вплоть до полного его исчезновения в пробах питательной среды. В нача^ этой стадии, инфекционный вирус удавалось выявлять в гомогенате клеток L-ЯЭ после 3-кратного замораживания и оттаивания (ДО^6.01в Т1]Д50/мл), однако к 1060 дню наблюдения вирус не выявляли и в гомогенате клеток. В то же время, по данным МФА, ВСЙ ЯЭ полностью исчез из цитоплазмы большинства клеток, однако слабое свечение антигена обнаруживали в околоядерной зоне более 802 клеток L-ЯЭ, что могло быть связано с накоплением дефектных вирионов в системе (Н.Б.Азадова, 1980).

Кариологический анализ клеток системы L-ЯЭ показал, что по модальному классу и по количеству М- и СН-хромосом эта линия мало отличалась от исходной (незараженной) линии клеток L929, Специфическая С-маркерная хромосома, характерная для клеток L929, обнаружена и в системе клеток L-ЯЭ, что свидетельствовало об отсутствии контаминации хронически инфицированной линии клетками иного происхождения.

Таким образом, разработана модель длительной инфекции культур клеток L, вызванной КЗ вируса ЯЗ. Показано, что КЗ способен также активно индуцировать персистентную инфекцию в этих культурах, как и в клетках HeLa, ПЭС, которые были изучены ранее. В течение всего периода наблюдения в системе L-ЯЗ можно было наблюдать постепенный переход к более глубоким взаимосвязям между вирусом и клеткой. Изучение основных параметров этих взаимоотношений позволило выделить хроническую, персистентную и латентную стадии инфекции" культур клеток L929. Выяснены условия активации вируса ЯЭ на латентной стадии инфекции. Прочность взаимодействия вируса ЯЭ и клетки в условиях хронической инфекции определялось высокой визнеспособностыо клеток-продуцентов вируса ЯЗ в период длительного "голодания" хронически инфицированных культур.

11.2. Корреляция вирусных и клеточных факторов, а также их роль в поддержании вирусоносительства в системе 1-ЯЗ.

По определении На1кег ( 1966г), персистентные инфекции являются примером "регулируемых инфекций", механизмы которых и этапы становления остаются далеко неясными. Это положение остается актуальным и в наши дни, в частности, для флавивирусных инфекций.

Целью настоящего раздела исследований было изучение феноменологии всех стадий длительной инфекции линии клеток 1929 и возможной роли различных факторов в становлении и поддержании вирусоносительства инфицированными клетками. В'основу исследований была положена идея о том, что "регуляция" персистектной инфекции осуществляется многофакторным механизмом, причем каждый из факторов может играть более или менее значимую роль на разных этапах персистенции.

Как было отмечено, 1-я стадия вирусоносительства в системе 1-ЯЗ по своим параметрам характеризовалась как хроническая инфекция. Результаты*,' детального изучения особенностей, характеризующих эту стадию, представлены в табл.5

Показано, что по мере культивирования клеток (до 220 дня) в популяции ПВ начинает "проявляться" 1з-признак: вирус ЯЗ размножался с одинаковой эффективностью как при 37 С. так и при 39 С ( 3,5 и 3,8 - 4,0 1в ТЦД50/мл соответственно), однако температура 40 С являлась непермиссивной для его репликации. В этой связи уместно напомнить, что КЗ, использованный для получения модели хронической инфекции, обладал гсЬ 40+ - признаком, сохранившимся и в условиях хронической инфекции культур клеток.

Наиболее значимой особенностью хронической стадии инфекции было обнаружение высоких титров интерферона в системе 1.-ЯЭ в культуральной жидкости, спустя 3 суток после смены среды. Для выяснения возможной роли интерферона в развитии резистентности части клеток 1,-ЯЗ к вирусу ЯЗ и в угнетении репродукции вируса были проведены опыты по изучению дейст'вия предварительной обработки клеток 1.929 (неинфицнрованная линия) различными дозами интерферона (рис.4).

Таблица 5.

Основные параметры,характеризующие хроническую стадию инфекции в системе 1.-ЯЗ

Признаки и свойства хронической инфекции культур клеток Ь-ЯЗ

ТЦД50/мл

Титры вируса:(1в)

Ю50/мл

Феномен аутоинтер^еренции

Чувствительность системы к суперинфекции гомологичным вирусом

- " - гетерологичныи вирусом (вирус клещевого энцефалита) Интерферон

Вирусспецифический антиген в клетках 1.-ЯЭ ' Инфекционность цитоплазиатичес-кой РНК инфицированных клеток: СПЭВ (острая инфекция) 1,-ЯЭ (хроническая инфекция)

Инфекционность препаратов ДНК клеток Ь-ЯЗ

Тигры ПВ ЯЗ до и после обработки 31Ш (100 мкг/мл)

Проявление параметров инфекции и их количественная оценка

(37 С) 3,0-3,5 (29 С) 5,0-5,2

(■N10 3,5-4,0 (в№с) О

Феномен "зоны":отсутствие ЦПЭ при заражении клеток СПЭВ неразве-денным материалом вируса и в разведении 1/10,

Отсутствие ЦПЭ в системе 1-ЯЗ

Отсутствие ЦПЭ в системе Ь-ЯЭ

180-320 ед/ид в среде культур Ь-ЯЭ через 72 часа после сиены среди

25% антигенположительных клеток 1.-ЯЭ

3,0 - 4,018 ТЦД50/мл 1,0 1в ТЦД50/иЛ

Полоаительная трансфекция при заражении материалом ДНК в разведении до 1:40,ДНК+РНК--аза - 1:40,ДНК+ДНК-аза -неинфекцйонна

4.01вТЦД50/мл и 25% антигенположительных клеток - до обработки; б,01 в ТЦД50/мл и 35% анти-генсодержацих клеток - после обработки.

Максимальные из использованных доз интерферона подавляли продукцию вируса ЯЭ'в клетках I. в условиях острой инфекции на 3 1е , что аналогично данным о продукции вируса в культураль-ную среду системы Ь-ЯЭ. Представляли интерес полученные данные об отсутствии выраженного влияния высоких доз интерферона на продукцию вируса клетками Ь, инкубируемыми при 29 С; В этих условиях титры вируса ЯЭ снижались ливь на 0.6-1,1 1в ТЦД 50/мл.Возможно, что интерферон в системе Ь-ЯЭ, угнетая продукцию варианта ПВ. активно размножающегося при 37 С, способствовал селекции в этой системе "холодовых" мутантов, 1з-мутантов вируса ЯЭ, наличие которых было убедительно доказано в последующих экспериментах._______

. Рис.4. Влияние интерферона на продукцию вируса ЯЭ в культурах клеток Ь 929, инкубируемых при различных температурах.

-I-1—-I-г

<0 20' 40 80 <60 зго

Доза внесенного в культуру интерферона

В исследованиях по изучению чувствительности клеток Ь-ЯЗ к суперинфекции другими флавивирусами (изо-, гомо- и гетероло-гичными штаммами) показана резистентность клеток к суперинфекции КЗ и КЗЗ штамма Накаяма вируса ЯЭ и гетерологичным вирусом (клещевой энцефалит). Это является дополнительным доказательством не только роли интерферона в осуществлении резитентности клеток 1.-ЯЭ, но и .вероятно, свидетельством изменений в'самом вирусном геноме, приводящих к образованию в популяции ПВ де-

фектных интерферирующих (ДИ) частиц, играющих вавную роль в механизме реализации длительного вирусоносительства (Huang и Baltimore.1970).

0 взаимном влиянии других хозяинспецифических факторов в поддервании хронической инфекции ■ свидетельствуют данные по изучению обработки культур клеток L-ЯЭ йоддезоксиуридиновой кислотой QUDR). После обработки монослоя клеток JUDR увеличивался процент антигенполовительных клеток и существенно повивался титр внеклеточного вируса в системе L-ЯЭ, что совпадало с результатами изучения модели хронической инфекции культур клеток вирусом кори (Henna,1975) и,по-видимому, свидетельствует о связи геедма ПВ ЯЭ с функцией клеточного ядра. Опыты по изучению биологической активности нуклеиновых кислот из клеток L-ЯЭ позволили'Йбнарувить РНК в инфекционной форме в цитоплазме инфицированных клеток .что такве подтвервдало возмовную связь генома вируса ЯЭ с ядерной ДНК в условиях персистенции. Второе половение, основанное на положительных экспериментах по трансфекции, требует дальнейшего изучения.

Суммируя феноменологию хронической стадии персистенции вируса ЯЭ, следует выделить, во-первых, накопление интерферона в системе, его ведущую роль в становлении и стабилизации хронической инфекции в культурах клеток L-ЯЭ.Во-вторых, появление ts -признака в популяции ПВ ЯЭ и, в-третьих, появление в системе ДИ-частиц. Вероятно, определяющим клеточным фактором равновесного состояние мевду вирусом и клеткой на этой стадии инфекции является интерферон, регулятор снивения продукции исходного полноценного вируса ниве"пороговых"значений, когда в системе наблюдается гибель клеток.

Вторая стадия взаимодействия вируса и клеткй в условиях длительного вирусоносительства характеризовалась как персис-тентная инфекция и сопрововдалась дальнейшим изменением свойств популяции ПВ, данные изучения которых представлены в табл.6,

Таблица 6.

Анализ вирусных и клеточных факторов, характеризующих персис-. тентую инфекцию культур клеток [.-ЯЗ.

Признаки и свойства персис- Проявление параметров инфекции

тентной инфекции клеток 1-ЯЭ. и их количественная оценка

1вТЦД50/мл 3,5-7,0 (37 С)

Титры вируса

1е Ю50/мл 2,2-0:увеличение латентного пе-

риода

Феномен аутоинтерференцнн Выраженный феномен "зоны"(отсут-

ствие ЦПЭ при заражении ПВ

клеток СПЭВ в разведении 0 -

■ 1: 1000 )

Чувствительность к суперин-

фекции гомологичным,.изоло- Отсутствие ЦПЭ в системе Ь-ЯЗ

гичным и

гетерологичным вирусами Наличие ЦПЭ в системе 1-ЯЭ

Интерферон 1:20 в среде культур клеток 1-

- ЯЭ через 72 часа после смены

среды

ННОА . 2-У/, антигенположительннх кле-

ток

Чувствительность ПВ к обра- 1 )Полное разрушение инфекционных ботке: 1 )РНК-азой (100 мкг/мл) свойств вируса, и 2) 4 И мочевиной 2Сохранение инфекционных свойств

ПВ ЯЭ.

Получены результаты, свидетельствующие о том, что ПВ ЯЭ. выделенный на стадии персистентной инфекции, сохранял высокую репродуктивную активность для культур клеток СПЗВ; в то же время титры его для белых мншей массой 6-7 г.при внутримозго-

вой введении материала были существенно ниже, а заболеваемость инфицированных животных наступала в более поздние сроки после зарааения (на 6-7 сутки). Иными словами, происходила дальнейшая аттенуация ПВ, и после 560 дня наблюдения, ПВ, выделенный из системы Ь-ЯЭ, не вызывал заболеваемости и гибели вивотных (сосунков белых мышей) при внитримозговом введения материала, причем реверсии нейровирулентных свойств ПВ ЯЭ не происходило и после 3-'4 "слепых"пассаяей через головной мозг мнвей-сосун-ков. Аттенуация ПВ четко коррелировала с появлением выраженного феномена "зоны", когда вирус в низких разведениях (0 -1:1000) не вызывал цитодеструкцию монослоя клеток СПЭВ, Этот феномен более существенно проявлялся на поздних сроках персис-тентной инфекцйи. Количество "ярких"антигенположительных клеток в этот пёрйЬд значительно снизилось (до 2-5Х). Исследования по изучении чувствительности ПВ ЯЭ из культур клеток 1,-ЯЭ к обработке мочевиной и РНК-азой свидетельствовали о дефекте в белковой оболочке продуцирующихся вирионов ЯЭ и о подавлении экспрессии генома вируса ЯЭ. Полученные результаты позволили предположить, что популяция ПВ ЯЭ в этот период содервит большое количество ДИ-частиц, играющих основную роль в поддервании персистенции вируса ЯЭ в этой системе. Подтвервдением этому предположению были опыты по изучению чувствительности системы 1,-ЯЭ к суперинфекции гомо- и гетерологичными вирусами, показавшими высокую резистентность клеток Ь-ЯЭ к реинфекции клоном КЗ вируса ЯЭ и чувствительность к отамму ТР-21,вируса Лангат. В этой связи представляют интерес данные С.В.Зуева и Н.В.Логиновой (1980). Полученная авторами популяция вируса ЯЭ, обогащенная ДИ-частицами, характеризовалась аналогичными свойствами при титровании в культурах клеток (низкой инфе^кциойностью, феномен "зоны"), а электронномикроскопические иследования, позволившие, обнаружить несоответствие количества физических вирионов и низкой инфекционности, явились доказательством наличия в популяции вируса ЯЭ ДИ частиц.

Низкие титры интерферона, , обнаруженные в системе Ь-ЯЭ, вряд ли могли свидетельствовать о ег'о ведущей регуляторной Функции в поддержании вирусоносйтельства. Следовательно, ведущим фактором в персистенции вируса ЯЭ во П-й период, скорее всего, являются ДИ-частици в популяции ПВ,* характеризующиеся

делецией генома вируса, обладающие способностью бистро проникать в клетку и тормозящие репликацию полноценных инфекционных вирионов ЯЗ.

Таблица 7.

Феноменология латентной стадии инфекции культур клеток Ь-ЯЭ.

Признаки свойства латентной Проявления параметров инфекции и

инфекции в системе Ь-ЯЗ и их количественная оценка

1В ТЦД50/ил 0 - 1.2 (37 С); 2,5-3.0 (29 С)

Титра вируса

93 1ц Ю50/ия 0 (37 С);

менее1:20 - через 72 часа

Интерферон 1:80 - через 96 часов

после смены среды

НИФЙ Слабое перинуклеарное свечение

. 80% клеток монослоя L-ЯЗ

Инфекционность РНК из нативная РНК - 0

клеток 1.-ЯЭ*- РНК+РНК-аза -0

Инфекционность ДНК клеток ДНК из осадка - 1:40

• Ь-ЯЭ ■ ДНК+РНК-аза - 1:40

ДНК супернатантная -1:20

ДНК+ДНК-аза - 0

* - Тотальную РНК экстрагировали из клеток L-ЯЭ в период .когда клетки L-ЯЭ не.продуцировали.- инфекционного вируса, выявляемого методом титрования в чувствительных культурах клеток СПЭВ.

Однако, по мнению Sekellck и Marcus (1978), способность ДИ частиц защищать клетки от летального дейсТёия инфекционного вируса связана не только с их способностью тормозить репликацию зрелого вируса, но'и опосредована интерфероном, даве', если этот клеточный фактор резистентности "продуцируется в низких титрах. В то ве время показано, что ts-мутанты являются хоро-иими. индукторами интерферона, который, в свою очередь, моает

способствовать дальнейшей селекции ПВ с ts-фенотипои, что было подтверждено при изучении системы L-ЯЭ, в частности, ее III стадии - латентной инфекции, характерные признаки которой представлены в табл.7.

Показано, что стадия латентной инфекции характеризовалась значительным снижением продукции инфекционного вируса в среду клеток L-ЯЭ и, если ПВ на ранних сроках этой стадии выявляли в гомогенате латентно инфицированных клеток, то в последующие дни наблюдения гомогенат клеток не содержал инфекционного вируса. Не удалось обнаружить и инфекционную РНК в клетках L-ЯЭ в этот период. Однако в перинуклеарной зоне около 802 клеток обнарувивали q^aöoe вирусспецифичесое "свечение" антигена ЯЭ, Полученные результаты побудили провести исследования по активации латентного вируса ЯЭ. С этой целью культуры клеток L-ЯЭ инкубировали в течение 20 дней при 29 С, в течение которых наблюдали явления вирусспецифического цитодеструктивного действия, а также снижение адгезивной способности инфицированных клеток, что в аналогичных условиях не было обнаружено при культивировании нормальных (неинфицированных) культур клеток L929, Результаты сравнительного вирусологического анализа линии клеток L-ЯЭ представлены в таблице 8.

Таблица 8.

Продукция ПВ ЯЭ клетками L-ЯЭ,инкубируемых при температурах

37 С и 26 С

Культуры клеток L-ЯЭ Титры ПВ ЯЭ для клеток СПЭВ.инкубируе-№N0 субкультур линии мых при разных темпера5турах (1еТЦД50/мл)

L-ЯЭ,инкубируемых при -----------------------------------

37 С и 28 С 29 С 37 С 42 С

L-ЯЭ (53) -37 С 3,8 О О

L-ЯЭ (53) -28 С 7,6 _6,6 О

L-ЯЭ (56) -37 С 5,5 1.0 О

L-ЯЭ (56) -28 С 8,5 7.5 , О

В результате этих исследований показано,что вирус ЯЗ mos-но было, обнаруаить в культурах клеток L-ЯЭ лишь в том случае, если зараженные индикационные клетки СПЭВ инкубировали при 29 С,'в этом случае титры ПВ ЯЭ достигали 3,6-5,5 lg ТЦД50/мл, что, вероятно, свидетельствовало в пользу селекции в системе L -ЯЭ "холодовых" ts-кутантов вируса ЯЗ, не способных размножаться при температуре 37 С.. Иные результаты были получены после инкубации культур клеток L-ЯЭ при 29 С в течение 20 дней. Титры ПВ ЯЭ, продуцируемые этими культурами, значительно возрастали и достигали 7.0-8,5 lg ТЦД50/мл при титровании на клетках СПЭВ, инкубируемых при 29 С, и 6,6-7,5 1в ТЦД50/мл -при титровании в условиях пермиссивной для клеток температуры (37 С). Следовательно, в системе клеток L-ЯЭ произошла не только селекция "холодовых" мутантов ПВ ЯЭ: данные исследований показали такне, что в этих условиях происходила активация латентного вируса ЯЗ, который оказался способным размножаться в системе L-ЯЭ лииь при пониженной температуре инкубации. Полученная после активации популяция ПВ ЯЭ содержала в своем составе как холодовыё ts -мутанты так н ts -мутанты, неспособные размножаться при повыиенной (40 С) температуре, сходные по признаку rct 42 с КЗ вируса ЯЗ, используемого для моделирования хронической инфекции.

-В этом отнопении представляют интерес данные Fisher, и Rapp (1979), наблюдавших аналогичный Феномен в клетках эмбриона хомячка, хронически инфицированных птаммом Зварц вируса кори. По мнении авторов, в основе этого явления леяит образование дефекта в синтезе вирусных структурных белков, потеря способности связываться с клеточными мембранами, что ведет за собой нарушение сборки, почкования и, в конечном итоге, цито-патического действия вируса.

Обнаруаенная в опытах трансфекции инфекционность ДНК клеток линии L-ЯЭ в определенной степени свидетельствует о взаи-косвязи репликации генома ПВ ЯЭ с клеточной ДНК L-ЯЗ. Однако убедительные доказательства формирования или отсутствия в системе L-ЯЗ ДНК-транскриптов и их интеграции с геномом клеток L 929, возмонно, могут быть получены лишь при использовании в этих целях метода полимеразной цепной реакции.

Следовательно, в основе латентной инфекции в культурах клеток L-ЯЗ лежит селекция ts-мутиантов вируса ЯЭ, неспособных вызвать литическую инфекцию при пермиссивной тсниерату-

ре.По-видимому. -мутанты ПВ ЯЗ на этойстадии играют ведущую роль в поддержании вирусоносительства в клетках Ь-ЯЭ. В то же время, нельзя полностью исключить и регуляторную функцию ДИ -частиц и интерферона на всех стадиях инфекции. Температу-ро-чувствительные мутанты, снижающие репликацию вируса, ДИ-частицы, тормозящие размножение гомологичного полноценного вируса, а также продукция в системе интерферона, являются свидетельство^ реализации многофакторного механизма установления равновесного состояния между вирусом и клеткой в системе Ь-ЯЭ. Кроме того, анализ этих факторов свидетельствует о взаимосвязи этих факторов на всех стадиях.длительного вирусоносительства. Показано также,, что реплицирующийся в клетках геном КЗ вируса ЯЭ. используемы^ для разработки модели персистентной инфекции культур клетокГявляется сильным индуктором интерферона, который. в свои очередь, осуществлял регуляторную роль в селекции ДИ-частиц и "холодовых" 1з-мутантов вируса ЯЗ в системе.

В процессе персистенции вируса ЯЭ в культурах клеток произошли глубокие необратимые изменения его биологических свойств по ряду вирусогенетических признаков (патогенность для ¡пшотных, антигенная активность), что еще. раз подтверждает существующую точку зрения о ведущей роли феномена персистенции в эволюции вирусов, неспособных к генетической рекомбинации. Наиболее ярким примером этого явления остается выделение из популяции персистирующего вируса ЯЭ КЗ вируса ЯЭ, характеризующегося уникальными свойствами, приобретенными им в результате длительной персистенции.

Таким образом, результаты изучения биологических свойств КЗ вируса ЙЭ в условиях острой и хронической инфекции культур клеток,с одной стороны,показали пригодность использования этого штамма вируса в качестве кандидата в вакцинные штаммы; с дрцгой стороны, исследования еще раз убедительно подтвердили существующее мнение о невозможности использования вируса ЯЗ для приготовления айвой аттенуированной вакцины для профилактики ЯЭ из-за опасности активации персистируящего вируса и приобретения им способности вызывать В' определенных условиях цитицидную инфекцию.

Возникала необходимость находить иные пути разработки на его основе профилактических, а также диагностических препаратор с учетом качественно новых свойств КЗ, приобретенных в течи!',!! персистенции.

III.КОНОКЛОНАЛЫШЕ НЫ11УНОГЛОБУПИНЫ К АНТИГЕНАМ ПЕРСНСТИРУВЩЕГО ВИРУСА ЯЗ (КЗ)

Освоение методов гибридомной технологии привело к развитии двух новых направлений экспериментальных исследований при арбовирусных инфекциях: с одной стороны, возмояность более детального изучения антигенного разнообразия вирусов и создания усовершенствованных диагностических препаратов: с другой стороны, обнаруяение специфических антигенов и выделение соответствующих эффективных моноклональных антител. (МКА), обеспечивающих зацитнуп активность иммуноглобулинов в заращенном организме (А.С.Иовохатский и др., 1984). Последнее полояение для Флавивируса ЯЗ является наиболее актуальным, поскольку в последние годы получены убедительные доказательства в пользу ведущей роли вируснейтрализуюцих антител в обеспечении защитного эффекта при инфекции ЯЗ. В то яе время, ни интерферон как имкуномоделирувднй фактор, ни антигеаагглитнннны не играют существенной роли в выздоровлении больных ЯЗ или в предупреяде-нии заболеваний, вызванных зтии вирусом ( гЬапд, 1987).

Цельв настоящих исследований было получение гибридом, продуц'ирупцих'ЙКА к КЗ вируса ЯЗ, для оценки роли МКА в дифференциации вариантов вируса ЯЗ и в механизме защитного (протек-тнвного) эффекта^ при летальной энцефалите, вызванном вирусом ЯЭ у зкспориаеитальных аивоткых.

111.1; Получение к характеристика гибрндон, продуцирующих 2КА к аптигенаи вируса ЯЭ

Для получения иннунных спленоцитов-'имйунйзирбванным по стандартной схеме иыиам за 4 дня до слияния внутривенно вводили вирус ЯЗ в дозе 8,2 1в БОЕ/мызь,- после чего отбирали пробы сыворотки и ИА8 перед удаленней селезенки и исследовали в се-рологичнеских реакциях на наличие антител к КЗ вируса ЯЗ. Титры вирусспецифических антител в этих .. пробах били достаточно .высокими и составляли.1:1280-1:5120 -в РТГА! 1:1280 - 1:640 -в НМФА; 1:160 - 1:320 в РБ№; 1:640 - 1:320 о РСК. Полученные данные явились дополнительным подтверждением антигенной актив-

ности КЗ вируса ЯЭ и позволили использовать иммунные спленоци-ты-мышей для слияния с мышиными миеломными линиями N50 и ХбЗ-Пев/ 653. В результате слияния получено 7 активно размножающихся, продуцирующих МКА к антигенам вируса ЯЗ гибридом (скриннинг гибридом проводили стандартным непрямым методом флюоресцеирующих антител - НИОА).

Гибридизация с клетками N5-0 привела к выделению 6 клонов, а с клетками Х63-Ай8/653 - одной гибридомы (ЗЯ-10),

Таблица Э

Специфическая активность ИКй в культуральной жидкости гибридом. серии ЗЯ

Гибри- Родитель- Класс Активность антител в НМФА с вирусами

дома екая ми- иммуно------------------------.------------

еломная глобу- ЯЭ Лан- КЗ ВЭЛ линия линов . КЗ гат Софь- 230

ТР-21 ин

ЗЯ-4 НБ-0 1ес 128 0 .. о 0

ЗЯ-7 N5-0 1ен 32 0 0 0

ЗЯ-10 Х-653 I вН 10 0 0 0

ЭЯ-19 N5-0 I дМ 64 0 0 0

ЭЯ-20 N5-0 I ВС 16 0 0 0

ЗЯ-26 N5-0 16 0 0 0

ЗЯ-28 N5-0 1еб 32 0 0 0

Исследования, проведенные с гибридомами, продуцирующими МКА к антигенам вируса ЯЭ, показали, что все серии ИКА реагировали в НМФА с антигеном КЗ вируса ЯЗ и не взаимодействовали с гетерологичными вирусами:Лангат (штамм ТР-21), вирусом КЗ (штамм Софьин) и вирусом ВЭЛ (штамм 230) - табл.9.

Среди полученных гибридом выделялись гибридные клоны ЭЯ-4 (18Ё) и ЭЯ-19 сIвМ). у которых наряду с выраженной продукцией противовирусных антител выявлены хороший5ростовце характеристики и удовлетворительная .эффективность клонирования, высокий процент позитивных клонов при реклонировании. Из 7 изученных гибридом 3 (ЭЯ-7,10 и 19) синтезировали иммуноглобулины М и 4

(ЭЯ-4, 20, 26, 28) - класса G. Интересно отметить, что все виды МКй к белкам вируса ЯЭ, полученные Kimura-Kuroda ( 1983),Liu (1982), относились к классу IgG, а среди гибридом, полученных Gould и др.(1983), только один клон продуцировал IgH.

Высокое представительство иммуноглобулинов класса М среди МКА. полученных к КЗ, мояет свидетельствовать об особенностях развития иммунных реакций у мышей, иммунизированных персиети-рующим вариантом вируса ЯЭ.

Дальнейшие исследования были направлены на изучение степени прививаемости и перевививаемости гибридом, продуцирующих МКА к вирусу ЯЭ, в организме мышей линии Ва1в/с, в зависимости

от препаратов, используемых для сенсибилизации животных,а так-

,1

же на проведение серологических исследований, определяющих особенности продуцируемых МКА.

Остановлено,что наибольшей способностью индуцировать образование асцитных опухолей в организме мышей линии Balb/c обладали гибридомы ЭЯ-4 и ЭЯ-19, что позволило в течение 4 месяцев произвести 6 последовательных пассажей асцитных опухолей. Максимальная приживляемость и прививаемость установлена для гибридных клеток ЭЯ-4, которая достигала 80%.

Данные, приведенные в табл.10, свидетельствуют о возможности применения . пристана и полного адъюванта Фрейнда в качестве сенсибилизирующих препаратов в опытах по получению асцитных препаратов гибридом. В то же время, предобработка животных адъювантом Фрейнда, как правило, приводила к удлинению сроков образования асцитных опухолей, индуцированных пш-ридомами серии ЭЯ до 30 суток и более (табл.Ю). Продукция МКА в асцитных препаратах гибридом значительно возрастала в случае введения мышам пристана , была выше,чем при сенсибилизации животных адъювантом . Фрейнда; титры МКА в асцитных препаратах гибридом, полученных от вивотных, сенсибилизированных приста-ном, достигали 1:9120. Объем моноклональных HAS был также несколько выае у животных, сенсибилизированных пристанон. В то ке время, в этих исследованиях показана принципиальная возможность использования в качестве сенсибилизирующего препарата -более доступного полного адъюванта Фрейнда, введение которого животным в конечном счете обеспечивало рост гибридом, образование асцитных опухолей и получение необходимых количеств моноклональных ИйИ; содержащих антитела в достаточно высоких титрах. Пригодных для экспериментальных исследований.

Характеристика асцитных препаратов

ЭЯ-19

Таблица 10 гибридом серии ЭЯ-4 и

Сенсибили- Гибридоыа Срок обра-зирунщий зования

агент асцитной

опухоли

Объем ИйН Число Титры (мл) клеток антител хЮО млн в ННФЙ

Полный ЭЯ-4 (пер- 25+8 адъювант вичное вве-Фрейнда дение)

ЭЯ-4 (в пас-савах на 46 + 2 мышах) ЭЯ-1Э(первичное вве- 29+5 дение)

ЭЯ-19 (в пассажах на 33+7 мышах)

3.1 + 1.5 15 + 11 1:1280

2,0 + 0.5 12X2 1 :640 -1:1280

2.5 + 1.7 1? + 9 1:1280^

2.6 * 0.9 11 + 7 1:1280

Ирис тан

ЭЯ-4Спервичное введение

ЭЯ-4Св пас- 14 + 2,0 сашах)

ЗЯ-1ЭС пер- 23 + 8 вичное введение)

ЭЯ-19(в пассажах на 21+7 мышах)

21 +3 3.0 + 0.5 23 + 0,5 1:1280

2,7 + 1,5 70,+ 33 1:5120 3,1 +1.5 25+8 1:1280

2.6 + 0.9 106 + 80 1:5120

Изучение НКА.продуцируемых гибридомаыи серии ЗЯ. и раз-• личных серологических реакциях показало, что ни одна из полученных серий МНА не была активна в РТГА, что. вероятно, ооус-ловлено методом, используемым при скриннинге гибридом (ттолицл 11).

Таблица 11,

Характеристика асцитных препаратов гибридом серии ЗЯ в серологических реакциях

Гибри- НИФА РБИ

дома------------------------------------- РТГА РСК

Антиген Антиген Титр Индекс вируса вируса анти- нейтра-ЯЭ КЗ тел лизации

ЗЯ-4 1: 1280 0 1: 160 -1:320 3,3-4.3 0 0

ЗЯ-19 1:1280 0 1:10 . 1.3 0 1:320

ЗЯ-20 1:640 0 1:10 1 ,9 О 1:40

■ ЫКЙ ЗЯ-19 и ЗЯ-20 не обладали вируснейтрализующей активностью, в то время как НКА ЗЯ-4 оказались высокоактивными и этой реакции и нейтрализовали вирус на 3,3-4,3 1в Щ50/мл С индекс нейтрализации), титры вируснейтрализунщих антител составляли 1:160-1:320. В РСК активно реагировали моноклональшд; иммуноглобулины й - ЗЯ-19 (1:320),

Таким образом, высокая антигенная активность КЗ позволила получить гибридомы, активно продуцирующие НКА. изучение которых показало перспективность дальнейшего использования, по крайней мере, двух гибридоь:: ЗЯ-4, продуцирующую вируснейтр.ч-лизующие 1аБ, и ЗЯ-19, продуцирующую IеМ. активно реагируют« в РСК.

III Л.Протективное действие МКА при летальной энцефалите, вызванном у ыывей вирусом ЯЭ

Известно, что многие представители семейства Flavlviridae вызывают спорадические или эпидемически потенциально опасные менингоэнцефалиты у человека и животных. Защиту от заболевания обеспечивает иммунитет к реинфекции, формирующийся либо в результате вакцинации, или первичную инфекцию предотвращает введение иммунной сыворотки (пассивная защита). Разработка субъединичных, синтетических полипептидных, генно-инкенерных вирусных вакцин, включающих определенные антигенные детерминанты вирусов, требует предварительного изучения достоверной протективной способности антител, индуцируемых антигенами в составе этих вакцин. Протективные МКА могут быть использованы для оценки функциональной активности антигенов ¿"-составе вакцин и для изучения гуморальных факторов, вовлеченнык-а^проти-вовирусный иммунитет ( Matheus и Roehrlß, 1984). Показанй"-т§к-ве, что вируснёйтрализующие МКА играют ванную роль протективном иммунном ответе при флавивирусных инфекциях (Zharig и др., 1987,1989), и определена перспективность их использования в разработке вакцин на основе антиидиотипических антител.

Показано, что защитное действие поликлональных антител коррелирует с титром антител, вызывающих нейтрализацию вируса (Schlesinger и др., 1985), причем нейтрализация вируса IgG происходит,как считают,на стадии слияния мембраны вируса с эн-досомами и проникновения в цитозоль, что предотвращает депро-теинизацию вируса (Halstead и O.Rourke, 1977).

Представляло интерес изучить протективные свойства МКА серии ЭЯ-4, обладающих нейтрализующей активностью, при летальном энцефалите (ЯЭ) у мыией в эксперименте. Предварительно была изучена серологическая акивкость МКА ЭЯ-4 и ЭЯ-19 по отношение к антигенам разных штаммов вируса ЯЗ (табл.12).

В случае, если титры антител, продуцируемых гибридомой ЗЯ -4. незначительно варьировали в отношении всех вариантов вируса ЯЭ в НМФА (за исключением штамма Пекин-1), то, по данным РБН, TsKA активно нейтрализовали лиль КЗ вируса ЯЗ и в незначительной степени другие-варианты вируса ЯЭ. Следовательно, с помощью МКА серии ЗЯ-4 возмонна дифференциация антигенных ва-

риантов вируса ЯЗ. и в этой реакции МКй серии ЭЯ-4 проявляли свойства штаммовоспецифических антител, активно реагирующих лишь с эпитопом (-ани) гомологичного вируса - КЗ . В то же • время, иммуноглобулины ЗЯ-19 одинаково активно реагировали в РСК со всеми вариантами вируса ЯЭ, кроме антигена штамма Пекин ..'-1, однако в НМФА также оказались способными дифференцировать антигенные варианты вируса ЯЭ. Методом иммуноблоттинга показано, что МКА серии ЭЯ-4 направлены к основному иммунизирующему структурному белку КЗ - белку Е. Полученные данные являются веским подтверждением тому, что КЗ вируса ЯЭ в значительной степени отличается от других вариантов вируса ЯЗ по функциональной активности вируснейтр^лизующего втаммовоспецифического эпитопа (или нескольких эпитопов), расположенных на структурном белке Е.

Таблица 12

Активность МКА к вирусу ЯЭ в серологических

реакциях с антигенами вариантов вируса ЯЭ.

Антигены МКЙ ЭЯ-4 МКА ЭЯ-1Э вируса ЯЭ -------------------------------------------------

НМФА РБН РСК НМФА РБН РСК

Клон ИоЗ 1:2560 4,3 0 1:5120 1.7 1:320

Джагар 01- 1:1280 0.8 0 1:1280 0 1:320

Накаяма 1:640 1.6 0 1:2560 0 1:320

Пекин 1 1:80 2.0 0 1:640 0 1:80

Сасазаки 1:1280 1.2 0 1:1280 0 1:320

Таким образом, МКА ЭЯ-4, полученные к белку Е КЗ вируса ЯЭ, дали уникальную возможность в РБН легко отличать КЗ от других известных вариантов вируса ЯЭ.

.В этой связи представляло интерес провести исследования по сравнительному изучению протективной активности МКА ЭЯ-4 п отношении КЗ и штамма Дяагар 01, различающихся по способности нейтрализоваться МКА зтой серии (рис.4)

<>ис.4.Протективная активность ЫКй серии ЗЯ-4 при летальной энцефалите мышей, вызванном КЗ вируса ЯЗ.

Внутривенное введение МКЙ ЗЯ-4 в объеме 0,2 мл Гтитр: 1:1280 - по данным НМФЙ) мышам массой 7-8 г.за три часа до внутримозгового заражения КЗ в дозах, вызывающих летальный энцефалит, как правило, приводило к значительному защитному эффекту. НКй защищали более 40% животных, инфицированных в мозг, в разведениях, достигающих 1:125. Введение моноклональных I серии ЗЯ-4 в разведении 1:5 - 1:25 обеспечивало 90-100% выживаемость животных, инфицированных летальными дозами (10 и 100 1.050).

Полученные данные свидетельствовали о той, что вирдснейт-рализующие МКЙ ЭЯ-4 характеризуются высокой протективной активностью в отношении гомологичного варианта вируса.

Представляло интерес в аналогичных условиях изучить про-тективную активность этих ЫКЙ в отношении изологичного штамма Дкагар. который фактически не.нейтрализовался иммуноглобулинами ЭЯ-4. Было показано, что при профилактическом введении МКЙ ЭЯ-4 выживаемость инфицированных в головной иозг вивотных составляла 80% и 100%, в зависимости от дозы заражения. Данные позвйляют предположить о том,' что КЗ и Даагар 01 в значительной степени различаются,по функциональной активности вирус-нейтрализующих зпитопов-, но сходны по протективной активности

МКЙ, индуцируемых данными эпитопами. Иными словами, КЗ вируса ЯЭ индуцирует штаммовоспецифические вируснейтрализующие антитела, характеризующиеся высокой протективной активностью широкого спектра действия.

Таким образом, получены дополнительные доказательства в Пользу правильного выбора в качестве кандидата в вакцинные атаммы КЗ вируса ЯЗ. Кроме того, благодаря высокой протективной активности, МКА ЗЯ-4, индуцируемые его белком Е, могут быть использованы при разработке рекомбинантных генно-инменер-ных вакцин Против ЯЭ на стадии индикации продуктов экспрессии, а также, в перспективе, для получения на их основе иммунобиологических препаратов для профилактики ЯЭ.

Полученные результаты получили веское подтверждение в исследованиях Heinz и др., 1983, Matheus и Roehriе, 1984, Gould и др.,1986, Mason, 1989, Pincus и др.,1992, показавших, четкую корреляцию вируснейтрализующей активности МКА к белку Е in vitro с их способностью защищать животны* от летального энцефалита, Кроме того, авторами было обнаружено, что защиту от летального энцефалита обеспечивали не только МКА к белку Е флавивирусов, но и МКА, полученные к каждбму из 2 вирусспеци-фических и индуцированных белков: pr M и NS1. которые или не обладали вируснейтрализующей активностью, или их способность нейтрализовать вирус была незначительна. Эти данные следует учитывать при разработке профилактических, генно-иняенерннх препаратов против ЯЭ.

Ш.2.йнтителозависииое усиление патогенйости КЗ вируса

ЯЭ; опосредованное ЙКА ЭЯ-4

/

В последние годы внимание исследователей привлек феномен усиления репродуктивной и патогенной активности вирусов в присутствии МКА в субнейтрализуыщих концентрациях. Эффект антите-лозависимого усиления репродуктивной активности вирусов (АЗУР) описан при многих флавивирусных инфекциях in vitro (Porterfleld, 1985; Gould. 1987; Zhang, 1989; С.Я.Гайдамовнч \\ др., 1989 г. и многими другими). Феномен АЗУР, впервые описанный Haukes (1964), проявляется in vitro при использовании клеток ионоцитарно-ыакрофагального ряда и связан с индукцией эпи-топоспецифических и штаммовоспецифических антител антигенами

белка Е, ответственными за вируснейтрализующиуш активность вируса (Peris 3. и др.,1979, 1981).

Учитывая тот факт, что МКА ЭЯ-4 являются штаммовоспецифи-ческими, слабо нейтрализующие инфекционные свойства изологич-ного штамма Даагар 01, а такяе отсутствие в литературе данных

0 проявлении этого феномена при ЯЭ in vivo, на уровне организма, интересно было изучить возможность проявления эффекта АЗУР при подковном и внутрибрюшинном зараяении мышей штаммом Даагар

01 (рис.5).

Показано, что если МКА ЭЯ-4 внутривенно вводили мышам, спустя 3 часа после заражения штаммом Дяагар 01. их защитные свойства утрачивались. В этих условиях отчетливо проявлялся феномен ЙЗУР, а именно: в присутствии МКА ЗЯ-4 все инфицированные нивотные погибали, и лишь i ОХ мышей, зараженных вирусом в дозе 10 LD50, выаивало. В то ае время, когда инфицированным ьышам не вводили МКА, как правило, около 20-402 животных, выаивало.

-МКА+МКА -МКА+ИКЛ" - МКА ♦ МКА

Рис.5.Феномен АЗУР, обнаруженный при введении МКА животным, инфицированным внутрибрюшинным способом штаммом Даагар 01 в дозе 10 - 1000 1,050 (для внутримозгового введения), заштрихованная область - процент погибших животных; незаштрихо-ванная область : процент выживших инфицированных животных.

В условиях, когда МКА вводили спустя 3 часа после периферического заражения штаммом Даагар 01" вируса ЯЗ, их защитные свойства утрачивались. В то же время, в этих условиях отчетливо проявлялся эффект АЗУР, а именно: в присутствии МКА ЗЯ-4 в зависимости от дозы заражения (10 -100 Ю 50) около 90-100% животных погибало. В контрольных экспериментах, когда инфицированным аивотным не вводили в эти сроки МКА, количество вы-

пивших от летального энцефалита нивотных било выше и составляло от 20 до Ш.

Аналогичные результаты были получены в опытах, когда штамм Двагар 01 в десятикратных разведениях подкояно вводили животным. а спустя 3 часа, внутривенно вводили МКЙ ЭЯ-4 в разведениях от 1:10 до 1:250 (рис.6).

Показано, что под воздействием МКА ЭЯ-4 титры штамма Джа-гар 01 вируса ЯЭ возрастали с 2,4 lg LD50 до 3,6 lg LD50 для мывей при титровании подковным способом; тенденция к снижении титров вируса проявлялась лишь при введении МКА в более высоких концентрациях (1:5). В этом случае, вероятно, доминировало действие протективных антител.

Таким образом, данные свидетельствуют о том, что МКА ЭЯ-4, характеризующиеся слабой нейтрализующей активностью в отношении штамма Двагар 01, в субнейтрализувщих концентрациях обладали способностью вызывать феномен АЗУР in vivo. Обнаруженный эффект вааен, прежде всего, для расшифровки механизмов патогенеза флавивирусных инфекций, в том числе, и патогенеза длительно протекающих инфещий, в частности, условий, способствующих обострению инфекционного процесса.

Представляло интерес выяснить причини, в конечном итоге приводящие к усилению патогенности вируса в присутствии ЙКЙ. Является ли этот фенонен результатом изменения патогкннчх свойств вируса или повышенной репликативной активности вирус-з в присутствии МКЙ. Ответ на этот вопрос Сил получен при изучении летального энцефалита иыней'массой 5-6 г, вызванного атте-нунроиаиным вариантом вируса Венесульского энцефаломиелита ло-

о

"ТТТШГГЗВ '»¡250 Т-.Т280' ____РАЗвелеиив- МКА

Рис.6, Эффект АЗУР, опосредованный МКА ЭЯ-4, наблюдаемый у мышей, подкожно инфицированных штаммом Двагар 01.

шадей С ВЭЛ—230 ) в присутствии вируснейтрализующих МКЙ к штамму Тринидад вируса ВЭЛ, любезно предоставленных проф.С.Я.Гайдамо-чич. МКЙ серии, 226 в различиной степени нейтрализовали эти штаммы вируса ВЭЛ ( индекс нейтраэизации: 5,41в - для штамма Тринидад и 2.0 1в -для штамма 230).

Получены результаты о том, что внутривенное введение МКЙ 226 инфицированным в головной мозг мышам как за 24 часа до за-равения, так и спустя 24 часа после заражения штаммом 230, как правило, приводило к высокому протективному эффекту, (рис. 7). Даяе в разведении 1:80 МКЙ зачищали 1002 животных от летального энцефалита после зараяения 1000 Ю50 вируса ВЭЛ-230. В то же время мыши, не получавшие МКЙ, погибали на 3-5-е сутки после зараяения. Необходимо было выяснить возможность репликации вируса ВЭЛ-230 в головном мозге мышей, защищенных МКЙ (рис,7).

мозге мышей, "леченных" различными дозами МКЙ -226 (внутримоз-говое введение вируса в дозе 1000 Ю 50).

Данные убедительно показали, что введение вивотным МКЙ в высоких концентрациях приводило к полному угнетению репродукции вируса в головном мозге. Введение яе МКЙ в' разведениях от 1:40 до 1:80 не только не приводило к полной элиминации вируса; наоборот, после непродолвительной фазы снижения репродук-

ции вируса в клетках мозга, к 42-50 часам титры вируса значительно возрастали и на 2 - 2,5 порядка превышали их значения в эти сроки у контрольной группы животных.

Несмотря на активнуи репродукцию вируса в головном мозге животных, мыши- оставались внешне здоровыми в течение 15 дней (срок наблюдения), в то время как животные контрольной группы заболевали к 80 часам после инфекции, и к 4-5 дню все они погибали от энцефалита при относительно низких показателях титров вируса в головном мозге.

Таким Образом, полученные даннные свидетельствовали о том, что: 1) под влиянием МКЙ феномен ЙЗУР. наблюдаемый при летальном энцефалите, вызванном вирусом ВЭЛ-230, не является следствием усиления патогенных потенций вируса (отсутствие признаков заболеваемости животных), а скорее всего результатом повышенной репродуктивной активности вируса, опосредованной МКЙ; 2) отсутствие заболеваемости животных, "леченных" MKfl. вероятно, связано с опосредованным дейстбием МКй, защитивших чувствительные клетки мозга от литического действия вируса о критический для данного возраста мышей период, т.к. известно, что у мышей более зрелого возраста внутримозговое введение штамма ВЭЛ-230 не приводит к симптоматически выраженному энцефалиту, а следовательно, к гибели животных.

По-видимому, феномен ЙЗУР, в случае патогенных вариантов вирусов (например, штамм Джагар) in vivo, в конечном счете приводит к активации патогенных свойств вируса в результате опосредованного МКй усиления продуктивной литической инфекции. В случае инфекции, вызванной аттенуированными вариантами вирусов (например, итаммм вируса ВЭЛ-230), - к длительно протекающей бессимптомной персистентной инфекции клеток головного мозга.

Несомненно, что дальнейшее изучение факторов, участвующих в проявлении феномена ЙЗУР при арбовирусных инфекциях может иметь огромное теоретическое и практическое значение, т.к. мн-ханизм этого явления может лежать в основе патогенеза острых и хронических флавивирусных инфекций на уровне организма. Обнаружение феномена ЙЗУР диктует необходимость более тщательного иммунологического изучения, оценки безопасности препаратов (вакцин, специфических иммуноглобулинов), предлагаемых для практического здравоохранения (Gould , 1390 г, и др.).

Таким образом, к антигенам КЗ вируса ЯЭ получены МКА, позволившие их использование для дифференциации штаммов вируса ЯЭ в различных серологических реакциях. Наиболее интересной из гибридом оказалась гибридома, . продуцирующая МКА серии ЭЯ-4. МКА этой серии, являясь вируснейтралиэующими, втаммовоспецифи-ческими, обладали высокой протективной активностью при экспериментальном энцефалите мышей, вызванном представителями обоих иммунотипов вируса ЯЗ. Впервые, in vivo, обнарувен феномен усиления репродуктивной активности вирусов ЯЭ и ВЭЛ-230, опосредованный «таммовоспецифическими антителами, свидетельствующий о необходимости поиска новых средств усиления иммунного ответа в организме вивотных и человека при арбовирусных инфекциях.

IU.ОЦЕНКА ПРОТИВОВИРУСНОЙ АКТИВНОСТИ СТИМУЛЯТОРА АНТИТЕЛО-ПРОДУЦЕНТОВ (МИЕЛОПИДА)

Известные данные о недостаточной иммунологической активности антифлавивирусных вакцинных препаратов и иммуноглобулинов (Gould ,1990), а такве наши данные о ненелательных последствиях, которые могут иметь место при использовании таких препаратов в практике свидетельствуют о необходимости поиска эффективных средств усиления иммуного ответа при флавивирусных инфекциях для обеспечения стабильных показателей невосприимчивости организма к инфекции.

Цель настоящего исследования заключалась в оценке влияния миелопида на гуморальный иммунный ответ и вывиваемость вивотных. заравенных флавивирусами. Ниелопид - стимулятор антите-лопродуцентов, выделяемый клетками интактного костного мозга вивотных. Он представляет собой рибонуклеопротеид с молекулярной массой 13000 дальтон ( Петров Р.В. и др.,1978, Сергеев И.О.. Михайлова А.А.,1978 г.). Функциональная активность данного медиатора иммуной системы характеризуется усилением анти-телообразования на высоте иммунного ответа. Установлено, что прирост антител под влиянием миелопида связан с появлением дополнительного количества антитело^разраих моток в популяции иммунных лимфоцитов. По данным Р.В.Еарова (1985) , миелопид обладает зндорфиноподобйым эффектом, действующим на нервные структуры, составлявшие'антистрессовые системы. Кроме того, он

влияет на меясистемние взаимодействия в процессе передачи информации от иммунной к нервной системе. Его протективная активность связана со стимуляцией локального антителогенеза. действием на антистрессовые системы, влиянием на функциональную активность макрофагов, стволовых клеток и Т-киллеров.

IV.I. Влияние миелопида на продукция противововирусных антител у мышей,зараженных флавивирусами, в условиях острой инфекции,

В связи с тем, что препарат до сих пор не был изучен .при вирусных инфекциях, представляло интерес оценить влияние мие-лопида (прежние названия: СйЛ. В-активин) на гуморальный иммунный ответ у животных, зараяенных различными по патогенности флавивирусами в условиях острой инфекции (табл.13).

» Таблица 13,

Влияние миелопида на выработку противовирусных антител у мывей при острой инфекции, вызванной флавивирусами.

Группа Титры антител к флавивирусам в реакциях

яивот--------------------------------------------------------

лых / КЗ ЯЭ КЗ-Ь ЯЭ Лангат ТР-21

РБН РТГА РБН РТГА РБН РТГА

12 1 112 1 112

-I-

-I-

I 1:10 1,0

II 1:80 2,5

III 1:80 2,0

1:80

1:160

1:320

I I

1:5 н.д1. 1:40 I 1:10 н.д.

1 I

1:40 -"-) 1:80 I 1:40 н.д.

I 1

1:80 -"-I 1:160 I 1:160 н.д.

1:40

1:160

1:320

Примечания: I-титры антител в РБН; г -индекс неттчлнзашш в РБН;I- группа зараженных животных, не получин-иих препарат; II-группа зараженных хипотних, получивших однократно миело-пидна 8 сутки;III - группа животных.получивших препарат трехкратно: по 50 нкг на мышь на 3, 5 и в су тки после заражения.

Исследования сывороток животных на 10-й день после заражения показало, что титры вируснейтрализующих антител в сыворотках мышей контрольной группы были незначительны и колебались в пределах 1:5-1:10, а титры антигемагглютининов составляли 1:40 - 1:80. Однократное внутривенное введение ыие-лопида, как правило, приводило к повышении содержания антител в сыворотке крови животных, причем стимуляция антителообразо-вания была более интенсивной в отношении вируснейтрализующих антител, чем антигемагглвтининовСтитры антител, выявляемых в РБН, возрастали в 4-8 раз, а в РТГА - в 2-4 раза). Суммарная доза миелопида в 150 мкг, вводимая животным, вызывала 8-16 кратное увеличение титров антител (по данным РБН), ив 2-8 раз возрастали титры антигемагглютининов. Индекс нейтрализации сывороток животных, которым вводили препарат, повышался в 20 -30 раз. :' .

Необходимо отметить, что варианты флавивирусов, используемые в этих опытах, значительно различались по иммуногенным свойствам. В предварительных опытах было показано, что наименее иммуногенными вариантами были: вирус ЯЭ, выделенный из хронически инфицированных культур клеток L (K3-L). и штамм ТР-21 вируса Лангат. Следовательно, эффективность препарата кост- ,.-ного мозга была значительно выше в отношении сдабоиммуногенных вариантов флавивирусов. В этих исследованиях были получены дополнительные доказательства о высоких имиуногенных свойствах КЗ вируса ЯЗ, поскольку существенной разницы в увеличении ан- . тителообраэования к этому варианту вируса ЯЗ при одно- и 3-кратном введении препарата не наблюдали.

Использование миелопида в экспериментальных исследованиях позволило сократить сроки иммунизации животных для получения высокотитражных сывороток к вирусу ЯЗ. В частности, было пока- ; зано, что двукратная иммунизация мывей без адъвванта с последующим внутривенным введением миелопида на 12-й день после первой иммунизации уже к 15 див вызывает свработку противовирусных антител в титре 1:640 Сданны„е РТГА),: в то время как максимальные титры антител в сыворотках вывей, получаемых в эти сроки после иммунизации без введения миелопида, но с использованием адъвванта Фрейнда, составляли 1:160, т.е. в 4 раза меньшей концентрации*. • •■ ■' •'.•-■

10.2. Влияние миелопида на продукции противовирусных антител при хронической инфекции и на выживаемость животных, зараженных флавивнрусами.

Для проведения исследований были получены модели хронической инфекции мывей линии Ва1Ь/с и сирийских хомячков, зараженных различными вариантами флавивирусов: КЗ вируса ЯЗ. вариантами вируса ККЗ (втаммы Софьин, Еланцев, вирус Лангат штамм ТР-21), Хроническую инфекцию мышей, зараженных КЗ, наблюдали в течение 205 дней. Препарат в дозе 50 мкг на мышь внутривенно вводили за 2 дня до определения титров антител (табл.14).

Таблица 14.

Влияние миелопида на продукцию вируснейтрализующих антител у мывей, хронически инфицированных КЗ вируса ЯЗ

Группа животных Титры вируснейтрализуювчх антител у мышей в различные сроки (сутки) после заражения

10-е 44-е 205-е

.опытная 1:40 1:40 1:5

контрольная 1:10 1:5 0

Показано, что введение миелопида на 8 и 42-е сутки после индукции хронической инфекции у мыией вирусом ЯЭ приводит к 48 - кратному увеличению титров вируснейтрализуюних антител. Вместе с тем, введение препарата на 203-й день существенно не влияло на продукцию вируснейтрализующих антител у хронически инфицированных животных, что, вероятно, обусловлено особенностями хронической инфекции а мывей, описанными Price (1966). Авторов было показано, что при хронической инфекции мышей вирусом Кьязанурской лесной болезни, персистирующий в организме /■ивотных вирус не нейтрализовался вирусспецифическими антителами, что, вероятно, было обусловлено продукцией в организме -животных вирионов с дефектом в суперкапсидной оболочке .

В следующей серии опытов сирийских хомячков подкожно заражали вирусами ККЭ (Софьин, Еланцев, ТР-21 вируса Лангат) в "оздх, вызывающих развитие хронической инфекции. Каждую группу животных наблюдали в течение 1 мес. На 30 день после заражения внутривенно вводили миелопид по 200 мкг на животное. Через 2 дня после введения препарата в крови животных опытных и контрольных групп определяли уровень противовирусных антител (табл. 15).

Таблица 15

Влияние миелопида на выработку противовирусных антител в организме хронически инфицированных сирийских хомячков

Группа животных Титры антител (обратные значения) к штаммам

Софьин Еланцев ТР-21

Опытная 1024t0 2560i0 1070 i. 199

Контрольная 533 ± 62 266 ¿50 133 ± 25

Наибольший эффект препарата был выявлен при введеннии животным. хронически инфицированным слабопатогенными вариантами ККЭ: Еланцев и Лангат (ТР-21): титры антител в 8-16 раз превышали значения титров вируснейтрализующих антител у контрольной группы животных. & то же время, в условиях хронической инфекции препарат активно стимулировал антителообразование в организме хомячков, хронически инфицированных патогенным вариантом вируса - штаммом Софьин (титры антител в сыворотках животных, получивших препарат, были в 16-32 раза выше, чем у контрольной группы хронически инфицированных животных).

Таким образом, показана стимулирующая активность миелопида на продукцию противовирусных антител и при хронической инфекции животных, вызванной флавивирусами ЯЭ и ККЭ. Впоследствии эти данные получили подтверждение в исследованиях В.Б.Погодиной и соавт.,1989 г. Авторами было изучено влияние миилоЬида на течение персистентной инфекции, вызванной вирусом КЗ, у яванских макак. 'В частности, было показано 25-кратное снижение частоты персис*енции вируса КЗ, резкое ограничение

зон локализации flß, в том числе, и в ЦНС. отсутствие морфологических признаков прогрессирования патологического процесса в ЦНС. •

В связи с тем, что препарат миелопид в большей степени стимулирует продукции вируснейтрализувщих антител, с которыми чаще всего связывают протективную активность при флавивирусных инфекциях, представлялось важным изучить защитные свойства миелопида в эксперименте на животных.

В опытах, когда мышей заражали в головной мозг разный» разведениями вируса ИЗ, было показано, что внутривенное введение миелопида за 3 дня до заражения приводило к снижении титров 93 с 6,0 lß LD50 до 4,6 Ц LD50, что не наблюдали при введении препарата одновременно с заражением мышей вирусом или спустя 3 дня после заражения в той же дозе (100 мкг на мышь). Аналогичные результаты были получены и при внутрибрюиинном заражении мыпей линии Balb/c КЗ в дозе 5.0 lg LD50. На 4-е сутки животным вводили миелопид в вену в дозе"50 мкг на мышь. Результаты этих опытов показали, что животное, получившие препарат, в 95% случаев были защищены от японского энцефалита, в то время как выживаемость мышей в контрольной группе в аналогичных условиях составила всего 50%.

Таким образом, исследования по оценке влияния миелопида на выработку противовирусных антител и выживаемость животных, зараженных флавивирусами, показали перспективность использования препарата для усиления противовирусной активности антител как в условиях острой, так и хронической инфекции, а также для обеспечения большего протективного эффекта противозовирусных препаратов (возможно, в условиях комбинированного использования миелопида и антифлавивирусных вакцин - В.В.Погодина и др., 1989). Эффективность комбинированного использования препаратов для обеспечения протектиной активности представляется существенной, т.к. миелопид обладает способностью в большей степени влиять на продукцию вируснейгрализующих (протективных) антител при флавивирусных инфекциях.

Актуальность использования стимулятора антителопродущ-н-тов при флавипирусной инфекции ЯЗ является несомненной, т.к. этот медиатор иммунного ответа может способствовать иммунокор-рекции в инфицированном организме и. следовательно, во время защитить от заболевания или от осложнений, которые часто связаны со слабим гуноральным ответом.

U. РАЗРАБОТКА КУЛЬТУРАЛЫШЙ ИНАКШИРОВАННОИ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ЯПОНСКОГО ЭНЦЕФАЛИТА.

Несмотря на возрастающую опасность распространения японского энцефалита в странах Юго-Восточной Азии, западного побережья Тихого океана, а также на Дальнем Востоке навей страны, как свидетельствует информация, получаемая ВОЗ, до сих пор окончательно не реиен вопрос о создании высокоиммуногенно-го,экономичного вакцинного препарата против ЯЭ для массовой иммунизации населения в эндемичных районах. Вакцины против ЯЭ много лет используют в странах Юго-Восточной Азии (Уопц-Х1п. 1987: Sakena. 1984). Среди препаратов с наилучшими характеристиками признана во всем мире вакцина, производимая в Японии с 1968 г.на основе штамма "Накаяма" iTakaku, 1968, Gupta и др., 1987; Rao-Bhau и др.. 1988 ). Эта вакцина представляет собой инактивированную формалином фракцию вирионов, полученную путем очистки суспензии головного мозга инфицированных ЯЗ мышей. Хотя эти фракции и были свободны от белков мышиного происхождения, у вакцинированных людей описаны аллергические реакции (Anderson и Rose. 1991). Более того, следует учитывать и относительно высокую стоимость производства этой вакцины и возможную опасность заражения персонала, имеющего дело с большим количеством высокопатогенного вирусного материала ( Gupta и др.. 1991, Konlshl и др..1992).

Трудности в разработке эффективной вакцины против ЯЭ. вероятно, связаны с особенностями биологических свойств природных штаммов (слабая репродуктивная активность в культурах клеток. невысокие антигенные и иммуногенные свойства), иными словами, для разработки препарата необходимо получить в качестве вакциннного штамма иммунологически адекватный вариант с широким спектром антигенных связей (Ханина М.К. и др.,1990).

Задачей настоящего исследования была разработка инактии-ровапной культуральной вакцины против ЯЗ на основе КЗ вируса ЯЗ, биологические свойства которого позволили отнести его к вакцинным штаммам вируса ЯЭ.

К.I.Лпполнительнаа биологическая характеристика КЗ вируса ЯЭ

Ранее било показано, что КЗ вируса !1Э характеризовал! я уникальной способностью вызывать цитодеструкцию фибробластоь куриного эмбриона и активно репродуцироваться в этих культурах (до 10,0-10,5 1в БОЕ/мл, т.е., титры КЗ для этих культур значительно превышали значения титров вируса для других чувствительных к вирусу ЯЭ клеток (ВНК-21, СПЭВ, 464? и др).

Дополнительные исследования показали, что наилучшим способом выранивания КЗ вируса ЯЗ в этих культурах является рол-лерннй (рис.8),

Ьреия (часы) отбора проб дгчя Множественность инфекции

титрования 0 0,1 ВОЕ Э 1,0 ВОЕ

га <0 бое а шоеое

Рис.8.Содержание инфекционного вируса и гемагглвтининов п среде культур фибробластов куриного эмбриона,инфицированных КЗ вируса ЯЗ при роллерном способе выранивания

При заражении монослойних культур ККЗ, выращенных роллер-ным способом, КЗ с оптимальной множественностью инфекции - 10100 БОЕ/клетка, не позднее, чем через 24 часа после посадки клеток, уже через 20-24 часа после заражения в КС содержался инфекционный вирус в титре до 10 1в БОЕ/мл и более. КС содержала гемагглютинины, титры которых достигали 1:256-1:512 при минимальном содержании в среде продуктов клеточного детрита, определяемого в эти сроки, причем в этот же период отмечалась четкая корреляция ГА и инфекционной активностей, выявляемых в КС. Это дало возможность в дальнейшем по содержанию ГА в КС предварительно судить не только о концентрации вируса, но и о пригодности вируссодержавей КС для приготовления вакцины, об иммуногенности экспериментальных серий препарата, поскольку ГА входят в состав оболочечного белка Е вируса ЯЗ. являющегося основным иммунизирующим белком флавивирусов (Бг^агСаиа и др., 1990).

Таким образом, были отработаны оптимальные условия получения вируссодержащего культурального слива, пригодного для приготовления вакцины против ЯЗ. По данным Ы.К.Ханиной и др.. 1930 г., наиболее иммуногенные серии экспериментальной культу-ральной вакцины против ЯЗ были авторами получены из партий, содержащих культуральный вирус ЯЭ в титре более 8,0 1в 1.П50/мл.

и.11.Разработка экспериментальных серий культуральной инактивированной вакцины против ЯЭ,изучение ее свойств.

Оптимальные культуральные свойства КЗ, а именно, его высокая репродуктивная активность в культурах ККЗ, позволяющая в короткие сроки собирать высокий урожай активно гемагглютиниру-ющега вируса,широкий спектр антигенных связей.высокие иммуногенные свойства, низкие показатели нейровирулентности вируса, что важно для обеспечения безопасности персонала, работающего в производственных условиях,легли в основу ¡.азработки простой и экономичной технологической схемы производства культуральной инактивированной вакцины против ЯЗ (табл.16).

.Изучение необходимых параметров, характеризующих безопасность полупроизводственных серий вакцины, проводили по классической схеме оценки безопасности вакцинных препаратов, разработанной для флавивирусных вакцин (И.С.Воробьева и др.,1986).

Таблица 16.

Рекомендуемая технологическая схема производства культураль-ной инактививрованной вакцины против японского энцефалита

NN Необходимое время

пп Этапы производства на каждый этап

1 2 3

1. Трипсинизация куриных эмбрионов .посев клеток на роллерные бутыли (отбор проб для подсчета клеток и для проверки на стерильность)

2. Просмотр культур клеток подмикроскопом для отбора роллерных бутылей,содернащих полноценный монослой клеток.Заранение КЗ вируса ЯЭ

3. Слив культуральной яидкости в одну серии,отбор вируссодериащих проб на стерильность.проверку ГА-активности и ин-фекционности.

4. Инактивация надосадка после центрифугирования слива( 10 тыс об.мин в течении 20 мин) формальдегидом в концентрации 1:2 ООО при 32 С.

5. Отбор проб для изучения безопасности полученных полупроизводственных серий вакцинного препарата,адсорбция на гидроокиси алюминия в соотношении 1:10, розлив,фасовка.

4-5 часов

через 20 -24 . часа

спустя 18-24 часа

в течение 72 часов

2-5 часов

Итого: время, необходимое для приготовления культуральной инактивированной вакцины (без учета тестов на безопасность, иммуногенность, протективную активность) составляет 5 с лишним суток.

В результате исследований показано, что разработанная технологическая схема производства позволяет получать полупроиз

водственные серии вакцины против 93, которые отвечают всем требованиям безопасности, заложенными в рекомендациях М.С.Воробьевой и др.,1986, и ВОЗ (1990).

Иммуногенность полупроизводственных серий инактивирован-ной вакцины против ЯЗ и коммерческой вакцины против ЯЗ (фирма "Toshiba, Япония) проверяли на мышах массой 18-20 г.. которым препарат вводили по следующей cxete: в первый день - по 0,2-0, 4 мл внутримышечно и во 2-й день - внутрибрюшинно по 0,2 мл каждого из двукратных разведений вакцины.

Таблица 17.

Сравнительные показатели иммуногенности коммерческой и экспериментальной серий вакцины против ЯЗ для белых мышей.

Вакцина

Разведения

вводимого через 2 недели препарата

через 3 недели после вакцинации

при 1 по

ЯЗ РБН (lg) РТГА РБН (lg) РТГА

Автор- 1 2 5,0 1:160 5.0 1:160

ская

серия НоЮ 1 4 4,5 1:320 4.6 1:80

с сорбентом

1 8 4,5 1:160 3,6 1:40

Автор- 1 2 5,0 1:160 5.0, 1:160

ская серия

NolO без 1 4 5,0 1:80 4.0 1:80

сорбента

1 8 3.0 1:80 3,5 1:20

Вакцина 1 2 0 1:10 2,2 1:10

фирмы

"Toshiba" 1 4 0 1:40 2,0 < 1:10

(Япония)

1 8 0 1:10 1.5 < 1:10

Примечание: Результаты РБН приведены в виде индекса нейтрализации

На 14 и 21-25-е дни после второй иммунизации у животных брали кровь и в серологических реакциях определяли уровень ви-русспецифических антител в сыворотках: при этом в качестве тест вируса и его антигенов использовали штамм ДВК-4 вируса ЯЭ, выделенный на территории Приморского края России.

Результаты, приведенные в табл.17, свидетельствуют о том, что к 21-у дню после последней вакцинации у мышей накапливались антитела в высоких титрах: как вируснейтрализующие, способные в 10 ООО раз и более снижать цитопатогеннпуа активность вируса ЯЭ, так и антигеыагглютининн. Сколько-нибудь существенных различий не было отмечено в случае, если в качестве тест-штамма использовали изологичнчй вариант вируса ЯЭ - ДВК-4.

Аналогичные результаты были получены и в опытах, когда сыворотки от вакцинированных мыией исследовали спустя 2 недели после второй иммунизации (табл.17). В этом случае также были обнаружены высокие иммуногенние свойства препарата, сорбированного и не сорбированного гидроокисью алюминия.

Таблица 18

Характеристика экспериметальных серий вакцины против ЯЗ через год после хранения

NNo Стериль- Безопас- Токсич- рН Иммуноген-

серий ность ность ность ность*

вакцины

9

стерильна безопасна нетоксична 7,2 4,0/20

10

да

да 7,4 4,4/20

11

да

да

да 7,2 4,8/40

ЮС без

сорбента) да

да 7,2 4,0/20

Обозначения: * - отношение показателей индекса нейтрализации и титров антигемагглютининов в обратных величинах.

Показано также, что иыыуногенность полученных полупроизводственных серий вакцины сохранялась и через год хранения препаратов при 4 С (табл.18). Полученная таким способом куль-туральная вакцина, по данным серологических реакций: РБН и РТГА, оказалась более иммуногенной, чем коммерческий препарат фирмы "Toshiba", что, возможно, связано с более длительным сроком хранения последнего.

Учитывая тот факт, что индукция вируснейтрализующих антител и антигеиагглвтининов у иммунизированных вакциной против ЯЗ животных является основным, но не единственным фактором защиты от летального энцефалита, представляло интерес изучить репродукцию вируса ЯЭ в головном мозге вакцинированных животных при подкожном их заражении вирусом ЯЗ в дозе 4 — 5 1 в БОЕ через 2 недели после вакцинации. Необходимость постановки таких опытов диктовалась и тем, что в коллекции лаборатории нет штаммов вируса ЯЗ, способных вызывать заболевание и гибель мышей кассой более 20 г при подкожном или внутрибрюшинном введении вируссодержащего материала.

Кроме того, была исследована протективная активность сывороток от вакцинированных мышей в опытах In vivo. При этом сыворотки вводили внутривенно свежей партии мышей за 24 часа до подкожного заражения вирусом ЯЭ. В обоих случаях головной мозг животных извлекали на 4-5 дни после заражения, и полученную суспензию титровали в культурах клеток СПЭВ (рис.9).

Рис.9. Репродукция вируса ЯЭ в головном мозге милей, иммунизированных вакциной.

Примечание: аивотных иммунизировали авторской вакциной с сорбентом и (10 б/с) без сорбента.

Полученные результаты показали высокую протективную активность вакцины и сывороток от вакцинированных яивотннх для мышей. В ряде вариантов опыта репродукция вируса ЯЭ в головном мозге инфицированных животных полностью подавлялась при иммунизации вакциной в разведении 1:8. Данные этих экспериментов, вероятно, свидетельствуют в пользу ведущей роли гуморального иммунитета в подавлении репродукции вируса ЯЭ в головном мозге мышей. Кроме того, приведенные в табл.19 результаты изучения протективной активности вакцины и сывороток от вакцинированных высокими разведениями препарата аивотных позволили сделать вывод об отсутствии феномена АЗУР вируса ЯЭ у вакцинированных мышей авторскими сериями вакцины, что также свидетельствует в пользу разрабатываемого препарата. Следует отметить более низкую протективную активность вакцины фирмы*"Toshiba" и сывороток от вакцинированных этим препаратом животных, что совпадает с результатами изучения ее иммуногенной активности.

В опытах на животных и культурах клеток получены данные, характеризующие культуральрнуш инактивированную вакцину как препарат, отвечающий требованиям безопасности, предъявляемым к аакцинным препаратам.

Таким образом, разработана эффективная, экономичная культурал^ная вакцина против японского энцефалита на основе антигенноактивного, высокорепродуктивного авторского штамма -КЗ вируса ЯЭ и первичных культур клеток 9-дневных куриных эмбрионов, характеризующаяся высокой иммуногенностьш, протективной активностью, отвечающая требованиям безопасности в опытах на животных.

Получены результаты, свидетельствующие о возможности использования КЗ вируса ЯЭ и культур клеток куриного эмбриона для приготовления высокоимлуногенных протективных препаратов против ЯЭ, что не требует дорогостоящего оборудования для производства безопасной вакцины. Использование слабопатогенного варианта- КЗ вируса ЯЭ для производства препарарата позволяет значительно уменьшить риск инфицирования персонала, работающего с большим количеством инфекционного материала.

UI.ОЦЕНКА ВОЗМОВНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ПРЕПАРАТОВ РНК КЗ ВИРУСА ЯЗ ДЛЯ ГЕННО-ИН1ЕНЕР1ШХ ИССЛЕДОВАНИИ

Несмотря на то, что вакцинные препараты против ЯЭ и других флавивирусных инфекций успешно разрабатываются с использованием традиционных методов технологии, существует настоятельная потребность в разработке новых, лучшего качества вакцин, в частности, генно-инженерных, полученных методами рекомбинант-ной технологии (Brandt,1988). Вот почему в последние годы внимание исследователей привлекает проблема разработки реконби-нантных вакцин против ЯЗ. Показано, что такие вакцины, способные к синтезу внеклеточных частиц,содержащих вирусспеци-Фические белки рг М/М и Е, обеспечивают индукции высокоактивных нейтрализующих антител и антигемагглютининов и защищают от летального энцефалита, вызванного флавивирусами (Е. Konishl и др.,1992).

Успех в разработке вакцин второго поколения против ЯЗ и других флавивирусных инфекций, основанных на экспрессии белков - иммуногенов, может быть обеспечен в случае, если в генно-инженерных исследованиях будут использоваться препараты высокомолекулярной РНК флавивирусов. Способность КЗ вируса ЯЭ активно размножаться в первичных культурах клеток куриного эмбриона и накапливаться в среде культур в высокой концентарции позволяет считать этот штамм вируса наиболее перспективным для получения очищенных препаратов высокомолекулярной РНК, пригодной для проведения генно-инженерных исследований, в частности, для конструирования рекомбинантных плазмид, содержащих вирусспеци-фические последовательности генома вируса ЯЭ.

UI.I.Получение препаратов высокомолекулярной РНК КЗ вируса ЯЭ.

Основной целью данного раздела работы была отработка оптимальных условий для получения препаративных количеств РНК КЗ вируса ЯЗ, В этой связи важно было подобрать необходимые параметры для накопления вируса, его концентрации и очистки (табл. 19).

Таблица 19.

Основные параметры, характеризующие вирус ЯЗ (КЗ) до и после концентрации и очистки вируссодержащей культуральной жидкости

Время отбора проб Титры вируса ЯЗ (средние величины)

В культуральн.жидкости После осаждения ПЗГ

в супернатанте в осадке

1й БОЕ/мл РГЙ 18 БОЕ/мл РГЙ 1дБОЕ/мл РГЙ

24 часа 31 часа 48 часа 8.0-9.0 7,8-8,5 7,5-8,0 1/74 1/157 1/22 * 0—1.5 0 10,0-10,5 0 0 10,0-10,5 0-1,5 0 9,0- 9.3 1/4000 1/5000 1/2000

Показано,что при роллерном выращивании КЗ вируса ЯЗ в культурах ККЭ оптимальным сроком для отбора КС является 24 часа; именно в эти сроки титры вируса достигают своего максимального значения (9,0 БОЕ/мл и более) при незначительных явлениях цитодеструкции монослоя, целостность которого сохраняется. Обработка КС полиэтиленгликолем (мол.м.6 ООО) до конечной концентрации 8У. в течение ночи при +4 С с последующим центрифугированием при 10 ООО об/мин (30 мин) приводила к значительной концентрации вируссодернащего материала как по инфекционное™, так и Гй-активности (табл.20). При этом в супер-натанте не выявляли ГЙ-активность и значимых величин инфекционных титров вируса ЯЗ. Очистка концентрированных препаратов вируса ЯЗ путем градиентного центрифугирования в 20-60 У. сахарозе на буфере БТЕ показала, что использование вируссо-деряацей КС. отобранный через 31 и 48 часов для этих целей, приводит к деградации вируса ЯЗ (снижение инфекционности, раз-руление вирионних белков), что не позволяло выделить препараты высокомолекулярной РНК вируса ЯЗ.

В результате проведенных исследований были подобраны оптимальные условия для получения препаративных количеств высокомолекулярной РНК вируса ЯЗ. а именно; а) сроки сбора вирус-

содержащей КС были ограничены до 24 часов; б) обеспечение непрерывности процесса очистки и концентрации вируса и немедленного выделения РНК на холоду (+4 С); в) время градиентного центрифугирования было сокращено до 5 часов. Это позволяло получать интактный вирусный материал в титре 10.01b БОЕ/мл и более, с ГА-активностью до 1/4096, а методом электрофореза в ПА-АГе выявлять белок с м.м., равиой белку Е (58-60 кд) вируса ЯЗ.

Подбор оптимальных условий для концентрации и очистки вируса ЯЭ давал возможность экстрагировать с помощью фенол-хло-роформенного метода из очищенного вируса высокомолекулярную РНК, что подтверждалось анализом ее методом электрофореза в агарозном геле. Известно, что РНК вируса ЯЗ является инфекционной: это свойство было использовано для изучения активности полученных препаратов РНК. В частности, было показано, что полученный таким образом препарат очищенной РНК КЗ вируса ЯЭ, введенный в головной мозг мышей-сосоунков в первоначальном количестве 0,5 мкг, вызывал заболевание по типу энцефалита и гибель животных в условиях высоких его разведений: до 10- 100 нлн раз. Как правило, из головного мозга инфицированных РНК больных мыией-сосунков выделяли зрелый инфекционный вирус ЯЭ, по своим свойствам неотличимый от КЗ вируса ЯЭ.

Таким образом, получены данные, свидетельствующие о пригодности КЗ вируса ЯЭ для получения препаративных количеств высокомолекулярной РНК.

VI.2.Получение рекомбинантных плазмид, содержащих последовательности генома КЗ. Рекомбинантные плазмиды были получены в совместных исследованиях с группой ведущего научного сотрудника Института молекулярной биологии им. В. А. Знгель-гардта ЙН РФ докт. биологических наук Ю.В.Козлова. Синтез кДНК проводили с использованием высокомолекулярной РНК вируса ЯЭ, синтетической олигонуклеотидной затравки, комплементарной С-концевой области оболочечного белка Е и планцентарного ингибитора рибонуклеаз. Однонитевые концевые участки комплементарной копии достраивались с помощью ДНК-полимеразы Фага Т-4. Актирование осуществляли по Sma 1 сайту в векторе pUC-18. Трансформацию клеток E'.coll и скрининг полученных клонов проводили по Наниатису. Для идентификации вставок использовали рестрикционный анализ.

В результате было отобрано несколько клонов, содержащих вставки генома КЗ и, таким образом, сконструированы три реком-бинантныв плаэмиды: pUС JE 221 длина вставки 2200 оснований), pUC JE 12 (в 1200 оснований), pUC JE02 С 200 оснований).

Наииольаий интерес представлял клон со вставкой генома вируса ЯЗ в 2200 пар нуклеотидов, которая охватывает область, соответствующую структурным белкам С, pre И. М, Е и часть неструктурного белка NS1 генома вируса ЯЗ. .

Данные, характеризующие рекомбинантную плазииду pUC 22, позволяют рекомендовать ее использование для конструирвания генно-иняенерной вакцины против ЯЗ.

Развитие методов генной инжененрии в настоящее время позволяет разрабатывать высокочувствительные методы прямого определения вирусспецифических последовательностей генома вируса ЯЗ в клиническом материале и в комарах-переносчиках вируса ЯЗ, Одним из таких методов ускоренной диагностики вирусных инфекций является метод точечной гибридизации нуклеиновых кислот с помощьв молекулярных зондов. Получение плазмид, содержащих последовательности генома вируса ЯЗ, позволило на их основе сконструировать молекулярные зонды, меченные фосфором, и провести апробации метода точечной гибридизации для индикации последовательностей генома вируса ЯЗ в различных биосистемах. Показана принципиальная возможность использования молекулярных зондов для индикации вирусспецифических последовательностей в материале, содержащем вирус ЯЗ. Учитывая простую технику постановки метода, не требующего дорогостоящего оборудования, метод молекулярных зондов может быть успешно использован в полевых условиях при изучении очага японского энцефалита, В этих условиях наиболее удобным является использование молекулярных зондов, меченных биотином.

*

Таким образои, из хронически инфицированных культур клеток головного ыозга мышеГ.-сосунков выделен втаым вируса ЯЗ. КЗ, биологические свойства которого позволили успешно использовать вирус для изучения основных закономерностей острой н персистентной инфекции культур клеток . изучить факторы, участвующие в механизме длительного вирусоносительства 1л vitro, получить с его помощьв высокоактивные моноклональныв антитела, пригодные для идентификации протективных белков вируса ЯЗ. разработать диагностические и профилактические препарат.

ВЫВОДУ

1. Длительная персистенция флавивирусов японского и клещевого энцефалитов в культурах клеток различного происхоа-дения приводит к изменению биологических свойств вирусов, характеризующихся как фенотипической модификацией, так и стабильными изменениями генотипа. Персистирувщие флавивирусы приобретают новые патогенные, культуралыше. антигенные и др. свойства.

2. Впервые из хронически инфицированных культур клеток головного мозга мышей-сосунков выделен мутант вируса ЯЭ, клон N0 3, биологические свойства которого (высокая репродуктивная активность в клетках куриного эмбриона, вирокий спектр антигенных связей, снияенная нейровирулентность, высокая имиуно-генная активность) позволили рекомендовать его в качестве кандидата в вакцинные штаммы.

3. Получена модель длительной инфекции культур перевиваемых клеток 1923, вызванной КЗ вируса ЯЗ. Впервые показано., что персистенция вируса ЯЗ в культурах клеток I. в зависимости от длительности взаимодействия вируса и клетки, мовет характеризоваться как хроническая, персистентная и латентная инфекция с присущими для кавдой стадии особенностями.

4. Оценка роли клеточных и вирусных факторов в реализации механизма длительного взаимодействия вируса и клетки в системе Ь-ЯЭ, позволила впервые обнарчкить участие многофакторного механизма в поддернании вирусоносительства: интерферона - на стадии хронической инфекции. ДИ-частиц - на стадии персистент-ной инфекции и - мутантнов вируса ЯЭ - на стадии латентной инфекции. Обнарунено их взаимное влияние на состояние вирусоносительства системе Ь-ЯЭ в течение всего периода наблюдения.

5. Выявлены общие закономерности изменчивости персистиру-ющего вируса ЯЭ в системе Ь-ЯЭ (сниаение нейровирудентности для экспериментальных вивотных, изменение антигенных, культу-ральных и других свойств). Показана высокая визнеспособность хронически инфицированных клеток Ь. способных в послешоковый период к активной пролиферации и продукции вируса ЯЭ.

6. Впервые выявлены условия, способствующие активации ла- -тентного вируса ЯЗ в сягтеме Ь-ЯЭ. Показано, что при инкубации латентно инфицированных клеток 1-ЯЭ при непермиссивной темпе-. ратуре 129 С) происходит активная репродукция 1Ш ЙЭ в системе.

7, Получено 7 гибридом, продуцирующих моноклональние антитела к антигенам персистирующего вируса, КЗ вируса ЯЗ. изучены их серологические свойства, отработаны условия получения высокотитравных асцитных препаратов гибридом.

8. [,первые получена гибридома ЭЯ-4, продуцирующая вирус-нейтрализующие, штаммовоспецифические МКЙ к белну Е КЗ вируса ЯЗ. Это позволило использовать МКЙ ЭЯ-4 для дифференциации КЗ от других вариантов вируса ЯЗ. Обнаружена высокая протективная активность МКА серии ЭЯ-4 при экспериментальном энцефалите мы-вей, зараженных как гомологичным (КЗ), так и изологичным (штамм Джагар 01) вариантами вируса ЯЗ.

9. Впервые 1п «1уо, при энцефалите мышей, вызванном вирусом ЯЗ и штаммом 230 вируса В3/1, выявлен феномен усиления репродуктивной активности вирусов СНЗУР), опосредованный МКЙ ЭЯ-4 и МКЙ серии 226, к антигенам вирусов ЯЭ и ВЭ/1 соответственно. Показано,что феномен АЗУР может привести или к длительной нелетальной продуктивной инфекции, или к повышению заболеваемости и гибели инфицированных животных.

10. Впервые при флавивирусных инфекциях экспериментальных животных показана способность препарата костного мозга животных (миелопида) стимулировать антителообразование у животных и защищать их от летального энцефалита. . Обнаружено, что внутривенное введение миелопида животным на высоте иммунного ответа приводит к с.тимуляции в большей степени вируснейтрализующих (протективных) антител, чем антигемагглютининов.

11. Показана возможность использования авторского штамма - КЗ вируса ЯЗ для разработки культцральной инактивированной вакцины против ЯЭ. Полученные полупроизводственные серии вакцинного препарата против ЯЗ характеризовались высокими иммуно-генными и протективными свойствами. Разработан метод, позволяющий проводить предварительную экспресс-оценку иммучогенности вакцинного препарата.

12. Отработан метод получения препаративных количеств высокомолекулярной РНК КЗ вируса ЯЭ; на основе препаратов РНК КЗ вируса ЯЗ сконструированы три рекомбинантные плазмиды, содержащие кДНК-вставки генома вируса ЯЭ. Показано, что рекимби-нантная плазмида р11С ЗЕ 22 содержит последовательности,кодирующие структурные белки вируса ЯЗ(С. рге Н, М и Е) и может быть рекомендована для конструирования генно-инвенерной вакцииы против ЯЭ.

13. Впервые на основе плазмиды р!)С Я 22, содержащей вставку генома вируса ЯЗ (КЗ), получены ДНК-зонды и разработан метод точечной гибридизации нуклеиновых кислот для индикации последовательностей генома вируса 33 в исследуемом материале.

СПИСОК работ, опубликованных по материалам доклада

1.Cavrllov U.1.. Deryabin P.G.. Bojoaolova N.N., Andzhaparldze 0.6. Properties of transfected strains of , tick-borne encephalitis virus, flrch. of ees. Virusforschune, 1974, 46. 248-252.

2. Дерябин П.Г., Гаврилов В.И., Логинова Н.В. Персистентная инфекция культур клеток ПЭС вирусом японского энцефалита. Сб." Сжеванные и хронические вирусные инфекции", У., 1975, 4246.

3. Гаврилов В.И., Дерябин П.Г., Вданов В.И. Биологические свойства вариантов вируса КЗ, выделенных при трансфекции. Вопр.вирусол., 1975, 42-46.

4. Гаврилов В.И.. Дерябин П.Г,. Еданов В.М. Возможное взаимодействие онкогенных и инфекционных вирусов. Сб. "Вирусы рака и' лейкоза", И.. 1976. 149-158.

5. Михайлова Г.Р., Дерябин П.Г. Цитогенетическов исследование культур клеток головного мозга мыией-сосунков в условиях пер-систентной инфекции. Цитология и генетика. 1976. 6, 532-534.

6. Гаврилов В,И., Чередниченко D.H., Дерябин П.Г. Персистентная инфекция культур клеток ПЭС. вызванная вариантом вируса КЗ. Вопр. вирусол.. 1977, 3, 274-278.

7. Михайлова Г.Р., Дерябин П.Г. Влияние персистенции некоторых Флавивирусов на кариотип перевиваемых клеток. Вестник АМН СССР. 1977, 7. 52-55.

8. Астахова A.B., Дерябин П.Г., Богомолова H.H. Хроническая инфекция клеток вирусои клещевого энцефалита. Дополнительная характеристика провируса. Вопр. вирусол., 1977, 6, 707-712.

9. Логинова Н.В., Зуев C.B., Чередниченко В.Н., Дерябин П.Г. Моделирование хронической инфекции для изучения механизмов персистенции вируса ЯЭ в системе HeLa-Кз. Сб. "Экология вирусов", 1980, 67-71.

10. Loclnova U.U.. Deryabin P.S. Chronic infection of HeLa cells ulth Japanese encephalitis virus. Acta vlrol., 1980, 24. 399-405.

11. Лебедева Г.п., Дерябин П.Г., Логинова Н.В. Моделирование хронической инфекции куяьтур клеток головного мозна сосунков

сирийских хомячков. вызванной вирусом клещевого энцефалита. Вопр. вирусол., 1981, 6, 731-735.

12. Урываеэ Л.В., Параспк H.A., Дрынов II.Д., Дерябин П.Г. Феноменология и механизмы хронических тогавирусных инфекций п перевиваемых клеточных линиях. Сб. "Арбовирусы", tí., 1981, 6572.

13. Дерябин П.Г., Лебедева Г.А., Логинова 11.В. Взаимосвязь некоторых биологических свойств флавивирусов в условиях персистенции. Сб." Арбовирусы", П., 1991, 68-72.

14. Лебедева Г.А., Дерябин П.Г.. Логинова Н.В. Вняление потенциальной способности флавивирусов к персистенции. Сб. "Акт. вопр. иымунопроф. вирусн. и бакт. инфекций", 1981, Томск. 20-21.

15. Дерябин II.Г., Логинова Н.В.. Уркваев Л.В. Персистенция вируса японскою энцефалита в клетках L 929. 1. Общая характеристика системы. Вопр.вирусол., 1982, 5, 61-66.

16. Дерябин П.Г., Логинова Н.В,, Свынникова H.A., Родова М.Б. Нариологическая характеристика клеток L и идентификация в ли;: персистирунщего вируса японского энцефалита. Вопр.вирусол., 1982, 1. 48-53.

17. Дерябин П.Г..Логинова Н.В. Механизмы персистенции вируса японского энцефалита в культурах клеток L 929. Сб. "Акт. вопр. иммунопроф, вирусн. и бактер. инфекций", 1981, Томск, 22.

18. Deryahln Р.Б., Diet L.v.,Sak L.v, Pho о ng-phap chan Joan nhanh not о dich chua го nguen nhan. Hoc. Yap thai Khao, 1981, Ханой, 31, 46-51.

19. Deryabln P.S.. H.v.Nhe, L.v.Diet, Ph.X.Ninh. Hot so van de tronfi nghlen gu u о dich vlen Nao do ve.Hoc Tap Than Khan, 1981 4. 34. 20-23.

20. Дерябин П.Г. Логинова Н.В,, Михайлова A.A., Сергеев lö.O. Влияние костномозгового стимулятора антителопродуцентов на выработку вирусспецифических антител и выживаемость гивэтних,зараженных флавивирусаыи. 1 Всесовзн, конференция "Теоретическая и прикладная инфекционн. иммунология". М., 36.

21. Петров Р.В., Дэрябин П.Г., Сергеев В.О.. Логинова Н.В. Влияние костномозгового стимулятора антителопродуцентов на выработку вирусспецифических антител у животных,зараженных Фла-вивирусами, SM3K, 1983, 10. 67-71.

22. Дерябин П.Г., Логинова II.В., Сергеев И.О. Влияние костномозгового стимулятора антителопродуцентов на выработку рирусспецифических антител в организме инфицироваиннх кивот-ных. Иммунология, 1983, 6, 30-32.

23. Урываев Л.В., Дерябин П.Г., Тазулахова Э.Б.. Логинова Н.В. Персистенция вируса японского энцефалита в клетках L 929. Корреляция вирусных и клеточных фактиров.Вопр.вирусол., 1984, 1, 74-79.

24. Дерябин П.Г., Логинова Н.В. Варианты вируса японского энцефалита, характеризующиеся полезными для практического использования свойствами. Сб. "Арбовирусы", 1984, Таллин, 43.

25. Логинова Н.В., Дерябин П.Г. Функциональная характеристика белков флавивирусов.' Антигенные детерминанты. "Вирусология", Мед. реф. яурнал, 1985, 9, 11-16.

26. Дерябин П.Г., Логинова Н.В., Лебедева P.A., Новохатский А.' С., Малахова И.В.. Моноклональные иммуноглобулины к вирусу японского энцефалита в асцитных препаратах гибридом. Антибиотики и медиц. биотехнология, 1986, 1, 24-28.

27. Новохатский A.C., Малахова И.В., Логинова Н.В., Дерябин П. Г., Лебедева P.A., Алешкин В.А. Моноклональные иммуноглобулины к антигенам вируса японского энцефалита. Вопр.вирусол., 1986, 314 -318.

28. Дерябин П.Г., Лебедева Г.А., Тихомиров Е.Е., Логинова Н.В.. Новохатский A.C. Характеристика моноклональных антител к вирусу японского энцефалита. Сб. "Акт. вопр. общей и ыедиц. вирусол.", 1986, 147-149.

29. Логинова Н.В., Дерябин П.Г., Дебедева Г.А.. Буйницкая О.Б. Латенция вируса японского энцефалита в организме млекопитаю -щих, 1986, 147-149.

30. Дерябин И.Г., Лебедева Г.А., Логинова Н.В. Реакция нейтрализации тогавирусов на мышах и культурах клеток. Сб. "Арбови-русы", 1986, 120-126.

31. Сергеев D.O., Дерябин П.Г. Стимуляция противовирусного иммунитета у экспериментальных нивотных В-активином. Сб. "Механизмы иммуностимуляции", Киев, 1985, 205.

32. I.oginoya К.U, Deryabin P.G., Lebedeva G.A. Latency of Japanese encephalitis virus in mammals. Epidemiological signif. Sov. Bed. Reu. Б: Uirol., 1988, 3. 103-118.

33. Логинова H.B., Лебедева Г.А.. Деменев А.Н., Дерябин П.Г.

Применение реакции нейтрализации в лабораторной диагностике флавивирусных инфекций. Вопр.вирусол., 1 990, й, 115-110

34. Логинова Н.В., Евтеева H.H., Рупасова H.H., Дерябин П.Г., Курманова А.Г. Получение высокомолекулярной РНК вируса японского энцефалита для разработки метода точечной гибридизации. Сб. "Экологил вирусов и диагностика арбовирусних инфекций". М. , 1989, 53-59.

35. Дерябин П.Г. Реакция нейтрализации на нивотных и клеточных культурах. Сб. "Выявление циркуляции арбовирусов, методы вирусологических и серологических исследований".,И.. 1991 , 50-5fi.

36. Логинова Н.В., Дерябин П.Г. Варианты вируса японского энцефалита,полезные для практического использования. Сб. трудов Ин-та им.Н.Ф.Гамалеи, М. 1990 'г..вып.35, ч.2, 172-177

37. Дерябин П.Г., Логинова Н.В, Разработка культуральной инак-тивированной вакцины против японского энцефалита. Сб. "Арбовирусы и арбовирусные инфекции", 1992, М,,Итоги науки и техники,вирусол., 27,ч,1, 151-159.

38. Losinova N.U., Deryabln.P.G., Lebedeva. G.A..Latency of J EU In different tissue cultures. Third International Positive Strand RNA Syup.,1992,USA.27.

39. Locinova N.Ü., Deryabin P.G. Stable attenuated variant of 3EU. Third intern, posit, strand RNA Syup.. 1992,USA,29.

40. Втамм гибридных мышиных клеток, ЯК 181, продуцирующий ио-ноклональные антитела к вирусу японского энцефалита. A.C. Но— вохатский, Малахова И.В., Логинова Н.В.. Дерябин П.Г., Лебедева Г.А. Авторское свидетельство СССР No 1212044 - Н., 1985 г.

41. Штамм вируса японского энцефалита. используемый для приготовления диагностических и профилактических препаратов. Дерябин П.Г., Логинова Н.В. Авторск. свидетельство СССР. Поло-зительное решение No 4843422/ 13 /1990 г.

- äyucM/gi ¿,гггЖк4 Sa*? е&е* и- ,VO