Молекулярно-биологический и иммунохимический анализ вирусспецифических белков и надмолекулярных структур вируса клещевого энцефалита

Ляпустин, Виктор Николаевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-биологический и иммунохимический анализ вирусспецифических белков и надмолекулярных структур вируса клещевого энцефалита
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-биологический и иммунохимический анализ вирусспецифических белков и надмолекулярных структур вируса клещевого энцефалита"

РГ6 од

5 ' НЮЛ Щяш.

АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

ИНСТИТУТ ПОЛИОМИЕЛИТА И ВИРУСНЫХ ЭНЦЕФАЛИТОВ

ЛЯПУСТИН Виктор Николаевич

МаТЕКУЛЯРНО-БИОДОГИЧЕСКИИ И ИШНОХИМИЧЕСКИИ АНАЛИЗ ВИРУССПЕЩШЧЕСКНХ БЕЛКОВ И НАДМОЛЕКУЛЯРНЫХ СТРУКТУР ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА

(03.00.06 - вирусология)

диссертация ва соискание ученой стелена доктора биологических наук в форые научного доклада

На правах рукописи УДК 578.833.26

МОСКВА

1993

Гавота выполнена в лаборатории молекулярной биологии вирусов Института полиомиелита и вирусных гнцефглктов Российской АМН.

Научный консультант: -член-ворреспонцент РАМН,

доктор медицинских наук, профессор В.А.Лапкевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор A.A.Кущ

доктор медицинских наук,

профессор

М.С.Воробьева

доктор медицинских наук,

профессор

Л.Б.Эльберт

Ведущая организация: Государственные НИИ стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича МЗ РФ

до

Запзгге состоится " АУЛ Я 1993 г. е !0,00 часов нл заседании специализированного совета Д.001.27.01 при Институту полиомиелита и вирусных энцефалитов Российской АМН но адресу: 142782, Московская область, Ленинский район, п/о Институт полиомиелита.

С диссертацией мсгно ознакомиться в библиотеке Института полиомиелита и вирусных анцефа.штов Российской АМН. Научный доклад разослан апреля 1993 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук

(О.А.Медведяина)

стр.

ОСЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ 2

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 6

I. ИЗУЧЕНИЕ СИНТЕЗА И К.МУНОХИШЧЕСКИХ СВОЙСТВ

ВКРУССПЕЦИФИЧЕСКИХ БЕЛКОВ ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА 6

1.1. Идентификация синтеза вирусных Оелков

п культуре клеток 8

1.2. Закономерности синтеза Оелков в Сесклеточных

системах, программируемых вирнонной ГНК 12

1.3. Сравнительный анализ электрофоретической подешености вирусспецифичесгагх Оелков флавивирусов 16'

1.4. йшунохшягческие свойства

взфусспецифпческих белков 18

1.5. Заключение 20

',. АНАЛИЗ АНТИГЕННЫХ СТРУКТУР ЕИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА 2?.

2.1. Способы выявления и шалунохимические свойства в:фионного и невирконного антигенов 24

2.2. Закономерности осаядения антигенов по.таэтилегггликолен 27

2.3. Сединентащгснные п хромзтографические хзрактеристшш антигенных препаратов в:фуса клегдевого энцефалита 30

2.4. Исследование состава вирионного

и невирионного антигенов .32

2.5. Электроннокикроскопический анализ

антигенных структур 35

2.6. Оценка иммунологических свойств

препаратов невзгрионного антигена 36

2.7. Заклшение _ 41

. ОСОБЕННОСТИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА С ЧУБСТВИТЕЛЬНЬЗД! КЛЕТКАМИ 42

3.1. Репродукция вируса клещевого энцефалита

в культурах клеток ылекопитаицих 42

3.2. Изменчивость вируса при пассировании через

иксодовых 1аещеи и мелких млекопитающих 45

3.3. Згшшченив 47

ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИИ 49

4.1. Использование встречного гашуноэлептрофореза

для диагностики клещевого энцефалита 4Р

4.2. Примеиеше ракетного икиуно-злектрофореза для анализа вкусных препаратов, инактивированрых формалином 50

4.3. Использование оарьерного электрофореза

для очистки Еирусных препаратов 51

4.4. Закличение 53'

ПВО ДЦ 54

ЙСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДОКЛАДА 56

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Развитие исследований флавивирусов в значительной степей связано с примйнекиви новъи научных методов, Олагодарл которым был; долучгна существенная информация о природе флавивирусов. Вогникл новое направление в исследовании флавквирусных инфзкций, заключаю дееся в изучении репродукции флавивирусов к свойств флавивирусны структур с помощью молекудярно-Оиологических, биохимических, био физических, инмунохимических и генно-иняенерных методов с цель усовершенствования методов борьбы с этой группой тяжелых икфекцион ш заболеваний.

В данной работе представлены результаты экспериментальных иссле • дований по указанному направлению изучения флавквирусных инфекций.

Актуальность проблемы.

Вирус КЭ1 ■ является широко распространенным икфекциошп агентом, принадлежащим к подгруппе флавивирусов, переносит клещами. Эта подгруппа антигенно значительно отличается от друп флавивирусов, большая часть которых переносится друга членистоногими - комарами. Если в отношении' вируса КЭ к нача восьмидесятых годов публикаций молекулярно-Оиологического характе практически не было, то в отношеош других флавивирусов кнформац была достаточной, чтобы определить ряд направлений исследсвани ' актуальных, в ой^ебиологкческсм плане и важных для решения вопрос диагностики и профилактики этой группы инфекций.

Одним из направлоний являлось изучение вярусспецгфтас* синтезов в зараженных клетках. Было установлено, что в ходе флаг

- В дальнейшем использовгны следувиие сокращения:

Вирусы: 1Л - желтей ляхерадки; ЗН - Западн^й Нил; KJiE - кео( нурской лесной .болезни; КЭ - клешевого янцефалнта; ОГЛ - Оме: геморрагической лихорадки; ШЭО - шотлавдекого энцефаломиелита obi Эда - энцефалита долины Муррей; ЭСЛ - энцефалита Сан-Луи; fíe японского энцефалите.

Антигены: ВЛ - вириошшй антиген; МСГА - медленноседимен руиций антиген; НА - незирионный ("рэствориксй") антиген.

йммунохлмичёские и серологические гето.ды: БЮФ, P¡Í35 и СИЗ Естречнай, ракетный и слитный имнуноглектрофорезы; Ш,! - ш.муноф ментный метод; РДПД, РСК и PITA - реакции диффузионной прзципита в агаре, связывания комплемента и торможения геыагглютинации.

культуры клеток: КПЗМ - почек зеленой мартышки; ПЭС - пс эмбриона сеиньи; ФЭК - фибробластов эмбрионов кур.

Реактивы: ДСН - додецилсусьф^т нзтшя; ПЭГ - полизтиленглиг 6000; ЦГИ - циклогексиыид.

Другое обозначения: ГА-активност.ь - гемагглютинирушдая ara ность; ИИ - индекс инвазивности; ИР - аадекс резистентности; Ш полиакриламидный гель: ЭФП - электрофоретэтеская подвижность.

вирусной инфекции синтезируется несколько антигеЕОЗ, обладающих различающимися иммунохкмическими свойствами (ОигевМ, l'rent, 1973;

Rueee.l et al, 1S8G). Свойства вирионов, как одного из антигенов Блазивирусов, были изучены довольно подробно, тогда как в отношении яругах антигенов имелись фрагаэнтарныо, зачаотув противоречаще ïpyr другу данные. Другая проблема касалась вопросов трансляции такой крупной матрицы, как геном флавивирусов (около 4 мегадаль-:он). Имелись свидетельства образования структурного белка M путем гроцеисинга из более крупного полипептида N72 (ргеМ) (Shapiro et . il, 1973; Boleéis et âl, 1975). В отношении других белков флавк-:ирусов не было получено данных, свидетельсчвукцнх о протеолитн- . :еском образовании их из более крупных полшептидов (Wright, estaway; Wright et al, 1977). Данные о биосинтезе белков флави-ирусов были интерпретированы как свидетельства независимой иняша-ип сштеза каждого Cejnca (YTestarray, 1977), что противоречило обще-риняткм взглядам о способе трансляции, эукариотлческнх мРНК. Дия-азрешения этого противоречия 'был проведено изучение трансляции РНК пруса КЗ в бэсклеточннх системах.

Известно, что флавиЕируш размножаются в организме многих шотных - млекопитающих, птиц, членистоногих. Инфекция -молет завиваться з трех формах - острой; хронической и персистирущей. литература имеются данные, свидетельствующие о том, что развитие ювпвируснсй инфекции по тому или иному типу монет Сыть 5условлено синтезом определенных вирусных структур (Ьее, . (hloemsr, 1981; Brinton, 1986; Poidinger et al., 1991). В СВЯЗИ с та актуальной задачей представлялось изучение на модели вирусэ КЭ игторов, определяяцих характер протекания инфекции.

Цель и задачи исследования.

Цель представляемой работы состояла в получении новой информа-и о молекулярно-Сиологических и антигенных свойствах вирусспоци-ческих белков и надмолекулярных структур вирусе КЭ, а тазоа об ооэнкостях взаимодействия вируса с чувствнтелъштш гаетката.

Для выполнения поставленной цели необходимо было решить эдующие задачи:

1. Осуществить идентификации белков вируса КЭ.

?.. Изучить особенности сштеза вирусспеиифических белков.

3. Провести анализ антигенных свойств Еирусспецяфяческих белков;

4. Изучить молекулярно-бпологическиэ, физико-химические и ■ кммужшзкнческие свсйства антигенных структур вируса КЭ»

5. На основании полученной информации о свойствах белков и антигонши структур вируса КЗ ггроЕссти анализ особенностей азаи-лсдейстния вируса с чувствительными клетками'.

Научная нсбизна. Идентифицирован полный набор вирусепецифичес ких белков вируса КЗ, синтезирующихся'в культурах меток - in vive Впервые проведено изучение динамики синтеза вирусспецифических Oej ксв флаьиБируса ь течение единичного цикла размножения. Покьзанс что время интенсивного сингоса белков зависит от множественной инфекции. Выявлено, что белок KS32 образуется из болое крупного пс лкпептида р79 (ргеКЗЗ). Показано, что, помимо Селков Е, HS1 и prel глккопротеидами являются также Cbjikh NS5, NS3 и preNS3. Покаьш высокая шмунохнчичеекая активность белков N35, N33, NS1, Е и G.

Впервые изучена трансляция РНК флавивируса в бесклеточшх cmi темах - m vitro. Показано, что in vitro эффективно транслирует 5•-концевая область генома, кодирующая структурные белки, и ос ществляется слабая экспрессия последующей области генома. Изуче последовательность образования зрелых структурных белков вируса из полипбптида-предшествешгака и показано, что его процессинг ос ществляется при 'участии клэточных протваз, связанных с мембранами • Проведен сравнительннй электрофоретичесчий анализ вирусепэи •фических белков фдавивирусов. Показано, что оелок preNS3 являет типичным Д1хЯ вирусов, антигенной группы КЭ, но нэ для других фла£ вирусов. Показано, что вирусы комплекса КЭ гомогенны по ЭФП белг N55 и N33 и отличаются по этому признаку от исследованных флавш русов других антигенных групп и в;фуса Ловзсзпн.

Проведено сравнительное изучение антигенных структур вируса f Показано, что НА. вируса КЭ представляет собой мембрановязак надмолекулярную структуру, кардинально отличающуюся от вирионов диффузионным, электрофоретическим, морфологическим, физико-хикич! ким и имйсунохимическим характеристикам. Выявлено, что иммуноэле; рофоратичоскяе свойства вирионов определяются белком Е- Показа что основными антигенными компонентами НА являются димерные и му

Обозначение вирусспецифических белков дано соглэ номенклатуре, общепринятой после публикации ttioe et &1.0985) которой использовано обозначение неструктурных белков, как NSn. г. - место в тэгетгаложенш белков на геноме, нечиная с 5'-конца структурных белков, как Б, С и М, вместо использованного р£ обозначения неструктурных белков, как NVn, и структурных бел? как Vn, где п место - белка в ряду невирионных и йирионных бел? расположенных в последовательности возрастания их мол. i (Shapiro et al., 1971).

илерные формы белка HS1, часть которых существенно деградировала, [оказано, что мелкие кольцеобразные структуры, отождествлявшиеся юнее с HСТА фяавивирусов, антигенно сходны не с вирионьми, а с НА, : являются одной из форм НА. Проведена сравнительная оценка иммуно-югических свойств ВА и НА. Показано, что НА обладает существенно юныпими протективными свойствами, чем ВА, и на оказывает усили-1ающе'го эффекта на протективную активность при добавлении к препа-(атам ВА. Выявлено, что иммуногенная активность НА в отличие от ВА ie уменьшается после обработки формалином.

Впервые отмечено, что острое и хроническое течение инфекции ¡ирусом КЭ в культурах клеток млекопитающих сопровождается )азличием в физико-химических свойствах ьирионов и в соотношении их шфекционных и антигенных свойств.

Выявлена высокая степень изменчивости вируса КЭ при гэссировании через иксодовых клещей я мелких млекопитающих, что »бъясняется различием селективных свойств указанных систем хозяев.

Практическая ценность работы. Проведенные исследования явились юновой для решения ряда прикладных задач. Разработана оригинальная ¡одификация ВИЭФ, с помощью которой можно определять количество ¡ирионного антигена и антител к нему. Показано, что метод иммуно-1лектрофореза может быть использован для анализа антигенного юстава образцов вакцины и для характеристики технологических гроцессов получения вакцины против КЭ. Своеобразие поведения итигэнов вируса КЭ в примененной ишуноэлентрофоретичэской системе [спользовано для разраоотга метода барьерного электрофореза, :оторый позволяет быстро получать чистые образцы вирионов и [репараты НА, полностью освобожденные от примеси ВА вируса КЭ.

Алробация райски. Материалы работы были доложены на XII ¡сесоюзной конференции по электронной микроскопии (Сумы, 1982), iceсоюзной конференции по природной очаговости болезней (Тюмень, 984), Всесоюзной конференции - XX научной сессии Института голисмиелита и вкусных энцефалитов АМН СССР (Москва, 1985), южинститутской научной конференции, посвященной 80-летию. Томского Ш вакцин и сывороток (Томск, 1985), Всесоюзном симпозиуме 'Современные проблемы эпидемиологии, диагностики и профилактики глещевого энцефалита" (Иркутск, 1990), ХУ1 конференции Европейских ¡иохимических обществ (Москва, 1984), Международных симпозиумах "Биология клещевого энцефалита" (Новосибирск, 1987) и "Арбовирусы и фбовирусные инфекции" (Москва, 1989).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. ИЗУЧЕНИЕ СИНТЕЗА И ЖЯК02Ш1ЧЕСКИХ СВОЙСТВ ЕИРУСОТШФОТЕСКИХ БЕЛКОВ ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭЦЮАЛИТА

К началу проведешь исследований з литературе имелись сведения о синтезе и свойствах вирусспецифяческих белков ряда флавивирусов, но отсутствовала информация о биосинтеае оелков флавивирусов антигенной подгруппы вируса КЭ. Получение такой информации было необходимо для изучения на новом уровне антигенов вируса КЭ.

Оснозные характеристики единичного цикла размножения флавивирусов (Канджин, ЗН, денге-2, ЗСЛ, ЯЭ и Уганда S) изучены как в культурах клетск позвоночных, так и в культурах клеток комаров (Stollar et al., 1967; Trent et al., 1969; Shapiro et al., 1971; Fukui, 1973; Weetawp.y, 1973; Wengler et al., 1978; Ng, Westaway,

1979). Латентный период составляет около 13 часов, а зремя выхода основной массы инфекционных вирусных частиц райю 23-27 часам. Для вируса КЗ закономерности образования инфекционных частиц в клетках позвоночных (Анджапаридзе, Богомолова, 1962; Авакян и др., 1953; Heinz, Kunz, 1977), а также в организме клеща (Чушшш, Куренков,

1980), такие же, как и для флгвшшрусов, переносимых комарами. Синтез вирусспецрярических РНК флавивирусов, в том числе и Bjipyca КО, наиболее активно осуществляется в период 12-20 чесов после заражения (Соловьев и др., 1971, stoJlar et al., 1967; Trent et al., 19R9; Pukui, 1973; Boulton, Weetaway, 1977). Единственная вирусспецифичеекая РНК, функционируилэя как матричная, идентична вирионной РНК (Boulton, Westaway, 1977; Naeve, Trent, 1978; Wenslei et al., 1578; Deepres et al., 1986). Вирионы флавивирусов содержа: три белка: гликопрогеид Е, нуклеокапсидний белок С и мембранны!

. Оелок Ы. Было показано, что часть вирлонов содержит вместо белка М, Оолее крупный белок, являющийся гликопротеидом (Shapiro et al., 1933), и, как в дальнейшем было определено, представляющий co6oi Предшественник Оелка Ы (Wright, Westaway, 1977; Rioe et al., 19S5).

Особенностью синтеза вирусспецифических оелкоь флавивирусов i зараженных клетках является слабое подавление синтеза клеточнгс Оелков. Поэтому для идентификации вирусспецифического белковол синтеза применялась обработка клеток либо ЦГИ с последующе] •отмывкой (Shapiro et al.,' 1971; Trent, QureBhi, 1977), лко1 ттаертоническими концентрациями NaCl (Westaway et al., 1977). результате e клетках; зараженных флавивирусами, выявлен синтез н менее 8-10 вирусспецифических белков. Отменена высокая стэпэн

г-яикозилирования, помимо белков Е и ргеМ, белка N51 (Shapiro et al., 1S72: Smith, Wright, 1935).

В результате изучения синтеза вирусспецифических белков флавивирусов был получен ряд данных, свидетельствующих о возможности независимой инициации трансляции ряда белков (Shapiro et al., 1973; ïïestaway et al., 1973; VfeBtaway, 1977; Weetawey, Shew. 1977; Westaway et al, 1984).

В дальнейшем, благодаря применению генно-инженерных методов, получена существенно новая информация о структуре РНК флавивирусов ' и расположении виру с специфических белков на геноме. Анализ первичной структуры генома флавивирусов не подтвердил возможности внутренней независимой инициации трансляции флавивирусного генома. Было показано (Rioe et al, 1935; Caetle et al., 1985, 1986; ïïengler et al., 1985), что РНК флавивирусов содержит одну открытую рамку считывания флавивирусных белков и последовательности, кодирующие белки, располагаются на геноме, в следующем порядке: 5'- С - ргеМ - Е - 1S1 - NS2a - NS2b - NS3 - NSaa - 1154b - NS5 -3*.

Определение нуклеотидных последовательностей генома флавивирусов способствовало поиску в РНК флавивирусов структур, существенных для инициации трансляции. В РНК флавивирусов найдены aug-кодоны, предшествующие нуклеотидным последовательностям, кодирующим белки NSEa, NS2b, ïîS4b и NS5, в ближайшем окружении которых локализованы последовательности acu(0)cuugu, которые комплементарны 3'-концевым участкам рибосомальшх РНК (Coia et al., 1988). Кроме того, после- ' довательности нуклеотидов, окружающающие эти aug-кодоны, сходны с темп последовательностями, которые имеются около aug-кодонов, с которых осуществляется предпочтительная инициация трансляции на . мРНК эукариот (Kozak, 1983). Эти соображения не исключают возможности внутренней независимой инициации трансляции белков флавивирусов, но данных, свидетельствующих о реализации таксго способа синтеза белков флавивирусов, не-получено.

В то же время не иглеется данных, свидетельствующих об образовании в клетках, заракеншх флавивирусами, гигантского полипептида-предшественника, включающего в себя все вирусспецифические белки, что обусловлено, по всей видимости, котрансляционным процесоингом образующейся в ходе трансляции полипептидной цепи. Создание определенных специальных условий в течение вирусной инфекции позволяет выявить высокомолекулярные белки, более протяженные, чем самый крупный белок флавивирусов - белок N35 (CleaveB, 1985; Crawiord, Wright, 1987; Ozden, Poirier, 1935). Благодаря использованию поли-

клональных антисывороток к ряда вирусспецифических белков ь опытах in vivo оыж> показано, что: а) белей С, creta и Е не обнаруживаются в составе полип^ытида-предшестзенника: б) белок ns1 процесс.ирует из полкпелтида-прэдлествекника, содержадего также и Оелок ;J3£a; в; белок NS2b образуется без какого-либо промежуточного предшественника; г) обпасть белков NS3-5 процессирует с образованием значительного числа noJimeriTHflOB-rrpoAirecTBeHHHKOB (Chtrabcrs et al., 1990). Разрезание образующейся полипептидной цепи осуществляется, е основном, посредством вирусной протеазы К53, функциональная активность которой предсказана на основа анализа первичных белковых последовательностей (Bazan, Fletteriok, 1989; Goroalenya et &1., ■ 19S9) и в дальнейшем подтверждена экспериментально i,Falgout et al., 1991; Wtn^ler et al., 1991; Cahour et al., 1992).

1.1. Идентификация синтеза вирусных белков в культуре клеток.

Основным штаммом вируса КЭ, использованным нами для изучения синтеза вирусспецифических белков вируса КЭ,' был штамм Софьин, основной культурой - перевиваемые клетки ПЭС, в которых развиваете? острая вирусная.инфекция с разрушением монослоя клэi ок. Вирус КЭ, как и другие флавквирусы, незначительно подавляет синтез клеточныз белков, ибработка клеток актиномицином D незначительно подаьляоч синтез клоточеьрс оа.,1"ов и способствует при этом болэе интенсивному включению метки я виру с спе цифиче окие белки [1, При stid

условиях ряд вирусопецифических бежев - p93(NS5), р79, pS3(NS3-, р53(Е), р21, р13. pis и р12, хорошо выявляется при электрофорезе i ЮЖ к 15* ПАГ (рио. 1 ).

Обнаружено, что к течэше первых ¡3 часов после инфекции не происходит сколько-нибудь заметного синтеза Еирусспецифических бблко! [17]. В период 5-8 часов синтезируются з заметных количествах бежа HS5, HS3 и Е. Эти и другие вкрусспецифическиэ белки при заражони клеток с высокой множественностью 1шфеющи (100 БСЕ/клетка) наиболее активно синтезируется в период 8-14 часов после инокуляции, т< есть в конце лгтеьтного периода и во время выхода первых bhobi образованных инфекционных частиц из клеток. В дальнейшем, то ест] ю время активного выхода инфекционных частиц из клетки, синте: вирусспецифических белков уменьшается. Синтез вирусспецифическк белков при заражении клеток с более низкой множественностью иьфек-

3 - здесь и дале>.» ь квадратных скобках указан номер работы и: списка публикаций по матерл&лам доклада, в которой представлен. Солее подробная информация о проведенных исследованиям.

зш (4 БОЕ/клетка; существенно отличаотся. Период наиболее актпЕНО-■о синтеза вирусспвцифических белков сдвигается до 14-23 часов.

Для интерпретации различий синтеза ' вирусспецифических белкоз зируса КЗ при разных инфицирующих дозах важны данные Trent et al. ;1?69), которые показали, что количество первично инфицированных жрусоы ЭСЛ клеток составляет около 90% при любой множественности сражения в границах 5-90 БОЕ/клетка. Использованный автора'ли метод лтределения инфекционных центров не позволял определять количества [нфокционных частиц, пронькакхцих в отдельную клетку при разных

ей

рта-» рвз-

; г. <»•

Q3'i —

p2.fi-

<s M

«3

O-o

pa-

О ""

5 S~7

USStPKb

pre N33 (pVShl NSJ(pBS)-

® £9 ©

еэ f

<5 »

E (р5Ъ)-Ч US4 {pV7j-;<

г.?

i г з v s

>ис. 1. Анализ в 15% (А) и Ю» (Б) ПАТ белков, синтезирующихся, в

зараженных вирусом КЗ (дорожки 1, 3, 5) и незараженнкх

(дорожки 2, 4, 6) клетках ПЭС [24].

[а дорожках 1-4 представлены белки, синтезирующиеся в клетках, >бработанных актиномицином D (ЕЗмкг/мл), на дорожках 6,6 - -белки,' дштезиругсщкеся в клетках при дополнительной обработке ЦГИ (50 кг/мл) с последующей отмывкой и NaCl (избыток 190 мМ). Клетки ин-

губировали с 14С-маннозой (1, 2) и 35Б-метиошшом (2-6) с 32 по 3S

[ясы ьосле гирионов

инфекции. Дорожа

7 представляет белки препарата меченых при использовании С-гйдролизата хлореллы.

инфицирующих дозах, и степени развития патологических процессов клетке в зависимости от инфицирующей дозы, тогда как елэктрофорети ческий анализ оолков позволяет выявить различие течения инфекции зависимости от заражающей дозы.

По всей видимости, при высокой множественности инфекции клетку проникает большое' количество вирионов и после высвобожден« из них геномной РНК на ней осуществляется синтез вирусспецифическн белков. При заражении клеток с множественностью 4 БОЕ на клетку часть клеток, по всей видимости, проникает несколько вирионов небольшой синтез вирусспецифических белков, отмеченный в раннт сроки (8-11 часов), обусловлен трансляцией бэлкоЕ с PHP высвобожденных из вирионов. В большую часть клеток, зараженных щ 'инфицирующей дозе 4 БОЕ/клетка, проникает, по всей видимости, оде вирусная частица и для активного синтеза вирусспецифических белке в. клетках необходима репликация геномной РНК.

Вирусспецифические белки р47 (N51), р34, р24, и р23, синтез кс торых замаскирован клеточными белками, хорошо обнаруживаются гос. обработки клеток ЦГИ-и NaCl (рис. 1, дорожка 5). Следует отметит; что комбинация обработок ЦГИ и Nací подавляет синтез не толы клеточных белков, но и вирусспецифических белков pS9, р21, р12.

' Элиминирование включения метки в клеточные белки при обрабоп клеток,ЦГИ и NaPl, вероятно, обусловлено тем, что гипертоническ концентрации NaCl подазляют процесс инициации трансляции кШ Небольшая длина клеточных мРНК, по всей видимости, обеспечива полную трансляцию основной части мРНК клеток уже в течение 20 м обработки клеток Nací, т.е. до введения метет. Поскольку инициац трансляции некоторого количества геномной РНК вируса КЗ осущэствл ется до начала обработок, последующая элонгация трансляции эт длинной мРНК приводит к синтезу вирусспецифических оэлков на фо практически полного отсутствия синтеза белков клеток. Отсутств образования в условиях обработок ЦГИ и NaCl белков р£9 и р12 mos быть обусловлено подавлением процессов лротеолиза, обеспечиваш образование этих 'белков из промежуточных полжгептидов-предшэстве ников. Это предположение подтверждается фактом более интенсивно образования в условиях обработок клеток ЦГИ и NaCl полипепта белка р79, который, как показано нами при сравнении пептидных кг белков [2], является предшественником белка рбЭ (N33) - preisз.

Аналог белка р53 - белок Е оболочки вирионов, мигрирует г электрофорезе широкой полосой, что свидетельствует о его гетерогЕ ности по ЭФП. Е зараженных клетках ПЭС имеется два белка р53, oöj

дающих близкой подвижностью. Эти Оелки хорошо выявляются в 152, но ке в Ю% ПА1'. Оба эти белка по набору продуктов ограниченного □ротеолкзв идентичны. 14С-манноза и 5н-глюкозчмин включаются только в белок р53 меньшей электрофоретической подвижности. Это свидетельствует о том, что аналог белка Е вируса КЭ в зараженных, клетках существует в двух формах - гликозилированкой и негликозилированнс-й. Гетерогенность белка Е по электрофоретической подвижности может являться отражением включения в вирионы белка р53 разной степени гликозилирования. Существование негликозилированной формы белка Е' этмечено также для вируса Ш. (Sohlesinger et al., 1933).

Так же. как и для других флавивирусов (Shapiro et al., 1972; Smith. Wright, 1935), высокая степень гликозилирования отмечается :!в только для белка р53, но и для белков р47 (НЯ1 ) и р21 (ргзМ) вируса КЭ (рис. 1), что подтверждается также данными Дживанян и др. (1987) и Stephenson et al. (19В7). Нами отмечено также небольшое, хорошо выявляемое при элеутрофоретическом анализе в 10% ПАГ и цлительной экспозиции гелей, включение углеводных меток (14С-манно-еы и ЧЬглюкозаминз ) в Оелки р93 (KS5 ), р79 н р69 (N33 ). Эти дан-ше свидетельствуют о том, что потенциальная возможность гликозилирования NS5 и N53, вытекающая из сведений о нуклеотидной последовэ-гелькости генома вируса КЭ (Плетнев и др., 1989), реализуются в зараженных клетках. 0 реализации сайтов гликозилирования по N-типу, . имеющихся в белках iîS5 и N53, свидетельствуют также данные, полу-JSHHH9 при воздействии на клетки ингибитора гликозилирования -гунинамицина (Дживанян и др., 1987). Гликозилирование белков N55 и JS3 флавивирусов отмечено в ряде работ (WeBtaway, 1975; Stohlnan et si, 1976; Westaway, chew, 1977), тогда как в других исследованиях-ллккозшшрование ке было обнаружено. По Есей видимости, разноречи-зость Екоперименталышх данных связана с недостаточной стешнвю зазделения высокомолекулярных белков в 15% ПАГ и низким уровнем зк,течения радиоактивных углеводов в белки HS5 и NS3. Небольшое' жточение радиоактивных углеводоз в зоне высокомолекулярных -белксв ■пруса КЭ можно отметить также и в работе Stephenson et al. (1987).

Белок р13 является клеточной формой структурного белка С и меет большую ЭОП [2], что объясняется отщэплениек ■ из него ЮОН-концезой, якорной последовательности, в результате которого. >бразуется Еирионный белок С (Плетнев, 1990; Wengler et al., 1989).

Другке низкомолекулярные белки - р24, р23, р18 и ,р12, юответствуют, го всей еидимости, белкам NS4b, NS2a, HS2b и Н54а.

Как и для других флэвизирусов „ при репродукции зируса КЭ в

клетках ПЭС не обнаруживается аналога третьего структурного белка -р8 (Ы) 12]. По всей аилимости, вне вирионов этот белок быстро деградирует. .

*.2. Закономерности синтеза белков в бесклеточных системах, программируемых виряонной РНК

В связи с тем, что синтез вирусспецифических белков флавивирусов в культурах клеток осуществляется на фоне высокого синтеза клэточных белков, для подавления которого необходимо применить ряд обработок, приводящих одновременно к значительно меньшей утилизации радиоактивных метек, нами предпринято изучение •трансляции геномной РНК вируса КЭ в бесклеточных системах. Одна из tîikhx систем, основой которой являются экстракты из клеток Кребс-2, была эффективно использована для изучения биосинтеза пикорнаьирус-ных балков (Svitkin, Agol, 1978).

Предварительные' исследования показали, что при добавлении к босклеточным системам на основе клеток Кребс-2 вирионной РНК вируса КЭ наиболее высокое • включение радиоактивных аминокислот в полшеп-тида осуществляется при невысоких концентрациях КС1 (75 мМ). Наряду с полипептидами р53 и р13, которые идентичны по пептидным картам вирионным белкам Е л С, синтезируется значительное количество высокомолекулярных полипептидов с мол. массами до 160 КД [2]. Показано, что большинство этих•полипептидов имеет общую ffig-концевую последовательность аминокислот и содержит аминокислотные последовательности полипептидов р53 и р13. Увеличение концэнтрашы КС1 до 125 мМ приводит к резкому уменьшению количества этих полипептидов и одновременному увеличению количества р53, р13 и дуплета белков р33/35. Замена части КС1 (75 мМ) на КСНоСОО способствует синтезу небольших количеств полипептидов р93, р79 я р69 (рис. 2, дорокка 2), из которых, по меньшей мере, один - рбЭ, идентичен одному из неструктурных белков - NS3 вируса КЭ, поскольку они обладали одинаковы« набором продуктов ограниченного протеолиза [20].

Трансляция РНК вируса КЭ в лизатах ретикулоцитов 1фолика прк различных ионных условиях приводит к образованию гетерогенной смета белков, не содержащей зрелых структурных белков (рис. 2, дорожки 4-7). Бри изучении трансляции в> лизатах ретикулоцитов РНК флавивирусов ЗН и Канджин показано, что образующаяся гетерогенная смвс± полипептидов содержит аминокислотные последовательности структурные белков (Wengler et al., 1979; Monokton, Westaway, 1982). Все эта данные привели к предположению, что в лизатах ретикулоцитов отсут-

Рис. 2. Продукты трансляция РНК вируса

КЭ в Сесклеточной системе из

клеток Кребс-2 и лизатов реая-

кулоцитов кролика [7, 20]. .

Представлены продукты, образующиеся б бесклеточной системе из клеток Кребс-2 при 75 мМ KCl и 50 мМ ацетата калия в отсутствие экзогенной матрицы (1 ) или в присутствии РНК вируса КЭ (треки 2,3) й 0,Б% Тритона Х-100 t,C) а в лизатах ретикулоцитов в отсутствие экзогенной матрицы при 110 мМ ацетата калия (8) и в присутствии РНК вируса КЭ при 135 (4), 110 (5), 85 (б) И 65 (7) нМ ацетата калия. Бесклеточные системы инкубировали 3 часа.

гвуют компоненты, необходимые, для образования зрелых структурных »лков и присутствующие в экстрактах из клеток Кребс-2. Добавление ?больших количеств экстракта из клеток Кребс-2 приводит к образовано в лизатах ретикулоцитов полипептидов р53 и р13 и одаоц :.«>н-зму уменьшению количества высокомолекулярных полипептидор. ыо^ле эзделения компонентов экстракта клеток Кребс-2 было показано, что зиболыией активностью обладает фракция мембран эндоплазматического зтикулума, очищенная от примеси рибосом. Дополнительным свидетель-гвом необходимости мембран для образования зрелых структурных элков является то, что набор полипептидов, синтезируемых в бескле-эчной системе из клеток Кребс-2 б присутствии детергента тритона -100, который солюбилизнрует мембранные структуры, сходен с набо-ом продуктов-, обнаруживаемых в лизатах ретикулоцитов, и содержит ледовые количества р53 и р13 (рис. 2, дорожка 3). Таким образом, роцессинг предшественника структурных белков вируса КЗ осуществляйся на мембранах с участием меточных протеаэ.

Для выяснения механизма инициации трансляции РНК вируса КЭ Сн-и проведены опыты с инициаторной Г [35Г> ]Не г- 1. После исчэрпн-ающего переваривания продуктов трансляции РНК взфуса КЭ в бескле-очных системах из клеток Кребс-2 показано, что формил[]тметио-ин, в основном, содержится в одном поптидо [г]. Это указывает на ■о, что в бесклеточных системы реализуется один сайт инициации рансляшш. О его локализации на гекомэ свидетельствуют наши данные I влиянии 7-метилгуанозина-Г»мгокофосфата (п'Ор) на трансляцию РНК

рта -

Р79-PS9-

р55 - ф

1 Î Ъ U 5 в 7 о

• Рау -

• рР

•• Иг

рзб-

рЗЪ-р2Б —

ргз-

____ а

вируса КЗ 120]. Большинство эукариоти^еских аРНК, в том числе и РНК флавивирусов (Wengler et al., 1978; Cleaves, Dubin, 1979), содержит на Ь'-конце "кэп"-структуру (m^Gppp), которая играет важную роль в инициации трансляции. Трансляция таких матриц in vitro угнетается аналогами "кэпа", одним из которых является m7Gp (Keber et al., 1978). Из наших данных' следует, что n7Gp угнетает трансляцию клеточных тРНК и РНК вируса КЭ, и не влияет на трансляцию РНК вируса энцефаломиокардита, которая содержит на 5'-конце не "кэп"-структуру, а ковалентно присоединенный белок (Дрыгин и др., 1979). Включение формид [35з]-кетиокина в полипептид р13, но не в р53, указывает на то, что инициаторный участок содержится в р13. Полу-•ченные данные свидетельствуют о том, что участок генома, кодирующий структурные белки вируса КЭ, непосредственно примыкает к 5'-концу вирионной РНК. Существенно более поздняя аккумуляция в бесклеточной системе из клеток Кребс-2 неструктурных белков, по меньшей мере, полипептида р69 свидетельствует об удаленности участка, кодирующего неструктурные белки, от 5'-конца РНК вируса КЭ [20].

Данные о механизме и последовательности образования зрелых структурных белков из полипептида-предшественника получены в пульс-чейз экспериментах с использованием инициаторной f[35S]Met-tRKKjet (рис. 3) при условиях, исключающих повторную инициацию трансляции. Через 15-20 мин после добавления РНК в бесклеточной системе синтезируется дуплет полипептидов р36/33, меа.лихся i[ S]Mst и идентичных по набору олигспептидов р13, который образуется в ходе длительного чейза и также метится r[35s]Met. Это свидетельствует о соответствии полипептидов р36/33 нерасшепленному участку С-ргеМ, который процессирует в дальнейшем до зрелых белков С и М. Образование зрелого белка М нами не было выявлено вследствие отсутствия в HeN метионина, на что указывают данные по определению нуклеотидкой последовательности структурной области генома вируса КЭ (Плетнев у др., 1986). Пол1шептиды р26/23, по всэй видимости, представляют собой СООН-концевые фрагменты полипэптидов рЗВ/ЗЗ и являются предшественниками белка М. Полипептид р53 образуется не ранее чем чере; 20 мин, не метится x[35s]Met и его количества в ходе чейза не изменяются. В специальном опыте при изучении образования зрелого структурного бежа Е в лизатах ретикулоцнтоз в условиях добавления мембран клеток Кребс-2 на фоне исключения повторной инициации транс-'ляции с помошью пактамицина показано, что отщепление полипептидг р53 из образуидего полипептида-предшественника осуществляется не позднее 10 мин, т.е. только в случае, если размер предшественник;

МЕТКЛ

р 53 -

рЭ5 —{V

1 -Г ^ Г4» и»" . Г" - .

р5* Г- М1 ~ ~ «♦»' ♦» «

■4

4 -

_ -I ' — «V "* **

пипчпч п лч лчпчп 20 <<0 60 <8Э го 40 60 480

ВРЕМЯ (МИЮ

Рис. 3. Аккумуляция полипептидов в Сесклеточной системе из клеток

Кребс-2, программируемой РНК вируса КЭ при использовании в

качестве субстрата Г[353]Ме1;-^Шк"в'1; или [35БШе1; [15].

В различные интервалы времени из бесклеточной системы отбирали аликвоты и разделяли на 2 порции, из которых одна (п. пульс) сразу фиксировалась для электрофореза, а другая (ч, чейз). - после инкубации в присутствии ЦГИ (200 мкг/мл). Полное время' инкубации составляло 3 часа.

не превышает 56 КД [7]. Дальнейшее увеличение длины'полипейтида-предшественника, по всей видимости, приводит к тому, что полипептидная цепь приобретает структуру, которая препятствует взаимодействии с мембранами и дальнейшему созреванию структурных' белков.'

Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что в бес--, клеточной системе из клеток Кребс-2 осуществляется эффективная трансляция 5'-концевой области генома вируса КЭ, кодирующей структурные белки, тогда как последующая область генома, кодирующая

ею структурные сзлки транслируется с низкой эффективностью. Процес-синг структурных белков осуществляется с помощью клеточных протеоь: отщепление бэлка Б происходит быстро, тогда как белок С процесси-рует медленно из шлкшепуидоз р36/33, стщеплзкннх из полипептида-предаественкика . одновременно с белком Е. Белок М образуется из полипептидов р26/2й, представляющих собой, ССОК-концевую часть пслипептидсв р3£/33, по всей видимости, позже белка С.

1.3. Сравнительный анализ элекарофореткческсй подвижности вьруссгецифпчэскиу белков флавивирусов

Сравнительный элезтрофэрзтический анализ высокомолекулярных вируоспецифических С&.пков 12 флаЕИВирусов из 5 серологических групп, был прове деч в 8% ПА Г в ДСН-фосфатноЯ буферной системе (У/ев1;а-уау в! »1.. 1974). В этой работе нэ было обнаружено существенных отличий в числе и ЭФП высокомолекулярных вирус-специфических белков, за исключением заметно меньшей подвютости Селка N33 вируса денге-2. 3 то же врэмя, анализ вирусспецифичес:ая балков грех вирусов комплекса КЭ и вируса ЗК в 7,55 ПАГ е прерывистой буферной системэ ЬаеютИ и 970) выявил значительные различия £ Э01 белк.ов N35, N33 и Е (ЗКянков и др., 1982).

В результате этих исследовгний оставалось неясным, действительно ли при размножении флавивирусов различных групп образуются различные высокомолекулярные вирусспецяфичесгаю белки или же различия е числе и ЭФП отдельных вируссаэцифических белков определяются индивидуальными характеристиками использованных штаммов Епруссв.

•С целью выяснения этих вепри сов проведено изучение ЭчРГ высокомолекулярных вкрусспецпфи^еских белков 8 штаммов вируса КЭ 1 6 '.других вирусов, входящих б комплекс КЭ: КЛБ, Лангат, Негиши, ОГЛ, 11Э0 и Повэссан, ь также. флавивирусов, относящихся к различит серологическим комплексам: денге-2, Зика, ЗН и Уганда 3.

В клетках, зараженных флавивирусами, синтезируются высскомолэ-ку.нярные вирусспецифичь.ские белки N35, и&З и Е. На электрофореграм-мах белков шюток. (рис. 4), зараженных вирусами комплекса КЭ (дорожки 1-3, 7-10), в зоне мевду белками N35 и N33 определяется бело! р7Э (ргеНЗЗ). который не обнаруживается в контрольных незаражении: клетках (дорожка 11) и в клетках, зараженных другими флавивирусами.

При сравнении ЭФП белчоз гсэ5 различных флавивирусов можче отыэтить, что белки всех исследованных вирусов комплекса КЭ, кром вируса Повассан, кмбют одинаковую подвижность. Немного медленна! двигаются белки N35 Еирусов Повассан, ЗН и Уганда Б. Еще медлонно<

движутся белки N35 вирусов денге-2 л Зика.

Вирусспецчфические белки N53 флавюзирусов обладают более выряженными различиями ЭФГГ, чем белки N55. Для большинства представителей комплекса КЭ, а именно, вирусов КЗ (штаммы Софьин, 256, ЭК-328, Айна, Б-680 л ГОБ-45), ЛЭО, Непшш, ОГЛ и КЛБ, подвижность белков. кбз одинакова, но она немного меньше для вирусов Повассан и Лангат , а также для штамма Скалица вируса КЭ. Изученные нами флазивирусы, переносимые комарами, значительно различаются по ЭФП белка N53. Если ЭФП бежа N53 вирусов ЗН и Уганда Ь близка к ЭФП бежа N53 вирусов Лангат и Повассан, то для вирусоя Зика и денге-2 подвижность этого бежа существенно ниже и приближается к ЭН1 балда ргеизз вирусов комплекса КЗ.

Белок ргеМЗЗ (р79) образуется при заражешш клеток рядсм Бирусов комплекса КЭ. При инфекции клеток ПЭС штаммам* ЭК-328, Айна и Б-660 вируса КЭ этот белок не обнаруживался. Б клетках ПЭС, зараженных вируеом Повассан, белок ргеИЗЗ образуется слабо пли не обнаруживался вовсе, тогда как в клетках ЬНК-21 он активно синтезируется, что свидетельствует о различиях процессов протеолиза 'бежев в различных клеточных системах.

Подобно N35 и ИБЗ, Еирусспецифнческие белки Е флавизирусоз и/еадт неодинаковую ЭФП. Подвикность бежов Е вирусов комплекса КЭ практически одинакова, за исключением вируса Повассан и штамма

а ш и е-2 и зн п

13 У

О*"*

** -е»

«53 С"

Ч* *

л '> ;

' -Л,«

Г. *>

• ы)

Р V: -

б п а ' з

Рис. 4. Электрофоретичес-С 253 С к К кий анализ высокомолекулярных вирусспеыифических божов флавивирусов [6].

Через 40 часов после инфегада поддерживающая среда клеток ВНК-21 заменен? на среду с актиноми-цином В, через час вводили 14С-гидролизат хлореллы, через 7 часов клетки лкзязирочали и анализиро--вали е I0% ПАТ. Обозначения Еирусов: Л - Лангат, Ш - шотландский энцефаломиелит, Н - Негиши, Д-2 -денге-2, У - Уганда Б, ЗН - Западный Нил, П -Повассан, штаммы КЭ: С -уз - Софьин, Ск -• Скалице. „ -л Дорожка 11 характеризует ^ ^ белки незараженных клеток.

■Я

■ £> г

Скалице вируса КЭ, белки Е которых движутся в геле заметно медленнее. Другие флавивирусы гетерогенш по ЭФП бежа Е, а именно, белок Е вируса денге--2 движется медленнее, а бежи Е вирусов ЗН и Уганда s быстрее, чем соответствующие белки вирусов комплекса КЭ. На основании наших данных можно говорить о гомогенности вирусов комплекса КЭ но ЭФП белка Е.

Синтез белка N31 выявляется хорошо в условиях сильного подавления синтеза клеточных, белков при обработке клеток ПЭС гипертоническим pacïBopofr Na Cl [6]. Выявлено, что белки N31 как различных флавивирусов, так и разных штаммов вируса КЭ, отличаются по ЭФП.

Б настоящей работе показано, что белки N35, N33 и Е имеют одинаковую или близкую ЭФП у вирусов комплекса КЭ, в то время как соответствуйте белки флавивирусов, принадлежащих к другим антигенным группам, отличаются по ЭФП как от белков вирусов комплекса КЭ, так и между собой. Одинаковая подвижность бежов US5, NS3 и Е ряда штаммов вируса КЭ и вируса ШЭО была отмечена также Heinz, Kunz (1982),

Еирус Повассан отличается от других вирусов комплекса КЭ меньшей подвижностью бежа Е. Кроме того, вирус Повассан близок по ЭФП бежа NS5 к изученным флавивирусам, не принадлежащим к комплексу КЭ. Однако, в клетках ВНК-21, зараженных вирусом Повассан, отмечен активный синтез бежа preN53 - бежа, характерного для вирусов комплекса КЭ. На Ьсновании этих данных можно говорить о том, что вирус Повассан принадлежит к комплексу КЭ, но менее других■вирусов этого комплекса связан с ним. Эти данные согласуются с данными о серологических взаимосвязях вирусов антигенной группы КЭ, о которых пойдет речь в главе 2.

1.4. Иммунохимические свойства вирусспецифических бежов

Антигенную активность вирусспецифических бежов выявляли с помошью кммуноблота при использовании гипзриммунных антисывороток, полученных при иммунизации кроликов суспензиями мозга заракешшх мышей'(рис. 5А), а такие иммуносорбции на антителах гипериммунного лошадиного 7-глобулина производства объединения "Вирион" (Томск), пришитых на сефарозе [29]. Для обнаружения кроличьих антител, связавшихся с вирусспецифическимк бежами на нитроцеллюлозных фильтрах, использовали препарат "античела диагностические против иммуноглобулинов кролика, меченые пероксидазой", производства ИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН. О специфичности используемых антисывороток свидетельствовали данные контрольных экспериментов, в которых не отме-

ено связывания клеточных белков с вирусспецифическими антителами, ба метода хорошо выявляют белки р93 (NS5), рб9 (N33), р53 (Е) и 13 (С), что свидетельствует о их высокой имммуногенной активности, ебольшая степень отделения с помощью иммуносорбции белков р18, ■ 21, р23, и р24, вероятнее всего, обусловлена небольшой индукцией нтител к ним при иммунизации животных. Белок NS1 вируса КЗ также, ак для других флавивщрусоз (ïVinkler et al., 1988), существует в летках в форме димера (dirsi ). Этот белок обладает высокой антиген-ой активностью в иммуноблоте в отличие от монсмерной формы (р47) рис. 5А). На sтом рисунке представлены данные об антигенной актив-ости белка NS3 в составе бежа р79 (preNS3). Повторное иммунохими-еское тестирование высокомолекулярных белков, элюированных из ПАТ, оказало, что белок HS3 антигенно активен и в форме белка р69.

Налитое активности в РДПА препаратов клеток, зараженных виру-ом КЗ, посла обрэбки 1% ДСН [16], привело нас к поиску вирусспеци-ических белков ; сохраняющих способность к преципитации антителами осле воздействия жестких диссоциирующих условий. Для детекции рещшитирующбй активности использован метод РИЭФ, который более узствителен и удобен, чем РДПА. Для диссоциации белков клеток ' рименяли не прогревание при 100°С в. течение 1 минуты, а инкубацию ри комнатной температуре в течение 3-4 часов, поскольку прогрева-ке приводит к исчезновению преципитирующей активности. Успеху

А »__-J-NSS Б

---' Д

\ f ♦

H53dHS1 HS5

ис. Б. Выявление антигенной активности вирусспецифических. белков

вируса КЭ с помощью кммуноблота (А) и двумерного ДСНУиммуно .

электрофореза (Б) [16, 34].

летки ПЭС, зараженные вирусом КЭ, через 28 часов после инфекции изировали и разделяли в 10% ПАТ. А - Дохкотш 1 - негретая прбба, срожка 2 - проба прогрета при 100иС в течение минуты. Б - полоску АГ заплавляли в аг&рсзу и проводили ттауяофорез.

лроведелия такой работы помогло то, что прэципитируищая активность устойчива к воздействию диссоциирующих условий, которые создаются в буфере ЬаештпХу (256 ДСН, Ъ% меркаптоэтанола). Для выяснения того, какой белок обладает антигенной активностью при этих диссоциирующих условиях, была использована методика (Chua and Blomberg, 1979) с некоторыми модификациями. Полосу ПАТ с разделенными белками заплав-ляли в \% агарозу с 1% дезокскхолата, который использовали для лучшей электроэлюции белков в агарозный гель. В ходе электрофореза во втором направлении белки проходили через гель 1,5% тритона X-100i который использовали для связываний ДСН и переводу таким образом белков в форму близкую к нативной. После этого электрофореза в агарозном геле с гипериммунным 7-глобулином образовывались ракетные полосы преципитации, соответствующие по своему положению белкам NS5 и (1NS1 (рис. 5Б). Другие, антигенно активные в иммуноблоте и имму-носор&щи вирусспецифические белки не взаимодействуют после указанных диссоциирующих воздействий с антителами с образованием ракетных пслос преципитата!. Дополнительная обработка лизатов клзток 4M и 8М мочевиной приводила к тому, что белок сат31 терял способность образовывать ракетную полосу преципитации.

Таким образом, наибольшей антигенной активностью среди вирус-специфических оелков вируса КЗ обладают белки NS5, NS3, Е, NS1 и с.

• Из них белки NS5 и NS1 не чувствительны к воздействию ДСП и меркаптоэтанола, а булок NS5 - к обработке мочевиной.

1.4. Заключение.

, Полученные данные о спектра вирусспецифических белков вирус! КЗ, о динамике их синтеза в течение единичного цикла репродукции вируса, о включении углеводов в состав белков, о их кммунохимичосю активности получены нами впервые и в дальнейшей подтверждены : работах Других исследователей (Heinz, Кипя, 1932; Steph&nsorj е al., 1937; Дживанян" и др., 1987: Плетнев, 1930).

Выявленный (п ut00 набор впрусспзцифическил белков вируса К близок- к набору-вируспецифических белков флавквирусов из други антигенных групп. Исключение составляет- то, что в клетках, заражен ных вирусами комплекса КЗ, белок KS3 существует и хорошо выявляете также и б формэ предшественника - pr-eNS3. Существование бел« ргеМЗЗ вируса КЗ подтверкдено Морозовой (1991) при использовани

• моноклональных антител к белку NS3. Возможно, что существовали preNS3 обусловлено дефектами разрезания белка N33 от белков TfS2b NS4a. При определенных условиях балок pi*eNS3 выявляется и для др$

пи флавивирусов ¡.Ozden, Poirier, 1985; Cauchi et al., 1991). Показано, что этот оолок представляет собой полипептндную цепь, состоящую из белков NS3 и из4а и связанную с мембранами якорной последовательностью белка KS4a (Cola et al., 1988; Cauohi et al., 1991; Iiobig, 1992). Еыквлено, что полипептид KS3-4a вируса ЭДМ является стабильным предшественником, который резистентен к дальнейшему протеолитическому процессингу даже в присутствии зрелого NS3 (Lobig, 1992). Предположено, что стабильность полипептида KS3-2a Еируса ЭДМ обусловлена конформационными изменениями, существенными для проявления другой ферментативной Функции белка NS3 флавиЕирусов - полимеразной, которая предсказана на основе анализа первичной структуры белков и показана экспериментально (Gorbalenya et al., 1989; Плетнев, 1990; Wengler, Wengler, 1992).

Значительным отличием синтеза белков вируса КЭ in' vivo и in vitro является то, что неструктурные белки практически не транслируются с геномной РНК в бесклеточных системах. Возможно, имеется барьер в элснгацпи трансляции гигантского полипептцда-прэдшествен-ника,. содержащего последовательности всех вирусспецифичвских белков, и этот барьер успешно преодолевается в клетках. В последующих работах по изучению процессинга неструктурных белков флавивирусов использовались генетические конструкции, не содержащие последовательностей, кодирующих структурные белки (Wengler et al., 1991).

Полученные данные о механизме синтеза и процессинга структурных белков вируса КЭ подтверждены при изучении трансляции генетических конструкций, содержащих последовательности, кодирующие структурные белки флавивирусов (Nowak et al., 1989; Ruis-Linares et al., 1989; í-'arkoff, 1939).

Установленный нагга потзядок расположения участков, кодирующих структурные белки, на геномэ флавивирусов подтвержден при изучении нуклеоткдных последовательностей геномных РНК (Rice at al., 1985). Суще ственно, что опыты по трансляции РНК вируса КЭ в Оесклеточных системах позволили выявить последовательность образования Брелых структурных белков и необходимость для их процессинга связанных с мембрана?,от клеточных протеаз, которые осуществляют котрансляционную модификацию полипептида-предшественника.

Совокупность данных об организации генома флавивирусов и синтезе фпавивирусных белков послужили обоснованием выделения флавивирусов из семейства To^aviridae в отдельное семепсгьо -?laviviridae (Westaway et al., 1985).

ймиуноАкдатсксе изучение вирусспецифических белков вкоусэ lw

показало, что на только аналоги структурных белков Е и С, но и неструктурные оелки NS5, KS3 и Я51, обладают высокой активностью и что их иммунохимическая эктиеность модулируется по-разкому физико-химическими воздействиями. Эти данные имеют существенное значение для поникания и интерпретации материала, изложенного в следующей главе. Полученная информация о свойствах белка NS5 подтверждает данные Qursshi arjd Trent (1973), указывающие на высокую к.мунохимк-ческуго активность оелка NS5 флавивируса - вируса ЭОЛ.

2. АНАЛИЗ АНТИГЕННЫХ СТРУКТУР ВИРУСА КЭ.

Для . диагностики и дифференциации фшавквивирусов в качестве антигенных препаратов первоначально использовались экстракты и . суспензии тканей зараженных животных, такие как сахарозо-ацотоновый, боратно-солевой антигены, которые обладали ГА-активностью и позволяли поэтому проводить диагностику флавивирусов по антигенным детерминантам вирионов в РПГА (Clarke, Casals, 1958). Основной антиген В1фуса КЭ, присутствующий в таких препаратах, обычно образовывал в РДПА полосу преципитации посередине между лунками с антигеном и антисывороткой (Ржахова, Чумаков, 1955; Горев, 1966). При концентрировании зкруссодержащих культуральных жидкостей этот антиген также преобладал над вкрцонами (Кокорев, .Заккрова, 1966; Неустроев, Рубки, 1966, 1968; Lee et al-, 1991), которые обладали $жши диффузионными свойствами (Рубин, 1972).

Ультрацентрифугирование препаратов флавивирусов приводило к тому, что этот антиген оставался в надосадк-з, тогда как вирионы осагдались нз дно пробирок (Hawkes, Marshall, 1967; Гайдамович, Лаврова, 1974). Это послужило основанием для обозначения ноосаждаемого при улътрацектрифупфозании антигена флавивирусов, как "растворимого" (PA) (Sohleeinger, 1977; Rüssel et al., 1980). Одним из свойств, позволяющих дифференцировать РА от вирнснов в РСК, квлялась высокая степень резистентности антигенной активности РА к диссоциирующим воздействиям (оорасотка ДСН, кзркаптоэтанолом) (Brandt et al.,.1970; Eokele et al., 1975; Cardiff et al., 1971; Rai and Chosh, 1976). Благодаря этому р. результате фракционирования в градиентах концентрации сахарозы выявлено, что РА диювлвирусог отличается от в>фионов существенно более низкими седиментационныж свойства?,ш - коэффициент седаментацяи около 7 s, тогда как дл* . вирионоз этот показатель составляет 175-210 S (Brandt et al., 1970; Srcith. et al., 1970).

В результате сэдимэнтационного анализа в препаратах вируса К.'

выявлен материал, составляющий второй пик ГА-активности в положении 55-70 s (Heinz, Kunz, 1977), который находится на периферии широкого такса инфекционности, совпадающего с пиком вирионов (Ъее et al., 1939). Наличие Еторого пика ГА-активности вместе с обнаружением во фракциях этого пика пончикообразных структур диаметром 10-14 нм гослужило основанием для постулирования существования МСГА - неин- , секционного антигена флаЕивирусов, иммунохимически родственного :ирпонам (Brandt et al., 1970; Kitano et al., 1974; Deila-Porta, V estavv-iy, 1977; Cardiff et al., 1971; Sohlesinger, 1977; Rüssel et vi., 1980; Lee et al., 1989). МСГА стимулирует образование в орга-шзме животных ГА-ингиоирующих, нейтрализующих, комплементсвязываю-аих и протэктиБшх антител, но его серологическое родство с вирио-1ами не является полным (Cardiff et al., 1971; Heinz, Kunz, 197S). лсга не образуется в культурах клеток комаров, а в клетках млекопи-ГПКСГ.ПС его продукция отмечается на поздних стадиях инфекции (Sinai-aohatant, Olsen, 1973; Ng, Westaway, 1983; Лаврова, 1977). 5тот антиген не является продуктом разрушения вирионов, так как структуры, производные от вирионов, обладают иными физико-скмическиш и морфологическими характеристиками (Smith et al., 1970: Heinz, Kunz, 1979; Heinz et al., 1981). Исследование мембран-fflx структур зараженных флавивирусами клеток показало, что они обладают высокой икмукохимической активностью, характерной для-знрионсв, несмотря на отсутствие ГА-активности (stohlnan et, al., 1975, 1978). Репродукция в клетках Vero рекомоинантов вируса оспо-зукщпш, содержащих последовательность генома вируса ЯЭ, соответствующую белкам М, Ей NS1, сопровождается интенсивным синтезом структур, взаимодействующих с моноклональными антителами к белку Е î сходных по седаментационным свойствам с МСГА (Ыазоп et al., 1991). Все эти данные свидетельствуют о правомочности обозначения зсех структур, в том числе и МСГА, иммунохимическая активность сотсры?: обеспечивается белком Е, как виряонный антиген (ВА).

Определение молекулярной массы белка - носителя антигенной зктивности РА разными авторами давало широкий диапазон величин:, от Î9-40 до 53-58 килодальтон (Cardiff et al.. 1S70, 1971; Hai, Grosh, ¡976; Eckels et al., 1975). Использование поли- и моноклональтшх знтител, специфичных для РА, и сопоставление пептидных карт позтзо-шло идентифицировать селок РА как неструктурный белок NS1 (Smith st al., 1985; Lee et al., 1989). Эти данные подтверждают обосдован-юсть обозначения рядом авторов РА флавивирусов как неструктурного, иевириснногс антигена (на). Для на флавивирусов была отмечена высо-

кая степень ассоциации с мембранами эндоплазматического ретккулума (Stohlman et al., 1978) и высокая степень экспонирования на поверхности клеток (Westaway, Goodman, 1987). В то же время определено, что СООН-нонцевая последовательность бедка Ж51 не содаргжт якорного домена, имеющегося у белков Е и С„_ (Ries et al., 1985). Исследова-

Г-Jl

ние взаимосвязи белка N31 с мембранами показало, что сразу после синтеза белок N31 гидрофилен, что соответствует данным о последовательности аминокислот, и приобретает свойства мембрансвязанного белка только после димеризации (Winkler et al., 1989; Fan, Mason, 1990; Oauohi et al., 1991). Это указыв-^т, что белок NS1 принадлежит к классу амфитропных белков, которые существуют в клетке либо в свободном состоянии, либо ассоциированы с мембрана:.® (Вига, 1988). Внеклеточная форма бежа NS1 также представлена как в форме, связанной с мембранами, так и в форме, свободной от них (Mason, 1989).

2.1. Способы выявления и иммукохимкческие свойства вирионнсго и невирионного антигенов

Для детекции антигенов использовали антисыворотки, полученные в результате иммунизации кролтаов и белых мышей суспензиями мозге новорожденных йелкх мышей, зараженных Еируссм КЭ. Наиболее чаете использовали коммерческий препарат - гипериммунный т-глобулин иг сыворотки лошадей, многократно иммунизированных суспензиями мозгг белых мышей, производства объединения "Вирисн" (Томск). Данные раздела 1.4. свидетельствуют о полиспецифичности этих иммунных препаратов - содержании в них антител к большинству вирусспецифяческш белков. В качестве моноспецифичного иммунного препарата использовали кроличьи антисыворотки к очищенным зирионам.

Для получения антигенных препаратов вируса КЭ кспользовалис; ультрацентрифугирование ьируссодержэщих культуральных нидкссте; (режим 12-14 млн £мм;ш ) и концентрация кз.досадочной ¡¡сидкостя дно ультрафильтрацией,- либо осаждением 70S сульфатом аммония. Материа осадка, полученного после ультрэцентрлфугировэния, прэдетавляет со бой препарат ВА,_ а концентрат надое блочной гкидкости - препарат НА.

Основной антиген Еируса КЭ содержится в нэдосадочнсй кидкост и представляет собой КА, который образует в РДПА полосу прешшита ции с гипериммунным 7-глсбулином посередине между лунками (рис. 6 и не взаимодействует с антисывороткой к очищенным вирионам.

При взаимодействии препаратов ВА с антителами обычно выявляют ся две полосы преципитации. Одна, более четкая полоса образуется е расстоянии около 1,2 ш от лунки с антигеном уже через 6-8 часов,

Рис. б. Преципитирующая активность препаратов ВА (А) и НА (Б) вируса КЭ, полученных в культурах клеток ПЭС [4]. В лунки 1-6 помещали антигенные препараты, полученные после инкубации культур в течение 8 часов и в интервалы времени 8-16, 16-24, 24-32, 32-40, 40-48 часов после заражения, соответственно. В средние лунки помещали гипериммуннай 7-глобулин. Концентрацию ВА из вируссодержащей жидкости в 100 раз осуществляли ультрацентрифугированием, последующую, концентрацию НА в 7,5 раз проводили осаждением 70% СА. А и Б - схема и фотография окрашенных полос преципитации, соответственно. Расстояние между лунками - 5,5 мм.

ругая, менее четкая полоса появляется приблизительно через 48 ча-ов и отстоит от лунки с антигеном на 0,8 мм (рис. 6А). Образование тих линий преципитации как при использовании гипериммунного 7-гло-.,лина из сыворотки лошади, так и антисыворотки к очищенным вирио-ам, свидетельствует о том, что антигён, образующий их, и есть ВА.

После неоднократного введения препаратов ВА в агаровый гель' бразуется еще' одна полоса преципитации на расстоянии 2-2,5 мм от увки с антигеном. Эта третья полоса преципитации сливается- с олосой преципитации, образуемой препаратами на, что говорит о астичном осаждении НА при использованных нами режимах осаждения ВА.

ВА и НА вируса КЭ различались также по иммуновлектрофоретичес-им свойствам. ВА формировал при взаимодействии в РИЭФ ракетную олосу преципитации, обрамляющую лунку и вытянутую в сторону като-а. Такая форма обусловлена движением в использованной нами элект-офоретической системе части ВА к аноду, а осноеной популяции ВА -катоду. Это хорошо видно при анализе движения ВА в электрическом эле с помощью РИЭФ и ПИЭФ [14, 26]. НА образовывал в РИЭФ остроко-эчную преципитационную ракету в катодной, удаленной от лунки части гарозных гелей. Особенности иммуноэлектрофоретического поведения к и НА вируса КЭ можно видеть на рис. 12-15, иллюстрирующих данные эответствующих разделов. Следует отметить, что иммуноэлектрофоре-иеские методы позволяют проводить не только качественную, но и эличбственную оценку антигенов в вирусных препаратах благодаря 1ределению площади ракетной полосы преципитации (Аксельсен и др.,

1S77). Кроме того, эти метода просты, удоош и не требуют получения моноспецнфичшх антисывороток.

Использованные антисыворотки обладали высокой специфичностью, поскольку не образовывали полос преципитации с контрольными препаратами, полученными из неззражонных культур клеток.

При изучении динамики появления ВА показано, что интенсивный синтез БА наблюдается с 16 по 48 часы (рис. 6). При оценке еысот ракет ВА, образуемых при иммуноэлоктрофорезо, наибольшая концентрация ВА была выявлена через 32-40 часов после заражения, тогда как в более ранние или более поздние сроки количество ВА было приблизительно в два раза меньшим. При изучении динамики накопления На выявлено, что синтез НА начинается уже в ранние сроки после заражения - через 8-16 часов. Наибольшее количество на отмечено в период с 24 по 40 часы после заражения.

Отсутствие'гемагглютинируицей активности б препаратах НА является значительным отличием НА от ВА, но не может являться свидетельством полного различия антигенных детерминант ВА и НА, которое было получено в опытах по истощений гипериммунного 7-глобулина. Этот иммунный препарат посла инкубации его в смеси с препаратом Ш и последующем использовании з РДПА этой смеси в качества антисыворотки образует с препаратами ВА двойную полосу преципитации, характерную для ВА, но не образует полосы преципитации, типичной лы этого антигена, с- препаратами НА. И наоборот, гкпериммуннк! 7-глобулия после истощения его препаратом ВА продолжает образовывать полосу преципитации посередине между лунками с препаратом НА но не образует с препаратом ВА полос преципитации, характерных да: ВА. Для выявления икмукохимиче ских отличий ВА и КА вируса КЗ но пользовали также моноклональные антитела к белкам Е и NS1, получен ные при совместных исследованиях сотрудниками ИЛВЭ РАМП и Новоси бирского Института биоорганической химии СО РАН, и препараты ВА КА, полученные с помощью барьерного электрофореза (см. раздел 4.3. и содержащие по данным РИЭФ только один из указанных антигенов Показано, что препараты ВА взаимодействовали в HíM только с монс клональными антителами к структурному белку Е , тогда как препараа НА - только с маноклональными антителами к неструктурному бели N31. Все эти данные свидетельствуют о полной разнице антигеннь свойств ВА и НА вируса КЗ.

Следует отметить сольгую специфичность НА шрусоз комплекса Г по отнесению к гетерологкчной антисыворотке по сравнению с ВА [Б; Так, ВА вирусе Оовзосан образует полосу преципитации с пгаеримму!

нш 7-гжюулином против КЭ, ко эта полоса ш сливается с полосой преципитации, образуемой ВА гомологичного вируса - вируса КЗ. О слабом связывании в РДПА ВА ряда штаммов вируса Повассан с иммунной сывороткой к вирусу КЭ свидетельствуют данные Леоновой (1992). В отличие от этого, НА вируса Повассан не образовывал полосы преципитации с гипериммунным т-глобулином против КЭ даже при многократном введении антигена и антител. Это свидетельствует о практически полном иммунологическом несоответствии НА вирусов КЭ и Повассан. Вирус Поеэссэн, скорее всего, является вирусом, который наименее антиген-ко связан с вирусом КЭ. Это подтверждается данными других исследователей, из которых одни не включают вирус Повассан в антигенную группу КЭ (й.еМайгтД, РснЧегПеЗЛ, 1974), а другие отмечают одностороннею связь вируса Повассан с вирусом КЭ (СаИвЬег е* а!., 1989).

Другие вирусы комплекса КЭ более близки к вирусу КЭ. Так, при взаимодействии НА вирусов КЭ (штаммы Софьин и 256), Лангат, ОГЛ и Негиши с гипериммунным 7-глобулшом против КЭ выявлены следующие закономерности. НА Еирусов КЭ (штаммы Софьин и 255) образуют с гомологичной антисывороткой полосы преципитации, которые не только сливаются, но и образуют "шпору"4 с полосами преципитации, образованными гетерологичными по отношению к используемой антисыЕоротке антигенами (НА вирусов Лангат, ОГЛ и Негиши). Это свидетельствует о наличии частичного иммунологического несоответствия между гомологичными и гетерологичными антигенами. Внутри своих групп гомологичные (НА штаммов Софьин и 256) и гетерслогичные (НА вирусов Лангат, ОГЛ и Негишк) по отношению к антисыворотке антигены не дифференцируются друг от друга. Сходные закономерности взаимосвязи Еирусов комплекса КЗ были выявлены ранее при использовании сахарозо-эцетонового антигена, который в РДПА идентичен НА (Ржахова, Чума-сов, 1965; Горев, 1969), и антигена, получаемого из культуральных шруссо,держащих жидкостей осаждением с помощью ПЭГ, который представляет собой ВА (Рубин, 1972).

2.2. Закономерности осаждения антигенов полиэтиленгликол'ем.

Одним из способов концентрации вирионсв вируса КЭ' является юзждение их с помощью относительно невысоких концентраций ПЭГ Чумаков и др., 1968). В связи с тем, что было не ясно, возможно ли :спользоввть ПЭГ для концентрации НА вируса КЭ, нами было проведено

- прещшитащюшюе образование, известное для близкородственных нтигеков и отмеченное для вирусов комплекса КЭ Горевым (1969).

подробное изучение способности ПЭГ осаждать антигены вируса КЭ.

В результате использования дробного осаждения антигенов последовательно увеличиващимися концентрациями ПЭГ было показано, что препатэата вируса КЗ, полученные осаждением ПЭГ вплоть до 7%, обладают ГА-активностью, максимум которой приходится на 2% ПЭГ [5]. Эти препараты имеют высокую концентрацию ВА и небольшое количество НА. При последующем добавлении ПЭГ, начиная с &% и вплоть до 22%, осаждается основная часть НА (рис. 7). Данные об осаждении НА вируса КЭ при невысоких концентрациях ПЭГ (5%) присутствуют также в работе Le* et al. t1939).

Электрофоретический анализ антигенных препаратов показал, чтс препараты, полученные из исходной виру с с о держащая жидкости пр;: добавлении ПЗГ до 4% , содержат, в основном, вирионные белки. Препараты, полученные осаждением ПЭГ в диапазона 4-7%, содержат меньшее количество вирданных белков и большее количество примесей. Препараты, полученные при последующем добавлении ПЭГ как из исходной, так и из подвергнутой ультрацентрифугщюванию вируссодержащез жидкости, содержат значительное количество солков, часть из которы: совпадает по ЭФЛ с неструктурными белками N55, NS3, NS1 вируса КЗ.

Как указано б разделе 2.1., часть НА осаждается ультрацентрк фугированием, которое обеспечивает концентрацию в осадке основны количеств БА. Для выявления особенностей осаждения неседимэнтирук щих ВА и НА наш предпринято дробное фракционирование с помощью IE

Рис. 7. СИЭФ. Иммупохкмические прс

фили осаждения антигене вируса КЭ из вируссодерж! щей культуральяой жидкое с помощью ПЭГ [223.

Цифры в лунках указывают приман емые для осавдения антигенов ко: центрации ПЭГ в процентах. Анод вверху, катод - внизу.

белков и белковых структур из таруссодетзжащей кулътуральной жидкости, подвергнутой ультрацентрифугированига. Осаждение основной популяции Ва происходит при добавлении к вирусоодэркащей жидкости, не подвергнутой улътоацентрифуглроваиию, ПЭГ до 3% , тогда как осаждение ва, не концентрирующегося при ультрацентрифугировании, осуществляется большими концентрациями 1ТЭГ - 3-6%. Значительная часть НА, осаждающаяся невысокими концентрациями ПЭГ (до Б-7%), удаляется из вкоуссодержащей жидкости з результате ультрацентрифугирования. Анализ антигенов-вируса КЭ, присутствующих в вкруссодержощей культуральной жидкости и осажденных ПЭГ, свидетельствует о гетерогенности физико-химических свойств на'. При невысоких концентрациях ПЭГ еыпа-дают в осадок формы на, частично седиментирущие при центрифугировании, тогда как при введении больших количеств осаждающих агентов концентрируются на, не осаждаемые при использованном нами реаимэ ультрацентрифугирсвания. Для того, чтобн интерпретировать полученные данные, следует коснуться механизма осаждающего действия ПЭГ.

Введение в раствор ПЗГ приводит не только к активному разрушении гидратных оболочек и уменьшению растворимости б&лков ег а1., 1973; Ро1боп, 1974), но и к образованию в растворе пространственной сетки взаимодействующих друг с другом молекул полимера (Тихснегасо, 1973; Ьаигег^, 1967). Плотность этой сетки зависит от концентрации полимера. Осаждаемый объект, если он стерически не способен включиться в такую сэгку, не удерживается ею в растворе и осаждается. Это объединяет феномен осаждения с помощью ПЭГ с гельфильтрационным разделением и указывает на то,- что определяющим з нем являются такие параметры как размер, форма, а также масса осаждаемого объекта. Известно, что единичные белки осаждаются высокими концентрациями ПЭГ (на ниже 20%). Поэтому эсзудение К1 вируса КЭ в широком диапазоне концентраций ПЭГ дает основание предположить, что НА представляют собой различающиеся по указанным параметрам надмолекулярные комплексы. По осаждению ПЭГ ВА представляет собой довольно гомогенную популяцию антигенных структур, что, учитывая сказанное выше о механизме действия ПЭГ, можно интерпреаировать как близость ВА по размеру и форме. Осаждение ВА 3-7% ПЭГ может свидетельствовать о том, что небольшая, часть ВА имеет несколько меньшие размеры, чем основная популяция ВА, осаждающаяся при добавлении ПЭГ до 3% .

Следует отметить, что метод дробного осаждения антигенов вируса КЭ представляет собой простой и удобный способ получения препаратов На, не содержании. ВА.

2.3. СедимептациоЕнае и хроматографичоские характеристики антигенов препаратов Еируса клещевого энцефалита.

Дальнейшее изучение физико-химических свойств антигенов вируса КЭ онло проведено с помощью седиментации в сахарозных градиентах и хроматографии.'

типичный пример седиментационных профилей препарата структур вируса КЭ представлен на рис. 8. Следует отметить олизость распределения оптической плотности при 280 им (0В280) и метки по РНК, а также распределения оелковой метки и величин ГА-активности. Совпадение пиков по Есем вышеуказанным параметрам наблюдается для зоны с коэффициентом седиментации 200-210 Б, которая содержит нативные вирконы. и ооозначена нами как пул 1. Оледущий, меньший пик по ГА-актизности и оелковой метке соответствует по коэффициенту седиментации 70 Б к несколько предваряет пик по 0С280 и метке по РНК, который ооычно превосходил по указанным показателям фракции пула 1. Эти два пика, которые трудно дискриминировать друг от друга, обозначены нами как фракции пула 2. Верхушечные фракции градиента, для которых характерно снижение величин ОБ2до, меток по белку и РНК, выделены в пул■а. Для пулз 3, в ряде случаев, отмечается неосльшой подъем величин ГА-активности.

Практически, данные по величинам указанных параметров позволяют судить только о распределении основной массы вирионов (пул 1) и примесей (пул 2 и 3). Более исчерпывающая характеристика седимэнта-

Рис. 8. Седиментационше профили

■5

а *

а ^,

г 1

1 7 1 (С А* / и

!/ 1Л

• / / \ / •

с !

№ <6 и а

-Г

« 6

? I

препарата вирусспецифических структур вируса КЭ, полученного с помощью ультрацентрифугирования, в 5-30 % градиенте концентрации сахарозы [14].

Величины ГА-активности выражали в обратных двоичных логарифмах разведений фракций.

Д'ю

1С С та 25 Верх

Л/: фракиии

циошшх свойств антигенных структур вируса КЭ получена нами благодаря использованию иммуноэлэктрофоретических методов, которые позволили судить о качественном и количественном распределении ВА и НА вируса КЭ по фракциям градиента (рис. 9А). Видно, что ВА-присутствует не только во фракциях: пула 1, но и во фракциях, прилегающих к нему, в донных фракциях и во фракциях верхней части градиента, соотготствунцих отчасти фракциям 2 пика ГА-активности. Часть НА седиментирует вместе с основной массой вирионов и его распределение по фракциям совпадает с распределением ВА, а основное количество НА' находится в верхней части градиента, во фракциях пулов 2 и 3.

Сходное распределение антигенов Еирусов ЯЗ и КЭ по фракциям" градиента получено при использовании для детекции моноклоиалыых антител к белкам Е и N31 (Хее е* а1., 1939; Мавоп, 1989; Сгоокв et а!., 1990). Отличие состояло в том, что нами выявлен НА", седименти-

Еис. 9. Сздиментациснный (А) и хроматографкческий (Е) анализ антигенов вируса КЗ.

Вируссодериащую жидкость культур клеток ПЭС ультрацентрифуги— тхтали, осадок суспендировали и подвергали седиментации в 5-30% гпадиенте концентрации сахарозы в пробирках объемом 60 мл в- роторе 3x65 центрифуги ííSE-65 при 22000 об/мин" в течение 4 часов. Фракции собирали со дна пробирки.

Надосадочную жидкость после ультрацентрифугирования концентрировали ультрафильтрацией на фильтре PSJM, и хроматографировали на колонке, заполненной сефакрилом S-400 (диаметр - 2,5 см, высота -46 см). Для калибровки колоши использовали моркеоы: голубой дек-, стран 2000, Ферштин (Ф), кат-алазу (К) и альбумин человека (ЧА), ияеюпше молекулярные массы 2000, 450, 240 и 69 КД, соответственно.

Фракции вносили в лукки агарозных гелей, не содержащих 7-глоОулина, выдерживали 4 часа при комнатной температуре и затем проводили иммуноэлектрофорез.

рующий в полокешш вириояоЕ. Отсутствие такого Hi. в исследованиях упомянутых авторов объясняется тек, что в первом случае вирусные препараты получали в культуре клеток "его, в которой в ходе вирусной инфекции не наблюдается разрушения клеток (Mason, 1989), а во втором - б культуре гслеток ПЗС на ранних стадиях инфекции (Lee et al., 198S; Crooks et al., I99C), когда вирусные препараты содоржат, в основном, вирионные структуры пула 1.

Хроматографии препаратов структур вируса НЭ, которые остались неосажденнымн после ультрацеатрифугирования, проводили на раз.пичных носителях - сефарозе 6В, сефакрилах Б-ЯОО: з-ЗОО и S-400. Распределение меток по белку и FHK, а также ODoqq, нб дает существенной »¿.•формации о содержании ВА и НА во фракциях, тогда как использование иммунозлектрохимических методов позволяет судить о распределении БА и НА по хроматографическим фракциям. ВА, содержащийся в препаратах низкомолэкулярных структур вируса КЭ, элюируется только во фракциях следующих за свободным объемом колонки (рис. 9Б, фракции 17-23). Небольшое количество НА элюируется с колонки вместе с ВА. Основное количество НА выходит с колонки позжэ, во фракциях 23-37, включая фракции,' в которые йлюируются белковые маркеры (фракции 32-38).' Элюция НА во все хроматографические фракции указывает на высокую степень гетерогенности НА по размерам.

Аналогичные данные о распределении антигенных структур вируса КЭ при хроматографии• были получены Сгоокв et al. (1990). Детекция НА вируса КЭ по белку NS1 показала широкое распределение. НА по хроматографическим фракциям. Молекулярная масса НА вируса КЗ определена в 331 КД, что интерпретировано как существование НА в форма гексамерного образования белка N31, переходящего в димерную структуру после воздействия ДОН.

2.4. Исследование состава вирионыого и невирионного антигенов.

Изучение белкового состава НА проводилось по двум направлениям.' Одно из направлений заключалось в электрофоретическом ана./1изе полос преципитации, образуемых при иммуноэлвктрофорезе. Ракетные полосы преципитации выделялись в результате радиоавтографии высушенных агарозкых гелей. Области геля, содержащие ракетные полосы преципитации, размачивались водой и переносились в лизиругаций буфер Лэммли. Аналогичный метод применен также для анализа белков антиге-яов вируса герпеса (Norrild et al., 1985). Эффективность метода опробована нами при анализе ВА, различающихся по седиментационгом и электрофоретическим свойствам. Показано, что неседиментируюцие

формы ВА не отличаются по оелковому составу от основной популяции вирионов: полосы преципитации содержат три структурных Облка 123]. При анализе полосы преципитации, образуемой ВА в анодной части геля, показано, что этот ВА содержит вместо белка M белок р21-24 126]. Это указывает на то, что анодная популяция ВА представляет собой незрелые вирионы, на которых не прошел протеолиз предшественника белка М.

Анализ полос преципитации, образуемых НА вируса КЗ, выявил, что основным белковым компонентом НА является белок NS1, который' представлен не только димерной, но олигомерными формами более высокого порядка (рис. 10). Существенно, что значительная часть белка * NS1 деградирована и присутствует в форме белков р26 и р24. Это хорошо видно при переводе мультимерных форм белка N51 в мономерную кипячением в течение 5 глин. По всей видимости, выявление нами в полосах преципитации, образуемых НА в РДПА, белка р20 [4] объясняется тем. что в этом случае_ процессы деградации бежа NS1 резко усилены из-за активации действия сывороточных протеаз при инкубации агаровых гелей при 37°С.

Другое направление идентификации актигенно активного бежа НА состояло в изучении иммунохимической активности белковых компонентов антигенных структур после обработки антигенных препаратов детергентами. В разделе 1.4. показано, что практически все вирус-специфические белки сохраняют сбою антигенную активность после

Рис. 10. Электрофоретический

анализ бежов из полос

преципитации, образуемых

антигенами вируса КЭ в '

РИЭФ [34].

Дорожка 1 - белки из полосы преципитации, образуемой ВА; на дорожках 2-8 представлены, белки из полос преципитации, образует,'мх НА: в составе препарата разрушенных клеток, полученных в осадке в результате осветления вируссодержа-шей культуральной жидкости -дорожки 2,3, и в составе препаратов, полученных из вад-осадочной жидкости осаждением 10% ПЭГ (дорожки 4,5) и ПЭГ в диапазоне 10-22% (дорожки 6,7). Дорожкам 1,3,5,7 соответствуют пробы, прогретые при 100 С в течение 5 мин.

ргоо-^ " ® 4

£î l i|

w» t

*** 1

ti* ; ; •.

й - т Ь ^¿NSl

к. '

g -t. *». V». . -

1 РЗ ^ Щ HSt

-лз —р26

-.-> ' «е.- ■— ргА

4 1 Ъ h 5 6 7

воздействия детввгентов. ТШзгенаты клеток ПЭС, зараженных вирусом КЭ, обладают иммунохимической активностью, присущей как ВА, так и НА. ВА, содержащийся в гомогенатах клеток, сохранял свою иммуно-электрофоретическую активность в присутствии 1% лаурилсахарозы, 1% тзина 45, 1% Brij 58. При добавлении 1% дагктошша и \% тритона Х-100 ВА гомогенатов клеток терял преципитирующую активность. Воздействие детергентов не подавляет активность НА гомогенатов клеток. Следует отметить, что обработка гомогенатов клеток детергентами [28], как и в случае с прогреванием [4], повышает выход НА, если судить по высоте и площади ракетных полис преципитации. Разрушение НЛ вируса КЭ как структуры и освобождение субъединиц НА, активные ■центры которых в составе структуры были в значительной мере закрыты," может объяснять активацию НА вируса КЭ при прогревании и воздействии детергентов.

Исследование иммунохимической активности белковых компонентов препаратов ВА и НА после воздействия детергентов проводили с помощью иммуноссрбщш - отделения из препаратов ВА и НА белков, связывающихся с поликлональнкми антителами гипериммунного 7-глобулина, пришитыми на сефарозе, и анализом белков препаратов НА с помощью иммунсблота.

Известно, что обработка вирионов вируса КЭ неионными детергентами приводит к отделению белка Е от нуклескапсида (Heinz, Kunz, 1981). Белок Е после удаления детергентов образует структуры в форме розеток. Иммуноэлектрохимкческие характеристики белка Е сходны с теми, которые обнаружены нами для вирионов: имеются как катодная, так и анодная субпопуляции [23]. Различие состояло в существенно меньшей интенсивности ракетных полос преципитации, образуемых белком Е, что, вероятнее всего, обусловлено большей аффинностью вирионов. Эти данные свидетельствуют о том, что иммуно-электрофоретические. свойства ВА определяются белком Е. Нуклеокапсвд не образовывал ракетных полос преципитации и не отделялся на пришитых к сефарозе антителах, тогда как клеточный аналог белка С -полипептид р13, 'активно взаимодействовал с антителами, иммобилизованными на сефарозе [23, 29]. Это указывает на то, что белок С в составе нуклеокапсида обладает такой конформацией, которая не позволяет ему взаимодействовать с антителами.

Проведение иммуносорбции белков из препаратов НА вируса КЭ показало, что антитела отделяют из препаратов НА гетерогенный белок с молекулярной массой 77-85 КД наряду с небольшим количеством белка NS5 [28, 29]. Наличие белка р77-85 в элюатах наряду с присутствием

ряда белков, имепдих меньшую молекулярную массу, было интерпретировано как следствие протеолиза белка NS5. В дальнейшем, исследование антигенной активности препаратов НА с помощью иммуноблота и сопоставления пептидных карт белков N35, NS1, р77-85 и р24-26 показало, что гетерогенный белок р77-85 представляет собой не продукт деградации белка NS5. а является димерной формой бежа NS1 [34].

Гетерогенность физико-химических характеристик НА вируса КЭ ' привела нас к заключению, что НА представляет собой не белок, а структуру, состоящую не только из бежов, но и из небежовых компонентов. С целью проверки этого предположения были использованы различные радиоактивные метки и анализ в ШЭФ НА, меченого ими." Выявление полос преципитации НА. с помощью 14С-уридина, 14С-холина и различных углеводных меток свидетельствует о том, что в состав НА входят углеводы, липиды и РНК. В совокупности, данные этого раздела свидетельствуют о связи гликопротеида N51 с мембранными структурами, что отмечено для флавивируссв с помощью двухфазных систем и воздействия щелочных условий "(Winkler et al., 1989; Fan, Mason, 1990; Cauchi et al., 1991).

2.5. Злектроннолшкроскопяческий анализ антигенных структур.

Для морфологического анализа,-проводимого с помощью негативного контрастирования, использовали как сами вирусные препараты, так и материал, экстрагированный из полос преципитации . Злектронномик-• роскопический анализ фракций пула 1 градиента концентрации сахарозы,. установил, что они содержат большое количество интактных вириоков диаметром 42-5 нм. Анализ материала, экстрагированного из анодных и катодных полос преципитации, образуемых ВА в составе пула 1, выявил типичные вирионные структуры, покрытые иммуноглобулинами.

Фракции верхней части градиента концентрации сахарозы содержат, в основном, мелкие звездчатые структуры неправильной формы и следовые количества структур, сходных по морфологии "с нвтивными влриояами. В результате электроннсмикроскопического анализа препаратов полос преципитации, образуемых ВА фракций пулов 2 и 3, было выявлено, что эта катодные полосы преципитации, сливающиеся с ракетными полосами преципитации ВА фракций пула 1 (см. рис. ЗА), образованы структурами, морфологически сходными с вирионйми [14]. Существенно, что в препаратах полос преципитации, образуемых ВА, не выявлено кольцеобразных структур, сходных по морфологии с гипотетическим MGTA. При электронномикроскопическом анализе материала, элшровакного из полос преципитации, образуемых НА, содержащимся в

пудах 2 и 3, выявлены крупные аггрегаты гранулярно-фибриллярных структур, которые, по всей видимости, ооразовались при взаимодействии антител с вышеупомянутыми звездчатыми структурами. Среди этих аггрегатов обнаруживаются кольцеооразные частицы диаметром ь-10 нм, имеющие в ряде случаев полость. Такие же частицы выявляются и при электронномикроскопическом изучении фракций, полученных после гель-фильтрации препаратов НА вируса КЗ (рис. 11). Полученные нами дан* ч*«*^ Рис- 11. Электронномикроскопические •'•. изображения структур из фракций,

VI'" .г.' -•■¡' полученных после гельфильтрацки

ные о морфологии НА вируса КЗ трудао, к сожалению, сопоставить с данными других авторов, поскольку исследователи, анализирующие антигенные структуры вируса КЭ и приводящие сведения о высокой степени гетерогенности НА вируса, приводят морфологические наблюдения только относительно • вирионных структур, ограничиваясь рассуждениями о гексамерной природе НА, как нативной структуры (Ьее et al., 1989; Crooks et al., 1990).

2.6. Оценка иммунологических свойств препаратов невириоякого антигена

Защита против флавивирусных инфекций обеспечивается вакцинацией либо живой, либо инактивированной вакциной (Stephenson, 198Э). В результате вакцинации в организме продуцируются вируснейтрализущие антитела, связывающие синтезируемые вирионы по антигенным детерминантам белка Е и таким образом обеспечивающие инактивацию инфекционных вирионов при заражении людей. В то же Еремя при определенных концентрациях антитела _ против белка Е могут усиливать репродукцию флэвивирусов (Philipcttr, et al., 1985, 1987). Это обстоятельство стимулировало проведение ряда исследований по оценке возможной иммунологической значимости структуры флавивирусов, антигенная активность которой обеспечивается неструктурным белком НБ1. Былс показано, что моноклональные антитела к белку NS1 вирусов КЛ i декге-2 и сам белок NS1 частично предохраняют обезьян и мышей 01 вирусной инфекции, причем моноклональяыэ антитела, не обладающие способностью связывать комплемент,, протективной активностью не

препарата НА на колонке, заполненной сефакрилом Б-400 [31 ].

Обладают (Schlesinger et al., 198b, 1S86, 1987; Gould et al., 1986; Henchal et al., 1988). Получены данныэ, свидетельствующие, что ослабление флавивирусной инфекции обеспечивается присоединением антител к белку NS1, экспонированному на поверхности зараженных клеток, связыванием комплемента с образовавшимся иммунным комплексом и последующим лизисом клеток (Sohlesinger et al., 1990). Отмеченная протективная активность белка NS1 - носителя антигенной' активности НА флавивирусов, к сожалению, не определена количественно методами, применяемыми для оценки флавивирусных вакцин. Сравнение протективных свойств вакцинных образцов ВА и НА вируса КЗ привело к неоднозначным результатам. Одни авторы приводят данные," свидетельствующие о сопоставимости протективных активностей НА и ВА Еируса КЗ (Соколова и др., 1989), тогда как другие считают, что лишь ВА Ьбладает протективными свойствами (Тимофеев и Др., 1987).

Поэтому нами предприняты исследования протективных . и иммуногенных свойств изученных препаратов антигенных структур - ВА и НА вируса КЗ, близких по своим свойствам к вакцинным образцам.

Препараты антигенов вируса КЗ получали из вируссодержащей жидкости клеток ПЭС с помощью осаждения при разных концентрациях ПЭГ и барьерного электрофореза (подробно о нем изложено в разделе 5.3), характеризовали на содержание антигенов, количество белка, инактивировали формалином и определяли иммунологическую активность.

Исследуемые препараты вируса КЭ можно разделить по содержанию в них антигзнов на три группы.

Препараты 1 группы, условно обозначенные нами как препараты ЕА/НА, содержат как ВА, так и НА. Они обладают инфекционной (см. тэбл. 1), комплементсвязызающей (титры 1:2 - 1:16) и гемагглютини-• рующей (титры 1:16 - 1:1024) активностями и содержат суммарный белок в диапазоне 3-4 мг/мл. За исключением образца 4, который обладал невысокой инфекционной активностью, небольшой активностью в РГА (титр 1:2) и не был активен в РСК, препараты первой группы по-количеству и соотношению антигенов сходны с неконцентрированной культурпльной кнактивировэнной вакциной против КЭ, получаемой в 1сультурах ФЭК.

Большинство препаратов ВА/НА обладали высокой протективной активностью. Низкая протективная активность препарата 4 привела нас к необходимости выяснения того, какие количества ВА но имеют протективных свойств. Для этого были изучены препараты 2 группы, которые по своим характеристикам близки к очищенной, концентрированной вакцина против КЭ, получаемой на культурах ФЭК.

Таблица 1 - Инфекционные и протективнне свойства препаратов вируса КЭ [35].

Группа и номер препарата Способ получения препаратов Количество антигенов по отношению к исходному^) ИА* ПА**

ВА НА

1 Исходная вируссодержащая культуральная жидкость 100 100 н'.о. 5,16

ВА/НА 2 3 Осаждение '¿'¿% ПЭГ "Соёдинешк препаратов Ь И 10 16 30 4,48 3,57

1 « I 4 Анодная фракция препара^ та, полученного 8% ПЭГ 0,5 15 3,21 0,94

I 1 1 I ВА 1 5 смесь катодных фракций препаратов, полученных 8$ ПЭГ и в диапазоне 1_ 8-22« ПЭГ 16 0 3,23 3,77

6 Катодная фракция препа- 100 1~ 0 —0— —о~ н.о. ■ 7234

I 1 7 рата, полученного 8% ПЭГ н.о. н.оТ

I 1 9 Осаждение в диапазоне 10-20% ПЭГ 0 н.о. 3,33 1,91

1 ! ¡'НА 10 Анодная фракция препарата, полученного в диапазоне 8-22% ПЭГ 0 30 2,00 2,37

11 Осаждение ПЭГ в диапазоне 10-20:5 0 *Т7ПТ~

1? 13 ~ 0 0" ~ 20" 4 и.о. "н.оГ- "2,45

* - инфекционная активность (1р, ГЛ)-П/0,03 гг.1) ** - протектквная активность: индекс-резистентности ХЛ^/пй.) и.о.- не определял:

Для получения препаратов 8-13 использовали надосадочну» жидкость после предварительного осаждения белковых структур из исходной вируссодержащэй падкости при низких концентрациях ПЭГ (8% или 10%).

Препараты 2-й группы - препараты ВА (5-8), содержат только ВА со следовыми количествами балластных белков, ГА-ахтивность препаратов Б,6 составляла 1:16-1:32. Количество суммарного белка в образ-

• цах, используемых для определена*: ярогектлвнсй активности, составляло менее 1 мкг/мл. Отсутствие примесных оелксв, по видимому, заоулцакцкх ъхру? ст инактивации, в препаратах 1-й группы приводит к тому, что инфекционная активность препаратов обычно невысока.

• Добавление к препарату 5 белковых примесей в виде препарата 10 приводит к существенному сохранению инфекционной активности (см. табл. 1, препарат 3).

Оценка защитных свойств препаратов 5-8 показала, что ВА зляется высокопротективным антигеном и что значительное снижение ?о количества приводит к резкому падению протективных свойств, экно сделать вывод, что дальнейшее снижение количества ВА до ровня, который не детектируется в РИЭФ, обеспечивает отсутствие ротективных свойств. Это существенно важно для оценки протективной ктивнооти препаратов НА вируса КЭ.

Для получения препаратов 3-й группы ~ препаратов НА (9-13), сполъзовэлк повторное осаждение в диапазоне 10-22% ЮГ после . редварительного осакдения антигенных структур 8% или 105? ПЭГ. тсутствие ВА в препарате 10 было обеспечено тем, что небольшое' оличество ВА, которое не осадилось при добавлении 8$ ПЭГ, было тделено от КА благодаря барьерному электрофорезу. Препараты НА не бладали ГА-активностью и имели низкую инфекционную активность (1-3 5 Ы)50/о,оз мл). Антигенная активность препаратов НА хорошо нявлялась в РГОФ. Количество белка в препаратах НА не превышало -3 мг/мл. ' .'

Исследования показали, что препараты НА имеют невысокую проективную активность (ИР равен 1,91-2,49). Протективная активность, ¡рэпарята 11 не была выявлена. Это может быть обусловлено высокой онцентрацией балластных белков, которая маскирует протектиЕную итивкость НА. Сниненке концентрации балластных белков в препаратах 2-13 осуществлялось разведением препарата 11, что приводит к одпо-гозкенному уменьшению количества НА. Несмотря на это препараты 2-13 обладают достоверной, хотя и небольшой, протективной актив-гостью. Исследование препарата 13, составленного смешиванием препа->атов ВА и НА, показало, что НА не усиливает протективной актив-юсти ВА вируса КЭ.

Поскольку препараты НА обладали следовой инфекционной активностью, нами предпринято исследование их иммуногенных свойств. !ммунизация кроликов нативными препаратами НА приводила к продукции . знтител как к ВА, так и к КА. Это указывает либо на то, что. коли-шства ВА, не детектируемые с помощью РИЭФ, достаточно иммуногенны, Ш1 на то, что остаточный инфекционный вирус вызывал у кроликов ■шаппарентную инфекцию с образованием антител к ВА. Антитела к ВА зинтезировались уне после 1-2 иммунизация, тогда как продукция значительных количеств антител к НА осуществлялась только после ' годного курса иммунизации. Использование инактивированных формалином препаратов НА не приводило к существенной продукции антител к ЗА дане после проведения полного курса иммунизации, тогда как уро-

вень антител к НА был сходен с полученным при иммунизации нативныш вирусными суспензиями. Эти данные свидетельствуют о существенно меньших иммуногенкых свойствах НА по сравнению с ВА и о том, что иммуногенная активность НА посла обработки формалином практически не теряется. Полученные данные об иммуногенных свойствах проясняют давнюю дискуссию о времени индукции у кроликов преципитируодих ан. тител к вирусу КЗ (Ркахова, 1967; Рубин, 1972). По всей видимости, в первом случае речь шла о продукции антител к НА вируса КЭ, тогда как во втором - об образовании преципитирующих антител к вирионам.

2.7. Заключение.

Проведенные исследования позеолили получить новую информацию о • свойствах антигенов флавивирусов. Выявлена электрофоретическая гетерогенность ВА вируса КЗ, его неоднородность по диффузионным свойствам и наличие части популяции ВА, обладающей другими седимен-тациокными свойствами, нежели основная часть вирионов. Нами показано, что медлешгаседиментиругаций ВА антигенно и морфологически идентичен вирионам и не имеет отношения к пончикообразным структурам флавивирусов, которые рассматривались как особое белковое образование, антигенно близкое к вирионам, - МСГА. Нами получены данные, свидетельствующие о том, что морфологически сходное образование . вируса КЭ - кольцеобразная структура, диаметром 5-10 нм, обладает антигенной• активностью, присущей НА вируса КЭ. Сходные по форме и размеру кольцеобразные частицы выявлены при анализе препаратов пестивирусов, которые классификационно близки к флавивирусам (Ritohie and «Ternelius, 196Э). На основании того, что эти кольцеобразные структуры пестивирусов не образовывали смешанных иммунных комплексов с вирионами, было высказано предположение о связи таких частиц с "растворимым" антигеном пестивирусов.

В то же время следует учитывать, что основное структурное образование, выявляемое во фракциях, содержащих наибольшее количество НА, представляет собой'звездчатые структуры, которые при взаимодействии с антителами образуют бесформенные конгломераты. По всей видимости, НА, как антиген, существует в двух формах: кольцеобразные частиц, возможно, состоящих из мультимерных форм белка NS1, и звездчатые образования, представляющие собой мембранные структура клеток с экспонированными на них вирусспецифическими белкам:". Исследования, показывающие тесную связь белка NS1 с мембранами, не позволяют судить о структурной организации белка NS1 (Winkler et al., 1989; Mason, 1989; Fan, Mason, 1990).

Полученную информацию необходимо учитывать при разработке диагностических и вакцинных препаратов. В отношении диагностической ценности НА флавиЕирусов тлеется довольно много свидетельств большей специфичности НА, нежели ВА. Специфичность НА использована для дифференциации штаммов вируса ЗН (Лаврова, ГайдамоЕИЧ, 1975; Лаврова, Обухова, 1978). В токе время в пределах антигенных подгрупп НА не полностью отличают один вирус от другого. Было показано, что использование обработки сахарозо-ацетоновых антигенов мочевиной позволяет хорошо дифференцировать вирусы комплекса КЭ (Гайдамович и др., 1985). В то же время наши данные о различной чувствительности белков îîsi и NS5 к обработке мочевиной и показанная ранее высокая типоспецифичность белка NS5 вирусов антигенного комплекса ЯЭ-ЗН (Oureshi, Trent, 1973) могут рассматриваться как свидетельство того, что активность антигенных препаратов, используемых' в работах Деменева (1984) и Гайдамович и др., (1985) вероятно обеспечивается также и белком N35. Кроме того, один из эпитопов бежа Е не чувствителен к диссоциирующим воздействиям (Heinz et al., 19ЭЗ) и также может вносить определенный вклад в антигенную активность сахарозо-ацетоновых антигенов. Эти соображения приводят к необходимости использовать для дифференциации и типирования флавивирусов белка NS1 и мсноклональных антител к нему. Показано, что белок NS1 вируса денге-2 содержит 8 антигенных эпитопов (Henohal et al., 1987). Использование набора моноклоналъкых антител к белку N51 Еируса денге-2 показало, что большинство антител специфично для этого вируса (Faloonar-, Young, 1991). Отмечено, что ряд антител реагирует с белком N31 вируса денге других типов, а некоторые реагируют с фла-вивирусэми антигенной группы ЯЗ. Эти данные, наряду с нашими наблга- . деникми о специфичности НА вируса КЭ, свидетельствуют, что использование полиспецифичных антисывороток не может обеспечить полную-стопень дифференцирования флавивирусов внутри антигенных групп.

Вопрос о профилактической ценности НА флавивирусов остается ■ открытым. Из нашей реботы следует, что основным протектившм•.агентом вируса КЗ являются вирконы, тогда как НА вируса КЗ обладает существенно меньшей протективной активностью. В то же время следует учитывать особенности протективного воздействия НА. Возможно, что способы оценки протективной активности вирионов не применимы для, изучения защитных свойств НА. Следует учитывать, что НА, как это показано нами, обладает меньшей вммуногенной способностью, чем варконы. Поэтому курс вакцинации должен быть более длительным. Не исключено, что введение антител к НА в организм непосредственно

после заражения может иметь оолее существенное значение, чем предварительная иммунизация.

3. ОСОБЕННОСТИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА С ЧУВСТВИТЕЛЬНЫМИ КЛЕТКАМИ

Вирус КЭ так же, как для большинство флавивирусов, репродуцируется в клетках млекопитающих и беспозвоночных (Чунихин, Леонова, 1985). Репродукция вируса КЭ в организме млекопитающих осуществляется в различных формах: в виде острого, хронического и персисти-рующего течения инфекции (Погодина и др., ¡986).

Вирус КЭ размножается во многих культурах клеток млекопитающих (Анджапаридзе, Богомолова, 1964; Левкович и др., 1967). Инфекция протекает в ряде культур с цитопатическим действием, а в других -без повреждения клеток. Одни культуры продуцируют при репликации вируса КЭ гемагглютинины, а в других культурах значительное накопление инфекционного вируса не сопровождается образованием гемагглю-тининов.

■3.1. Репродукция вируса клещевого энцефалита е культурах клеток млекопитающих.

• В связи с тем, что для понимания механизмов взаимоотношения вируса с различными клетками необходима всесторонняя характеристика структур вируса КЭ, нами проведено исследование как инфекционности, так и антигенного состава вирусспецифических структур . при репродукции вируса КЭ в различных системах клеток млекопитающих.

Использовали перевиваемые клеточные культуры - линию клеток ПЭС, линию фибробластов сирийского хомяка ВНК-21, линию фибробластоь китайского хомячка Ag17, линии почечных клеток эмбриона зеленой мартышки 6619, эмбриональных фибробластов человека КМ-1, фибробластов индийского оленя мунтжака Muntiacus muntjak (КОМ) и почечных клеток тасманийской сумчатой крысы Poiorous tridaotylis (РТК), и первичную культуру КПЗМ.

В-культурах клеток ПЭС, ВНК-21 и Ag17 вирусная инфекция характеризуется острым течением с выраженным цитопатогенным эффектом через 2-3 суток после заражения. В других культурах - РТК-1, КМ-1, КОМ, 6619 и КПЗМ, наблюдается хроническая инфекция с сохранением монослоя клеток и длительной продукцией вируса (до 3 недель).

Титрование вируссодеркащкх жидкостей культур клеток показало, что ГА-активность не превышает 5 log1/2Р> а инфекционная активность варьирует в диапазоне 6-9 igBOE/мл (табл. 2). Размеры бляшек

КУЛЬТУРА КЛЕТОК ГШАГГЛЮТИ" НМРУЮЩАЯ 4 АКТИВНОСТЬ i КНФЕКЦИ-1 ОКНОСТЬ, 1 lgEOE/МЛ

ПЭС 5 8,90-0,01

ВЯК-21 5 8,84±0,05

1 6,27*0,23

РТК-1 <1 6,11±0,14

КМ-1 1 7,78-0,07

КОМ 3 - 0,04-0,16

6619 <1 7,33-0,11

КПЗМ 1 -2 8,90-0,02

* - выражена в log1/2P, где Р - '

максимальное двоичное разведение вызывающее гемагглютинацию.

варьировали от 1 до 4 мм з диаметре. Сопоставление вели-Таол. 2. Характеристики репродукции ч™ ГА_ и инфекционной актив-вируса КЗ в культурах клеток [25]. ностей вируссодержащих жидкостей культур клеток млекопитающих показало, что нет зависимости между этими параметрами. Отсутствие или наличие небольшой ГА-активности и низкая продукция инфекционных частиц. - около 6 lg БОЕ/'мл, отмечены в культурах Ag17 и РТК-1. Наличие высокой инфекционной активности вируса КЗ в клетках КМ-1 и КЕЗМ сопровождается небольшой ГА-активностью, тогда как в клетках ПЭС и ВНК-21 отмечается как высокая ГА-активность, так и внсокая инфек-. ционность вируса КЗ.

Существенным моментом является отсутствие зависимости ■ между нфекционностью и количеством ВА, которое оценивали по величине и адиоактивности ракетного преципитата (рис. 12). В культурах ПЭС и g17 при практически одинаковых количествах ВА уровни инфекцион ости значительно различаются - по меньшей мере на 3 порядка. Ин-екционность поддерживающей среды клеток Ag17 и РТН-1 сопоставима, огда как по количеству ЕА эти культуры различаются. В культурах ТК-1, 6619 и КОМ продуцируются приблизительно одинаковые количест-а ВА, тогда как инфекционность культуральной жидкости, из которой ыделены указанные антигены, колеблется от S до- 8 lg БОЕ/мл. Все то позволяет предположить, что для каждой культуры клеток соотно-зете икфектрюнных и физических вирионных частиц различно.

Отмечено, что различие двух типов инфекции коррелирует с арактером синтеза белков в зараженных клетках [33]. Острая вирус-эя инфекция сопровождается активным синтезом вирусспецифических эжов непосредственно после латентного периода. Обычно синтез-неточных белков несколько подавляется. Для хронической инфекции 1рактерно отсутствие сколько-нибудь заметного подавления синтеза неточных белков. Благодаря применению иммуносорбции показано, что

Г г ъ к 5 в 7

fMc. 12. Анализ в WîSS> вирионных структур ьируса КЭ, синтезирующихся в различных культурах клеток 12В].

Препараты получали ультрацентрифугированием в рэжиме 14x105 ^хмин. Культуры клеток: 1 - ПЭС, 2 - БНК-21, 3 - Agi7, 4 - РТК, 5 - КМ, 6 - КОМ, 7 - 6619.

вирусспецифические белки синтезируются в наибольших количества; спустя длительное время после заражения - 5-6 суток.

Следующим существенным моментом является различив синтез антигенных структур вируса КЭ в зависимости от клеточных систем, которых этот вирус размножается. ВА, синтезирующийся в культура клеток млекопитающих, в которых развивается острая вирусная инфек ция, глектрофорэгически гетер&ген, э именно, при электрофорезе буфере Свендсена разделяется на анодную и катодную субполуляции Катодная субпопуляция содержит белки Е, С, М. Аноднсй субпопуляци ВА, синтезирующегося в клэтках ПЭС и ВНК-21, свойственен дефицг структурных белков О и M и наличие Еместо них белка р21-24 [26] Часть вирионов, щюдуцирувдкся к клетках Ag17, неподвшсна в элек: ркчоском поле. Вируссодержащая жидкость культур клеток, в которь осуществляется острая инфекция, содержит значительные количестз вириопов, не седиментирующих при ультрацептрифугировании в рект 14x106 g х мйе. В тс 'же время в клетках с хроническим течени; инфекции - культуры КОМ, КМ-1. 6619 и КПЗМ, популяция вирион< более однородна по злектрофорэтическим и седаментавдонным свойс вам. ЕА представлен только катодной субпопуляцией вирионов, а нал чие неседиментирующего ВА отмечено только при продукции вируса метках КОМ. Вируссодержащая жидкость культур клеток млекопитанци поддерживающих хроническую инфекцию, не содержит НА вируса К осаждеыцбгося при ультрацентрифугировании.

Различия характеристик репродукции вируса ХЭ яри острой и хронической инфекции, по есвй видимости, объясняется разницей в синтезе белков. Ранний активный синтез вирусспоцкфических белков в культурах клеток с острым течением инфекции приводит к быстрому нарушении клеточного метаболизма", разрушению клеток и, как следствие, к неоднородности популяции зириоков и ПА вируса КЭ по физико -химическим свойствам.

3.2. Изменчивость вируса клещевого энцефалита при пассировании через иксодовых клещей и мелких млекопитающих

Иммуноэлектрофоретические исследования вируса КЭ еыяеили гете- . рогенкость ВА по движению в электрическом поле - основная часть ВА' смещалась при электрофорезе в агарозных гелях к катоду- а меньшая -к ансду. Эти исследования были проведены на прототшшом штамме вируса КЭ Софьин, который образует крупные бляшки и обладает высокой периферической активностью. .Для клопа вируса КЭ, получившего после пассирования через клещей мелкоОляшечный фенотип, показано, что это изменение сопровождается изменениями в величине и месторасположению образующегося в РИЭО преципитата ВА (Дживэнян и др., 1583). Для выяснения возможных причин изменения фено- и генотдгш-ческих свойств вируса КЭ нами было предпринято сопоставление имму-ноэлектрохимическкх свойств ЗА пята штаммов с изменениями биологи^ ческих характеристик вируса после пассирования через клощей и мелких млекопитающих 121].

Штаммы УК—101, УК-124, ПК-36 и ЛК-183, выделенные из клещей, собранных в Удмурдской АССР а Приморском крое, до пассирогания через клещей Нуа1опла апа1:о11сиз1 обладав сходными свойствами - образовывали через 4-5 дней после заражения в культуре 1:леток ЕЭС под ' агьровьм покрытием крупные бляпют (4-6 мм в диаметре) и имели высокую периферическую активность (ИИ в пределах от 1 до 1,7' 1Ю50 ). При размножении зтих штаммов в культуре клеток ПЭС практически полная деструкция клеточного монослоя достигалась через 2 суток после инфекции, титры иьфэкщгонпости составляли 5"10® - 2'1С^ БОЕ/кл, ь титры гбмаггллтиншюв - 1:64 - 1:256. При анализе в РИЭФ препаратов-ВА этих штаммов, полученных из вируссодеркащей жидкости культур клеток ПЗС, выявлялось обычное для вируса КЭ образование- полос' преципитации. Выявлено, что основная часть ВА смещается :с катоду, а . небольшая часть, которая быстро насыщается антителами - к аноду (рис. 13А). Таким образом, указанные штаммы аналогичны по своим -

Рис. 13. Анализ препаратов ВА штаммов

вируса КЭ в РИЭФ [25]. А, Б, - штаммы УК-101 и ПК-20; а, -штамм УК-101 после пассирования в клещах; О - штамм ПК-20 после пассирования в полевках. Препараты получены ультрацентрифугированием в режиме 14x1 С млн ехмин.

биологическим и иммунохимическим характеристикам штамму Софьин.

Штамм ПК-20 отличается от других исследованных штаммов по составу ВА при сходном количестве инфекционных частиц и отсутствию ГА-активности в клетках ПЭО. Анализ в РИЭФ и ПИЭФ препаратов тгамма ПК-20 выявил подавляющее преобладание анодного ВА (рис. 13, Б). Небольшое количество катодного ВА все же продуцируется в клетках ПЭС, поскольку при длительной радиоавтографии гелей ПИЭФ препарата ВА штамма ПК-20, меченного [355]-метионином, выявляется и катодная полоса преципитации ВА. Отличие качественного и количественного состава популяции ВА для штамма ПК-20 коррелирует с отличием штамма ПК-20 от других исследованных штаммов по другим свойствам. Так, штамм ПК-20 обладает низкой периферической активностью (ИИ равен 5,6 Ы3^0) и способен образовывать в культуре клеток ПЭС только мелкие, точечные бляшки (менее 1 мм).

В результате пассирования через клещей Нуа1опгпа апа-ЬоПоит, проводимого при 37°С штаммы УК-101, УК-124, ПК-Зо и ПК-183 после 11, 18, 15 и 20 пассажей, соответственно, приобретают способность образовывать мелкие бляшки, которые как и бляапси штамма ПК-20, образуются на 2 дня позднее, чем крупные. Е течение 2-3 пассажей крупные бляшки полностью замещаются мелкими. Этот процесс сопровождается снижением периферической активности штаммов - Ш увеличивается до 5,2-6,0 15 иэ50. При дальнейшем пассировании штаммов УК-101, УК-124 и ПК-36' в течение'10, 5 и 8 пассажей, соответственно, эти характеристики не изменяются. Пассированные через клещей штаммы вызывают более позднюю деструкцию клеток - через 3-4 дня после инфекции, и сохраняют при размножении в клетках ПЭС высокую инфекционность (около 9 1§Б0Е/мл). ГА-активность при этом либо резко снижается (титр 1:2-1:4) для штамма ПК-183, либо пропадает совсем. Изменение свойств штаммов после пассирования через клещей сопровождается

изменением состава ВА - синтез катодного ВА подавляется, а синтез анодного ВА или остается на том же уровне или изменяется незначительно. Таким образом, пассирование штаммов вируса КЗ через клещей приводит к изменению биологических характеристик, которое сопровождается изменением электрофоретических характеристик вирионов.

Реверсия всех исходных характеристик штаммов УК-101, УК-124, ПК-183 осуществляется при однократном пассировании через полевок. Из крови выделяется вирус, имеющий исходные характеристики штаммов - высокую периферическую и ГА-активности, способность образовывать крупные бляшки и синтезировать основную, катодную часть ВА. Пассирование через организм полевок штамма ПК-20 также приводит к изменению его сеойств - ИИ снижается до 2,0 ы)50, приобретается крупноблятечный фенотип, ГА-активность достигает титров 1:4-1:8. Все эти признаки, по всей видимости, обусловлены приобретением штаммом ПК-20 способности синтезировать большие количества катодного ВА. Что касается изменения бляшечного фенотипа этих штаммов, то его интерпретировать труднее. Как известно, в основе титрования инфекционности методом бляшек под агаровым покрытием лежит неспособность пораженных вирусом клеток окрашиваться нейтралы*..' .фасным. Малый размер бляшек, более позднее их выявление, "ер-^ду с более поздним развитием цитопатогекного эффекта в клетках ПЭС для штаммов с доминированием анодной компоненты ВА, может свидетельст- . вовать о замедленном разеттии лнфзкционного процесса.

Таким образом, полученные данные позволяют судить о направлен- ' ности селективного процесса в природных' популяциях вируса КЗ: утрата или снижение патогенности этого вируса для чувствительных животных происходит в результате очень длительного размножения в • переносчиках - иксодовщ; клепах, а для восстановления данной характеристики достаточно разеюго попадания в организм естественных хозяев - полевок.

3.3- Заключение.

Проведенные исследования по изучения рзпродукции вируса КЗ в различных клеточных системах показали, что физико- и биохимические свойства вирусных структур зависят от вида клеточных культур. Это" обстоятельство необходимо учитывать при производстве вакцинных и диагностических препаратов, так как имеются свидетельства, что иммунологические свойства вирионов также варьируют в зависимости от ¡щеточного субстрата (Зльберт ж др., 1ЭЭ2).

Наша раоота свидетельствует о цзлэсоаоразностн иных, нежели клетки ФЭК, субстратов для производства вакцина против КЭ, которые осуществляют репродукцию вируса КЭ без разрушения клеток. В качестве таких субстратов предложены первичные и перевиваемые клетки почек зеленых мартышек (Slbert et al., 1991; Грачев и др., 1985; Чумаков и др., 1991). Вируссодержашие суспензии, полученные из таких клеток, предложено применять в качестве вакцины без очистки от белкоЕых примесей. Из наших данных следует, что такие клеточные субстраты продуцируют вирионы значительно более гомогенные по физико-химическим свойствам, нежели клетки ФЭК. Это может указывать на то, что из таких препаратов существенно проще и с большим выходом можно получать очищенную вакцину по технологии, используемой для вирусных суспензий, полученных из клеток ФЭК (Kunz et al., 1930; Эльберт и др., 1985).

Другой аспект взаимодействия вируса КЭ с клетками касается изменений, происходящих с вирусом в результате его пребывания в организме членистоногих, в данном случае клещей. Изменение фено- и генотипическкх свойств вируса КЭ, полученное ка примере штамма ЭК-328 и его дериватов (Дкиванян и др., 1986), подтверждено нами при длительном пассировании в клещах ряда штаммов из Приморского края и Удмурдской АССР, что свидетельствует о закономерности изменений свойств вируса КЭ, происходящих при смене хозяина. Эти данные наряду с данными популяционного анализа „гаммов из других регионов (Бочкова и др., 1ЭЭЭ; Дкиванян и др, 1990) указывают на то, что благодаря пассироганию вируса КЭ в клещах в природе поддерживается существование штаммовых вариантов, обладающих сниженной патоген-ностью. Такие штаммы быстро - при периферическом заражении млекопитающих в течение одного пассажа, а при внутримозговом заражении в течение 2-3 пассажей (Дкиванян и др., 1588), восстанавливают характеристики, присущие штаммам до пассирования в клещах.

Существование двух различающихся reo патогенным свойствам вариантов вируса КЭ может' быть необходимо для эффективной циркуляции вируса в природе '(Алексеев, 1936). Сохранение популяции вируса КЭ i мелких млекопитающих и клещах, а такжэ переход вируса от одного хозяина к другому обеспечивается, по всей видимости, различие», биологических характеристик ет&ммобых вариантов, например, пс способности выхода вирионов из клеток млекопитающих, по характера 'глккозилирования белков и по интерферирующим свойствам (Дкиванян ] др., 1991; Карганова, 1991).

4. ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИИ

Полученная информация об иммунохтаичэских свойствах антигенных структур вируса КЭ послужила основой для разработки методик, которые могут быть использованы для практических целей.

4.1. Использование модификации встречного иммуноэлектрофореза для диагностики клещевого энцефалита

Метод встречного иммуноэлектрофореза (ВИЭФ) с успехом применяется для диагностики вирусного гепатита, аденовирусных и энтеро-вирусных инфекций (Вильяме и др., 1Э79; Залесский, 1982; Зоваков и др.. 1983). В ВИЭФ полоса преципитации образуется при взаимодействии антигена, двигающегося в электрическом поле к аноду, и антител, двигающихся под действием электроэндоосмоса к катоду.

В отличие от большинства других антигенов, при использованных условиях электрофоретического разделения ВА вируса КЗ движется к катоду. Поэтому была разработана модификация методики ВИЭФ, в которой ВА, двигающийся к катоду, образует видимую в проходящем свете полосу преципитации с антителами, двигающимися к аноду [ю].

Для выявления антител в сыворотках больных людей методом ВИЭФ в реакции использовали 4 антигенных .единицы (АЕ) ВА вируса КЭ (-за одну АЕ принимали предельное разведение препарата ВА, при котором образовывалась видимая в проходящем свете полоса преципитации). За величину титра антител принимали предельное разведение сыворотки, при котором образовывалась видимая в проходящем свете полоса преципитации.

Сравнение результатов, полученных при исследовании 28 проб сывороток с помощью ВИЭФ и РДПЛ, показало, что метод ВИЭФ более чувствителен: в РИЭФ антитела были выявлены в 25 пробах сывороток, а в РДПА - только в 18. Преимуществом ВИЭФ является также быстрота реакции - полоса преципитации полностью образуется уже через 2 часа, тогда как в РДПА это происходит в течение 2 суток.

Из 118 исследованных проб сывороток в ВИЭФ были положительными на наличие антител 85 (72%), а в РПГА - 109 (92%) сывороток. Из этих 118 проб сывороток в РСК было исследовано 108 проб сывороток, положительными на наличие антител оказалась 91 {84%) проба..Титры, выявляемые в сыворотках больных людей методом ВИЭФ, не превышали разведение 1:16, тогда как в РПГА они достигали 1:640, а р РСК -1:256. Сравнение величин титров антител в РПГА и ВИЭФ и в РСК и ВИЭФ показало, что имеется соответствие между полученными резуль-

татами (коэффициенты коррэляции +0,65 и +0,61, соответственно).

Таким образом, использованная наш кодификация ВИЗФ оказалась более чувствительной, для обнаружения вирусспецифических антител, чем РДПА. и менее чувствительной, чем РСК и РПГА. Эта методика проста в постановке, позволяет быстро получать результаты и не требует обработки сывороток перед исследованием. Метод ВИЭФ может быть применен для диагностики вируса КЭ в качестве дополнительного к РПГА и РСК.

4.2. Применение ракетного иммунозлектрофореза для анализа . вирусных препаратов, инэктиЕированных формалином

Исходный препарат вируса КЭ представлял собой инактивированную - формалином вируссодержащую жидкость культуры ФЭК - полуфабрикат вакцины, полученный в объединении "Вирион" (Томск).

В предварителььых опытах было установлено, что антигены инак-тпвированного формалином вируса КЭ взаимодействуют с вирусспецифи-ческими антителами гипериммунного 7-глобулина практически так же, как и нативныб вирусные антигены. Примесные антигены, содержащиеся в полуфабрикате вакцины, не искажают картины выявления специфичных для антигенов вируса КЪ полос преципитации.

• Фракционирование полуфабриката вакцины против КЭ проводили с помощью улътрафильтрации и гель-хроматографии. Ультрафильтрацию проводили на мембранах У/.М-50 ("Еладипор"). Сконцентрированный с помощью ультрафильтрации полуфабрикат вакцины хромотографаровали на колонках, заполненные модифицированным полизшилпирролидоном макропористым стеклом (производство Горьковского опытного завода ВНИШШ) с диаметром пор 70 нм. в соответствии с технологией производства очищенной и концентрированной вакцины против КЭ, внедренной в ИПВЭ РАМН (Кгаз1Хп1коу е! а1., 1935; Эльберт и др., 1985).

В ходе гель-хроматографии ультраконцентрат вакцины разделялся по оптической плотности на два пика: первнй, небольшой пик следовал непосредственно за свободным объемом колонки, второй следовал за ним и был существенно больше. Полученные фракции были объединены в два пула (1 - фракции первого пика, 2 - фракции второго пика), существенно отличавшиеся по качественному и количественному составу вируеных антигенов (рис. 14).

Исходный препарат, ультракоьдентрат и пул 2 гельхроматографи-• ческих фракций содержал ВА и НА в одинаковом соотношении (0,28, 0,30 и 0,31, соответственно), но в ультраконцентрате они были в

Рис.14. Анализ ооразцсв вакцины в РЮФ [30 J.

1 - цолуфаОригсат;

2 - ультраконцентрат;

3, 4 - пулы 1 и 2 гель-хромзтографических фракций ультраконцентрата; 5 - ультрафильтрат.

большей концентрации (примерно в 10 раз при сокращении объема полуфабриката вакцины в 20 раз). Количество ВА в ультраконцентрате составляло около.45% от исходного. Потери ВА, возможно, связаны с его сорбцией на мембранах, поскольку ВА в ультрафильтрате не выявлялся. Потери НА при ультрафильтрации существенно меньше - в сумме его количество в ультраконцентрате и ультрафильтрате составляло около 80S от исходного. При гельурсматографян не удалось полностью разделить ВА и НА. Пул 1 гельхроматографических фракций содержал, по данным РЮФ и РДПА, только ВА. Пул 2 содержал оба антигена.

Таким образом, РИЭ<5 может быть применен для качественного и количестЕекного анализа антигенного состава закципных образцов..и характеристики технологических процессов получения вакцины против КЭ.

4.3. Использование барьерного электрофореза для очистки препаратов вируса КЭ

На основании различий электрофоретического поведения при РИЭФ• БА и НА вируса КЭ была предпринята разработка препаративного разделения антигенных структур вируса КЗ при использовании элементов РИЗФ - агарсзы и буфера Свевдсена. Сконструированное устройство, состоящее из камеры введения, камер накопления и электродных камер, подробно описано [27] я, в основных чоргах, сходно с'устройством Van de Woude, Davies (1963). На рис. 15 представлен пример электрофоретического разделения в устройстве.

Препарат ВА, полученный ультрацентрифугированием, содержит около 2/3 ВА и 1/3 НА, имеющихся в исходной вируссодеряащей куль-туральной жидкости. Остальная часть ВА и НА присутствует в прэПа-

Рис. 15. Анализ в РИЭФ антигенных препаратов вируса КЭ до и после барьерного

электрофореза [27]. 1,4- исходные препараты ВА и НА, полученные с поыощьв ультрацентрифугирования и последующей концентрацией с помощью ультрафильтрации;

2, 5 - препараты, полученные из катодных камер;

3, 6 - препараты, полученные из анодных камер.

рате, полученном о помощью ультрафильтрации. После электрофореза происходит распределение антигенных структур по камерам устройства. В катодных камерах содержится только ВА. Эффективность очистки подтверждается данными электронно-микроскопического и белкового анализа. В катодной камере после разделения препарата ВА содержится большое количество морфологически полноценных вирионов при отсутствии примесей (суммарное количество белка не превышает 100 мкг/мл). Эти белки представлены структурными белками при следовых количествах других белков. В анодных камерах после электрофореза препаратов ВА и НА отмечается накопление НА. npi- электронно-микроскопическом анализе и анализе белков в ПААГ в образцах анодных камер не обнаружено вирионов и структурного белка Е при на .личин значительных, количеств других белков - суммарное количество болка составляло около 800 мкг/мл. Разработанный способ разделения антигенных структур вируса КЭ обеспечивается применением буфера Свендсена, имеющего рН 8,8, ионную силу 0,08 и высокую буферную емкость, и агарозы с высоким показателем электроэндоосмоса (-0,33 .от?). Поскольку больлгаютво белков и белковых структур имеют кислую природу, они так же, как и меньшая часть ВА вируса КЗ штамма Софь-ин, обладают в буфере Свендсена оградательным зарядом н движутся в

электрическом поле к аноду. Высокая степень електроэндоссмоса згарозы создает движение буферного расавора к катоду и сбеспечива-эт накопление значительной части ВА штамма Софьин в катодной камере. отсутствие з ней примесей, заряженных в буфере Свендсена так. что они двигаются к аноду, определяет существенное достоинство способа - получение препаративных количеств чистого ВА.

Другим достоьнством ьлекгрофоретического разделения антиген-лих структур вируса КЭ является возможность получения в анодной камере КА, свободного от примеси ВА. Это достигается как применением ступенчатого получения препаратов НА, содержащих следовие количества ВА, так и меньшей скоростью движения к аноду части ВА. Последнее обеспечивается применением агарозных мостиков, через которые ВА, как более /.рупяая структура, движется медленнее, чем НА.

4.4. Заключение.

Осуществление указанных разработок основано на особенностях электрофоретического поведения антигенных структур вируса КЭ при подобранных электрсфоретических условиях: основное количество ВА перемещается при электрофорезе к катоду, а НА и клеточные примеси - к аноду. . ■ '

Разработанный нами метод ВИЭФ, к сожалению, уступает по чувствительности стандартным серологическим методикам (РТГА и РСК). Введение з медицинскую тактику высокочувствительного ИФМ (Караванов и др., 1990) существенно снижает возможности практического использование ВИЭФ для диагностики КЗ. В то же время эга разработанная нами модификация ВИЭФ может быть применена для диагностики других флпвив/руеккх пнфзкций, для которых не разработано иммуноферментных систем, поскольку ъа примере вируса ЗН показано, что имг.:уно&лектрофоретическое поведение антигенов этого вируса такое ко, как и у вируса КЭ (Ляпустиа и др., 1983).

Использование иммунофермэнтных методов для контроля вирусных препаратов (Тимофеев и др., 1987) также сужает возможность использования метода РйЭФ. Тем не менее, не исключено, что этот метод может быть использован для характеристики технологических процессов производства вакцины (ультрафкльтрация и хроматография) и тестирования качества партий материалов, применяемых для этих процессов, поскольку метод РИЭФ предоставляет возможность детектировать НА вируса КЭ.

В отношении аналитического микроустройстза для барьерного

электрофореза можно отметить, что опкт расоты с ним оудет полез для разработки новых вариантов устройства, которые могут быт использованы б практике вакцинных производств.

В цело.«:, материал, изложенный в этой глаЕв мошо рассматрива как иллюстрацию рязраоотки практических методик, ' основываясь свойствах конкретного вирусного ооъекта.

ВЫВОДЫ

1. Проведено изучение синтеза и иммунохимических свойст вирусспецифических Оелков вируса КЗ.

а) Показано, что наОор вирусспецифических белков вирусе Б сходен с набором вирусспецифических белков других фшавивирусо! Выявлены белки p93(N35), рбЭ(КБЗ), р53(Е), p47(NSl), р21(ргеМ) р13(С), а также белки р24, р23, р18 и р11. Показано, что BpeN интенсивного синтеза вг^усспецифических белков зависит от мнокесз венности инфекции. При высокой множественности белки интенсиЕ! синтезируются через s-14 часов, а при низкой - позже, через 14-S часа поело инфекции. Показано, что белок NS3 частично существует форме предкесткенника - белка р79 (ргеЖЗ). Отмечена высокая сте пень гликозилироваяия белков Е, NS1 и prebi, а также небольшое вклл чекие углеводов в белки N35, N33 и preN33.

б) Проведено изучение трансляции РНК вируса КЗ в бесклеточш системах. Показано, что (u vitre осуществляется эффективная транс ляция 5 ' -концевой области генома флавивирусс-в, кодирующая последс вательно структурные белки с и Е, и слаоая экспрессия последующ* области генома, кодирующей неструктурные белки. Показано, что пре; шественник структурных белков подвергается процессингу в ходе ез синтеза при участии клеточных протеаз, ассоциированных с меморг нами.

в) Показано, что неструктурные белки из5 вирусов комплекса I имеют одинаковую ЗФП. - ЭФП Оелков KS5 вируса Повассан и ряда флав! вирусов, принадлежащих к другим антигенным группам, сходна и н< много ниже, чем у бежа NS5 Еирусов комплекса КЗ. Установлено, ч1 белки р'геКЗЗ обычно активно синтезируются в клетках, заражена вирусами комплекса КЗ. ЭФП белков N33 флавивирусов других антиге] ных групп и вируса Повассан варьирует в диапазоне величин, присущ белкам NS3 и preNS3 вируса КЗ. На основании данных о подвижное вирусспецифических белков можно говорить о том, что вирус Повасс; входит в комплекс КЗ, но менее других вирусов связан с ним.

г) Показана высокая иммунохимичесхзя активность белков Ж35, NS3, *îSi > Е и р13, из которых белки 115 5 и N31 не чувствительны к дпссощщручщим воздействиям. ■ ..

2. Проведено изучение антигенных структур вируса КЗ.

Ь) При репродукции вируса КЗ, помимо вирионов, синтезируется КА, который представляет собой надмолекулярную структуру, связанную с мембранами и кардинально отличашугося от вирионов по диффузионным; электрофоретическим и иммунохимическим свойствам.

б) Показано, что иммуноэлектрофоретическив свойства вирионов определяются белком Е и что белок С в составе нуклеокапсида не • обладает иммунохнмической активностью.

в) Выявлено, что основными антигенными компонентами НА являются димерные ' и мультимерные форш белка N51, часть которых деградировала.

г) В результате изучения характеристик осаждения ВА и НА вируса КЗ с помощью ПЭГ, а 'также проведения седиментационного и хроматогрзфического анализа препаратов вируса КЭ показано, что НА вируса ЯЭ обладает существенно более гетерогенными физико-химическими характеристиками, чем ВА. - .

д) Морфологически НА представляет собой мелкие, "звездчатые" структуры, образующие при взаимодействии с онтьтелами скопления агрегатов гранулярного характера, средл которых обнаруживаются кольцеобразные частицы, имеющие диаметр 5-10 ил и внутреннюю, полость. Это свидетельствует о том, что кольцеобразные структуры, отождествлявшиеся ранее с МСГА флавивируссЕ. антигенно сходны не с зирионами, а с НА, и являются одной из форм НА.

е) Показано, что НА вируса КЭ обладает существенно меньшими протехтивннми свойствами, чем ВА, и не оказывает усиливающего эффекта на протектпвную активность при добавлении к препаратам ВА.

3. Проведено изучениэ особенностей взаимодействуя вируса КЭ с. клетками млекопитающих и клещей.

а) Показано, что острое и хроническое течение вирусной инфекции сопровождается различиями Е физико-химических свойствах вирионов и в соотношении их инфекционных и антигенных свойств.

б) Выявлена высокая степень изменчивости вируса ' КЭ при пассировании через госсодовых клещей и мелких млекопитающих, что может объясняться различием селективных свойств хозяйских систем.

4. Полученные результаты послужили основой для решения, ряда прикладных задач:

а; разработана модификация встречного имуноэлектрофореза, • которая монет быть использоЕана для диагностики КЗ.

б) отработаны условия иммуноэлектрохимического анализа инекти-Еированных формалином препаратов вируса КЗ, что позволяет проводить анализ антигенного состава образцов Еакцикы и характеризовать процессы концентрации и очистки вакцины с помощып иммуноэлектрофореза.

в) разработан метод барьерного электрофореза, который позволяет получать из неочищенных препаратов Еируса КЗ чистые образцы вирионсв и препараты КА, освобожденные от примесей ВА вируса КЗ.

' БЛАГОДАРНОСТИ

Автор благодарен руководству Института полюмиелита и вирусных энцефалитов РАМН (дфектор - академик РАМН С.Г.Дроздов) за предоставленную возможность провести исследование, результаты которого излсдсены в этом докладе.

Развитие работы проходшю в обстановке благожелательной критики и при постоянной поддержке со стороны члена-корреспондента РА1Ш В.А.Лашкевича, в лаборатории которого проведены исследования и которому автор глубоко благодарен.

Основные результаты, изложенные в диссертации, получены в соавторстве с сотрудниками ИПВЭ РАМН: В.И.Аголом, Е.Б.Андреевой, Т.С.Грицун, Т.И.Джизанян, А.И.Жанковым, A.C.Каравановым, Г.Г.Карга-новой, М.Б.Королевым, В.М.Лисаком, А.Н.Мустафиной, Г.П.Пивановой, И.А.РешетникоЕЫм, Ю.В.Свиткикым, С.Г.Соболевым, С.П.Чунихикым; МГУ: Т.Ю. Угаровой; ЛенНИИЭМ им. Пастера: Е.Д.Соколовой; ТомНЖВС: Н.Н.Киселевой, которым я глубоко олагодарек.

Выполнение экспериментальной части работы было бы невозможно •без помопи лаборантов Н.Ю.великой, Л.Т.карпенко, А.А.Симуниной и ' 3.С.Тимофеевой, которым я сердечно благодарен.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДОКЛАДА.

• 1. Lyapustin V.N., Svitkin У.Y., Lashkevich У.A. Synthesis of viius-speciíio proteins in tick-borne encephalitis virus-infected pig embryo kidney cells. Aota virol., 1580, v. 24, N 5, C. 305-3102. Svitkin Y.V., Ugarova Т.У., ChernovEkaya I.V., Lyapustin V.N., Lashkevich-V.Á., Agol V.l. Translation oí tick-borne er.oeph.a-litis virus (Flavivirus) in y(tro: Synthesis of two structural polypeptides. - Virology, 1981, v. 110, p. 26-34.

3. Лисак B.M., Королев М.Б., Ляпустш B.H., Дашкевич В.А. Методические подходы к изучению структуры флавивирусов. - В кн.: Тез. докл. XII Всесоюзной конф. по электронной микроскопии. М., "Наука", 1982, с. 290-291.

4. Ляпустин В.Н., Жанков А.И., Дкиванян Т.И., Лашкевич В.А. Характеристики низкомолекулярного невирионного ("растворимого") антигена вируса клещевого энцефалита. Вопр. вирусол., 1983, Jé 2, с. 200-207.

5. Ляпустив В.H., Лашкевич В.Д. Получение вирионного и низкомолекулярного невирионного ("растворимого") ангигенэ вируса клещевого энцефалита дробным осаждением полиэтиленгликолем. Вопр. Еиру-СОЛ., 19&3, » 4, С. 122-124.

6. Ляпустир В.Н., Жанков А.И., Дживанян Т.Н., Лашкевич В.А. Сравнительный анализ электрофоретической подвижности высокомолекулярных вирусспецифических белков флавивирусов. - Вопр. вирусов, 1964, Л 6, с. 740-743.

7. Svitkin Y.V.,' Lyapustin V.N., Laehkevioh V.A., Agol V.l. Differenoes between translation produot of tiok-borne enoephalitie. vii-us RNA in oell-free systems from Krebs-2 cells and rabbit retieulooyte3: involvement of membrane in the prooesBing of nascent precursors cf flaviviruB protéine. - Virology, 1984, v. 135, p. 536-541.

8. Свиткин D.B., Ляпустин В.Н., Лашкевич В.А., Агол В.И. Мемб-ран-зависимый процессинг насцентного предшественника структурных белков флавивируса (вирус клещевого энцефалита). в бесклеточных системах. В кн.: Тез. докл. 16--ой конф. федерации Европейских биохимических обществ. М., 1984, V-003, р. 230.

9. Андреева Е.Б., Ливанова Г.П.,-Ляпустин В.Н"., Караванов A.C., Лашкевич В.А., Неклюдова В.М. Использование метода встречного имму-ноэлектрофореза для диагностики клэщввого энцефалита. В кн.: Тез. докл. Всесоюзной конф. по природной очаговости болезней. Тюмень-Москьа, 1984. с. 7.

ю.Ляпустин В.Н., Андреева Е.Е., Ливанова Г.П., Караванов A.C., ЛэшкеЕич S.A. Еылзление антител к виряонному антигену вируса клещевого энцефалита в сыворотках больных людей с помощью встречного имиуноздектрсфореза. - Вопр. вирусол., 1985, й 1, с. 102-104.

11. Ляпустин В.Н., Грицун Т.С., Решетников И.А., Чунихин С.П., Дашкевич В.А. Синтез вирусспецифических белков вирусов ; клещевого энцефалита и Западный Нил. В кн.: "Актуальные проблемы медицинской вирусологии", Тез. докл., г.1., 1985, с. 200-201.

12. Лисак В.М., Королев М.Б., Ляпустин В.Н., Грицун Т.О., Джи-ванян Т.И., Лашкевич В.А. Электронномикроскопический анализ высокомолекулярных структур, особенностей строения и репродукции- вируса клещевого энцефалита. В кн.: "Актуальные проблемы медицинской вирусологии", Тез. докл., М., 1985, с. 202-203.

13- Дкпвапян Т.И., Ляпустин В.Н., Жанков А.И., Лашкевич S.A. Сравнительное изучение вирусспецифических белков флавивирусов.

В кн.: "Актуальные проблемы медицинской вирусологии", Тез. докл., U., 1985, С. 222-223.

14. Ляпустин В.Н., Лисак В.М., Грицун Т.О., Королев М.Б., Лашкевич В.А. Иммунохимический и електронномикроскопический анализ высокомолекулярных структур вируса клещевого энцефалита. Вопр. вирусол., 1985, * 4, С." 419-427.

15. Lyapustin V.N., Svitkin Y.Y., Lashkevioh V.A.,. Agol V.l. A tentative model of formation of structural proteins of tiok-borae enoephalitiB villus (flavivirue). FEBS Letters, 1986a, v. 200, Л 2, p. -314-316.

■16. Ляпустин E.H., Грицун Т.О., Лашкевич В.А. Неструктурный белок вируса клещевого энцефалита обладает преципитирувдей активностью, "характерной для невириснного ("растворимого") антагена. Вопр. вирусол., 1986, Л 3, с. 329-333.

17. Lyapustin V.N., Gritsun T.S., Labhkevioh V.A. Effect of the multiplicity of infeotior. on synthesis of the tiok-borne enoe-phalitis virus-epeoified proteins during a single replication oyole. Acta virol.,'1986, v. 30, N 4, C. 289-293.

18. Ляпустин В.Н., Грииун Т.О., Каргаяова Г.Г., Лашкевич В.А. Ливанова Г.П., Караванов A.C. Применение иммунохимкческих методов для определения качественного и количественного состава специфичных для 'клещевого энцефалита препаратов антигенов и антител. В кн.: "Актуальнее вопросы' производства иммунобиологических препаратов. Материалы межинститутской научной конф., Томск, 1986, с. 24-24.

. 19. Грицун Т.е., Ляпустин В.Н., Лисэк В.М., Королев М.Б., Лашкевич В.А. Седакентационная и электрофоретичеекая гетерогенность вирионного антигена вируса клещевого энцефалита. В кн.: "Актуальные вопросы производства иммунобиологичеасих препаратов", Материалы мекинститутской. научной конф., Томск, 1986, с. 63-64.

20. Свиткин Ю.В., Ляпустин Б.Н., Лашкевич В.А., Агол В.И. Синтез и мембранзависимый процессинг предшественника структурных белков вируса клещевого энцефалита (флавиЕирус) в бесклеточных системах. Молекулярная биология, 1986, т. 20, № Е, с. 1251-1264.

21. Чунихин С.П., Решетников И.А., Лящстин B.h. Изменчивость вируса клещевого энцефалита при пассировании через иксодовых клещей и мелких млекопитающих. Мед. паразитол. к паразитарные болезни, 1986, J6 6, с. 58-61.

22. Ляпустин В.Н., Грицун Т.С., Лашкевич В.А. Характеристики осаждения антигенных структур вируса клэщэеого энцефалита поли-

»тиленгликолем и сульфатом аммояьл. Вопр. вирусол., ¡937, И 2, с. 88-195.

23. 1"рицун Т.е., Ляпустин В.Н., Лисак В.М., Королев М.Б., [эгпкевич В.А. Электрофоретическая и седиментациоЕная гетерогенность ¡крионного антигена вируса клещевого энцефалита. Вопр. вирусол., 987, Ü 2, с. 196-204.

24. Ляпустин В.Н., Грицун Т.О., Лашкевич В.А. Гликозилировон-ие и негликозилированные белки вируса клещевого энцефалита, силте-¡ирующиеся -в перевиваемых клетках печки эмбриона свиньи. Вопр. гарусол., 1987, Я 3, с. 337-342.

25. Ляпустин В.Н., Чунихин С.П., Решетниког И-А., Лашкевич В.А. 'вменения синтеза вирионного антигена вируса клещевого энцефалита юсле. пассирования через иксодовых клэщей и мелких, млекопитающих. !опр. вирусол., 1987, Л 4, с. 451-456.

26. Ляпустин В.Н., Лашкевич В.А., Мустафина А.Н., Решетников I.A., Чунихин 0!.П. Зависимость синтеза вирионных структур вируса вещевого энцефалита от вида клеточных культур. Вопр. вирусол., 987, А 6, 707-709.

27. Ляпустин В.Н., Карганова Г.Г., Соболев С.Г., Грицун Т.е. [репаративное разделение структур вируса клещевого энцефалита" с гамощьы электрофореза в жидкой фазе. Вопр. вирусол., 1988, Я 1, :. 98-102.

28. Грицун Т.О., Ляпустин в'.Н., Карганова Г.Г., Лашкевич В.А-Гевирионный ("растворимый") антиген вируса клещевого энцефалита. :опр. вирусол., 1 эаа, .4 2, с. 217-227.

29. Ляпустин В.Н., Карганова Г.Г , Мустафина А.Н., Грицун Т.С., ¡ашкевич З.А. Выявление вирусспецифичэских белков вируса клещеБого • нцефалита с помошью иммукосорбции. Вопр. вируссл., 1988, Н 4,

!. 448-452;

30. Соколова Е.Д., Киселева H.H., Fokkcbb JT.B., Осипова Е.Г., япусгин В.Н., Лашкевич В.А. Изучение иммуногенности и антигенного остава фракций культуралькой вакцины против клещевого энцефалита, :олученны7. методам! ультрафильтрэции, гель-хроматографии и ультра-;онтрифугирования. Б кн.: "Клещевой энцефалит", Сборпик трудов ИКЭМ им. Пастера, т. 65, Ленинград, 1989, с. 141-150. • .

31. Грицун Т.О., Лйсак В.М., Ляпустин В.Н., Королев М.Б., ■ :аикевич В.А. Медленноседиментирующий гемагглютипин вируса клеще-ого энцефалита. Вопр. вирусол., 1989, Л 4, с. 449-454.

32. Ляпустин В.Н., Грицун Т.С., Лашкевич В.А. Иммунохимический

анализ вирусспецифических белков и надмолекулярных структур вирус! клещевого энцефалита. В кн.: "Арбовирусы и арбовирусные инфекции1' Тез. докл., М., 1939, о. 23-21, р. 75-76.

33. Ляпустин В.Н., Мустафина А.Н., Лашкевич В.А. Репродукцю вируса клещевого энцефалита в различных культурах клеток млекопитающих и соматических гибридах. В кн.: "Современные проблем эпидемиологии, диагностики и профилактики клещевого энцефалита" Тез. докл., Иркутск, 1990, с. 8-9.

34. Грипун Т.С., Ляпустин В.Н., Шаталов А.Г., Лашкевич В.А. Множественные формы белка К31 как основного компонента невириопног< ("растворимого") антигена вируса клещевого энцефалита. Вопр вирусол., 1990, Л 6. с.471-474.

35- Ляпустин В.Н., Пиванова Г.П., Караванов A.C., Лашкевич В., Сопоставление протективных свойств препаратов вирионного и невири-онного ("растворимого") антигенов вируса клещевого энцефалита Вопр. вирусол., 1991, * 6, с. 498-500.

Подписано к печати 23.03.93 г. Заказ № 269 ■ Тираж 80 экз. Институт полиомиелита и вирусных ьнцефалитов Российской АМН.

Информация о работе

Ляпустин, Виктор Николаевич
доктора биологических наук
Москва, 1993
ВАК 03.00.06

Автореферат

Молекулярно-биологический и иммунохимический анализ вирусспецифических белков и надмолекулярных структур вируса клещевого энцефалита - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы